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RPG Rev Pós Grad 2011;18(4):244-252

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Análise de miofibroblastos no estroma de carcinoma epidermoide da bocaGABRIELA BOTELHO MARTINS*, MARLOS BARBOSA RIBEIRO**, SILVIA REGINA DE ALMEIDA REIS***

* Professora Adjunto Doutora do Curso de Fisioterapia da Universidade Federal da Bahia (UFBA) – Salvador/BA. ** Pós-graduando em Endodontia pela Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia (UFBA) – Salvador/BA. *** Professora Adjunto Doutora do Departamento de Diagnóstico e Terapêutica da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia

(UFBA) – Salvador/BA.

Resumo

O estroma tumoral sofre modificações durante a progressão de neoplasia maligna. As alterações da ma-triz extracelular e a presença de miofibroblastos pare-cem influenciar nos processos de invasão e metástase que caracterizam os tumores malignos orais. Objetivou-se, com a pesquisa, investigar a presença de miofibroblas-tos na frente de invasão neoplásica do carcinoma epi-dermoide de boca, por meio da microscopia eletrônica de transmissão e marcadores imunoistoquímicos. Neste estudo, 23 casos de carcinomas epidermoides de diver-sas localizações da boca foram classificados segundo um sistema de graduação histológica. Foram utilizadas as colorações pela hematoxilina-eosina (HE) e as ex-pressões imunoistoquímicas da vimentina, da actina alfa de músculo liso e da desmina foram analisadas em lesões com diferentes escores histológicos de maligni-dade. A microscopia eletrônica de transmissão foi uti-lizada a fim de confirmar a presença de células do tipo miofibroblastos no estroma tumoral. A expressão da vimentina apresentou diferentes padrões nos carcino-mas epidermoides da cavidade oral com altos e baixos escores de malignidade. A actina alfa de músculo liso esteve presente em alguns casos estudados. Embora a actina alfa de músculo liso tenha sugerido a presença de miofibroblastos no estroma dos carcinomas epider-moides da cavidade oral, a análise ultraestrutural não confirmou este resultado.

DescRitoRes

Carcinoma. Microscopia eletrônica. Miofibroblastos.

intRoDução

Os miofibroblastos são células mesenquimais es-pecializadas, com propriedades similares às das células musculares lisas e dos fibroblastos4. São expressas em condições fisiológicas ou patológicas como parte da res-posta do hospedeiro à injúria6,10,12,15,23. Podem ser apre-sentados por meio da expressão de proteínas do cito-esqueleto e por microscopia eletrônica de transmissão. Vimentina, desmina e actina alfa de músculo liso são os três filamentos mais utilizados para identificar os miofibroblastos10. A modulação e o comportamen-to destas células no estroma de carcinomas invasivos e metastáticos dependem da interação entre citocinas e moléculas da matriz extracelular9,17,20,22,23. Essa intera-ção gera sinais que são responsáveis pelo controle da expressão gênica, pela proliferação, apoptose e dinâmi-ca do citoesqueleto celular6,18,19,21.

Células com características de miofibroblastos são predominantes em estroma tumoral de diversos carcino-mas, sejam eles primários ou metastáticos4,9. Elas têm papel fundamental na deposição de grandes quantida-des de colágeno, para dar firmeza e garantir a retração do tumor, por isso, sugeriu-se que essas células con-tribuíam para o fenômeno da desmoplasia e contração em muitos carcinomas4,6,11,17,19,20. Além disso, exercem força, gerando resistência tecidual, dificultam a proli-feração tumoral e aumentam a deformação do tecido sadio circundante11,19,23.

