toxoplasmose em bovinos e suÍnos, e a …uenf.br/uenf/downloads/pganimal_3897_1164627408.pdf ·...
TRANSCRIPT
TOXOPLASMOSE EM BOVINOS E SUÍNOS, E A VIABILIDADE DE CISTOS DE Toxoplasma gondii EM ENCÉFALOS SUÍNOS NO
MUNICÍPIO DE CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ
EDWARDS FRAZÃO-TEIXEIRA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
MARÇO - 2006
TOXOPLASMOSE EM BOVINOS E SUÍNOS, E A VIABILIDADE DE CISTOS DE Toxoplasma gondii EM ENCÉFALOS SUÍNOS NO
MUNICÍPIO DE CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ
EDWARDS FRAZÃO-TEIXEIRA Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Orientador: Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira
Co-Orientadora: Profª. Lílian Maria Garcia Bahia-Oliveira
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ MARÇO - 2006
TOXOPLASMOSE EM BOVINOS E SUÍNOS, E A VIABILIDADE DE CISTOS DE Toxoplasma gondii EM ENCÉFALOS SUÍNOS NO
MUNICÍPIO DE CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ
EDWARDS FRAZÃO-TEIXEIRA
Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Aprovada em 03 de março de 2006 Comissão Examinadora: ___________________________________________________________________
Prof. Walter Flausino (Doutor, Parasitologia) - UFRRJ
___________________________________________________________________ Profª. Maria Angélica V. da C. Pereira (Doutora, Parasitologia) - UENF
___________________________________________________________________ Profª. Sílvia Regina Ferreira G. Pereira (Doutora, Microbiologia) - UENF
___________________________________________________________________ Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira (Doutor, Parasitologia) - UENF
(Orientador)
ii
“Maybe I will never be
All the things that I want to be
But now is not the time to cry
Now's the time to find out why
I think you're the same as me
We see things they'll never see
You and I are gonna live forever”
Noel Gallagher
iii
A
Todos aqueles que me conhecem na íntegra e,
por isso, sei que sempre serão os meus
verdadeiros amigos.
DEDICO
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por continuar oferecendo sua proteção e me guiar por
caminhos inimagináveis em busca de uma luz.
Ao meu pai, pelo constante zelo e por ser meu modelo de honestidade e
caráter.
A minha mãe, pelo carinho e cuidados dispensados numa vida inteira de
realizações. Ainda não sei como consegue fazer tantas coisas ao mesmo tempo.
Ao meu irmão Diego. Ver você crescer é como reviver grandes momentos da
minha vida. O futuro exige apenas que nós tenhamos o trabalho de estender a mão
para alcançá-lo.
Ao meu irmão Dariozinho. Crescemos juntos e aprendemos juntos. Sempre
admirei sua inteligência, que me custou algumas partidas de xadrez perdidas. O
sucesso é pouco para mentes brilhantes.
A Lu, suporte constante quando tudo parece perdido. Você é minha luz,
minha maior incentivadora. Ainda espero, algum dia, ter 7% da sua praticidade.
Aos meus avós Frazão, Jutirene, Heloíza e Edwards, admiro vocês pela vida
que viveram e pelo muito que ainda têm a viver. São os pilares da nossa família e
onde minha vida começa. Obrigado por terem se amado, do contrário não estaria
aqui.
A Tia Inês e Tia Lolô. O orgulho de vocês é alimento à minha caminhada,
que está apenas começando. Torcemos juntos, comemoraremos juntos.
A Vulks e Zari. Muitos seres humanos tendem a adquirir características
animais. Muitos animais demonstram as qualidades mais humanas.
v
Aos amigos, colegas e muitas outras pessoas que tive o prazer de conhecer
nestes dois anos de trabalho. De várias maneiras diferentes, vocês contribuíram
para a execução deste Projeto.
Ao meu amigo Lério, pela grande ajuda durante a coleta das amostras e cujo
carinho e brincadeiras dão toque especial à Pesquisa Científica. Valeu “coisinha” !
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, pela
oportunidade de fazer Ciência.
À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela bolsa de estudos.
Àqueles professores que sabem os mestres que são, mas nunca esquecem
os alunos que foram.
Em especial, às Professoras Maria Angélica e Sílvia Regina, pelas
constantes palavras de elogio e incentivo.
À Profª. Lílian, pela co-orientação, confiança, incentivo e conhecimentos
passados durante estes anos de pesquisa.
Finalmente, ao “meu jovem” amigo Francisco. Obrigado pela constante
confiança em meu potencial. Muitos têm a sorte de ter um Orientador amigável.
Poucos têm o prazer de ter um grande amigo como Orientador.
vi
BIOGRAFIA
EDWARDS FRAZÃO TEIXEIRA, filho de Manoel Dario Marinho Teixeira e
Lídia Pessanha dos Santos Teixeira, nasceu em Campos dos Goytacazes, Estado
do Rio de Janeiro, em 3 de setembro de 1979.
Concluiu o Ensino Fundamental em 1994 nas escolas Externato Nacional e
Instituto Dom Bosco - Salesiano, em Campos dos Goytacazes. Em 1997, concluiu o
Ensino Médio no Colégio Escola Santo Antônio – CESA.
Ingressou no Curso de Medicina Veterinária em 1999, na Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF). No mesmo ano, iniciou suas
atividades como bolsista de trabalho junto ao Laboratório de Biologia do Reconhecer
do Centro de Biociências e Biotecnologia (CBB) da UENF, sendo selecionado em
2001 pela Comissão de Bolsas de Iniciação Científica para atuar no Laboratório de
Sanidade Animal do Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA).
Em fevereiro de 2004, foi selecionado para ingresso no Curso de Pós-
Graduação em Produção Animal, área de concentração Sanidade Animal, nível de
Mestrado, da UENF. Em março de 2005, iniciou suas atividades como bolsista no
Pré-Vestibular Teorema, que envolve aulas ministradas por pós-graduandos da
UENF. No referido curso, tem ministrado aulas na disciplina Inglês.
Em janeiro de 2006, foi selecionado para o Doutorado no Curso de Pós-
Graduação em Produção Animal, Sanidade Animal, da UENF.
Defende, agora, sua Dissertação de Mestrado.
vii
CONTEÚDO
RESUMO................................................................................................................ xiv
ABSTRACT............................................................................................................ xvi
1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 1
2. OBJETIVOS................................................................................................... 3
2.1. Gerais..................................................................................................... 3
2.1. Específicos............................................................................................ 3
3. REVISÃO DE LITERATURA......................................................................... 4
3.1. Toxoplasma gondii................................................................................ 4
3.1.1. Taxionomia.................................................................................... 4
3.1.2. Histórico........................................................................................ 4
3.1.3. Ciclo biológico.............................................................................. 6
3.1.4. Morfologia...................................................................................... 8
3.2. Pesquisas realizadas............................................................................ 8
3.2.1. No mundo...................................................................................... 8
3.2.2. No Brasil........................................................................................ 13
3.2.3. Em Campos dos Goytacazes...................................................... 14
3.3. A infecção em bovinos......................................................................... 15
3.4. A infecção em suínos........................................................................... 17
3.5. Vigilância Sanitária e Toxoplasma gondii........................................... 19
3.5. O ensaio imunoenzimático - ELISA..................................................... 21
4. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 23
4.1. Seleção das propriedades.................................................................... 23
viii
4.2. Classificação das propriedades.......................................................... 23
4.2.1. De bovinos...................................................................................... 23
4.2.2. De suínos........................................................................................ 24
4.3. Coleta de sangue e remoção dos soros............................................. 24
4.4. Padronização do teste sorológico....................................................... 24
4.4.1. Para análise de soro bovino.......................................................... 25
4.4.2. Para análise de soro suíno............................................................ 26
4.5. Avaliação sorológica............................................................................ 27
4.5.1. Nos bovinos.................................................................................... 27
4.5.2. Nos suínos...................................................................................... 28
4.6. Visualização dos resultados sorológicos.......................................... 28
4.7. Seleção dos estabelecimentos comerciais........................................ 29
4.8. Aquisição dos encéfalos suínos.......................................................... 29
4.9. Digestão péptica das amostras encefálicas....................................... 29
4.10. Bioprova............................................................................................... 30
4.10.1. Inoculação.................................................................................... 30
4.10.2. Isolamento do parasita................................................................ 31
a) Observação de taquizoítas em líquido peritoneal......................... 31
b) Impressão de órgãos em lâminas................................................... 31
c) Observação direta de esfregaços de encéfalos............................ 32
d) Técnica de arrasto............................................................................ 32
4.10.3. Eutanásia...................................................................................... 32
4.11. Análise estatística das medidas dos taquizoítas............................. 33
5. RESULTADOS............................................................................................... 34
5.1. Padronização do teste sorológico...................................................... 34
5.1.1. Para amostras bovinas.................................................................. 34
5.1.2. Para amostras suínas.................................................................... 34
5.2. Cálculo do “cut-off” e discriminação da soropositividade............... 37
5.2.1. Em bovinos..................................................................................... 37
5.2.2. Em suínos....................................................................................... 37
5.3. Prevalência de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii................... 41
5.3.1. Nos soros bovinos......................................................................... 41
5.3.2. Nos soros suínos........................................................................... 42
5.4. Isolamento de Toxoplasma gondii em encéfalos de suínos............ 43
ix
6. DISCUSSÃO.................................................................................................. 46
6.1. Padronização do teste sorológico...................................................... 46
6.1.1. Para amostras bovinas.................................................................. 46
6.1.2. Para amostras suínas.................................................................... 46
6.2. Cálculo do “cut-off” e discriminação da soropositividade............... 47
6.2.1. Em bovinos..................................................................................... 47
6.2.2. Em suínos....................................................................................... 47
6.3. Prevalência de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii................... 47
6.3.1. Nos soros bovinos......................................................................... 47
6.3.2. Nos soros suínos........................................................................... 49
6.4. Isolamento de Toxoplasma gondii em encéfalos de suínos............ 52
7. CONCLUSÕES.............................................................................................. 57
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 58
x
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Prevalências de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em
bovinos no mundo.....................................................................
17
Quadro 2. Prevalências de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em suínos
no mundo...................................................................................
18
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Presença de anticorpos anti-Toxoplasma gondii, pelo teste de
ELISA indireto, em bovinos criados nos arredores e limites do
município de Campos dos Goytacazes/RJ.....................................
42
Tabela 2. Anticorpos anti-Toxoplasma gondii observados em soros de
suínos criados em regiões urbanas e arredores do município de
Campos dos Goytacazes/RJ..........................................................
43
Tabela 3. Isolamento de Toxoplasma gondii de suínos (Sus scrofa)
comercializados em mercados populares do município de
Campos dos Goytacazes-RJ..........................................................
44
Tabela 4. Dimensões de taquizoítas de Toxoplasma gondii isolados de
suínos (Sus scrofa) em lavado peritoneal de camundongos (Mus
musculus).......................................................................................
45
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo biológico de Toxplasma gondii.............................................. 7
Figura 2. Valores em densidade óptica (DO) em ensaio para padronização
de ELISA indireto em soros de bovinos. Diluição do conjugado
1:4.000; diluição dos soros controle positivo e negativo a 1:500 e
1:1000 e sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml. (A)
Solução bloqueio com PBS-T 0,05% + BSA 1%. (B) PBS-T
0,05% + ovalbubina 1%. (C) PBS-T 0,1%....…...............................
35
Figura 3. Valores em densidade óptica para padronização do ELISA
indireto em soros de suínos. Diluição do conjugado 1:10.000;
diluição dos soros controle positivos e negativos a 1:200, 1:400 e
1:800. (A) sensibilização da placa com antígeno a 5 µg/ml. (B)
sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml..........................
36
Figura 4. Valores em densidade óptica em ensaio para padronização do
ELISA indireto em soros de suínos. Diluição do conjugado
1:20.000 e diluição dos soros controle positivos e negativos a
1:200 e 1:400. (A) sensibilização da placa com antígeno a 5
µg/ml. (B) sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml.........
36
Figura 5. Valores em densidade óptica (DO) em ensaio imunoenzimático
(ELISA indireto) dos soros dos bovinos positivos (placa 1).
Diluição do conjugado 1:4.000; diluição dos soros a 1:500;
sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml e bloqueio com
PBS-T 0,1%....................................................................................
38
xiii
Figura 6. Valores em densidade óptica em ensaio imunoenzimático
(ELISA indireto) dos soros dos bovinos positivos (placa 2).
Diluição do conjugado 1:4.000; diluição dos soros a 1:500;
sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml e bloqueio com
PBS-T 0,05% e BSA 1%.................................................................
39
Figura 7. Valores em densidade óptica em ensaio imunoenzimático
(ELISA indireto) dos soros dos suínos positivos. Diluição do
conjugado 1:20.000; diluição dos soros a 1:400 e sensibilização
da placa com antígeno a 5 µg/ml....................................................
40
Figura 8. Espécimes de Toxoplasma gondii isolados em lavado peritoneal
de camundongo corados por GIEMSA. Em A (— com 10 µm) e
em B (— com 5 µm) são observados taquizoítas livres no
exsudato peritoneal. Destaque para os núcleos dos parasitas
(→). Em C (— com 5 µm) observa-se em detalhes o núcleo de
um taquizoíta e grânulos de amilopectina em seu citoplasma
(→). Em D (— com 5 µm), destaca-se o parasita em processo de
divisão dentro de macrófagos (→ abaixo) e a formação do
vacúolo parasitóforo (→ acima)......................................................
55
Figura 9. Espécimes de Toxoplasma gondii observados em cérebros de
camundongos. Em A e B, cistos em observação a fresco.
Destaque para a parede cística de espessura delgada (→). Em
C e D, cistos corados por GIEMSA. Destaque para os núcleos
dos bradizoítas (→). Barra com 20 µm...........................................
56
xiv
RESUMO
FRAZÃO-TEIXEIRA, Edwards, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; março de 2006; Toxoplasmose em bovinos e suínos, e a viabilidade de cistos em encéfalos suínos no município de Campos dos Goytacazes-RJ; Orientador: Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira. Co-Orientadora: Profª. Lílian Maria Garcia Bahia-Oliveira.
Soros de 73 bovinos e 62 suínos criados em Campos dos Goytacazes e
arredores foram analisados para a presença de anticorpos do tipo IgG contra
Toxoplasma gondii. Ainda, 12 cabeças de suínos foram adquiridas em
estabelecimentos populares do município, os quais comercializam carne suína in
natura diretamente para a população. Seus encéfalos foram removidos e
processados para bioprova em camundongos, com o intuito de isolar formas
infectivas viáveis do parasita. As prevalências de anticorpos anti-T. gondii foram
52,06% para bovinos em geral e 20,59% para suínos domiciliares. O nível de
isolamento de encéfalos suínos foi 50%. A atenção dispensada pelos criadores aos
suínos dos sistemas de criação intensiva devem ter contribuído para a baixa
soroprevalência nestes animais. As prevalências verificadas para bovinos e suínos
representam potenciais de infecção através do consumo de suas carnes, de acordo
com informações relatadas por outros estudos. Para os suínos, a suspeita levantada
pela soropositividade pôde ser confirmada pelo alto percentual de isolamento do
parasita nos encéfalos analisados. Outros autores já relataram correlação entre a
presença de T. gondii em cérebros de suínos e outros tecidos, incluindo músculos. A
padronização da técnica de ELISA indireto para detecção de anticorpos em soros de
xv
suínos e bovinos foi bem sucedida, o que confirma os relatos de outros
pesquisadores acerca de seu uso para investigação de infecções em populações.
Conclui-se, ainda, que existe alto percentual de infecção dentre os bovinos e suínos
analisados, e que estes animais são fontes de infecção humana. Adicionalmente, a
presença do parasita em suínos comercializados em estabelecimentos populares
deste município confirma que a toxoplasmose tem uma importante fonte de infecção
nesta espécie animal.
Palavras-chave: anti-T. gondii, bovinos, suínos, ELISA.
xvi
ABSTRACT
FRAZÃO-TEIXEIRA, Edwards, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; February 2004; Toxoplasmosis in cattle and pigs, and the viability of Toxoplasma gondii cysts in encephalons of pigs in the municipality of Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro state; Adviser: Professor Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira. Co-Adviser: Professor Lílian Maria Garcia Bahia de Oliveira.
Sera from 73 bovines and 62 pigs bred in Campos dos Goytacazes and
surroundings were analysed for the presence of IgG antibodies against Toxoplasma
gondii. Though, 12 pigs’ heads were acquired in popular establishments of the
municipality, which commercialize in natura pig’s meat directly to the population.
Their encephalons were removed and processed for bioassay in mice, in order to
isolate viable infective forms of the parasite. The prevalences of anti-T. gondii
antibodies were 52.06% for cattle in general and 20,59% for domicile pigs. The
isolation level from pigs’ encephalons was 50%. The attention given by the breeders
to the intensive breeding system pigs must have contributed for the low
seroprevalence in these animals. The prevalence verified for cattle and pigs
represent potential of infection through the consumption of their meat raw or
undercooked meat, according to information reported by other studies. For pigs, the
suspicion raised by the seropositivity could be confirmed by the high percentage of
isolation of the parasite in the analyzed encephalons. Other authors have already
reported correlation between the presence of T. gondii in pigs brains and other
tissues, including muscles. The standardization of the indirect ELISA technique for
detection of antibodies in pig’s and bovine’s sera was successful, what confirms the
xvii
reports by other researchers on its use for infection investigations in populations. It is
concluded, though, that there is high percentage of T. gondii infection among the
analysed bovines and pigs, and that these animals are sources for human infection.
Additionally, the presence of the parasite in pigs commercialized in popular
establishments of this municipality confirms that toxoplasmosis have an important
source of infection in this animal species.
Key words: anti-T. gondii, cattle, pigs, ELISA.
1
1. INTRODUÇÃO
Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose, parasitose que
acomete animais de sangue quente e tem como hospedeiros definitivos os felídeos.
A doença afeta seriamente indivíduos imunocomprometidos, com sérios danos ao
sistema nervoso central. Vários pesquisadores relatam que indivíduos
imunocompetentes são menos vulneráveis à infecção e aos danos causados pelo T.
gondii ao tecido nervoso. Entretanto, com o advento de novas tecnologias
moleculares e pesquisas comportamentais, diversos autores têm proposto que a
situação pode ser mais grave do que se imagina. Vários sinais têm sido detectados
em indivíduos imunocompetentes e a associação com a presença do parasita
exaustivamente investigada.
Paralelamente a isso, cresce cada vez mais o interesse dos pesquisadores
em estudar a cadeia epidemiológica de várias doenças e as principais fontes de
infecção humana. Várias infecções estão re-emergindo, antigos patógenos se
modificando. Estudos sobre zoonoses tornam-se ainda mais importantes e a
toxoplasmose, a mais cosmopolita delas, vem atraindo cada vez mais atenção da
comunidade científica.
A cidade de Campos dos Goytacazes, localizada no Norte do Estado do Rio
de Janeiro, tem sido internacionalmente citada pela endemia de toxoplasmose
humana, com relatos de alto percentual em indivíduos de baixa renda e doença
congênita. Vários estudos têm sido realizados a fim de detectar a principal fonte de
infecção humana neste município. Estas pesquisas comprovaram a ampla
2
contaminação ambiental e ponderam acerca do papel de fontes de água na
epidemiologia da doença.
Por outro lado, este município possui papel histórico no ciclo da pecuária e
até hoje destaca-se pela produção extensiva de gado bovino. Estes hospedeiros
intermediários, após adquirirem a infecção a partir de ambientes contaminados,
podem exercer papel fundamental não só para disseminação da toxoplasmose como
para a intensidade da infecção. Isto porque um cisto tecidual de T. gondii pode
albergar até centenas de formas infectivas do parasita. A carne de um animal
infectado pode conter muitos cistos e é, definitivamente, uma fonte a ser
considerada em regiões endêmicas para essa parasitose.
Bovinos e suínos são importantes fontes de proteína animal para populações
humanas. Várias são as pesquisas que visam determinar os índices de infecção por
T. gondii em rebanhos de inúmeras regiões do planeta. Os índices variam e o
assunto é cada vez mais estudado à medida que a correlação com a possibilidade
de infecção humana é confirmada. Os investimentos em métodos preventivos têm
crescido, o que pode ser confirmado pela corrida em busca de uma vacina para a
toxoplasmose animal e pela melhoria das condições sanitárias em criadouros.
Nesse contexto, cresce ainda mais a importância da Vigilância Sanitária na
fiscalização e garantia de produtos de origem animal livres de patógenos. Vários são
os relatos de isolamento de T. gondii viável em tecidos animais comestíveis, assim
como os surtos da doença humana, tendo como causa a ingestão de alimentos de
origem animal.
Com base nestes relatos, justifica-se um trabalho de pesquisa que avalie a
prevalência da toxoplasmose em animais de produção em Campos dos Goytacazes,
assim como a presença do parasita em tecidos de animais comercializados in natura
nos limites deste município.
