Neuroprotección por 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol

y Ácidos grasos poliinsaturados-omega-3

en modelos in vitro e in vivo

BERTA LUZÓN TORO

Tesis Doctoral

Mayo 2005

Neuroprotección por 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol

y Ácidos grasos poliinsaturados-omega-3

en modelos in vitro e in vivo

Memoria presentada por la licenciada Berta

Luzón Toro para optar al grado de Doctora

en Biología.

Granada, Mayo 2005

Berta Luzón Toro

Esta Tesis Doctoral ha sido realizada en la empresa Puleva

Biotech, S.A. y en la Universidad de Granada, en colaboración

con la Universidad de Saarland (Alemania), bajo la dirección del

Doctor Arjan Geerlings.

Arjan Geerlings

Doctor en Ciencias Químicas

Puleva Biotech,S.A.

Departamento de Biomedicina. Puleva Biotech S.A.(Granada)

Departamento de Bioquímica y BªMolecular. Universidad de Granada

Deparmento de Neurobiología. Universidad de Saarland (Homburg-Saar, Alemania)

“No puedo cambiar la dirección del viento, pero

puedo ajustar mis velas para alcanzar siempre

mi destino”

(Jimmy Dean).

A mis padres y a mis hermanas.

Abreviaturas

4 Desaturasa= Delta4 Desaturasa

5-HT= Serotonina

7-DHC= 7-dehidrocolesterol

AA= Ácido araquidónico

AAL= Ácido -linolénico

Abs=Absorbancia

ABTS= Ácido sulfónico 2,2'-Azino-di-(3-Etilbenzotiazolina)

Ac= Acetilcolina

AcN= Acetonitrilo

ACTH= Hormona Adrenocorticotrópica

ADH= Ácido docosahexaenoico

Ag/AgCl= Plata/cloruro de plata

AGEs= Ácidos grasos esenciales

AGPIs= Ácidos grasos poliinsaturados

AK= Ácido kaínico

AL= Ácido linoleico

AMPA= Receptor ionotrópico de Glutamato

ApoE= Apoliproteína E

ASTM =Asociación Americana de Prueba de Materiales

AT= Ácido tiobarbitúrico

A = Pétido beta amiloide

BHE= Barrera hematoencefálica

BHT= 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol

BSTFA= N,N-Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida

CA = regiones del hipocampo denominadas Cornu Ammonis

CAT= Catalasa

CG-MS= Gases masas

Ci/mmol= Cantidad total de radioactividad por milimol (actividad

específica de compuestos marcados radioactivamente por unidad de masa)

Col= Colesterol

COMT= Catecol-O-metiltransfesasa

Contr= Control

COX= Ciclooxigenasa

Abreviaturas

CRH= Hormona liberadora de corticotropina

C-terminal= Carboxilo terminal

Cu= Cobre

DA=Dopamina

DAB= Diaminobenzidina

DHPA= Dihidroxipropiladenina

DMSO= Dimetil sulfóxido

DOPAC= Ácido 3,4-dihidroxifenilacético

DOPAL= 3,4-dihidroxifenilacetaldehído

DOPET= 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol

DPA= Ácido Docosapentaenoico

DTT= Ditiotreitol

EA= Enfermedad de Alzheimer

EAE= Encefalitis autoinmune experimental

EAF= Forma familial de la Enfermedad de Alzheimer

EDTA= Ácido etilén diamino tetraacético

EGTA= Ácido N,N,N',N'-tetraacético etilenglicol-bis (2-aminoetileter)

ELISA= Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas

ELO= Elongasa

EM= Esclerosis Múltiple

eNO= Óxido nítrico endotelial

ENU= Etil nitrosa urea

EP= Enfermedad de Parkinson

EPA= Ácido eicosapentaenoico

EROs= Especies reactivas de oxígeno

FCS= Suero bovino fetal

FCN= Factor de crecimiento nervioso

Fen= Fenilalanina

g= Medida de centrifugación

g= Gramos

GSD= Glutatión superóxido dismutasa

He= Hembra(s)

h= Horas

Abreviaturas

H2O2= Peróxido de hidrógeno

HCl= Ácido clorhídrico

HLA= Antígeno humano de histocompatibilidad

HMG-CoA reductasa= 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A

reductasa

HPLC= Cromatógrafo líquido de alta resolución

HVA= Ácido 4-hidroxi-3-metoxifenilacético

IC50= Dosis inhibitoria de crecimiento 50.

IL= Interleukina

Ile= Isoleucina

kDa= Kilodalton

kg= Kilogramos

KH2PO4= Fosfato dipotásico

KHPO4= Fosfato monopotásico

KOH= Hidróxido potásico

L= Litro(s)

LAD= Lipoproteínas de alta densidad

LAM= Laberinto acuático de Morris

LBD= Lipoproteína de baja densidad

LBD= Lipoproteínas de baja densidad

LC5D= Latosterol C5-desaturasa

LCR= Líquido cefalorraquideo

Leu= Leucina

Lis= Lisina

LMBD= Lipoproteínas de muy baja densidad

m/z= Masa/carga

M= Molar

Ma= Macho (s)

mA= Miliamperios

MAO (A y B) = Monoamino oxidasa ( variantes A y B)

MDA= Malondialdehido

Me2SO= Dimetil sulfóxido

MeOH= Metanol

Abreviaturas

Met= Metionina

mg/kg= Miligramos/kilogramo

mg= Miligramos

min= Minutos

mJ= Megajulio

mL= Mililitro

mm= Milímetro

mM= Milimolar

mmin= Medición mínima

MOPAL= 4-hidroxi-3-metoxifenilacetaldehído

MOPET= 4-hidroxi-3-metoxifeniletanol

n= Tamaño de muestra

Na2HPO4= Fosfato disódico

NADH= Nicotinamin adenin dinucleótido

NaH2PO4= Fosfato monosódico

NE= Norepinefrina

ng= Nanogramos

nm= Nanometros

nM= Nanomolar

NMDA= N-metil-D-aspartato

Om-3= Omega-3

Om-6= Omega-6

ON=Ovillos neurofibrilares

Pb= Pares de bases

PBS= Tampón fosfato salino

PCR= Reacción en cadena de la ADN polimerasa

PMSF= Fenil metil sulfonil fluoruro

PN= Placas neuríticas

PPA= Proteína precursora del amiloide

PS= Presenilinas

PS1= Presenilina 1

PS2= Presenilina 2

Psi= Unidad de medida de presión

Abreviaturas

PSS= Solución salina fisiológica

P-tau= proteína tau-hiperfosforilada

RE= Retículo endoplasmático

r.p.m.= Revoluciones por minuto

S105= Sobrenadante obtenido tras centrifugar a 105.000 x g

SBF= Suero bovino fetal

SDS= Dodecil sulfato sódico

SIM= Método de análisis por CG-MS (Selected Ion Monitoring).

SNC= Sistema nervioso central

SOD= Superóxido dismutasa

SRAT= Sustancias reactivas de ácido tiobarbitúrico

T= Tiempo

TBE= Tris borato EDTA

TBS-T= Tris buffer salino Tween-20

Th1= Linfocitos colaboradores-1

TNF- = Factor de necrosis tumoral alfa

Tris= Tris (hidroximetil)-amino metano

U/mL= Unidades de enzima por mililitro

UV= Ultravioleta

Val= Valina

Wt= Salvaje

YAC= ratón transgénico portador de cromosomas artificiales de levadura

Zn= Cinc

-PPA= Proteína precursora del amiloide-alfa

-secretasa= Alfa-secretasa

-PPA= Proteína precursora del amiloide-beta

-secretasa= Beta-secretasa

-secretasa= Gamma-secretasa

µg= Microgramo

µJ =Microjulio

µL= Microlitro

µm= Micras

µM= Micromolar

Índice

RESÚMEN 10

SUMMARY 32

I. INTRODUCCIÓN. 53

I.1. Neurodegeneración. 53

I.1.1. Concepto. 53

I.1.2. Estrés oxidativo. 53

I.1.3. Marcadores de estrés oxidativo. 55

I.1.3.1. Malondialdehido (MDA). 55

I.1.3.2. Sustancias reactivas con ácido tiobarbitúrico (SRAT). 56

I.1.4. Modelo animal de estrés oxidativo: Ácido Kaínico. 56

I.1.5. Neuroinflamación. 58

I.2. Enfermedades neurodegenerativas. 60

I.2.1. Concepto. 60

I.2.2. Enfermedad de Alzheimer (EA). 61

I.2.2.1. Origen de la EA. 61

I.2.2.2. Incidencia de la EA. 62

I.2.2.3. Neuropatofisiología de la EA. 63

I.2.2.4. Cambios estructurales en la EA. 64

I.2.2.4.1. Placas neuríticas (PN). 65

I.2.2.4.2. Ovillos neurofibrilares (ON). 66

I.2.2.5. Estrés oxidativo en la EA. 67

I.2.2.6. Genética de la EA. 69

I.2.2.6.1. Proteína precursora del amiloide (PPA). 71

I.2.2.6.1.1. Rutas de procesado de PPA. 73

I.2.2.6.1.2. Efectos neurobiológicos de los metabolitos de PPA. 75

I.2.2.7. Presenilinas (PS). 76

I.2.2.8. Modelos animales de la EA. 79

I.2.2.8.1. Transgénicos de PPA. 80

I.2.2.8.2. Transgénicos de PS. 81

I.2.2.9. Laberinto acuático de Morris (LAM). 81

I.2.3. Enfermedad de Parkinson (EP). 83

I.2.3.1. Origen de la EP. 83

Índice

I.2.3.2. Incidencia de la EP. 83

I.2.3.3. Neuropatofisiología de la EP. 83

I.2.3.4. Dopamina y la EP. 86

I.2.3.5. Mecanismo de neurodegeneración en la EP. 87

I.2.3.6. Actividades enzimáticas implicadas en la EP: Monoamino

oxidasa (MAO). 88

I.2.4. Esclerosis múltiple (EM). 89

I.2.4.1. Origen de la EM. 89

I.2.4.2. Incidencia de la EM. 89

I.2.4.3. Neuropatofisiología de la EM. 90

I.2.4.3.1. Fase inflamatoria y fase neurodegenerativa de la EM. 91

I.2.4.4. Genética de la EM. 92

I.2.4.5. Modelos animales de la EM. 93

I.3. Terapias. 94

I.3.1. Farmacología. 94

I.3.1.1. Aplicada a la EA. 94

I.3.1.1.1. Inhibidores de la Acetilcolinesterasa. 94

I.3.1.1.2. Drogas anti-A . 95

I.3.1.1.3. Agentes anti-inflamatorios. 96

I.3.1.1.4. Terapia hormonal sustitutoria. 96

I.3.1.1.5. Estatinas. 96

I.3.1.1.6. Neurotransmisores: Acetilcolina (Ac). 97

I.3.1.1.7. Moduladores del receptor NMDA. 98

I.3.1.2. Aplicada a la EP. 99

I.3.1.3. Aplicada a la EM. 99

I.3.2. Dieta. 100

I.3.2.1. Antioxidantes. 100

I.3.2.1.1. Búsqueda de antioxidantes. 100

I.3.2.1.1.1. Aceite de oliva: DOPET. 101

I.3.2.1.1.1.1. Actividades biológicas de DOPET. 104

I.3.2.1.1.1.2. Metabolismo de DOPET. 105

I.3.2.1.1.1.3. Relación de DOPET con catecolaminas. 107

Índice

I.3.2.1.2. Colesterol. 108

I.3.2.1.2.1. Metabolismo del colesterol:

Latosterol C5-desaturasa. 108

I.3.2.1.2.2. Colesterol y la EA. 110

I.3.2.1.2.3. Colesterol y la EM. 114

I.3.2.1.3. Ácidos grasos poliinsaturados (AGPIs). 114

I.3.2.1.3.1. Clasificación de los ácidos grasos de la dieta. 115

I.3.2.1.3.2. Funciones fisiológicas de AGPIs. 116

I.3.2.1.3.3. Metabolismo de los AGPIs. 117

I.3.2.1.3.4. AGPIs y colesterol. 119

I.3.2.1.3.5. Ácido docosahexaenoico (ADH). 122

I.3.2.1.3.6. AGPIs y la EA. 124

II. OBJETIVOS. 130

III. MATERIALES Y MÉTODOS. 133

III.1. MATERIAL. 133

III.1.1. Modelos animales experimentales. 133

III.1.2. Modelos celulares experimentales. 135

III.1.3. Dietas experimentales. 135

III.2. MÉTODOS. 137

III.2.1. Técnicas. 137

III.2.1.1. Sacrificio de los animales. 137

III.2.1.2. Extracción de ADN. 137

III.2.1.3. PCR. 138

III.2.1.4. Lisados de proteínas. 139

III.2.1.5. Western Blot. 139

III.2.1.6. ELISA A 40 y A 42. 140

III.2.1.7. Determinación de ácidos grasos en cerebro y plasma de

ratón. 141

III.2.1.8. Determinación de colesterol total en plasma y cerebro.

142

Índice

III.2.1.9. Disección y parafinación del cerebro de ratón. 143

III.2.1.10. Preparación de las secciones de tejido e inmunotinción

con el kit ABC-Vectastain. 144

III.2.1.11. Screening de compuestos naturales con capacidad

antioxidante. 145

III.2.1.12. Biodisponibilidad de DOPET. 147

III.2.1.12.1. Determinación de DOPET por HPLC-ABTS. 147

III.2.1.12.2. Cuantificación de DOPET por HPLC. 148

III.2.1.12.3. Determinación de DOPET por CG-MS. 149

III.2.2. Obtención de DOPET por síntesis química. 153

III.2.3. Estudios de neuroprotección. 153

III.2.3.1. Cultivo celular. 153

A) Para la medida de citotoxicidad. 153

B) Para el ensayo COMET. 154

C) Para el efecto de DOPET sobre la captación de dopamina y

norepinefrina in vitro. 155

III.2.3.2. Aislamiento de mitocondrias hepáticas. 156

III.2.4. Microarrays en ratones sondados con DOPET. 157

III.2.5. Estudios de antioxidación. 158

III.2.5.1. Detección de MDA en cerebro. 158

III.2.5.2. Detección de MDA en plasma. 158

III.2.5.3. Cuantificación de la actividad catalasa en cerebro de

conejo. 164

III.2.5.4. Modelo de ácido kaínico:

Laberinto acuático de Morris. 165

III.2.6. Estudios de estabilidad de DOPET en agua. 166

III.2.7. Estudios del metabolismo del colesterol. 168

III.2.7.1. Determinación de actividad Latosterol-C5-Desaturasa por

HPLC. 168

III.2.7.2. Efecto de diferentes dietas en el metabolismo del

colesterol de conejos. 172

Índice

III.2.7.3. Determinación de la concentración de colesterol en

cerebro y plasma. 173

III.2.7.4. Concentración de latosterol en cerebro por CG-MS. 174

IV. RESULTADOS. 178

IV.1. Estudios en modelos animales de la EA. 178

IV.1.1. Estudios con dietas enriquecidas en AGPIs omega-3 en

modelo transgénico simple PPA de la EA. 178

IV.1.1.1. Determinación de ácidos grasos en cerebro y plasma. 178

IV.1.1.2. Determinación de colesterol total en cerebro y plasma.184

IV.1.1.3. ELISA A 40. 186

IV.1.1.4. Correlación entre colesterol en y A 40. 189

IV.1.2. Estudios en ratones mutantes KOZACK-colesterol 16. 191

IV.1.2.1. Determinación de la concentración de colesterol en

suero. 191

IV.1.2.2. Inmunotinción de secciones de tejido embebidas en

parafina. 194

IV.1.2.3. ELISA A 40 y 42. 196

IV.1.3. Estudios en modelo de ratón transgénico doble PPA/PS1 de

la EA. 199

IV.1.3.1. Inmunotinción de secciones de tejido embebidas en

parafina. 199

IV.1.3.2. ELISA A 40 y 42. 201

IV.1.3.3. Determinación de la concentración de colesterol en

plasma. 203

IV.2. Estudios con DOPET. 206

IV.2.1. Screening de compuestos naturales con capacidad

antioxidante y potencial neuroprotector. 206

IV.2.2. Biodisponibilidad de DOPET. 207

IV.2.2.1. Determinación de DOPET por HPLC-ABTS. 207

IV.2.2.2. Determinación de DOPET por CG-MS. 208

IV.2.3. Estudios de antioxidación. 210

Índice

IV.2.3.1. Detección de malondialdehido (MDA). 210

IV.2.3.1.1. MDA en cerebro de rata. 210

IV.2.3.1.2. MDA en plasma de ratón. 211

IV.2.3.1.3. Cuantificación de la actividad catalasa en cerebro de

conejo. 214

IV.2.4. Estudios de neuroprotección. 216

IV.2.4.1. Medida de citotoxicidad de DOPET. 216

IV.2.4.2. Ensayo COMET. 222

IV.2.4.3. Modelo de excitotoxicidad con ácido kaínico: laberinto

acuático de Morris. 223

IV.2.5. Microarrays en ratones sondados con DOPET. 225

IV.2.6. Efecto de DOPET en un modelo animal de Esclerosis

Múltiple (EM). 230

IV.2.7. Estudios del metabolismo del colesterol. 235

IV.2.7.1. IC50 de DOPET para la actividad enzimática Latosterol-C5

desaturasa. 235

IV.2.7.2. Efecto de diferentes dietas en el metabolismo del

colesterol de conejos. 239

IV.2.8. Efecto de DOPET sobre la captación de dopamina y

norepinefrina in vitro. 245

IV.2.8.1. IC50 de DOPET para la actividad Monoamino oxidasa

(MAO) en mitocondrias aisladas de hígado y cerebro de rata. 252

V. DISCUSIÓN. 255

V.1. Estudios en modelos animales de la EA. 257

V.1.1. Estudios con dietas enriquecidas en AGPIs omega-3 en

modelo transgénico simple PPA de la EA. 257

V.1.2. Estudios en ratones mutantes KOZACK-colesterol 16. 259

V.1.3. Estudios en modelo de ratón transgénico doble PPA/PS1 de la

EA. 260

V.2. Estudios con DOPET. 264

V.2.1. Estudios de antioxidación. 265

V.2.2. Estudios de neuroprotección. 266

Índice

V.2.2.1. Modelo de excitotoxicidad con ácido kaínico: laberinto

acuático de Morris. 267

V.2.3. Microarrays en ratones sondados con DOPET. 268

V.2.4. Efecto de DOPET en un modelo animal de Esclerosis Múltiple

(EM). 269

V.2.5. Estudios del metabolismo del colesterol. 271

V.2.5.1. Estudios sobre LC5D. 272

V.2.5.2. Efecto de diferentes dietas en el metabolismo del colesterol

de conejos. 273

V.2.6. Efecto de DOPET sobre la captación de dopamina y

norepinefrina in vitro. 274

VI. CONCLUSIONES. 280

VII. PROYECTOS DE FUTURO. 285

VIII. BIBLIOGRAFÍA. 288

RESÚMEN

Resúmen10

La enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP) y la

esclerosis múltiple (EM) son procesos neurodegenerativos de origen

multifactorial, que cursan con reacciones inflamatorias, neurotoxicidad

glutamatérgica, incremento en los niveles de hierro y óxido nítrico, eliminación

de los antioxidantes endógenos, reducción de los factores tróficos y pérdida de

neuronas, entre otros eventos. Constituyen algunas de las patologías que mayor

coste económico suponen para la sociedad actual.

