UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO ESCOLA DE QUMICA MESTRADO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUMICOS E BIOQUMICOS

Avaliao das tcnicas de bioaumento fngico e bioestmulo em processos de biorremediao utilizando solo contaminado por petrleo

Sabrina Dias de Oliveira

Rio de Janeiro 2008

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Avaliao das tcnicas de bioaumento fngico e bioestmulo em processos de biorremediao utilizando solo contaminado por petrleo

Sabrina Dias de Oliveira

Dissertao de Mestrado apresentada Escola Federal de do Qumica Rio de da Universidade como

Janeiro,

requisito para a obteno do ttulo de Mestre em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos.

Orientadores:

Prof. D. Sc. Selma Gomes Ferreira Leite D. Sc. Judith Liliana Solrzano Lemos

EQ / UFRJ Rio de Janeiro 2008

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Avaliao das tcnicas de bioaumento fngico e bioestmulo em processos de biorremediao utilizando solo contaminado por petrleo

SABRINA DIAS DE OLIVEIRA

Dissertao submetida ao Corpo Docente do Curso de Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica da Universidade do Brasil - UFRJ, como parte dos requisitos necessrios obteno do grau de Mestre em Cincias.

Aprovada por:

_________________________________________________________ Selma Gomes Ferreira Leite, D. Sc. (orientador presidente da banca) _________________________________________________________ Judith Liliana Solrzano Lemos, D. Sc. (orientador) ___________________________________________________________ Eliana Flvia Camporese Srvulo, D. Sc. _________________________________________________________ Paulo Negrais Carneiro Seabra, D. Sc. __________________________________________________________ Vicente Paulo de Souza, D. Sc.

Rio de Janeiro 31 de Julho de 2008

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Oliveira, Sabrina Dias de. Avaliao das tcnicas de bioaumento fngico e bioestmulo em processos de biorremediao utilizando solo contaminado por petrleo. xviii, 140 p.: il. Orientadores: Selma Gomes Ferreira Leite e Judith Liliana Solrzano Lemos. (Dissertao) Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Qumica, 2008. 1. Biorremediao. 2. Petrleo. 3. Fungos Filamentosos Tese. I. Ttulo. II. Dissertao (Mestrado UFRJ/ EQ).

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A alegria est na luta, na tentativa, no sofrimento envolvido. No na vitria propriamente dita. Mahatma Gandhi.

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Dedico esse trabalho a duas grandes mulheres: minha av Dris (in memorian) e minha me Maria Luiza.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, por mostrar e abrir meus caminhos. Aos meus pais e irmo, que sempre estiveram ao meu lado e acreditaram no meu empenho.

Ao Flavio Bittencourt, por compreender minha ausncia e ajudar a trilhar minha histria.

A minha av Dris (in memorian), pela sua lio de fora e coragem. A toda a minha famlia, em especial a minha av Lourdes. Sua ajuda permitiu que eu chegasse at aqui.

A minha orientadora, D. Sc. Judith Liliana, por ser a mentora desse projeto e por ter me ensinado muito mais do que biorremediao.

A minha orientadora, D. Sc. Selma Leite, pelas contribuies e pelo carinho demonstrado, principalmente, nos momentos mais difceis.

A Claudinha e Bianca, por serem minhas grandes amigas e confidentes, em todos os momentos.

A Marion, pela colaborao na execuo dos experimentos. A sua companhia foi fundamental para prosseguir.

As minhas grandes companheiras do projeto de biorremediao/fungos: Accia, Yaci, Juliana, Llian e Aline.

A Moniquinha, por toda a ajuda tcnica fornecida. Seu auxlio foi fundamental para a formatao desse trabalho.

Aos amigos do mestrado: Diego, Patrcia, Ricardo, Graziela e Camilo, pela parceria nas disciplinas cursadas e pela amizade.

A Dani, Gisele, Pedro Flix, Jorge Luiz ( JL), Tatiane Moura, Ary e Grace, por todo o auxlio fornecido durante a parte experimental.

Aos amigos do CETEM, que me fizeram sorrir durante esses dois anos: Juan, Clenilson, Dbora Monteiro, Dbora Sanchez, Michel, Mrcia, Luiz Felipe, Jnior, Jorginho, Hugo Masson, Felipe, Rodrigo, Renata Barreto, Tayra, Rodnei, Gustavo, Michel, Felipe Duarte, Renata da Matta, , Paula Arago e Paula Batista.

A todos os meus amigos, que compreenderam minha ausncia e me deram foras pra continuar.

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Ao LABFER, em especial, ao Prof. Everaldo Zonta, pelas anlises de fertilidade. A toda a equipe do LECOMIN, em especial, a pesquisadora Silvia Egler e ao mestrando Ricardo Cezar, pela realizao dos ensaios de ecotoxicidade

Ao Ronaldo Santos, Coordenador de Processos Metalrgico e Ambientais do CETEM, pelo aporte intelectual e tcnico.

Aos pesquisadores Andra Rizzo, Cludia Cunha, Valria, Vicente, Luiz Sobral e Flvio Lemos, pelas contribuies valiosas.

A todos dos Servios Gerais, em especial, ao Raul e Seu Vicente. Aos motoristas, em especial ao Mrcio, pelas viagens para a UFRRJ e Analytical Solutions.

A toda a equipe da oficina e da unidade-piloto. Escola de Qumica, pelo suporte acadmico e tcnico. A direo do CETEM, pela infra-estrutura oferecida para a realizao da parte experimental da minha dissertao.

A Petrobrs, por ceder gentilmente o solo e o petrleo para a realizao da parte experimental.

A CAPES, pelo apoio financeiro.

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RESUMO

Oliveira, Sabrina Dias de. Avaliao das tcnicas de bioaumento fngico e bioestmulo em processos de biorremediao utilizando solo contaminado por petrleo. Orientadores: Selma Gomes Ferreira Leite e Judith Liliana Solrzano Lemos. Rio de Janeiro: UFRJ/EQ, 2008. Dissertao (Mestrado em Cincias). O presente trabalho visa determinar as estratgias de biorremediao mais efetivas para um solo nordestino, intencionalmente adicionado de petrleo, e avaliar a contribuio dos fungos filamentosos, nos processos de biodegradao. Para cumprir os objetivos relatados, os ensaios de biodegradao foram divididos em quatro estgios. O ensaio preliminar consistiu em um processo de atenuao natural monitorada de um solo contaminado com 5% m/m de petrleo. O principal objetivo, nesta fase, era a determinao de um momento ideal para adio de um inculo predominantemente fngico. Foi observado que, na quinta semana do experimento, houve um aumento na populao de fungos filamentosos, definindo esse momento como o perodo adequado para execuo de uma inoculao fngica no solo. Na segunda etapa, foram avaliadas, principalmente, a contribuio das fontes de nitrognio e suas respectivas concentraes nos testes de biodegradao de leo cru em micro-escala, alm da CRA (capacidade de reteno de gua) mais favorvel para o crescimento microbiano. Por meio da anlise de hidrocarbonetos totais do petrleo (HTP), a condio empregando uria na relao C:N 100/10 e 50% da CRA, mostrou um incremento maior na remoo de petrleo (62,34%) comparada amostra com mamona na relao C:N 100/20 e 50% da CRA (54,40%). A terceira etapa do procedimento experimental consistiu no estudo dos microrganismos biodegradadores de leo em uma escala maior (biorreatores estticos). A associao bioestmulo-bioaumento se mostrou mais favorvel para a biodegradao do petrleo do que as tcnicas empregadas individualmente; e o bioaumento realizado no incio do processo apresentou resultados mais satisfatrios do que o realizado na quinta semana. Dentre as condies testadas nos ensaios de biodegradao, destaca-se o emprego da uria, na relao C:N 100:15, e a adio do bioaumento no incio do processo para amostras contaminadas, tanto com 1% m/m, quanto com 5% m/m de contaminante, diferenciando-se, apenas, na relao C:N utilizada (100:10) para amostras com 5% de petrleo. Na ltima etapa, foi realizada a avaliao da qualidade do solo contaminado por meio de ensaios de toxicidade aguda com minhocas. Os solos contendo 1% e 5% m/m de petrleo no foram considerados txicos para os testes de letalidade e perda de biomassa realizados. Contudo, a incorporao das fontes de nitrognio se mostrou mais agressivas qualidade do solo do que o prprio contaminante.

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ABSTRACT

Oliveira, Sabrina Dias de. Evaluation of the fungal bioaugmentation and biostimulation tecniques in bioremediation process using contaminated soil with crude oil. Supervisors: Selma Gomes Ferreira Leite and Judith Liliana Solrzano Lemos. Rio de Janeiro: UFRJ/EQ, 2008. Dissertation (Master of Science). This work aims at determining the most effective strategies for bioremediating a northeast oil-bearing soil, being such oil intentionally added, and evaluate the contribution of filamentous fungi in the biodegradation process. To achieve such goals, tests of biodegradation were divided into four steps. The preliminary test consisted of monitored natural attenuation process of soil contaminated with 5% w/w of oil. The main goal at this step, was determining an ideal time for adding a predominantly fungal inoculum. It was observed that in the ffth week i of the experiment, there was an increase in fungal population. This step defined the fifth week as the right time for implementing a fungal inoculation in the soil. In the second step, the contribution of the nitrogen sources and their concentrations were evaluated mainly in the tests of biodegradation of crude oil in micro scale, besides the more favorable WRC for microbial growth. The experiment was followed by direct measurements of carbon dioxide, from soil contaminated with 5% w/w of oil. Through analysis of total petroleum hydrocarbons (TPH), the condition employing urea in the 100/10 C: N ratio, and 50% of WRC, showed a higher oil removal (62.34%) compared to the sample with castor bean in the 100/20 C: N ratio, and 50% of the WRC (54.40%). The third step of the experimental procedure consisted in the study of microorganisms with the ability to degrade oil on a large scale (static bioreactors). The association bio-stimulation-bio-augmentation was more favorable for the biodegradation than the techniques used individually, and bio-augmentation carried out early in the process presented more satisfactory results, than those obtained in the fifth week. Among the conditions tested in the biodegradation assays, the use of urea in the 100:15 C: N r tio, and the early addition of the inoculum in the contaminated samples a were evidenced, either with 1% w/w, or with 5% w / w of contaminant. The difference was in the latter condition, accomplished in 100:10 C:N ratio. At the last step, the quality of contaminated soil was evaluated by acute toxicity tests with earthworms. The soils containing 1% and 5% w/w oil were not considered toxic to the tests of lethality and loss of biomass. However, the incorporation of nitrogen sources was more aggressive on soil quality than the actual contaminant.

