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Trabalho 2 Cromatografia 15 16TRANSCRIPT
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SEPARAÇÃO DE COMPOSTOS BIOLÓGICOS POR CROMATOGRAFIA
1ª sessão I. Cromatografia de filtração em gel
I.1. Introdução
O método de filtração em gel, baseado no efeito de peneira molecular, é um método usado para a separação de substâncias de acordo com o tamanho e forma moleculares. Estas peneiras moleculares são redes porosas tridimensionais, constituídas por cadeias lineares de polímeros que se entrecruzam e formam a matriz do gel. Os géis mais usados são os obtidos pela polimerização de cadeias de polissacáridos (Sephadex) ou os constituídos pela polimerização de cadeias de poliacrilamida (Biogel). Quando estas peneiras moleculares se colocam em água, incham e formam o gel. As partículas que formam o gel têm poros e o tamanho dos poros é função do grau de entrecruzamento das cadeias de polímeros. A possibilidade de variar o tamanho do poro torna este método útil para a separação de diferentes substâncias e a sua utilização na determinação das massas moleculares das mesmas.
A facilidade de uma molécula de soluto penetrar na rede do gel é função do seu tamanho e forma molecular. Quando as moléculas são demasiado grandes para penetrar na matriz do gel, elas passam somente no volume de líquido fora do leito (Vo). Quando as moléculas são suficientemente pequenas elas podem penetrar em quase todo o volume interior do leito (Vi).
Se o volume das partículas de gel for (Vg), então o volume total (Vt) do leito será:
Vt = Vo + Vi + Vg
Se for colocada uma mistura de macromoléculas na parte superior de uma coluna cheia de gel, e se se deitar tampão para provocar a sua eluição, as moléculas começarão a sair da coluna com o tampão em fracções diferentes e por ordem decrescente do seu tamanho molecular. A filtração em gel é pois uma técnica muito usada na separação de misturas de macromoléculas de massas moleculares diferentes e especialmente utilizada no isolamento e purificação de proteínas.
TABELA 1. ALGUNS TIPOS DE SEPHADEX E RESPECTIVOS LIMITES DE EXCLUSÃO MOLECULAR
Tipo de Sephadex Massa Molecular (kDa)
Limite Inferior Limite Superior
G-‐10 – 0,7
G-‐15 – 1,5
G-‐25 1 5,0
G-‐50 1,5 30,0
G-‐75 3,0 70,0
G-‐100 4,0 150,0
G-‐150 5,0 400,0
G-‐200 5,0 800,0
Comercialmente encontram-‐se preparações de géis com vários tamanhos de poro permitindo separar macromoléculas de diferentes massas moleculares. Na tabela 1 são apresentados vários tipos de Sephadex utilizados na separação de proteínas. Por exemplo, o Sephadex G-‐25 tem poros relativamente pequenos e
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exclui moléculas de massas moleculares (MM) superiores a 5000 Da. É um gel útil na separação de moléculas de MM compreendidas entre 1000 e 5000 Da. O Sephadex G-‐200 só exclui moléculas com MM superiores a 800000 Da e é utilizado na separação de massas moleculares entre 5000 e 800000 Da. Entre estes dois tamanhos existe uma grande gama intermédia de poros que permite a separação mais fina dentro de gamas de MM mais estreitas.
Numa separação as macromoléculas são eluídas em fracções diferentes e por ordem decrescente da sua MM podendo estabelecer-‐se relações empíricas entre o volume de solvente necessário para a sua eluição (Ve) e a respectiva MM. Esta relação é empírica e varia para as diferentes classes de macromoléculas (polissacáridos, proteínas globulares, etc.). Para as proteínas globulares verificou-‐se que essa relação é traduzida por:
Ve = A log10(MM) + B
em que A e B são constantes, tendo A um valor negativo. Esta relação só é válida num domínio restrito de MM. Assim Ve terá um valor mínimo igual ao Vo quando a proteína tem uma MM superior ao limite máximo de exclusão do gel. Para proteínas com MM dentro dos limites de exclusão do gel, o volume Ve aumentará com a diminuição da massa molecular. Proteínas com MM inferior ao limite mínimo de exclusão do gel são eluídas com o volume Ve=Vo+Vi. As constantes A e B são determinadas por calibração da coluna com pelo menos duas proteínas globulares de massa molecular conhecida.