Diversos trabalhos na literatura registram a pre-sença de miofibroblastos em estromas tumorais de neoplasias de mama, próstata, cólon, fígado e do trato respiratório, porém, existem poucos estudos sobre a sua

Trabalho realizado na Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia (UFBA) – Salvador/BA. Endereço para correspondência:Sílvia Regina de Almeida ReisRua Araújo Pinho, 62 – CanelaCEP 40110-150 – Salvador/BAFone: (71) 3283-9007E-mail: [email protected]

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Martins GB, Ribeiro MB, Reis SRA. RPG Rev Pós Grad 2011;18(4):244-252.

ocorrência em carcinomas orais. Acredita-se que estas células possam desempenhar um importante papel no desenvolvimento e progressão destas neoplasias, atra-vés da geração de sinais bioquímicos, oferecendo su-porte ao tumor.

objetivos

Os objetivos deste estudo foram investigar a ex-pressão de miofibroblastos na frente de invasão neoplá-sica do carcinoma epidermoide de boca, com diferentes escores de malignidade, por meio da identificação de células a partir da microscopia eletrônica de transmis-são e marcadores imunoistoquímicos como a vimenti-na, a desmina e a actina alfa de músculo liso, e estabele-cer dados descritivos sobre o comportamento biológico destas neoplasias.

mateRial e métoDo

Seleção de casos

Foram utilizados nesta pesquisa 23 casos de car-cinoma epidermoide da cavidade oral, selecionados do laboratório de patologia cirúrgica de uma unidade uni-versitária em Salvador, Bahia. Os pacientes eram pro-venientes das clínicas cirúrgicas e autorizaram o proce-dimento com a assinatura de termo de consentimento livre e esclarecido. Os aspectos macroscópicos de cada peça foram descritos e as amostras preparadas para pro-cedimento de rotina.

O projeto foi enviado e aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia (UFBA) e o parecer fa-vorável foi emitido.

Microscopia de luz

Histologia

Do material destinado à microscopia de luz, fo-ram realizadas secções de 4 mm de espessura, sendo submetidas ao método de coloração hematoxilina-eo-sina (HE).

Todo material foi observado ao microscópio ópti-co (Leica ATC 2000, New York, USA), sendo utilizada para graduação histológica a classificação de tumores malignos indicada por Anneroth et al.1, que consiste da avaliação de seis características morfológicas: grau de queratinização, pleomorfismo nuclear, número de mito-ses, padrão de invasão, estágio de invasão e infiltração

linfoplasmocitária. O parâmetro estágio de invasão foi omitido, já que foram utilizadas biópsias incisionais de carcinomas epidermoides de boca.

Esta classificação histológica de malignidade é ba-seada na população das células tumorais e nas caracte-rísticas da relação tumor-hospedeiro. Cada parâmetro morfológico é graduado de 1 a 4 pontos. O escore final para cada caso é definido pela soma total de pontos atri-buídos aos parâmetros avaliados, obtendo-se uma mé-dia da divisão destes pelo número total de parâmetros. São considerados escores baixos os valores entre 1,0 e 2,5, e escores altos os entre 2,6 e 4,0.

Imunoistoquímica

Para a realização da imunoistoquímica, foram rea-lizados cortes de tecido de 4 mm de espessura, coloca-dos em lâminas de vidro previamente preparadas com poli-L-lisina. O método de imunomarcação utilizado foi da streptavidina-biotina peroxidase.

Os cortes histológicos foram submetidos à despa-rafinização em banhos sequenciais de xilol, acetona, ál-cool (absoluto, 95, 70, 50 e 30%) e água destilada em temperatura ambiente. Em seguida, foram submetidos, quando necessário, à recuperação antigênica, com pos-terior bloqueio das ligações inespecíficas e, então, in-cubados overnight a 4ºC com os anticorpos primários (Vimentina – 1:200, clone 3B4, DAKO Corporation USA; Actina alfa de músculo liso – 1:50, clone 1A4, DAKO Corporation USA; e Desmina – 1:50, clone D33, DAKO Corporation USA). O anticorpo secundá-rio foi utilizado segundo as orientações do Kit LSAB – Peroxidase (DAKO Corporation, USA) e a revelação realizada por meio do diaminobenzidina tetrahidroclo-reto (DAB) com peróxido de hidrogênio a 30%. As lâ-minas foram contracoradas com hematoxilina de Gill e montadas com bálsamo do Canadá e lamínula para ava-liação qualitativa. Como controles positivos foram utili-zados cortes de gengiva sadia, removidos por indicação cirúrgica prévia, ou cortes de tecido contendo músculo liso; e como controles negativos, os mesmos tecidos, sendo suprimido da reação o anticorpo primário.