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Fontes de Nitrognio.......................................................................................25 Tabela 2. Condies adotadas no Teste de Biodegradao em microcosmos................55 Tabela 3. Variveis e Nveis utilizados no Planejamento Experimental 23 do teste em microcosmos....................................................................................................................56 Tabela 4: Condies adotadas nos Ensaios em Biorreatores Estticos..........................59 Tabela 5. Descrio das amostras utilizadas na avaliao da qualidade do solo por ensaios de ecotoxicidade.....................61 Tabela 6. Rotina de Fertilidade, Teor de Nitrognio Total e determinao da CRA no solo virgem......................................................................................................................68 Tabela 7. Relao natural C:N para as amostras de solo virgem e contaminado...........69 Tabela 8. Composio Qumica da Uria e da Mamona................................................70 Tabela 9. Matriz do planejamento fatorial completo (23 ) ..............................................82 Tabela 10. Incremento na remoo de HTP para as condies 1 e 15, em relao aos seus respectivos controles, sem fonte de nitrognio. ......................................................92

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Constituio de um solo ideal ..........................................................................9 Figura 2. Classificao granulomtrica do solo.............................................................10 Figura 3. Esquema de contaminao no meio ambiente................................................12 Figura 4. Construo do landfarming.............................................................................19 Figura 5. Plantao de mamona (Ricinus communis L.) ...............................................27 Figura 6. Fluxograma das etapas do processamento das sementes de mamona para a produo do leo e do subproduto torta..........................................................................28 Figura 7. Principais benefcios proporcionados pelos fungos........................................39 Figura 8. Homogeneizao do solo................................................................................47 Figura 9. Quarteamento do solo.....................................................................................48 Figura 10. Biorreator esttico contendo solo contaminado com petrleo a 5% m/m.....52 Figura 11. Foto do microcosmo utilizado nos Testes de Biodegradao.......................54 Figura 12. Ensaio utilizando biorreatores estticos........57 Figura 13. Incluso das minhocas nas rplicas e disposio dos lotes no teste..............63 Figura 14. Contagem de colnias de fungos filamentosos em solo contaminado com 5% m/m de petrleo. .............................................................................................................73 Figura 15. Contagem de colnias de microorganismos heterotrficos totais em solo contaminado com 5% m/m de petrleo. .........................73 Figura 16. Teor de leos e graxas para as amostras de solo contaminado com 5% m/m de petrleo e 50, 75 e 90% da CRA. ..................................75 Figura 17. Teste de biodegradao de solo contaminado com 5% de petrleo, utilizando uria (U) como nutriente: condies 1-12...............................78

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Figura 18. Teste de biodegradao de solo contaminado com 5% de petrleo, utilizando torta de mamona (MA) como nutriente: condies 13-24...........................78 Figura 19. Teste de biodegradao de solo contaminado com 5% de petrleo, utilizando uria: Condies 1, 2, 3, 4, 7 e 8.....................................................................................79 Figura 20. Teste de biodegradao de solo contaminado com 5% de petrleo, utilizando mamona: Condies 13, 14, 15, 16, 19 e 20....................................................................80 Figura 21. Relao entre os valores experimentais observados e os preditos pelo planejamento fatorial completo 23 , avaliando os fatores fonte de nitrognio,

concentrao do nutriente e CRA....................................................................................83 Figura 22. Grfico de Pareto: visualizao dos efeitos estatisticamente relevantes para os resultados de carbono removido do planejamento fatorial completo 23 , avaliando os fatores fonte de nitrognio, concentrao do nutriente e CRA........................................84 Figura 23. Grfico das mdias das interaes entre os fatores concentrao x CRA das fontes 1 (uria) e 2 (mamona) do planejamento fatorial completo 23 .............................85 Figura 24. Testes utilizando uria: Condies 1-4 descontadas.....................................89 Figura 25. Testes utilizando torta de mamona: Condies 13-16 descontadas..............89 Figura 26. Condies promissoras para a biodegradao de petrleo nos testes em microcosmos: 1 (uria 100/10 com 50% de CRA) e 15 (mamona 100/20 com 50% de CRA) descontadas...........................................................................................................90 Figura 27. Visualizao de microorganismos degradadores para a condio 6, nas semanas 4 e 8, respectivamente. .....................................................................................97 Figura 28. Microorganismos degradadores presentes nos biorreatores estticos...........98 Figura 29. Remoo de hidrocarbonetos derivados do petrleo para as Bandejas 110.....................................................................................................................................99

xiv

Figura 30. ndice de letalidade das minhocas adicionadas aos lotes para avaliao ecotoxicolgica..............................................................................................................105 Figura 31. Perda de biomassa das minhocas nos lotes 1, 2 e 4............................107

xv

LISTA DE REAES

Reao 1. Reao de reduo do nitrato amnia realizado por fungos........................33 Reao 2. Oxidao do enxofre puro por fungos............................................................35

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SUMRIO

CAPTULO 1: Introduo e Objetivos

1.1 1.2

INTRODUO...............................................................................................................2 OBJETIVOS.....................................................................................................................5 1.2.1 1.2.2 OBJETIVO GERAL.............................................................................................5 OBJETIVOS ESPECFICOS...............................................................................5

CAPTULO 2: Reviso Bibliogrfica

2.1

SOLO................................................................................................................................8 2.1.1 CONSTITUINTES, PROPRIEDADES QUMICAS E FSICAS DO SOLO.........8 2.1.2 POLUIO DO SOLO..........................................................................................10

2.2 2.3

PETRLEO...................................................................................................................13 BIORREMEDIAO...................................................................................................14 2.3.1 TECNOLOGIAS DE BIORREMEDIAO........................................................16 2.3.2 TCNICAS AUXILIARES DE BIORREMEDIAO........................................21 2.3.2.1 BIOAUMENTO........................................................................21 2.3.2.2 BIOESTMULO.......................................................................22

2.4

EMPREGO

DE

FUNGOS

FILAMENTOSOS

NO

PROCESSO

DE

BIORREMEDIAO................................................................................................................29 2.4.1 FUNGOS FILAMENTOSOS.................................................................................29 2.4.2 CULTIVO DOS FUNGOS FILAMENTOSOS.....................................................36 2.4.3 FUNGOS NO SOLO..............................................................................................38 2.4.4 APLICAO DE FUNGOS NA BIORREMEDIAO......................................38

xvii

2.5

ENSAIOS

DE

ECOTOXICIDADE

EM

PROCESSOS

DE

BIORREMEDIAO................................................................................................................43

CAPTULO 3: Materiais e Mtodos

3.1

SOLO...............................................................................................................................47 3.1.1 CARACTERIZAO PARCIAL DO SOLO.......................................................48

3.2 3.3 3.4 3.5

PETRLEO....................................................................................................................49 FONTES DE NITROGNIO........................................................................................49 INCULO........................................................................................................................50 TESTES DE BIODEGRADAO................................................................................50 3.5.1 3.5.2 3.5.3 PRIMEIRA ETAPA: ENSAIO PRELIMINAR.................................................52 SEGUNDA ETAPA: EXPERIMENTOS EM MICROCOSMOS.....................53 TERCEIRA ETAPA: ENSAIOS EM BIORREATORES ESTTICOS...........57

3.5.4 QUARTA ETAPA: ENSAIOS DE ECOTOXICIDADE AGUDA...................60 3.6 MTODOS ANALTICOS DE MONITORAMENTO DOS ENSAIOS DE

BIODEGRADAO..................................................................................................................63 3.6.1 DEGRADAO DO CONTAMINANTE........................................................63 a) Quantificao do Gs Carbnico Gerado....................................................................63 b) Anlise do teor de leos e graxas (OG)...................................................................... 64 c)Anlise da Concentrao de Hidrocarbonetos Totais do Petrleo

(HTP)............................................................................................................................................65 3.6.2 QUANTIFICAO DOS MICROORGANISMOS..........................................65

a) Heterotrficos totais....................................................................................................65 b) Microorganismos degradadores..................................................................................65

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CAPTULO 4: Resultados e Discusso

4.1 CARACTERIZAO PARCIAL DO SOLO...................................................................68 4.2 COMPOSIO QUMICA DAS FONTES DE NITROGNIO....................................70 4.3 TESTES DE BIODEGRADAO....................................................................................71 4.3.1 PRIMEIRA ETAPA: ENSAIO PRELIMINAR PARA REALIZAO DO

BIOAUMENTO..............................................................................................................72 4.3.2 4.3.3 SEGUNDA ETAPA: EXPERIMENTOS EM MICROCOSMOS.....................76 TERCEIRA ETAPA: ENSAIOS EM BIORREATORES ESTTICOS...........93

4.3.4 QUARTA ETAPA: ENSAIOS DE ECOTOXICIDADE AGUDA.................104

CAPTULO 5: Concluses e Sugestes

5.1 CONCLUSES......................................................................................................110 5.2 SUGESTES.........................................................................................................115

CAPTULO 6: Referncias Bibliogrficas

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS......................................................................117

ANEXOS

ANEXO A TABELAS..................................................................................135

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CAPTULO 1: Introduo e Objetivos

2

1.1

INTRODUO

PEARSON (1995) afirma que a degradao de reas ambientais j podia ser observada no Oriente Mdio e na ndia em 2000 a.C. Segundo ele, a alterao no solo era causada pelo sistema de irrigao com gua salobra, que era a fonte de gua utilizada na poca. O autor refere que as altas concentraes de sal na gua causavam a desertificao do solo. Os problemas de poluio e degradao ambiental agravaram-se com a formao dos centros urbanos e, com a Revoluo Industrial no final do sculo XVIII, durante a qual se intensificou a produo de resduos, devido mecanizao dos processos de produo (LEITE, 1995 apud DIAS, 2000). Naquela poca, a disposio e o tratamento destes resduos eram bastante precrios. Da mesma forma, a acelerao dos processos industriais, principalmente no sculo XX, gerou os chamados poluentes ambientais, decorrentes da produo e m administrao destes resduos, que se refletem atualmente nas inmeras reas contaminadas em todo o mundo. Os problemas ambientais que caracterizam os tempos modernos so numerosos e bem documentados. As causas so variadas e envolvem praticamente todas as atividades humanas. O crescimento exacerbado da populao, por exemplo, acarretou o estabelecimento de conglomerados de alta densidade populacional, o que colabora, significativamente, para o aumento da quantidade de resduos produzidos (lixo domstico, esgoto etc.). Por sua vez, a atividade industrial contribui com grandes volumes de efluentes e resduos slidos de natureza diversa, os quais, geralmente, carregam espcies qumicas de carter txico (BRITO, 2003). No mbito industrial, destaca-se o setor de petrleo. Comercialmente explorado

3 desde a metade do sculo XIX, o petrleo tem sido usado por muitas dcadas, para iluminao e, em menor escala, como lubrificante. No entanto, a inveno do motor de combusto interna e sua rpida adoo em todas as formas de transporte aumentaram o consumo dessa fonte natural, o que elevou sua demanda, produo, transporte e distribuio, assim como a dos seus derivados. Todas essas atividades envolvem riscos de poluio que podem ser minimizados, mas no totalmente eliminados e, quando ocorrem, causam srios problemas para o ambiente (PALA, 2006). Cabe destacar aqui que a manuteno de padres de produo e consumo no sustentveis da sociedade atual impe um desafio em busca de estratgias e medidas para enfrentar os efeitos da contaminao do meio ambiente. Alm disso, soma-se aos problemas supracitados a presso da opinio pblica, que no se coloca mais margem quando a discusso o meio ambiente. Documentrios alarmantes sobre aquecimento global e as perspectivas sobre o mau uso dos recursos naturais transpassam os muros das universidades e atingem sociedade. Dessa forma, grupos sociais exigem a implantao de programas ambientalmente sustentveis como seqestro de carbono, uso de biocombustveis e outras fontes de energia renovveis para reduo do efeito estufa, s para citar alguns exemplos. Na conjuntura atual, o uso de tecnologias verdes, como as tcnicas que utilizam processos biolgicos para o tratamento de stios poludos, torna-se popular e recebe grande aceitao pblica. Sendo assim, a aplicao da biorremediao est bem inserida nesse contexto, j que se trata da incrementao de um processo biolgico que j ocorre naturalmente. O processo de biorremediao pode ser definido como o uso de

microorganismos para remover poluentes ambientais do solo, gua e sedimentos.