I.2. Cromatografia de filtração em gel e sua utilização no tratamento químico de proteínas
A cromatografia de filtração em gel é também frequentemente utilizada no tratamento de proteínas com determinados reagentes (de MM muito inferior ao das macromoléculas). Assim, podemos carregar uma zona da coluna com um determinado reagente de modo que, a proteína ao mover-‐se e ao atravessar essa zona vá contactando sucessivamente com camadas de reagente novo tornando o processo de reacção mais eficiente. A separação entre a proteína e o excesso de reagente pode ser feita por eluição contínua.
I.3. Objectivo do trabalho
Neste trabalho vamos utilizar a técnica de filtração em gel com dois objectivos distintos:
i) Utilização do gel como suporte para uma reacção química entre uma proteína e reagentes químicos, conseguindo-‐se detectar as diferentes formas da hemoglobina.
ii) Separação entre a proteína e os reagentes.
Nesta experiência a oxihemoglobina (vermelho vivo) é tratada com ferricianeto de potássio (Fe(CN)63-‐) e transforma-‐se em metahemoglobina (castanha). Esta mistura é aplicada na coluna cromatográfica para separação. A metahemoglobina é posteriormente tratada na coluna com ditionito de sódio (Na2S2O4)
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resultando na conversão em desoxihemoglobina (púrpura) que é oxigenada à medida que percorre o gel, contactando com o oxigénio molecular que aí se encontra, dando origem a oxihemoglobina (vermelho vivo). AS DIFERENTES FORMAS DE HEMOGLOBINA
A função da hemoglobina (MM = 64500 Da) é a de transportar oxigénio dos pulmões para os tecidos e dióxido de carbono e H+ dos tecidos para os pulmões. A hemoglobina contém um grupo prostético hemo. O hemo contém um ião ferroso que está quelado no centro de um anel de porfirina. Os iões Fe2+ são mais estáveis quando é satisfeito um número de coordenação 6. Quatro das posições de coordenação são preenchidas pelos átomos de azoto do anel de porfirina, outra posição pela base de histidina (His) da cadeia polipeptídica da proteína e, na oxihemoglobina, a sexta posição é preenchida por oxigénio molecular.
Nesta experiência vão ser observadas três formas de hemoglobina: – Metahemoglobina -‐ nesta forma o ião Fe2+ no centro do anel de porfirina é oxidado à forma férrica
com ferricianeto. Esta forma não liga O2 e é rapidamente reconhecida pela sua cor castanha; – Desoxihemoglobina -‐ esta forma tem cor púrpura (roxo); – Oxihemoglobina -‐ hemoglobina oxigenada. Esta forma apresenta uma coloração vermelho viva.