Microscopia eletrônica

O material destinado ao estudo para microscopia eletrônica de transmissão foi dividido em diminutos fragmentos de 1 a 2 mm, fixados, imediatamente após biópsia, em glutaraldeído a 4% em tampão cacodilato de sódio a 0,2 M (1:1), durante 1 hora a 4°C. Os frag-mentos foram lavados em tampão cacodilato de sódio

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a 0,2 M e pós-fixados em tetróxido de ósmio a 2% em tampão cacodilato de sódio a 0,3 M durante 1 hora e também a 4°C.

Após a lavagem com tampão cacodilato de sódio 0,1 M (3 banhos de 10 minutos), os fragmentos foram, então, desidratados em acetona em concentrações pro-gressivas de 30, 50, 70 e 100%, sendo 10 minutos para cada uma. Após a desidratação, foram incluídas em re-sina e acetona 100%, na proporção de 1:1 por 1 hora e, finalmente, incluídos em resina Poly Bed B12 pura e polimerizados em estufa a 60°C por 3 dias.

Os blocos foram cortados em ultramicrótomo auto-mático Reichert - Jung Ultra-Cut II. Os cortes semifinos, obtidos com navalhas de vidro e com 0,5 micrômetros de espessura, foram corados com azul de metileno-azur II e examinados ao microscópio óptico para seleção das áreas para cortes ultrafinos. Estes foram realizados com navalha de diamante, colocados em lâminas de vidro e contrasta-dos com acetato de uranila a 7%, em álcool metílico ab-soluto e citrato de chumbo. As grades contrastadas foram examinadas ao microscópio eletrônico de transmissão Zeiss - EM - 109.

Análise dos cortes histológicos por meio da microscopia de luz

Após classificação histológica de malignidade, as secções coradas pela HE foram analisadas. As lâ-minas obtidas pelas reações imunoistoquímicas para os anticorpos antivimentina, antiactina alfa de mús-culo liso e antidesmina foram analisadas de forma qualitativa, a fim de possibilitar estudo descritivo das alterações observadas no estroma dos carcinomas epidermoides verificados.

A positividade dos cortes analisados para cada an-ticorpo foi considerada quando se encontrava marcação positiva nas secções examinadas. Na análise do padrão de marcação, seguiram-se os critérios previamente es-tabelecidos por Harada et al.8.

ResultaDos

Aspectos clínicos

Dos pacientes estudados, 74% pertenciam ao sexo masculino (17 casos). O feminino foi representado por apenas 6 casos (26%). A idade dos indivíduos portado-res de carcinoma epidermoide da cavidade bucal variou de 29 a 81 anos, com média de 60 anos. A localização mais frequente foi a língua e, em seguida, o assoalho

da boca. Em relação à raça, observou-se predomínio de indivíduos leucodermas, seguidos por faiodermas (39,1%) e melanodermas (13%).

Aspectos histopatológicos

Do total da amostra, 60,9% exibiam baixos esco-res de malignidade, ou seja, possuíam escores totais entre 1,0 e 2,4, enquanto que 39,1% obtiveram altos escores de malignidade, uma vez que se encontravam entre 2,5 e 4,0.

Os cortes histológicos das lesões com baixos esco-res de malignidade corados pela HE exibiram prolifera-ção de células epiteliais malignas, com graus variáveis de ceratinização, predominando lesões moderadamente ceratinizadas. Apenas dois casos mostravam ausência completa de ceratinização. A análise do pleomorfismo nuclear neste grupo de lesões demonstrou que 7 dos 14 casos (50%) registravam grau moderado de células com núcleos pleomórficos. Observando-se o parâmetro número de mitoses, notou-se que somente uma lesão mostrou ocorrência de mais de 5 mitoses por campo examinado, havendo predomínio de lesões com 2 a 3 mitoses por campo (50%).