El que un proceso neurodegenerativo sea un mecanismo multifactorial, podría

explicar porqué el limitado número de terapias clínicas neuroprotectoras que

utilizan drogas simples, no consiguen generar resultados significativos. Por

tanto uno de los principales objetivos en neurodegeneración y neuroprotección

es la determinación de cuáles de estos factores constituyen los causantes

primarios, la secuencia en la que tienen lugar y si actúan en concurrencia con los

procesos patogénicos.

Los mecanismos neuroprotectores pueden ser afrontados desde modificaciones

dietarias, que es el fundamento de la presente Memoria, basada en la aplicación

de los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 (AGPIs omega-3) y de un

compuesto polifenólico, 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol (DOPET), en una serie de

sistemas in vitro e in vivo asociados a procesos y enfermedades

neurodegenerativas como la EA, la EP y la EM. Se analizarán marcadores

propios de cada patología, parámetros de oxidación y la modificación del perfil

lipídico. La investigación realizada sobre los mecanismos que llevan a la muerte

neuronal, han llevado a la creencia que el uso terapéutico de antioxidantes

podría resultar de utilidad en estas patologías.

Resúmen 11

COLESTEROL

El cerebro es el órgano del cuerpo humano que contiene mayor cantidad de

colesterol (20 mg/g de tejido). Una de las razones que explican la relativa

insensibilidad de las enfermedades que afectan al SNC a los niveles séricos de

colesterol, podría basarse en la regulación independiente del metabolismo del

colesterol en el SNC con respecto a la periferia.

Uno de los factores de riesgo más prevalentes en la EA es la Apolipoproteína 4

(Apo E), isoenzima de la proteína de transporte de colesterol Apo E, presente

tanto en el cerebro como en la periferia. Hay multitud de enzimas implicadas en

el metabolismo del colesterol que también muestran una conexión putativa con

el inicio tardío de la EA, como la colesterol 24-hidroxilasa asociada al citocromo

P450, implicada en la oxidación del colesterol a 24(s)-hidroxicolesterol.

El consumo de niveles elevados de colesterol y grasas saturadas se asocia con un

mayor riesgo de demencia, mientras que el consumo de pescado, fuente

importante de AGPIs, se asocia con la reducción de este riesgo y la protección

frente a la demencia (Kalmijn et al., 1997). El nivel medio de colesterol total y

de lipoproteínas de baja densidad (LBD)-colesterol en sangre, están

significativamente elevados en pacientes de la EA con respecto a los controles

sanos de avanzada edad y relacionado con el estatus Apo 4. Los niveles de

colesterol cerebral también aparecen elevados en la corteza frontal de pacientes

de la EA y enfermedad coronaria arterial (Notkola et al., 1998).

El colesterol procedente de la dieta, afecta al metabolismo del colesterol

cerebral, acelerando el envejecimiento cerebral a través de un incremento en los

niveles cerebrales de colesterol como consecuencia de un mayor estrés

oxidativo.

Las membranas de los cerebros de pacientes afectados por la EA, presentan una

mayor degradación de fosfolípidos, ya que la peroxidación lipídica asociada a la

enfermedad altera la composición de las membranas en contraste con el

proceso normal de envejecimiento, provocando una reducción en el ratio molar

colesterol:fosfolípidos que reduce la anchura de las membranas, por lo que el

Resúmen12

incremento en colesterol puede ser un mecanismo de defensa celular para

proteger las membranas del daño oxidativo.

El colesterol es un débil antioxidante y estabilizante de la estructura de las

membranas. Se ha sugerido que el colesterol formaría parte del sistema

antioxidativo jerárquico (incluyendo melatonina, ascorbato, ubiquinol, vitamina

E, tioles como el glutatión y los AGPIs) que protege a las células de las acciones

detrimentes de los oxirradicales. Cuando este sistema está sometido a estrés y

deficiencias, el colesterol se oxida y moviliza indicando que el colesterol de la

membrana se intercambia con las reservas exógenas cuando ocurre un proceso de

peroxidación lipídica. Por tanto, cuando el estrés oxidativo es suficiente,

disminuye el contenido en colesterol mitocondrial y microsomal e incrementa la

fluidez de las membranas en las sinapsis del cerebro (Huertas et al., 1992; Wood

et al., 1995).

Existen evidencias epidemiológicas, bioquímicas y genéticas que relacionan al

colesterol con la EA, y se ha demostrado que el colesterol modula el procesado

de la proteína precursora del amiloide (PPA) y que su contenido puede afectar a

la actividad de las secretasas. Los metabolitos de PPA en cerebro pueden ser

modulados por el colesterol de la dieta, un efecto que requiere la presencia de

ApoE. El colesterol incrementa los niveles celulares de PPA, disminuye el

metabolismo y la liberación de -PPAs e incrementa la producción y deposición

amiloidogénica de A .

El colesterol es el esteroide más prevalente en humanos y es producido en una

multi-cascada, que comienza con la acción de la -hidroxi- -metilglutaril CoA

(HMG-CoA) sintasa y la HMG-CoA reductasa. Esta última es una de las dianas

de las estatinas, un tipo de drogas para reducir el colesterol y cuyo efecto

benificioso en la EA continúa siendo hoy día tema de controversia. El vínculo

directo entre las alteraciones en el metabolismo del colesterol y otros lípidos de

membrana en la EA, permanece aún por esclarecer, ya que aún se desconoce si

tales alteraciones son responsables de la disfunción y muerte neuronal.

Resúmen 13

DOPET

El aceite de oliva es un componente importante de la dieta Mediterránea y es

reconocido como fuente de la denominada “comida funcional” por su elevado

contenido en antioxidantes fenólicos naturales. Posee una composición única, a

base de un 56%-84% de ácido oleico y un 3%-21% de ácido linoleico. Algunos

estudios atribuyen un efecto modesto pero directo en la reducción de los niveles

de colesterol para las grasas monoinsaturadas cuando se toman de manera

independiente y reemplazando equicalóricamente a la ingesta de carbohidratos.

Entre las actividades biológicas atribuídas a los fenoles del aceite de oliva figuran

la inhibición de la oxidación de las LBD, tanto in vitro como ex vivo, la inhibición

de la derivatización de apoproteínas y de la agregación plaquetaria, la reducción

de los tromboxanos B2 y leucotrienos B4 producidos por leucocitos humanos

activados, la eliminación de las especies superóxido y reactivas de oxígeno, la

inhibición del daño al ADN, de la nitración inducida por tirosina activada por

peroxinitrito así como acción hipotensiva.

La estructura de los compuestos fenólicos, formados por anillos aromáticos con

sustituyentes hidroxilos, es especialmente adecuada para ejercer una actividad

antioxidante (donador de hidrógeno o electrones, o captador de radicales libres).

La capacidad de los compuestos fenólicos como quelantes de metales,

especialmente cobre y hierro, les permite actuar indirectamente como

antioxidantes mediante la inhibición de la acción de los metales como

catalizadores en la formación de radicales libres.

Entre esos compuestos fenólicos se encuentran los fenoles simples de C6-C2,

flavonoides o secoiridoides. La oleuropeína, el principal secoiridoide amargo que

debe ser eliminado de las aceitunas para hacerlas comestibles, y sus derivados

hidrolíticos, como DOPET, oleuropeína aglicanos y oleodio-11-metil ester, son los

componentes fenólicos predominantes en la pulpa de la aceituna. Otros

compuestos fenólicos cuantitativamente importantes son el tirosol y ácidos

fenólicos como el ácido vanílico y cafeico. Todos estos fenoles están implicados en

la prevención de la formación de otros productos de peroxidación lipídica, como

los isosprostanos, malondialdehido y lipoperóxidos, manteniendo sus niveles

Resúmen14

cercanos a los basales. Otras actividades biológicas atribuidas a estos polifenoles

son la modulación de la formación de trombos y de la inflamación, la defensa del

hospedador ante la infección por parásitos, propiedades antimutagénicas,

anticarcinogénicas y antiglicémicas.

Se seleccionó DOPET por ser el principal o-difenol detectable en el aceite de oliva

virgen extra, tanto en su forma libre como esterificada con ácido elenólico para

formar oleuropeína aglicano. Entre las actividades biológicas de DOPET figuran

la capacidad de prevención de la oxidación de LBD, la agregación plaquetaria e

inhibición de las enzimas 5- y 12-lipooxigenasas, reducción de los efectos

citotóxicos ejercidos por la formación de malondialdehido sobre varios sistemas

de células humanas, efecto antiproliferativo y capacidad para permeabilizar las

membranas de las células intestinales humanas. Uno de los mecanismos

propuestos para la efectividad de los polifenoles implicaría su estructura tipo

catecol, conocida por conferir protección frente a una variedad de insultos

neurotóxicos.

AGPIs OMEGA-3.

Hace más de 30 años que se determinó que la causa de la reducción en la tasa de

mortalidad por enfermedad coronaria correspondía a la ingesta de grasa de foca,

ballena y pescado, ricas en Ácido Eicosapentaenoico (EPA) y Ácido

Docosahexaenoico (ADH). Los investigadores también observaron la efectividad

de los AGPIs omega-3 para reducir los niveles de colesterol y triglicéridos en el

suero, y años después se ha corroborado el efecto hipocolesterolemiante en

monos Rhesus.

Los ácidos grasos son componentes esenciales de la dieta humana, implicados en

el crecimiento y la reproducción. Están asociados con numerosas patologías,

como la enfermedad cardiovascular. El sistema nervioso presenta el mayor

contenido lipídico tras el tejido adiposo. Entre el 50 y el 60% del peso seco del

cerebro adulto son lípidos, 35% de los cuales están representados por los ácidos

grasos poliinsaturados (AGPIs) y entre los que los fosfolípidos son los

componentes cuantitativamente más significativos de las membranas lipídicas.

Resúmen 15

Los ácidos grasos de la dieta son importantes para el cerebro, influenciando

tanto al tejido adulto como al envejecido.

Los AGPIs, se subdividen, a su vez, en el grupo omega-3 y en el grupo omega-6.

La mayoría de los efectos beneficiosos se atribuyen a los omega-3, aunque es

necesario mantener un balance apropiado entre ambas series para el normal

desarrollo y mantenimiento del organismo, que se estima en una relación de 6:1

(omega6:omega3) para un adulto sano.

Los AGPIs, son moduladores putativos de la neurotransmisión en el cerebro y en

el eje hipotalámico-pituitario-adrenal, controlando la expresión génica de los

tejidos lipogénicos, hígado y sistema inmune, lo que deriva en la modificación de

determinados procesos cognitivos y fisiológicos y lo que demuestra que poseen

efectos anti-inflamatorios clínicamente importantes (Mori and Beilin, 2004).

Estudios cuantitativos in vivo demuestran, que aproximadamente un 5% del

contenido en ADH y AA del cerebro es metabolizado y reemplazado por ácidos

grasos provenientes de la dieta a través de la circulación sanguínea.

El principal mecanismo de actuación neuroprotectora y cardioprotectora de la

serie omega-3, podría basarse en la supresión de la síntesis y liberación tanto de

Factor de necrosis tumoral alfa como de Interlequina-10, en la modulación de

las respuestas anti-inflamatorias del eje hipotalámico-pituitario-adrenal y en el

incremento de la liberación de Acetilcolina. Por tanto parece existir una estrecha

interacción entre el Sistema Nervioso Central (SNC), los órganos endocrinos,

citoquinas y los AGPIs omega-3. Esta podría ser una de las razones que

explicasen el beneficio de estos ácidos grasos en condiciones tales como la EA, la

EP, enfermedades inflamatorias, diabetes mellitus, hipertensión, septicemia y

arteriosclerosis.

La presente Memoria ha sido realizada en el Departamento de Biomedicina de la

empresa Puleva Biotech S.A. y en el Departamento de Bioquímica y Biología

Molecular de la Universidad de Granada, en colaboración con el Departamento

de Neurobiología de la Universidad de Saarland (Homburg-Saar, Alemania), y

los objetivos que se planificaron para su ejecución fueron:

Resúmen16

A. Estudiar la relación entre colesterol y la EA:

1) Modulación ejercida por los AGPIs omega-3 de la dieta sobre los niveles de

colesterol y la patología de la EA en un modelo animal de la EA.

2) Influencia de parámetros como la edad y/o el género en los niveles de

colesterol en diferentes modelos animales de la EA.

B. Demostrar el efecto neuroprotector de DOPET en sistemas in vitro e in vivo.

3. Efecto neuroprotector de DOPET in vitro.

4. Efecto neuroprotector de DOPET in vivo.

5. Relación de DOPET y el colesterol.

6. Influencia de DOPET sobre la actividad MAO, implicada en la EP.

Resúmen 17

A continuación se recogen los resultados obtenidos.

Estudios en modelos animales de la EA.

Estudios con dietas enriquecidas en AGPIs omega-3 en un modelo

transgénico simple PPA de la EA.

Algunos autores han demostrado la capacidad de los AGPIs omega-3 para

inducir una reducción en los niveles de colesterol y suprimir la inflamación, lo

que ha permitido establecer una conexión directa con el retraso en el inicio del

desarrollo de patologías como la EA y la EP.

Se decidió evaluar el efecto de una dieta compuesta por EPA:ADH en un modelo

animal de ratón transgénico simple PPA.

En cuanto al análisis del perfil lipídico, se obtuvo una reducción significativa en

el nivel de Ácido Araquidónico (AA) tanto en plasma como en cerebro en el

grupo omega-3 con respecto al grupo control, revelando así la efectividad de la

dieta omega-3 sobre la composición lipídica de las membranas. La reducción en

el contenido en ácidos grasos omega-6 favorece la actuación de los omega-3. El

incremento significativo de ADH en cerebro y la ausencia de alteración en

plasma, apoyan la hipótesis de la sustitución de los omega-6 por omega-3 en las

membranas cerebrales como consecuencia de la dieta.

Se obtuvo una disminución en los niveles de colesterol en cerebro en el grupo

omega-3 con respecto al grupo control, mientras que solamente las hembras

transgénicas alimentadas con omega-3 experimentaron un descenso en los

niveles de colesterol plasmático.

Dada la descrita mayor susceptibilidad de las hembras a padecer la EA y la

relación entre colesterol y esta patología, estos resultados podrían considerarse

beneficiosos para la aplicación de los AGPIs omega-3 en este modelo animal, ya

que mejora la composición lipídica y disminuye la concentración de colesterol a

nivel cerebral, reduciendo el riesgo de formación de depósitos A .

En cuanto al análisis de los niveles de A -40 en cerebro, no se obtuvieron

diferencias significativas entre ambos grupos, probablemente porque el grupo

Resúmen18

no alcanzó los 6 meses de edad apropiados para el desarrollo completo de la

patología. Sin embargo, se obtuvo una tendencia en el grupo de hembras

alimentadas con omega-3 a la reducción en los niveles de amiloide cerebral.

Si los cambios de colesterol en plasma alteran al metabolismo de los esteroles en

el SNC o afectan la función cognitiva del cerebro o la incidencia de demencia, es

algo que permanece aún por esclarecer.

Estudios en ratones mutantes KOZACK-colesterol 16.

Se obtuvieron diferencias entre ambos géneros, tanto en la acumulación de

depósitos de amiloide como en los niveles de colesterol sérico. La correlación

entre A y colesterol resultó negativa para las hembras y positiva para los

machos, aunque no resultaron de significación estadística, por lo que

establecemos una tendencia a ser negativa o positiva en cada caso. Tanto los

cortes inmunohistoquímicos y los Western blot frente a PPA y A evidenciaron

la mayor expresión de la patología en el grupo de las hembras frente al grupo de

los machos, las cuales mostraron menores niveles de colesterol en suero, que

refuerza la tendencia a que la correlación sea negativa.

Estudios en modelo de ratón transgénico doble PPA/PS1 de la EA.

Se han realizado numerosos estudios para elucidar la relación entre el contenido

en colesterol plasmático y la generación de A , aunque la correlación aún no se

ha establecido de manera definitiva. En el presente estudio se analizó la relación

existente entre ambos parámetros durante el envejecimiento normal en ratones

dobles transgénicos PPA/PS1, que expresan ambas proteínas humanas mutantes

(PPA y PS1) y ratones control no transgénicos, todos hembras y a tres tiempos

(3, 8 y 13 meses de edad).

Se obtuvo una marcada reducción en los niveles de colesterol plasmático entre

los grupos de transgénicos de 3 y 13 meses, mientras que en los no transgénicos

permaneció invariable conforme avanzaba la edad, lo que permite apreciar la

influencia del genotipo y la edad sobre los niveles de colesterol. Aunque se ha

Resúmen 19

descrito que los niveles cerebrales de esteroles, incluyendo colesterol y sus

precursores, no sufren modificaciones entre ratones transgénicos PPA y no

transgénicos durante el envejecimiento, en realidad se conoce muy poco sobre

los niveles plasmáticos de colesterol, y en nuestro grupo se obtuvo una

diferencia significativa entre los animales de 13 meses transgénicos y controles

de la misma edad, lo que refuerza la influencia del genotipo sobre el

metabolismo del colesterol.

Se obtuvo un incremento dramático en los niveles de A (variantes 40 y 42) en

los transgénicos de 8 y 13 meses, en comparación con el grupo de jóvenes

transgénicos. La correlación entre el los niveles de A en cerebro y el contenido

de colesterol en plasma resultó significativamente negativa en nuestro modelo.

Mientras que en los estudios realizados por otros autores se modifican los

niveles de colesterol de manera artificial (ej.: dieta hipercolesterolémica,

estatinas), en nuestro estudio los animales no recibieron ningún tipo de

tratamiento o dieta especial con semejante finalidad.

Algunos estudios clínicos en pacientes de la EA apoyan una correlación positiva

mientras que otros describen una relación negativa entre ambos parámetros. Así

mismo, se han realizado estudios en animales en los que ratones alimentados con

dietas enriquecidas en colesterol o tratados con inhibidores de la síntesis del

colesterol, que soportan bien una relación negativa como la observada en nuestro

estudio o una relación positiva.

La comparación de todos estos estudios entre sí y con el nuestro es de relativa

validez, en base tanto a las diferencias de edad para los animales utilizados en

cada caso, lo que supondría diferencias en los niveles hormonales, como a la

ausencia de tratamiento en nuestro estudio, pero sigue manteniendo la duda

acerca de la relación entre colesterol en sangre y amiloide en cerebro.

Resúmen20

Estudios con DOPET.

Se realizó un screening entre numerosos extractos naturales y compuestos

polifenólicos, con objeto de seleccionar aquéllos con capacidad antioxidante y

para pasar al cerebro.