4 Destacam-se suas numerosas vantagens em relao a outros processos empregados na remoo de poluentes, sendo um dos mtodos mais eficientes para tratar ambientes contaminados (PALA, 2006). Os possveis benefcios e vantagens da biorremediao incluem: baixo custo energtico, requerido para as transformaes bioqumicas; possibilidade de tratamento no prprio local; reduo de custos do transporte; eliminao permanente do resduo, reduzindo os riscos em longo prazo; reduo dos riscos de contaminao de outras reas; alm da positiva aceitao pblica, j enfatizada anteriormente. Deve-se salientar que a biorremediao j foi aprovada pela Agncia de Proteo Ambiental Americana (US-EPA) como uma tecnologia de limpeza de locais contaminados com resduos perigosos (DELARCO, 1999). Sendo assim, as alternativas, que utilizam solues mais naturais e com menores impactos no subsolo, vem ganhando maior destaque nos ltimos anos. Porm, vale lembrar que essas solues, devido ao maior tempo requerido na remediao, nem sempre so suficientes para atingir os objetivos do projeto e, muitas vezes, devem ser aplicadas em complemento a outras tecnologias convencionais existentes, como os processos de tratamentos qumicos e fsicos (NOBRE & NOBRE, 2004).

5 1.2 OBJETIVOS

1.2.1

OBJETIVO GERAL

O presente trabalho visa determinar as estratgias de biorremediao mais efetivas para um solo nordestino, intencionalmente adicionado de petrleo, por meio da contribuio dos fungos filamentosos nos processos de biodegradao.

1.2.2

OBJETIVOS ESPECFICOS

i.

Avaliar o comportamento microbiano, no processo de atenuao natural, para determinao do momento de decrscimo da populao de heterotrficos totais a fim de se realizar uma inoculao fngica no solo contaminado;

ii. Comparar duas fontes de nitrognio, uria e mamona, em diferentes concentraes, para fins de bioestimulao do processo de biorremediao; iii. Agregar valor a um resduo agroindustrial da produo do biodiesel a torta de mamona por meio da sua insero, como nutriente, no processo da biorremediao. iv. Determinar a melhor relao nutricional C/N a ser empregada nos testes de biorremediao; v. Analisar as condies mais influentes nos ensaios de biodegradao em microcosmos, estatstica; vi. Confrontar os dois diferentes momentos de adio (tempo zero ou durante o utilizando o planejamento experimental como ferramenta

6 experimento) de um inculo predominantemente fngico no solo contaminado e verificar a real influncia desse parmetro no emprego do bioaumento. vii. Analisar a eficcia do emprego das tcnicas de bioaumento e bioestmulo, em conjunto ou separadas, nos testes de biodegradao. viii.Avaliar qual das concentraes de contaminante presente no solo, 1% e 5% m/m, produzem o maior percentual de remoo efetiva de hidrocarbonetos totais de petrleo, frente ao uso de tcnicas auxiliares de bioaumento fngico e bioestmulo. ix. Estudar a toxicidade do solo contaminado com petrleo, nas concentraes de 1% e 5% m/m. x. Avaliar o impacto toxicolgico das fontes de nitrognio, nas amostras de solo contaminado, no incio do tratamento biolgico.

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CAPTULO 2: Reviso Bibliogrfica

8 2.1 SOLO

O solo pode ser considerado como um conjunto de diversos ciclos naturais, em que participam fragmentos de rochas, minerais, gua, ar, seres vivos e seus detritos em decomposio. Esses resultam de fatores climticos no decorrer do tempo e da atividade combinada de microorganismos decompondo restos de animais/vegetao,

respectivamente. Dessa forma, o solo considerado resultado das interaes da litosfera, hidrosfera, atmosfera e biosfera (ROCHA et al., 2004). A seguir, sero discutidos os constituintes e as propriedades do solo.

2.1.1 CONSTITUINTES, PROPRIEDADES QUMICAS E FSICAS DO SOLO

O solo, nosso ocal de contaminao e, por isso, motivo de estudo, definido l como a camada superficial da crosta terrestre, que transformada por fatores climticos, biolgicos e, em grande parte, pelas atividades antropognicas, sendo composto de fases slida, lquida e gasosa, intensamente misturadas. As propores relativas de cada fase variam de solo para solo e, em um mesmo solo, com as condies climticas, a presena de plantas e manejo (ROCHA et al., 2004). Em geral, a fase slida, constituda de formaes minerais e de frao orgnica, ocupa em mdia 50% do volume total do solo, sendo que 45% so representados por minerais e 5% por matria orgnica. O restante do volume do solo ocupado por fases lquida e gasosa, representando cada uma 25% do volume total do solo, como mostra Figura 1 (ROCHA et al., 2004).

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Figura 1. Constituio de um solo ideal (CETESB, 2007).

Dentre os constituintes do solo, a matria orgnica inclui uma grande variedade de seres vivos, desde bactrias e fungos at protozorios etc. Os organismos do solo, em especial os microorganismos, so responsveis pela decomposio de resduos orgnicos, bem como, pela sntese de molculas orgnicas de elevada estabilidade as substncias hmicas com propriedades importantes como a capacidade de reteno de gua, poder tamponante do solo e uma fonte de nutrientes para a microbiota (BARROS, 2007). Os horizontes dos solos, ou seja, as camadas que se diferenciam entre si, so formadas por meio dos processos de intemperismo. O perfil do solo ento, o conjunto dos horizontes e/ou camadas que abrangem, verticalmente, desde a superfcie at o material originrio. As propriedades fsicas do solo (textura, estrutura, densidade, porosidade, permeabilidade, fluxo de gua, ar e calor) so responsveis pelos mecanismos de atenuao fsica de poluentes, como filtrao e lixiviao, possibilitando ainda condies para que os processos de atenuao qumica e biolgica possam ocorrer (CETESB, 2007). A Figura 2 mostra a classificao granulomtrica do solo.

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Figura 2. Classificao granulomtrica do solo (CETESB, 2007).

Por outro lado, as propriedades qumicas dos solos pH, teor de nutrientes, capacidade de troca inica e condutividade eltrica so, junto com a matria orgnica e a atividade biolgica, responsveis pelos mecanismos de atenuao de poluentes nesse meio. Dentre os mecanismos envolvidos, podem ser destacadas a adsoro, a fixao qumica, precipitao, oxidao, troca inica e a neutralizao que, invariavelmente, ocorrem no solo e que por meio do manejo de suas propriedades, podem ser modificados de acordo com a convenincia (CETESB, 2007).

2.1.2 POLUIO DO SOLO

Na atualidade, o tema poluio do solo tem despertado, a um s tempo, interesse e preocupao dos especialistas e das autoridades. So importantes, no apenas, os

11 aspectos ambientais e de sade pblica, como tambm e, principalmente, a ocorrncia de episdios crticos de poluio de mbito mundial, tais como a questo das reas contaminadas (GNTHER, 2005). Segundo BRASIL (1981), o termo poluio definido como toda alterao das propriedades fsicas, qumicas e biolgicas que possa constituir prejuzo sade, segurana e ao bem-estar das populaes e, ainda, possa comprometer a biota e a utilizao dos recursos para fins comerciais, industriais e recreativos. Desta forma, a poluio do solo denota a presena significativa de algum elemento ou substncia que pode afetar componentes biticos do ecossistema, comprometendo sua funcionalidade e sustentabilidade. Assim, a poluio do solo est ligada concentrao, ou quantidade de resduos, incorporados acidentalmente ou intencionalmente. De acordo com a legislao ambiental, para o controle dessa poluio, certos padres e indicadores de qualidade do solo (taxa de eroso etc.) devem ser respeitados num determinado ambiente (BRAGA et al., 2002). Conseqentemente, a introduo de contaminantes no solo pode resultar na perda de algumas ou vrias de suas funes e ainda provocar contaminao de gua subterrnea. A ocorrncia de contaminantes no solo, originados por vrias fontes, acima de certos nveis, provoca mltiplas conseqncias negativas para a cadeia alimentar, para a sade pblica e para os diversos ecossistemas e recursos naturais (RODRIGUES e DUARTE, 2003). Embora a poluio do solo, geralmente, no seja to visvel ou imediatamente perceptvel, seus efeitos podem ser muito nocivos, uma vez que o solo um compartimento ambiental que no se renova rapidamente, ao contrrio do ar e da gua (BRASIL, 1983 apud DIAS, 2000). As complexas reaes qumicas que acontecem no solo so realizadas pela presena de milhares de espcies de microorganismos, como

12 bactrias, fungos e algas, entre outros. A grande maioria destes organismos vive no primeiro horizonte do solo, at uma profundidade de cerca de 40 cm. dessa estreita camada que os vegetais retiram nutrientes necessrios ao seu desenvolvimento, garantindo alimento para os animais que habitam sobre ela. Entretanto, esta a primeira a ser atingida pelos compostos txicos. Desta forma, quando estas substncias so descartadas, os organismos morrem, comprometendo diretamente todo o sistema de respirao do solo (DIAS, 2000). A poluio dos solos, por metais pesados e substncias txicas orgnicas e inorgnicas, tem sido relatada em muitos contextos diferentes, sendo essencial sua deteco para evitar problemas relacionados sade, bem como s degradaes ambientais (BERNARD, 1997; ACCIOLY & SIQUEIRA, 2000). Um dos poluentes que merece destaque o petrleo, pelo seu alto teor de contaminantes, com drsticos efeitos no meio ambiente e na sade. Na Figura 3, observamos um esboo das formas de contaminao que ocorrem no meio ambiente.