3
2. OBJETIVOS
2.1. Gerais a) Examinar bovinos e suínos criados em áreas urbanas periféricas e
arredores do município de Campos dos Goytacazes-RJ quanto à presença de
anticorpos anti-T. gondii em amostras séricas;
b) Demonstrar a presença de formas infectivas viáveis de T. gondii em
encéfalos de suínos comercializados in natura em estabelecimentos populares que
comercializam carne suína neste município.
2.2. Específicos
a) Padronizar o teste de ELISA indireto (“indirect Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay”) para detecção de anticorpos anti-T. gondii em soros de
bovinos e suínos;
b) Verificar a importância de bovinos e suínos na cadeia epidemiológica da
toxoplasmose em Campos dos Goytacazes;
c) Verificar a importância das carnes suína e bovina como potenciais
transmissoras da toxoplasmose neste município e arredores;
d) Avaliar o risco de ocorrência de toxoplasmose através da ingestão de
tecidos e derivados da carne de suínos naturalmente infectados;
e) Alertar quanto à necessidade de maior controle na Inspeção Sanitária dos
animais que servem ao consumo humano e são criados em regiões urbanas e
arredores do município sem controle sanitário.
4
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Toxoplasma gondii 3.1.1. Taxionomia A classificação taxionômica do agente etiológico da toxoplasmose, de
acordo com Current et al. (1990) e Cavalier-Smith (1993), é:
Império: Eucariota (CAVALIER-SMITH, 1993)
Reino: Protozoa (OWEN, 1858)
Filo: Apicomplexa (LEVINE, 1970)
Classe: Sporozoazida (LEUKART, 1879)
Ordem: Eucoccidiorida (LEUKART, 1879)
Subordem: Eimeriorina (LÉGER, 1911)
Família: Sarcocystidae (POCHE, 1913)
Sub-família: Toxoplasmatinae (BIOCA, 1956)
Gênero: Toxoplasma (NICOLLE e MANCEAUX, 1909)
Espécie: Toxoplasma gondii (NICOLLE e MANCEAUX, 1909)
3.1.2. Histórico Alfonso Splendore foi o primeiro a detectar T. gondii. Em um estudo com
coelhos em São Paulo, o pesquisador de origem italiana observou uma patologia
5
com quadro semelhante ao kalazar humano. Ele descreveu as lesões e os
corpúsculos parasitários presentes, tanto as formas livres como intracelulares
(SPLENDORE, 1908). A descoberta de Splendore ocorreu em julho de 1908,
porém em outubro do mesmo ano, Nicolle e Manceaux relataram uma
descoberta semelhante em células de baço e do fígado de Ctenodactylus gundi,
um roedor africano (NICOLLE e MANCEAUX, 1908).
Segundo OLIVEIRA (2002), um oftalmologista chamado Jankü fez a
primeira descrição de toxoplasmose congênita humana, em 1923. O paciente era
uma criança de 11 anos de idade com hidrocefalia e cegueira, que veio a falecer.
Ao corte histológico do globo ocular durante a necropsia, pôde-se observar a
presença de parasitas na retina. TORRES (1927) relatou toxoplasmose humana
pela primeira vez no Rio de Janeiro e descreveu microorganismos em cortes
histológicos do cérebro, miocárdio e músculos esqueléticos de um bebê que
faleceu aos 29 dias de vida. Ele reconheceu os organismos como sendo
semelhantes a Toxoplasma gondii e espécies do gênero Encephalitozoon.
A primeira caracterização de toxoplasmose fatal em recém-nascidos foi
realizada por WOLF e COWEN (1937). Dois anos mais tarde WOLF et al. (1939
e 1940) conseguiram, pela primeira vez, infectar animais com cepas isoladas de
uma lesão do sistema nervoso central de um bebê falecido com um mês de vida.
A caracterização da doença em indivíduos adultos foi documentada por
PINKERTON e WEINMAN (1940) nos Estados Unidos (EUA).
Após a padronização de testes sorológicos, em especial o teste de Sabin-
Feldman (SABIN e FELDMAN, 1948), pôde-se quantificar a prevalência da
infecção por T. gondii em seres humanos e animais, confirmando sua ampla
distribuição na natureza (FELDMAN, 1982).
Todavia, o ciclo completo do parasita só foi desvendado em estudos
realizados por HUTCHISON (1965) e DUBEY et al. (1970), que descreveram a
transmissão do parasita pelas fezes de gatos e sua fase sexual no intestino
destes felídeos, culminando com a produção de oocistos.
6
3.1.3. Ciclo biológico
Dentre todas as espécies de parasitas, T. gondii destaca-se pela
complexidade do seu ciclo biológico (DUBEY, 1994). As formas infectivas se
diferenciam de acordo com cada uma das três fases de seu ciclo.
No intestino de seu hospedeiro definitivo, o felídeo, a forma infectiva
resultante é o oocisto. Este é liberado em sua forma não esporulada juntamente com
as fezes do felídeo infectado. No ambiente, este oocisto sofre uma alteração em sua
estrutura para tornar-se potencialmente infectivo. Esta transformação é catalisada
pela ação da temperatura, umidade e concentração de oxigênio ambientes ideais e é
chamada esporulação (DUBEY, 1994).
O oocisto é uma importante ferramenta de disseminação do parasita no meio
ambiente (da SILVA et al., 2003). Nesse local ele pode alcançar uma grande
variedade de hospedeiros intermediários, onde realiza mais uma etapa de seu
desenvolvimento biológico. Ao ser ingerido por qualquer animal de sangue quente,
seja através de alimentos ou água contaminados, o oocisto esporulado rompe-se no
intestino, liberando oito esporozoítas. Estes se dividem rapidamente nas células
intestinais e linfonodos associados e dão origem aos taquizoítas (DUBEY, 1994). Os
taquizoítas aproveitam-se da circulação sanguínea e linfática para atingirem os mais
variados tecidos do hospedeiro (DUBEY e BEATTIE, 1988). Entretanto, dependendo
da competência imunológica do indivíduo, o parasita migra para tecidos nervosos,
musculares e hepáticos, onde se encistam. É importante ressaltar que essa fase
extra-intestinal ocorre também nos felídeos (FREYRE et al., 1989), tornando-os,
conseqüentemente, hospedeiros intermediários (Figura 1).
As formas de proliferação rápida, os taquizoítas, responsáveis pela fase
aguda da doença, reduzem sua velocidade de multiplicação dentro dos cistos
teciduais. Por este motivo passam a se chamar bradizoítas. Um cisto pode abrigar
até centenas de bradizoítas e essa é a fase crônica ou latente da toxoplasmose
(DUBEY, 1994).
O carnivorismo é o principal responsável pela continuidade do ciclo biológico
a partir dos hospedeiros intermediários. O tecido contendo cistos teciduais, ao ser
ingerido, sofre a ação de enzimas proteolíticas do estômago e intestino. Estas
enzimas digerem a parede do cisto e permitem que até centenas de bradizoítas
infectem os enterócitos do hospedeiro. Nestas células, os bradizoítas transformam-
se novamente em taquizoítas e infectam os tecidos do hospedeiro (DUBEY, 1994).
7
Figura 1. Ciclo biológico de Toxoplasma gondii (modificado de DUBEY, 1993).
Quando os felídeos ingerem cistos teciduais, o ciclo biológico se completa
(Figura 1). Os bradizoítas iniciam um ciclo enteroepitelial com uma fase assexuada e
outra sexuada (DUBEY, 1998a). Os oocistos se formam durante a fase sexuada no
lúmen intestinal após a fertilização dos gametas femininos (macrogametas) pelos
masculinos (microgametas), de acordo com DUBEY (1994).
Outra forma de transmissão do T. gondii é através da via transplacentária
(DUBEY, 1994), que acontece quando hospedeiros não imunes são infectados
durante a gestação. O parasita prolifera-se na placenta e atinge o feto, levando a
abortamentos ou lesões congênitas irreversíveis. A infecção pode ocorrer ainda por
transfusões sanguíneas e transplantes de órgãos, mas não possuem a mesma
importância que a ingestão de tecidos infectados (DUBEY, 1994; 1998a) e água
(BAHIA-OLIVEIRA et al., 2003) ou alimentos contaminados com oocistos (DUBEY,
1994).
8
3.1.4. Morfologia O taquizoíta de T. gondii possui forma de meia-lua. Sua extremidade
posterior é arredondada e torna-se afilada em sua porção anterior. Suas dimensões
são, em média, 2 x 6 µm e seu núcleo é observado próximo à extremidade posterior
ou no centro da célula (DUBEY, 1977). Ainda segundo este autor, pela coloração de
GIEMSA, o núcleo torna-se avermelhado e expõe sua forma circular.
No organismo hospedeiro, os taquizoítas se multiplicam nas células do
indivíduo e formam os chamados pseudocistos, grupos, clones ou colônias terminais
(DUBEY, 1977; AMATO-NETO et al., 1982).
Os bradizoítas apresentam algumas singularidades que os discriminam
morfologicamente dos taquizoítas. A principal diferença é a localização de seu
núcleo. Este se situa, geralmente, na região posterior da célula parasitária (DUBEY,
1998a). Os cistos teciduais podem medir 5 µm e conter apenas quatro bradizoítas,
quando ainda são jovens. Mas podem alcançar, com o tempo, tamanhos de até 100
µm e conter centenas de bradizoítas (DUBEY, 1998a). Os cistos são geralmente
subesféricos, contudo podem tomar o contorno da célula hospedeira (AMATO-NETO
et al., 1982).
A terceira forma infectiva do T. gondii, o oocisto, varia de tamanho e forma,
de acordo com seu desenvolvimento infectivo. O oocisto não esporulado mede cerca
de 10 x 12 µm, adquirindo uma aparência subesférica a esférica. Já o oocisto
esporulado mede 11 x 12,5 µm e sua forma varia de subesférica a elipsóide (DUBEY
et al., 1970; DUBEY, 1973, 1976).
3.2. Pesquisas realizadas
3.2.1. No mundo
A toxoplasmose adquiriu grande importância com a descoberta de sua
influência negativa em indivíduos imunocomprometidos, principalmente portadores
do Vírus da Imunodeficiência Humana - HIV (KHAN et al., 2005). Inúmeras são as
pesquisas realizadas com o intuito de melhor conhecer os fatores agravantes desta
relação e encontrar métodos mais eficientes de diagnóstico precoce da encefalite
causada pelo parasitismo (COLOMBO et al., 2005).
9
Por ser uma doença que acomete animais (ZAKI, 1995) e seres humanos
(McALLISTER, 2005) e pelas graves seqüelas que podem advir da infecção humana
(FRICKER-HIDALGO et al., 2005), a toxoplasmose tem sido cada vez mais estudada
(BONFIOLI e OREFICE, 2005). Apesar de ser considerada uma infecção
oportunista, raramente apresentando manifestações patológicas graves em
indivíduos imunocompetentes (LUFT e REMINGTON, 1988), esta zoonose é
diagnosticada em todo o mundo (DIAS et al., 2005). Pacientes acometidos pela
infecção são vistos em consultórios e enfermarias de quase todas as especialidades
médicas (WULF et al., 2005).
As lesões causadas pela infecção adquirem maior gravidade em recém-
nascidos e caracterizam-se por encefalite, icterícia, urticária e hepatomegalia,
geralmente associados a coriorretinite, hidrocefalia e microcefalia, com altas taxas
de morbidade e mortalidade (DUBEY, 1986). Desta forma, a infecção congênita é
considerada um tópico de destaque em pesquisas realizadas com populações de
baixa renda (BAHIA-OLIVEIRA et al., 2003), onde a falta de informação e os hábitos
precários de higiene são dominantes.
De todas as complicações que podem advir da infecção por T. gondii,
aquelas decorrentes da transmissão mãe-feto merecem especial atenção. Em
muitos casos a infecção pode se instaurar na mãe e permanecer silenciosa durante
todo o período gestacional, enquanto o protozoário é passado via placenta ao bebê.
CERMAKOVA et al. (2005) relataram toxoplasmose congênita em um bebê cuja mãe
experimentara a forma assintomática da doença. Os pesquisadores diagnosticaram
a patologia na mãe através da detecção de anticorpos anti-T. gondii dos tipos IgM,
IgE e IgA em seu soro. Estas imunoglobulinas são, segundo os próprios autores, os
marcadores da infecção aguda. A detecção da toxoplasmose congênita no feto
ocorreu através do reconhecimento de DNA de T. gondii em seu sangue, dos
marcadores de infecção aguda no soro, sinal de hidrocefalia e calcificação à ultra-
sonografia cerebral. O diagnóstico acurado e instituição de terapia em ambos, mãe e
feto, levaram à normalização progressiva dos testes laboratoriais.
Por outro lado, estudos recentes vêm considerando o impacto das novas
terapias imunossupressoras e esclarecem que a infecção adquirida na fase adulta
pode assumir aspectos graves (KHAN et al., 2005; FRICKER-HIDALGO et al., 2005).
Vários têm sido os relatos de toxoplasmose cerebral em indivíduos adultos
(COLOMBO et al., 2005), sem mencionar as complicações oftálmicas (PASHANINA
10
et al., 2005) e até de cunho psiquiátrico (BROWN et al., 2005). A doença é a causa
mais comum de infecção de retina em todo o mundo (HOLLAND, 2003). Uma
pesquisa avaliou o efeito dos tratamentos convencionais na toxoplasmose ocular
(STANFORD et al., 2003). Segundo os autores, nenhuma das tentativas de
tratamento em indivíduos imunocompetentes mostrou efeito benéfico. Ainda, em
pesquisa realizada por BOSCH-DRIESSEN et al. (2002), que avaliou indivíduos com
toxoplasmose ocular durante um longo período, foi possível observar que 24% dos
olhos afetados tornaram-se cegos.
A década de 1990 foi singular para o estudo da toxoplasmose clínica, mais
especificamente no caso da doença ativa em indivíduos imunocompetentes. Muitos
estudos apontaram a importância de se observar as alterações decorrentes da
infecção por T. gondii em indivíduos que não apresentam qualquer distúrbio do
sistema imunológico (CARME et al., 2002; BAHIA-OLIVEIRA et al., 2003). Os
principais sinais incluem linfadenopatia, febre, fraqueza e debilidade, oftalmite e
infecções multissistêmicas severas (DURLACH et al., 2003). Ainda, há estudos que
realizaram avaliações mais complexas, passando a associar a toxoplasmose com
desvios de comportamento e personalidade (LEWEKE et al., 2004; YOLKEN et al.,
2001; BROWN et al., 2005). Trabalhos recentes com roedores trouxeram evidências
de alteração de comportamento em animais acometidos com a parasitose (BERDOY
et al., 1995 e 2000), cooptando com o reconhecimento de situações similares em
seres humanos. Condições mentais como esquizofrenia, mudança de personalidade
e inteligência reduzida estão cada vez mais sendo associados à infecção por T.
gondii (FLEGR et al., 2003). Motivados pelo grande entusiasmo gerado pelas
associações citadas, muitos pesquisadores têm postulado várias teorias. Um
exemplo é o estudo realizado por NOVOTNA et al. (2005) em que são apresentadas
provas de que a alteração nas características de personalidade podem ser resultado
de infecções cerebrais em geral, e não em conseqüência de uma atividade
manipuladora específica do T. gondii.
Dentre outras afecções clínicas às quais a toxoplasmose que vem sendo
associada no decorrer dos anos, a urticária merece ser mencionada. MIRALLES
LOPEZ et al. (2005), por exemplo, citam um caso em que o paciente, do sexo
masculino, desenvolveu urticária fria associada à toxoplasmose. A patologia foi
detectada através de sorologia e os efeitos da associação puderam ser observados
no local da pele onde houve contato com cubos de gelo.
11
Por essas e outras razões, a toxoplasmose vem suscitando o interesse de
muitos pesquisadores, no intuito de se detectar as principais fontes de infecção
(DIAS et al., 2005). Por ser uma zoonose, é clara a importância dos animais de
produção em sua disseminação na população humana (HOGHOOGHI-RAD e
AFRAA, 1993). Altas prevalências de anticorpos anti-T. gondii têm sido reveladas em
estudos realizados em todo o planeta, seja em animais (KLUN et al., 2006) ou em
seres humanos (HOGHOOGHI-RAD e AFRAA, 1993), levantando hipóteses diretas
a respeito do consumo de carne infectada pelo parasita (Figuras 1 e 2). Provas mais
contundentes de que animais de produção são fontes importantes de infecção por T.
gondii ao homem vêm sendo apresentadas através de isolamentos do parasita em
produtos de origem animal (DIAS et al., 2005).
Com os avanços alcançados através do advento da biologia molecular,
novas técnicas de diagnóstico têm se destacado. Uma delas é a Reação em Cadeia
da Polimerase (PCR), capaz de detectar a presença de um microorganismo a partir
de pequenas amostras de seu DNA. KHAN et al. (2005) detectaram a presença de
T. gondii em líquido cérebro-espinhal de 8 em 10 pacientes HIV-positivos através de
PCR.
Estudos recentes têm avaliado o poder sinérgico de diferentes técnicas de
diagnóstico da toxoplasmose. COLOMBO et al. (2005) sugerem que o uso associado
de técnicas sorológicas e PCR no diagnóstico da toxoplasmose cerebral pode ser
uma boa estratégia, substituindo abordagens mais invasivas.
Vários trabalhos ressaltam a eficiência dos testes moleculares na
caracterização genética dos isolados de T. gondii. GALLEGO et al. (2005) realizaram
análise genética de amostras humanas (sangue, fluido cérebro-espinhal e amniótico)
e animais (vários órgãos) na Colômbia. Das 33 amostras positivas caracterizadas
como possuidoras do gene SAG2 de T. gondii, 31 eram do tipo I (93,9%), uma do
tipo II e uma mostrou-se atípica. Os resultados cooptam com a predominância da
linhagem tipo I em seres humanos e animais na América do Sul, segundo os
autores.
A evolução dos níveis analíticos acarretada pelo maior refinamento das
técnicas moleculares tem permitido aprofundamentos mais complexos nos estudos
das linhagens de T. gondii. Estas pesquisas trazem novos questionamentos e
levantam novas hipóteses a serem comprovadas. Um bom exemplo é a pesquisa
12
realizada por KHAN et al. (2005), onde detectou-se uma linhagem de T. gondii
distinta das linhagens clones arquétipos, através de PCR.
Os estudos soroepidemiológicos têm fornecido informações preciosas a
respeito do comportamento da doença em todo o mundo. Um recente estudo
avaliou a ocorrência de anticorpos anti-T. gondii em seres humanos no Norte da
Grécia durante os últimos 20 anos (DIZA et al., 2005). Através dos testes Ensaio de
Imunofluorescência (IFA) e Ensaio Imunoenzimático de Micropartículas (MEIA), os
autores puderam verificar um declínio significativo na prevalência. Ao discutirem os
dados e verificarem que a população idosa aumentou no citado período, os
pesquisadores explicam que esse declínio na prevalência de anticorpos anti-T.
gondii resulta de uma melhoria na situação sócio-econômica. Todavia, um outro
dado merece atenção. Segundo esta pesquisa, existe um grande número de
mulheres em idade de reprodução e susceptíveis à infecção por T. gondii, o que
pode representar um potencial risco à Saúde Pública. Ponderam ainda que a
educação da população e a tomada de medidas profiláticas podem ser importantes.
Outros estudos salientam a importância dos testes sorológicos para o
diagnóstico da toxoplasmose (PRESS et al., 2005), bem como do avanço das
metodologias, em especial os imunoenzimáticos, no reconhecimento de reinfecções
(DZITKO et al., 2006). Entretanto, é intensa a busca por métodos mais simples de se
diagnosticar a parasitose. Sob esta ótica, SINGH et al. (2005) investigaram a
presença de anticorpos anti-T. gondii na saliva de 125 indivíduos, sendo 100 deles
portadores do Vírus da Imunodeficiência Adquirida Humana (HIV). Utilizando a
técnica de ELISA, diagnosticaram-se 20% dos indivíduos como positivos para a
presença de imunoglobulinas G (IgG) e 25% para imunoglobulinas M (IgM). Os
autores afirmaram que amostras de saliva são substitutos viáveis ao soro no
diagnóstico da toxoplasmose. Adicionalmente, STROEHLE et al. (2005) salientam a
análise salivar como um método não invasivo para detecção de anticorpos anti-T.
gondii. Em sua pesquisa, os autores analisaram soro e saliva de 201 voluntários
saudáveis através do teste Immunoblotting para detecção de IgG. Pela análise
sorológica, através do Teste de Avidez (VIDAS), “Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay” (ELISA) e “Immunoblotting”, o resultado foi 29,4% (59/201) de positividade.
Dos positivos, 98,3% (58/59) apresentaram positividade também pela análise salivar.
13
3.2.2. No Brasil
Impulsionados pelas descobertas realizadas em universidades e institutos de
pesquisa em todo o mundo, pesquisadores brasileiros vêm realizando trabalhos
acerca da presença do parasita no país, tanto no homem como em animais. Em
Brasília, um estudo retrospectivo em 2.636 mulheres grávidas, 17 foram
diagnosticadas com toxoplasmose aguda. Destes 17 casos, 15 foram confirmados
como infecções primárias (NOBREGA ODE e KARNIKOWSKI, 2005). No mesmo
estudo, as autores reportam uma soroconversão anual de 6,4 para cada 1.000
indivíduos.