Compuestos Positivos (antioxidantes que cruzan BHE) Extractos naturales:

Hoja de olivo; esencia de tomillo ( 500µL/ratón);

Aceite de pepita uva (500µL/ratón, comercial)

Polifenoles:

Timol (Sigma, 10mg/ratón disuelto en aceite virgen);

Carvacrol (Sigma, 20mg/ratón en aceite girasol; muy tóxico); Ácido homovanílico;

Ácido hidroxibenzoico; Ácido siríngico, 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol

Tabla 1: Compuestos naturales positivos tras el análisis por HPLC-ABTS.

Listado de los extractos naturales y polifenoles que tras ser administrados a los

animales demostraron cruzar la BHE y presentar capacidad antioxidante. = 254 nm

y 734 nm.

De todos los compuestos positivos para ambas capacidades, se eligió DOPET por

la descrita actividad antioxidante, por cruzar la barrera hematoencefálica, de

manera rápida y eficaz, y su permanencia en cerebro durante 1 h

aproximadamente. Así mismo, el hecho de ser un componente del aceite de oliva

y la importancia de éste en la dieta Mediterránea, nos hizo escogerlo para

estudios de neuroprotección.

El Departamento de Química de Puleva Biotech, S.A., realizó la síntesis de

DOPET para su utilización en todos los estudios.

Resúmen 21

Figura 1.: Cromatograma de DOPET obtenidos por HPLC-ABTS. El análisis

de DOPET por HPLC-ABTS confirmó la capacidad antioxidante del compuesto

comparado con Vitamina C. El pico obtenido a 6,3 min corresponde a 10 µg de DOPET.

Tiempo de análisis=60 min, utilizando PDA a 280 nm.

Estudios de antioxidación.

Los radicales libres son mediadores del daño oxidativo en enfermedades

neurodegenerativas y uno de los marcadores utilizados para determinar este

tipo de daño es el Malondialdehido (MDA).

En un primer estudio in vitro se determinó mediante ensayo colorimétrico la

capacidad de DOPET para reducir la producción de sustancias reactivas de ácido

tiobarbitúrico (SRAT), marcador de lipoperoxidación. Los ensayos realizados con

DOPET revelaron su efectividad antioxidante frente al daño oxidativo provocado

a las membranas cerebrales de rata.

Por tanto, se pasó a realizar un estudio en ratones alimentados con dietas

enriquecidas con colesterol y suplementadas con DOPET en el agua de bebida

durante 30 días. El grupo que recibió el compuesto redujo de manera significativa

sus niveles plasmáticos de MDA determinados mediante HPLC-FLD.

Resúmen22

Finalmente, se determinó la actividad Catalasa, enzima capaz de evitar el daño

oxidativo a las membranas, en el cerebro de conejos de un modelo de

aterogénesis creado mediante manipulación dietaria y suplementados con

DOPET. Se establecieron 7 grupos: dieta control (30 y 60 días), dieta

aterogénica (30 y 60 días), dieta aterogénica más DOPET (30 días) y los 30 días

siguientes con dieta control y dieta aterogénica durante 1 mes y el siguiente mes

con dieta control. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias estadísticamente

significativas entre ninguno de los grupos.

En definitiva, estos resultados confirmaron la capacidad antioxidante del

compuesto tanto in vitro como in vivo, protegiendo a las membranas cerebrales

del daño oxidativo que supone la peroxidación lipídica.

Estudios de neuroprotección.

Basándonos en la capacidad antioxidante descrita para DOPET decidimos

determinar su potencial neuroprotector en una serie de ensayos in vitro e in

vivo.

Utilizando diferentes concentraciones de DOPET en cultivos de células C6 y

células neuronales de hipocampo incubadas frente a diversos agentes oxidantes

(H2O2, glutamato, péptido A 22-35) se confirmó la protección del compuesto a

concentraciones inferiores a 100 µM, por encima de la cual el preparado

induciría muerte celular.

Para verificar que la neurotoxicidad inducida por DOPET a concentraciones de

100 µM, se llevó a cabo el ensayo COMET, basado en la irradiación de un cultivo

celular con UV-C, generadora del daño en el material genético responsable de

mutaciones y muerte por apoptosis. Se confirmó que la concentración empleada

de DOPET no protegía del daño ocasionado por la irradiación en estas células.

Resúmen 23

Microarrays en cerebro e hígado de ratones sondados con DOPET.

Se ha descrito la capacidad de los compuestos fenólicos de la dieta para prevenir

respuestas celulares como la apoptosis y la diferenciación por activación de una

cascada de eventos moleculares. Por el interés creciente sobre la mejora de la

eficacia de estos compuestos antioxidantes sobre dianas terapéuticas, se decidió

realizar un estudio genómico sobre la influencia de dos concentraciones

diferentes de DOPET en hígado y cerebro de ratón.

Se seleccionaron todos los genes que resultaron de interés para esta Memoria, y

entre todos ellos se escogieron dos genes: el gen de la Esterol-C5-desaturasa

(reprimido en hígado de ratón por 10 mg de DOPET) y el gen de la Mielina

(sobreexpresado en hígado de ratón por 10 mg de DOPET).

Modelo de excitotoxicidad con kainato: laberinto acuático de Morris.

Uno de los rasgos más característicos y devastadores de la EA es la afectación

de la memoria, asociada fundamentalmente a la región cerebral denominada

hipocampo. El laberinto acuático de Morris (LAM) es una técnica muy efectiva

para la evaluación del proceso conocido como “empeoramiento de la memoria”,

consistente en una prueba realizada en una piscina para la evaluación de la

capacidad de aprendizaje y memorización de los animales. Se han descrito

diferencias significativas en base al fondo genético de cada raza de ratón que se

utilizan normalmente para evaluar el neurocomportamiento. Aunque está

descrita la mayor sensibilidad de la raza Balb/c frente al estrés provocado por

pruebas como el LAM, se decidió poner a punto un protocolo de afectación

hipocampal mediante la inyección intraperitoneal de ácido kaínico (AK), con

objeto de crear un modelo animal sobre el que determinar si DOPET era capaz

de prevenir la pérdida de memoria y /o de mejorar el daño provocado por AK

en una raza tan vulnerable como Balb/c.

El modelo funcionó porque no solamente se consiguió generar un déficit de

memoria en los animales que recibieron AK, sino que aquéllos ratones que

Resúmen24

recibieron DOPET junto con la toxina lograron ejecutar el LAM correctamente y

de igual manera que los controles.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 1 2 3 4 5 6 7

Tiempo (días)

Tie

mp

o la

ten

cia

(seg

)

CONTROL

A K

DOPET

DOPET+A K

Figura 2.: Representación del aprendizaje de todos los grupos de

animales en el Laberinto acuático de Morris. Se muestran los valores medios

del tiempo de latencia (segundos en alcanzar la plataforma) en cada grupo durante

los 7 días del estudio. Se observan diferencias significativas entre el grupo control y

AK (P<0,001), así como entre el grupo con toxina (AK) y el grupo DOPET+AK

(P<0,05). No hubo diferencias entre el grupo DOPET y el grupo DOPET+AK.

Efecto de DOPET en un modelo animal de Esclerosis Múltiple (EM).

La EM es una enfermedad desmielinizante crónica del SNC y es la mayor causa de

disfunción neurológica traumática en los adultos jóvenes. Las lesiones se

caracterizan por infiltraciones de linfocitos y macrófagos fundamentalmente, así

como por varios grados de pérdida axonal y desmielinización.

Resúmen 25

Se eligió un modelo animal de la EM, denominado EAE (Encefalitis Autoinmune

Experimental), por tratarse de un reconocido modelo animal con signos clínicos y

lesiones que asemejan los observados en la EM, con objeto de estudiar el efecto de

DOPET sobre los brotes de la enfermedad. Se analizó el efecto sobre el

neurocomportamiento y la progresión de la enfermedad de los animales. Los

resultados se basaron en la medición diaria de los scores de cada animal en cada

uno de los grupos (control y DOPET). Los datos recogidos muestran una mejora

significativa en la incidencia como en la gravedad de los brotes diarios en el grupo

que recibió agua con DOPET.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

22 23

24 25

26

28

Tratamiento (días)

Scor

e ac

um

ula

do

DOPET

Control

Figura 3.: Representación del score diario para cada grupo a lo largo

del estudio. La diferencia obtenida para el grupo DOPET con respecto al control

presentó significación estadística (P= 0,06).

En definitiva, la información obtenida puede ser de gran interés para el futuro

desarrollo de un tratamiento aplicado a la EM basado en las propiedades de un

antioxidante natural como DOPET.

Resúmen26

Estudios del metabolismo del colesterol.

El colesterol no esterificado es un componente estructural esencial de la

membrana plasmática de cada célula. El SNC en los humanos contiene unos 23

miligramos de colesterol por gramo de tejido a pesar de suponer el 2,1% del

peso corporal. En todos los animales, la mayoría del proceso de crecimiento y

diferenciación del SNC tiene lugar durante los primeros años de vida, y el

colesterol necesario para ello proviene casi exclusivamente de síntesis de novo.

Algunos autores han descrito una relación directa entre los niveles plasmáticos

de colesterol y la incidencia de demencia, incluyendo la EA. El tratamiento con

agentes farmacéuticos que reducen la concentración del colesterol plasmático

parece asociarse con una menor incidencia de tales demencias. Sin embargo

hay que enfatizar que la mayoría de estas asociaciones no han sido verificadas.

Por tanto, de confirmarse la relación entre ambos parámetros, las lipoproteínas

transportadoras de colesterol contribuirían de manera muy destacada en el

contendio de colesterol del cerebro y la médula espinal, afectando directa o

indirectamente al procesado de proteínas como la proteína precursora del

amiloide (PPA) o los receptores de neurotransmisores.

Algunos estudios previos apoyan la capacidad de DOPET para inhibir la

peroxidación provocada por la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad

(LBD), por lo que desarrollamos una serie de ensayos in vitro e in vivo para

determinar su capacidad hipocolesterolemiante.

Estudios sobre LC5D

Los resultados obtenidos en los Microarrays realizados con el compuesto,

revelaron la capacidad de DOPET para reprimir el gen de la Esterol-C5

desaturasa en hígado, por lo que decidimos estudiar la enzima Latosterol–C5

desaturasa. Se trata de una enzima implicada en el metabolismo del colesterol,

mediando la transformación de latosterol en 7-Dehidrocolesterol, precursor del

colesterol. La inhibición de esta enzima podría resultar de interés para evitar

un incremento en los niveles de colesterol.

Resúmen 27

Se determinó la IC50 de DOPET para la LC5D y se obtuvo un valor igual a 187

µM, lo que indicaba que era capaz de inhibir a la enzima. Estos datos

concordaban con los resultados obtenidos en el análisis de la influencia sobre la

expresión génica, en los que la dosis más alta (10 mg) era la más efectiva en la

inhibición de este gen.

Para concluir el estudio bioquímico de esta enzima, se determinó su Km

mediante HPLC frente a diferentes concentraciones de sustrato (latosterol). Se

obtuvo un valor de Km igual a 157,3 µM.

Efecto de diferentes dietas en el cerebro de conejos.

Se estableció un modelo de aterogenia en conejo mediante manipulación

dietaria, para analizar el efecto de dietas suplementadas con DOPET en un total

de 56 conejos, divididos en 7 grupos de 8 animales cada uno, alimentados con

dietas controles y aterogénicas a dos tiempos, 30 y 60 días. Se determinaron una

serie de parámetros bioquímicos relacionados con el metabolismo del colesterol

plasmático y cerebral. En los grupos suplementados con DOPET se obtuvo una

mejora en el perfil lipídico plasmático, mediante una reducción en el colesterol

total y LAD-colesterol (P<0,05) tras 60 días de tratamiento. Así mismo, se

observó una reducción de los triglicéridos plasmáticos en el grupo DOPET con

respecto al resto de los grupos. Por tanto, la relación colesterol:LAD se redujo en

el grupo DOPET. Aunque no hubo diferencias en el contenido de colesterol

cerebral, probablemente a causa de la corta duración del estudio (2 meses) en

relación a la vida media de este esterol en cerebro (6 meses). Sin embargo, el

grupo DOPET (1 y 2 meses) experimentó una reducción en el contenido de

latosterol cerebral, de menor vida media que el colesterol en cerebro.

Resúmen28

Efectos de DOPET sobre la captación de dopamina y norepinefrina en

células PC12.

En base a la similitud molecular de DOPET (C8O3H10) con la Dopamina

(C8H11NO2), se planteó un estudio para determinar si el compuesto era capaz de

actuar sobre el metabolismo de las catecolaminas o incluso ser reconocido por

los transportadores de estas aminas, que suponen una diana terapéutica en la

investigación frente a la EP.

El presente estudio se realizó en colaboración con la Dra. S. Hilfiker (Universidad

de Manchester, Inglaterra). Se diseñó para probar los efectos de DOPET en la

captación y liberación de dopamina (DA) desde las células PC12. Se trata de un

modelo catecolaminérgico muy útil, poseedor de todas las proteínas relevantes

para el transporte y metabolismo de DA y NE, y una herramienta excelente para

elucidar los efectos de compuestos noveles sobre la captación, secreción y

degradación de monoaminas.

Se determinó la capacidad de actuación del compuesto a nivel del transportador

de DA (TDA) y del transportador de norepinefrina (TNE). Así mismo, se evaluó su

actuación sobre una de las enzimas responsables de la eliminación intracelular de

DA, como es la Monoamino oxidasa (MAO). El hecho de obtener un efecto de este

compuesto sobre las posibles vías de retirada de DA, podría ser de utilidad

terapéutica en patologías como la EP.

Los resultados obtenidos en los ensayos realizados demuestran que DOPET es un

compuesto potente incrementado las cantidades tanto de DA como de NE

intracelulares. Los efectos de DOPET sobre el consumo de DA podrían estar

mediados por un efecto del compuesto sobre TNE, que también transporta DA.

Los resultados de este estudio indican que DOPET podría actuar modulando al

TNE, lugar de acción de un rango de drogas con potencial terapéutico. Bajo

condiciones patológicas, el TNE podría actuar en la progresión de enfermedades

como el fallo cardiaco, asociado con la reducción en la función y densidad de

TNE. Una intervención dirigida a la mejora de TNE en esta patología cursaría con

efectos beneficiosos. El esquema del modo de actuación propuesto para DOPET

sería el siguiente:

Resúmen 29

Figura 3.: Mecanismo de acción de DOPET en células PC12. DOPET

activaría al transportador TNE, responsable de la captación de NE y DA en la célula

para su posterior incorporación en vesículas. No se ha demostrado este mecanismo a

través de la activación de TDA. DBH= Dopamina-beta-hidroxilasa

En base a la hipótesis propuesta como mecanismo de acción (Figura 3), en la

que DOPET podría facilitar la internalización de DA, previniendo de la

degradación de la misma mediante la acción de la MAO, y apoyados por los

estudios que confirman la efectividad de algunos compuestos fenólicos como

inhibidores de MAO, se analizó la capacidad de DOPET como inhibidor de la

MAO-B en mitocondrias aisladas de cerebro de rata.

Los resultados determinaron que se trataba de un compuesto con un elevado

potencial inhibidor sobre la actividad MAO-B en cerebro (IC50 = 16,3).

NE + DA DA Extacelular

TNE TDA

Intracelular

+

DOPET NE + DA

+

DOPET

vesículas

?

DOPET

MAODOPAL

APOPTOSIS

DOPET

DA HVACOMT

NE

-

DBHNE DA

Resúmen30

Finalmente, y a modo de conclusión global de esta Memoria, se han compilado

los principales hallazgos relacionados con DOPET y los AGPIs omega-3 de la

dieta utilizados en los diferentes sistemas in vitro e in vivo:

1) En relación a los efectos de los AGPIs omega-3, aplicados en un modelo

animal de la EA, se demuestra su capacidad para mejora el perfil lipídico de los

ratones transgénicos simples PPA. Se obtuvo una reducción significativa en los

niveles de colesterol y AA (omega-6) en plasma y cerebro, así como un

incremento en ADH (omega-3) en cerebro. Así mismo, se observó una diferencia

significativa entre dietas, géneros y entre genotipos, revelando que los animales

alimentados con dieta omega-3 experimentaron los cambios más notables en su

perfil lipídico, y concretamente las hembras transgénicas alimentadas con dieta

omega-3 fueron las que más positivamente se vieron afectadas. Además, en este

grupo de hembras se obtuvo una tendencia a la reducción en los niveles de A -

40 cerebral, lo que apunta que la dieta omega-3 podría haber resultado

beneficiosa para la patología de haberse completado los 6 meses de edad

(adecuados para el pleno desarrollo de la enfermedad).

2) En los estudios realizados con DOPET, se ha demostrado su capacidad para

ejercer neuroprotección tanto en sistemas in vitro como in vivo.

a. Por su capacidad para atravesar la BHE.

b. Por su efecto antioxidante en células C6 y neuronas de hipocampo

sometidas a diferentes agentes oxidantes, así como por su capacidad para

reducir los niveles de peroxidación lipídica in vitro e in vivo.

c. Por su capacidad para mejorar la incidencia de los brotes en un animal de

EAE, con una tendencia a ser un beneficio significativo.

d. Por su capacidad para inhibir el metabolismo del colesterol, inhibiendo a la

LC5D. Así mismo ha demostrado reducir los niveles de colesterol en plasma y de

latosterol en cerebro de conejos.

e. Por su capacidad para inhibir a la MAO in vitro e in vivo.

SUMMARY

Summary 32

Neurodegenerative disorders as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease

(PD) and Multiple Sclerosis (MS) have a multifactorial origin, attending with

toxic and inflammatory reactions, glutamatergic neurotoxicity and increment

on the iron and nitric oxide levels, scavenging of the endogenous antioxidants,

reduction in trophic factors and loss of neurons, among other events. They are

some of the most devastating pathologies with a highest cost in the current

society.

The multifactorial origin of these diseases may explain why the limited number

of clinical neuroprotective therapies using single drugs, failed to show

significant results. Thus, the fundamental objective in neurodegeneration and

neuroprotection research is to determine which of these factors constitute the

primary event, the sequence in which they occur and whether they act in

concordance with the pathogenic process.

The neuroprotective mechanisms could be confronted with dietary skills, which

is the main purpose of this Memory, based on the application of

polyunsaturated fatty acids omega-3 (PUFAs omega-3) and a polyphenolic

compound as 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethanol (DOPET) on in vitro and in vivo

systems related with neurodegenerative disorders as AD, PD and MS. Some

markers of these diseases, as well as some oxidation and lipidic parameters will

be analyzed. The intense investigations on the mechanisms why neurons die

have led to the belief that the therapeutic use of antioxidants could be of help in

these pathologies.

Summary 33

CHOLESTEROL

The brain is the organ with the highest amount of cholesterol (20 mg/g tissue)

in the human organism. One of the reasons to explain why the disorders

affecting the Central Nervous System (CNS) are relatively insensitive to serum

cholesterol levels, could be based on the independent regulation of the

cholesterol metabolism in the CNS in comparison with the levels in the

periphery.