Das nove lesões cujos cortes histológicos foram diagnosticados como carcinoma epidermoide com al-tos escores de malignidade, observou-se, pela colora-ção da HE, neoplasias constituídas por grande número de células epiteliais pleomórficas, com núcleos de ta-manhos variados e hipercromáticos. Embora este pa-râmetro histológico fosse, neste grupo de lesões, mais acentuado, tanto qualitativa quanto quantitativamente, o número de mitoses na quase maioria dos casos ana-lisados foi considerado moderado, perfazendo duas a três por campo examinado. Somente 2 casos (22,2%) apresentaram número de mitoses acima de 5 por cam-po examinado. Individualmente, as células tumorais exibiam ausência de ceratinização em 5 dos casos (55,5%) e mínima ceratinização nos restantes. Quando se analisou o padrão de invasão, observou-se que a maioria das neoplasias era marcadamente difusa, com invasão de células isoladas ou em pequenos grupos (5 casos; 55,5%). Porém, quando esses achados foram confrontados com o restante das lesões do mesmo gru-po de altos escores de malignidade, notou-se padrão de invasão bem menos agressivo (4 casos; 44,4%). A presença de infiltrado inflamatório foi escassa em 6 casos (66,6%), tanto na área da invasão da neoplasia quanto no restante do estroma, e em 1 deles foi ausen-te. As células mais representadas foram os linfócitos e, muito raramente, plasmócitos (Tabela 1).

Tabela 1Sistema de graduação histológica de malignidade segundo Anneroth et al.1

População celular tumoral Relação tumor hospedeiro

Grau de ceratinização Pleomorfismo nuclear Número de mitoses* Padrão de invasão Infiltrado

inflamatório

Esco

re

1Altamente ceratinizado Pouco 0–1 Margens bem definidas Marcante(+ de 50% das células) (+ de 75% de células maduras)

2Moderadamente ceratinizado Moderado 2–3 Cordões sólidos ou ilhotas Moderado

(20 a 50% das células) (50 a 75% de células maduras)

3Mínima ceratinização Abundante 4–5 Pequenos grupos ou cordões Escasso(5 a 20% das células) (25 a 50% de células maduras) (>15 células)

4Ausência de ceratinização Extremo >5 Dissociação celular marcante Ausente

(0 a 5% das células) (0 a 25% de células maduras) (<15 células) *aumento de 400x.

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Análise imunoistoquímica

Vimentina

A vimentina é um filamento intermediário tí-pico das células de origem mesenquimal. No es-troma dos carcinomas epidermoides classificados com altos e baixos escores de malignidade, obser-vou-se sua expressão em todos os casos estudados, com graus variáveis de marcação com o anticorpo monoclonal antivimentina, que é positivo para cé-lulas endoteliais, fibroblastos, miofibroblastos e células musculares.

Nas lesões de baixos escores, predominou marca-ção de moderada a intensa, em virtude de maior núme-ro de componentes da matriz extracelular presentes, os quais indicavam organização mais predominante (Figura 1). Em apenas um caso foi observada fraca marcação para este anticorpo. Nos carcinomas com altos escores de malignidade, podia-se perceber maior número de casos com expressões de discreta a mode-rada (5) da vimentina em células próximas à frente de invasão neoplásica (Figura 2).

As células epiteliais neoplásicas foram posi-tivas em 6 casos (26%) da amostra total estudada. Esta marcação exibiu padrão discreto, e em 4 dos casos (66,6%) ocorreu principalmente nas células epiteliais próximas ao tecido conjuntivo subjacente, aparentemente desprovido de membrana basal. As le-sões restantes também expressavam a vimentina em áreas mais centrais do tumor. Constatou-se, assim, que se tratavam de lesões mais agressivas, com al-tos escores de malignidade e possuidoras de frente de invasão constituída po r células isoladas e menos diferenciadas.