Em outro estudo, VIDAL et al. (2005) realizaram análise prospectiva de 55
casos com suspeita ou confirmados de toxoplasmose cerebral em pacientes HIV-
positivos. Em 19 dos casos (35%), o diagnóstico da toxoplasmose levou à detecção
de AIDS. Em 41 casos, a toxoplamose cerebral foi a principal doença associada à
AIDS. De acordo com outros resultados, sinais de deterioração neurológica prevêem
resposta não favorável ao tratamento e a administração do tratamento anti-retroviral
altamente ativo (HAART) parece estar relacionado a melhores índices de
sobrevivência e menores taxas de recidivas.
Estudo realizado por CARVALHEIRO et al. (2005) estimou a incidência da
toxoplamose congênita no município de Ribeirão Preto. Na pesquisa, coletaram-se
amostras de sangue de 15.162 neonatos, através de adsorção em papel filtro, que
foram submetidas ao teste sorológico para detecção de IgM anti-T. gondii. Do total
de amostras, 15 estavam positivas, mas somente 13 continuaram o estudo. Cinco
destas amostras foram consideradas positivas para toxoplasmose congênita e
tiveram como principais sinais a detecção de marcadores de infecção aguda,
anticorpos do tipo IgG presente por mais de um ano de idade e anormalidades
clínicas. Os autores ponderam ainda a respeito da necessidade da instauração de
medidas preventivas contra a toxoplasmose e que o rastreamento neonatal é
possível desde que sejam utilizados métodos com melhores performances, pois a
infecção congênita pelo T. gondii raramente é identificada por exames clínicos de
rotina.
GARWEG et al. (2005) compararam a resposta imune específica local de
indivíduos de Erechim, Sul do Brasil, com aqueles da Suíça. Os indivíduos sofriam
de toxoplasmose ocular ativa. Foram coletadas amostras pareadas de humor
aquoso e soro de 27 brasileiros e 50 suíços. Os resultados foram sugestivos de uma
14
deficiência mais pronunciada na barreira uveovascular dos pacientes brasileiros. Em
outra pesquisa, o sangue de 47 trabalhadores de oito fábricas de lingüiça no
município de Londrina, Paraná, foi analisado e 28 (59,5%) tiveram anticorpos anti-T.
gondii em seus soros (DIAS et al., 2005). Dos 36 que trabalhavam diretamente com
a produção de lingüiças, 20 (55,5%) apresentaram os anticorpos contra o parasita,
enquanto a prevalência para os envolvidos com outras funções foi de oito em 11
(72,7%). Segundo os estudo, não houve significância para o fator hábito dos
trabalhadores em relação à infecção por T. gondii.
Um trabalho de pesquisa recém-realizado relatou o primeiro isolamento e
caracterização genética de T. gondii viável em 7 de 28 suínos soropositivos em São
Paulo (dos SANTOS et al., 2005). De acordo com os autores, todos os isolados
foram letais para camundongos, sendo dois caracterizados geneticamente como do
tipo I e cinco como do tipo III.
3.2.3. Em Campos dos Goytacazes O município de Campos dos Goytacazes, localizado no Norte do Estado do
Rio de Janeiro, apresenta alta soroprevalência humana para anticorpos contra T.
gondii, de acordo com dados apresentados por BAHIA-OLIVEIRA et al. (2003).
Segundo esta pesquisa, os vários casos de uveíte humana, condizentes com
toxoplasmose, chamaram a atenção dos profissionais de saúde e pesquisadores e
culminaram em um estudo de 3 anos (1997-1999). De acordo com os resultados,
grande parte da população de baixa condição sócio-econômica do município
apresentou anticorpos anti-T. gondii (84%). Os valores para prevalência nos grupos
sócio-econômicos médio e alto foram 62% e 23%, respectivamente.
De posse destes resultados, uma série de estudos com o objetivo de se
detectar as principais fontes de infecção e fatores de risco associados à transmissão
da doença na região foram realizados (BAHIA-OLIVEIRA, et al., 2003; da SILVA et
al., 2003; DUBEY et al., 2003). BAHIA-OLIVEIRA et al. (2003) ponderaram ainda a
respeito da importância dos oocistos de T. gondii no ambiente, baseando-se no fato
de o principal fator de risco associado à soroprevalência nas classes sócio-
econômicas baixa e média ser a ingestão de água não filtrada.
Em outra pesquisa realizada no município, da SILVA et al. (2003) afirmaram
que a contaminação ambiental com oocistos de T. gondii era alta, com base em
15
testes sorológicos realizados em galinhas criadas soltas no município. No estudo,
198 galinhas tiveram amostras de seus sangues coletadas e os soros analisados
pelo MAT (Teste de Aglutinação Modificado), resultando em 129 amostras positivas.
Ainda, corações e cérebros de 86 das 198 galinhas foram submetidas à bioprova em
camundongos albinos para detecção de T. gondii. O protozoário foi isolado em 61
amostras (70,9%), inclusive de animais que haviam sido considerados negativos
pelo teste sorológico.
DUBEY et al. (2003) realizaram estudos de caracterização genética de
isolados em galinhas do município. A partir dos resultados os autores verificaram
que a maior parte dos isolados eram do tipo I (70%), contra 27% de isolados
caracterizados como do tipo III. Não foram encontrados isolados do tipo II nos
tecidos das galinhas estudadas. Gatos inoculados com 11 cepas do tipos I
eliminaram uma grande quantidade de oocistos em suas fezes (19-539 milhões),
indício de que há grandes possibilidades de disseminação desta cepa no ambiente.
3.3. A infecção em bovinos
A doença natural em ruminantes foi diagnosticada, pela primeira vez, em
bovinos na Alemanha, por HOUERSDORF e HOLTZ (1952), citados por MAYER
(1965). Quase concomitantemente, SANGER et al. (1953) demostraram a presença
de T. gondii em três vacas, um touro e dois bezerros procedentes de quatro
rebanhos diferentes no Estado de Ohio, EUA. Um bezerro oriundo de uma destas
vacas foi necropsiado logo após o nascimento. Toxoplasma gondii foi isolado do
fígado deste bezerro, assim como do colostro, parede uterina, baço e pulmão
maternos. Em pesquisa realizada por OLIVEIRA et al. (2001), os maiores títulos
obtidos para as espécies bovinas (Bos indicus e Bos taurus) e bubalinas (Bubalus
bubalis) inoculadas com 2 x 105 oocistos de T.gondii foram 256, 16.384 e 256,
respectivamente.
SANGER et al. (1953) e BEVERLEY et al.(1977) produziram sintomatologia
clínica em bovinos jovens e adultos semelhante a de animais naturalmente
infectados, através de inoculações com taquizoítas e cistos. T. gondii pôde ser
isolado após inoculação em camundongos e demonstrado histologicamente em
lesões de pulmão, cérebro, fígado e baço de bezerros inoculados.
16
JACOBS et al. (1960) realizaram estudos nos EUA sobre a presença de
cistos de T. gondii em carne de suínos, bovinos e ovinos, através da digestão
péptica artificial e inoculação em camundongos. Dos 60 diafragmas de bovinos
examinados, um apresentou infecção, demonstrada através da sorologia positiva
dos camundongos inoculados.
CATAR et al. (1969), na Tchecoslováquia, isolaram oito (9,4%) amostras de
T. gondii de cérebro e diafragma de 85 bovinos. Destas oito, seis foram isoladas de
animais com 2 a 3 anos de idade e o restante com 5 a 6 anos. Quatro amostras
foram obtidas de cérebro, duas de diafragma e 2 de ambos os órgãos. Das oito
amostras isoladas de bovinos, sete eram oriundas de animais com título igual ou
maior que 1:8 na reação de fixação de complemento. Apenas uma amostra foi
isolada de bovinos com título 1:4. Baseando-se nestes achados, os autores
consideraram os bovinos reservatórios de T. gondii.
Outros trabalhos sobre a tentativa de isolamento do T. gondii em ruminantes
são encontrados na literatura (FERGUNSON e ELLIS, 1979; COSTA, 1979;
OLIVEIRA et al., 2001). Fígado, baço, linfonodos mesentéricos, pulmão e
musculatura foram os órgãos de maior prevalência do parasita.
COSTA et al. (1977), no Brasil, infectaram experimentalmente bezerros
(B.taurus) com média etária de três meses, via oral, com oocistos de T. gondii. O
isolamento na musculatura comprovou mais uma vez a importância da infecção por
T. gondii em saúde pública, porquanto da ingestão de carne infectada crua ou mal
cozida, representando perigo de infecção humana (COSTA et al., 1977).
Evidentemente, tornam-se necessárias novas investigações especialmente
delineadas para o estabelecimento definitivo da importância desta espécie animal na
cadeia epidemiológica da toxoplasmose em diferentes países (DUBEY, 1993).
OLIVEIRA et al. (2001), inoculou oocistos via oral em três de cada espécie
de ruminantes (Bos indicus, Bos taurus e Bubalus bubalis) isolando T. gondii de
diversos tecidos. Chamou a atenção o isolamento do parasito nos músculos psoas
maior (filé mignon) de dois B. indicus e no músculo glúteo superficial (picanha) de
um B. indicus e um B. bubalis. Bubalinos e zebuínos apresentaram aparente
normalidade clínico laboratorial, ao contrário dos taurinos (OLIVEIRA et al.,2001).
Entretanto, apresentaram igual comportamento quanto a presença de cistos em seus
tecidos (OLIVEIRA et al., 2001).
17
A prevalência da toxoplasmose em bovinos tem sido mensurada em todo o
mundo, como pode ser observado no Quadro 1.
Quadro 1. Prevalências de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em bovinos no mundo
PAÍS LOCALIDADE % AMOSTRAS ESTÁGIO APTIDÃO TESTE AUTORES Bangladesh 75 16,10 205 - - Aglutinação em látex Samad et al. (1993)
Brasil Bahia 1,03 194 - - Aglutinação em látex Pita Gondim et al. (1999)
Brasil Rio de janeiro 14,8 589 vacas adultas leite Imunofluorescência Indireta Albuquerque et al. (2005)
China Guangdong 4,4 90 - - Hemaglutinação Indireta Lin et al. (1990)
Costa Rica - 34,4 601 - - Imunofluorescência Indireta Arias et al. (1994b)
Etiópia Região central 6,6 785 - - Hemaglutinação Indireta Bekele e Kasali (1989)
EUA Montana 3,2 - - - Aglutinação Modificado Dubey (1985)
- 1,2 - bezerros - - van Knapen et al. (1995) Holanda
- 27,9 - vacas adultas leite -
Índia Região Norte 19,3 243 - - Hemaglutinação Indireta Chhabra et al. (1985)
Indonésia Lampung 9,0 200 - - Aglutinação em látex Matsuo e Husin (1996)
Irã - 0,0 2000 - - Aglutinação em látex / Hemaglutinação Indireta Hashemi-Fesharki (1996)
Paquistão Região sudeste 25,0 100 abate carne Aglutinação em látex Zaki (1995)
Polônia - 55,5 - - - Aglutinação Direta Uminski et al. (1989)
Sérvia - 76,3 611 - - Aglutinação Modificado Klun et al. (2006)
- 3,0 - vacas adultas - Ensaio Imunoenzimático Wyss et al. (2000)
- 2,0 - touros jovens - -
- 6,0 - novilhas - -
Suíça
- 1,0 - bezerros - -
Vietnã Região Sul 10,5 200 vacas adultas leite Aglutinação Direta Huong et al. (1998)
3.3.2. A infecção em suínos
A detecção de anticorpos anti-T.gondii em suínos através da utilização de
testes sorológicos foi introduzida por WEINMAN e CHANDLER (1956), os mesmos
que, pela primeira vez, investigaram a associação entre a toxoplasmose nos suínos
e nos seres humanos.
A dosagem de anticorpos específicos para T.gondii em suínos tem
importantes aplicações na determinação das freqüências atuais da infecção e como
uma ferramenta para a vigilância sanitária na detecção da toxoplasmose em granjas
de suínos (LIND et al., 1997).
De acordo com D`ÁNGELINO e ISHIZUKA (1986), os levantamentos
soroepidemiológicos visando a detecção de anticorpos anti-T. gondii em matadouros
ou em rebanhos são realizados não só para estimar a freqüência da ocorrência da
infecção em suínos, como também para avaliar o risco de infecção a que se expõe a
população humana que se alimenta da carne e de outros produtos derivados desta
18
espécie animal. Diversos são os trabalhos que relatam a freqüência com que os
suínos são diagnosticados como positivos para a presença de anticorpos anti-
T.gondii (Quadro 2).
Quadro 2. Prevalências de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em suínos no mundo.
PAÍS LOCALIDADE % AMOSTRAS MANEJO / ESTÁGIO TESTE AUTORES Alemanha - 5,6 300 convencional / - - - 0,0 100 orgânico / - -
Schulzig e Fehlhaber (2005)
Alemanha Hesse 19,0 2041 - Ensaio Imunoenzimático Damriyasa et al. (2004) Alemanha Munsterland 9,3 1500 - Ensaio Imunoenzimático Damriyasa e Bauer (2005) Suíça - 0,0 - - Ensaio Imunoenzimático Wyss et al. (2000) Argentina - 37,8 230 - / abate Aglutinação Modificada Argentina - 4,5 88 tecnificado / - Aglutinação Modificada Argentina - 40,2 112 a pasto Aglutinação Modificada
Venturini et al. (2004)
Áustria (1982) - 13,7 - - Áustria (1992) - 0,9 -
Imunofluorescência Indireta Edelhofer (1994)
Brasil São Paulo 9,6 300 abate Ensaio Imunoenzimático / Western Blot Suarez-Aranda et al. (2000)
Peru Lima 32,3 96 abate Ensaio Imunoenzimático / Western Blot Suarez-Aranda et al. (2000)
Canadá - 9,4 1443 abate Aglutinação Modificado Smith (1991) China Guangdong 10,4 816 - Hemaglutinação Indireta Lin et al. (1990)
Costa Rica - 43,8 496 - Imunofluorescência Indireta Arias et al. (1994b)
Espanha - 38,4 507 animais selvagens Aglutinação Modificada Gauss et al. (2005) Peru Lima 27,7 137 EUA Geórgia 16,4 152 - / abate Western Blot Saavedra e Ortega (2004)
EUA Ilha de Ossabaw 0.9 1264 Dubey et al. (1997)
continente (Georgia) 18.2 170 animais selvagens Aglutinação Modificada
Sabin-Feldman Dye Test Hemaglutinação Indireta
EUA Illinois 20,8 5080 - / matrizes Aglutinação Modificada Weigel et al. (1995) EUA Illinois 3,1 1885 - / terminação Aglutinação Modificada Weigel et al. (1995) EUA Iowa 14,3 273 - / matrizes Aglutinação Modificada Smith et al. (1992) EUA Iowa 22,2 1000 - / abate Aglutinação Modificada Dubey et al. (1995) EUA Montana 5,0 413 - Sabin-Feldman Dye Test Dubey (1985) Finlândia - 2,5 1847 - / abate Ensaio imunoenzimático Hirvela-Koski (1992) Gana - 39 - - Ensaio Imunoenzimático Arko-Mensah et al. (2000) Havaí Oahu 48,5 59 - Agglutination Test Dubey et al. (1992) Holanda - 2,1 23348 - Ensaio Imunoenzimático Berends et al. (1991) Índia Região Norte 31,5 178 - Hemaglutinação Indireta Chhabra et al. (1985) Japão Ilha Amakusa 1,1 90 animais selvagens Aglutinação em Látex Shiibashi et al. (2004) Japão Kitakyushu 9,1 208 - / abate - Horio et al. (2001) Polônia - 27,9 - - Aglutinação Modificada Uminski et al. (1989) República Checa - 15,0 124 animais selvagens Sabin-Feldman Dye Test Hejlicek et al. (1997) Suécia - 5,2 807 - / abate Ensaio Imunoenzimático Lunden et al. (2002) Taiwan - 27,65 3880 - Aglutinação em Látex Chang et al. (1991)
Taiwan - 47,11 3880 - Ensaio Imunoenzimático-IgM Chang et al. (1991)
Taiwan Taoyuan 28,8 111 - / abate Aglutinação em Látex Fan et al. (2004) Trinidade e Tobago - 5,5 - - / abate - Adesiyun e Cazabon (1996)
Zimbábue - 9,3 97 domiciliar / - Aglutinação Enzimática Hove e Dubey (1999)
Sinais de toxoplasmose clínica em suínos foram relatados por
WINGSTRAND et al. (1997) e incluíram inapetência, febre e debilitação. Os suínos,
com oito semanas de idade, foram infectados experimentalmente e apresentaram
perda significativa de peso em duas semanas de infecção. No entanto, obtiveram
crescimento compensatório até a oitava semana de infecção. Os mesmos autores
ponderaram a respeito do suco da carne como uma alternativa viável ao soro para
detecção de infecção por T. gondii nestas espécies animais.
19
3.4. Vigilância Sanitária e Toxoplasma gondii
Além de causar prejuízo à pecuária, a toxoplasmose tem impacto também
em saúde pública, visto que os cistos teciduais podem permanecer viáveis durante
longos períodos (BLEWETT e WATSON, 1993; BUXTON, 1990) e o consumo de
carne mal cozida pode levar à infecção humana e animal (FRENKEL, 1990; SMITH,
1993). Por outro lado, placentas e fetos mortos infectados com cistos de T. gondii
podem servir como fonte de infecção para roedores e pássaros. Felídeos, após
consumirem tais animais, excretam um grande número de oocistos de T. gondii
(DUBEY, 1977), favorecendo a disseminação do agente na natureza.
Apesar de a toxoplasmose humana, enquanto doença, ser relativamente
rara, a soroprevalência de anticorpos contra o parasita é alta. DESMONTS et al.
(1965), citados por DUBEY (1977), descreveram alta soropositividade humana em
Paris (80%), onde a ingestão de carne crua é costume. Em países dos mais variados
climas o percentual de positividade sorológica humana varia de 20 a 83%.
A maioria dos surtos de toxoplasmose humana tem sido atribuída ao
consumo de carne crua ou insuficientemente cozida. KEAN et al. (1969), citados por
DUBEY (1977), descrevem uma pequena epidemia de toxoplasmose em estudantes
de medicina da Universidade Cornell, os quais tinham ingerido hambúrgueres mal
cozidos. MAGALDI et al. (1967) relataram 30 casos em um seminário no interior do
Estado de São Paulo. Na Universidade de São José dos Campos, após a ingestão
de carne mal cozida, 110 pessoas tiveram a infecção, com 79 indivíduos
apresentando sinais de febre e linfadenopatia (MAGALDI et al., 1969). Outros surtos
de toxoplasmose aguda após a ingestão de carne mal cozida têm sido relatados,
mas a origem da carne não pôde ser determinada (SMITH, 1993).
Trabalhos com o objetivo de isolar T. gondii viável em tecidos de animais
utilizados para consumo humano são cada vez mais freqüentes. Em recente trabalho
de pesquisa, DUBEY et al. (2002) isolaram o parasita em 51 de 55 suínos
destinados ao consumo humano numa fazenda em Massachussetts, EUA. Os
suínos tinham idade de mercado (seis meses) e os tecidos testados foram coração e
língua. Estes autores ponderam, ainda, que até a implementação de um exame de
carnes para detecção de infecção por T. gondii em abatedouros, toda carne deve ser
cozida de acordo com os padrões industriais antes de seu consumo.
JAMRA et al. (1969), numa tentativa de avaliar a importância dos alimentos
de origem animal como fontes de infecção por T. gondii para a população da cidade
20
de São Paulo, examinaram 98 amostras de carne, fígado e cérebro de bovinos. Das
amostras de carne 8,1% encontravam-se parasitadas por T. gondii. Os dados de
isolamento destes autores basearam-se na sorologia positiva à reação de Sabin-
Feldman dos camundongos inoculados e permitem inferir que os baixos títulos
encontrados, iguais ou menores que 1:16, sem isolamento de parasito, possam
resultar da presença de anticorpos específicos em camundongos inoculados com
cistos inviáveis. Acreditam os autores que esta reação sorológica é sensível para
detectar infecção em camundongos e que várias passagens sucessivas são
usualmente desnecessárias para o isolamento do parasita.
Pelos trabalhos mencionados, pode-se verificar que a freqüência da infecção
por T. gondii em bovinos e suínos é relativamente alta (COSTA et al., 1977).
OLIVEIRA et al. (2001) comprovam ainda que a aparente normalidade clínico
laboratorial de espécies mais rústicas, como bubalinos e zebuínos, não impede a
disseminação do protozoário em seus tecidos.
Tendo em vista a importância da produção de alimentos de origem animal
livres de doenças que afetam o homem, algumas pesquisas têm fornecido
importantes informações acerca da inativação de parasitas na carne. HILL et al.