One of the most prevalent risk factors for AD is the Apolipoprotein (Apo E4),

which is an isoenzyme of the cholesterol transport protein called Apo E present

in brain and also in periphery. Many enzymes are implied in cholesterol

metabolism, connected putatively with the late-onset of AD, as cholesterol-24-

hydroxilase associated to cytochrome P450, which is implied in cholesterol

oxidation to 24(S)-hydroxycholesterol.

The cholesterol and saturated fats consumption is associated with a higher risk

to develop dementia, while fish ingestion is related with lower risk and

protection against this process (Kalmijn et al., 1997). The total serum

cholesterol and LDL-cholesterol levels are significantly elevated in AD patients

in comparison with non-demented people, and related with the Apo E4 status.

The brain cholesterol levels in the frontal cortex were also elevated in those AD

patients (Notkola et al., 1998).

The cholesterol from diet is able to affect the brain cholesterol metabolism,

accelerating the brain aging as a consequence of the increase in the brain

cholesterol levels and a higher oxidative stress. The brain membranes of AD

patients show more phospholipids degradation than a normal aged brain,

reduced cholesterol:phospholipid ratio and narrower membranes. The

increment in the cholesterol amount could act as a defensive mechanism of the

cell to protect the membranes form the oxidative damage.

Cholesterol is a weak antioxidant and stabilizing agent of the membrane

structure. It has been suggested the role of cholesterol protecting cells from the

oxyradical attack besides melatonin, ascorbic acid, ubiquinol, vitamin E,

glutation and PUFAs. When this system is under stress and has deficits,

Summary 34

cholesterol is oxidized and interchanged with the exogenous reservoir. So then,

when the oxidative stress is high enough, the mitochondrial and microsomal

cholesterol levels are reduced and the membrane fluidity in the brain synapses

used to increase (Huertas et al., 1992; Wood et al., 1995).

There are epidemiologic, biochemical and genetical evidences to relate

cholesterol and AD. The brain APP metabolites could be modulated by the

cholesterol from diet in presence of Apo E. Cholesterol is able to increase

cellular APP levels and to reduce the metabolism and release of -APPs as well

as to favor the amyloidogenic production and deposition. Cholesterol is one of

the most abundant steroids in human beings and it is produced by a

multicascade which begins with -hydroxy- -metylglutaril CoA (HMG-CoA)

synthase and HMG-CoA reductase. The last enzyme is one of the targets for

cholesterol-lowering drugs (statins) and its effectiveness against AD is still a

controversial theme. In AD, the direct link between alterations in cholesterol

metabolism and other membrane lipids still remains uncertain.

Summary 35

DOPET

Olive oil is an important component of the Mediterranean diet and is

recognized as a source of the so-called “functional food” because of the

natural phenolic antioxidant content. It has a unique composition, with a 56-

84% oleic acid and a 3-21% linoleic acid. Some research attributes a modest

but direct effect to monounsaturated fats on the reduction of the cholesterol

levels and replacing carbohydrates in the caloric profile.

Among the biological activities attributed to phenols in olive oil we found the

inhibition of LDL oxidation, in vitro and ex vivo, the inhibition of the

apoprotein derivatization and platelet aggregation, the reduction of

tromboxan B2 and leucotrien B4 produced by activated human leukocytes,

scavenging of reactive oxygen species and the inhibition of DNA damage and

nitration induced by activated tyrosine peroxinitrite.

The structure of the polyphenols, containing an aromatic ring with hydroxyl

radicals is especially convenient to work as an antioxidant (donator of

hydrogen or electrons, or scavenging free radicals).

The capacity of phenols as metal chelators, specially iron and copper, let

them operate as antioxidants trough the inhibition of the formation of free

radicals catalyzed by the metals. Some of these compounds are simple

phenols, flavonoids or secoiridoids. Oleuropein is the main bitter secoiridoid

which is eliminated from olives to makes them eatable, and its hydrolytic

derivatives as DOPET, oleuropein aglycans and oleo-11-methyl ester are the

main components in the olive pulp. Tyrosol and phenol acids as vanillic and

cafeic acid are some other quantitative important compounds. All of these

phenols are implied in the prevention of the lipid peroxidation products, as

isoprostanes, malondialdehyde (MDA) and lipoperoxides, whose levels are

close to the basal one. These phenols also modulate the thrombo formation

and inflammation, the host defense against parasitic infection and they have

antimutagenic, anticarcinogenic and antiglicemic properties.

DOPET is the main o-diphenol detectable in extra virgin olive oil, in free and

sterified form with elenolic acid to produce oleuropein aglycan.

Summary 36

Some of the biological activities related to DOPET are the prevention of

Lipoprotein Low Density (LDL) oxidation, platelet aggregation and 5- and 12-

lipooxigenase inhibition, reduction of the cytotoxic effects caused by MDA

formation in some human cell systems, antiproliferative effect and capacity to

permeabilize the human intestine cells.

One of the mechanisms proposed for the effectiveness of the polyphenols may

involve its catechol-like structure, known to confer protection against a variety

of neurotoxic products.

Thirty years ago it was discover that coronary diseases in Eskimos was lower

than in other population due to the consumption of seal fat, whale and fish, all

of them rich in Eicosapentaeonic and Docosahexaeonic acids (EPA and DHA

respectively). The researchers also saw a reduction in the serum cholesterol and

triglycerides levels by the PUFAs omega-3 consumption, an effect that has been

seen some years later in Rhesus monkeys.

Fatty acids are essential components of the human diet, implied in growth and

reproduction. They are associated with much pathology as the cardiovascular

disorder. The nervous system shows the highest lipid content after adipose

tissue. Between the 50 to 60 % of the dry weight in an adult brain are lipids,

where 35% of them are represented by PUFAs and among them phospholipids

are the quantitatively more significant components in the lipid membranes.

Dietary fatty acids are therefore important for the adult and aged brain.

PUFAs are further subdivided in omega-3 and omega-6 groups. Most of the

beneficial effects are attributed to omega-3 but not to omega-6, although a

correct balance between both type of PUFAs is needed for the normal

development and maintenance of the organism, which has been estimated in 6:1

(omega-6:omega-3) for an healthy adult.

PUFAs are putative modulators of neurotransmission in the brain and in the

hypothalamic-pituitary-adrenal axis, controlling the gene expression in

lipogenic tissues, liver and the immune system. This property has direct effects

on cognition and physiological processes, and reveals its anti-inflammatory

capacity (Mori and Beilin, 2004).

Summary 37

Quantitative in vivo studies demonstrated that approximately 5% of brain DHA

and arachidonic acid (AA) are metabolized and replaced by dietary fatty acids

through the blood circulation.

The principal mechanism of cardio- and neuroprotective actions of omega-3

fatty acids could be mediated by the suppression of Alfa-Tumoral Necrosis

Factor and Interleukin-10 synthesis and release, through the modulation of the

anti-inflammatory responses from the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and

by an increase in Acetylcholine release. This might explain why and how these

fatty acids could be beneficial in AD, PD, inflammatory diseases, diabetes

mellitus, hypertension, septicemia and atherosclerosis.

The current Memory has been realized in the Biochemistry and Molecular

Biology Department (University of Granada, Spain) and the Department of

Biomedicine of Puleva Biotech S.A. (Granada, Spain), in collaboration with the

Neurobiology Department of the University of Saarland (Homburg-Saar,

Saarland, Germany) and the objectives planned were:

A. To study the relationship between cholesterol and AD:

1) Role of a diet enriched in PUFAs omega-3 on cholesterol and AD pathology

in an AD animal model.

2) Influence of age and/or gender on cholesterol levels on some AD animal

models.

B. To demonstrate the neuroprotector effect exerts by DOPET on in vitro and

in vivo systems.

3. Neuroprotection of DOPET in vitro.

4. Neuroprotection of DOPET in vivo.

5. Relation between DOPET and cholesterol levels.

6. Influence of DOPET on MAO activity, implies in PD.

The results obtained in this Memory are summarized hereafter.

Summary 38

Studies in animal models.

Studies with diet enriched with omega-3 PUFAs in a simple APP

transgenic mouse model of AD.

Some authors have demonstrated that omega-3 PUFAs were able to reduce

cholesterol levels and suppress inflammation. This property has permitted to

establish a direct link with the delay in the onset of AD and PD.

A diet enriched with EPA: DHA was tested in a simple APP transgenic mouse

model.

The biochemical analysis of lipid profile showed a significant reduction in

plasma and brain AA levels in omega-3 group compared to the control group.

These results reveal the effectiveness of the diet to alter the lipid membrane

composition in brain. A decrease in omega-6 fatty acids in the membranes

propitiates the actuation of omega-3 PUFAs. The fact that brain DHA levels were

significantly increased and the absence of changes in DHA plasma levels,

support the idea that omega-6 could be substituted by omega-3 PUFAs in brain

membranes as a consequence of the omega-3 enriched diet.

The brain cholesterol levels resulted reduced in omega-3 group, while the plasma

cholesterol levels decreased only in the female transgenic mice fed with omega-3

enriched diet.

Regarding the brain A -40 levels quantification we could not find any significant

difference among the groups, most probably because the animals could not get 6

months of age to develop the disease properly. However, we could find a

tendency to reduce the amyloid brain levels in the female mice feeding with

omega-3 diet. The question that remains is whether the changes in plasma

cholesterol levels modify the sterol metabolism in CNS or whether they affect the

cognitive function or the incidence of dementia.

Summary 39

Studies in AD mutant mice KOZACK-cholesterol 16.

After the last study, we continue with the analysis of the relationship between

serum cholesterol levels and brain amyloid levels.

We get some gender differences in brain A and serum cholesterol levels. The

correlation between both parameters was negative in female mice while it

was positive in male group, although this relation was not statistically

significant. We could suggest a negative tendency for females or positive

tendency for males animals. The inmunohystochemistry and Western blot to

determine APP and A evidenced the higher expression of the pathological

markers in female animals against males, which paradoxically showed the

lowest serum cholesterol levels. This point supports the negative tendency in

this group.

Studies in AD double transgenic mice model APP/PS1.

There are many studies that analyze the relationship between cholesterol

levels and A , although this relation still remains unclear. In the present

study we tried to elucidate the link between plasma cholesterol and brain A

levels throughout the normal aging in a transgenic mouse model expressing

both mutant human amyloid precursor protein and mutant human

presenilin-1 during normal aging, PPA/PS1, and wild-type mice, all of them

female grouping by age (3, 8 and 13 months).

Measurements of plasma cholesterol levels revealed a significant reduction in

aged transgenic mice, whereas plasma levels in young and aged wild type

mice remained almost unchanged. We could appreciate the influence of

genotype and age on cholesterol levels. Although it has been described that

brain sterol levels are unchanged among transgenic and no transgenic mice,

we found a significant reduction between 13 months-old transgenic mice and

same age wild type mice. This result shows the genotype influence on

cholesterol metabolism.

Summary 40

As expected, brain A (40 and 42) levels increased significantly in the 8 and 13

months transgenic mice compared with mice 3 months old. Statistical analysis

revealed a significant negative correlation between plasma cholesterol and brain

A levels during aging in this model.

Whereas a couple of former studies report on the modulation of cholesterol

levels, using either high-cholesterol diets or cholesterol-lowering drugs, we tried

to elucidate the relationship between plasma cholesterol and brain A during

normal aging, by measuring plasma cholesterol content and brain A -42 levels

in untreated APP/PS1 transgenic and age- and sex-matched wild type control

mice.

Clinical studies in AD patients support either a positive or a negative correlation

among both parameters. There are feeding studies in mice with diet enriched in

cholesterol and mice treated with cholesterol-synthesis inhibitors which showed

a positive or a negative correlation like our study. The comparison of all of these

studies with our experiment has relative validity, because of the age differences

among animals used which implies hormonal variances. Another factor to

consider is the absence of treatment in the current study.

Summary 41

Studies realized with DOPET.

After the absence of effect of PUFAs omega-3 on the pathological markers of

an AD model, except for the modifications in the lipid profile, we decided to

search for a natural compound which could cross the blood brain barrier

and with antioxidant properties, to study its neuroprotector potential.

We analyzed the antioxidant capacity of a huge amount of natural

compounds, based on the HPLC-ABTS method to know it in comparison

with the chromatogram obtained for the ABTS cation. The positive

copmpouds we selected were:

Positive compounds (antioxidants which cross the BBB) Natural extracts:

Olive leaf; thymus essence (500µL/mouse);

Oil of grapped nugget (500µL/mouse, commercial)

Poliphenols:

Tymol (Sigma, 10mg/Mouse; dissolved in oil);

Carvacrol (Sigma, 20mg/Mouse dissolved in oil; highly toxic);Homovanillic

acid; Hidroxybenzoic acid; Siringic acid, 2-(3,4-dihidroxyphenil)-ethanol

Table 1: Natural compounds which crossed the BBB and with

antioxidant properties. Animals were oral-gavaged with some natural extracts

and polyphenols to test their capacity to cross the BBB and their power as

antioxidants. = 254 nm y 734 nm.

From all positives compounds abovementioned, we decided to select 2-(3,4-

dihidroxyphenil)-ethanol because is one of the major antioxidants included

in olive oil which has a relevant role in the Mediterranean diet and in the

current society.

The Department of Chemistry of Puleva Biotech, S.A. made the compound

through a synthetic way to use it in the rest of experiments.

Summary 42

It was demonstrated the ability of DOPET to cross the BBB, in a fast way which

let it be inside the brain during 1 hour. The antioxidant power was analyzed by

HPLC-ABTS and the linear regression model was determined by HPLC.

Figure 1.: Chromatogram obtained of DOPET by HPLC-ABTS. Comparison

among DOPET and Vitamin C to demonstrate the antioxidant capacity of our

compound.The retention time was 6,3 minutes to 10 µL DOPET (1 g/L), corresponding

to 10 µg of the compound. Analysis time= 60 min., using PDA (280 nm).

Summary 43

Antioxidation and DOPET.

Free radicals are mediators of oxidative damage in neurodegenerative

disorders and one marker of such damage is Malondialdehyde (MDA).

In a first in vitro study, the effect of DOPET on the thiobarbituric reactive

substances (TBARS) production was determined. TBARS are considered a

marker of lipoperoxidation. The assays realized with DOPET showed it as a

good antioxidant against oxidative damage in rat brain membranes.

After these results, DOPET showed to protect from lipid peroxidation, and

we made a study in mice fed during 30 days with a diet enriched with

cholesterol and supplemented with DOPET in drinking water. We found a

significant reduction in the plasma MDA levels of the group supplemented

with DOPET, determined by HPLC-FLD.

Finally, we analyzed the brains of the rabbits for the cholesterol study in this

Memory to analyze the effect of DOPET in diet on the catalase activity. These

animals were divided in 7 groups, feeding in a different way: control diet (30

and 60 days), aterogenic diet (30 and 60 days), aterogenic diet plus DOPET

(30 days), aterogenic diet plus DOPET 30 days and the next 30 days with

control diet plus DOPET and an aterogenic diet (30 days) and the next 30

days with control diet. The results did not show any effect of DOPET on the

catalase enzimatic activity.

Definitely, these results demonstrated the antioxidant capacity of DOPET in

vitro and in vivo, protecting brain membranes from oxidative damage

generated by lipid peroxidation.

Neuroprotection and DOPET.

Based on the antioxidant capacity of DOPET, we decided to determine the

neuroprotector power in some in vitro and in vivo assays.

We used different concentrations of DOPET in C6 cells and hippocampal

neurons culture tested with some oxidants (H2O2, glutamate, A 22-35 peptide).

Summary 44

It was confirmed the validity of this natural antioxidant under concentrations

of 100 µM, because over this concentration showed to induce cell death.

To confirm the neurotoxicity induced by DOPET at 100 µM, we develop an assay

so-called COMET, based in the UV-C irradiation of a cell culture to induce

damage and mutations to genes and a subsequent apoptosis.

Finally, this concentration of DOPET used was confirmed to be unable to protect

cells from DNA damage.

Microarrays in liver and brain of mice with DOPET oral-gavaged.

The ability of dietary phenols to prevent cell responses as apoptosis and

differentiation by activation of a molecular cascade has been described. There is

a growing interest around the improvement of antioxidant compounds to use

them on therapeutic targets. For this reason, we realized a microarray study to

know the influence of two concentrations of DOPET on mouse liver and mouse

brain gene expression.

From a large list of genes, we selected 2 genes from the whole outcomes: Sterol-

C5-desaturase (downregulated in liver by 10 mg of DOPET) and Myelin (up

regulated in liver by 10 mg of DOPET).

Model of excitotoxicity with kainic acid: Morris Water Maze.

One of the most characteristic features in AD is the memory impairment,

basically associated with the hippocampus. Morris Water Maze (MWM) is a

technique so useful to evaluate this process. Briefly, it is a test realized in a

swimming pool to check the learning and memory of the rodents. There are

some differences related with the genetic background of the strains used in

neurobehavioral tests. The strain more sensitive against stress evoked by MWM

is Balb/c, but we trained this strain in a study where they received kainic acid

(KA) by an intraperitoneal injection and DOPET by oral-gavage, to know if this

substance was able to avoid the memory impairment caused by KA and/or

improve the damage evoked by this neurotoxin.

Summary 45

The model worked well because we induced a memory deficit in mice injected

with KA, while mice with DOPET completed the test as efficiently as controls.

We observed a significant difference between the DOPET groups in relation

with the KA+DOPET-treated mice, so we could say DOPET was able to

protect this model from hippocampal damage evoked by KA.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 1 2 3 4 5 6 7

Time (days)

Lat

ency

(se

c)

CONTROL

KA

DOPET

DOPET+KA

Figure 2.: Morris Water Maze Task in mice treated with KA and DOPET.

We found a significant learning of the DOPET group in relation with the AK+DOPET

treated mice.

Summary 46

Study in an animal model of Multiple Sclerosis with DOPET

disolved in drinking water.

MS is a chronic demyelinating disorder of CNS and the main reason of traumatic

neurological dysfunction in young adults. Lesions are basically lymphocytes and

macrophages infiltrations, axonal damage and demyelization.

We selected the EAE model (Experimental Autoimmune Encephalitis) because it

is a recognized animal model able to develop the clinical signs and lesions

observed in MS. The aim of the study was to determine the activity of DOPET to

affect the attacks and progression of the disease. The outcomes were realized in

the daily measurement of the scores of each animal in every group. We found a

significant improvement in the incidence and gravity of the attacks in mice

consuming DOPET in drinking water. The information above could be of interest

to develop of therapies for MS, based on a natural antioxidant as DOPET.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 28

Tratamiento (días)

Scor

e ac

um

ula

do

DOPET

Control

Figure 3.: Representation of the scores evaluated for each group. The

difference among DOPET and control group has a tendency to be statistically

significant (P= 0,06).

Summary 47

Studies in colesterol metabolism.

Non-esterified cholesterol is a structural component in the plasmatic

membrane of each cell. Human CNS contains 23 mg cholesterol per gram of

tissue althoughº brain constitutes only a 2,1% of the corporal weight. In all

animals, the main process of CNS growth and differentiation occurs during

the first years of lifespan and the cholesterol required come from de novo

synthesis.