Figura 3. Esquema de contaminao no meio ambiente (CETESB, 2007)

13 2.2 PETRLEO

Petrleo significa leo da pedra, por ser encontrado, normalmente, impregnado em determinadas rochas porosas denominadas de arenito, dispostas em camadas geolgicas sedimentares. Formou-se na Terra h milhes de anos, a partir da decomposio de pequenos animais marinhos, plncton e vegetao tpica de regies alagadias e encontrado junto ao gs de petrleo, formando bolses entre rochas impermeveis ou impregnando rochas de origem sedimentar (FONSECA, 1992). O petrleo constitudo, essencialmente, de carbono e hidrognio (90% dos leos crus), com quantidades relativamente pequenas de compostos orgnicos sulfurados, nitrogenados, oxigenados e organometlicos. Predominam os

hidrocarbonetos como os acclicos saturados (alcanos), de cadeia normal e ramificada, bem como os cclicos, tambm de cadeia normal ou ramificada (cicloalcanos) e os aromticos. Os demais compostos, por figurarem na composio com teores minoritrios, so classificados como impurezas oleoflicas. No petrleo bruto, no ocorrem hidrocarbonetos olefnicos. Quando esses compostos aparecem nos derivados do petrleo porque foram incorporados durante o seu processamento

(www.maxwell.lambda.ele.puc-rio.br/cgi-bin/PRG_0599.EXE/4333_3.PDF?). A composio qumica do petrleo varia com a sua origem e, conseqentemente, afeta a susceptibilidade ao ataque microbiano. A maioria dos hidrocarbonetos possui baixa solubilidade em gua o que acarreta baixas taxas de metabolizao do poluente (WIDDEL e RABUS, 2001). A introduo de leo cru no solo, seja esta acidental ou intencional, provoca aumento do nmero de microrganismos com capacidade de degradao de petrleo e,

14 conseqentemente, a elevao da atividade microbiana nesse ambiente. Isso ocorre, porque os microrganismos oriundos do solo podem adaptar-se ao petrleo, sofrer enriquecimento seletivo e mudanas genticas, que possibilitam esse aumento. Em solos no contaminados, menos de 1% da populao microbiana nativa apresenta capacidade para degradar hidrocarbonetos de petrleo, enquanto esse valor pode atingir de 1 a 10% do total de microrganismos nativos presentes em ambientes terrestres contaminados por leo cru (ATLAS, 1991).

2.3

BIORREMEDIAO

Atualmente, existe uma preocupao mundial em torno dos impactos ambientais ocasionados pelos resduos slidos. Essa inquietao resultado das contaminaes ambientais que afetam a sade pblica e a biodiversidade, e foram geradas pela m administrao dos resduos anteriormente produzidos (DIAS, 2000). A aplicao de processos biotecnolgicos envolvendo, individualmente ou conjuntamente, microorganismos e/ou enzimas e surfactantes, com o objetivo de solucionar ou minorar problemas de poluio ambiental, tem se tornado crescente. Dessa forma, a microbiologia de degradao de hidrocarbonetos constitui um campo de pesquisa em pleno desenvolvimento (BONAVENTURA & JOHNSON, 1997). E como destaque, surge a biorremediao como prtica atrativa de remoo de hidrocarbonetos de petrleo, por causa da simplicidade da manuteno, aplicao em grandes reas, baixo custo, alm da possibilidade de ocasionar a destruio completa do contaminante (BENTO et al., 2005).

15 A biorremediao pode ser definida como um conjunto de tecnologias, que utilizam processo(s) biolgico(s), aplicadas recuperao ou remediao de reas contaminadas, ou ao tratamento de compostos orgnicos volteis txicos ou efluentes, contendo resduos txicos, que devam ser eliminados antes da descarga no ambiente. Para isto, em geral, utilizam-se microorganismos, plantas ou produtos biolgicos, como enzimas e componentes celulares, com a finalidade de realizar uma mineralizao, a qual, possivelmente, resulta em gs carbnico e gua como produtos finais (DIAS, 2000). O objetivo da biorremediao, quando usada como tcnica de tratamento em reas contaminadas, induzir ou acelerar os processos biolgicos naturais de reciclagem de compostos de interesse, incluindo compostos orgnicos ou inorgnicos. Assim, o desafio principal utilizar a capacidade intrnseca dos microorganismos de degradar matria orgnica para degradar compostos orgnicos txicos, tanto de origem natural como compostos sintticos (DIAS, 2000). Os processos de biorremediao, h muitas dcadas, j vm sendo usados com sucesso no tratamento de efluentes industriais e esgotos domsticos. Tambm podem observar-se processos biolgicos de tratamento em aterros industriais de resduos perigosos e aterros de resduos urbanos, em geral. Atualmente, tem crescido o interesse em relao a biorremediao, como objeto da sua aplicao em reas contaminadas pela descarga inadequada (intencional ou acidental) de resduos slidos (DIAS, 2000). O uso da tcnica de biorremediao, embora apresente inmeras vantagens tais como aplicao em grandes reas, baixo custo e eliminao expressiva do contaminante depende de muitos fatores para alcanar as condies timas de biodegradao, entre os quais, podem ser citados: o tipo, concentrao e biodisponiblidade dos poluentes,

16 suprimentos de nutrientes e histrico do local contaminado (BENTO et al., 2005). Dentre os parmetros interferentes, destacam-se ainda, propriedades fsico-qumicas do solo e histrico do local contaminado, ecologia microbiana (com nfase para a competio interespcies) e metodologia do processo, tendo, como exemplo, mtodo e concentrao do inculo. O sucesso da biodegradao tambm influenciado pelas fontes de energia (doadores de eltrons), aceptores de eltrons, nutrientes, pH, temperatura e substratos inibidores ou metablitos, alm do conhecimento da densidade da populao de microorganismos degradadores de leo e o seu potencial de biodegradao para a biorremediao de locais contaminados (HAMDI et al., 2007; BENTO et al., 2005; VOGEL, 1996; BOOPATHY, 2000). Dentre os fatores interferentes mencionados, sero destacadas a composio e as propriedades fsico-qumicas do poluente o petrleo, neste caso especfico e do solo, local de contaminao e razo de estudo. Fatores estes que j foram discutidos anteriormente.

2.3.1 TECNOLOGIAS DE BIORREMEDIAO

A biorremediao uma prtica que vem alcanando importncia mundial, uma vez que o aumento da atividade industrial est degradando, cada vez mais, os ecossistemas naturais. O emprego de microorganismos conhecidos para o tratamento de rejeitos potencialmente txicos uma prtica habitual em alguns pases desenvolvidos (LEMOS, 2003). De acordo com o tipo de tratamento, as tcnicas de biorremediao so denominadas in situ e ex situ, adotadas considerando no s os poluentes, mas o custo

17 dos processos e, principalmente, a concentrao final do contaminante, no trmino do tratamento, como aceitvel para o tipo de resduo e para o uso futuro da rea. Na biorremediao in situ, o processo de biodegradao ocorre no local contaminado. As tcnicas in situ, geralmente envolvem o aumento da atividade microbiana local, por meio da alterao da rea degradada, usando-se a adio de nutrientes, ajuste de pH, o controle da umidade e da aerao para propiciar as condies timas de degradao biolgica dos componentes txicos (FERRARI, 1996;

BOOPATHY, 2000; MARTINS, 2003). Na biorremediao ex situ, o solo retirado e transferido at a unidade de tratamento. Para este propsito, emprega-se a remoo do material contaminado, geralmente, por escavao do solo e o bombeamento da gua. Quando o tratamento do tipo ex situ, em geral, envolve o uso de biorreatores ou de algum mecanismo que possibilite o aumento do controle dos parmetros mais importantes do processo de remediao (FERRARI, 1996; BOOPATHY, 2000; MARTINS, 2003). As funes naturais do solo so perturbadas em conseqncia da estratgia utilizada no seu tratamento. No caso do uso de tcnicas in-situ, as funes do solo podem sofrer mudanas em sua estrutura ou modificaes no balano hdrico. J as tcnicas ex-situ podem modificar a caractersticas do solo de modo mais intenso. Neste s caso, o solo tratado pode ter diminuio das quantidades de matria orgnica, de nutrientes e da capacidade de troca catinica, com conseqente reduo de suas propriedades filtrantes, de tamponamento e de depurao (SEABRA, 2005). SKIPPER (1999) apud BENTO et al. (2005) menciona estratgias para um tratamento de biorremediao barato e natural que incluem uso de tecnologias como

18 atenuao natural, bioventilao, landfarming, compostagem, fitorremediao, alm de tcnicas auxiliares como bioaumento e bioestmulo, que sero discutidas com maior profundidade em um prximo item.

Atenuao natural monitorada

O termo atenuao natural parece ser o mais adequado para descrever todos os processos que ocorrem sem a interveno humana, sendo uma forma passiva de remediao (NYER,1998 apud ROSADO, 2005). SANCHEZ et al. (2000) apud

SARKAR et al. (2005) descreve a atenuao natural como uma sucesso de processos biolgicos, qumicos e fsicos que ocorrem naturalmente, resultando na conteno, transformao ou destruio de produtos qumicos indesejveis no ambiente.

Bioventilao

A bioventilao uma tcnica geralmente usada para remediar solos contaminados com hidrocarbonetos do petrleo, que aumenta a capacidade da microbiota do solo para degradar compostos naturais e xenobiticos. O ar injetado na zona no saturada do solo fornece, aos microorganismos aerbios, condies de transporte de oxignio adequadas, de forma que a degradao possa continuar de forma eficiente por perodos mais longos (STERREICHER-CUNHA et al., 2004).

19 Landfarming

Atualmente, uma das tcnicas preferidas para a remediao de solos contaminados por derramamento de combustveis o landfarming. Esta tcnica muito utilizada em locais remotos, porque o mtodo requer o uso reduzido de equipamentos, sendo a opo de mais baixo custo, principalmente se comparada incinerao. O termo landfarming, geralmente, refere-se a um processo em que o solo contaminado com hidrocarbonetos distribudo em uma camada de meio metro de espessura, com adio de nutriente, devendo ser periodicamente revolvido. Essa ltima etapa deve permitir a mistura dos resduos camada frtil do solo, a fim de que a prpria microbiota do solo atue como agente de degradao. A homogeneizao e a aragem do solo, geralmente, so realizadas por meio de tratores utilizados na agricultura (JORGENSEN et al., 2000), conforme mostra a Figura 4. Por outro lado, durante o tratamento, podem ser perdidos hidrocarbonetos por volatilizao, bem como pela ao da biorremediao e, assim, conclui-se que o landfarming recorre combinao dos dois processos (PAUDYN et al., 2008).

Figura 4. Construo do landfarming.

20 Compostagem

A compostagem uma ao biolgica de decomposio da matria orgnica presente em restos de origem animal ou vegetal. Ocorre por ao de agentes microbianos e, portanto, precisa de condies fsicas e qumicas adequadas para que o composto orgnico final seja de boa qualidade (PERES e NAUMOFF, 1998). A presente estratgia, diferente da tcnica de landfarming, requer a adio de material que favorea o aumento da porosidade e a transferncia de oxignio, bem como fornea, ao sistema, uma fonte de energia capaz de beneficiar um rpido crescimento microbiano. Os materiais, comumente, adicionados na compostagem so: palha, grama, folhas, bagao de cana, serragem ou esterco. Uma das caractersticas do processo que o calor, gerado metabolicamente, se mantm preso ao sistema, provocando o aumento de temperatura e mudanas na sua populao microbiana (POTTER et al., 1999; SEMPLE et al., 2001). O produto resultante da compostagem pode ser considerado como um enriquecedor do solo, ou seja, poder ser aplicado para melhorar as caractersticas do mesmo, sem que haja uma contaminao do meio ambiente (BRITO et al., 2003). importante salientar que a tcnica pode ser utilizada para a degradao de derivados de petrleo. Nesse caso, o processo denomina-se biopilha, sendo o produto final no necessariamente empregado na agricultura, a no ser no caso da comprovao da ausncia de toxidez do resduo. Na pesquisa de SEABRA (2005), o autor constatou que vivel a aplicao de biopilha, na biodegradao de petrleo de solos com altos teores de argila e silte, podendo eliminar os risco do leo residual, a curto e mdio prazo. No trabalho, o autor ainda menciona que o tratamento em biopilha tambm contribuiu para

21 recuperar a qualidade dos solos em termos de ecotoxicidade.