As três formas podem ser interconvertidas de acordo com o esquema seguinte:
Redução Na2S2O4 Oxigenação Metahemoglobina desoxihemoglobina Oxihemoglobina
Oxidação Fe(CN)63-‐
I.4. Procedimento experimental
Reagentes
Sephadex G-‐50 equilibrada em 50 mM tampão fosfato pH=7, 0 50 mM Tampão fosfato pH = 7,0 (19,5 mL NaH2PO4 1 M, 30,5 mL Na2HPO4 1M, para 1 L) Ditionito de sódio: Solução 10 mg/mL preparada no tampão fosfato Ferricianeto de potássio (MM 329 g/mol) Solução de hemoglobina
Grupos metilo
Grupos vinilo
Grupos propionato
Anel pirrólico
Oxihemoglobina Desoxihemoglobina
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Preparação da coluna
Com a torneira fechada, transfira um pouco de tampão para a coluna e verifique que esta não se encontra entupida. Transfira para a coluna com a ajuda de uma vareta a suspensão de gel devidamente diluída com tampão. Abra lentamente a torneira e observe o empacotamento do gel. Vá adicionando mais gel, sem deixar formar interface, até que a zona já empacotada atinja uma altura de aproximadamente 20 cm. Feche a torneira. Depois de devidamente cheia a coluna deve ser lavada com tampão. Utilizando uma pipeta de Pasteur, deite o tampão cuidadosamente no topo da coluna e abra a torneira para deixar escorrer o excesso de tampão através do gel até que o nível esteja mesmo acima da superfície do leito. Feche a torneira. É muito importante não deixar secar a coluna durante todo este processo. Pipete cuidadosamente aproximadamente 0,2 mL da solução de ditionito de sódio para a superfície do gel. Abra a torneira para deixar o ditionito entrar na coluna até que o menisco atinja a superfície do gel. Feche a torneira. Logo a seguir pipete cuidadosamente 0,2 mL de tampão para a superfície da coluna. Abra a torneira para deixar o tampão entrar na coluna até que o menisco atinja a superfície do gel. Feche a torneira.
Preparação e eluição da solução de metahemoglobina
Adicionar 50 mg de ferricianeto de potássio sólido à solução de hemoglobina. Agitar bem. Pipete cuidadosamente 0,5 ml de solução de metahemoglobina para a superfície da coluna. Abra a torneira e depois da amostra penetrar no gel, inicie a eluição adicionando tampão pelo topo da coluna (a solução eluente contem sais, para diminuir qualquer adsorção de proteína ou reagentes ao gel). Comece a recolher o eluído num copo limpo. Deixe a amostra percorrer as partículas do gel e anote as mudanças de cor observadas. Repare ainda na banda amarela do ferricianeto de potássio que se atrasa e separa da banda da hemoglobina. Para determinar os volumes de eluição da hemoglobina e do ferricianeto a recolha do eluído é feita em dois copos; desde o início até à saída de metade da banda vermelha num copo e desde aí até à saída de metade da banda amarela noutro copo. Meça os volumes recolhidos com uma proveta.
Lave a coluna com tampão até esta ficar de novo branca para recuperação do gel.
Gel
Ditionito de sódio
Tampão
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II. Cromatografia de permuta iónica
II.1. Introdução
As proteínas podem ser separadas por adsorção diferencial em materiais de permuta iónica. Alguns destes materiais são convenientemente preparados introduzindo grupos iónicos na celulose. A dietilaminoetilcelulose (DEAE-‐C) é um destes materiais e contém grupos ―OCH2CH2N(C2H5)2 em vez de alguns grupos OH da celulose original. Estes grupos adquirem uma carga positiva quando o átomo de azoto se combina com um protão para se tornar ―NH+R2. A DEAE-‐C é uma resina aniónica pois as suas cargas positivas atraem aniões.
A solução de proteínas a separar é aplicada numa coluna de DEAE-‐C e as diferentes proteínas são eluídas passando através da coluna soluções tampão com composições diferentes. Baixando o pH elui-‐se mais proteína pois vai-‐se diminuindo o número total de cargas negativas da molécula de proteína diminuindo a sua interacção com a DEAE-‐C carregada positivamente. Por outro lado, o aumento da concentração de sal no tampão facilita a eluição de mais proteína pois há mais aniões no meio para competir com a proteína para as cargas positivas da DEAE-‐C.
Neste trabalho vamos separar duas proteínas a catalase (proteína verde) e o citocromo c (proteína vermelha). A primeira é uma enzima que catalisa a reacção:
H2O2 ⇌ H2O + ½O2
O citocromo c medeia a transferência de electrões entre os complexos III e IV da cadeia respiratória:
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II.2. Procedimento experimental
Reagentes
Mistura de citocromo c e catalase em água Resina aniónica DEAE-‐C equilbrada com tampão A Tampão A: tampão 20 mM acetato de sódio, 5 mM ácido acético Tampão B: tampão 20 mM acetato de sódio, 5 mM ácido acético, 1 M NaCl Ferricianeto de potássio Ditionito de sódio Peróxido de hidrogénio (10 vol.) Preparação da coluna de permuta iónica
A forma de preparação da coluna é semelhante à anterior, sendo utilizado neste caso o tampão A. Transfira a resina DEAE-‐C para a coluna com a ajuda de uma vareta, de modo a ficar com uma altura de aproximadamente 10 cm. Esta resina foi previamente equilibrada no tampão A. Verifique se a superfície da coluna está plana. Lave a coluna com tampão A, tendo o cuidado para não perturbar a superfície. É importante que a coluna não seque.