Some authors support a direct relation between plasma cholesterol levels and

the incidence of developing dementia. The treatment with cholesterol-

lowering drugs has shown to be associated with a lower risk of dementia.

Anyway, all of these hypotheses need further confirmation. If both

parameters will be related as they suggested, cholesterol transporter

lipoproteins will contribute in a direct or indirect way to process APP or

neurotransmitter receptors.

Some studies demonstrate the inhibition exerted by DOPET on lipid

peroxidation. Based on these, we realized some in vitro and in vivo studies to

analyze that hypocholesterolemic power.

Studies realized with LC5D

After the microarrays outcomes we performed some assays to study the

enzyme Lathosterol-C5 desaturase (LC5D), because DOPET down regulated

its gene expression in liver.

LC5D is an enzyme implies in cholesterol metabolism, catalyzing the

conversion of Lathosterol in 7-Dehydrocholesterol, a precursor of cholesterol.

Inhibiton of this enzyme could be of interest to avoid the increase of

cholesterol.

The IC50 of DOPET for this enzyme was equal to 187 µM. This value indicates

the capacity to inhibit it, but with a relative elevated amount of compound.

Summary 48

Study of the effect of different diets on the brain of rabbit.

An atherogenic model in rabbit was established by dietary manipulation, to

analyze the effect of DOPET supplementation in a total of 56 animals, distributed

in 7 groups (n=8) feeding with control diets and atherogenic diets at two time

points, 30 and 60 days. Some biochemical parameters related with cholesterol

metabolism (total plasma cholesterol, HDL and triglycerides; total brain

cholesterol and lathosterol) were determined.

We found plasma cholesterol and plasma HDL-cholesterol reduction (P<0,05)

in DOPET group at 2 months time point. Also, the triglycerides in this DOPET

group were reduced in relation the rest of the groups. So then, the ratio

cholesterol:HDL in DOPET group was decreased at 2 months after treatment.

There were no differences for the brain cholesterol levels, probably because of

the short period of the study (2 months) in comparison with the time-life of

cholesterol in brain (6 months). However, the animals in the first group

supplemented with DOPET showed a reduction of lathosterol in brain.

Effects of DOPET on Dopamine and Norepinefrine uptake in PC12

cells.

Based on the structural-molecular similarity between DOPET (C8O3H10) and

Dopamine (C8H11NO2), we decided to study if our compound was able to work

on the metabolism of catecholamine or even if it could be recognized some

amine transporters, because these are some of the targets in the research

against PD.

The current study was realized in collaboration with PhD. Dª. S. Hilfiker

(University of Manchester, England). It was designed to test the effects of

DOPET on Dopamine (DA) uptake and release from PC12 cells. This is a

catecholaminergic model expressing all the relevant proteins for the transport

and metabolism of DA and NE. It is the perfect skill to elucidate the effects of

novel compounds on monoamine uptake, secretion and degradation.

Summary 49

The role of DOPET on dopamine transporter (DAT) and Norepinefrine

transporter (NET) as well as its influence on MAO (enzyme responsible of DA

cell release) was determined.

DOPET has been found to be a potent compound at specifically increasing the

amounts of intracellular [3H]-DA and [3H]-NE. The effects on DA could be

mediated by an influence of our compound on NET, which also transport DA.

Thus, the present data strongly support that DOPET may act to modulate NET,

which is the site of action of a range of drugs with therapeutic and abuse

potential. Under pathological conditions, changes in NET function might play a

key role in the progression of diseases like heart failure, associated with

reduction in NET density and function. It is likely that interventions enhancing

NET in the failing heart would be expected to achieve beneficial effect.

The scheme of a hypothetical mechanism of action for DOPET could be as

follows:

Summary 50

Figure 3.: Mechanism of action for DOPET in PC12 cells. DOPET could

activate NET which is responsible of NE and DA uptake in cell, to follow through the

incorporation into vesicles. This effect has been not demonstrated trough DAT.

DBH= Dopamine-beta-hydroxilase.

Some studies have analyzed the effectiveness of phenol and alkaloid compounds

as inhibitors of MAO activity, but until now there is no evidence of that power

for DOPET, structurally related with Dopamine and its metabolites.

Based on the hypothesis proposed for the mechanism of action of DOPET

described in figure 3, where DOPET could facilitates the uptake of Dopamine,

avoiding its degradation by MAO, and also counting with the references which

support the role of phenols as inhibitors of MAO, we determine the power of our

compound to inhibit MAO-B in mitochondria isolated from rat liver and brain.

The outcomes validated DOPET as an inhibitor of MAO-B activity in brain

(IC50 = 16,3) and liver (IC50 = 72,4).

NE + DA DA Extacelullar

TNE TDA

Intracelullar

+

DOPET NE + DA

+

DOPET

vesicles

?

DOPET

MAODOPAL

APOPTOSIS

DOPET

DA HVACOMT

NE

-

DBHNE DA

Summary 51

Finally, we could elaborate a global conclusión of this Memory, through the

compilation of the main results with DOPET and omega-3 PUFAs from diet

used on some in vitro and in vivo systems.

1) Regardind the effects exerted by omega-3 PUFAs enriched diet applied in

an animal model of AD, we found some benefits in the lipid profile of these

simple transgenic APP mice. A reduction in plasma and brain cholesterol and

AA (omega-6) levels, as well as brain AHD (omega-3) levels was observed.

We obtained a significant difference between control and omega-3 enriched diet,

but we demonstrated a gender and genotype difference. Female transgenic APP

mice fed with omega-3 enriched diet were the ones with the better improvement

of all lipidic parameters, and they showed a tendency to reduce brain A -40

levels. These outcomes suggest the omega-3 enriched diet would work properly

in the pathology of AD if our animals should have reached 6 months of age.

In the studies realized with DOPET, we have demonstrated its capacity as a

neuroprotector in vitro and in vivo.

a. Because of its ability to cross the brain blood barrier.

Because of its antioxidant effect on C6 and hippocampal cells damaged by some

oxidants, and because DOPET avoided lipid peroxidation in vitro and in vivo.

b. Because DOPET improved the incidence of developing Multiple Sclerosis in

an EAE animal model.

c. Because DOPET inhibited LC5D, an enzyme implied in cholesterol

biosynthesis. Further on, DOPET reduced significantly plasma colesterol levels

and brain lathosterol in an atherogenic model in rabbit.

d. Because its capacity to inhibit MAO in vitro and in vivo.

I. INTRODUCCIÓN

Capítulo I. Introducción 53

I.1. Neurodegeneración.

I.1.1. Concepto.

La neurodegeneración es un proceso multifactorial que conduce a la muerte de

neuronas, mediante la ejecución de una serie de reacciones tóxicas, incluyendo

inflamación, neurotoxicidad glutamatérgica, incremento de hierro y óxido

nítrico, eliminación de antioxidantes endógenos, reducción en la expresión de

factores tróficos, disfunción del sistema ubiquitín-proteasoma, y expresión de

proteínas pro-apoptóticas (Mandel and Youdim, 2004).

I.1.2. Estrés oxidativo.

El daño oxidativo que sufren las biomoléculas neuronales, la acumulación de

hierro en regiones específicas del cerebro, y los procesos inflamatorios

combinados con la proliferación de microglía reactiva, son algunos de los

principales aspectos patológicos asociados con el envejecimiento y algunas

enfermedades neurodegenerativas.

El cerebro es particularmente sensible al daño oxidativo, en base a su elevada

tasa de consumo de oxígeno acoplada a los bajos niveles de mecanismos de

defensa antioxidantes, como el glutatión y un elevado contenido en ácidos

grasos poliinsaturados (AGPIs) en las membranas, que son fácilmente

oxidables. La acumulación de daño oxidativo se relaciona con el envejecimiento

y los radicales libres están implicados, directa o indirectamente, en la

patogénesis de numerosas enfermedades neurodegenerativas asociadas con el

envejecimiento, como la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de

Parkinson (EP) (Christen, 2000; Owen, 1996).

Capítulo I. Introducción 54

Figura I.1.: Teoría de la oxidación en la EA. El proceso normal de

envejecimiento, unido a ciertas mutaciones en los genes determinantes de la EA

llevaría a la exacerbación en la producción de péptido A , causante del incremento

en la generación de las especies reactivas de oxígeno (EROs) responsables del daño

final a las neuronas.

El oxígeno es imprescindible para la vida pero, paradójicamente, su

metabolismo produce las denominadas especies reactivas de oxígeno (EROs) de

elevada toxicidad para las células. Entre las EROs figuran los radicales libres,

que contienen electrones altamente reactivos desapareados como los radicales

superóxido, el radical hidroxilo, el óxido nítrico, peróxido de hidrógeno y

peroxinitrito. Todos estas especies son redox-activas y pueden interaccionar con

componentes celulares, como las proteínas (ej: afectando su estructura y

función), lípidos (ej: generando peroxidación lipídica de los ácidos grasos

insaturados) y ADN (ej: provocando mutaciones genéticas). Están implicados en

Capítulo I. Introducción 55

numerosas patologías como la EA, la EP, isquemia, trauma cerebral y la

esclerosis múltiple (EM).

Por su elevada tasa metabólica y su reducida capacidad para la regeneración

celular, el cerebro es el órgano más susceptible al daño provocado por las EROs,

que suele derivar en muerte celular o daño irreversible. Determinados

marcadores de peroxidación lipídica (ej: malondialdehido), han sido

identificados en el hipocampo de pacientes de la EA y en la sustancia negra de

pacientes con la EP, demostrando el elevado índice de EROs en las principales

regiones afectadas por la patología (Butterfield, 2002a; Hensley, 1998). La

evidente implicación del estrés oxidativo en estas enfermedades no prueba que

esté implicado en neurodegeneración. La interacción entre varios de estos

componentes no ha de ser necesariamente una cascada sino que puede cursar a

modo de ciclo de sucesos, donde el estrés oxidativo desempeña un papel

primordial (Andersen, 2004).

Entre los procesos que generan radicales libres de oxígeno, encontramos rutas

metabólicas de ácido araquidónico, óxido nítrico y péptido beta amiloide (A )

(Ayasolla et al., 2004).

I.1.3. Marcadores de estrés oxidativo.

I.1.3.1. Malondialdehido (MDA).

Los marcadores de estrés oxidativo pueden proveer una herramienta potente

para evaluar la progresión de la enfermedad estudiada y el tratamiento

aplicable en tal caso. Uno de estos marcadores, el MDA, se forma a partir de

la ruptura de endoperóxidos durante las últimas etapas de oxidación de los

AGPIs, principalmente de aquéllos que contienen tres o más dobles enlaces.

El MDA reacciona con grupos amino primarios de moléculas biológicas por lo

que aparece tanto in vivo como aldehído libre o aducto con otros

componentes celulares (Marnett, 1999). El método más común para

determinar el MDA (libre o asociado), es un procedimiento colorimétrico que

Capítulo I. Introducción 56

detecta la reacción con ácido tiobarbitúrico (AT), en base a que el MDA

pertenece al grupo de sustancias reactivas de AT in vivo (SRAT).

Recientemente se han correlacionado los niveles de MDA con el desarrollo de

la EA, en base al genotipo de la apoliproteína E (ApoE) del paciente. Los

estudios post-mortem han revelado un incremento en los niveles del MDA en

el hipocampo, corteza piriforme y amígdala, y cortezas temporal, frontal,

parietal y occipital (DiCiero, 2000).

I.1.3.2. Sustancias reactivas con ácido tiobarbitúrico (SRAT).

Los SRAT son una medida de peroxidación lipídica no específica (Butterfield,

2002b). Hay cierta controversia en relación a la zona con un mayor

incremento de SRAT en la EA. Mientras que algunos estudios encuentran ese

aumento en el lóbulo frontal y no en el cerebelo, otros lo detectan en las

cortezas occipital y sensorial. Únicamente el lóbulo parietal inferior parece

verse afectado por lipooxidación en un estudio, mientras que otros aportan

datos significativos de afectación en hipocampo y corteza (Lovell, 1995).

I.1.4. Modelo animal de estrés oxidativo: Ácido kaínico.

La muerte neuronal es un marcador de numerosas enfermedades

neurodegenerativas, como la EA, la EP y la corea de Huntington. La pérdida

de la función cerebral, causada por neurodegeneración, afecta a millones de

personas cada año y supone una de las causas primarias de discapacidad de

larga duración. Estudios recientes sobre el mecanismo de

neurodegeneración han confirmado que, en numerosas ocasiones, la muerte

neuronal comienza mediante la sobreexcitación de neuronas en respuesta a

la acumulación extracelular de elevados niveles de glutamato, un

aminoácido excitatorio (Lipton, 1994). Este mecanismo de

neurodegeneración se denomina excitotoxicidad.

Entre los numerosos mecanismos que intervienen en la degeneración

excitotóxica, un proceso que se asocia con muerte celular tras un ataque

Capítulo I. Introducción 57

isquémico o epiléptico, es la ruptura de la barrera hematoencefálica (BHE),

permitiendo así la entrada de las proteínas plasmáticas al parénquima cerebral.

Numerosas patologías implican la afectación de la BHE, como los tumores

cerebrales y la EM (Roelcke, 1995). En contraposición a lo esperado, los

estudios in vivo para comprobar la relación entre el daño neuronal y la ruptura

de la BHE, han confirmado que se trata de dos procesos independientes, en que

la apertura de la BHE sucede tras la muerte neuronal y las proteínas

plasmáticas, consecuentemente, no iniciarían la degeneración (Chen, 1999).

A B

Figura I.2.: Excitotoxicidad en una terminal sináptica tras una

isquemia. Un proceso isquémico supone el bloqueo de los vasos que riegan el

cerebro, y con ello el cese de oxígeno en las neuronas. Esto desencadena la

sobreexcitación de la neurona dañada, en la que el intercambio normal de iones a

través de los receptores de glutamato de la membrana plasmática (A) se altera

generando un liberación excesiva de Ca2+, rompiendo la homeostasis del calcio y

activando así una cascada de enzimas capaces de destruir la membrana de la

neurona, y por tanto a la célula (B).

En base al concepto de excitotoxicidad, se establece un modelo que induce

neurodegeneración en el sistema nervioso central (SNC) de manera similar a

la observada en varias patologías, generada mediante la inyección de un

agonista del receptor del glutamato, el ácido kaínico (AK). El AK fue aislado

Capítulo I. Introducción 58

del alga roja Digenea simplex y utilizado como agente anti-ascaridiasis en

Japón tras la guerra. Comenzó a ser utilizado desde 1970, cuando se

describió su potente actuación como neurotoxina en el SNC de mamíferos

(Shinozaki, 1970). Las inyecciones locales de AK provocan lesiones axonales

y provocan convulsiones cuando es aplicado sistemáticamente en algún área

del sistema límbico cerebral. Aparte de estos efectos directos, la

administración de AK ejerce lesiones secundarias distantes en otras regiones

cerebrales, notablemente en hipocampo, corteza piriforme y la amígdala

(Schwob, 1980).

La principal característica de AK en relación con la epilepsia, es su potencial

para inducir un síndrome con un estado epiléptico agudo de origen límbico,

con el subsecuente daño neuronal cerebral similar al contemplado en la

epilepsia del lóbulo temporal en humanos.

La aplicación de AK conlleva un patrón de daño neuronal en la formación

hipocampal, con especial afectación en las células piramidales de la región

CA3 y las interneuronas del hilo del giro dentado. La degeneración neuronal

permanece durante meses, llevando a la contracción masiva del hipocampo y

de la amígdala, corteza piriforme y áreas de la corteza entorrinal (Baran,

1988).

I.1.5. Neuroinflamación.

Numerosas enfermedades neurológicas, incluyendo la EA, la EP y la EM,

comparten una característica patológica fundamental, como es la serie de

reacciones inflamatorias atípicas. La neuroinflamación puede ser tanto causa

como consecuencia del estrés oxidativo crónico.

En el caso de la EA, parece que se trata de un lazo de retroalimentación, en

que la patología provoca una activación de la microglía y una mayor

producción de citoquinas pro-inflamatorias, que a continuación estimulan la

generación de A , que a su vez es capaz de activar varias rutas inflamatorias.

Los estudios realizados en pacientes de la EA, mediante la administración de

drogas anti-inflamatorias no-esteroideas, revelan que los tratamientos debe

Capítulo I. Introducción 59

realizarse antes de la aparición de los síntomas clínicos a los grupos de mayor

riesgo y al menos durante un período de dos años para conseguir que el

tratamiento sea eficaz (Mhatre, 2004).

Capítulo I. Introducción 60

I.2. Enfermedades neurodegenerativas.

I.2.1. Concepto.

Las enfermedades neurodegenerativas incluyen un grupo de enfermedades

de causa desconocida y que contienen como atributo común el curso

progresivo de los síntomas, reflejo de la desintegración paulatina de una

parte o partes del SNC. Todas ellas presentan algunas características clínicas

comunes, en cuanto a que su inicio es insidioso, y su curso progresivo, sin

remisiones. No tienen un tratamiento etiológico y las actuaciones

terapéuticas son sintomáticas en algunos casos y paliativas en todos ellos.

Las repercusiones socioeconómicas son muy importantes, pues al propio

proceso de la enfermedad hay que sumar el impacto psíquico, la merma en la

calidad de vida, la incapacidad laboral, la pérdida de las habilidades sociales,

la carga física y psíquica de los cuidadores de estos pacientes y el enorme

gasto económico que conlleva la atención social y sanitaria de todas estas

personas (Sáenz de Pipaón). Actualmente, las enfermedades degenerativas

del cerebro son las más comunes y las que mayor coste sanitario suponen

para la sociedad.

El estudio de las enfermedades neurodegenerativas de origen esporádico y

familial en la última década y la identificación de mutaciones en ciertos

genes, han permitido la caracterización de numerosos rasgos distintivos de

las lesiones cerebrales propias de estas patologías.

Una serie de factores de riesgo ambientales y de comportamiento se han

propuesto para cada enfermedad, aunque aún hoy día la mayoría de estas

asociaciones carecen de consistencia y especificidad.

Capítulo I. Introducción 61

I.2.2. Enfermedad de Alzheimer (EA).

I.2.2.1. Origen de la EA.

Esquirol y Pinel hicieron una descripción apropiada del cuadro clínico de la

demencia. Las placas neuríticas (PN) fueron descritas en Paris en 1892 en un

caso de epilepsia y posteriormente en Praga en pacientes con demencia.

Durante muchos años se pensó que la EA era una entidad clínico-patológica

con muy pocas excepciones que no se ajustaban a un mismo patrón.

Actualmente, se sabe que la EA es heterogénea en diversos aspectos. Estas

diferentes etiologías están basadas en un proceso patofisiológico común,

consistente en un incremento en la deposición de péptido beta amiloide (A )

(Hyman, 1996).

Figura I.3.: Regiones cerebrales afectadas en la EA. Tanto la corteza como

regiones internas (hipocampo, amigdala) resultan alteradas en el transcurso de la

patología.