Fitorremediao

A fitorremediao utiliza sistemas vegetais (rvores, arbustos, plantas rasteiras e aquticas) e a sua microbiota com o fim de remover, degradar ou isolar substncias txicas do ambiente. O termo dissipao comumente usado para essa tecnologia, j que o desaparecimento de hidrocarbonetos policlicos aromticos (HPA) pode ser devido aos processos fsico-qumicos como volatilizao, foto-oxidao, soro e lixiviao (NORTHCOTT e JONES, 2000). A fitorremediao, como qualquer outra tecnologia, apresenta vrias vantagens e desvantagens. Se o baixo custo uma vantagem, o tempo para que se observem os resultados pode ser longo, pois depende do ciclo vital da planta. Alm disso, a concentrao do poluente e a presena de outras toxinas devem estar dentro dos limites de tolerncia da planta. Outra limitao que as plantas, usadas com o propsito de minimizar a poluio ambiental, podem entrar na cadeia alimentar e resultar em conseqncias indesejveis. Apesar dos problemas ainda no resolvidos, o mercado para a explorao dessa tecnologia promissor (PLETSCH, 1999).

2.3.2 TCNICAS AUXILIARES DE BIORREMEDIAO

2.3.2.1 BIOAUMENTO

O processo de bioaumento envolve a introduo de microorganismos que tm

22 sido cultivados para degradar vrias cadeias de hidrocarbonetos dentro de um sistema contaminado. As culturas podem ser derivadas de um solo contaminado ou obtidas de uma cultura estoque que tenha demonstrado, previamente, capacidade para degradar esses hidrocarbonetos (SARKAR et al., 2005). Para que a aplicao do bioaumento tenha sucesso, necessrio que os microorganismos selecionados apresentem algumas caractersticas, como: capacidade para degradar a maior parte dos contaminantes, estabilidade gentica, alto nvel de atividade enzimtica, alm da capacidade de competir com a populao intrnseca do solo. Deve ser lembrado que os agentes microbianos no podem ser patognicos e no devem produzir substncias txicas durante o processo de biodegradao (LEAHY & COLWELL, 1990). Sabe-se que os fungos so microorganismos produtores de um sistema enzimtico complexo, capazes de degradar substncias qumicas de estrutura complexa, de maneira a produzir molculas mais simples e mais facilmente assimilveis. Em funo desses mecanismos de degradao, a utilizao de fungos e enzimas, obtidas a partir desses microorganismos, uma alternativa biolgica vivel para a remediao de solos contaminados por petrleo (BRITO, 2004; LEMOS, 2001). Sendo assim, faz-se necessria uma discusso mais aprofundada sobre fisiologia dos fungos e utilizao desses microorganismos em processos de biorremediao, objeto do trabalho, abordado num item subseqente.

2.3.2.2 BIOESTMULO

O processo de bioestmulo uma das estratgias mais adotadas em tratamentos

23 de recuperao de reas impactadas. Esta tcnica consiste na correo das condies ambientais, tais como nutrientes (nitrognio, fsforo, potssio), oxignio e umidade para aumentar a atividade da populao microbiana existente nas reas contaminadas (ATLAS, 1981; LIN et al., 1999; PANKRANTZ, 2001 apud SARKAR et al., 2005). Os microorganismos podem ou no, inicialmente, ter como alvo os hidrocarbonetos como fonte de alimento. Contudo, os hidrocarbonetos so, supostamente, degradados mais rapidamente do que no processo de degradao natural, devido elevao da populao de microorganismos, causada pelo implemento dos nveis de nutrientes (SARKAR et al., 2005). A suplementao de nutrientes para a degradao de hidrocarbonetos tem sido, tradicionalmente, focada na adio de fontes de N e P, tanto orgnicas quanto inorgnicas. Devido ao fato do carbono ser o principal constituinte dos combustveis de petrleo, a sua dosagem tem sido considerada como um ndice para a determinao das quantidades de N e P que necessitam ser adicionadas para atingir a tima relao C:N:P (RISER-ROBERTS, 1998 apud SARKAR et al., 2005). Vrias fontes de nutrientes, tais como fertilizantes inorgnicos, uria, serragem, hmus, estrume e bioslidos tm sido usados no bioestmulo (CHO et al., 1997;; NAMKOONG et al., 2002 apud SARKAR et al., 2005). Segundo ANTUNES (1997), o extrato de levedura estimula o crescimento de diversos microorganismos, em virtude deste nutriente ser uma fonte de aminocidos e vitaminas, especialmente do complexo B. Porm, apesar da importncia do extrato de levedura como fonte de nitrognio e de outros nutrientes, seu custo elevado afetaria a viabilidade do processo. Para tal, torna-se indispensvel a procura por outras fontes de nitrognio para diminuir os custos de produo. As fontes inorgnicas seriam, neste caso, as mais recomendveis, uma vez que so as mais baratas e muito utilizadas nos

24 processos industriais. Tcnicas auxiliares de bioaumento e bioestmulo, em conjunto, so citadas em diversos trabalhos da literatura que empregam a biorremediao. TRINDADE e colaboradores (2005) relataram sobre amostras do solo (intemperizadas e recentemente contaminadas) que foram submetidas s tcnicas mencionadas acima, e que mostraram eficincia de biodegradao, aproximadamente, duas vezes maior do que aquelas sem tratamento, como a atenuao natural monitorada, por exemplo. Da mesma forma, HAMDI e colaboradores (2007) investigaram os efeitos do bioestmulo e/ou bioaumento na degradao dos HPAs, concluindo do estudo em microcosmo, que a degradao de HPAs foi favorecida em amostras de solos contaminados, carentes de correes. Alm disso, trabalhos que utilizam o bioaumento fngico, j mencionado, como estratgia para a acelerao da biodegradao de hidrocarbonetos tm tido cada vez de maior relevncia. A partir desse pressuposto, foram utilizadas duas fontes de nitrognio comerciais, empregadas como fertilizantes, para a correo das relaes nutricionais para a microbiota nativa do solo contaminado: a uria e a torta de mamona.

URIA

A uria fertilizante, produzida industrialmente, um slido que se apresenta na forma de grnulos brancos e utilizada na agricultura, pecuria e indstria. Geralmente, vendida pelos fabricantes a empresas misturadoras, que por sua vez, produzem compostos agrcolas para finalidades diversas, de acordo com a necessidade do solo. um subproduto do petrleo e destaca-se entre as fontes comerciais de nitrognio (N)

25 pela facilidade de acesso no mercado, menor custo por unidade de nitrognio, elevada solubilidade e compatibilidade para uso em mistura com outros fertilizantes. ressaltar que, toda a uria consumida no pas produzida nacionalmente. Alm disso, o composto que mais apresenta nitrognio em sua composio, percentualmente. A Tabela 1 mostra a porcentagem de nitrognio em massa presente na uria fertilizante Cabe

(http://sbrtv1.ibict.br/upload/sbrt5926.pdf?PHPSESSID=e3b8397659a63ceddd4a88291 601ea95).

TABELA 1. Fontes de Nitrognio.

Adubos qumicos Uria Sulfato de Amnio Nitrato de Clcio Nitrato de Amnio

Porcentagem de nitrognio em massa 45% 20% 33% 35,5% ( NH4 + e NO3 -)

(Fonte: Universidade Federal de Maring. Disponvel em: www.dzo.uem.br/disciplinas/Solos/nutrientes.doc>).

De acordo com a Associao Nacional para Difuso de Adubos ANDA, cerca de 60% do total do nitrognio comercializado est na forma de uria

(http://sbrtv1.ibict.br/upload/sbrt5926.pdf?PHPSESSID=e3b8397659a63ceddd4a88291 601ea95).

MAMONA

A cultura da mamona sempre foi considerada uma atividade de pequenos

26 produtores, especialmente na regio de clima s emi-rido do Brasil. Entretanto, aes do governo brasileiro para fomentar o desenvolvimento regional, priorizando, em princpio, a cultura da mamona como fonte potencial para o desenvolvimento do setor de biocombustveis, vem mudando esse panorama. Com o advento do biodiesel, a cultura da mamona teve um aumento na produo em todo pas, por ser considerada uma das espcies mais promissoras para produo de leo diesel vegetal (OLIVEIRA et al., 2006). O Brasil destaca-se como o terceiro produtor mundial de mamona tendo produzido, aproximadamente, 210 mil toneladas na safra 2004/2005. A produo concentra-se na regio Nordeste, destacando-se o Estado da Bahia como responsvel por cerca de 90% do volume total (LIMA et al., 2006). A mamoneira (Ricinus communis L.), pertencente famlia Euphorbiaceae, uma planta de origem tropical, resistente seca e exigente em calor e luminosidade (Figura 5). considerada uma oleaginosa de alto valor econmico em razo de suas inmeras possibilidades de aplicao na rea industrial. Esta oleaginosa, possivelmente originria da frica, segundo BELTRO (2004), est disseminada em quase todo o territrio brasileiro e cultivada, principalmente, na regio nordeste, cujas condies climticas so adequadas ao seu desenvolvimento. Tem uma baixa exigncia hdrica (400-600 mm/ano) e pode ser cultivada em ampla faixa de temperatura (20 34C) (MONTEIRO, 2007).

27

Figura 5. Plantao de mamona (Ricinus communis L.). Fonte: Wikipdia (2008)

O fruto da mamoneira apresenta aproveitamento integral, obtendo-se como produto principal o leo, estvel sob variadas condies de presso e temperatura, e como subproduto a torta, a qual pode ser utilizada como adubo orgnico (COSTA et al., 2004), conforme fluxograma da Figura 6.

Mamona em bagas

28

Pr-limpeza

Cozimento

Farinetas

Prensagem

Torta

leo Bruto

Expanso

Centrifugao

Extrao por solvente

leo degomado

leo Bruto

Farelo

Moagem Neutralizao Secagem

Torta de Mamona

Figura 6. Fluxograma do processamento das sementes de mamona para a produo do leo e do subproduto torta. Fonte: Embrapa Algodo (2005).

O processo de descascamento e extrao do leo de mamona produz dois importantes resduos: a casca do f uto e a torta, j comentada anteriormente. Para cada r tonelada de semente de mamona processada, so gerados 620 kg de casca e 530 kg de torta de mamona (SEVERINO, 2005 apud LIMA et al., 2006). Como a produo brasileira de mamona foi de 210 mil toneladas em 2005, estima-se que tenham sido

29 produzidas aproximadamente 130 mil toneladas de cascas e 111 mil toneladas de torta. Tradicionalmente, estes dois produtos tm sido utilizados como adubo orgnico, sendo a torta comercializada por conter alto teor de nitrognio, aproximadamente 5%, e as cascas apenas levadas de volta para dentro da lavoura ou aproveitada na prpria fazenda (LIMA et al., 2006).