Separação da mistura de proteínas
Deixe entrar todo o tampão A na coluna antes de introduzir cuidadosamente 3 mL da solução de proteína. Observe a concentração de material corado no topo da coluna. Depois de deixar entrar a solução de proteína na coluna, continue a adicionar o tampão inicial (tampão A) até eluir completamente a primeira proteína. Note que a banda avermelhada não se adsorve à superfície começando a descer imediatamente na coluna. Recolha o eluido em tubos de ensaio desde o início até ao fim da eluição das duas proteínas (recolha um volume de cerca de 3 mL por tubo). Completada a eluição da banda vermelha, mude para o tampão B, para eluir a 2ª proteína. Repare que a banda esverdeada desce na coluna, continue a recolha do eluido em tubos de ensaio até ela sair.
Identificação das proteínas coradas
1. Verifique quais as fracções mais concentradas em proteína, medindo a absorvância das fracções recolhidas a 280 nm. Represente graficamente a absorvância a 280 nm em função do número de fracção.
2. Com as fracções mais concentradas e com o objectivo de identificar as proteínas divida cada fracção em duas partes. A uma das partes adicione H2O2 (a 10 volumes) e verifique se há libertação de bolhas. À outra adicione ditionito (Na2S2O4) para reduzir a proteína e trace o espectro de visível entre 350 e 700 nm. Compare os espectros com os da figura em que se apresentam os espectros de visível do citocromo c e da catalase na forma oxidada (a) e na forma reduzida (b).
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Preparação da aula prática
Cromatografia de filtração em gel
1. Qual a base do método de separação por cromatografia de filtração em gel?
2. Quais são os componentes separados na coluna de Sephadex neste trabalho?
3. Será possível determinar a massa molecular da hemoglobina por cromatografia de filtração em gel utilizando Sephadex G-‐25? Em caso negativo diga qual o tipo de Sephadex que escolheria.
Cromatografia de permuta iónica
1. Calcule o pH e a força iónica (I = ½∑Ci(Zi)2) dos dois tampões utilizados sabendo que o pKa do ácido acético é igual a 4,7.
2. Qual a base do método de separação por cromatografia de permuta iónica?
3. Sabendo que apenas a banda verde adsorve à resina DEAE-‐C ao pH do tampão A o que pode concluir acerca do pI do citocromo c de cavalo? E acerca do pI da catalase?
4. A banda verde é eluída por aumento de força iónica do tampão de eluição (força iónica do tampão B > força iónica do tampão A). Sugira um método alternativo para a eluição desta proteína mantendo constante a força iónica. Explique como procederia.
Análise dos resultados
Separação de compostos biológicos por cromatografia de filtração em gel
1. Explique a sucessão de cores observada na coluna de Sephadex.
2. Usando os volumes de eluído recolhidos (volume recolhido até saída de metade da banda vermelha e o volume recolhido no segundo copo) diga qual é a relação entre os volumes de eluição da hemoglobina (MM = 64500 Da) e do ferricianeto (MM = 329 g/mol) e os volumes Vo e Vi, tendo em consideração os limites de exclusão molecular do gel utilizado na aula. Justifique.
3. Determine Vo e Vi para a coluna que utilizou na aula.
Separação de compostos biológicos por cromatografia de permuta iónica
1. Com base na representação gráfica da absorvância medida a 280 nm em função do número das fracções recolhidas, comente a eficiência da separação.