Actina alfa de músculo liso

A actina alfa de músculo liso é um microfilamen-to presente no citoplasma das células musculares lisas, sendo parte integrante do seu sistema contrátil. Uma vez que os miofibroblastos apresentam fenótipos que expressam este microfilamento, o anticorpo monoclo-nal antiactina alfa de músculo liso foi utilizado com a finalidade de localizar estas células no estroma de car-cinomas epidermoides. A sua positividade é também observada na imunomarcação de células musculares lisas, células mioepiteliais e pericitos.

Na análise imunoistoquímica das secções exami-nadas de carcinomas epidermoides, com altos e bai-xos escores de malignidade, observou-se positivida-de do anticorpo no endotélio dos vasos sanguíneos, distribuídos por todo o estroma das lesões analisadas, principalmente nas de altos escores de malignidade. Somente dois casos sugeriram presença de miofibro-blastos no estroma tumoral por apresentarem reação positiva para células fusiformes. Observou-se também positividade em algumas células que se localizavam próximas a vasos e capilares em brotamento, seme-lhantes a pericitos. Esses dois casos, especificamente, tratavam-se de carcinomas mais agressivos, com in-tensa proliferação vascular. As células do parênquima tumoral não expressaram positividade à imunomarca-ção para este anticorpo (Figuras 3 e 4).

Desmina

A desmina é outro filamento intermediário intracitoplasmático com função contrátil das cé-lulas musculares, sendo um dos marcadores utili-zados na identificação de diferentes fenótipos de miofibroblastos.

Figura 1 - Visão geral da expressão da vimentina em células de ori-gem mesenquimal no estroma de carcinoma epidermoide com baixo escore de malignidade (Streptavidina biotina, 100x).

Figura 2 - Frente de invasão de carcinoma com alto escore de ma-lignidade. Pouca expressão da vimentina em células da matriz con-juntiva (Streptavidina biotina, 400x).

Figura 3 - Visão panorâmica de carcinoma de língua com alto es-core de malignidade. Observar marcação do anticorpo antiactina alfa de músculo liso em um grande contingente de células fusi-formes (Streptavidina biotina, 100x).

Figura 4 - Detalhe da frente de invasão com presença de células actino-positivas (Streptavidina biotina, 400x).

Figura 5 - Detalhe das células fusiformes desmino-positivas (Streptavidina biotina, 400x).

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Em todos os casos estudados não foi possível ob-servar a positividade deste marcador em células com características de miofibroblastos. Nas lesões de língua, observou-se células musculares esqueléticas desmino-positivas de forma alongada, com núcleos arredonda-dos e citoplasma volumoso, localizados entre as ilhas tumorais (Figura 5). Assim como a actina alfa de mús-culo liso, as células neoplásicas não foram positivas para este marcador.

Análise da microscopia eletrônica de transmissão

Os achados ultraestruturais nos casos estudados não revelaram a presença de células com caracterís-ticas de miofibroblastos, uma vez que não foram vi-síveis células fusiformes, com núcleos denteados e membrana com regiões eletrodensas em sua extensão, formando uma estrutura semelhante a uma segunda

membrana descontínua, com junções celulares e um sistema contrátil desenvolvido. Uma observação in-teressante em alguns dos casos analisados de carci-noma de língua foi a presença de células alongadas,

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volumosas, com núcleos arredondados e denteados, mas que apresentavam membrana dupla contínua. Estas células mostravam um sistema contrátil bastante desenvolvido, com a presença de miofilamentos dis-tribuídos por toda a extensão do citoplasma, o que é característico nas células musculares. O retículo en-doplasmático rugoso não se encontrava ativo. Estas células estavam isoladas e se localizavam em toda a extensão do estroma tumoral, apesar de não serem vi-síveis em grandes quantidades.