(2004) avaliaram os efeitos de diversos condimentos e sais na viabilidade de T.
gondii presente em carne suína. O estudo provou que soluções de cloreto de sódio a
2% e lactato de potássio ou lactato de sódio a 1,4% ou mais, sozinhos ou em
combinação com outras substâncias, foram capazes de evitar a transmissão de T.
gondii através de lombos de porcos infectados experimentalmente.
É crescente a quantidade de estudos a respeito de formas de prevenção da
toxoplasmose. DUBEY et al. (1998) imunizaram suínos com oocistos inativados por
radiação. A bioprova de tecidos destes animais em camundongos indicou menos
cistos em amostras teciduais retiradas de animais vacinados. Outros trabalhos vêm
respaldar essa necessidade de se investir em melhores métodos de detecção de T.
gondii em alimentos. T. gondii viável foi isolado de uma de 67 amostras de carne
suína curada pronta para consumo (WARNEKULASURIYA et al., 1998).
Adicionalmente, maiores considerações são necessárias para implicações do
consumo de carnes curadas durante a gravidez (WARNEKULASURIYA et al., 1998).
NAVARRO et al. (1992) avaliaram a resistência de T. gondii presente em amostras
de lingüiça suína ao cloreto de sódio e outros condimentos (pimenta e alho).
Lingüiças preparadas com tecidos de suínos infectados experimentalmente foram
21
tratadas com as citadas substâncias. O tratamento com o sal em concentrações de
2% e 2,5%, por um período de no mínimo 48 horas eliminou efetivamente o parasita.
3.5. O ensaio imunoenzimático - ELISA
Os métodos de pesquisa de anticorpos vêm conquistando a confiança de
pesquisadores em todo o mundo, principalmente como medida preventiva em
substituição aos procedimentos de inspeção de produtos de origem animal, quando
estes não são os mais indicados para o diagnóstico (HIRVELA-KOSKI, 1992). É o
caso da detecção de T. gondii em carcaças animais, pois os métodos parasitológicos
são muito dispendiosos (HIRVELA-KOSKI, 1992) para uso em procedimentos de
inspeção rotineiros.
O ensaio imunoenzimático (ELISA) é um excelente teste para detecção de
anticorpos anti-T. gondii em virtude de sua capacidade para captar respostas
humorais ínfimas originadas, por exemplo, em casos de infecções latentes (DUBEY
et al., 1996). Estes autores realizaram análises em suínos infectados
experimentalmente por via oral com oocistos de T. gondii e obtiveram boa
sensibilidade. Com o objetivo de determinar a sensibilidade e especificidade do
ELISA para detecção de anticorpos do tipo IgG contra T. gondii, DUBEY et al. (1995)
fizeram uso da bioprova em camundongos e gatos como prova comparativa. Os
resultados foram 73% de sensibilidade e 86% de especificidade.
Nem sempre a positividade sorológica garante uma facilidade de isolamento
(NAVARRO et al., 1992). DUBEY et al. (1996) isolaram T. gondii viável em suínos
infectados sem, entretanto, encontrar soropositividade para quaisquer técnicas.
Entretanto, ARAÚJO et al. (1998) ponderam que os sucessos do ELISA em várias
pesquisas prevê uma rápida disseminação do seu uso em exames sorológicos em
suínos.
Como todo método laboratorial, o ELISA possui vantagens e desvantagens.
A única grande desvantagem para a aplicação rotineira do ELISA é a complexidade
da padronização (FRENKEL, 1997). Todavia, seus prós são suficientemente
satisfatórios, pois é um método altamente sensível e específico, além de não
apresentar riscos aos técnicos que o executam (GUHL et al., 1981). Ainda, é
indicado para estudos epidemiológicos pela possibilidade de utilização de uma única
diluição dos soros a serem testados (GUHL et al., 1981).
22
Em adição, devido a peculiaridades inerentes à natureza do sistema enzima-
substrato e ao antígeno utilizado, o valor do “cut-off” precisa ser constantemente
calculado (SANCHEZ et al., 1985). Segundo VENKATESAN e WAKELIN (1993), não
se pode presumir que os padrões utilizados para um sistema sejam ideais para
outro. Não há padrões para os testes sorológicos no diagnóstico da toxoplasmose,
desta forma, é fundamental adaptar cada ensaio para os diferentes sistemas
(DUBEY et al., 1996).
23
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Seleção das propriedades
Foram selecionadas para o estudo criações de bovinos e suínos de áreas
urbanas do município de Campos dos Goytacazes-RJ e arredores, aproveitando-se
a casuística de atendimentos a domicílio da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro (UENF).
A região Norte Fluminense possui um efetivo total de 518.465 bovinos e
18.114 suínos (IBGE, 1997). Todavia, existem propriedades urbanas e de arredores
que criam bovinos e suínos, mas não são contabilizadas em estatísticas oficiais.
Estas propriedades são responsáveis por um expressivo contingente animal.
4.2. Classificação das propriedades 4.2.1. De bovinos
As propriedades que tiveram sangue dos bovinos coletado foram
classificadas de acordo com o tipo de produção e manejo. No que diz respeito à
produção, as propriedades foram divididas em produtoras de leite, produtoras de
carne e produção mista (leite e carne). Quanto ao tipo de manejo, foram
classificadas em sistema de criação extensivo, semi-extensivo e intensivo. Os
animais tiveram fichas individuais, onde constaram os números ou nomes, idade,
sexo, estado geral e presença de outros parasitos.
24
4.2.2. De suínos
As propriedades cujo sangue dos suínos foi coletado foram classificadas de
acordo com o sistema de criação em domiciliares e de confinamento. A exemplo dos
bovinos, estes animais também tiveram fichas individuais, onde constaram o número
ou nome, idade, sexo, estado geral e presença de outros parasitos.
4.3. Coleta de sangue e remoção dos soros
A escolha dos animais para coleta das amostras foi por conveniência
(PEREIRA, 1995).
Foram coletadas 77 amostras sanguíneas de bovinos. O sangue foi obtido
por punção da veia jugular, utilizando-se seringas e agulhas descartáveis de
dimensões 30 x 8 mm.
Dos suínos, foram coletadas 62 amostras sanguíneas. O sangue dos
animais de criações domiciliares foi obtido da veia marginal da orelha, através de
seringas e agulhas descartáveis de dimensões 25 x 6 mm. O sangue dos animais de
criações sob sistema de confinamento foi obtido diretamente de um abatedouro da
cidade de Itaperuna, durante o abate dos animais.
Os sangues foram acondicionados em tubos de vidro de 5ml, sem
anticoagulante, identificados e levados ao Setor de Parasitologia e Doenças
Parasitárias do Laboratório de Sanidade Animal (LSA) da UENF, onde foram
centrifugados a 200g por 10 minutos para sedimentação dos coágulos. Os soros
foram removidos com o auxílio de uma micropipeta graduada de 100-1000 µl,
acondicionados em microtubos de 2ml do tipo “eppendorf”, devidamente
identificados e mantidos sob temperatura de -20ºC até o momento da realização do
teste sorológico.
4.4. Padronização do teste sorológico
O teste sorológico para detecção de anticorpos anti-T. gondii do tipo IgG
empregado nesta pesquisa foi o ELISA indireto, padronizado e executado no
Laboratório de Biologia do Reconhecer (LBR) do Centro de Biociências e
Biotecnologia (CBB) da UENF.
25
O antígeno utilizado no teste sorológico foi produzido a partir de espécimes
de T. gondii da cepa RH. Esta é mantida em camundongos albinos (Mus musculus)
no Infectório do CBB e em cultivo celular no LBR.
4.4.1. Para análise de soro bovino
Os soros controle positivo e negativos, para a padronização do teste de
ELISA Indireto para detecção de anticorpos anti-T. gondii em soros de bovinos,
foram gentilmente cedidos pelo Dr. Jitender. P. Dubey do U.S.D.A. (“United States
Department of Agriculture”).
Uma placa de poliestireno com 96 poços1 (placa de ELISA) foi sensibilizada
com antígeno de T. gondii da cepa RH na concentração de 10µg/ml, diluído em
tampão carbonato-bicarbonato (pH 9,6), durante 18 a 20 horas a 4ºC.
Após o período de sensibilização, a placa foi lavada três vezes com solução
PBS/T (tampão salina fosfato + Tween 20) 0,05%, seca por inversão em papel
toalha e bloqueada com PBS-T 0,1%, PBS-T 0,05% + BSA (Albumina Sérica Bovina)
1%, e PBS-T 0,05% + Ovalbumina 1%, em três setores proporcionalmente idênticos
da placa, incubando-se a 37ºC por duas horas. As soluções bloqueio foram
descartadas e a placa foi lavada conforme acima descrito.
Foram adicionados os soros controle positivo e negativos previamente
diluídos em solução contendo PBS-T 0,05% + BSA 0,5%, 100µl/poço, sob as
diluições 1:500 e 1:1000. As duas diluições foram associadas aos três tipos de
bloqueio. A placa foi incubada a 37ºC por uma hora, lavada três vezes com solução
PBS-T 0,05% e seca como acima descrito. Acrescentaram-se, então, 100µl/poço da
solução contendo os anticorpos anti-IgG bovino conjugados a peroxidase2,
previamente diluída na concentração 1:4000 em PBS-T 0,05% + BSA 0,5%,
incubando-se a 37ºC por uma hora.
Ao término deste período, a placa foi lavada, seca e revelada pela adição da
solução substrato {ácido cítrico 2,1%, fosfato de sódio desidratado 2,84%, ABTS
[2,2-azino-bis(3-ethylbenz-thiazoline-G-sulfonic acid)]1mg/ml, e H2O2 a 0,003%}, que
reagiu com a peroxidase e resultou numa coloração verde, onde a reação foi
positiva.
1 IMMUNLON 2-DYNATECH 2 SIGMA
26
Foram deixados poços para os controles branco e conjugado. Nos poços
reservados para o controle branco adicionou-se tampão carbonato-bicarbonato (pH
9,6), em substituição ao antígeno, na fase de sensibilização, e PBS-T 0,05% nas
fases de bloqueio e de adição dos soros controle, seguindo-se normalmente as
outras fases do processo. Nos poços reservados para o controle do conjugado
apenas não foram adicionados os soros controle, substituindo-os por PBS-T 0,05%
no mesmo volume.
A reação foi interrompida com a adição de 30µl da solução de ácido cítrico
(42g de ácido cítrico em um litro de água destilada) após o surgimento da cor. A
leitura da placa foi feita no leitor de ELISA3, utilizando-se filtro de 405nm.
4.4.2. Para análise de soro suíno
Uma placa de ELISA foi sensibilizada com antígenos de T. gondii da cepa
RH em duas concentrações diferentes, 5 e 10µg/ml, diluídas em tampão carbonato-
bicarbonato (pH 9,6), durante 18 a 20 horas a 4ºC.
Após o período de sensibilização, a placa foi lavada três vezes com solução
PBS-T 0,05%, seca por inversão em papel toalha, bloqueada com solução PBS-T
0,05% + BSA 1% e incubada a 37ºC por duas horas. A solução bloqueio foi
descartada e a placa foi lavada conforme acima descrito.
Foram adicionados os soros controle positivos e negativos previamente
diluídos em PBS-T 0,05% + BSA 0,5%, 100µl/poço, em três diluições: 1:200, 1:400 e
1:800. As três diluições foram associadas a ambas as concentrações do antígeno. A
placa foi incubada a 37ºC por uma hora, lavada três vezes com solução PBS-T
0,05% e seca como acima descrito. Acrescentaram-se então os anticorpos anti-IgG
suína conjugados a peroxidase4, previamente diluídos nas concentrações 1:10.000 e
1:20.000 em PBS-T 0,05% + BSA 0,5%, incubando-se a 37ºC por uma hora. Ambas
as diluições foram também associadas às duas concentrações do antígeno e às três
diluições dos soros controle.
Ao término deste período, a placa foi lavada, seca e revelada pela adição da
solução substrato (item 4.4.1.), que reagiu com a peroxidase resultando numa
coloração verde, onde a reação foi positiva.
3 DYNATECH MR500 4 SIGMA
27
Foram deixados poços, em duplicata, para os controles branco e conjugado,
conforme descrito no item 4.4.1.
A reação foi interrompida com a adição de 30µl da solução de ácido cítrico
(item 4.4.1.) após o surgimento da cor. A leitura da placa foi feita no leitor de ELISA,
utilizando-se filtro de 405nm.
4.5. Avaliação sorológica 4.5.1. Nos bovinos
Duas placas de ELISA foram sensibilizadas com antígeno de T. gondii da
cepa RH previamente diluído com tampão carbonato-bicarbonato (pH 9,6) na
concentração 10µg/ml, incubando-se por 18 a 20 horas a 4ºC.
Após o período, as placas foram lavadas três vezes com solução PBS-T
0,05%, secas por inversão em papel toalha, bloqueadas com solução PBS-T 0,1% e
incubadas a 37ºC por duas horas. A solução bloqueio foi então descartada e as
placas foram lavadas como descrito acima.
Foram adicionados os soros controle (positivo e negativos) e os soros dos
bovinos a serem analisados, previamente diluídos em PBS-T 0,05% + BSA 0,5%,
100µl/poço, em 1:500. As placas foram incubadas a 37ºC por uma hora, lavadas três
vezes com solução PBS-T 0,05% e secas como acima descrito. Acrescentou-se,
então, a solução com os anticorpos anti-IgG bovino conjugados a peroxidase
previamente diluídos na concentração 1:4000 em PBS-T 0,05% + BSA 0,5% a 37ºC
por uma hora.
Ao término deste período, as placas foram lavadas, secas e reveladas pela
adição da solução substrato mencionada no item 4.4.1., que reagiu com a
peroxidase resultando numa coloração verde, onde a reação foi positiva.
Foram deixados poços para os controles branco e conjugado, como descrito
no item 4.4.1.
A reação foi interrompida com a adição de 30µl da solução de ácido cítrico
(item 4.4.1.) após o surgimento da cor. A leitura da placa foi feita no leitor de ELISA,
utilizando-se filtro de 405nm.
28
4.5.2. Nos suínos
Duas placas de ELISA foram sensibilizadas com antígeno de T. gondii da
cepa RH previamente diluído com tampão carbonato-bicarbonato (pH 9,6) na
concentração 5µg/ml, incubando-se durante 18-20 horas a 4ºC.
Após este período, as placas foram lavadas por três vezes com solução
PBS-T 0,05%, secas por inversão em papel toalha e bloqueadas com solução PBS-T
0,05% + BSA 1%, incubando-se a 37ºC por duas horas. A solução bloqueio foi então
descartada e as placas foram lavadas como descrito acima.
Foram adicionados os soros controle (positivos e negativos) e os soros dos
suínos a serem avaliados previamente diluídos em PBS-T 0,05% + BSA 0,5%,
100µl/poço, em 1:400. As placas foram incubadas a 37ºC por uma hora, lavadas três
vezes com solução PBS-T 0,05% e secas como acima descrito. Acrescentou-se,
então, a solução com os anticorpos anti-suíno conjugados a peroxidase previamente
diluídos na concentração 1:20.000 em PBS-T 0,05% + BSA 0,5%, incubando-se a
37ºC por uma hora.
Ao término deste período, as placas foram lavadas, secas e reveladas pela
adição da solução substrato mencionada no item 4.4.1., que reagiu com a
peroxidase e resultou numa coloração verde, onde a reação foi positiva.
Foram deixados poços para os controles branco e substrato, conforme
descrito no item 4.4.1.
A reação foi interrompida com a adição de 30µl da solução de ácido cítrico
(item 4.4.1.) após o surgimento da cor. A leitura da placa foi feita no leitor de ELISA,
utilizando-se filtro de 405nm.
4.6. Visualização dos resultados sorológicos
Após a leitura das placas, foram obtidos valores numéricos que representam
as variações de cor formadas após a adição da solução substrato. Esta variação de
cor é denominada densidade óptica (DO).
Através das DOs dos soros controle negativos calculou-se um valor
referencial a partir do qual a soropositividade ou não, de cada amostra, foi
discriminada. Este valor referencial é chamado “cut-off”. Valores de DO superiores
29
ou iguais ao “cut-off” foram considerados positivos, enquanto valores inferiores foram
considerados negativos.
Para o cálculo do “cut-off”, utilizou-se a seguinte fórmula:
cut-off = + 3s
= média dos controles negativos s = desvio padrão da média
4.7. Seleção dos estabelecimentos comerciais
Foram selecionados para o estudo estabelecimentos populares que
comercializam carne suína in natura para consumo humano no município de
Campos dos Goytacazes. O critério de seleção dos estabelecimentos para coleta
das amostras foi por conveniência (PEREIRA, 1995) e naqueles de maior procura
pelo consumidor.
4.8. Aquisição dos encéfalos suínos
Foram adquiridas 12 cabeças de suínos diretamente nos estabelecimentos
comerciais. Estas foram abertas com o uso de serras, que foram eficientemente
lavadas e autoclavadas após cada utilização, evitando contaminação entre os
tecidos. Os encéfalos foram retirados, armazenados em recipientes individuais
identificados e mantidos sob refrigeração até seu processamento.
4.9. Digestão péptica das amostras encefálicas
A aplicação da técnica de digestão péptica baseou-se em protocolo
previamente estabelecido por DUBEY (1998b), assim como o preparo do inóculo,
com algumas modificações.
30
Cada encéfalo foi triturado por inteiro e separadamente, utilizando-se para
isso um liquidificador de uso doméstico. Durante a trituração adicionou-se um
volume mínimo de PBS para facilitar o procedimento. O copo do aparelho foi
devidamente lavado entre as etapas para evitar contaminação entre as amostras.
Foram então retirados 40 gramas de cada homogeneizado, que foram armazenados
individualmente em Erlenmeyers de 200ml devidamente identificados. Completou-se
o conteúdo com solução de pepsina ácida até o volume de 200ml. A pepsina ácida
foi preparada com a adição de 2,6 g de pepsina, 5 g de cloreto de sódio e 7 ml de
ácido clorídrico, completando-se com água destilada até atingir um volume total de
500 ml. Com o auxílio de um peagâmetro, estabilizou-se o pH entre 1,1 e 1,2.
O processo de digestão foi simulado com o uso de um agitador orbital
termostatizado (incubadora tipo “shaker”), programado para uma temperatura de
37°C durante uma hora. Após este período, o material digerido foi passado em tamis
com gaze dupla, o filtrado distribuído em quatro tubos de 50ml e então centrifugado
a 1800g por 10 minutos.
Após a centrifugação, descartou-se o sobrenadante, restando apenas um
“pellet” de aproximadamente 5 ml no interior de cada tudo. Completou-se o conteúdo
com solução neutralizadora até atingir um volume final de 10 ml. Para o preparo da
solução neutralizadora (bicarbonato de sódio 1,2%) adicionaram-se 12 g de
bicarbonato de sódio e água destilada até atingir um litro. O pH da solução final foi
estabilizado em 8,3.
O conteúdo total de cada um dos quatro tubos foi reunido em um único tubo
de 50ml. Este foi centrifugado e processado a 1800g durante 20 minutos. Após a
centrifugação, o sobrenadante foi descartado e adicionaram-se cinco a 10 ml de
solução antibiótica. A solução antibiótica foi preparada com a adição de 100 µg/ml
de estreptomicina e 1000 UI de penicilina. 4.10. Bioprova
4.10.1. Inoculação Foram utilizados 48 camundongos albinos, pesando entre 20 e 25 g,
oriundos do Biotério da UENF. Duas doses de 1 ml da suspensão contendo o
produto da digestão péptica foram inoculadas via intraperitoneal (i.p.) nos
camundongos, com um intervalo de 24 horas entre as inoculações. Foram utilizados
31
três camundongos para cada amostra, totalizando 36 camundongos inoculados.
Outros 12 receberam inóculo contendo apenas o veículo (Tampão Salina Fosfato –
PBS) e serviram como controle para cada três amostras de encéfalo analisadas.
4.10.2. Isolamento do parasita
Cada grupo de camundongos inoculados, referente a um encéfalo
examinado, foi mantido em uma caixa devidamente identificada e recebeu ração
própria para a espécie e água ad libitum. Os animais foram observados durante seis
semanas. Aqueles que morreram, apresentaram aumento de volume abdominal ou
qualquer sinal que sugeriu infecção por T. gondii, foram examinados para eventual
presença do parasita em líquido peritoneal e impressão de órgãos em lâminas,
através da observação em microscópio óptico5 após coloração com GIEMSA. Os
encéfalos dos camundongos que não apresentaram quaisquer sinais de
toxoplasmose ao fim do período de observação foram examinados através de
observação direta de esfregaços de encéfalos ao microscópico óptico e da técnica
de arrasto.
a) Observação de taquizoítas em líquido peritoneal
Nos animais que morreram ou apresentaram aumento de volume abdominal
e/ou outros sinais que demonstraram suspeita da doença foi realizada lavagem
peritoneal com solução salina 0,9%. Uma gota do conteúdo foi então colocada entre
lâmina e lamínula para observação de formas de proliferação rápida de T. gondii
(taquizoítas).
b) Impressão de órgãos em lâminas Daqueles animais que vieram a óbito ou que foram eutanasiados, por
apresentarem aumento de volume abdominal, foram colhidas amostras de fígado,
baço e pulmão. Estas amostras passaram por um procedimento que consiste em
opor fragmentos de tecidos em lâminas, fixar com metanol, corar com GIEMSA e
5 OPTON
32
observar ao microscópio óptico em busca de taquizoítas. Para a coloração com
GIEMSA, cada lâmina foi completamente coberta com o corante (Azur II 80mg/dl +
Eosinato de Azur II 100mg/dl), através do auxílio de uma pipeta Pasteur. Decorridos
30 minutos, as lâminas foram lavadas em água corrente para remoção do excesso
do corante e secas à temperatura ambiente.
c) Observação direta de esfregaços de encéfalos
Os animais que não vieram a óbito 42 dias após a inoculação foram
eutanasiados, seus encéfalos retirados e individualmente macerados com PBS em
quantidade suficiente apenas para homogeneização da mistura. Em seguida, com o
auxílio de seringas e tubos de 15 ml, foram feitos esfregaços em lâminas para
observação direta ao microscópio óptico em busca de cistos encefálicos.
d) Técnica de arrasto Ainda acerca dos animais que não vieram a óbito após o fim do período de
observação, fragmentos dos tecidos encefálicos foram utilizados para a observação
de cistos cerebrais sob a técnica de arrasto.