Capítulo I. Introducción 62

I.2.2.2. Incidencia de la EA.

Actualmente se calcula en unos 200 millones el número de personas afectadas

por esta patología en el mundo. Es una patología que afecta a personas de

ambos sexos, aunque de mayor prevalencia en mujeres, que sólo en España

afecta a más de 450.000 personas y se calcula que esta cifra podría duplicarse

en el año 2020. Entre ellas, un 64% son mujeres y un 36% hombres. Un 10% no

reciben tratamiento y un 90% de los enfermos españoles se hayan aún sin

diagnosticar. Es la cuarta causa de muerte en España, su incidencia es del 1% y

su prevalencia del 1.5% entre personas de 60 a 70 años y del 20% en mayores de

85 años.

En personas que padecen síndrome de Down, se estima que el 25% pueden

mostrar signos y síntomas de demencia tipo Alzheimer a partir de los 35-40

años. El porcentaje aumenta con la edad, de modo que en la década de los

sesenta el porcentaje alcanza cifras que son muy variables según las diversas

estadísticas.

Capítulo I. Introducción 63

I.2.2.3. Neuropatofisiología de la EA.

La demencia es un síndrome común a una variedad de enfermedades que

afectan, directa o indirectamente, al SNC. La causa más frecuente de

demencia es la EA, una degeneración primaria del SNC cuyo diagnóstico

definitivo suele hacerse post mortem por la presencia de hallazgos

neuropatológicos y neuroquímicos característicos.

La demencia se caracteriza por un deterioro cognitivo, por lo general

irreversible y progresivo, que compromete a la memoria a corto y largo plazo,

el lenguaje, el reconocimiento de objetos y las funciones ejecutivas. Durante

el proceso normal de envejecimiento, tiene lugar un desequilibrio entre

neuropéptidos y hormonas en las neuronas sometidas a estrés metabólico

(Heininger, 1999). Las demencias plantean un problema epidemiológico de

escala mundial, sobre todo en los países desarrollados, debido al

envejecimiento considerable y progresivo de su población.

En un cerebro normal envejecido, encontramos tanto el péptido A , como las

PS, proteína tau-hiperfosforilada (P-tau) y los ovillos neurofibrilares (ON), lo

que sugiere que su producción es independiente y podrían suponer un estado

preclínico de la enfermedad (Price and Morris, 1999). Estos procesos no son

específicos para la EA y únicamente con algunos factores cuantitativos y

cualitativos adicionales, identificados como factores epidemiológicos de

riesgo, estos procesos relacionados con la edad, pueden conducir al

desarrollo de marcadores patomorfológicos de la EA.

A pesar de los adelantos en la patogenia de la EA, su etiología es aún

desconocida. Una de las hipótesis planteadas es que sea provocada por virus

lentos o priones, en base a la similitud de manifestaciones clínicas, los

hallazgos neuropatológicos y la semejanza histoquímica y ultraestructural

entre priones y depósitos de amiloide, mientras que otros estudios la

relacionan con herpesvirus (Castellani, 2004; Itzhaki, 2004).

Capítulo I. Introducción 64

I.2.2.4. Cambios estructurales en la EA.

La atrofia cerebral observada macroscópicamente en los pacientes con esta

enfermedad, hizo pensar inicialmente que se trataba de un proceso de

degeneración difusa del cerebro.

Pero actualmente se sabe que afecta a las áreas

de asociación y a los circuitos neuronales de

la corteza límbica mientras que algunas áreas

del cerebro permanecen intactas (Stein, 1998).

Además se observa un ensanchamiento de los ventrículos,

aumento del líquido cefalorraquídeo y disminución de sustancia blanca.

Neuropatológicamente, la EA se caracteriza por una serie de eventos

espaciales y temporales, que comprometen secuencialmente al prosencéfalo

basal, corteza entorrinal, hipocampo, amígdala y áreas de asociación cortical

(Braak, 1997). La patología de tipo Alzheimer cursa con depósitos difusos de

A , pérdida neuronal por necrosis y apoptosis, gliosis, distrofia, y activación y

agrupamiento de la microglía dentro de las PN (Calhoun, 1998; Hsiao et al.,

1996; Moechars, 1999).

Mientras que en general el tamaño de las neuronas puede ser un marcador

para la degeneración, las largas neuronas piramidales hipocampales de la

región CA3 parecen ser relativamente más resistentes a la neurodegeneración,

indicando que la vulnerabilidad es determinada por algo más que meramente

el tamaño y la morfología celular. Los marcadores neuronales que destinan a

las células a la degeneración en la EA, incluyen:

a) Equipamiento concreto de proteín-kinasas.

b) Elevados niveles de proteínas de los neurofilamentos.

c) Expresión de la isoforma de tau y del ARNm de tau bajo estrés celular

(Morrison, 1998).

d) Marcada activación de varias catepsinas proteinasas pertenecientes al

sistema endosoma-lisosomal.

e) Incremento de la actividad del intercambiador Na+/Ca2+ en corteza

frontal y temporal

Capítulo I. Introducción 65

f) Disminución en la función de los canales de Ca2+ y el tipo de calbindina

expresada en estas células

g) Abundancia relativa de pro- y anti-apoptóticos y la intrínseca

maquinaria de muerte celular programada (Cataldo and Paskevich, 1998;

Sagara and Schubert, 1998). En el hipocampo, las capas CA1 y CA3 son

particularmente vulnerables a isquemia, trauma, epilepsia y EA.

Los cambios neuroquímicos en la corteza de pacientes con EA se asocian con: a)

pérdida de neuronas colinérgicas en el prosencéfalo basal, correlacionado con la

reducción cortical de la enzima colina-acetil-transferasa; b) mayor densidad de

ovillos neurofibrilares (ON); c) mayor severidad clínica de la demencia; d)

pérdida de estructuras presinápticas; e) aumento del número de receptores

colinérgicos por célula, como posible mecanismo de compensación a la

denervación y f) disminución de la cantidad total de receptores colinérgicos de

tipo muscarínico y nicotínico en la población, lo que supone la pérdida de

neuronas.

I.2.2.4.1. Placas neuríticas (PN).

Las PN son lesiones extracelulares, esféricas, que contienen depósitos del

péptido A y pueden presentarse en un espectro de configuraciones que va

desde las PN difusas hasta las PN maduras, en función de los tipos celulares que

presenten.

En el cerebro de pacientes con la EA,

la frecuencia de PN maduras es

significativamente mayor que en los

individuos no demenciados de la

misma edad y su densidad se

correlaciona positivamente con la

severidad de la demencia.

En la región que rodea a la PN, se producen procesos de inflamación asociados a

una activación de la microglía. Además, la inflamación parece estar asociada a la

Capítulo I. Introducción 66

formación de radicales libres, estrés oxidativo, trastornos en la homeostasis del

calcio y a trastornos de la membrana mitocondrial, procesos que contribuirán

en la muerte neuronal (Nagy et al., 1996).

I.2.2.4.2. Ovillos neurofibrilares (ON).

Los ON son acúmulos intraneuronales de haces de fibras helicoidales apareadas.

Estas fibras están constituidas por formas insolubles (hiperfosforiladas y/o

ubicuitinizadas) de la proteína asociada a microtúbulos de tipo tau. Su

frecuencia es marcadamente mayor en pacientes con la EA, su número aumenta

conforme progresa la enfermedad

y su densidad se correlaciona positivamente con la severidad del deterioro

cognitivo, posiblemente a consecuencia de la relación entre la muerte y la

disfunción neuronal.

En efecto, la presencia de ON en el

hipocampo se correlaciona con la magnitud

del deterioro de la memoria, mientras que su

presencia en la corteza de asociación se

correlaciona con la magnitud del deterioro

cognitivo total. (Dani, 1997).

Capítulo I. Introducción 67

I.2.2.5.Estrés oxidativo en la EA.

Numerosas evidencias relacionan al estrés oxidativo con la patofisiología de la

EA (Markesbery, 1997).

El equilibrio entre la actividad oxidativa ejercida por los oxidantes (EROs y

metales de transición) y por los antioxidantes (superóxido dismutasa (SOD),

catalasa (CAT), glutatión superóxido dismutasa (GSD) y vitaminas E, C y A)

determina la susceptibilidad de los tejidos al daño oxidativo (McCord, 1993).

Sin embargo, el patrón de expresión de las enzimas antioxidantes como SOD,

GSD y CAT en el cerebro de pacientes de la EA no es consistente. La actividad

SOD en líquido cefalorraquídeo (LCR) y eritrocitos aparece incrementada y

reducida a nivel plasmático (Rinaldi et al., 2003).

La implicación del estrés oxidativo en la patogénesis de la EA es evidente por

las siguientes razones:

a) Las neuronas son particularmente sensibles a los radicales libres, por

su reducido contenido en glutatión (importante antioxidante natural) y su

elevado contenido en AGPIs en sus membranas (Prasad et al., 1998).

b) El envejecimiento es el principal factor de riesgo de la EA, y algunas

EROs pueden acumularse durante años (Benzi, 1995).

c) Estudios post-mortem de cerebros de la EA revelan numerosos

marcadores de estrés oxidativo, tales como: formación de proteín carbonilos

en el lóbulo parietal inferior e hipocampo, peroxidación lipídica, nitración y

oxidación proteica y daño al ADN nuclear y mitocondrial, aunque existe cierta

controversia a este respecto (Hayn, 1996; Lovell et al., 1997; Lyras et al.,

1997). Una posible explicación a esta inconsistencia podría encontrarse en el

genotipo apo E, de modo que aquéllos individuos portadores del alelo 4

serían más susceptibles a la

peroxidación (Ramassamy, 1998).

d) Los agentes capaces de eliminar radicales libres, reducen la toxicidad

generada por A . Estudios in vivo indican que el estrés oxidativo puede

promover la patogénesis de la EA, apoyando la fiabilidad de los

Capítulo I. Introducción 68

enfoques terapéuticos basados en antioxidantes. La peroxidación lipídica

causada por A en las membranas de las células cerebrales, es inhibida por la

suplementación con antioxidantes, que protege tanto de la neurotoxicidad

causada por A extracelular como del estrés oxidativo inducido por la

acumulación intracelular de A (Butterfield, 1994; Ohyagi, 2000).

Figura I.4: Compendio de factores que desencadenan estrés oxidativo.

e) La EA cursa con anomalías mitocondriales, que podrían explicar las

alteraciones en la producción de radicales libres (Beal, 1995).

f) Estudios clínicos con vitamina E y selegilina (inhibidor de la enzima

monoamino oxidasa-B) en pacientes de la EA mostraron una significativa

reducción del proceso patogénico (Sano, 1997).

g) Estudios inmunohistoquímicos han localizado una mayor actividad Cu-Zn-

SOD, Mn-SOD, CAT, ferritina y transferrina en PN y ON (Connor, 1992).

Cada vez son mayores las evidencias que sugieren que las perturbaciones en los

sistemas que emplean L-glutamato, están detrás de numerosos mecanismos

patogénicos entre los que cuentan la hipoxia-isquémica,

epilepsia y enfermedades neurodegenerativas crónicas, como la corea de

Huntington y la EA. Prácticamente la totalidad de las neuronas del SNC llevan

Capítulo I. Introducción 69

el subtipo NMDA de los receptores ionotrópicos de L-glutamato, mediador del

influjo de Ca2+ post-sináptico. La excesiva activación de los receptores de

NMDA por efecto de la excitotoxicidad, puede incrementar la vulnerabilidad

de las neuronas como consecuencia de la alteración en la distribución regional

de los subtipos de receptores de NMDA (Hynd, 2004).

Estudios recientes en ratones transgénicos de la EA, muestran el papel

protector que ejerce la proteína precursora del amiloide (PPA) contra el daño

excitotóxico en neuronas, mediante la regulación de la función de los

transportadores gliales de glutamato, lo que se traduce en una mayor

susceptibilidad a la toxicidad asociada al glutamato, al igual que en pacientes

de la EA (Masliah, 2000).

I.2.2.6. Genética de la EA.

En la etiología de la EA encontramos una paradigmática interacción “genes-

ambiente” que contribuye a la manifestación de la enfermedad. Numerosos

estudios epidemiológicos han demostrado que una historia familial positiva es

un factor de riesgo para la EA (Mendez, 1992).

Desde hace más de 10 años parece claro que la EA, en humanos, está causada

por unas 100 mutaciones de alta penetrancia autosómicas dominantes en tres

genes: PPA, presenilina 1 (PS1) y presenilina 2 (PS2) (Chartier-Harlin, 1991;

Hardy, 1997).

La forma familial de la EA (EAF) supone entre un 4-8% de todos los casos,

causada por mutaciones en PS1 en la mayoría de los casos. Las mutaciones en

PPA comprometen a un porcentaje pequeño pero significativo de los casos,

mientras que las mutaciones en PS2 son raras y no completamente penetrantes

(Sherrington, 1996). La posibilidad de utilizar las mutaciones de la EAF para

estudiar el 92-96% de los casos de la EA de

causa genética por definir, se refuerza con la observación de que la EAF aparece

de manera idéntica a los casos esporádicos de la EA, excepto que EAF suele

iniciarse antes de los 60 años de edad.

Capítulo I. Introducción 70

Adicionalmente, la forma más común de la enfermedad, de inicio tardío, se he

relacionado con un polimorfismo en el gen de la ApoE, que incrementa la

susceptibilidad a la patología. El alelo 4 de ApoE, localizado en el cromosoma

19, incrementa de 5 a 8 veces el riesgo de desarrollar la forma familiar y la forma

esporádica de la enfermedad (Soininen, 1996).

Estudios recientes revelan que estos cuatro genes únicamente provocan el 30%

de las variantes genéticas de EA y que deben existir otros factores genéticos

implicados, aún por identificar (Tanzi and Bertram, 2001).

En la tabla I.1. se resumen las alteraciones genéticas en la EA y sus efectos en

el metabolismo de A .

Capítulo I. Introducción 71

Cromosoma Producto Edad comienzo Efecto

21 Mutación de

la PPA

Temprana Sobreproducción

A

14 Presenilina 1 Temprana Aumento

producción A 42

1 Presenilina 2 Temprana Aumento

producción A 42

19 APOE 4 Tardío/temprana Aumento

depósitos A

12 Proteína

relacionada

con receptor

de LBD

Temprana Intercede en el

efecto del alelo

APOE 4

6 HLA-A2 Temprana Regula el proceso

inflamatorio

17 Bleoximicina

hidroxilasa

Tardío/temprana Aumenta la

producción de

amiloide

LBD=lipoproteína de baja densidad. APOE=lipoproteína E. HLA=antígeno

humano de histocompatibilidad.

Tabla I.1.: Genes implicados en la patología de la EA.

I.2.2.6.1. Proteína precursora del amiloide (PPA).

El gen de la proteína precursora del amiloide (PPA) está albergado en el

cromosoma 21, crítico también para el desarrollo del síndrome de Down. El

péptido A es la pieza central en el puzzle que entraña la EA y el principal

constituyente de la angiopatía cerebral amiloidea. Se deposita en el centro de

las placas y resulta neurotóxico tanto in vitro como in vivo. Este fragmento

beta forma parte de una proteína mayor denominada PPA. Esta proteína está

implicada en la adhesión célula-célula y célula-matriz extracelular,

Capítulo I. Introducción 72

diferenciación neuronal, y plasticidad y estabilidad sináptica (Mattson et al.,

1997).

Es una molécula con varios dominios que contienen una única región

transmembrana, el extremo aminoterminal, que se extiende hacia el ambiente

extracelular y un corto extremo carboxiterminal que lo hace hacia el citosol

(Lamb, 1993). Se sobreexpresa en neuronas, astrocitos y células microgliales en

respuesta a multitud de factores de estrés celular, como daño axonal, la pérdida

de inervación y de factores tróficos, un choque térmico, procesos inflamatorios,

isquemia, hipoglucemia, trauma cerebral, excitotoxicidad, ataques epilépticos,

estrés oxidativo y envejecimiento (Wallace et al., 1993).

Las mutaciones que provocan los cambios típicos en cerebros afectados por la

EA, resultan en un procesado alternativo de PPA, incrementando la producción

de A en las neuronas y células periféricas (Citron, 1994; Haass et al., 1994).

Aunque estas mutaciones son responsables de una pequeña fracción de los casos

de EAF, es evidente el valor de A en la etiología de la EA.

Las mutaciones autosómicas dominantes en PPA asociadas con EAF, se localizan

en torno a los lugares de procesado por y -secretasas. La denominada

mutación Swedish, en los aminoácidos 670 y 671 desde Lis-Met hasta Asp-Leu se

encuentra aguas arriba del lugar de procesado de la -secretasa y supone un

incremento de 5 a 8 veces en la formación tanto de A 40 como de A 42 (Citron

et al., 1992). Otras dos mutaciones diferentes en el aminoácido 717, la mutación

London, Val-Ile, y la mutación Indiana, Val-Fen, son adyacentes al lugar de

procesado e incrementan específicamente la producción de A 42 (Suzuki et al.,

1994).

Las mutaciones de PPA identificadas en los casos de EAF provocan un deterioro

de la plasticidad neuronal, en la que la extensión de las neuritas y la transmisión

sináptica son defectivas y por tanto podrían inducir alteraciones durante el

desarrollo cerebral (Hsia, 1999).

Capítulo I. Introducción 73

I.2.2.6.1.1. Rutas de procesado de PPA.

Existen dos rutas, mutuamente exclusivas, por las que PPA puede ser

metabolizada. La vía secretora (Fig I.5A), en la que la proteína es integrada en

la membrana plasmática del pericario y transportada a las membranas

sinápticas, donde es atacada por -y -secretasas, dentro del dominio A ,

liberando así al ectodominio soluble denominado -PPAs junto a un pequeño

fragmento denominado p3, lo que excluye la generación de A (Bayer et al.,

2001). La secreción requiere la maduración completa de PPA en el retículo

endoplásmico y aparato de Golgi.

Por otro lado, mediante la llamada vía amiloidogénica (Fig I.5.B y I.5.C), la

proteína es procesada en primer lugar por una -secretasa en la parte más

distal dentro de la molécula, generando un fragmento C-terminal de 12 kDa

que es procesado a continuación por una -secretasa, produciendo un péptido

hidrofóbico de 39 a 43 residuos, denominado A , que comprende entre 11 a 15

aminoácidos de la región transmembrana y los 28 residuos animoterminales

de la misma. Estas variantes de A son segregadas constitutivamente por

células con actividad metabólica normal y se encuentran en el plasma y el

líquido cefalorraquideo (LCR) de mamíferos sanos (incluído el hombre). El

péptido A secretado tiende a agregarse, formando oligómeros anfifílicos que,

superando ciertas concentraciones críticas, tienden a depositarse en los

tejidos, especialmente aquéllos formados por el A 42 (Selkoe, 2001). El 90%

de los péptidos A en cerebro son del tipo A 40, y el 10% restante lo

constituyen los más fibrilogénicos A 42/43.

