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TRANSFORMAÇÃODE CLOROPLASTOS

QUAIS AS VANTAGENS EM SE MODIFICAR ESTA ORGANELA?

Helaine Carrer

Pesquisadora do Centro de

Biotecnologia Agrícola (CEBTEC)

Professora doutora do

Departamento de Química,

ESALQ/USP

Foto cedida pelos autores.

Cloroplastos são organelasintracelulares presentes em algas e plan-tas , responsáveis pelo processofotossintético, desde a captação da ener-gia luminosa até a formação de compos-tos orgânicos, participando também daassimilação do nitrogênio, na síntese earmazenamento de amido e nabiossíntese de aminoácidos e lipídios. Aestrutura desse centro fotossintetizadorestá representada na figura 1, onde sepode observar a presença da membranadupla, a qual é característica da organelaque se originou através do processoendossimbiótico de integração de uma

cianobactéria em uma célula eucarionte,dando origem ao cloroplasto (Gray, 1993.Curr. Opinion Genet Dev. 3: 884-890). Hátambém membranas dos tilacóides e gra-na, e regiões denominadas nucleóidesque se localizam no estroma e onde seencontram as cópias do genoma docloroplasto (ptDNA). Esta região não édelimitada por uma membrana, existin-do a presença de proteínas que mantêmalgumas cópias do genoma agregadas.De certa forma, a presença de cópias dogenoma nos nucleóides facilita o pro-cesso de transformação do cloroplastodurante a desdiferenciação celular na

divisão celular, quando somente umnucleóide é transferido para a célula-filha. O DNA é encontrado em três com-partimentos numa célula: no núcleo, noscloroplastos e na mitocôndria. O núcleoé o local mais comum para estudos deengenharia genética de plantas com oobjetivo de introduzir características agro-nômicas desejáveis. Modificação nogenoma de cloroplasto já é uma realida-de enquanto que a mitocôndria de plan-tas permanece sem uma tecnologia detransformação. Entretanto, modificaçõesgenéticas nas mitocôndrias da algaChlamydomonas e da levedura S.

cerevisae já foram obtidas, acreditando-se que num futuro próximo, esta organelatambém será alvo de transformação ge-nética em plantas superiores.

Estrutura do genoma de cloroplastos

O genoma do cloroplasto é circular,o tamanho varia entre 120 a 180kb,apresentando uma região duplicada comorientação invertida na maioria das es-pécies vegetais. A figura 2 mostra ogenoma de cloroplasto de tabaco(Nicotiana tabacum), o qual possui155.884 pares de bases e foi totalmente

seqüenciado por Sugiura et al. em 1986(EMBO J. 5: 2043-2049). Atualmente essegenoma também foi seqüenciado emoutras espécies vegetais: arroz, milho,Arabidopsis , Pinus e as a lgasfotossintetizantes Chlamydomonas eEuglena. O seqüenciamento do genomatem importância fundamental para o co-nhecimento dos genes que participamdos caminhos metabólicos, no estudo dainteração dos genes nucleares que seexpressam nos cloroplastos e apresentafundamentos para análise do sistemaevolutivo da organela nos vegetais. Emplantas superiores, como o tabaco, o

genoma codifica em torno de 120 genes,um número pequeno quando compara-do com o genoma da cianobactéria.Existem pelo menos de 500 a 1.000 genesnucleares que se expressam noscloroplastos após síntese pré-protéicanos ribossomos do citoplasma. Dos genescodificados no plastídio, em torno de 50estão envolvidos na transcrição dos genesplastidiais como: rRNA, tRNAs, genes deproteínas ribossomais e gene da RNApolimerase. Os genes relacionados como metabolismo vegetal são aproximada-mente 40 e formam complexos comgenes nucleares, codificando compo-

