Anatomia Patolgica, Citolgica e Tanatolgica

Tcnica Citolgica

Ano letivo 2013/2014

Citologia de Base Lquida Vantagens e desvantagens, aplicaes da tcnica e

comparao de tcnicas

Cludia Ribeiro, n 10120118

Daniela Figueira, n 10120120

Maria Costa, n 10120129

Vila Nova de Gaia, 11 de Dezembro de 2013

1

ndice

1. Citologia de base lquida ........................................................................................................ 2

2. Diferentes tcnicas de citologia de base lquida ................................................................ 3

2.1. ThinPrep ........................................................................................................................ 3

2.2. DNAcitoliq ..................................................................................................................... 4

2.3. CytoRich ........................................................................................................................ 6

2.4. LiquiPrep ....................................................................................................................... 7

2.5. BD SurePath ................................................................................................................ 9

2.6 Shandon PapSpin ...................................................................................................... 11

3. Comparao entre as diferentes tcnicas de citologia de base lquida ........................ 12

4. Referncias Bibliogrficas .................................................................................................... 13

2

1. Citologia de base lquida

A Citologia o estudo da estrutura morfolgica e funcional das clulas (1). A citologia convencional uma tcnica bem conhecida e utilizada, sobretudo, na rotina de citologias ginecolgicas, introduzida por George Nicholas Papanicolaou. No entanto, esta tcnica possui um ndice elevado de resultados falsos-positivos e falsos-negativos, podendo ser considerada um teste de qualidade inferior. A qualidade associada citologia convencional est diretamente associada ao modo como so feitos a colheita e o esfregao: o material da amostra pode no pertencer zona da leso (no representativo), a qualidade da amostra pode-se apresentar reduzida (obscurecimento por fundo hemorrgico, inflamao e/ou m fixao), a transferncia de clulas para a lmina pode ser incompleta ou os esfregaos muito espessos (o que leva a uma sobreposio celular), entre outros. Estes fatores, isolados ou conjugados, tornam-se um entrave observao dos detalhes morfolgicos, surgindo erros na interpretao e leitura das lminas obtidas (2; 1). O facto da citologia convencional ser uma metodologia menos sensvel e mais trabalhosa em relao a outros mtodos, impulsionou a pesquisa para o desenvolvimento de novas tcnicas de rastreamento alternativas ou coadjuvantes. A citologia de base lquida foi introduzida como uma alternativa utilizao do mtodo convencional. Esta baseia-se no processamento de clulas que so inicialmente imersas numa soluo lquida conservante e, posteriormente, transferidas para uma lmina histolgica. uma tcnica muito aplicada na citologia esfoliativa, onde se obtm bons resultados, nomeadamente nos tratos pulmonar, urinrio, gastrointestinal e na boca (3; 1). Com o implemento da citologia de base lquida pretende-se melhorar alguns aspectos negativos da citologia convencional e atingir-se algumas vantagens como a simplificao da tcnica de amostragem, permitindo a obteno de lminas representativas para diagnstico e a diminuio de artefactos celulares (levando a uma menor quantidade de diagnsticos inadequados) (3). Diferentes tcnicas de citologia em base lquida, aprovadas pela FDA (United States Food and Drugs Administration), tm sido desenvolvidas para a utilizao de uma soluo estvel na preservao do material colhido e na preparao de lminas (1).

3

2. Diferentes tcnicas de citologia de base lquida

2.1. ThinPrep

O ThinPrep um teste de Papanicolaou de base lquida, onde utilizado

um meio lquido para preservar as clulas. Este teste envolve um processo

automatizado para eliminao de contaminantes e permitir uma distribuio

representativa uniforme, em camada fina, numa lmina (4).

Este teste melhora a qualidade da amostra, preparando a lmina de forma

mais apropriada para permitir o diagnstico. Apresenta, ainda, uma grande

clareza e facilidade de leitura, diminuindo a quantidade de sangue, muco e outros

contaminantes, pelo que confere uma maior preciso, tanto para a avaliao

manual como computadorizada das clulas. Deste modo, aumentada a

qualidade da lmina e so eliminados erros tcnicos comuns, associados com a

preparao da amostra (4).