2.4 EMPREGO

DE

FUNGOS

FILAMENTOSOS

NO

PROCESSO

DE

BIORREMEDIAO

2.4.1

FUNGOS FILAMENTOSOS

Os fungos esto amplamente distribudos na natureza, assim, eles so encontrados na gua, no ar atmosfrico, no solo, sobre os animais e vegetais vivos parasitando-os, na matria orgnica em decomposio, nos produtos alimentcios e produtos industriais (SILVEIRA, 1995). Constituem um conjunto de seres vivos que inclui desde organismos unicelulares a organismos pluricelulares macroscpicos. So formados por clulas eucariotas, com uma parede rgida, e se caracterizam por serem imveis, apresentarem nutrio heterotrfica por absoro e reproduo assexuada e sexuada (SILVEIRA, 1995). Os fungos unicelulares so microscpicos, possuem forma arredondada e se denominam leveduras. Porm, a maioria dos fungos pluricelular, formada por clulas cilndricas aumentadas, que se dispem linearmente para constituir grandes filamentos, que se denominam hifas. Ao conjunto de hifas d-se o nome de miclio. As hifas podem

30 apresentar separao entre as clulas espcies septadas ou no denominadas, ento, de espcies cenocticas. Normalmente, qualquer fragmento hiflico pode dar origem outra formao micelial quando destacado e colocado em meio apropriado (PUTZKE, 2004). Na vida livre ou nos cultivos, o miclio se diferencia em duas partes, a que penetra nos substratos nutritivos, denominada miclio vegetativo, e a que se dispe em superfcie e contm as estruturas reprodutoras, que constituem o miclio areo ou reprodutor (uab-gtip.uab.es/Apuntsmicro/hongos.pdf). Como biodegradadores naturais, os fungos encontram as substncias necessrias para o seu desenvolvimento na natureza, principalmente, macromolculas insolveis, que precisam ser primeiramente degradadas em unidades monomricas solveis antes de sua assimilao. Polissacardeos, protenas, cidos nuclicos, lignina, lipdios e outros compostos de grande peso molecular, ou insolveis, no podem ser incorporados diretamente sem antes terem sido reduzidos. Os fungos absorvem nutrientes atravs da membrana plasmtica, como compostos de baixo peso molecular dissolvidos em gua, o que j stifica essa necessidade. Para isso, esses organismos secretam enzimas especficas u para o meio exterior, conseguindo reduzir o tamanho das molculas e aumentar a sua solubilidade. Assim, essas substncias passam pela membrana, que tem grande poder seletivo para molculas pequenas, apesar de algumas enzimas, que fazem parte de sua composio, poderem incorporar, ativamente, determinados nutrientes por seleo. Desse modo, molculas simples tero preferncia na sua utilizao como nutrientes, sendo, ento, reprimida a sntese de enzimas para molculas mais complexas. Por exemplo, se houver glicose no meio, a qual preferida pelo fungo, no sero formadas as enzimas para degradar substratos complexos, como amido e celulose, nem enzimas

31 para degradar dissacardeos, como galactose, maltose e sacarose (PUTZKE, 2002). Tal como nas plantas, em geral, os fungos tambm necessitam de duas classes de nutrientes de acordo com a quantidade necessria em suas dietas: os macronutrientes (exigidos em quantidades por volta de 10-3 M) e os micronutrientes (requeridos em quantidades por volta de 10-6 M ou menos). Os macronutrientes so: carbono, hidrognio, oxignio, fsforo, potssio, nitrognio, enxofre e magnsio, dos quais o primeiro mais exigido, por ser um elemento estrutural, associado ao hidrognio, oxignio e nitrognio. Entre os micronutrientes, so citados: ferro, cobre, mangans, zinco e molibdnio (PUTZKE, 2002). A literatura descreve, em geral, a necessidade de incorporao de

macroelementos como requisito nutricional para o crescimento de fungos em laboratrio. Portanto, destacam-se, dentre os macronutrientes, os seguintes elementos:

CARBONO

amplamente utilizado por ser um dos componentes estruturais dos fungos, pois sabemos que os microorganismos apresentam 50% de carbono na sua massa celular. Dependendo do tipo de metabolismo, os microorganismos incorporam clula propores diferentes de substrato de carbono, o que para os anaerbicos de 10%, para os aerbios representa de 50 a 55% (ROITMAM et al., 1988). A glicose a fonte de

carbono mais amplamente utilizada, sendo os estudos realizados principalmente com esse ou outro carboidrato, como frutose, manose e galactose (PUTZKE, 2002).

32 NITROGNIO

O nitrognio encontrado no solo, em maior quantidade na forma de nitrato, sendo amplamente utilizvel por fungos, mas nem todas as espcies tm essa capacidade. Dentre as demais formas de nitrognio que podem ser encontradas no solo, somente a amnia tem ampla utilizao, apesar de ser txica. Mas isso facilmente contornvel em funo de ser encontrada na forma de seu on NH4 +, o que leva a um pH levemente bsico, que permite o crescimento dos fungos. Nitrito e hidroxilamina, apesar de serem txicos tambm, so empregados como fonte de N para por muitas espcies, tal como uria, aminocidos e outros compostos nitrogenados. Misturas de aminocidos parecem ser mais apropriadas, pois aceleram o crescimento em relao a culturas onde um nico componente adicionado (PUTZKE, 2002). Dentro desse contexto, PEREIRA e LEMOS (2003) estudaram o efeito das fontes de nitrognio na degradao de petrleo por A. versicolor, realizando um experimento que possibilitou a comparao de quatro diferentes fontes de nitrognio: extrato de levedura (EL), uria ((NH)2 CO), sulfato de amnio ((NH4 )2 SO4 ) e nitrato de sdio (NaNO3 ). O resultado mostrou que a maior eficincia de degradao foi alcanada quando se fez uso de EL (39,5%). O emprego de (NH)2 CO, (NH4 )2 SO4 e NaNO3 proporcionou um resultado decrescente em relao fonte anterior, com percentuais na ordem de 17,41 %; 6,8 % e 4,8 %, respectivamente. No trabalho de SANTOS (2007), foi avaliado o efeito da adio de duas fontes de nitrognio, uria e nitrato de sdio, em amostras contaminadas por petrleo e adicionadas de p da casca de coco verde, como material estruturante. O experimento, no qual o solo foi corrigido com uria, foi responsvel por uma remoo de carbono

33 66% maior do que a amostra controle. PUTZKE (2002) descreve as formas de utilizao das diferentes fontes de nitrognio por espcies de fungos, discutidas a seguir. A assimilao de nitrato (NO3 -) ou de nitrito (NO2 -) pelos microrganismos conduz reduo de ambas fontes de N a amnia, por meio de vias metablicas especficas. A reduo de nitrato a amnia envolve duas enzimas: nitrato redutase e nitrito redutase, como mostra a Reao 1 (WIAME et al., 1985; GRIFFIN, 1994). Experincias, com relao sntese dessas enzimas por Aspergillus nidulans, indicam que a sua formao controlada tanto pela induo por nitrato, como pela represso por amnia. Alm disso, admite-se a possibilidade de que nitrato redutase desempenhe um papel regulador autgeno que controla a sua prpria sntese e a de nitrito redutase (MARZLUF, 1981). O on nitrato pode ser incorporado ao meio de cultivo, utilizando-se nitrato de amnio, nitrato de potssio, nitrato de sdio e nitrato de clcio. Os passos da reduo que permitem ao fungo a utilizao do nitrato so apresentados, esquematicamente, na Reao 1, a seguir:

Nitrato redutase

Nitrito redutase

Nitrato (NO-3 ) Nitrito (NO-2 ) amnia+ H 2OReao 1.Reao de reduo do nitrato amnia realizado por fungos (PUTZKE, 2002)

Porm, muitos fungos no tm a capacidade de utilizar outra fonte de nitrognio, que no seja a amnia. O on amnia e o nitrognio orgnico apresentam o mesmo nvel de oxidao, dispensando a necessidade de produo das enzimas redutoras. A

34 utilizao preferencial da amnia, evidentemente, tambm representa um gasto energtico menor para o fungo (PUTZKE, 2002). As evidncias sugerem que os fungos assimilam amnia e a transformam em aminocidos, por meio das vias do glutamato e da glutamina. O grupamento -amino, da maioria dos aminocidos, proveniente do grupamento -amino do glutamato, obtido por transaminao. O glutamato sintetizado a partir do on amnio (NH4 +) e de -cetoglutarato, um intermedirio do ciclo do cido ctrico, graas ao da glutamato dehidrogenase. Por sua vez, a glutamina contribui com a sua cadeia lateral para a biossntese de variados compostos, e forma-se pela incorporao de ons amnio na molcula de glutamato, por ao da glutamina sintetase. Esta enzima considerada um elemento controle-chave no metabolismo intermedirio, devido regulao do fluxo metablico do nitrognio (SLAUGHTER, 1988). A outra forma assimilvel do nitrognio na forma orgnica. O nitrognio orgnico pode ser adicionado aos meios de cultura, por meio da utilizao de aminocidos, peptdios ou peptonas. Estes ltimos por hidrlise, resultam em aminocidos. Em geral, a maioria dos fungos utiliza nitrognio orgnico (PUTZKE, 2002). Sabe-se que, o extrato de levedura estimula o crescimento de diversos microrganismos, por ser uma fonte de aminocidos e vitaminas, especialmente do complexo B. Porm, apesar da importncia do extrato de levedura como fonte de N e de outros nutrientes, deve-se ter, tambm, um compromisso com a viabilidade econmica do processo em desenvolvimento, devido ao custo elevado do nutriente. Para tal, tornase indispensvel a procura por outras fontes de N, visando substituir o extrato de levedura e diminuir os custos de produo. As fontes inorgnicas seriam, neste caso, as

35 mais recomendveis, uma vez que so as mais baratas e muito utilizadas nos processos industriais (ANTUNES, 1997).

ENXOFRE Em culturas de fungos, normalmente utiliza-se o sulfato de magnsio como fonte de enxofre, no qual o on sulfato entra facilmente na clula, por transporte ativo. Muitos fungos podem reduzir o on enxofre e, ainda, oxidar enxofre puro ou formas reduzidas de enxofre a partir dos meios onde ocorram. A seqncia da reao mostrada na Reao 2:

2 S0 S2O3 S4O2 SO2 6 4Enxofre elementar Tiossulfato Tetrationato Sulfato

Reao 2. Oxidao do enxofre puro por fungos (PUTZKE, 2002)

FSFORO

O fsforo assimilado pelos fungos sob a forma de nion fosfato. Esse nion importante para o metabolismo da clula fngica por fazer parte da molcula de DNA, RNA, alm de fosfolipdios, NAD, FAD, coenzima A e de algumas vitaminas. Em meios de cultura, a incluso de fsforo feita com a adio de sais de fosfato inorgnico ao mesmo (PUTZKE, 2002). Geralmente, o teor de fsforo encontra-se em baixa concentrao nos ambientes contaminados por hidrocarbonetos de petrleo, onde as relaes carbono/nitrognio e

36 carbono/fsforo so elevadas e desfavorecem o crescimento microbiano (ATLAS, 1981). Cabe salientar, que a fonte de fsforo pode ser txica para os microrganismos envolvidos na biorremediao, e pode inviabilizar o referido processo, como comprovado para o cido metilfosfnico, que causa destruio da membrana celular devido sua natureza lipoflica (DELARCO, 1999).