Esta técnica consiste em colocar-se um fragmento de tecido entre duas
lâminas e arrastar uma sobre a outra, formando uma camada delgada de tecido para
observação ao microscópio óptico após fixação e coloração com GIEMSA.
4.10.3. Eutanásia
A eutanásia dos camundongos utilizados neste experimento foi realizada em
câmara de CO2, conforme resolução nº 714 de 20 de junho de 2002 do Conselho
Federal de Medicina Veterinária (CFMV, 2002) e com a Lei Estadual nº 3900/02
(ALERJ, 2002).
33
4.11. Análise estatística das medidas dos taquizoítas
As medidas médias e os índices morfométricos dos taquizoítas foram
submetidos à análise descritiva e suas médias comparadas através do teste de
Tukey (PIMENTEL GOMES, 2000).
34
5. RESULTADOS
5.1. Padronização do teste sorológico 5.1.1. Para amostras bovinas
As amostras de soros de bovinos foram testadas nas diluições 1:500 e
1:1.000, nos três sistemas, a primeira permitiu melhor distinção entre os controles.
As três concentrações de solução bloqueio apresentaram resultados
satisfatórios e podem ser utilizadas em ensaios imunoenzimáticos para análise da
presença de anticorpos anti-T. gondii em soros de bovinos (figura 2). Entretanto, o
sistema que utilizou PBS-T 0,1% como bloqueio foi o escolhido para esta análise.
5.1.2. Para amostras suínas
Dentre as diluições de soro 1:200, 1:400 e 1:800, a que melhor permitiu
observar as diferenças existentes entre os soros positivos e negativos nos quatro
sistemas apresentados foi a diluição 1:400, como pode ser observado nas figuras 3
e 4.
A diluição do conjugado escolhida foi 1:20.000 (Figura 4) e a concentração
de antígeno escolhida para sensibilização da placa foi 5µg/ml (Figuras 3 e 4).
35
0,6135
0,3495
0,46
0,251
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
1 500 + 1 500 - 1 1000 + 1 1000 -
0,6795
0,327
0,457
0,236
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
1 500 + 1 500 - 1 1000 + 1 1000 -
0,6385
0,326
0,4925
0,2515
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
1 500 + 1 500 - 1 1000 + 1 1000 -
B C
A
Figura 2. Valores em densidade óptica (DO) em ensaio para padronização deELISA indireto em soros de bovinos. Diluição do conjugado 1:4.000;diluição dos soros controle positivo e negativo a 1:500 e 1:1000 esensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml. (A) Solução bloqueiocom PBS-T 0,05% + BSA 1%. (B) PBS-T 0,05% + ovalbubina 1%. (C)PBS-T 0,1%.
36
1,3485
0,5885
1,3153
0,392
0,9783
0,3115
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1 200 + 1 200 - 1 400 + 1 400 - 1 800 + 1 800 -
1,54
0,6635
1,4605
0,4635
1,2803
0,3255
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1 200 + 1 200 - 1 400 + 1 400 - 1 800 + 1 800 -
A B
Figura 3. Valores em densidade óptica para padronização do ELISA indireto emsoros de suínos. Diluição do conjugado 1:10.000; diluição dos soroscontrole positivos e negativos a 1:200, 1:400 e 1:800. (A)sensibilização da placa com antígeno a 5 µg/ml. (B) sensibilização daplaca com antígeno a 10 µg/ml.
0,8515
0,3805
0,6978
0,265
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1 200 + 1 200 - 1 400 + 1 400 -
1,0163
0,3885
0,792
0,2845
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1 200 + 1 200 - 1 400 + 1 400 -
A B
Figura 4. Valores em densidade óptica em ensaio para padronização do ELISAindireto em soros de suínos. Diluição do conjugado 1:20.000 ediluição dos soros controle positivos e negativos a 1:200 e 1:400. (A)sensibilização da placa com antígeno a 5 µg/ml. (B) sensibilização daplaca com antígeno a 10 µg/ml.
37
5.2. Cálculo do “cut-off” e discriminação da soropositividade 5.2.1. Em bovinos O ELISA indireto para detecção de anticorpos do tipo IgG em soros de
bovinos foi realizado em duas placas. Para a primeira placa, os valores em DO
obtidos para os controles sabidamente positivos e os três controles negativos foram,
respectivamente, 0,2760; 0,1840; 0,1910 e 0,1895. A partir destes valores, aplicou-
se a fórmula (ver material e métodos) e calculou-se o “cut-off” em 0,1992. Os valores
em DO para os soros positivos são apresentados na figura 5.
Para a segunda placa, observaram-se valores em DO para o controle
positivo e os três controles negativos de 0,2190; 0,1555; 0,1560 e 0,1555. Com base
nestes valores, calculou-se o “cut-off” correspondente a este sistema em 0,1565. Os
valores em DO para os soros considerados positivos são apresentados na figura 6. 5.2.2. Em suínos O teste de ELISA indireto para detecção de anticorpos do tipo IgG anti-T.
gondii em soros de suínos também foi realizado em duas placas. Na primeira placa,
os valores em DO para os dois controles positivos e os quatro negativos foram,
respectivamente, 0,7195; 0,5595; 0,1555; 0,2860; 0,2705 e 0,2370. A partir destes
valores, calculou-se o “cut-off” em 0,4120. Os valores em DO para os soros positivos
são apresentados na figura 7.
Para a segunda placa os valores em DO obtidos para os dois controles
positivos e os três controles negativos foram, respectivamente, 0,4430; 0,7125;
0,1580; 0,2145 e 0,2245. O valor do “cut-off” para este sistema foi 0,2810. Nesta
placa, todos os soros analisados foram considerados negativos.
38
0,
0,276
0,184 0,1992 0,2195 0,20250,2305 0,2125 0,2
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 1 2 3 4 5
276
0,184 0,1992 0,209 0,22950,278
0,214 0,2055
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 6 7 8 9 10
0,276
0,184 0,1992
0,260,202 0,204 0,2135 0,2075 0,2175
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 11 12 13 14 15 16
Figura 5. Valores em densidade óptica (DO) em ensaio imunoenzimático (ELISA indireto)dos soros dos bovinos positivos (placa 1). Diluição do conjugado 1:4.000;diluição dos soros a 1:500; sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/ml ebloqueio com PBS-T 0,1%.
39
-0
0,219
0,1555 0,1565 0,178 0,161 0,1570,1965
0,1615
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 1 2 3 4 5
0,219
0,1555 0,1565 0,158 0,1570,184
0,1575 0,165
,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 6 7 8 9 10
0,2190,1555 0,1565
0,1965 0,171 0,158 0,1605 0,1575
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 11 12 13 14 15
0,219
0,1555 0,1565
0,3025
0,1775 0,1585 0,159 0,1655
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 16 17 18 19 20
0,2190,1555 0,1565 0,158 0,1615
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
Controle + Controle - cut-off 21 22
Figura 6. Valores em densidade óptica em ensaio imunoenzimático (ELISA indireto)
dos soros dos bovinos positivos (placa 2). Diluição do conjugado 1:4.000;diluição dos soros a 1:500; sensibilização da placa com antígeno a 10 µg/mle bloqueio com PBS-T 0,05% e BSA 1%.
40
0,7195
0,1555
0,412 0,429
0,585
0,4590,535
0,469
0,5950,539
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Contro
le +
Contro
le -
cut-o
ff 1 2 3 4 5 6 7
Figura 7. Valores em densidade óptica em ensaio imunoenzimático (ELISAindireto) dos soros dos suínos positivos. Diluição do conjugado1:20.000; diluição dos soros a 1:400 e sensibilização da placa comantígeno a 5 µg/ml.
41
5.3. Prevalência de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii
5.3.1. Nos soros bovinos A análise laboratorial das amostras de soro dos bovinos criados em
propriedades dos arredores e limites deste município resultou num percentual de
positividade total de 49,35% (Tabela 1).
Dos 77 animais analisados, 39 eram utilizados para produção tanto de leite
como de carne (produção mista), 33 para produção apenas de leite e cinco para
produção de carne (Tabela 1).
Dentre os cinco animais utilizados para produção de carne, nenhum
apresentou soropositividade. Em compensação, dos animais utilizados para
produção mista, em 53,85% foi observada positividade. Para os animais utilizados
para produção leiteira, 51,51% apresentaram anticorpos anti-T. gondii em suas
amostras séricas (Tabela 1).
Um outro ponto que se pôde avaliar nesta pesquisa foi o comportamento das
prevalências de anticorpos nos soros dos bovinos provenientes de diferentes
sistemas de criação. Foi possível distinguir dois tipos principais de sistemas, sendo
eles o extensivo e o semi-extensivo. Analisando-se os dados da tabela, pôde-se
detectar um maior percentual de anticorpos dentre aqueles animais mantidos sob
sistema extensivo (70%). Uma prevalência igualmente elevada foi encontrada para o
sistema semi-extensivo (44,64%). Todavia, o sistema semi-extensivo foi
predominante dentre as propriedades pesquisadas (Tabela 1). É importante salientar
que 11 animais não foram possíveis de serem identificados quanto ao tipo de
criação. Neste grupo também foi possível detectar um alto percentual de positividade
para a presença de anticorpos anti-T. gondii em seus soros (54,55%)
42
Tabela 1. Presença de anticorpos anti-Toxoplasma gondii, pelo teste de ELISA indireto, em bovinos criados nos arredores e limites do município de Campos dos Goytacazes/RJ.
ESPECIALIDADE Mista Leite Carne Total
SISTEMA DE CRIAÇÃO
NAa MIb DPc NA MI DP NA MI DP NA MI DP Extensivo
Animais Totais Nd - - 10 6,9 1,91 N - - 10 6,9 1,91Animais Positivos N - - 7
(70%) 6,43 2,15 N - - 7 (70%) 6,43 2,15
Semi-Extensivo
Animais Totais 28 5,14 1,46 23 4,84 1,39 5 3,8 0,84 56 4,90 1,42Animais Positivos 15
(53,57%) 4,63 1,15 10 (43,48%) 5,17 1,40 0
(0%) 3 0 25 (44,64%) 4,79 1,29
Indefinido
Animais Totais 11 7,46 2,62 N - - N - - 11 7,46 2,62Animais Positivos 6
(54,55%) 8 3,03 N - - N - - 6 (54,55%) 8 3,03
Total
Animais Totais 39 5,80 2,11 33 5,55 1,84 5 3,8 0,84 77 5,56 1,99Animais Positivos 21
(53,85%) 5,55 2,35 17 (51,51%) 5,63 1,77 0
(0%) 3 0 38 (49,35%) 5,52 2,09
a Número de animais b Média das idades dos animais c Desvio padrão da média das idades d Não foram avaliados soros de animais com essas características
5.3.2. Nos soros suínos Após discriminação dos resultados das DOs dos soros dos suínos em
relação aos valores de “cut-off” obtidos para os ensaios realizados, observou-se uma
prevalência de 20,59% de soropositividade para anticorpos anti-T. gondii para
suínos mantidos sob sistema de criação domiciliar.
Os suínos mantidos sob sistema de confinamento obtiveram uma
prevalência baixa, pois nenhum dos animais estava soropositivo para anticorpos
anti-T. gondii.
Os índices de infecção obtidos em relação ao sexo foram, para machos e
fêmeas, respectivamente, 33,33% e 13,64% (Tabela 2). No entanto, os fatores
determinantes desta diferença não puderam ser detectados, havendo necessidade
da realização de outros trabalhos para uma investigação mais acurada desta
relação.
43
No que diz respeito à idade dos animais, os percentuais de soropositividade
foram, para os animais de criações domiciliares, 35,29% para animais com idade
igual ou superior a um ano de vida e 5,88% para animais que apresentaram idade
inferior a um ano (tabela suínos).
Tabela 2. Anticorpos anti-Toxoplasma gondii observados em soros de suínos criados em regiões urbanas e arredores do Município de Campos dos Goytacazes/RJ.
SISTEMA DE CRIAÇÃO MACHOS FÊMEAS TOTAL P/Na PPb P/N PP P/N PP
DOMICILIAR 4/12 33,33% 3/22 13,64% 7/34 20,59%< 1 ANO 1/7 14,29% 0/10 0 1/17 5,88% ≥ 1 ANO 3/5 60% 3/12 25% 6/17 35,29%
CONFINAMENTO 0/24 0 0/3 0 0/27 0 < 1 ANO 0/24 0 0/3 0 0/27 0 ≥ 1 ANO 0/0 0 0/0 0 0/0 0
TOTAL 4/36 11,11% 3/25 12% 7/61 11,48%< 1 ANO 1/31 3,23% 0/13 0 1/44 2,27% ≥ 1 ANO 3/5 60% 3/12 25%
6/17 35,29%a Número de animais positivos / número total de animais. b Percentual de positividade.
5.4. Isolamento de Toxoplasma gondii em encéfalos de suínos
Dos 12 encéfalos de suínos analisados neste experimento foi possível
detectar a presença de T. gondii em seis. Isto significa que 50% dos animais
estavam infectados por parasitas viáveis, os quais promoveram infecções agudas e
latentes em camundongos.
Foram observados parasitas no exsudato peritoneal, fígado, baço, pulmão e
encéfalo dos camundongos infectados, variando de animal e estado infectivo. Houve
ampla distribuição do parasita nos órgãos dos camundongos, com 25% de
isolamento para cada órgão (Tabela 3).
O resultado da inoculação de homogeneizados de encéfalos de três suínos
(animais de números quatro, seis e sete) provocou morte nos camundongos nos dias
15, nove e seis após a infecção, respectivamente. Estes animais foram vítimas de
44
toxoplasmose aguda, comprovada pelo isolamento do parasita em líquido peritoneal.
Não foram observados sinais clínicos da doença nestes animais.
Os camundongos inoculados com homogeneizados de encéfalos de outros
dois suínos (animais números dois e nove) não apresentaram sinais clínicos até o
término do período de observação. Nestes, verificou-se a presença de cistos de T.
gondii em seus encéfalos.
Um camundongo inoculado com homogeneizado de amostra encefálica do
suíno número cinco apresentou sinais nervosos 38 dias após a inoculação e foram
detectados cistos de T. gondii em seu encéfalo.
Os taquizoítas observados no líquido peritoneal dos camundongos (Tabela
4) apresentaram medidas médias de 5,86 x 2,06 µm em seus diâmetros maior e
menor, respectivamente, para o suíno quatro; 5,25 x 2,08 µm para o suíno seis; e
6,22 x 2,31 µm para o suíno sete. Não foram observadas diferenças significativas
entre as medidas referentes a cada animal.
Tabela 3. Isolamento de Toxoplasma gondii de suínos (Sus scrofa) comercializados em estabelecimentos populares do Município de Campos dos Goytacazes/RJ.
Camundongos Animais Imprintinga
Lavadoa
Peritoneal Fígado Baço Pulmão Cistob
Cerebral Total
1 - - - - - - 2 - - - - + + 3 - - - - - - 4 + + + + - + 5 - - - - +c + 6 + + + + - + 7 + + + + - + 8 - - - - - - 9 - - - - + +
10 - - - - - - 11 - - - - - - 12 - - - - - -
Percentual 25 25 25 25 25 50 a Procedimento verificado em animais com ascite ou sinais de toxoplasmose. b Procedimento verificado em animais seis semanas após inoculação. c Animal eutanasiado com sintomatologia nervosa cinco semanas após inoculação.
45
Tabela 4. Dimensões de taquizoítas de Toxoplasma gondii isolados de suínos (Sus scrofa) em lavado peritoneal de camundongos (Mus musculus).
ISOLAMENTOS VALOR DE pDADOS
Suíno 4 Suíno 6 Suíno 7
Amostrasa 10 10 10 -
Diâmetro maior 5,86±0,50 5,25±1,30 6,22±0,86 0,0880
Diâmetro menor 2,06±0,48 2,08±0,33 2,31±0,40 0,3347
Índice Morfométrico 3,02±0,91 2,54±0,59 2,74±0,44 0,3046 aNúmero de taquizoítas medidos.
46
6. DISCUSSÃO
6.1. Padronização do teste sorológico
6.1.1. Para amostras bovinas A escolha da solução PBS-T 0,1% como bloqueio para a análise sorológica
em bovinos deveu-se ao fato desta demandar um reagente a menos em comparação
às demais, que continham, além do PBS-T, ovalbumina ou BSA. Isto é um fator
simplificador e econômico para o procedimento. O ELISA é um método diagnóstico
considerado viável para a avaliação em massa (GUHL et al., 1981). Desta forma,
toda oportunidade para simplificá-lo e reduzir custos deve ser considerada.
6.1.2. Para amostras suínas Durante o processo de escolha da diluição do conjugado adequada para o
ensaio, optou-se por aquela que apresentou boas diferenças entre os controles, com
menores valores de DO. Valores de DO muito altos em ELISA podem aumentar as
chances de interferências nos resultados, como as oriundas de alta concentração do
conjugado. Por isso a escolha da diluição do conjugado 1:20.000 em detrimento a
1:10.000. (Figura 7). Seguindo o mesmo raciocínio, a concentração de antígenos
escolhida para sensibilização da placa foi 5µg/ml (Figuras 6 e 7).
47
6.2. Cálculo do “cut-off” e discriminação da prevalência 6.2.1. Em bovinos De todas as amostras de soros bovinos analisadas, a de número 16 da placa
dois merece destaque pela expressiva absorção no comprimento de onda de 405
nm (Figura 6). Esta amostra foi coletada de uma vaca de cinco anos de idade.
Outras quatro amostras destacam-se pelos maiores valores em relação às demais.
São as de números quatro e 11 do ensaio realizado com a placa dois, e oito e 11 da
placa um (Figuras 5 e 6).
Algumas amostras consideradas negativas apresentaram valores em DO
muito próximos ao “cut-off”. Nove amostras (12,33%) obtiveram valores para DO
que ficaram a menos de 0,0100 do valor do “cut-off” de sua respectiva placa. É um
expressivo percentual e merece ser comentado.
6.2.2. Em suínos De todas as amostras de soro positivas, merecem destaque as de números
dois e seis (Figura 7), pela expressiva absorção no comprimento de onda de 405
nm. Ambas são provenientes de animais machos, com cinco meses e dois anos de
idade, respectivamente.
6.3. Prevalência de anticorpos IgG anti-T. gondii
6.3.1. Nos soros bovinos TIÚBA (1998) revisou dados sobre os índices nacionais de infecção por T.
gondii nos principais animais passíveis de transmitir o parasita ao homem pela
ingestão de sua carne. O percentual encontrado para bovinos (32,30%) ficou abaixo
do detectado neste trabalho de pesquisa (49,35%). Desta forma, com um índice que
ultrapassa os níveis de infecção bovina por T. gondii do país, pode-se considerá-lo
expressivo. É interessante comentar que os níveis de anticorpos anti-T. gondii em
outros estados do Brasil, como a Bahia (PITA-GONDIM et al., 1999), distanciam-se
em larga escala dos da região pesquisada neste trabalho (1,03%).
O alto percentual de infecção bovina aqui apresentado, somado aos dados
encontrados por outros pesquisadores (OLIVEIRA et al., 2001), permite que se
48
pondere sobre o risco de infecção com T. gondii através do consumo da carne
destes animais. Em outras áreas do mundo, pesquisadores ponderam que o bovino
não representa uma fonte potencial de infecção humana por T. gondii ao afirmar que
não encontraram cistos do parasita em tecidos deste animal de produção após
infecção oral com oocistos esporulados (ESTEBAN-REDONDO et al., 1999).
Entretanto, OLIVEIRA et al. (2001) confrontam estes dados, já que infectaram
bovinos experimentalmente, via oral, com oocistos de T. gondii e isolaram o parasita
70 dias depois, em diferentes órgãos. Estes autores isolaram, inclusive das
musculaturas dos animais, incluindo partes nobres muito apreciadas e, em muitos
casos, ingeridas mal-cozidas pelo consumidor, como o filé mignon (psoas maior) e a
picanha (glúteo superficial).