Era possível observar ampla quantia de fibroblas-tos típicos, que se mostravam como células alongadas, do tipo fusiformes, com núcleos ovóides, e que apre-sentavam retículo endoplasmático rugoso volumoso, ocupando grande parte do citoplasma celular. Este fato sugere que as células estavam em intensa atividade de síntese. Os fibroblastos permeavam todo o estroma tu-moral, sendo também encontrados próximos à frente de invasão neoplásica e, por vezes, entremeando as células epiteliais malignas.

As fibras colágenas eram visíveis em grandes quantidades, formando feixes dispostos de forma para-lela, apresentando a periodicidade típica dos colágenos. Outras se dispunham em sentido transversal. Menos or-ganizadas eram as poucas fibras elásticas distribuídas por toda a extensão da matriz. Em algumas regiões, se registrava a presença de uma matriz extracelular frou-xamente organizada, com grandes espaços “vazios”, possivelmente preenchidos por proteoglicanas. Outra verificação muito frequente foi a presença de pequenos capilares e vasos sanguíneos, que permeavam todo o estroma tumoral .

As células epiteliais tumorais eram visíveis em pe-quenos grupos e, algumas vezes, isoladas. Apresentavam atipias características, com formas irregulares, citoplas-mas desorganizados e núcleos com excesso de croma-tina. Algumas ainda exibiam junções celulares. O infil-trado de células monomorfonucleares do tipo linfócito era, em algumas lesões, predominante e permeava todo o campo examinado, inclusive entremeando os grupos de células epiteliais. Foi ainda observada a presença de macrófagos e mastócitos.

Discussão

O carcinoma epidermoide é a neoplasia maligna mais frequente da cavidade oral. O comportamento tumoral desta patologia parece ser influenciado tan-to por suas características clínicas quanto por mo-dificações das células do parênquima tumoral e da

matriz extracelular, daí a necessidade sempre urgen-te de estudos cada vez mais aprofundados sobre esta patologia9,18,24.

Os miofibroblastos são células presentes em abundância na matriz extracelular durante o reparo tecidual, e tem sido objeto de inúmeras investigações científicas4,6. Nesta condição, as células passam a ser expressivas a partir do 4º dia da ferida, aumentando até o 15º dia, e, a partir daí, decrescem gradualmen-te5. Porém, são poucos os estudos que caracterizam a presença das células no estroma de lesões neoplási-cas orais. Tem sido relatado que a matriz extracelular de carcinomas de mama, pulmão e estômago reflete o mesmo padrão de organização do reparo tecidual. Desta forma, segundo Schürch et al.17, os miofibro-blastos têm sido identificados em carcinomas quando associados a um estroma “jovem”, com poucas fibras colágenas, podendo ser escassos ou ausentes quando elas se tornarem maduras.

A heterogeneidade do citoesqueleto dos miofi-broblastos em diferentes condições patológicas é bem conhecida12,19,23. No reparo tecidual, o fenótipo de mio-fibroblasto caracterizado inicialmente como vimentina-positivo é substituído na fase de contração pelo fenóti-po vimentina/actina. Os miofibroblastos cujos fenótipos expressam vimentina/desmina/actina são menos obser-vados nesta condição16. Em crescimentos neoplásicos, o fenótipo vimentina/actina vem sendo identificado mais frequentemente.

Todos os casos de carcinomas epidermoides aqui estudados foram considerados vimentina-positivos para as células mesenquimais, assim como os estudos de Rabanal et al.13, Azumi et al.3 e Tuxhorn et al.20. A expressão da vimentina foi mais acentuada nos tumo-res com graus histológicos mais baixos de malignida-de, possivelmente porque a matriz ainda apresentava-se mais organizada e celularizada. Nas lesões mais agres-sivas, apesar da vimentina ter sido menos evidente no estroma tumoral, observou-se marcação positiva também das células epiteliais malignas nos casos que possuíam padrão de invasão mais agressivo. Alguns autores tentaram correlacionar a expressão da vimen-tina no estroma de carcinomas com o prognóstico das neoplasias, e observaram que nos casos que haviam ex-pressão desta proteína nas células epiteliais malignas, os tumores exibiam altas taxas de proliferação celular e se tratavam de carcinomas pouco diferenciados13,14,20. A presença da vimentina nas células epiteliais malignas demonstra perda da diferenciação celular e da inibição por contato destas células. Essa expressão positiva no

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parênquima tumoral das lesões de boca do nosso estudo pode ser atribuída a alterações fenotípicas das células epiteliais malignas.