POTSSIO

+ O potssio , geralmente, empregado em sua forma inorgnica K . importante

nos processos de transporte celular e na regulao do potencial osmtico da clula (PUTZKE, 2002).

MAGNSIO

O magnsio , da mesma forma que o potssio, empregado em sua forma inorgnica Mg+2 , tendo ao importante na estruturao da membrana celular (PUTZKE, 2002).

2.4.2

CULTIVO DOS FUNGOS FILAMENTOSOS

Os fungos crescem facilmente nos meios de cultivo convencionais dando lugar a colnias visveis macroscopicamente, com morfologia bem diferenciada para leveduras ou fungos filamentosos. A identificao das leveduras ocorre pelo estudo de suas

37 caractersticas metablicas, mas a identificao dos fungos filamentosos de baseia nas caractersticas morfolgicas (uab-gtip.uab.es/Apuntsmicro/hongos.pdf). H mais de

uma dcada, a tcnica de seqenciamento de DNA auxilia a identificao desses microorganismos em pases europeus e nos Estados Unidos. Porm, no Brasil, a tcnica de identificao por meio das caractersticas morfolgicas ainda amplamente aplicada. A adsoro de nutrientes pelos fungos auxiliada por enzimas secretadas no meio, que hidrolisam as molculas orgnicas em pores menores e, conseqentemente, podem ser transportadas mais facilmente para dentro da clula. Todos os fungos so heterotrficos e podem crescer no laboratrio em uma mistura simples, contendo uma fonte de carbono orgnico geralmente, um acar , uma fonte de nitrognio inorgnico ou orgnico e alguns minerais. Por outro lado, outros tm a capacidade de crescer em meios complexos, que contm uma variedade de compostos orgnicos, providos de peptona e de extrato de carne, bem como fontes complexas de carbono como celulose e hemicelulose (LEMOS, 2001).

Alm das fontes de carbono e nitrognio, um suporte slido, como o agar, permite aos fungos filamentosos o desenvolvimento do miclio areo - onde se localizam as estruturas reprodutoras - e o aumento do nmero de colnias, no caso das leveduras. O meio de cultivo mais utilizado para os fungos o meio glicosado de Saboraud, que possui uma concentrao maior de acar que o meio de cultivo para as bactrias (4%), e um pH de 5,6, caractersticas que dificultam o crescimento bacteriano (uab-gtip.uab.es/Apuntsmicro/hongos.pdf).

38 2.4.3 FUNGOS NO SOLO

Na biosfera, o habitat mais rico em fungos o solo. O solo um meio timo e favorvel vida dos fungos, pois a grande quantidade de detritos orgnicos animais e vegetais constitui uma fonte inesgotvel de alimentos para os mesmos (SILVEIRA, 1995; ROITMAN et al., 1991). No solo, estes organismos so encontrados desde a superfcie at uma profundidade que varia de 15 a 20 cm. Junto s bactrias constituem a maioria da microflora e, principalmente, nos solos cidos e ricos em matria orgnica chegam a sobrepujar estas ltimas (SILVEIRA, 1995). PUTZKE (2002) apresenta uma estimativa dos nmeros de microorganismos por grama de solo frtil: as unidades formadoras de colnias para fungos estariam numa faixa de 105 a 106 e para as bactrias de 108 a 109 . Em 1957, foram catalogados como fungos do solo 690 espcies, pertencentes a 170 gneros (GILMAN, 1957 apud ROITMAN et al., 1991). Desde esta data, muitas novas espcies fngicas foram isoladas do solo, sendo os gneros mais freqentemente encontrados: Mucor, Penicillium, Trichoderma e Aspergillus, seguidos por Rhizopus, Zygorhynchus, Fusarium, Cephalosporium e Verticillium (SILVEIRA, 1995;

ROITMAN et al., 1991).

2.4.4

APLICAO DE FUNGOS NA BIORREMEDIAO

Os fungos apresentam uma srie de caractersticas econmicas e ecolgicas que os transformaram em organismos indispensveis para todo e qualquer ecossistema. O

39 impacto da descoberta da penicilina, das substncias que evitam rejeio de rgos transplantados, das micotoxinas e de tantos outros produtos e subprodutos de origem fngica marcou a humanidade. A Figura 7 destaca a presena dos fungos em nossa vida cotidiana contribuio para a fabricao de pes, queijos e bebidas e na degradao e reciclagem de nutrientes (PUTZKE, 2002).

Figura 7. Principais benefcios proporcionados pelos fungos (PUTZKE, 2002).

As tecnologias de biorremediao contam, comumente, com a atividade das bactrias para descontaminar o ambiente. Entretanto, menos ateno tem sido dada a biorremediao de ambientes contaminados efetuada por fungos. Por outro lado, avaliaes de fungos, em escala de laboratrio, apresentam um potencial adequado para degradar hidrocarbonetos policclicos aromticos de alto peso molecular (HPAs) e

40 outros compostos e orgnicos outros. recalcitrantes, os por meio se de sistemas num enzimticos grupo de

extracelulares

Portanto,

fungos

constituem

microrganismos atrativos e promissores para a sua investigao como agentes degradadores (ATAGANA, 2006). Na ltima dcada, tm sido identificadas e caracterizadas diferentes espcies de bactrias e fungos filamentosos, utilizados nos processos de biorremediao. Os fungos so conhecidos pela sua diversidade e habilidade notvel para degradar materiais naturais complexos e persistentes, tais como lignina, quitina e celulose microcristalina. Portanto, algumas caractersticas dos fungos filamentosos, como a bioatividade e o crescimento morfolgico, os tornam potencialmente melhores degradadores do que as bactrias. Alm disso, os fungos so capazes de crescer sob condies ambientais de estresse como meios com baixos valores de pH, pobres em nutrientes e com baixa atividade de gua, favorecendo o seu desenvolvimento diante de outros

microorganismos (MOLLEA et al., 2005; DAVIS & WESTLAKE, 1978 apud ATAGANA, 2006). Na pesquisa de ARAJO e LEMOS (2002), foram realizados o isolamento e identificao de fungos filamentosos com capacidade de degradao do petrleo. A

partir de um solo contaminado com 5% m/m de petrleo, foram obtidas oitenta linhagens, das quais sessenta apresentaram capacidade para degradar hidrocarbonetos de petrleo. A identificao dos microrganismos as agrupou em 4 gneros fngicos (Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces e Fusarium) subdivididos nas seguintes espcies: Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Aspergillus niveus, Aspergillus niger, Penicillium corylophilum, Parcilomyces variotti,

Paecilomyces niveus e Fusarium sp.

41 ATLAS (1981) destacou onze gneros de fungos e seis gneros de bactrias responsveis pela oxidao de hidrocarbonetos em solo. Em outro estudo, realizado por DAVID & WESTLAKE apud ATLAS (1981), foram isoladas sessenta espcies de fungos, capazes de crescer em n -tetradecano, tolueno, naftaleno e sete tipos de leo cru. Os fungos encontrados com maior freqncia no solo foram aqueles que produziram pequenos condios, tais como Penicillium e Verticillium ssp. RAVELET et al. (2000) identificaram vrias espcies de fungos com capacidade para degradar pireno, um hidrocarboneto policclico aromtico que possui quatro anis aromticos. Os microrganismos isolados foram: Mucor racemosus, Mucor racemosus var. sphaerosporus, Gliocadium virens, Penicillium simplicissimum, Penicillium janthinellion, Phialophora alba, Phialophora hoffmannii, Trichoderma hazianum, Scopulariopsis brumptii e Coniothyrium fuckelii. MOLLEA et al. (2005) tambm utilizaram linhagens fngicas puras na otimizao da biodegradao de HPA. Os resultados apresentados nesse artigo mostraram que T. harzianum no foi capaz de biodegradar naftaleno, diretamente no microcosmo contendo solo, enquanto P. Chrysosporium, nas mesmas condies de teste, degradou o poluente at atingir uma concentrao residual de 150 mg/kg de solo, aps 80 dias, em condies corrigidas com nitrognio. Porm, no trabalho de BAHERI & MEYSAMI (2002), o bioaumento, com linhagens de fungo da podrido branca, no teve um efeito significativo na biorremediao do solo. Isso foi devido, segundo o prprio artigo, presena de linhagens naturais de fungos da podrido branca no solo e no material estruturante que continha a madeira. Porm, conhecido que os microorganismos podem no degradar o contaminante numa exposio inicial, mas faz-lo aps uma exposio duradoura. Essas adaptaes metablicas tm sido objeto de

42 estudo quanto aos mecanismos que as causam, dentre elas a de adaptao de enzimas de crescimento das populaes biodegradantes e mutaes genticas (BRITO, 2004). ATAGANA et al. (2006) avaliaram a capacidade de linhagens fngicas (Cladosporium, Fusarium, Penicillium, Aspergillus e Pleorotus), isoladas do solo contaminado com creosoto, na degradao de HPAs. O estudo foi realizado com bioestmulo, sob a forma de adio de nutrientes. Os pesquisadores apontaram Pleurotus, um fungo da podrido branca, como o microrganismo com maior potencial degradador. Embora todas as culturas puras tenham degradado ativamente o creosoto (mximo de remoo de 80%), a mistura de culturas fngicas foi mais efetiva, com remoo igual a 94,1% no tratamento do solo com adio de nutrientes. OLIVEIRA e LEMOS (2005) tambm analisaram o benefcio do tratamento exsitu de amostras contaminadas por petrleo, empregando, conjuntamente, o bioestmulo, com fontes de nitrognio, e o bioaumento, com Aspergillus versicolor. O tratamento proporcionou um aumento de 57,4% na atenuao de hidrocarbonetos do petrleo em relao amostra controle. BARROS et al. (2007) avaliaram o desempenho da associao de inoculo fngico e p de coco como material estruturante. Os autores relataram que, nas amostras sem inculo fngico, a evoluo de CO2 foi inferior, demonstrando a importncia dos fungos no processo. Dessa forma, o uso de microorganismos, especialmente fungos filamentosos, em processos de produo em grande escala altamente conveniente, principalmente em funo da dispensa de reagentes qumicos adicionais, da freqente auto-sustentabilidade do processo e da natureza pouco poluente dos processos biolgicos (BRITO et al., 2004).