Na citologia convencional, o clnico faz a colheita de uma amostra com um

aparelho de colheita e espalha uma poro da amostra na lmina. Deste modo,

as preparaes convencionais podem ficar, frequentemente, cobertas com

sangue e muco, que dificultam a observao celular. Para alm disso, se as

clulas no forem imediatamente fixadas, podem ocorrer artefactos de secagem.

A isto acresce-se o facto de, aquando do descarte do aparelho utilizado para a

colheita, por vezes, perdida mais de 80% da amostra do paciente (4).

Por sua vez, com o ThinPrep , o clnico faz a colheita da amostra utilizando

um utenslio semelhante a uma escova ou uma combinao de escova/esptula.

No entanto, em vez de ser descartada parte deste utenslio, aps transferncia da

amostra para uma lmina, todo o utenslio mergulhado num frasco de soluo

preservante; pelo que, teoricamente, toda a amostra de clulas aproveitada. A

amostra enviada para o laboratrio, onde um processador automtico prepara a

lmina, dispersando e filtrando a amostra, transferindo uma poro representativa

da mesma para a lmina; assegurando a representatividade da amostra e

reduzindo contaminantes que dificultem o diagnstico (como sangue e muco) (4).

4

Figura 2: Comparao entre os resultados obtidos pela tcnica de citologia convencional (A) e pelo mtodo ThinPrep (B).

2.2. DNAcitoliq

De modo semelhante ao mtodo anteriormente mencionado, o DNAcitoliq tambm um mtodo de citologia de base lquida, que visa melhorar os resultados obtidos pela citologia convencional, com utilidade na citologia oncolgica (como no caso do cancro do colo do tero) e na deteo molecular de DNA de HPV, Neisseria gonorrhoea e Clhamydia trachomatis. (5; 6). Foram j feitos alguns estudos, onde abordado o desenvolvimento de meios conservantes que permitam a avaliao diagnstica, com o preparo de amostras citolgicas com preservao da morfologia e evitando o fundo indesejado (muco, hemorragia e infiltrado inflamatrio), para alm de permitir a realizao de testes moleculares (como captura hbrida e PCR) e avaliao da existncia de leses epiteliais, com uma nica colheita (5; 6). Num estudo (Sistema DNA-Citoliq (DCS): Um novo sistema para citologia em base lquida - aspectos tcnicos) referido que, com esta tcnica, a amostra em base lquida homogeneizada, utilizando-se, para isso, o vrtex; com o objetivo de destacar as clulas aderidas escova utilizada para fazer a colheita da amostra e para se obter uma amostra celular aleatria. No mesmo estudo, referida a possibilidade de preparao de 12 amostras em simultneo (5). A sensibilidade e a especificidade dos mtodos moleculares realizados nas amostras colhidas em meios desenvolvidos para a citologia de base lquida

A B Figura 1: Comparao entre a tcnica de citologia convencional (A) e o ThinPrep (B).

5

apresentam-se muito elevadas, pelo que esses mtodos podero, eventualmente, ser associados s rotinas laboratoriais na investigao ginecolgica de doenas sexualmente transmissveis (6). Num estudo em que eram comparados os resultados obtidos pelos mtodos de citologia convencional e DNAcitoliq (com diferentes tempos no vrtex), foram registados bons resultados para o segundo mtodo: na maioria dos casos, as amostras apresentavam-se distribudas de modo homogneo, com extensas reas de aspecto regular e distribuio em camada fina (tendo-se, no entanto, observado tambm alguma sobreposio celular). Todavia, a morfologia celular era facilmente interpretvel devido preservao da policromasia citoplasmtica. Tambm as caractersticas nucleares se apresentavam bem preservadas e claramente identificveis. Para alm disso, comparativamente aos esfregaos convencionais, as amostras preparadas pelo mtodo DNAcitoliq com os tempos de vrtex de 5 e 20 segundos demonstraram nmero significativamente menor de reas vazias (5). Com esse estudo, foi verificado que, com o sistema DNAcitoliq , as clulas preservadas no meio lquido desenvolvido, em determinados protocolos testados, apresentaram-se, regra geral, como pelculas finas com os detalhes morfolgicos bem preservados. tambm referido nesse estudo que a avaliao das clulas epiteliais mais fcil, devido reduo de factores que obscurecem a observao microscpica; havendo tambm uma melhor distribuio celular (5). No que se refere ao desempenho na identificao dos agentes infecciosos acima mencionados, um estudo (Citologia de base lquida pelo sistema DNA-Citoliq (DCS) - Eficcia na identificao da microbiota vaginal) refere que os resultados do DNAcitoliq foram semelhantes ao convencional, excepto para alguns microrganismos (sendo referida a possibilidade de isso se dever maior experincia dos observadores para os esfregaos convencionais). Concluem, assim, que este sistema se apresenta similar ao convencional (6).