Em cultura de células neoplásicas do carcinoma epidermoide de boca, observou-se que a liberação de interleucinas e citocinas como TGF-β1, TGF-β, IGF-α, por essas células, resultou na transdiferenciação de fibroblastos em miofibroblastos, semelhante ao que ocorre em tumores mamários e de próstata. Na análise imunoistoquímica, evidenciou-se expressão de actina alfa de músculo liso em células de grandes dimensões e presença de numerosas extensões citoplasmáticas9. No entanto, no estudo não foi realizada análise ultraestrutu-ral para evidenciação dos miofibroblastos.

Nesta pesquisa, os carcinomas epidermoides inves-tigados da cavidade oral se caracterizaram clinicamen-te como lesões exofíticas, muitas vezes ulceradas com ausência de retração e de desmoplasia. Nas neoplasias classificadas com baixos escores de malignidade, em que a matriz extracelular ainda exibia melhor organi-zação de seus componentes, não foram observadas cé-lulas com características imunoistoquímicas e ultraes-truturais de miofibroblastos. No entanto, em dois casos de lesões mais agressivas, caracterizadas por escores mais altos de malignidade, observou-se positividade para actina alfa de músculo liso em células fusiformes próximas à frente de invasão, sugerindo presença de miofibroblastos. Segundo Kellermann et al.9, estas cé-lulas estão significantemente elevadas no estroma de tumores que exibem maior expressão de células Ki-67 positivas. Ademais, apesar destas células estarem mais presentes no estroma de tumores, com maior índice de proliferação celular, não foi encontrada associação di-reta entre a presença de miofibroblastos e a sobrevida do paciente13.

Em nosso estudo, além da vimentina e actina alfa de músculo liso, os anticorpos antidesmina foram tam-bém utilizados com o objetivo de identificar os três fe-nótipos principais de miofibroblastos. Enquanto a vi-mentina foi um filamento intermediário verificado em todas as células de origem mesenquimal no estroma dos carcinomas estudados, inclusive nas células actino-positivas das duas lesões mais agressivas supracitadas, a desmina não expressou positividade em nenhum dos casos pesquisados.

Os resultados de análises de localização de mio-fibroblastos baseados somente em recursos imunois-toquímicos utilizando-se marcadores específicos, de-vem ser interpretados com cuidado e criticamente.

Vered et al.21, ao analisarem o estroma de tumores e cistos odontogênicos por meio da imunoistoquímica, afirmaram ter encontrado miofibroblastos somente com a marcação da proteína actina alfa de músculo liso. Sabe-se que algumas características inerentes aos miofibroblastos não podem ser evidenciadas tão facilmente com apenas um único marcador, sendo necessário o uso de outros recursos, em especial, a análise por microscopia eletrônica de transmissão. A imunoistoquímica tem diversas limitações, já descri-tas na literatura, e os miofilamentos expressos pelos miofibroblastos podem também ser evidenciados em células musculares lisas, mioepiteliais e pericitos. Em 1972, já se definiam as características dos miofibro-blastos pelo uso da microscopia eletrônica de trans-missão7. A partir daí, os estudos para identificação dos miofibroblastos em diversas patologias, incluindo o estroma tumoral, passaram a fazer uso deste recurso ultraestrutural2,6,7.

Por meio de revisão da literatura, observou-se que apenas Eyden6 realizou análise ultraestrutural na pes-quisa de miofibroblastos em carcinomas orais. Em seu estudo, componentes básicos foram determinados para classificar miofibroblastos pelo método ultraestrutural, a saber, proeminente rugosidade do retículo endoplas-mático, aparelho de Golgi produzindo grânulos de se-creção de colágeno, miofilamentos na periferia, cruza-mentos fibronexus e junções GAP.