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nentes do sistema fotossintético, os quaiscompreendem os genes da enzimaRubisco (r ibulose-1 ,5-bi fosfatocarboxilase/oxidase), que é a principalproteína do cloroplasto; genes partici-pantes do complexo do fotossistema I eII; do citocromo b/f e da enzima ATPsintase e NADH desidrogenase. Nasdicotiledôneas, o gene accD codificauma subunidade da acet i l -CoAcarboxilase, enzima participante dabiossíntese de lipídios, porém não estápresente nas monocot i ledôneasseqüenciadas até o momento. Estegenoma também possui genes que codi-ficam tRNA envolvidos na biossíntese declorofilas, processo metabólico específi-co para cloroplastos e cianobactérias.Além destes genes com funções conhe-cidas, existem seqüências de quadros deleitura (ORFs) com potencial para seremgenes cujas funções ainda não foramidentificadas. Embora as cópias do

genoma sejam idênticas dentro de umaespécie, o número de cloroplastos e doptDNA é dependente do tipo de célulavegetal. Nas células meristemáticas en-contra-se a forma indiferenciada chama-da proplastídio, em número de 10 a 15,possuindo no máximo 50 cópias doptDNA. Por sua vez, a célula foliar possuios proplastídios diferenciados emcloroplastos, os quais sãofotossinteticamente ativos encontradosem número de aproximadamente 100,sendo que há em média 100 cópias doptDNA, determina-se um total de aproxi-madamente 10.000 cópias do genomapor célula (Maliga et al. 1993. Phil. Trans.R. Soc. Lond. B 341, 449-454).

Transformação de

cloroplastos

Através do desenvolvimento datecnologia de manipulação de genes decloroplastos in vivo criou-se uma novaferramenta para estudar os aspectos dabiologia celular e molecular desta

organela. O sucesso obtido com a trans-formação de cloroplastos exigiu: 1) de-senvolvimento de um método de intro-dução dos t ransgenes (DNAtransformante) através da membranadupla do cloroplasto; 2) disponibilidadede genes marcadores seletivos com ex-pressão na organela e 3) eficiente esco-lha do local de integração do transgenepara não interferir com a função normaldos genes no genoma. Essa transforma-ção foi obtida primeiramente emChlamydomonas reinhardtii, uma algaunicelular, por Boyton et al., 1988(Science 240: 1534-1538), e em plantassuperiores a transformação foi obtidaem tabaco (Nicotiana tabacum) por Svabet al. 1990 (PNAS 87: 8526-8530). Sistemade liberação do transgene no cloroplasto:Através do sistema de biolística (biologia+ balística) desenvolvido por Klein et al.,1987 (Nature 327: 70-73) foi possívelintroduzir transgenes no interior dos

cloroplastos. Outro método que demons-trou resultados positivos foi descrito porGolds et al., 1994 (Biotechnology 11: 95-97) e O'Neill et al., 1993 ( Plant J. 3: 729-738), utilizando tratamento com PEG(polietileno glicol), mas a eficiência detransformação é menor comparando-secom o método de biolística. A utilizaçãode Agrobacterium vem sendo objeto deestudo em muitos laboratórios sem re-sultado satisfatório até o momento. Oprotocolo de t ransformação decloroplasto de tabaco está apresentadona figura 3. A metodologia consiste emintroduzir o transgene no interior doscloroplastos através de biolística. Cópiasdo transgene ficam aderidas às partícu-las de ouro ou tungstênio de aproxima-damente 1mm em tamanho, elas sãoaceleradas pelo gás de hélio em altapressão em câmara de vácuo, sãointroduzidas no cloroplasto onde libe-ram o DNA. Inicialmente, somente umaou poucas cópias do genoma são altera-das entre as 10.000 cópias presentes nascélulas do mesófilo foliar. Após serem

bombardeadas, as células são mantidasem meio de crescimento sem agentesele t ivo por dois dias pararestabelecimento da divisão celular, sen-do em seguida cortadas em pequenossegmentos e transferidas para meio decultura contendo o agente seletivo. Após5 a 6 semanas observam-se as brotaçõesde novas plantas regeneradas a partir deuma única célula que possivelmente re-cebeu o transgene no cloroplasto. Estaplanta é colocada em meio deenraizamento e analisada através de téc-nicas de biologia celular, como PCR(Polymerase Chain Reaction) ou análisede Southern para verificar a integraçãodo transgene no genoma do cloroplasto.Para que as plantas transformadas sejamgeneticamente estáveis, é necessário quetodas as cópias do genoma sejam unifor-memente transformadas. Uma planta pri-mária (primeira brotação) em geral en-contra-se na fase heteroplásmica, quan-