Figura 3: Comparao dos resultados obtidos pela tcnica de citologia convencional (A) e pelo mtodo

DNAcitoliq (B).

6

2.3. CytoRich

CytoRich um sistema de fixao base de etanol, usado na colheita,

preservao, hemlise, transporte e transferncia de amostras citolgicas para

uma lmina de vidro. uma tcnica aplicada, preferencialmente, em amostras

no-ginecolgicas, como lavados, escovados (e outros mtodos de colheita

abrasivos), fludos corporais (hipercelulares, hipocelulares e/ou hemorrgicas) e

bipsias aspirativas (7).

Este sistema de preservao est comercialmente disponvel sob a forma de

CytoRich Red Preservative e de CytoRich Blue Preservative. O primeiro um

fixador hemoltico destinado ao tratamento de material citolgico e pequenas

bipsias (principalmente bipsias aspirativas de agulha fina), cujos princpios

ativos incluem lcoois, formaldedo, aditivos no txicos, emolientes e solues

tampo. Conserva clulas e pequenos fragmentos tecidulares em suspenso para

exames histolgicos e citolgicos, atravs da solubilizao de protenas e da lise

de eritrcitos. Preserva a morfologia geral das clulas no-ginecolgicas e

conserva a amostra por longos perodos de tempo (at dois anos) e de forma

compatvel com as coloraes imunohistoqumicas, ao permitir resultados

semelhantes aos obtidos com formalina tamponada neutra. Numa fase inicial, as

clulas so recolhidas numa soluo salina fisiolgica, por exemplo, e podem ser

tratadas com anticoagulantes (por exemplo, heparina) para inibir a formao de

cogulos de fibrina. Concentra-se a suspenso de clulas ao submet-la

centrifugao convencional. Aps descarte do sobrenadante e obteno de uma

soluo homognea de clulas, transferem-se cerca de 5 a 10 gotas desta para

10 mililitros de CytoRich Red Preservative, sendo que amostras hipocelulares,

como o LCR, podem ser preservadas em quantidades inferiores (1 mililitro). A

amostra torna-se estvel para aguentar vrias semanas, sendo que, antes de

utilizada deve repousar pelo menos 30 minutos. aconselhado o sistema de

tratamento de lminas PrepStain para a colorao (7; 8).

A soluo CytoRich Blue Preservative tem como objetivos a conservao

de clulas em suspenso e respetiva preparao para anlise biolgica.

habitualmente utilizada em amostras de urina e amostras no-hemolticas. A

despistagem citolgica destas amostras implica a sua fixao no CytoRich Blue

Preservative, a concentrao das mesmas por centrifugao, a colocao em

lminas e a respetiva colorao, tornando possvel a sua visualizao ao

microscpio. O tempo mnimo recomendado de conservao , tambm, de 30

minutos, mas as amostras citolgicas permanecem estveis durante catorze dias,

no mximo, temperatura ambiente. , por isto, um fluido de preservao

citolgica recomendado para a citologia de rotina (7; 9).

7

As amostras citolgicas devem ser fixadas em CytoRich imediatamente

aps a colheita para evitar degradaes que podero conduzir a um exame

citolgico insatisfatrio. Por outro lado, o fluido constituinte do CytoRich Red

no deve ser utilizado na fixao de fragmentos com um dimetro mdio superior

a 5 mm e a utilizao do CytoRich no aconselhada na substituio de outros

mtodos de acondicionamento que permitam esfregaos cervicais citolgicos (7;

8; 9).