O percentual de soropositividade para a presença de anticorpos anti-T.
gondii encontrado dentre os animais utilizados para produção leiteira (51,51%) foi
alto quando comparado ao obtido com o mesmo tipo de animal em outras regiões do
Brasil e do mundo. ALBUQUERQUE et al. (2005) analisaram soros de vacas leiteiras
dos municípios de Resende e Rio Claro no Estado do Rio de Janeiro. Os resultados
foram 15,3% e 14,2% respectivamente. O teste sorológico utilizado foi o de
Imunofluorescência (IFAT). Utilizando-se o LAT (Teste de Aglutinação em Látex) e o
IHAT (Teste de Hemaglutinação Indireta), HASHEMI-FESHARKI (1996) não
encontrou anticorpos anti-T. gondii numa amostragem total de 2000 vacas leiteiras
no Iran. Já em pesquisa realizada por HUONG et al. (1998) no sul do Vietnã foi
relatado um nível de anticorpos em bovinos de 10,5%, numa amostragem de 200
animais. Isso mostra o quanto, apesar de ser a mais cosmopolita das zoonoses, os
níveis de infecção por T. gondii podem variar muito entre as diferentes regiões do
planeta. Ao mesmo tempo, infere-se que a infecção por T. gondii seja altamente
disseminada, também, em outros países, como citado por SAMAD et al. (1993) a
respeito do nível de infecção em bovinos utilizados para consumo humano em
Bangladesh (Quadro 1).
Analisando-se os dados referentes às idades dos animais (Tabela 1), é
importante destacar o alto percentual de animais soropositivos em idade avançada.
Segundo DUBEY (1983), T. gondii pode permanecer viável em tecidos bovinos até a
idade de abate destes animais.
Em busca de fatores que explicassem a prevalência da toxoplasmose em
bovinos, HEJLICEK et al. (1995) realizaram estudos com esses animais em diversas
49
propriedades. Segundo estes autores, animais de propriedades pequenas possuem
mais chances de aquisição de infecções por T. gondii, pois estão mais sujeitos ao
contato com gatos. Estes dados estão de acordo com observações feitas em
propriedades de bovinos nos arredores do município, válidos também para as
propriedades de suínos. Em adição, os principais reservatórios de T. gondii nas
propriedades são os pequenos mamíferos terrestres, em virtude da importância que
possui a transmissão intra-uterina na disseminação da toxoplasmose nestes animais
(HEJLICEK et al., 1995). Não raro observa-se roedores e outros pequenos
mamíferos ao redor das propriedades. Estes animais são, geralmente, caças
perfeitas para os felídeos que vivem nas proximidades da criação e, indiretamente,
mantém o ciclo da parasitose ativo.
DUBEY relatou o primeiro isolamento de T. gondii viável em uma vaca adulta
naturalmente infectada. O estudo aconteceu numa propriedade americana e o
animal seria utilizado para consumo humano (DUBEY, 1992). O parasita foi isolado
da parede intestinal e o hospedeiro apresentou alta titulação para anticorpos contra
T. gondii em seu soro. Um ano depois, DUBEY e THULLIEZ (1993) isolaram T.
gondii da língua, coração, fígado, cérebro e musculatura esquelética de três bovinos
experimentalmente infectados com 10.000 oocistos da cepa GT-1. No ano seguinte,
ARIAS et al. (1994a) isolaram T. gondii em vários outros tecidos bovinos
naturalmente infectados através de bioprova e ponderaram a respeito da importância
destes animais na epidemiologia da toxoplasmose na Costa Rica.
Estes isolamentos vêm respaldar a importância da carne bovina como
reservatório do parasita. HEJLICEK et al. (1995) ponderam que a transmissão de
formas infectantes de T. gondii ao homem a partir de fontes conhecidas merece total
atenção dos especialistas e é um ponto-chave para a prevenção da toxoplasmose.
6.3.2. Nos soros suínos A análise dos resultados encontrados para a soroprevalência de anticorpos
anti-T. gondii nos suínos mantidos sob sistema de criação domiciliar (20,59%)
permite inferir que o nível de infecção por T. gondii dos suínos criados em sistema
de confinamento é expressivamente menor, pois todos foram soronegativos. Estes
resultados foram também verificados por outros pesquisadores (TENTER et al.,
2000), os quais afirmaram que a prevalência de T. gondii em animais utilizados para
50
consumo humano criados em propriedades que utilizam sistema intensivo de criação
decresceu consideravelmente nos últimos 20 anos. Afirmam ainda que a utilização
do sistema tecnificado para criação de suínos reduziu a importância da carne suína
como transmissora da toxoplasmose para o homem em países da União Européia.
Mas, segundo WANG et al. (2002), mesmo havendo indícios de que o sistema
intensivo de criação diminua significativamente a probabilidade dos suínos serem
infectados, o baixo retorno financeiro não compensaria a mudança de manejo,
desestimulando os criadores em tal investimento.
As práticas de manejo estão associadas diretamente à prevalência de
anticorpos anti-T. gondii em suínos (AGANGA et al., 1981; ARKO-MENSAH et al.,
2000). Os cuidados dispensados pelos criadores (WENTZ et al., 1986) aos animais
sob regime tecnificado como, por exemplo, maior rigor no controle de outros animais
na área, inclusive roedores, e melhor sistema de limpeza e desinfecção ambiental
devem ter seguramente contribuído para minimizar os riscos de infecção pelo
protozoário. Pondera-se que estes fatores justificariam as baixas prevalências em
suínos registradas em outras pesquisas no Brasil (AMARAL et al., 1975; SILVA et
al., 1981; SOUZA, 1995).
DAVIES et al. (1998) classificaram suínos em terminação na Carolina do
Norte, EUA, de acordo com os sistemas de manejo, em animais mantidos a pasto e
animais mantidos em confinamento. Após pesquisa de anticorpos, descobriu-se que
a soroprevalência de anticorpos anti-T. gondii dentre os animais mantidos a pasto foi
de 19,47% e apenas 0,057% para os animais mantidos em confinamento. SOUZA
(1995) coopta com estes dados, pois encontrou baixo índice de positividade (1,11%)
em animais tecnificados em trabalho realizado em abatedouros de suínos da
Mesorregião do Grande Rio de Janeiro.
Estes dados vêm reafirmar os resultados aqui apresentados e reforçam,
ainda, os de GARCIA et al. (1999), que encontraram resultados similares em suínos
criados em áreas rurais, com prevalência de 24% através da Reação de
Imunofluorescência Indireta (RIFI) no Município de Jaguapitã, Paraná. Outros
pesquisadores ponderam, inclusive, que suínos criados em regime semi-intensivo
estão mais sujeitos e expostos ao risco de infecção, através da ingestão de oocistos
liberados pelas fezes de felídeos (DUBEY, 1990; DUBEY et al., 1990; ZIMMERMAN
et al., 1990; DUBEY et al., 1991).
51
Um surto de toxoplasmose clínica foi registrado em 13 de 80 suínos numa
propriedade alemã (WEISSENBOCK e DUBEY, 1993). A causa presumida foi
ingestão de fezes de gatos através da comida dos animais. Sete animais morreram e
um foi eutanasiado. Os principais sinais clínicos foram anorexia, apatia, febre,
cianose, dispnéia e fraqueza parcial de membros posteriores. Dois animais
sobreviveram e foram eutanasiados nos dias 40 e 140 após o aparecimento dos
sinais. Nestes foram detectados altos títulos de anticorpos, meningoencefalite severa
e cistos de T. gondii no cérebro, além de hiperplasia dos órgãos linfóides.
Providências deveriam ser tomadas para que haja uma redução da exposição dos
animais ao T. gondii (GAMBLE et al., 1999), o que inclui melhores condições de
higiene nos criadouros.
OMATA et al. (1994) sugerem que a produção de anticorpos anti-T. gondii
em suínos é dependente da patogenicidade da cepa infectante. As principais
evidências para esta afirmação encontram-se no fato de isolados que provocaram
morte mais rápida em camundongos (< 15 dias apos a infecção) foram os que
suscitaram titulações mais altas em suínos. Após as análises dos soros dos suínos
do presente estudo, foram observados valores de DO que se destacaram das
demais (Figura 7). Esta última observação suporta a necessidade da realização de
pesquisas futuras que caracterizem geneticamente os isolados de T. gondii oriundos
de carnes suínas comercializadas neste município.
Em resposta ao uso cada vez maior de sistemas tecnificados de produção
animal, muito mais eficientes contra a propagação de doenças, e à demanda
crescente de consumidores cada vez mais exigentes, alguns produtores holandeses
têm investido em sistemas de manejo mais sensíveis ao conforto animal (KIJLSTRA
et al., 2004). Um novo sistema que tem adquirido fama na Holanda é o chamado
“Animal-Friendly Pig Production Systems”, que possui algumas características
singulares em comparação ao tradicional sistema tecnificado. As principais
diferenças são: acesso dos animais ao pasto, cama de palha, uso restrito de drogas
e antibióticos e alimentos orgânicos (vegetais cultivados em fazendas que não
utilizam fertilizantes químicos artificiais ou pesticidas). A análise final permite aos
autores inferirem que o novo sistema de criação pode levar à reemergência da
toxoplasmose no país.
52
6.4. Isolamento de Toxoplasma gondii em encéfalos de suínos
A detecção de cistos em cérebros de suínos pode ser indício da presença de
cistos em outras vísceras e musculaturas (DUBEY et al., 1986). Levando-se em
consideração os resultados encontrados neste trabalho de pesquisa para a presença
de T. gondii viável em encéfalos de suínos e que, muitas vezes, cérebro e músculos
são utilizados na confecção de embutidos, como a lingüiça, existe risco real de
infecção através do consumo de carne e vísceras cruas ou mal cozidas de suínos do
Município de Campos dos Goytacazes (SUAREZ-ARANDA et al., 2000). Ainda,
estes animais podem ser fonte de infecção para felídeos e, conseqüentemente, fonte
indireta de infecção ao homem através dos oocistos liberados quando felídeos são
alimentados com músculos ou vísceras infectadas de suínos (RUIZ e FRENKEL,
1980; DUBEY, 1986; MAYER et al., 1987).
Em um estudo feito por DUBEY (1988), foi possível isolar T. gondii em 14 de
16 suínos soropositivos para anticorpos anti-T. gondii. Após eutanásia nos dias 103
e 875 após inoculação com oocistos do parasita, T. gondii foi isolado do cérebro,
coração, língua e diafragma dos animais. Este mesmo autor infere ainda a respeito
da possibilidade de outros órgãos estarem infectados. Tendo em vista as
ponderações deste autor, pode-se afirmar que houve correlação positiva entre os
resultados sorológicos de suínos criados neste município e o isolamento de T. gondii
em amostras encefálicas desta espécie comercializada na mesma área geográfica.
A busca por anticorpos em animais de produção pode ser um avaliador concreto da
presença de T. gondii em tecidos suínos e, conseqüentemente, do risco a que se
submete a população ao ingerir carne crua ou mal-cozida destes animais
(D`ÁNGELINO e ISHIZUKA, 1986).
Em pesquisa a respeito da distribuição de cistos teciduais deste parasita em
suínos, DUBEY et al. (1984) isolaram T. gondii em vários órgãos dos animais,
incluindo cérebro (8/8), língua (7/8), musculatura esquelética (5/8), diafragma (4/8),
rins, fígado e intestino delgado (2/8), e glândulas salivares e olhos (1/8). Segundo os
autores, coração e cérebro são os tecidos mais indicados para pesquisa de T.
gondii. Afirmam também que espécimes viáveis de T. gondii podem persistir em
tecidos comestíveis de suínos vivos por no mínimo 171 dias. Há, desta forma, uma
relação positiva entre a presença de T. gondii em encéfalos de suínos e outros
tecidos comestíveis do animal, representando risco de infecção pela ingestão de
carne ou vísceras de porco cruas ou mal cozidas. No presente trabalho os suínos
53
utilizados estavam naturalmente infectados, diferentemente dos suínos analisados
pelos autores acima citados. Isto é mais uma evidência do risco de infecção ao qual
a população está exposta, ressaltando-se que animais deste tipo são
comercializados livremente em Campos dos Goytacazes.
Pesquisas foram realizadas com o intuito de se estudar a prevalência da
toxoplasmose suína em várias regiões do Brasil e no mundo. NAVARRO et al.
(1992) encontraram cistos teciduais em 19,66% das carnes suínas comercializadas
em açougues da cidade de Londrina/PR. Mais recentemente, GARCIA et al. (1999)
revelaram uma soroprevalência de 24% em suínos criados de forma rústica em
propriedades rurais do Estado do Paraná. T. gondii viável foi isolado de uma de 67
amostras de carne suína curada pronta para consumo (WARNEKULASURIYA et al.,
1998). Em São Paulo, isolou-se T. gondii viável em 7 de 28 suínos soropositivos. Em
Massachussetts, EUA, isolou-se T. gondii em 51 de 55 suínos destinados ao
consumo humano.
Dois surtos de toxoplasmose aguda em seres humanos foram notificados
por CHOI et al. (1997). No primeiro caso, três pacientes apresentaram sinais de
coriorretinite unilateral como conseqüência da ingestão de baço e fígado crus de um
suíno selvagem. Os primeiros sinais clínicos surgiram três meses após a ingestão
dos tecidos infectados. No segundo surto, um de cinco soldados que comeram
fígado cru de um suíno doméstico desenvolveram linfadenopatia. Ambos os casos
ocorreram na Coréia.
Na presente pesquisa, encontrou-se um alto percentual de suínos
soropositivos para anticorpos anti-T. gondii, em sua grande maioria com idade
superior a um ano. Tomando como base a relação soropositividade e isolamento, já
discutida nos parágrafos acima, isto explicaria o alto percentual de isolamento da
pesquisa (50%), pois verificou-se grande maioria de animais abatidos com idade
superior a um ano nos estabelecimentos comerciais pesquisados.
Pesquisas têm confirmado a contaminação ambiental com oocistos de T.
gondii em áreas endêmicas para toxoplasmose humana em Campos dos
Goytacazes (DUBEY et al., 2003). A confirmação ocorreu através de bioprova em
camundongos de cérebros e corações de galinhas criadas no município. A
prevalência de T. gondii em galinhas é um bom indicador da contaminação
ambiental (DUBEY et al., 2003), devido ao seu hábito de ingerir porções de terra
durante a alimentação. Assim, é certo que outros animais domésticos que convivem
54
no mesmo espaço também estejam expostos à infecção, principalmente porcos, pelo
seu hábito de fuçar o solo. Adicionalmente, observou-se uma predominância de
isolados da linhagem tipo I nas galinhas da região. Esta cepa é altamente virulenta e
encontrada em infecções clínicas em humanos (DUBEY et al., 2002). Outros
trabalhos são, portanto, necessários para uma análise genética da linhagem de T.
gondii isolada dos suínos comercializados em estabelecimentos que fornecem carne
in natura para a população humana. Todavia, há grande possibilidade de estes
animais serem portadores das linhagens tipos I e III, comprovadamente presentes no
solo de áreas endêmicas para toxoplasmose deste município (DUBEY et al., 2003).
De acordo com BAHIA-OLIVEIRA et al. (2003), a incidência de anticorpos
anti-T. gondii na população humana do Município de Campos dos Goytacazes/RJ é
próxima a 80%. Estes resultados, juntamente com os obtidos neste trabalho,
permitem considerar a hipótese de que a alta soroprevalência humana em Campos
dos Goytacazes tenha expressiva influência da ingestão de carne infectada com
cistos do parasita. Um ponto fundamental para a redução da prevalência da
toxoplasmose em seres humanos é o investimento em programas educacionais. Em
estudo realizado por BOYER et al. (2005), a preconização deste tipo de programa
pode ter prevenido a aquisição de T. gondii por mães que tinham riscos claros de
exposição direta ou indireta à carne crua ou mal cozida ou a excrementos de gatos.
No entanto, os autores afirmam que apenas uma busca sistemática por anticorpos
anti-T. gondii de todas as crianças ao parto poderia prevenir ou detectar uma maior
proporção de infecções.
De acordo com DUBEY (1980), em infecções experimentais as cepas
patogênicas matam camundongos dentro de 15 dias e as cepas pouco patogênicas
dentro de um a dois meses. Ainda, segundo BEVERLEY (1976), algumas cepas são
fatais para camundongos, mesmo em baixas doses, enquanto outras não causam
doença aparente. Estes achados nos permitem inferir que algumas das cepas
encontradas neste experimento são virulentas, devido aos óbitos dos camundongos
a partir da primeira semana do experimento.
As medidas médias obtidas de taquizoítas isolados neste experimento estão
de acordo com FRENKEL (1973), que confirmam a forma em meia-lua ou arco dos
taquizoítas, medindo de 4 a 7 µm de comprimento e 2 a 4 µm de largura, e sua
extremidade anterior mais afilada que a posterior (Figura 8).
55
Considerando os taquizoítas e suas respectivas medidas observadas nos
líquidos peritoneais, a morfologia dos cistos observados nos encéfalos dos
camundongos (Figura 9), além da patogenicidade verificada em camundongos,
podemos inferir que o parasita isolado é T. gondii.
Figura 8. Espécimes de Toxoplasma gondii isolados em lavado peritoneal de
camundongo corados por GIEMSA. Em A (— com 10 µm) e em B (—com 5 µm), são observados taquizoítas livres no exsudato peritoneal.Destaque para os núcleos dos parasitas (→). Em C (— com 5 µm),observa-se em detalhes o núcleo de um taquizoíta e grânulos deamilopectina em seu citoplasma (→). Em D (— com 5 µm), destaca-seo parasita em processo de divisão dentro de macrófagos (→ abaixo) e aformação do vacúolo parasitóforo (→ acima).
56
Figura 9. Espécimes de Toxoplasma gondii observados em cérebros decamundongos. Em A e B, cistos em observação a fresco. Destaquepara a parede cística de espessura delgada (→). Em C e D, cistoscorados por GIEMSA. Destaque para os núcleos dos bradizoítas (→).Barra com 20 µm.
57
7. CONCLUSÕES
A partir dos resultados apresentados nesta pesquisa, pode-se concluir que:
O teste de ELISA indireto pode ser utilizado para análises de prevalências
de infecções por T. gondii em rebanhos de suínos e bovinos;
A prevalência de infecção por T. gondii em bovinos e suínos criados no
município de Campos dos Goytacazes e arredores foi considerada alta;
O percentual de infecção por T. gondii dos suínos criados sob sistema de
confinamento foi menor em comparação aos sistemas domiciliares;
Pode haver risco de infecção por T. gondii para a população humana através
do consumo de carne crua ou mal cozida de bovinos de Campos dos Goytacazes e
arredores;
O parasita isolado em encéfalos de suínos comercializados in natura em
estabelecimentos populares do município de Campos dos Goytacazes é T. gondii;
A carne suína in natura vendida em estabelecimentos comerciais populares
deste município pode estar altamente infectada por T. gondii e, desta forma, seu
consumo, crua ou mal cozida, pode representar risco de infecção para a população.
58
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADESIYUN, A. A.; CAZABON, E. P. (1996) Seroprevalences of brucellosis, Q-fever
and toxoplasmosis in slaughter livestock in Trinidad. Rev Elev Med Vet Pays
Trop., 49: 28-30.
AGANGA, A. O.; BELINO, E. D.; ADEGBOYE, D. S.; ILEMOBADE, A. A. (1981) A
serological survey of toxoplasmosis in food animals (cattle, sheep, goats and
swine) in two northern states of Nigeria. International Journal of Zoonoses, 8: 57-
62.
ALBUQUERQUE, G. R.; MUNHOZ, A. D.; FLAUSINO, W.; SILVA, R. T.; ALMEIDA,
C. R.; MEDEIROS, S. M.; LOPES, C. W. (2005) Prevalence of anti-Toxoplasma
gondii antibodies in dairy cattle from Sul Fluminense Paraiba Valley, State of Rio
de Janeiro. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, 14: 125-8.
ALERJ. Lei nº 3900 de julho de 2002. Rio de Janeiro, RJ, 2002;
http://notes.a.../3a78021f7425852103256c0504f 796f em 19/10/02.
AMARAL, V. dO; SANTOS, S. M.; REBOUÇAS, M. M. (1975) Estudos preliminares
sobre a prevalência de anticorpos anti-Toxoplasma, por hemaglutinação, em
soros de suínos provenientes dos Estados de São Paulo e Rio Grande do Sul,
Brasil. O Biológico, 41: 105-7.
AMATO-NETO, V.; CAMPOS, R.; BARUZZI, R. G.; DUARTE, M. I. S. (1982)
Toxoplasmose. São Paulo: Sarvier, 155 p.
59
ARAÚJO, F. A. P.; SANTOS, J. R.; SOUZA, W. J. S. (1998) Detection of Toxoplasma
gondii infection in naturally infected pigs by enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) in the área of Great Erechim, RS, Brazil. Arquivos da Faculdade de
Veterinária-UFRGS, 26: 57-65.