Na presente pesquisa, além dos recursos imu-noistoquímicos, utilizou-se também a microscopia eletrônica de transmissão para analisar o estroma tumoral dos carcinomas epidermoides, com o obje-tivo de dissipar dúvidas quanto à real existência de miofibroblastos. Observou-se que a vimentina foi ex-pressa positivamente em todas as lesões estudadas e a sua presença em células fusiformes poderia estar relacionada a um dos fenótipos de miofibroblastos. Além disso, os casos actino-positivos suscitou maior interesse na confirmação ultraestrutural destas célu-las. Procedeu-se, então, extensa busca de células do estroma tumoral com características ultraestruturais de miofibroblastos nas regiões próximas da frente de invasão neoplásica, de acordo com as características citadas acima. A análise dos cortes ultrafinos reve-lou a presença de fibroblastos típicos, em intensa atividade de síntese. Foi frequente a observação dos feixes colágenos, organizados em íntima associação com estas células. As quantidades expressivas de vasos e capilares constituíram outro achado interes-sante. Apesar das verificações imunoistoquímicas

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evidenciarem a marcação de miofilamentos em dois casos, características ultraestruturais típicas dos mio-fibroblastos não foram observadas. Esta ausência de características ultraestruturais e a proximidade das células actino-positivas aos vasos nos faz concluir que se tratavam de pericitos ou mioblastos, células que também expressam miofilamentos.

O estroma sofre diversas modificações durante o processo de invasão neoplásica6,18. A região próxima à frente de invasão tumoral constitui área com maior quantidade de alterações observáveis, por se tratar do local que primeiro sofre as influências das células epi-teliais malignas4,11. Isto também confirma a existência de um sistema interativo entre parênquima e estroma tumoral, responsável por estas alterações.

conclusão

Neste estudo preliminar, os achados imunoistoquí-micos apenas sugeriram a presença de miofibroblastos no estroma de carcinomas epidermoides bucais, embora não fossem confirmados na análise ultraestrutural. A expres-são da vimentina em células neoplásicas malignas como forma de perda da diferenciação celular é confirmada-mente um auxiliar de prognóstico. Este achado e outros resultados desta pesquisa devem ser considerados ao se fazer uma avaliação completa de cada indivíduo portador de carcinoma epidermoide da cavidade oral. Entendemos que novos estudos com maior número de casos, e também com a utilização de recursos ultraestruturais, método mais fidedigno na identificação dos miofibroblastos, sejam fun-damentais na confirmação dos nossos achados.

abstRact

Analysis myofibroblasts in the stroma of squamous cell carcinoma of mouth

The tumor stroma undergoes changes during the progression of malignant neoplasia. Changes in the extra-cellular matrix and the presence of myofibroblasts appear to influence the processes of invasion and metastasis of malignant tumors that characterize the oral. The objective was to investigate the presence of myofibroblasts in front of invasion in squamous cell carcinoma of mouth, through transmission electron microscopy and immunohis-tochemical markers. In this study, 23 cases of squamous cell carcinoma of the mouth from various locations were classified according to a histological grading system. Were used by hematoxylin-eosin (HE) staining and immu-nohistochemical expression of vimentin, the alpha smooth muscle actin and desmin were analyzed in lesions with different histological scores of malignancy. The transmission electron microscopy was used to confirm the presence of cell-type myofibroblasts in tumor stroma. The expression of vimentin showed different patterns of squamous cell carcinoma of the oral cavity with high and low scores of malignancy. The alpha-smooth muscle actin was present in some cases. Although the alpha smooth muscle actin has suggested the presence of myofibroblasts in the stroma of squamous cell carcinoma of the oral cavity, ultrastructural analysis did not confirm this result.

DescRiptoRs

Carcinoma. Microscopy, electron. Myofibroblasts.

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Recebido em: 27/6/11 Aceito em: 8/1/2012

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