2.4. LiquiPrep

O LiquiPrep Cytology Processing Kit uma combinao de diferentes

solues que permite a prtica de citologia de base liquida sem necessidade de

vcuo, filtros e plsticos descartveis. Este mtodo combina uma soluo

preservante (LiquiPrep Preservative Solution), uma mistura diluda de lcool

desnaturado, utilizada na colheita e transporte da amostra citolgica; uma soluo

lquida de limpeza (LiquiPrep Cleaning Solution) para a remoo de sangue e

outro produto; e uma soluo adesiva (LiquiPrep Cellular Base Solution) que

proporciona, como o prprio nome indica, uma melhor adeso das clulas da

amostra lmina (10; 11).

A soluo preservante utilizada neste mtodo pode ser utilizada em

Biologia Molecular e em Imunohistoqumica, uma vez que permite a realizao

das tcnicas a estas reas associadas, sem interferncias nas reaes e

resultados. constituda por diferentes solues - o reagente Lytic para limpar o

sangue e o muco das amostras e um antibacteriano que evita o crescimento

bacteriano durante o transporte da amostra. Para alm disso, conserva a amostra

cerca de 90 dias, sem alteraes morfolgicas das clulas (10).

A soluo de limpeza permite, aps centrifugao, a formao do pellet

com as clulas clinicamente relevantes, ao manter o sangue e o muco na

superfcie da mesma. Para amostras mais concentradas em muco e sangue

utiliza-se o reagente Lytic. Este permite que a separao de componentes seja

mais eficiente. Estas solues evitam a utilizao de filtros e permite o

processamento da toda a amostra (10).

A aderncia da amostra celular s lminas de vidro proporcionada pela

soluo adesiva, sem que seja necessrio o tratamento prvio das clulas nem a

utilizao de lminas de vidro especiais. Esta soluo controla a concentrao

das clulas depositadas na lmina e assegura a presena do nmero de clulas

suficientes ao diagnstico quando se trabalha com amostras pouco celulares,

atravs da variao do volume da soluo utilizado. compatvel com os

8

procedimentos de colorao habitualmente utilizados e permite a realizao de

mtodos moleculares no diagnstico do HPV e na pesquisa do oncogene ErbB2

responsvel pelo cancro da mama, por exemplo, e mtodos de imunohistoqumica

(10).

O LiquiPrep Cytology Processing Kit permite a concretizao de

diferentes procedimentos de acordo com as especificidades das amostras

clnicas, visto que pode ser utilizado no processamento de colheitas cervicais,

fludos corporais de grande e pequeno volumes, escovas de colheita bronquial e

outros coletores, bipsias aspirativas e de agulha fina e escarro. Regra geral,

depois da colheita, a amostra dever ser diretamente preservada no frasco do

LiquiPrep Preservative Solution, ou colocada neste uma hora antes do

processamento. Depois de preservada, a amostra deve ser centrifugada e o

sobrenadante descartado. Ao pellet celular, obtido no passo anterior, adicionada

a LiquiPrep Cellular Base Solution e a amostra bem misturada recorrendo-se

ao vrtex. Por fim, adicionam-se lmina 50L da suspenso homogeneizada

que, depois de seca, corada e observada a microscpio. A LiquiPrep Cleaning

Solution s deve ser adicionada ao tubo de centrifugao, antes da centrifugao,

no processamento de amostras muito mucosas, como lavagens bronquiais,

escarro ou amostras ginecolgicas (10; 11).

Figura 4: - Imagem comparativa de amostras processadas segundo a citologia convencional (A) e segundo a

citologia de Base Liquida (B), ambas coradas com mtodo de colorao Papanicolaou.

Figura 5: Exemplo de diferentes lminas para diagnstico cujo armazenamento e processamento foi feito por

LiquiPrep .

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2.5. BD SurePath

O SurePath de base lquida um teste de Papanicolaou simples, padronizado e eficiente (12).

O SurePath Pap Test compreende 3 passos fundamentais para a realizao da colheita e processamento de uma amostra crvico-vaginal (13).

1- 1 - Colheita: Introduz-se a escova Cervix-Brush no canal endocervical e fazem-se movimentos de rotao no sentido horrio.

2- 2 - Descarte: Procede-se ao descarte da cabea da escova para dentro do frasco SurePath .