do as cópias do ptDNA não se apresen-tam uniformemente modificadas. Paraque se torne uma planta transgênicahomoplásmica, a qual possui todas ascópias do ptDNA uniformemente trans-formadas, são necessárias 3 a 4subculturas transferindo pequenas se-ções da folha da planta primária emmeio seletivo. Durante a subcultura, ascélulas que não possuírem os transgenesnão se dividem, e se tornam cloróticas.As que possuem o transgene se divideme voltam ao estado desdiferenciado, oqual possui somente um nucleóide com2 a 10 ptDNA. A partir do sistema derecombinação obtém-se a uniformidadedas cópias do ptDNAs, monitorando-seatravés de PCR. Seleção dostransformantes: O primeiro genemarcador se le t ivo expresso emcloroplasto de Chlamydomonas e tabacofoi um gene plastidial alelo ribossomalmutante do gene 16S rRNA. Mutações dealgumas bases na seqüência desse generesultam na resistência a inibidores dasíntese de proteína de procariotos, como

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os ant ibiót icos espect inomicina,estreptomicina e lincomicina. Entretan-to, a freqüência de transformação decloroplastos util izando este genemarcador seletivo foi muito baixa, emmédia entre 0.5 a 2 transformantes paracada 100 bombardeamentos (Svab eMaliga, 1991. Mol. Gen. Gen. 228: 316-319; Staub e Maliga, 1993. EMBO J. 12:601-606). Existe sempre a necessidadede identificação de genes marcadoresseletivos para facilitar a introdução dostransgenes com alta eficiência de sele-ção. Os genes bacterianos: aadA (Svab eMaliga, 1993. PNAS 90: 913-917) e nptII(Carrer et al., 1993. Mol Gen Gen 241: 49-56) conferem resistência aos antibióticosespectinomicina e canamicina, respecti-vamente. Estes genes utilizados comomarcadores seletivos apresentaram me-lhores resultados na eficiência de trans-formação, em torno de 2 a 10transformantes por bombardeamento,sendo que o gene nptII apresentou me-nor freqüência de transformação e tam-bém expressão nuclear. O gene de plantaque confere resistência aos herbicidasinibidores da enzima acetolactato sintase(ALS) foi testado para utilização comomarcador seletivo (Carrer e Maliga, resul-tados não publicados). Recombinaçãohomóloga: A integração de um transgeneno genoma de cloroplasto ocorre atravésde recombinação homóloga, como de-monstrado na figura 4. Para tanto, naconstrução de um vetor de transforma-ção, seqüências do ptDNA devemflanquear o gene de interesse, indo destaforma o transgene para o local de inser-ção no genoma. Quando o local deinserção é a região duplicada invertidado cloroplasto, existe a necessidade de"correção" da segunda cópia, podendo,então, ocorrer a correção para a formaoriginal ou transformada. O transgene éexpresso no cloroplasto sob controle deum promotor procariótico, o qual possuios sinais de expressão na organela.

Aplicações da tecnologia de

transformação

Até o momento, o tabaco tem sido aúnica planta superior a ter o cloroplastotransformado, sendo utilizada como plan-ta-modelo. Existe várias vantagens em seexpressar os transgenes nessa organelado que no genoma nuclear. Herançamaterna: Análise de plantas variegadasrevelou que os cloroplastos não apre-sentam segregação mendeliana, apre-sentando herança maternal dos genesdevido ao fato de não serem transmiti-dos pelo pólen. Isto é observado namaioria das espécies de plantas cultiva-