ARIAS, M. L.; CHINCHILLA, M.; REYES, L.; SABAH, J.; GUERRERO, O. M. (1994a)
Determination of Toxoplasma gondii in several organs of cattle by carbon
immunoassay (CIA) testing. Vet Parasitol., 55: 133-6.
ARIAS, M. L.; REYES, L.; CHINCHILLA, M.; LINDER, E. (1994b) Seroepidemiology
of Toxoplasma gondii (Apicomplexa) in meat producing animals in Costa Rica.
Rev Biol Trop., 42: 15-20.
ARKO-MENSAH, J.; BOSOMPEM, K. M.; CANACOO, E. A.; WASTLING, J. M.;
AKANMORI, B. D. (2000) The seroprevalence of toxoplasmosis in pigs in Ghana.
Acta Trop., 76: 27-31.
BAHIA-OLIVEIRA, L. M. G.; JONES, J. L.; AZEVEDO-SILVA, J.; ALVES, C. C.;
OREFICE, F.; ADDISS, D. G. (2003) Highly endemic, waterborne toxoplasmosis
in north Rio de Janeiro state, Brazil. Emerging Infectious Diseases, 9: 55–62.
BEKELE, T.; KASALI, O. B. (1989) Toxoplasmosis in sheep, goats and cattle in
central Ethiopia. Vet Res Commun., 13: 371-5.
BERDOY, M.; WEBSTER, J. P.; MacDONALD, D. W. (1995) Parasite-altered
behaviour: is the effect of Toxoplasma gondii on Rattus norvegicus specific?.
Parasitology, 111: 403–9.
BERDOY, M.; WEBSTER, J. P.; MacDONALD, D. W. (2000) Fatal attraction in rats
infected with Toxoplasma gondii. Proceedings. Biological Sciences, 267: 1591–
1594.
BERENDS, B. R.; SMEETS, J. F.; HARBERS, A. H.; van KNAPEN, F.; SNIJDERS, J.
M. (1991) Investigations with enzyme-linked immunosorbent assays for Trichinella
spiralis and Toxoplasma gondii in the Dutch 'Integrated Quality Control for
finishing pigs' research project. Vet Q., 13: 190-8.
60
BEVERLEY, J. K. (1976) Toxoplasmosis in animals. Veterinary Research, 99: 123-7.
BEVERLEY, J. K.; HENRY, L.; HUNTER, D.; BROWN, M. E. (1977) Experimental
toxoplasmosis in calves. Research in Veterinary Science., 23: 33-7.
BLEWETT, D. A.; WATSON, W. A. (1993) The epidemiology of ovine toxoplasmosis.
II. Possible sources of infection in outbreaks of clinical disease. British Veterinary
Journal, 139: 546-55.
BONFIOLI AA, OREFICE F. (2005) Toxoplasmosis. Semin Ophthalmol., 20: 129-41.
BOSCH-DRIESSEN LE, BERENDSCHOT TT, ONGKOSUWITO JV, ROTHOVA A.
(2002) Ocular toxoplasmosis: clinical features and prognosis of 154
patients.Ophthalmology, 109: 869–878.
BOYER, K. M.; HOLFELS, E.; ROIZEN, N.; SWISHER, C.; MACK, D.; REMINGTON,
J; WITHERS, S.; MEIER, P.; MCLEOD, R. (2005) Risk factors for Toxoplasma
gondii infection in mothers of infants with congenital toxoplasmosis: Implications
for prenatal management and screening. American Journal of Obstetrics and
Gynecology, 192: 564-71.
BROWN, A. S.; SCHAEFER, C. A.; QUESENBERRY JR., C. P.; LIU, L.; BABULAS,
V. P.; SUSSER, E. S. (2005) Maternal exposure to toxoplasmosis and risk of
schizophrenia in adult offspring, The American Journal of Psychiatry, 162: 767–
773.
BUXTON, D. (1990) Ovine toxoplasmosis: A review. Journal of the Royal Society of
Medicine, 38: 509-11.
CARME, B.; BISSUEL, F.; AJZENBERG, D.; BOUYNE, R.; AZNAR, C.; DEMAR, M.;
BICHAT, S.; LOUVEL, D.; BOURBIGOT, A. M.; PENEAU, C.; NERON, P.;
DARDE, M. L. (2002) Severe acquired toxoplasmosis in immunocompetent adult
patients in French Guiana, Journal of Clinical Microbiology, 40: 4037-44.
CARVALHEIRO, C. G.; MUSSI-PINHATA, M,M.; YAMAMOTO, A. Y.; de SOUZA, C.
B.; MACIEL, L. M. (2005) Incidence of congenital toxoplasmosis estimated by
61
neonatal screening: relevance of diagnostic confirmation in asymptomatic
newborn infants. Epidemiology and infection, 133: 485-91.
CATAR, G.; BERGENDI, L.; HALKOVA, R. (1969). Isolation of Toxoplasma gondii
fom swine and cattle. The Journal of Parasitology, 5: 952-5.
CAVALIER-SMITH, T. (1993) Kingdom Protozoa and its 18 Phyla. Microbiology
Review, 57: 953-94.
CERMAKOVA, Z.; PRASIL, P.; RYSKOVA, O. (2005) Congenital toxoplasmosis:
possibilities for laboratory diagnosis. Epidemiologie, Mikrobiologie, Imunologie,
54: 75-7.
CFMV. Resolução nº 714 de 20 de junho de 2002. Brasília, DF, 2002;
http://www.cfmv.org.br/res714.htm em 19/10/02.
CHANG, G. N.; TSAI, S. S.; KUO, M.; DUBEY, J. P. (1991) Epidemiology of swine
toxoplasmosis in Taiwan. Southeast Asian J Trop Med Public Health., 22 Suppl:
111-4.
CHHABRA, M. B.; GUPTA, S. L.; GAUTAM, O. P. (1985) Toxoplasma
seroprevalence in animals in northern India. Int J Zoonoses., 12: 136-42.
CHOI, W. Y.; NAM, H. W.; KWAK, N. H.; HUH, W.; KIM, Y. R.; KANG, M. W.; CHO,
S. Y.; DUBEY, J. P. (1997) Foodborne outbreaks of human toxoplasmosis. J
Infect Dis., 175: 1280-2.
COLOMBO, F. A.; VIDAL, J. E.; PENALVA DE OLIVEIRA, A. C.; HERNANDEZ, A.
V.; BONASSER-FILHO, F.; NOGUEIRA, R. S.; FOCACCIA, R.; PEREIRA-
CHIOCCOLA, V. L. (2005) Diagnosis of cerebral toxoplasmosis in AIDS patients
in Brazil: importance of molecular and immunological methods using peripheral
blood samples. Journal of Clinical Microbiology, 43: 5044-7.
COSTA, A. J. (1979) Toxoplasmose congênita natural em bovinos e infecção
experimental de vacas gestantes com oocistos de T.gondii. Tese (Doutorado em
Parasitologia) - Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de São Paulo.
São Paulo, 88p.
62
COSTA, A. J.; ARAUJO, F. G.; COSTA, J. O.; LIMA, J. D.; NASCIMENTO, E. (1977)
Experimental infection of bovines with oocysts of Toxoplasma gondii. The Journal
of Parasitology, 2: 212-4.
CURRENT, W. L.; UPTON, S. J.; LONG, P. L. (1990) Taxonomy and life cycles. In:
Coccidiosis of man and domestic animals. Ed. LONG, P. L., Boca Raton: CRC
Press, p. 2-16.
D’ANGELINO, J.L.; ISHIZUKA, M.M. (1986) Toxoplasmose suína. Avaliação de
prevalência de infecção toxoplásmica em rebanhos suínos pela prova de
imunofluorescência indireta e hemaglutinação. Boletín de la Oficina Sanitaria
Panamericana, 6: 634-47.
da SILVA D. S.; BAHIA-OLIVEIRA, L. M.; SHEN, S. K.; KWOK, O. C.; LEHMAN, T.;
DUBEY, J. P. (2003) Prevalence of Toxoplasma gondii in chickens from an area
in southern Brazil highly endemic to humans. The Journal of Parasitology, 89:
394-6.
DAMRIYASA, I. M.; BAUER, C. (2005) Seroprevalence of Toxoplasma gondii
infection in sows in Munsterland, Germany. Dtsch Tierarztl Wochenschr., 112:
223-4.
DAMRIYASA, I. M.; BAUER, C.; EDELHOFER, R.; FAILING, K.; LIND, P.;
PETERSEN, E.; SCHARES, G.; TENTER, A. M.; VOLMER, R.; ZAHNER, H.
(2004) Cross-sectional survey in pig breeding farms in Hesse, Germany:
seroprevalence and risk factors of infections with Toxoplasma gondii, Sarcocystis
spp. and Neospora caninum in sows.Veterinary Parasitology, 126: 271-86.
DAVIES, P. R.; MORROW, W. E.; DEEN, J.; GAMBLE, H. R.; PATTON, S. (1998)
Seroprevalence of Toxoplasma gondii and Trichinella spiralis in finishing swine
raised in different production systems in North Carolina, USA. Preventive
Veterinary Medicine, 36: 67-76.
DIAS, R. A. F.; NAVARRO, I. T.; RUFFOLO, B. B; BUGNI, F. M.; DE CASTRO, M.
V.; FREIRE, R. L. (2005) Toxoplasma gondii in fresh pork sausage and
seroprevalence in butchers from factories in Londrina, Paraná State, Brazil.
Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 47: 185-9.
63
DIZA, E.; FRANTZIDOU, F.; SOULIOU, E.; ARVANITIDOU, M.; GIOULA, G.;
ANTONIADIS, A. (2005) Seroprevalence of Toxoplasma gondii in northern
Greece during the last 20 years. Clinical Microbiology and Infection, 11: 719-723.
dos SANTOS, C. B. DE A.; DE CARVALHO, A. C. F. B.; RAGOZO, A. M. A.;
SOARES, R. M.; AMAKU, M.; YAI, L. E. O.; DUBEY, J. P.; GENNARI, S. M.
(2005) First isolation and molecular characterization of Toxoplasma gondii from
finishing pigs from São Paulo State, Brazil. Veterinary Parasitology, 131: 207-11.
DUBEY, J. P. (1973) Feline toxoplamsosis and coccidiosis: a survey domiciled and
stray cats. Journal of the American Veterinary Medical Association, 162: 873-7.
DUBEY, J. P. (1976) A review of Sarcocystis of domestic animals and other coccidia
of cats and dogs. Journal of the American Veterinary Medical Association, 169:
1061-78.
DUBEY, J. P. (1977) Toxoplasma, Hammondia, Besnoitia, Sarcocystis and other
tissue cyst-forming coccidian of man and animals. In: KREIER, J. P. Parasitic
Protozoa. Gregarines, Haemogregarines, Coccidia, Plasmodia and
Haemoproteids, v. 3, Nova Iorque: Academic Press, 563 p.
DUBEY, J. P. (1980) Mouse pathogenicity of Toxoplasma gondii isolated from a goat.
American Journal of Veterinary Research, 41: 427-9.
DUBEY, J. P. (1983) Distribution of cysts and tachyzoites in calves and pregnant
cows inoculated with Toxoplasma gondii oocysts. Veterinary Parasitology, 13:
199-211.
DUBEY, J. P. (1985) Serologic prevalence of toxoplasmosis in cattle, sheep, goats,
pigs, bison, and elk in Montana. Journal of the American Medical Veterinary
Association, 186: 969-70.
DUBEY, J. P. (1986) Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Association,
2: 166-79.
DUBEY, J. P. (1988) Long-term persistence of Toxoplasma gondii in tissues of pigs
inoculated with T. gondii oocysts and effect of freezing on viability of tissue cysts
in pork. American Journal of Veterinary Research, 49: 910-3.
64
DUBEY, J. P. (1990) Status of toxoplasmosis in pigs in the United States. Journal of
the American Veterinary Medical Association, 196: 270-4.
DUBEY, J. P. (1992) Isolation of Toxoplasma gondii from a naturally infected beef
cow. J. Parasitol., 78: 151-3.
DUBEY, J. P. (1993) Toxoplasma, Neospora, Sarcocystis and other tissue cyst-
forming Coccidia of humans and animals. In: Kreier, J. P. (ed.) Parasitic
Protozoa. v. 6., 2. Ed. San Diego: Academic Press, p. 1-158.
DUBEY, J. P. (1994) Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical
Association, 205: 1593-8.
DUBEY, J. P. (1998a) Advances in the life cycle of Toxoplasma gondii. International
Journal for Parasitology, 28: 1019-24.
DUBEY, J. P. (1998b) Refinement of pepsin digestion method for isolation of
Toxoplasma gondii from infected tissues. Veterinary Parasitology, 74: 75-7.
DUBEY, J. P.; BEATTIE, C. P. (1988) Toxoplasmosis of animals and man: CRC
Press, Boca Raton, Florida, 220 p.
DUBEY, J. P.; GAMBLE, H. R.; HILL, D.; SREEKUMAR, C.; ROMAND, S.;
THULLIEZ, P. (2002) High prevalence of viable Toxoplasma gondii infection in
market weight pigs from a farm in Massachusetts. The Journal of Parasitology,
88: 1234-8.
DUBEY, J. P.; GAMBLE, H. R.; RODRIGUES, A. O.; THULLIEZ, P. (1992)
Prevalence of antibodies to Toxoplasma gondii and Trichinella spiralis in 509 pigs
from 31 farms in Oahu, Hawaii. Veterinary Parasitology, 43: 57-63.
DUBEY, J. P.; GRAHAM, D. H.; da SILVA, D. S.; LEHMANN, T.; BAHIA-OLIVEIRA,
L.M. (2003) Toxoplasma gondii isolates of free-ranging chickens from Rio de
Janeiro, Brazil: mouse mortality, genotype, and oocyst shedding by cats. The
Journal of Parasitology, 89: 851-3.
65
DUBEY, J. P.; KOTULA, A. W.; SHARAR, A.; ANDREWS, C. D.; LINDSAY, D. S.
(1990) Effect of high temperature on infectivity of Toxoplasma gondii tissue cysts
in pork. The Journal of Parasitology, 76: 201-4.
DUBEY, J. P.; LEIGHTY, J. C.; BEAL, V. C.; ANDERSON, W. R., ANDREWS, C. D.;
THULLIEZ, P. (1991) National seroprevalence of Toxoplasma gondii in pigs. The
Journal of Parasitology, 4: 517-21.
DUBEY, J. P.; LUNNEY, J. K.; SHEN, S. K.; KWOK, O. C. (1998) Immunity to
toxoplasmosis in pigs fed irradiated Toxoplasma gondii oocysts. The Journal of
Parasitology, 84: 749-52.
DUBEY, J. P.; LUNNEY, J. K.; SHEN, S. K.; KWOK, O. C.; ASHFORD, D. A.;
THULLIEZ, P. (1996) Infectivity of low numbers of Toxoplasma gondii oocysts to
pigs. The Journal of Parasitology, 82: 438-43.
DUBEY, J. P.; MURREL, K. D.; FAYER, R. (1984) Persistence of encysted T. gondii
in tissues of pigs fed oocysts. American Journal of Veterinary Research, 45:
1941-3.
DUBEY, J. P.; MURRELL, K. D.; FAYER, R.; SCHAD, G. A. (1986) Distribution of
Toxoplasma gondii tissue cysts in commercial cuts of pork. Journal of the
American Veterinary Association, 188: 1035-7.
DUBEY, J. P.; ROLLOR, E. A.; SMITH, K.; KWOK, O. C.; THULLIEZ, P. (1997) Low
seroprevalence of Toxoplasma gondii in feral pigs from a remote island lacking
cats. The Journal of Parasitology, 83: 839-41.
DUBEY, J. P.; THULLIEZ, P. (1993) Persistence of tissue cysts in edible tissues of
cattle fed Toxoplasma gondii oocysts. American Journal of Veterinary Research,
54: 270-3.
DUBEY, J. P.; THULLIEZ, P.; POWELL, E. C. (1995) Toxoplasma gondii in Iowa
sows: comparison of antibody titers to isolation of T. gondii by bioassays in mice
and cats. The Journal of Parasitology, 81: 48-53.
66
DURLACH, R. A.; KAUFER, F.; CARRAL, L.; HIRT, J. (2003) Toxoplasmic
lymphadenitis: clinical and serologic profile. Clinical Microbiology and Infection, 9:
625–31.
DZITKO, K.; STACZEK, P.; GATKOWSKA, J.; DLUGONSKA, H. (2006) Toxoplasma
gondii: Serological recognition of reinfection. Experimental Parasitology, 112: 134-
7.
EDELHOFER, R. (1994) Prevalence of antibodies against Toxoplasma gondii in pigs
in Austria: an evaluation of data from 1982 and 1992. Parasitology Research, 80:
642-4.
ESTEBAN-REDONDO, I.; MALEY, S. W.; THOMSON, K.; NICOLL, S.; WRIGHT, S.;
BUXTON, D. & INNES, E. A. (1999) Detection of T. gondii in tissues of sheep and
cattle following oral infection. Veterinary Parasitology, 86: 155-71.
FAN, C. K.; SU, K. E.; TSAI, Y. J. (2004) Serological survey of Toxoplasma gondii
infection among slaughtered pigs in northwestern Taiwan. The Journal of
Parasitology, 90: 653-4.
FELDMAN, H. A. (1982) Epidemiology of toxoplasma infections.
Epidemiologic Reviews, 4: 204-13.
FERGUNSON, H. W.; ELLIS, W. A. (1979). Toxoplamosis in a calf. The Veterinary
Record, 28: 392-3.
FLEGR, J.; PREISS, M.; KLOSE, J.; HAVLICEK, J.; VITAKOVA, M.; KODYM, P.
(2003) Decreased level of psychobiological factor novelty seeking and lower
intelligence in men latently infected with the protozoan parasite Toxoplasma
gondii Dopamine, a missing link between schizophrenia and toxoplasmosis,
Biological Psychology, 63: 253–68.
FRENKEL, J. K. (1973) Toxoplasma in and around us. BioScience, 23: 343-52.
FRENKEL, J. K. (1990) Toxoplasmosis in human beings. Journal of the American
Veterinary Medical Association, 196: 240-8.
67
FRENKEL, J. K. (1997) Toxoplasmose. In: VERONESI, R. (ed). Tratado de
Infectologia. São Paulo, Atheneu. Cap. 99, p. 1290-1306.
FREYRE, A.; DUBEY, J. P.; SMITH, D. D.; FRENKEL, J. K. J. (1989) Oocyst-induced
Toxoplasma gondii infections in cats. The Journal of Parasitology, 75: 750-5.
FRICKER-HIDALGO, H.; BRION, J. P.; DURAND, M.; CHAVANON, O.; BRENIER-
PINCHART, M. P.; PELLOUX, H. (2005) Disseminated toxoplasmosis with
pulmonary involvement after heart transplantation. Transplant Infectious Disease,
7: 38-40.
GALLEGO, C.; SAAVEDRA-MATIZ, C.; GOMEZ-MARIN, J. E. (2005) Direct
genotyping of animal and human isolates of Toxoplasma gondii from Colombia
(South America). Acta Tropica, 97: 161-7.
GAMBLE, H. R.; BRADY, R.C.; DUBEY, J. P. (1999) Prevalence of Toxoplasma
gondii infection in domestic pigs in the New England states. Veterinary
Parasitology, 82: 129-36.
GAMBLE, H. R.; Dubey, J. P.; Lambillotte, D. N. (2005) Comparison of a commercial
ELISA with the modified agglutination test for detection of Toxoplasma infection in
the domestic pig. Veterinary Parasitology, 128: 177-81.
GARCIA, J. L.; NAVARRO, I. T.; OGAWA, L.; DE OLIVEIRA, R. C.; KOBILKA, E.
(1999) Seroprevalence, epidemiology and ocular evaluation of human
toxoplasmosis in the rural zone of Jaguapitã (Paraná), Brasil. Pan American
Journal of Public Health, 6: 157-63.
GARWEG, J. G.; VENTURA, A. C.; HALBERSTADT, M.; SILVEIRA, C.; MUCCIOLI,
C.; BELFORT, R. J.; JACQUIER, P. (2005) Specific antibody levels in the
aqueous humor and serum of two distinct populations of patients with ocular
toxoplasmosis. International Journal of Medical Microbiology, 295: 287-95.
GAUSS, C. B.; DUBEY, J. P.; VIDAL, D.; RUIZ, F.; VICENTE, J.; MARCO, I.; LAVIN,
S.; GORTAZAR, C.; ALMERIA, S. (2005) Seroprevalence of Toxoplasma gondii
in wild pigs (Sus scrofa) from Spain. Veterinary Parasitology, 131: 151-6.
68
GUHL, F.; GONZALEZ, A. C.; MARINKELLE, C. J.; SÁNCHEZ, N. de. Estudio
comparativo entre las pruebas de immunofluorescencia indirecta y ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay) para toxoplasmosis em 877 sueros.
Revista Latinoamericana de Microbiología, 23: 235-8, 1981.