3- 3 - Envio: Coloca-se a tampa no frasco SurePath e aperta-se de modo a que este fique bem fechado. Coloca-se a informao do paciente no frasco e por fim, envia-se o mesmo para o laboratrio para a amostra ser processada.

No mtodo SurePath , a amostra cervico-vaginal imediatamente transferida para o frasco contendo uma soluo conservante alcolica (isopropanol, etanol e metanol) a qual, alm das clulas, conserva tambm o DNA, o RNA e as protenas, permitindo a realizao de testes

complementares como a PCR, a genotipagem e a captura hbrida (14; 12).

A tcnica do SurePath permite tambm fazer testes no mbito de doenas como o HPV e Tricomonas (12). Chegadas ao laboratrio, as amostras em meio lquido SurePath , permitem uma maior automatizao, padronizao e produtividade num laboratrio, uma vez que o processamento e a colorao da lmina so automatizados, o que permite fornecer resultados padronizados e de alta qualidade. O tempo de rastreamento e o tempo para a obteno dos resultados so reduzidos. Este mtodo apresenta uma alta produtividade (processamento de 96 lminas no-coradas a cada 64 minutos e de 48 lminas coradas por hora) aumentando a capacidade do laboratrio. O processador usado para preparar as lminas SurePath com amostras crvico-vaginais tambm usado para preparar amostras no-ginecolgicas, como por exemplo biopsias aspirativas com agulha fina, fludos de cavidades corporais e urina, suprindo assim todas as necessidades na rea de citologia (12). O teste de Papanicolaou em meio lquido SurePath reduz significativamente de 43% a 81%, o nmero de amostras insatisfatrias, diminuindo a necessidade de repetio do exame. O SurePath Pap Test tambm melhora a deteco de HSIL+. As HSILs so leses escamosas

Figura 6: Realizao da colheita de uma amostra cervico-vaginal.

10

intraepiteliais de alto grau. No so consideradas cancro mas, se no forem tratadas, podem evoluir para carcinoma. (12). O SurePath Pap Test um teste de citologia em meio lquido capaz de garantir que 100% da amostra colhida enviada ao laboratrio para processamento, no havendo deste modo perda de clulas de interesse para o diagnstico (12). Processo de enriquecimento celular patenteado BD SurePath Pap Test

O processo de enriquecimento celular patenteado BD SurePath Pap Test

permite separar e reduzir a quantidade de materiais que podem causar obscurecimento na leitura das lminas (como sangue e muco) e clulas inflamatrias, preservando a interpretao do fundo e proporcionando uma melhor e mais rpida visualizao das clulas de interesse.

No h necessidade de etapas extra no processamento das amostras com excesso de sangue ou muco, o que confere maior padronizao ao processamento de amostras e produz resultados mais confiveis (12).

Figura 7: Lmina convencional vs Teste de Papanicolaou em meio lquido BD SurePath aps enriquecimento celular.

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2.6 Shandon PapSpin

O Shandon PapSpin um outro teste de Papanicolaou de citologia de base lquida, que permite obter bons resultados no estudo de doenas como o Vrus do Papiloma Humano (HPV) (15).

O mtodo de colheita da amostra cervico-vaginal muito semelhante ao utilizado na tcnica anteriormente descrita, o SurePath , uma vez que o kit PapSpin vem tambm equipado com uma escova Cervix-Brush de cabea descartvel, que permite que toda a amostra recolhida no exame do Papanicolaou seja colocada dentro do frasco com a soluo conservante. Esta soluo funciona como um pr-fixador, capaz de manter a integridade da amostra. No final, a informao do paciente marcada no frasco e este, por sua

vez, enviado para o laboratrio para processamento (16).

No laboratrio, as amostras em meio lquido PapSpin so processadas por equipamentos automatizados, o que possibilita uma maior produtividade, havendo, por isso, uma reduo do tempo de espera para a obteno dos resultados. Esta tcnica de base lquida possibilita que 100% das clulas recolhidas sejam transferidas para o frasco, devido ao sistema de cabea descartvel da escova. compatvel com o cytospin, economicamente vivel e de fcil uso; eficaz e rpida, uma vez que permite o processamento de vrias amostras em simultneo (16).