das, como milho, arroz, trigo, algodão,feijão e outras. A figura 5 mostra semen-tes de tabaco de plantas transgênicas(transplastômicas) contendo o gene nptIIgerminadas em meio de seleção em pre-sença de canamicina (200mg/ml). Assementes de planta autopolinizada (Self)e de F1, planta transgênica (feminino)fertilizada pelo pólen da planta-controle(masculino), apresentam-se todas resis-tentes à canamicina, enquanto as semen-tes provindas de retrocruzamento (RF),em que a planta-controle (feminino) éfertilizada pelo pólen da planta transfor-mada (masculino), apresentavam-se to-talmente sensíveis ao antibiótico. Utili-zando esta característica, quando umgene de resistência a herbicida, por exem-plo, for introduzido no cloroplasto deuma planta de interesse comercial, pode-se garantir que não vai ocorrer dissemi-nação deste gene de resistência para asespécies relacionadas no campo. Tem-se, assim, a possibilidade de controle dadisseminação de transgenes no ambien-te. Alta expressão de proteínas: Sendo osistema genético de cloroplastos alta-mente poliplóide, os transgenes são am-plificados para um grande número decópias. A introdução do transgene sobcorretos sinais de controle da traduçãoleva a proteína a ser expressa em altaconcentração. Este potencial de alta ex-pressão de proteína em cloroplastos foidemonstrado por McBride et al., 1995(Biotechnology 13: 362-365). Os autoresintroduziram um gene modificado doBacillus thuringiensis em cloroplastosvia biolística e verificaram o acúmulo daprotoxina com ação inseticida ao nívelde 3 a 5% da proteína solúvel total. Talnível de expressão não poderia ser con-seguido utilizando-se o mesmo gene nonúcleo. A figura 6 apresenta o resultadodo efeito tóxico da protoxina nas folhasde tabaco transformadas para as larvasdo inseto Spodoptera exigua. Efeito delocal de integração do gene: Na transfor-mação nuclear um mesmo transgenepoderá apresentar diferentes níveis deexpressão, dependendo do local deintegração no genoma. Em contraste, aintegração do transgene no genoma decloroplasto ocorre em local específico,produzindo somente um único eventode integração, devido à transformaçãono cloroplasto ocorrer através derecombinação homóloga. Desta forma,fica eliminada a necessidade de se ca-racterizar um grande número de plantastransformadas independentemente. Uti-lizando esta particularidade, genes decloroplastos podem ser trocados pelomesmo gene mutado in vitro para estudoda função destes genes. O gene ycf3

(hypothetical chloroplast reading frameNº3) está relacionado ao fotossistema I,o que auxiliou nas elucidações de ques-tões fundamentais da biologia decloroplastos, incluindo também os me-canismo de regulação dos genes (Ruf etal., 1997, J. Cell Biol 139, 95-102). Ausên-cia de co-supressão: Integração de vári-as cópias de um gene ou de um segmen-to do gene pode resultar em co-supres-são, termo que se refere à inativaçãonão-intencional do gene nuclear, devidoà interferência entre os transgenes ouentre um transgene e um gene nativo.Como o sistema genético dos cloroplastosé naturalmente poliplóide, ocorre a faltade um mecanismo de inativação do gene.Integração de transgene sem marcadorseletivo: Através de cotransformação foiestudada a integração de dois transgenesindependentes sem haver seleção paraum deles. Através da análise de Southernfoi observada a presença do gene semseleção em aproximadamente 20% doseventos de transformação (Carrer eMaliga, 1995. Biotechnology 13: 791-794).Alta taxa de cotransformação demonstraa facilidade em integrar mais de um geneno ptDNA, não havendo a necessidadede estarem fisicamente ligados a umgene marcador seletivo. Estes resultadosapontam para uma metodologia impor-tante na manipulação de genesfotossintéticos, na qual o marcador sele-tivo poderia influenciar no funciona-mento dos genes. Apesar de a tecnologiade transformação de cloroplastos terapresentado resultados reprodutivos emplantas de tabaco, acreditamos ser detotal importância a transferência destatecnologia para outras espécies cultiva-das. Isto vem sendo objetivo de estudoem vários laboratórios de pesquisa deuniversidades e empresas privadas comoMonsanto e outras. O nosso laboratóriomantém colaboração com o Dr. PalMaliga, Waksman Institute, RutgersUniversity, EUA e Dr. Ralph Bock,University of Freiburg, Alemanha.