Capítulo I. Introducción 74

Figura I.5: Rutas de procesado de PPA: El procesado de PPA está dividido en dos

rutas: la vía no-amiloidogénica alfa, en la que PPA es procesada por una -secretasa,

evitando la producción de A . Sin embargo, en la via amiloidogénica, PPA es cortada

por - y -secretasas que conducen a la liberación del péptido A . Recientemente, la -

secretasa se ha identificado como una BACE/Asp2 (enzima de procesado de PPA unida

a una proteasa de membrana ligada a aspártico) (Vassar et al., 1999). La PS1 actúa

directamente en el procesado por -secretasas.

El procesado de PPA es regulado mediante un ciclo celular-dependiente del

equilibrio entre fosforilación/desfosforilación (Gouras et al., 1998). Las

cascadas de fosforilación implican a la proteína kinasa C isoforma-específica,

proteína kinasa A, fosfolipasa A2, fosfoinositol, proteína kinasa activada por

mitógenos así como a la fosforilación de tirosina. Algunos de los factores

capaces de incrementar la liberación de PPAs incluyen la activación de

receptores de neurotransmisores (muscarínicos, nicotínicos, glutamato

metabotrópico y serotoninérgicos) al igual que de receptores de factores de

crecimiento, interleukinas, neuropéptidos y agentes como el

A (40-42)

PPA (770, 751, 695)

y secretasas

y secretasas

Vía amiloidogénica ( -PPAs)

Vía secretora ( -PPAs) C83

C99

P3

A)

B)

C)

Capítulo I. Introducción 75

ácido araquidónico (AA) (Mills and Reiner, 1999). La escasez de suministro

energético y la sobrecarga de Ca2+ inducen tanto el incremento en la

producción de PPA así como la ruta amiloidogénica de procesado de esta

proteína. Una mayor expresión de PPA y ciertas mutaciones dirigen a la

molécula desde la vía secretora hacia la amiloidogénica. Se ha demostrado

que situaciones de isquemia, hipoglucemia y trauma cerebral pueden inducir

una mayor producción de PPA y de su ARNm, tanto en modelos animales

como en cultivos celulares (Murakami et al., 1998).

In vivo, el estrés excitotóxico induce la expresión de PPA en la región que

rodea al corazón necrótico de las PN y favorece la producción de PPA en

astrocitos reactivos (Panegyres, 1998). La inhibición del metabolismo

energético de la mitocondria altera el procesado de PPA, para generar un

derivado potencialmente amiloidogénico. Inversamente, la función

mitocondrial puede verse comprometida por A , ya que en respuesta a una

falta de energía, el fallo mitocondrial se exacerbaría.

I.2.2.6.1.2. Efectos neurobiológicos de los metabolitos de

PPA.

Tanto PPA como -PPAs son neurotróficos de una manera parcialmente

isoforma-dependiente, completando así la “rama” neuroprotectora del lazo de

retroalimentación PPA-Ca2+. Son responsables del aumento de la

supervivencia neuronal, la extensión de las neuritas y el brote axonal in vitro

así como del incremento de la densidad sináptica y el desarrollo de la

memoria in vivo (Meziane et al., 1998). En la corteza de los ratones

transgénicos, la PPA humana tiene un efecto sinaptotrófico que reside en un

péptido de 17 aminoácidos (Yamamoto et al., 1994). Las -PPAs protegen

también frente al daño causado por hipoxia, isquemia y daño neuronal

excitotóxico atenuando la elevación de Ca2+ inducida por glutamato y

contrarrestando el efecto inhibidor del glutamato en el crecimiento de las

dendritas. La actividad excitoprotectora de las -PPAs

Capítulo I. Introducción 76

podría estar relacionada con la supresión directa de las corrientes de NMDA y

con el incremento de la re-captación de glutamato por parte de los astrocitos en

base a una mayor producción de la proteína del transportador de glutamato

(Masliah et al., 1998).

Las acciones celulares de A han sido motivo de numerosos artículos (Mills and

Reiner, 1999). Le han sido atribuidos papeles neurotóxicos, neurotróficos o

neuromoduladores. Estudios in vitro y en menor medida in vivo han demostrado

las propiedades neurotóxicas de concentraciones muy bajas de A fibrilar,

mediadas por la disrupción de la homeostasis del Ca2+-energía redox.

Concentraciones aún menores de este péptido en estado soluble, resultan

neurotóxicas y neurotróficas. En base a estos hallazgos, se le atribuye un papel

patofisiológico en la EA.

I.2.2.7. Presenilinas (PS).

La presenilina-1 (PS1) y la presenilina-2 (PS2) están codificadas por los genes

albergados en los cromosomas 14 y 1, respectivamente, y se relacionan con el

desarrollo de la mitad de los casos de la EAF con una edad de comienzo en torno a

los 40 años (Hardy, 1997). El conocimiento sobre el papel que desempeñan las PS

está aún por completar, aunque ya se conoce que actúan en diferenciación

neuronal, plasticidad sináptica, supervivencia celular, apoptosis y modulación de

la excitabilidad neuronal, homeostasis del Ca2+ y transducción de señales (Capell

et al., 1997; Handler et al., 2000; Hartmann et al., 1997). Ambas PS están

localizadas en el retículo endoplasmático, aparato de Golgi y en estructuras

vesiculares del compartimiento somatodendrítico de las neuronas,

predominantemente en regiones vulnerables al desarrollo de la EA, donde se

expresan de manera coordinada (Culvenor et al., 1997). El procesado

endoproteolítico de las PS origina dos fragmentos proteicos y está regulado

durante el desarrollo (Thinakaran et al., 1996). La producción de PS incrementa

en respuesta a una serie de estresores metabólicos como la isquemia, trauma y la

EA. Por ejemplo, la expresión de la PS1 disminuye en el hipocampo de pacientes

Capítulo I. Introducción 77

con la EA pero la incrementa en la fracción libre de ovillos aunque no en las

neuronas que contienen ovillos (Giannakopoulos et al., 1997).

La disminución en la generación de la PS1 resulta en un menor crecimiento y

una mayor susceptibilidad a la apoptosis. Las PS interaccionan directamente

con PPA, incrementando la secreción de -PPAs y son necesarias para el

correcto procesado de PPA por -secretasas (Marambaud et al., 1998;

Weidemann et al., 2002).

Un claro ejemplo del papel que desempeña la PS1 lo refleja el modelo

transgénico de ratones mutantes para PS1, donde se encuentra deteriorada la

habilidad neuronal para diferenciarse, el crecimiento de las neuritas se reduce

y se altera la plasticidad sináptica a largo plazo en la región CA1 del

hipocampo (Dowjat et al., 1999). Los cerebros que portan PS1 mutante

exhiben un incremento masivo de deposición de A e incluso una patología

cerebral severa y mayores niveles plasmáticos de A (Tamaoka, 1998).

Evidencias recientes sugieren que PS1 podría ser una -secretasa (Wolfe,

1999). Los estudios de fotoafinidad indican que los inhibidores de -secretasa

se unen específicamente a PS1 y PS2, lo que indica que las PS podrían

contener el sitio activo para dicha actividad enzimática, aunque esta hipótesis

requiere confirmación (Li, 2000).

Los mutantes para PS1 y PS2 presentan un incremento significativo en la

expresión de PPA en los fibroblastos, una reducida producción y secreción de

-PPAs, un incremento en la acumulación y secreción de A 40 y A 42

intracelular en células transfectadas y ratones transgénicos de una manera

edad-dependiente (Borchelt et al., 1996; Duff et al., 1996; Marambaud et al.,

1998).

El papel que juegan las PS en la regulación de la apoptosis, puede ser

modulado por su procesado proteolítico dado que la generación de fragmentos

C-terminales de PS1 y PS2 retrasa la apoptosis mientras que las mutaciones de

PS1 y PS2, incrementan la vulnerabilidad a este proceso de muerte celular

programada (Guo et al., 1998; Vezina et al., 1999; Wolozin et al., 1996).

Capítulo I. Introducción 78

Figura I.6: Estructura molecular de las proteínas PS1 y PPA. Se indican los

lugares de procesado por las correspondientes enzimas ( -, -, y -secretasas).

En relación a la actuación de las PS en la homeostasis de Ca2+ en las neuronas,

puede estar mediada por las propiedades intrínsecas de los canales de Ca2+, por

unión y regulación de la actividad de la proteína G0 modulando las corrientes de

Ca2+ y favoreciendo las corrientes de los canales de K+ (Smine et al., 1998). Las

mutaciones de PS1 alteran la señalización y homeostasis del Ca2+, perturban la

función mitocondrial, favorecen la producción de radicales oxidativos en cultivos

de líneas celulares y sinaptosomas y sensibilizan a las neuronas a la apoptosis

(Begley et al., 1999).

Capítulo I. Introducción 79

Figura I.7.: Gráfico representativo de la molécula de PS2 anclada en la

membrana plasmática.

I.2.2.8. Modelos animales de la EA.

Antes de identificar las mutaciones genéticas que conducen a la EA, los

modelos animales se centraban en reproducir los aspectos más específicos de

la neuropatología, desde el daño neuronal hasta la depleción colinérgica.

Aunque informativos, estos modelos eran demasiado restringidos, por lo que

se crearon los modelos de ratones transgénicos, basados en la expresión de

genes mutantes de la EA en humano, que han demostrado ser perfectamente

válidos y enormemente explicativos (Campion, 2001). Modelos transgénicos

de ratón que expresan PPA mutante imitan algunas de las características

patológicas y comportamentales más prominentes en la EA (Hsiao, 1998;

Price, 1998).

Capítulo I. Introducción 80

El modelo animal de esta enfermedad cursa con un deterioro cognitivo,

anomalías tanto en la transmisión sináptica

como en la potenciación a largo-plazo, un incremento en los niveles cerebrales de

A , particularmente de A 42, y una reducción en los niveles de -PPAs,

disfunción mitocondrial y un mayor estrés oxidativo (Hsiao, 1998; Moechars,

1999; Pappolla, 1998).

I.2.2.8.1. Transgénicos de PPA.

El primer modelo transgénico de la EA sobreexpresaba PPA (no mutante), tanto

en su totalidad como en su forma amiloidogénica (Pearson, 1993). La

característica común en ambos modelos, era la no producción de placas frente a

una gran acumulación de A , fenómeno corroborado por la no formación de

placas a pesar de los elevados niveles de expresión de la PPA salvaje humana

(Mucke, 2000). Incluso la total expresión genómica de PPA en un ratón

transgénico YAC es insuficiente para producir la deposición hasta alcanzados

niveles muy elevados de A (Lamb, 1999). Otro factor crucial es la edad: todas las

líneas de ratón que sobreexpresan PPA son aparentemente normales al nacer,

pero comienzan a desarrollar la histopatología en torno a la mitad de período

vital de un ratón normal.

La distribución de placas no es uniforme en el cerebro de un ratón individual,

aunque la disposición regional es similar en todas las líneas de ratón. Es

significativo que ninguno de los modelos de ratón demuestra una

neurodegeneración comparable a la observada en la EA humana, quizás porque

no viven lo suficiente como para desarrollar la patología en su plenitud.

A nivel de comportamiento, la pérdida de memoria es uno de los primeros y más

prominentes rasgos en los modelos de roedor de EA, por lo que las pruebas para

este modelo se centran en aprendizaje y memoria.

Capítulo I. Introducción 81

Aunque es probable que la pérdida masiva de neuronas pueda afectar al déficit

de comportamiento, la función cognitiva también puede verse comprometida

con una moderada o nula pérdida neuronal. De hecho, los modelos

transgénicos de PPA presentan una acumulación de proteínas relacionadas con

la patología, que provocarían el déficit de aprendizaje y memoria en ausencia

de una pérdida celular significativa. Por tanto, parece plausible que las

alteraciones comportamentales podrían ser el resultado de alteraciones en la

fisiología sináptica (Campion, 2001).

I.2.2.8.2. Transgénicos de PS.

El gran número de modelos que sobreexpresa las mutaciones en la PS1, refleja

que estas mutaciones suponen la mayoría de los casos de la EAF. Aunque

estos modelos no reproducen exactamente la patología de la EA, la creciente

evidencia de que la PS1 es una -secretasa, sugiere que los mutantes PS1

suponen una importante herramienta en el desarrollo de tratamientos para la

EA.

Los cruces de mutantes PPA con mutantes PS1, resulta en animales que

producen una mayor cantidad de A que la generada por el transgénico

simple(Borchelt, 1997; MCGowan, 1999). A pesar de mostrar una temprana y

extensiva deposición de placas, no presentan una neurodegeneración

significativa en el hipocampo o corteza prefrontal.

I.2.2.9. Laberinto acuático de Morris (LAM).

El denominado laberinto acuático de Morris (LAM) fue descrito hace 20 años

como un dispositivo para el estudio del aprendizaje espacial y la memoria en

ratas y ratones de laboratorio (Morris, 1984). Los ratones desarrollan la

prueba de manera diferente a las ratas, aunque los autores indican que no se

debe a diferencias en las habilidades espaciales (Whishaw, 1996).

Capítulo I. Introducción 82

Entre los factores que afectan al resultado de la prueba, se encuentra el género y

la raza de los animales. En relación a la raza, encontramos resultados

contradictorios. Mientras que para algunos autores los ratones BALB/cByJ son

los que peor desarrollan el laberinto, argumentando su mayor sensibilidad al

estrés causado por esta prueba en relación a otras razas (Francis, 1995). Sin

embargo, estudios posteriores comparativos entre 4 razas de ratones, no

encuentran diferencias significativas entre los ratones C57BL/6 y los

BABL/cByJ, a pesar de ser los ratones negros los recomendados para este tipo de

prueba por considerar que poseen mejores habilidades visuales que los albinos

(Wehner, 1988, Royle, 1999 #1027).

En términos nutricionales, se ha demostrado una mejora en el déficit-edad

dependiente observado en el laberinto, mediante la suplementación con

extractos con actividad antioxidante así como en ratas alimentadas con AGPIs

omega-3 durante varias generaciones (Joseph, 1999).

El hipocampo es una estructura cerebral necesaria para la adquisición y

recuperación de la información espacial, al igual que para su consolidación y

almacenamiento. Prueba de ello es la inactivación hipocampal reversible

mediante la aplicación de un antagonista AMPA/Kainato que compromete

seriamente el desarrollo del LAM en ratas (Riedel, 1999). La aplicación de

antagonistas de receptores de aminoácidos excitatorios (ej: receptores de

NMDA; Kainato y AMPA) como compuestos capaces de influir en la capacidad

de aprender mediante el desarrollo de LAM en roedores, han demostrado jugar

un papel muy impotante en el aprendizaje espacial, variando su efecto en función

del momento de administración (antes o después del aprendizaje) (D´Hooge,

2001; Morris, 1994).

Capítulo I. Introducción 83

I.2.3. Enfermedad de Parkinson (EP).

I.2.3.1. Origen de la EP.

En 1817, James Parkinson publicó su famoso monográfico “ensayo sobre el

pulso tembloroso”. En este documento, describe una enfermedad

neurológica, conocida hoy como EP, consistente en un temblor de reposo y

una forma peculiar de discapacidad motora progresiva.

Durante décadas, desde el descubrimiento de la base patológica y

neuroquímica de la EP, se ha intentado entender su etiopatogenia a través de

un único mecanismo, implicándose sucesiva e incluso reiteradamente un

origen infeccioso, metabólico, tóxico o genético. Sin embargo es mucho más

probable un orígen multifactorial. El amplio espectro experimental y clínico

de factores y causas que provocan degeneración de la sustancia negra así lo

indica.

I.2.3.2. Incidencia de la EP.

Se estima que en España más de 500.000 personas padecen esta enfermedad,

se estima que aparecen unos 6.000 casos anuales con una ligera mayor

incidencia en los hombres. La prevalencia de la EP en países industrializados

se estima alrededor de un 3% de la población general y en torno a un 1% de la

población mayor de 60 años (de Rijk, 2000). Personas de todas las etnias

pueden verse afectadas y los hombres muestran mayor predisposición a la

enfermedad y la edad de inicio de la patología se sitúa entre el final de los 50 y

la primera mitad de los 60 (Inzelberg, 2002).

I.2.3.3. Neuropatofisiología de la EP.

El parkinsonismo describe un síndrome caracterizado por rigidez, temblor y

bradikinesia, del cual la EP es la principal causa y la enfermedad más

Capítulo I. Introducción 84

común que afecta a la función motora y movimiento. La patología es atribuida a

la pérdida selectiva de neuronas en la substantia nigra, dañando las

proyecciones dopaminérgicas desde la substantia nigra pars compacta hasta el

núcleo caudado y estriado, comprometiendo a los ganglios basales y

neoestratum. Además afecta a las neuronas motoras de la columna vertebral y

tronco cerebral, causando fragilidad muscular y debilitamiento, que puede ir

acompañada de demencia progresiva (Mayeux, 2003). Patológicamente, el

envejecimiento está asociado con la pérdida de neuronas pigmentadas en la

substantia nigra, pero en un patrón que difiere del contemplado en la EP

(McGeer, 1977).

Entre las neuronas que permanecen, se desarrollan los denominados cuerpos

intraneuronales de Lewy y las neuritas de Lewy. Los cuerpos de Lewy,

responsables de la mayoría de los síntomas no motores, no están confinados a la

substantia nigra, sino que aparecen en corteza, amígdala, locus coeruleus ,

núcleo vagal, y el sistema nervioso autonómico periférico (Braak, 2003).

Figura I.8.: Cuerpos de Lewy propios de la EP. Son estructuras eosinofílicas

presentes en el citoplasma de las neuronas. Normalmente son circulares, con un

núcleo proteínico denso rodeado de un halo periférico.

Capítulo I. Introducción 85

Los signos clínicos aparecen cuando se ha perdido tanto un 80% de la DA

estriatal como un 50% de las neuronas nigrales (Fearnley, 1991). Al igual que

en la EA, el diagnóstico definitivo de la EP idiopática se realiza en estudios

post-mortem.

Numerosos estudios parecen confirmar la naturaleza multifactorial de la

epidemiología de la EP, en la que el envejecimiento, factores ocupacionales,

ambientales y genéticos parecen influir en el riesgo de padecer la enfermedad

(Gorell et al., 2004).

Entre las características motoras asociadas a la EP, destacan el temblor de

reposo, rigidez y bradikinesia y entre los rasgos no-motores, la disfunción

autonómica, cambios cognitivos y psiquiátricos, síntomas sensoriales y

alteraciones del sueño (Samii et al., 2004).

El 40% de los individuos con la EP desarrolla demencia y el 50% presenta

depresión. Las similitudes clínicas, patológicas y genéticas entre la EP y la EA

sugieren que la ApoE podría estar implicada en la etiología de la EP (Wilson,

2000). Un par de estudios recientes relacionan la EP con esta lipoproteína,

aunque únicamente Parsian y colaboradores obtienen una asociación

significativa entre el alelo apo 4 y los pacientes de la EP con demencia

(Parsian, 2002).