43

2.5

ENSAIOS

DE

ECOTOXICIDADE

EM

PROCESSOS

DE

BIORREMEDIAO

Os testes de toxicidade so amplamente empregados para a avaliao dos efeitos adversos de agentes qumicos sobre a biota terrestre e aqutica e possibilitam a avaliao dos impactos de poluentes para organismos do solo e dos corpos receptores. Sendo assim, os testes de toxicidade podem ser realizados para avaliar o potencial de bioacumulao do contaminante podendo ser fornecendo uma informaes ferramenta de no toxicidade auxlio e do

biodisponibilidade,

importante

monitoramento de reas degradadas (RAMOS et al., 2007). Nos testes de ecotoxicidade, so utilizados organismos-teste terrestres, de guas continentais, estuarinas e marinhas que ficam expostos aos contaminantes sob condies controladas (CETESB, 2005). A toxicologia o estudo dos efeitos nocivos dos agentes qumicos ou fsicos sobre os organismos vivos, tendo como objetivo principal estabelecer o uso seguro dos agentes qumicos. As substncias qumicas de interesse incluem tanto os produtos qumicos sintticos, quanto aqueles que existem naturalmente no ambiente. Na toxicologia, os efeitos so determinados, em geral, pela injeo ou administrao oral de substncias de interesse em animais, observando-se como a sade desses afetada, por meio da relao dose-resposta (BAIRD, 2002). Estes estudos tm possibilitado o estabelecimento de limites permissveis de vrias substncias qumicas e na avaliao dos impactos de poluentes para organismos do solo e dos corpos receptores, j que analtica e economicamente invivel identificar

44 todas as substncias txicas em compartimentos ambientais e criar padres para cada uma delas (CETESB, 2005). Normalmente, tais estudos envolvem testes de toxicidade simples, realizados em curto espao de tempo. Entretanto, de acordo com a complexidade do estudo, testes de longa durao tambm podem ser realizados (RAMOS et al.). Porm, segundo SISINNO et al. (2006), os testes de ecotoxicidade so, geralmente, desenvolvidos para determinar a toxicidade de substncias adicionadas a um solo artificial, a fim de que vrios interferentes sejam eliminados. O grande desafio na adaptao desses mtodos para a complementao da avaliao de reas contaminadas a substituio do substrato artificial pelas amostras de solos trazidas dessas reas, a avaliao dos possveis interferentes nos resultados, bem como a escolha dos organismos-teste para amostras com determinadas caractersticas (SISINNO et al., 2006). A partir desse pressuposto, os autores realizaram ensaios de toxicidade com minhocas em amostras como naturais provenientes no de reas de contaminadas avaliao de por reas

hidrocarbonetos, contaminadas.

complementao

processo

DORN et al. (1998) tambm avaliaram a qualidade do solo, resultante de um derramamento de leo aps o processo de remediao, pela anlise da toxicidade de organismos do solo. Para aumentar o entendimento da qualidade do solo resultante de um processo de remedio, os autores utilizaram trs mtodos para testes de toxicidade, dentre eles, o ensaio de letalidade de 14 dias para as minhocas. DORN e SALANITRO (2000) ressaltam que poucos dados existem para efeitos especficos de contaminao de hidrocarbonetos para tipos de solo, tipos de leo e outros produtos qumicos presentes em solos. A maioria dos dados sobre os efeitos dos

45 hidrocarbonetos derivada das informaes sobre ambientes aquticos, sendo estes extrapolados para solos. Isso ressalta a importncia da realizao de testes de ecotoxicidade para solos contaminados, antes e aps o processo de biorremediao. No nosso estudo, porm, o objetivo maior era avaliar a toxicidade do petrleo, nas concentraes empregadas e, principalmente, a das fontes de nitrognio sobre o sistema contaminado, sem necessariamente, avaliar a qualidade das amostras de solo aps o tratamento biolgico.

46

CAPTULO 3: Materiais e Mtodos

47 3.1 SOLO

O solo utilizado neste trabalho, do tipo franco-arenoso, proveniente de um campo de explorao e produo de petrleo em terra, localizada em Carmpolis, municpio do Sergipe. O material em questo foi gentilmente cedido pela Petrobrs e a coleta foi executada por equipe da prpria empresa a fim de garantir a representatividade do sistema. Aps a chegada do solo no Centro de Tecnologia Mineral (CETEM/MCT), em dezembro de 2005, foi realizado o procedimento de secagem a temperatura ambiente durante, aproximadamente, trs dias. Posteriormente, o material foi peneirado em uma peneira de malha de 10 mesh (1,68 mm), homogeneizado e quarteado em 1,5 kg. Em seguida, o solo foi estocado em cmara fria a 4C at a sua utilizao nos experimentos. As Figuras 8 e 9 mostram o solo aps homogeneizao e quarteamento, respectivamente, nas dependncias do CETEM.

Figura 8. Homogeneizao do solo.

48

Figura 9. Quarteamento do solo.

3.1.1

CARACTERIZAO PARCIAL DO SOLO

As caractersticas qumicas do solo, proveniente de Sergipe, foram determinadas por meio de anlises de fertilidade e teor total de nitrognio, no Departamento de Solos (LABFER) da UFRRJ. A rotina de fertilidade do solo e a anlise fsica foram realizadas de acordo com as metodologias descritas no Manual de Mtodos de Anlise de Solos (EMBRAPA, 1997). O teor de nitrognio total foi executado conforme metodologia descrita por TEDESCO et al. (1995). A determinao da capacidade de reteno de gua (CRA) no solo foi realizada conforme adaptao do procedimento descrito em ALEF e NANNIPIERI (1995).

49 3.2 PETRLEO

O petrleo, utilizado nos trabalhos experimentais, proveniente do mesmo campo de explorao e produo de petrleo em terra, do qual o solo tambm originado. A contaminao intencional do solo foi realizada nas dependncias do CETEM. Para isso, o solo foi retirado da cmara fria (4C) e exposto temperatura ambiente, do laboratrio (24C) para secagem durante sete dias. A contaminao foi feita adicionando-se 5% m/m de leo cru ao solo seco. Somente na terceira etapa experimental, foi acrescentado 1% m/m de petrleo ao solo seco. Isso se deve ao fato da utilizao de dois nveis de concentrao do poluente 1 e 5% na terceira etapa do trabalho. Trs dias aps a contaminao, o sistema (solo+leo) foi empregado nos testes de biodegradao. Esse perodo foi destinado para evaporao dos compostos volteis presentes no petrleo. A determinao da capacidade de reteno de gua (CRA) no solo contaminado para ambos os nveis de contaminao empregados foi realizada conforme adaptao do procedimento descrito em ALEF e NANNIPIERI (1995).

3.3

FONTES DE NITROGNIO

As rotinas de fertilidade e a anlise de teores totais de nitrognio, fsforo e potssio para as amostras comerciais de uria e mamona foram realizadas pelo Departamento de Solos (LABFER) da UFRRJ, de acordo com as metodologias descritas em 3.1.1.

50 3.4 INCULO

O preparo do inculo predominante fngico foi realizado pela extrao da microbiota nativa presente no solo, e seu posterior cultivo, com inteno de propagar a biomassa. Para isso, foi utilizada soluo salina 0,9% m/v (45 mL) com 0,1g de cloranfenicol por litro de soluo, ajustada em pH 4. Tanto o antibitico, como o ajuste de pH, serviram para inibir o aparecimento excessivo das bactrias. Foi acrescentado 5g de solo virgem soluo e a suspenso foi agitada em shaker a 150rpm e 30C por 1h e, em seguida, deixada em repouso por 24h. Retirou-se 5 mL de inculo dessa suspenso e adicionou-se em 200mL de caldo Saboraud meio de cultivo especfico para fungos filamentosos contendo 0,1g de cloranfenicol por litro de soluo. O frasco foi agitado por 48h, de acordo com as condies mencionadas anteriormente, e a seguir, a suspenso contendo a biomassa foi adicionada aos sistemas na proporo de 50% do volume utilizado para umedecer as amostras de solo, nos dois momentos distintos, determinados na primeira etapa.

3.5

TESTES DE BIODEGRADAO

Os ensaios de biodegradao foram conduzidos usando solo contaminado com 5% e 1% m/m de petrleo sendo a ltima concentrao aplicada somente na terceira etapa experimental. O presente trabalho experimental foi conduzido em quatro etapas, tendo como meta definir as estratgias mais efetivas para a degradao do leo cru. A primeira etapa do trabalho, considerada como ensaio preliminar, foi realizada em biorreatores estticos (bandejas), durante um perodo de 10 semanas. O objetivo foi

51 avaliar o comportamento microbiano no solo contaminado, durante o processo de atenuao natural, para determinao do momento de decrscimo da populao de heterotrficos totais a fim de se realizar, a seguir, uma inoculao fngica no solo contaminado. Alm disso, tambm foi realizado um estudo das CRAs mais promissoras para os testes da prxima fase. A segunda etapa foi desenvolvida em microcosmos, durante 44 dias, aproximadamente. Nosso alvo era definir as melhores condies de cultivo a serem adotadas no solo contaminado com leo cru para a etapa seguinte. Assim, alguns fatores limitantes ao processo de biodegradao foram avaliados, como: a adio de fontes de nitrognio e as relaes nutricionais adequadas, bem como a capacidade de reteno de gua (CRA) mais favorvel para a propagao da microbiota nativa. Na terceira etapa, as melhores condies determinadas nos testes em microcosmos foram aplicadas em ensaios de biorremediao utilizando os biorreatores estticos, novamente, durante 8 semanas. Dando seqncia aos experimentos, foi realizado um bioaumento predominantemente fngico, em dois diferentes momentos: na primeira semana e na semana determinada na etapa preliminar. A quarta etapa teve como objetivo comparar o impacto toxicolgico do emprego das fontes de nitrognio, empregadas na segunda e terceira etapas do trabalho, sobre organismos do solo, no nosso caso, as minhocas. A seguir, sero narrados, de forma detalhada, os ensaios realizados em cada uma das etapas supracitadas, assim como as metodologias analticas de monitoramento incorporadas.

52 3.5.1 PRIMEIRA ETAPA: ENSAIO PRELIMINAR

Foi realizado o monitoramento microbiolgico do processo de atenuao natural por meio da quantificao de fungos e dos heterotrficos totais, presentes no solo contaminado com 5% m/m de petrleo, durante um perodo de dez semanas. Nesta etapa, foi feito exclusivamente o controle da umidade do solo, por diferena de peso. O objetivo foi identificar o momento no qual ocorreu a diminuio da populao de heterotrficos totais e crescimento da populao fngica no solo contaminado, utilizando tcnicas microbiolgicas convencionais, alm de definir a(s) CRA(s) mais favorvel(is) para o crescimento dos fungos filamentosos em solo contaminado. O experimento foi realizado em biorreatores estticos de bancada (Figura 10), que consistiam de trs bandejas de polietileno de aproximadamente 7,0 L de capacidade total, nos quais foram dispostos 1000g de solo nordestino contaminado e

homogeneizado. As amostras de solo foram submetidas intemprie, contabilizando trs dias, at a adio de gua para atingir 50, 75 e 90% de capacidade de reteno de gua (CRA), respectivamente. Os biorreatores estticos foram acondicionados no interior do laboratrio climatizado, sendo a temperatura mdia de 24C.

Figura 10. Biorre