Ao nvel das lminas, o PapSpin permite uma melhor representatividade celular da amostra recolhida, dada a aleatoriedade da tcnica, e possibilita a distribuio celular uniforme em camada fina, bem como a reduo de muco, sangue e inflamao, proporcionando uma melhor visualizao das clulas de interesse. (16).

Figura 9: Exame de Papanicolaou vs Shandon PapSpin.

Figura 8: Frascos e escovas "Cervix-Brush" de cabea descartvel.

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3. Comparao entre as diferentes tcnicas de

citologia de base lquida

A citologia de base lquida apresenta algumas vantagens face citologia

convencional, apresentando-se semelhante noutros aspetos. Ainda assim, dentro

das diferentes tcnicas de citologia de base lquida desenvolvidas, so referidas

caractersticas diferentes (1).

De um modo geral, a citologia de base lquida corresponde a um mtodo

com sensibilidade e especificidade acrescidas, apresentando ainda uma maior

facilidade de leitura das lminas e, consequentemente, diminuindo a percentagem

de falsos-negativos. Todavia, apresenta um custo econmico maior, algumas

limitaes no que se refere a alteraes do aspecto morfolgico de algumas

leses e o aumento da carga de trabalho da equipa tcnica (1; 3).

Assim sendo, os aspetos a salientar das diferentes tcnicas abordadas so

os apresentados na tabela a seguir:

Tabela 1: Comparao das particularidades e aplicabilidades das diferentes tcnicas de Citologia de Base

Lquida.

Tcnica

Particularidades Aplicabilidades

ThinPrep

Toda a amostra de clulas

aproveitada Citologias crvico-vaginais

DNAcitoliq

Possibilidade de realizao

de testes complementares

com uma s colheita

Citologia oncolgica

Deteo molecular de DNA

de HPV, Neisseria

gonorrhoea e Chlamydia

trachomatis

CytoRich

Fixador hemoltico

Preservao das amostras

at 2 anos

Amostras no ginecolgicas

Amostras em suspenso

LiquiPrep

Mistura de diferentes

solues

Lquido de limpeza

Doenas do trato vaginal

Realizao de mtodos

moleculares e

imunohistoqumicos

BD SurePath

Toda a amostra de clulas

aproveitada

Possibilidade de realizao

de testes complementares

com uma s colheita

Citologias crvico-vaginais

Citologias no ginecolgicas

Deteo de doenas como o

HPV e as tricomonas

Shandon PapSpin Toda a amostra de clulas

aproveitada

Citologias crvico-vaginais

Deteo de doenas como o

HPV

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4. Referncias Bibliogrficas

1. OAC, Brito. Citologia em Base Lquida versus Citologia Convencional. 2012.

2. Preliminary study concerning the cytoscreen system importance (Liquid Based

Cytology) in gynecologic cytology. Popescu CF, Badulescu A, Badulescu FL,

Cotarcea S, Gavanescu M. 20 de Maro de 2005, Romanian Journal of

Morphology and Embryology.

3. Campagnoli EB, Sandrin R, Frana BHS, Sassi LM, Machado MAM, Lima AAS.

Comparao entre a citologia em base lquida e citologia esfoliativa convencional

no diagnstico de carcinomas da regio de cabea e pescoo. ISSN. Maro de

2011, pp. 65-71.

4. The ThinPrep PAP Test. HOLOGIC. [Online] 2010. [Citao: 16 de Outubro de

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5. Longatto-Filho A, Namiyama G, Filho AC, Viann MR, Dres BD, Taromaru E.

Sistema DNA-Citoliq (DCS): Um novo sistema para citologia em base lquida -

aspectos tcnicos. 2005.

6. Alves VAF, Filho AC, Namiyama G, Filho AL, Vianna MR, Taromaru E, Dres

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identificao da microbiota vaginal. 2004.

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11. Sistema de Citologia Lquida de Segunda Gerao. [Online] [Citao: 24 de

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14

12. BD. BD SurePath Pap Test. [Online] [Citao: 4 de Novembro de 2013.]

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14. DMED News. DMED. [Online] [Citao: 4 de Novembro de 2013.]

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15. Weynand B, Berlire M, Haumont E, Massart F, Pourvoyeur A, Bernard P,

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http://www.thermo.com/eThermo/CMA/PDFs/Various/File_24264.pdf.