HASHEMI-FESHARKI, R. Seroprevalence of Toxoplasma gondii in cattle, sheep and
goats in Iran. (1996) Veterinary Parasitology, 61: 1-3.
HEJLICEK, K.; LITERAK, I. (1995) Animal foci and transmission routes of
Toxoplasma gondii. Epidemiologie, mikrobiologie, imunologie, 44:121-6.
HEJLICEK, K.; LITERAK, I.; NEZVAL, J. (1997) Toxoplasmosis in wild mammals
from the Czech Republic. Journal of Wildlife Diseases, 33: 480-5.
HILL, D. E.; SREEKUMAR, C.; GAMBLE, H. R.; DUBEY, J. P. (2004) Effect of
commonly used enhancement solutions on the viability of Toxoplasma gondii
tissue cysts in pork loin. Journal of Food Protection., 67: 2230-3.
HIRVELLA-KOSKI, V. (1992) The prevalence of Toxoplasma antibodies in swine
sera in Finland. Acta Veterinaria Scandinavica., 33: 21-5.
HOGHOOGHI-RAD, N.; AFRAA, M. (1993) Prevalence of toxoplasmosis in humans
and domestic animals in Ahwaz, capital of Khoozestan Province, south-west Iran.
The Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 96: 163-8.
HOLLAND, G. N. (2003) Ocular toxoplasmosis: a global reassessment. Part I:
epidemiology and course of disease. American Journal of Ophthalmology, 136:
973–88.
HORIO, M.; NAKAMURA, K.; SHIMADA, M. (2001) Risk of Toxoplasma gondii
infection in slaughterhouse workers in Kitakyushu City. Journal of UOEH, 23: 233-
43.
HOVE, T.; DUBEY, J. P. (1999) Prevalence of Toxoplasma gondii antibodies in sera
of domestic pigs and some wild game species from Zimbabwe. The Journal of
Parasitology, 85: 372-3.
69
HUONG, L. T.; LJUNGSTROM, B. L.; UGGLA, A.; BJORKMAN, C. (1998)
Prevalence of antibodies to Neospora caninum and Toxoplasma gondii in cattle
and water buffaloes in southern Vietnam. Veterinary Parasitology, 75: 53-7.
HUTCHISON, W. M. (1965) Experimental transmission of Toxoplasma gondii.
Nature, 206: 961-2.
IBGE (1997). Produção da Pecuária Municipal, 23. Rio de Janeiro. 28p.
JACOBS, L.; REMINGTON, J. S.; MELTON, M. L. (1960) A survey of meat samples
from swine, cattle, and sheep for the presence of encysted Toxoplasma. The
Journal of Parasitology, 46: 23-8.
JAMRA, L. M. F.; DEANE, M. P.; GUIMARÃES, E. C. (1969) On the isolation of
Toxoplasma gondii from human food of animal orgin. Partial results in the city of
São Paulo (Brazil). Revista do Instituto de Medicina Tropical, 3: 167-76.
KHAN, A.; SU, C.; GERMAN, M.; STORCH, G. A.; CLIFFORD, D. B.; SIBLEY, L. D.
(2005) Genotyping of Toxoplasma gondii strains from immunocompromised
patients reveals high prevalence of type I strains. Journal of Clinical Microbiology,
43: 5881-7.
KIJLSTRA, A.; EISSEN, O. A.; CORNELISSEN, J.; MUNNIKSMA, K.; EIJCK, I.;
KORTBEEK, T. (2004) Toxoplasma gondii infection in animal-friendly pig
production systems. Investigative Ophthalmology and Visual Science, 45: 3165-9.
KLUN, I.; DJURKOVIC-DJAKOVIC, O.; KATIC-RADIVOJEVIC, S.; NIKOLIC, A.
(2006) Cross-sectional survey on Toxoplasma gondii infection in cattle, sheep and
pigs in Serbia: Seroprevalence and risk factors. Veterinary Parasitology, 135:
121-31.
LEWEKE, F. M.; GERTH, C. W.; KOETHE, D.; KLOSTERKOTTER, J.;
RUSLANOVA, I.; KRIVOGORSKY, B.; TORREY, E. F.; YOLKEN, R. H. (2004)
Antibodies to infectious agents in individuals with recent onset schizophrenia,
European Archives of Psychiatry and Clinical Neuroscience, 254: 4–8.
70
LIN, S.; LING, Z. C.; ZENG, B. C.; YANG, H. Y. (1990) Prevalence of Toxoplasma
gondii infection in man and animals in Guangdong, Peoples Republic of China.
Veterinary Parasitology, 34: 357-60.
LIND, P.; HAUGEGAARD, J.; WINGSTRAND, A.; HENRIKSEN, S. A. (1997) The
time course of the specific antibody response by various ELISAs in pigs
experimentally infected with Toxoplasma gondii. Veterinary Parasitology, 71: 1-
15.
LUFT, R. Z.; REMINGTON, J. S. (1988) Toxoplasmic encephalitis. Journal of
Infectious Diseases, 157: 1-6.
LUNDEN, A.; LIND, P.; ENGVALL, E. O.; GUSTAVSSON, K.; UGGLA, A.;
VAGSHOLM, I. (2002) Serological survey of Toxoplasma gondii infection in pigs
slaughtered in Sweden. Scandinavian journal of infectious diseases, 34: 362-5.
MAGALDI, C.; ELKIS, H.; PATTOLI, D.; COSCINA, A. L.; (1969) Epidemic of
toxoplasmosis at a university in Sao-Jose-dos Campos, S.P. Brazil. 1. Clinical
and serologic data. Revista Latinoamericana de Microbiologia e Parasitologia,
11: 5-13.
MAGALDI, C.; ELKIS, H.; PATTOLI, D.; DE QUEIROZ, J.C.; COSCINA, A. L.;
FERREIRA, J. M. (1967) Outbreak of toxoplasmosis in a Paulist seminary in
Braganza (São Paulo state). Clinical, serological and epidemiological aspects.
Revista de Saúde Pública, 1: 141-71.
MATSUO, K.; HUSIN, D. (1996) A survey of Toxoplasma gondii antibodies in goats
and cattle in Lampung province, Indonesia. Southeast Asian Journal of Tropical
Medicine and Public Health, 27: 554-5.
MAYER, H. F.; MARDER, G.; PEIRETTI, H. A. (1987) Prevalence of Toxoplasma
antibodies in man and animals in North East Argentina. Veterinaria Argentina, 5:
889-93.
MAYER, H.F. 1965. Investigaciones sobre toxoplasmosis. Bol. Of. Sant.Panam.,
Washington, 6:485-97.
71
McALLISTER M. M. (2005) A decade of discoveries in veterinary protozoology
changes our concept of "subclinical" toxoplasmosis. Veterinary Parasitology, 132:
241-7.
MIRALLES LOPEZ, J. C.; LOPEZ ANDREU, F. R.; SANCHEZ-GASCON, F.; LOPEZ
RODRIGUEZ, C.; NEGRO ALVAREZ, J.M. (2005) Cold urticaria associated with
acute serologic toxoplasmosis. Allergologia et immunopathologia, 33: 172-4.
NAVARRO, I. T.; VIDOTTO, O.; GIRALDI, N.; FREIRE, R. L. (1992) Toxoplasma
gondii: isolamento a partir de carne e cérebro de suínos comercializados na
região de Londrina, PR. Semina, 13: 15-18.
NICOLLE, C.; MANCEAUX, L. (1908) Sur une infection a corps de Leishman (on
organisme voisins) du gondi. Comptes Rendus de I Academie des Sciences, 147:
763-6.
NOBREGA ODE, T.; KARNIKOWSKI, M. G. (2005) An estimation of the frequency of
gestational toxoplasmosis in the Brazilian Federal District. Revista da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical, 38: 358-60.
NOVOTNA, M.; HANUSOVA, J.; KLOSE, J.; PREISS, M.; HAVLICEK. J.;
ROUBALOVA, K. (2005) Probable neuroimmunological link between Toxoplasma
and cytomegalovirus infections and personality changes in the human host.
Infectious Diseases, 5: 54.
OLIVEIRA, B. C. (2002) Toxoplasmose: perfil sorológico durante a gravidez e
repercussões neonatais em maternidade pública de referência na cidade de
Belém do Pará, Tese (Mestrado em Pediatria), Escola Paulista de Medicina,
Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, 90 p.
OLIVEIRA, F. C. R.; COSTA, A.J.; SABATINI, G. A. (2001) Distribuição e viabilidade
de cistos de Toxoplasma gondii (Apicomplexa: Toxoplasmatinae) em tecidos de
Bos indicus, Bos taurus e Bubalus bubalis infectados com oocistos. Revista
Brasileira de Medicina Veterinária, 1: 28-34.
OMATA, Y.; DILORENZO, C.; VENTURINI, C.; VENTURINI, L.; IGARASHI, I.;
SAITO, A.; SUZUKI, N. (1994) Correlation between antibody levels in
72
Toxoplasma gondii infected pigs and pathogenicity of the isolated parasite.
Veterinary Parasitology, 51: 205-10.
PASHANINA, T. P.; NAPALKOVA, G. M.; SOMOVA, V. V.; KORSAKOVA, I. I. (2005)
Role of toxoplasmas in pathology of the vision organ. Meditsinskaia Parazitologiia
i Parazitarnye Bolezni, 3: 29-31.
PEREIRA, M. G. Amostras de conveniência. In: Pereira, M. G. Epidemiologia teoria e
prática. 1. ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, cap. 16, 1995, 596 p.
PIMENTEL GOMES, F. Curso de Estatística Experimental. 14 ed.: Nobel, 2000.
468p.
PINKERTON, H.; WEINMAN, D. (1940). Toxoplasma infection in man. Archives of
Pathology, 30: 374-92.
PITA GONDIM, L. F.; BARBOSA, H. V. JR.; RIBEIRO FILHO, C. H.; SAEKI, H.
(1999) Serological survey of antibodies to Toxoplasma gondii in goats, sheep,
cattle and water buffaloes in Bahia State, Brazil. Veterinary Parasitology, 82: 273-
6.
PRESS, C.; MONTOYA, J. G.; REMINGTON, J. S. (2005) Use of a single serum
sample for diagnosis of acute toxoplasmosis in pregnant women and other adults.
Journal of Clinical Microbiology, 43: 3481-3.
RUIZ, A.; FRENKEL, J. K. (1980) Toxoplasma gondii in Costa Rica cats. American
Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 29: 1150-60, 1980.
SAAVEDRA, G. M.; ORTEGA, Y. R. (2004) Seroprevalence of Toxoplasma gondii in
swine from slaughterhouses in Lima, Peru, and Georgia, U.S.A. The ournal of
Parasitology, 90: 902-4.
SABIN, A. B.; FELDMAN, H. A. (1948) Dyes as microchemical indicators of a new
immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma). Science,
108: 660–663.
73
SAMAD, M. A.; RAHMAN, K. B. & HALDER, A. K. (1993) Seroprevalence of
Toxoplasma gondii in domestic ruminants in Bangladesh. Veterinary Parasitology,
47: 157-9.
SANCHEZ, R. M.; CASTILLO, F. De la C.; GRANA, J. P. (1985) Comparación de
ELISA com las técnicas de inmunofluorescencia indirecta y fijación del
complemento para el diagnóstico de la toxoplasmosis. Revista Cubana de
Medicina Tropical, 37: 269-77.
SANGER, V. L.; CHAMBERLAIN, D. M.; CHAMBERLAIN, K. W.; COLE, C. R.;
FARRELL, R. L. (1953) Toxoplasmosis. V. Isolation of Toxoplasma from cattle.
Journal of American Veterinary Medical Association, 123: 87-91.
SCHULZIG, H. S.; FEHLHABER, K. (2005) Longitudinal study on the seroprevalence
of Toxoplasma gondii infection in four German pig breeding and raising farms.
Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift, 118: 399-403.
SHIIBASHI, T.; NARASAKI, K.; YOSHIDA, M.; NOGAMI, S. (2004) Prevalence of
anti-Toxoplasma gondii antibody in hunter-killed wild boars, Sus scrofa
leucomystax, on Amakusa Island, Kumamoto Prefecture, Japan. The Journal of
veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science, 66: 327-
8.
SILVA, N. R. S.; CHAPLIN, E. L.; MENDEZ, L. D. V.; ARAUJO, F. A. P. (1981)
Determinação de anticorpos toxoplásmicos em soros de suínos obtidos em
matadouros, na região do Alto Taquari, RS, Brasil. Arquivos da Faculdade de
Veterinária UFRGS, 9: 33-8.
SINGH, M. P.; DUBEY, M. L.; SUD, A.; MALLA, N. (2005) Antibody response to
Toxoplasma gondii in saliva samples from human immunodeficiency virus-
infected patients. British Journal of Biomedical Science, 62: 81-4.
SMITH, H. J. (1991) Seroprevalence of anti-Toxoplasma IgG in Canadian swine.
Canadian Journal of Veterinary Research. 55: 380-1.
SMITH, J. L. (1993) Documented outbreaks of toxoplasmosis : Transmission of
Toxoplasma gondii to humans. Journal of Food Protection, 56: 630-9.
74
SMITH, K. E.; ZIMMERMAN, J. J.; PATTON, S.; BERAN, G. W.; HILL, H. T. (1992)
The epidemiology of toxoplasmosis on Iowa swine farms with an emphasis on the
roles of free-living mammals. Veterinary Parasitology, 42: 199-211.
SOUZA, W. J. S. (1995) Epidemiologia da toxoplasmose: avaliação sorológica de
suínos e trabalhadores de abatedouros da Mesorregião do Grande Rio de
Janeiro. Tese (Doutorado). Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Rio de
Janeiro. 102 p.
SPLENDORE, A. (1908). Un nuovo protozoa parassita de conigli encontrado nelle
lesioni anatomiche d´une malattiache ricorda in moltopunti il Kalazar dell´uomo.
Nota preliminaire pel. Revista Societa Science Sao Paulo, 3: 109-112.
STANFORD, M. R.; SEE, S. E.; JONES, L. V.; GILBERT, R. E. (2003) Antibiotics for
toxoplasmic retinochoroiditis: an evidence-based systematic review.
Ophthalmology, 110: 926-31.
STROEHLE, A.; SCHMID, K.; HEINZER, I.; NAGULESWARAN, A.; HEMPHILL, A.
(2005) Performance of a Western immunoblot assay to detect specific anti-
Toxoplasma gondii IgG antibodies in human saliva. The Journal of Parasitology,
91: 561-3.
SUAREZ-ARANDA, F.; GALISTEO, A. J.; HIRAMOTO, R. M.; CARDOSO, R. P.;
MEIRELES, L. R.; MIGUEL, O.; ANDRADE, H. F. JR. (2000) The prevalence and
avidity of Toxoplasma gondii IgG antibodies in pigs from Brazil and Peru.
Veterinary Parasitology, 91: 23-32.
TENTER, A. M.; HECKEROTH, A. R.; WEISS, L. M. (2000) Toxoplasma gondii: from
animals to humans. International Journal for Parasitology, 30: 1217-58.
TIÚBA, S. R. O. (1998) Transmissão de Toxoplasma gondii ao homem através da
carne bovina. Monografia (Biologia Parasitária), Fundação Técnico-Educacional
Souza Marques, Rio de Janeiro, RJ., 80p.
TORRES, C. M. (1927) Sur une nouvelle maladie de l’homme caractérisée para la
presence dún parasite intracellularie très proche du toxoplasma et de
75
léncephalitozoon, dams le tisú masculaire cardiaque, les muscles du squelet, le
tisú cellularie sous-cutané et le tisú nerveux. Social Biology, 97: 1778-81.
UMINSKI, J.; CISAK, E.; CHMIELEWSKA-BADORA, J.; SKOMRA, S. (1989)
Detection of the foci of familial toxoplasmosis in rural environment. Wiadomo
Inverted Question Markci Parazytologiczne, 35: 289-97.
van KNAPEN, F.; KREMERS, A. F.; FRANCHIMONT, J. H.; NARUCKA, U. (1995)
Prevalence of antibodies to Toxoplasma gondii in cattle and swine in The
Netherlands: towards an integrated control of livestock production. The Veterinary
Quaterly., 17: 87-91.
VENKATESAN, P.; WAKELIN, D. (1993) ELISAs for parasitologists: or lies, damned
lies and ELISAs. Parasitology Today, 9: 228-32.
VENTURINI, M. C.; BACIGALUPE, D.; VENTURINI, L.; RAMBEAUD, M.; BASSO,
W.; UNZAGA, J. M.; PERFUMO, C. J. (2004) Seroprevalence of Toxoplasma
gondii in sows from slaughterhouses and in pigs from an indoor and an outdoor
farm in Argentina. Veterinary Parasitology, 124: 161-5.
VIDAL, J. E.; HERNANDEZ, A. V.; DE OLIVEIRA, A. C.; DAUAR, R. F.; BARBOSA,
S. P. Jr.; FOCACCIA, R. (2005) Cerebral toxoplasmosis in HIV-positive patients in
Brazil: clinical features and predictors of treatment response in the HAART era.
AIDS Patient Care STDS, 19: 626-34.
WANG, C.; DIDERRICH, V.; KLIEBENSTEIN, J.; PATTON, S.; ZIMMERMAN, J.;
HALLAM, A.; BUSH, E.; FAULKNER, C.; MCCORD, R. (2002) Toxoplasma gondii
levels in swine operations: differences due to technology choice and impact on
costs of production. Food Control, 13: 103-6.
WARNEKULASURIYA, M. R.; JOHNSON, J. D.; HOLLIMAN, R. E. (1998) Detection
of Toxoplasma gondii in cured meats. International Journal of Food
Microbiology, 45: 211-5.
WEIGEL, R. M.; DUBEY, J. P.; SIEGEL, A. M.; HOEFLING, D.; REYNOLDS, D.;
HERR, L.; KITRON, U. D.; SHEN, S. K.; THULLIEZ, P.; FAYER, R. (1995)
76
Prevalence of antibodies to Toxoplasma gondii in swine in Illinois in 1992. Journal
of the American Veterinary Medical Association, 206: 1747-51.
WEINMAN, D.; CHANDLER, A. H. (1956) Toxoplasmosis in man and swine: an
investigation of the possible relationship. The Journal of American Medical
Association, 161: 229-32.
WEISSENBOCK, H.; DUBEY, J. P. (1993) Toxoplasmosis epizootic in a fattening
swine herd. Deutsche Tierarztliche Wochenschrift, 100: 370-4.
WENTZ, I.; SOBESTIANSKY, J.; CHAPLIN, E. L. (1986) Prevalência de anticorpos
para Toxoplasma gondii em soros de suínos pedigree em Santa Catarina.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, 21: 441-3.
WINGSTRAND, A.; LIND, P.; HAUGEGAARD, J.; HENRIKSEN, S. A.; BILLE-
HANSEN, V.; SORENSEN, V. (1997) Clinical observations, pathology, bioassay
in mice and serological response at slaughter in pigs experimentally infected with
Toxoplasma gondii. Veterinary Parasitology, 72: 129-40.
WOLF, A.; COWEN, D. (1937) Granulomatous encephalomyelitis due to en
Encephalitozoon (encephalitozoic encephalomyelitis). A new protozoan disease
of man. Bulletin of the Neurology Institute of New York, 6: 306-35.
WOLF, A.; COWEN, D.; PAIGE, B. (1939) Human toxoplasmosis: occurrence in
infants as an encephalomyelitis: verification by transmission to animals. Science,
89: 226-7.
WOLF, A.; COWEN, D.; PAIGE, B. (1940) Toxoplasmic encephalomyelitis. IV –
Experimental transmission of the infection to animals from a human infant. The
Journal of Experimental Medicine, 71: 187-214.
WULF, M. W. H.; VAN CREVEL, R.; PORTIER, R.; TER MEULEN, C. G.;
MELCHERS, W. J. C.; VAN DER VEN, A.; GALAMA, J. M. D. (2005)
Toxoplasmosis after Renal Transplantation: Implications of a Missed Diagnosis.
Journal of Clinical Microbiology, 43: 3544-7.
77
WYSS, R.; SAGER, H.; MULLER, N.; INDERBITZIN, F.; KONIG, M.; AUDIGE, L.;
GOTTSTEIN, B. (2000) The occurrence of Toxoplasma gondii and Neospora
caninum as regards meat hygiene Schweizer Archiv fur Tierheilkunde, 142: 95-
108.
YOLKEN, R. H.; BACHMANN, S.; ROUSLANOVA, I.; LILLEHOJ, E.; FORD, G.;
TORREY, E. F.; SCHROEDER, J. (2001) Antibodies to Toxoplasma gondii in
individuals with first-episode schizophrenia. Clinical infectious diseases: an official
publication of the Infectious Diseases Society of America, 32: 842–4.
ZAKI, M. (1995) Seroprevalence of Toxoplasma gondii in domestic animals in
Pakistan. Journal of the Pakistan Medical Association., 45: 4-5.
ZIMMERMAN, J. J.; DREESEN, D. W.; OWEN, W. J.; BERAN, G. W. (1990)
Prevalence of toxoplasmosis in swine from Iowa. Journal of the American
Veterinary Medical Association, 2: 266-9.