Mientras que en la EA, el alelo apo 2 ejerce un papel neuroprotector

retrasando la edad de inicio de la patología, no existen evidencias de esa

asociación en el caso de la EP. Sin embargo, el alelo apo 4 parece ejercer el

mismo efecto en ambas patologías, incrementando el riesgo y disminuyendo la

edad de inicio de la enfermedad, aunque en la EP el efecto parece más

moderado que en la EA. En base a este hallazgo, parece lógico sugerir que la

patofisiología de la EA y de la EP podrían compartir ciertos elementos. De

hecho, los alelos apo parecen estar asociados de manera significativa con las

respuestas de las neuronas al estrés neurológico presente en la EA, la EM, la

esclerosis lateral amiotrófica y la EP (Li et al., 2004).

Capítulo I. Introducción 86

I.2.3.4. Dopamina y la EP.

Uno de los principales rasgos de la EP es la degeneración de las neuronas

dopaminérgicas del cerebro medio, que lleva a la total pérdida de la dopamina

cerebral (DA). Aunque las neuronas de DA son escasas (<1/100.000 neuronas

cerebrales), desempeñan un papel muy importante en la regulación del

comportamiento motor, del humor, de la motivación y de la memoria de trabajo

(Girault and Greengard, 2004).

La DA fue identificada como un neurotransmisor potencial en el cerebro a finales

de los 50s por Carlsson (Carlsson, 1959). Años después se comprobó que la EP

estaba acompañada de un descenso dramático en el contenido de DA de los

núcleos putamen y caudado, lo que condujo a la aplicación de levodopa, un

precursor metabólico de la DA, como terapia eficaz de remplazamiento para

aliviar los síntomas de la EP.

Figura I.9.: Degradación de la DA en las neuronas nigrostriatales. La

enzima mitocondrial MAO metaoliza la DA en la sustancia negra, favoreciendo la

pérdida de este neurotransmisor en las terminales nerviosas con la consecuente

pérdida de funciones motoras ligadas a la región nigroestriatal del cerebro.

Capítulo I. Introducción 87

Los cuerpos celulares de las neuronas de DA que inervan el núcleo caudado y

el putamen, están localizados en la denominada sustancia negra, mientras que

aquéllas que inervan el estriado ventral y la corteza prefrontal presentan una

localización más medial en el área tegmental ventral. La DA no es un simple

neurotransmisor excitatorio o inhibitorio, sino que se trata de un

neuromodulador que altera la respuesta de las neuronas diana a otros

neurotrasmisores en función del estado funcional en que se encuentren esas

neuronas. La DA también regula la actividad de los canales iónicos de voltaje,

tanto de Na+ como de Ca 2+, mediante la modulación del estado de

fosforilación de estos canales o de proteínas asociadas.

En el cerebro en desarrollo de los mamíferos, la DA contribuye a la

morfogénesis mediante la dirección de las células madre neurales. Estudios in

vitro e in vivo avalan la capacidad que posee la DA para regular la

neurogénesis durante la edad adulta, por lo que la pérdida de este

neurotransmisor en la EP afecta inexorablemente a la neurogénesis en estos

pacientes, que presentan una reducción en los precursores neuronales

(Hoglinger et al., 2004).

I.2.3.5. Mecanismo de neurodegeneración en la EP.

La neurodegeneración podría relacionarse con la disfunción mitocondrial,

estrés oxidativo, excitotoxicidad, apoptosis e inflamación. El descubrimiento

de las mutaciones en los genes que codifican para la -sinucleína, parkina y

ubiquitina C-terminal hidrolasa-1 en la variante familial de la EP, sugieren un

posible error en el sistema ubiquitín-proteosoma como vía final común en

neurodegeneración (McNaught, 2001).

La sustancia negra par compacta de los pacientes de la EP contiene

numerosas proteínas nitradas y oxidadas, resistentes a la degradación

proteosomal, lo que sugiere un incremento de la excitotoxicidad, aunque el

mecanismo exacto por el que tiene lugar la concentración anormal de

proteínas es aún desconocido (Halliwell, 1998).

Capítulo I. Introducción 88

I.2.3.6. Actividades enzimáticas implicadas en la EP:

Monoamino oxidasa (MAO).

La actividad enzimática mitocondrial denominada monoamino oxidasa (MAO)

regula los niveles intracelulares de aminas biogénicas (ej: neurotransmisores y

neurotoxinas) y la actividad neuronal en el SNC, eliminando el nitrógeno de los

grupos amino de las moléculas sobre las que actúa y protegiendo al organismo de

los efectos de las aminas dietarias activas farmacológicamente. Las dos

isoenzimas de MAO, A y B, inactivan catecolaminas como la DA, adrenalina,

noradrenalina e histamina, y parecen tener diferentes dominios de actividad en

el organismo. Ambas isoenzimas presentan diferentes sustratos y

especificaciones de inhibición, y están codificadas en dos genes del brazo corto

del cromosoma X. El tejido cerebral presenta ambos tipos de actividad, aunque

las neuronas adrenérgicas parecen presentar actividad MAO-A exclusivamente.

La MAO-A oxida preferentemente serotonina, y es inactivada irreversiblemente

por bajas concentraciones de clorgilina. La MAO-B oxida feniletilamina y es

inactivada irreversiblemente por pargilina y deprenil. La DA, tiramina y

triptamina son sustratos de ambas isoenzimas. La inhibición de la MAO-B se

asocia con la mejora en la actividad de la DA, al igual que con el descenso en la

producción de peróxido de hidrógeno (H2O2). Ambas actividades están mediadas

por diferentes moléculas enzimáticas y están reguladas independientemente por

factores endógenos y exógenos, incluyendo determinantes genéticos, hormonas,

y envejecimiento. En humanos, la inhibición de la actividad MAO-A se relaciona

con el tratamiento de la depresión, mientras que la baja actividad MAO-B puede

aliviar los síntomas y ralentizar la progresión de la EP (Pintar and Breakefield,

1982). La digestión normal de la DA por parte de la MAO-B, se lleva a cabo

mediante un proceso de desaminación de la DA para formar un aldehído, NH4 y

H2O2, la cual suele degradarse por acción de una glutatión peroxidasa, en

presencia de hierro, rompiéndose en radicales hidróxido que dañan las

membranas celulares. Por tanto, cuando se afectan las membranas de las

neuronas dopaminérgicas, se favorece el desarrollo de la EP.

Capítulo I. Introducción 89

I.2.4. Esclerosis múltiple (EM).

I.2.4.1. Origen de la EM.

Hace unos años, se propuso una hipótesis según la cual la EM se produciría

en las poblaciones con antecedentes escandinavos, a través de las invasiones

vikingas, que fueron más extensas de lo que se suele conocer y que llegaron

no sólo a Inglaterra, Irlanda, Islandia, Groenlandia o la zona más

septentrional de los EE.UU, sino a países situados al sur como Francia,

España, Italia, Grecia, Turquía, Rusia y parte de Asia (Poser, 1995).

I.2.4.2. Incidencia de la EM.

La Esclerosis Múltiple (EM) es la enfermedad neurológica crónica

desmielinizante primaria del SNC más frecuente en adultos jóvenes en Europa

y Norteamérica, a la que además se le atribuye un carácter autoinmune,

mediada por células Th1 CD4+ mielina-específicas, que culmina en

neurodegeneración (Croxford, 2003). En España se han completado 5

estudios que demuestran que se trata de una zona de riesgo medio-alto, con

cifras en torno a los 50 pacientes/100.000 habitantes, 3 nuevos

casos/100.000 habitantes/año y 0.35 fallecimientos/100.000 habitantes/año

(Fernandez, 1990).

Se expresa en sujetos genéticamente predispuestos sobre los que, por azar,

incidiría un factor ambiental desconocido, probablemente un virus, que

activaría un proceso inmune anormal, que originaría los fenómenos

inflamatorios y desmielinizantes propios de la enfermedad. La predisposición

genética es compleja, estando involucrados varios loci en su susceptibilidad.

Se han descrito focos y epidemias, que apoyan la existencia de un factor

ambiental.

Las mujeres están más afectadas por la EM, con una frecuencia doble a la de

los hombres. La enfermedad comienza al inicio de la edad adulta, con ataques

inflamatorios recurrentes contra la materia blanca del cerebro, causando una

Capítulo I. Introducción 90

miríada de daños neurológicos, incluyendo ceguera, pérdida de sensación y

coordinación, incontinencia de intestinos y vejiga, y dificultad para caminar.

Alrededor de un tercio de los pacientes que desarrollan la forma recaída-

remisión, evolucionan a una forma más crónica con una marcada

discapacidad.

I.2.4.3. Neuropatofisiología de la EM.

El principal marcador de la enfermedad es la placa, que es un área de mielina

que ha sido denudada por inflamación y marcada subsecuentemente por la

cicatrización de células no-neurales en el cerebro, incluyendo microglía

derivada de médula ósea y astroglía (Steinman, 2003).

La etiología de la EM es aún enigmática, aunque la mayoría de los

investigadores abogan porque el ataque inmune contra la materia blanca es

primordial, derivando en la degeneración de los axones y la mielina como

procesos secundarios de esa inflamación. Probablemente, el proceso inmune

presente en la EM sea una consecuencia y no la causa, que sería única y de

naturaleza infecciosa, basada en la evidencia epidemiológica que confiere a las

infecciones víricas la propiedad de iniciar/exacerbar la enfermedad clínica

(Olson, 2001). Las evidencias de una causa viral de la EM son indirectas, pues

no se ha logrado aislar de forma reproducible ningún virus ni partícula viral

en tejidos afectados por la enfermedad. Los virus implicados en la etiología de

esta enfermedad, incluyen virus del moquillo canino, virus del sarampión,

virus de varicela zoster, virus del herpes simple HHV6, virus de la encefalitis

por garrapatas y retrovirus Lm7 (Simon, 1996).

Capítulo I. Introducción 91

Numerosos grupos han analizado los polimorfismos en todo el genoma, para

determinar la conexión con la susceptibilidad a la EM (Dyment, 2002). De

todos estos estudios, se establece que los transcritos más abundantes en las

placas de EM, corresponden a la B-cristalina, prostaglandina D sintasa,

proteína de unión prostática, proteína ribosomal L17 y osteopontina. La

osteopontina debe ejercer funciones pleiotrópicas en la patogénesis de la

enfermedad desmielinizante. La producción de esta proteína por parte de las

células gliales puede atacar a las células Th1, y cuando es expresada por glía y

células ependimales, puede permitir que las células T penetren en el cerebro.

Recientemente se ha comprobado la capacidad de las neuronas para producir

esta molécula y participar en el proceso autoinmune.

I.2.4.3.1. Fase inflamatoria y fase neurodegenerativa de la

EM.

Las células T, las células B y las células presentadoras de antígenos,

incluyendo los macrófagos, entran en el SNC, donde secretan ciertas

citoquinas responsables del daño a la oligodendroglía, las células responsables

de fabricar la mielina que cubre los axones neuronales (ver figura I.11.). El

daño causado a la mielina afecta a la transmisión de los impulsos eléctricos.

Una vez que la BHE está quebrada, numerosas células inflamatorias pueden

penetrar y acumularse en la sustancia blanca. Dentro del cerebro, las células T

autorreactivas y los macrófagos que las acompañan, permiten la liberación de

moléculas capaces de dañar la capa de mielina, como la osteopontina,

interleukina-23, interferón-gamma y el factor de necrosis tumoral alfa (FNT-

). La presencia de osteopontina puede atraer a los linfocitos Th1

colaboradores. Concomitantemente, las células B producen anticuerpos

mielina-específicos, que interaccionan con el complejo terminal y la cascada

del complemento para generar complejos de ataque a la membrana que

continuan dañando a la oligodendroglía (Steinman, 2003).

Capítulo I. Introducción 92

Figura I.11.: Representación de las fases neurodegenerativa e

inflamatoria de la EM. La alteración conjunta de las células T y B, lleva a la

producción de sustancias químicas capaces de dañar el revestimiento de mielina de

los axones nerviosos del propio individuo.

I.2.4.4. Genética de la EM.

Los estudios genéticos de ligamiento y asociación han identificado al complejo

mayor de histocompatibilidad, como un determinante genético para la EM,

localizado en el brazo corto del cromosoma 6 (Compston, 1995). Este complejo

codifica los antígenos del sistema de histocompatibilidad que presentan los

antígenos peptídicos a las células T. La región clase II de este sistema, se asocia

fuertemente con la EM, en particular

Capítulo I. Introducción 93

con el alelo DR2 y su correspondiente haplotipo (DRB1*1501, DQA*0102,

DQB1*0602).

Los estudios familiares han permitido saber que la EM es entre 10 y 50 veces

más frecuente en los familiares de afectados por la enfermedad, que en la

población general, dependiendo del sexo. La transmisión recesiva ligada al

sexo, se elimina por la tasa mujer:hombre de 2:1 en los pacientes, mientras

que la herencia mitocondrial se elimina por la transmisión hombre-mujer. En

base a esto, se hipotetiza que en la EM existe un factor genético de

susceptibilidad, compatible con una herencia poligénica.

I.2.4.5. Modelos animales de la EM.

Uno de los modelos de la EM más utilizados en animales, es el de la

denominada encefalitis autoinmune experimental (EAE). El modelo de EAE

en marmotas, gracias a su similitud genética e inmunológica con el hombre,

provee de una plataforma experimental única para la investigación de los

mecanismos inmunopatogénicos básicos y para el desarrollo de tratamientos

más efectivos frente a la EM (t Hart et al., 2004).

Capítulo I. Introducción 94

I.3. Terapias.

La naturaleza multifactorial de la neurodegeneración, podría explicar por qué

únicamente un limitado número de terapias clínicas neuroprotectoras que

utilizan drogas simples, terminan avocadas a proporcionar resultados no

significativos. Por tanto, el objetivo principal en la investigación en

neurodegeneración y neuroprotección, es determinar cuales de esos factores

constituyen el evento primario, la secuencia en que dichos eventos se

desarrollan y si actúan en la ejecución de los procesos patogénicos.

Las estrategias de las terapias noveles neuroprotectoras apoyan la aplicación

de basureros de EROs, quelantes de metales de transición (ej: hierro y cobre),

drogas anti-inflamatorias no esteroideas, polifenoles antioxidantes naturales

no vitamínicos y drogas anti-apoptóticas.

I.3.1. Farmacología.

I.3.1.1. Aplicada a la EA.

I.3.1.1.1. Inhibidores de la Acetilcolinesterasa.

La pérdida de neuronas colinérgicas centrales del tronco cerebral basal fue la

primera observación bioquímica que se relacionó con la EA, y los déficits

colinérgicos se han relacionado directamente con la alteración en el procesado de

PPA (Roberson, 1997). Hasta la fecha, la única droga aprovada por la

Administración Federal de Drogas para el tratamiento sintomático de la EA, son

los inhibidores de acetilcolinesterasa, tacrina, donepezil, rivastigmina y

galantamina. Estos agentes no detienen la progresión, pero los estudios clínicos

han demostrado que estabilizan temporalmente el daño cognitivo y ayudan a

mantener la función global. Por tanto, las terapias que mejoran la función

colinérgica es probable que permanezcan en los regímenes de multidrogas.

Capítulo I. Introducción 95

I.3.1.1.2. Drogas anti-A .

La “hipótesis del amiloide”, que soporta la idea que el péptido A es el

principal responsable tanto de los casos familiares como esporádicos de la EA,

ha llevado a que la reducción en la generación, agregación y deposición de las

fibrillas de amiloide, constituya uno de los focos primordiales en el desarrollo

de drogas en la lucha contra la EA.

En este sentido, el uso de compuestos basados en difluorocetonas como

inhibidores de las -secretasas parece resultar una estrategia terapéutica de

utilidad. Entre las actuaciones más prometedoras que mejoran la eliminación

de A , figura la inmunización con A inyectado directamente en el modelo de

ratón PPA transgénico de la EA, que sobreproduce este péptido.

Pequeñas moléculas como el Congo rojo, algunos antibióticos y

antineoplásicos como la doxirubicina, previenen la toxicidad de A ,

posiblemente por la estabilización de los monómeros y la prevención de

oligomerización. Un antibiótico tan antiguo como el clioquinol, es efectivo

como interruptor de la fibrilación de A , aparentemente por su poder

quelante de hierro y de cinc (Cherny, 2001). Recientemente se ha descrito una

novedosa glicoproteína plasmática resistente a la proteolisis, denominada

proteína amiloide sérica, con capacidad para unirse a las fibrillas de A y

bloquear su degradación, desestabilizando los depósitos de A (Pepys, 2002).

La identificación de agentes capaces de eliminar esta proteína, favorecerían la

limpieza de los depósitos. El mejor candidato es el CPHP, un derivado

palindrómico de la prolina.

Capítulo I. Introducción 96

I.3.1.1.3. Agentes anti-inflamatorios.

Se ha observado una reducción en la frecuencia de la EA entre los individuos

tratados con drogas anti-inflamatorias no esteroideas, como el ibuprofeno, que

podrían actuar mediante la reducción de la cantidad de A 1-42 y/o alterando la

actividad -secretasa (Blasko, 2001; Weggen, 2001). Se ha asumido que el

mecanismo a través del cual actuarían las drogas anti-inflamatorios no

esteroideas, sería mediante la inhibición de la ciclooxigenasa (COX-1 y -2),

enzima implicada en la producción de mediadores de la respuesta inflamatoria.

Sin embargo, en este tipo de diana terapéutica hay que resaltar que hay

numerosas respuestas inflamatorias que son beneficiosas, lo que incrementa la

complejidad del desarrollo de nuevas drogas de este tipo.

I.3.1.1.4. Terapia hormonal sustitutoria.

El uso de estrógenos por mujeres post-menopáusicas, se relaciona con una

reducción en el riesgo de desarrollar la EA (Tang, 1996). Los estudios en modelos

animales parecen indicar que los estrógenos ejercerían un efecto anti-amiloide, a

través de la regulación del procesado de PPA a través de la vía amiloidogénica

(Greenfield, 2002).

I.3.1.1.5. Estatinas.

La asociación entre los agentes que reducen los niveles de colesterol en plasma

(inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa, HMG-CoA

reductasa) y la EA es positiva, disminuyendo el riesgo de iniciar la enfermedad

en algunos ensayos clínicos, posiblemente debido al papel de las lipoproteínas y

sus receptores en la limpieza de depósitos de A del cerebro, aunque su

efectividad necesita ser revisada y confirmada en futuros estudios (Fassbender et

al., 2002; Wolozin et al., 2000).

Capítulo I. Introducción 97

La eficacia de los AGPIs omega-3 en el tratamiento de la hipertrigliceridemia

es un hecho bien establecido (Harris, 1989). Pacientes con hiperlipidemia

combinada tratados con Pravastatina y AGPIs omega-3, muestran una

prometedora mejora a nivel de lípidos y lipoproteínas séricas. De manera

similar, se demuestra la efectividad de la administración de inhibidores de la

HMG-CoA reductasa combinados con ácido eicosapentaenoico (EPA),

mejorando el perfil lipídico de pacientes con hiperlipidemia (Nakamura et al.,

1999).

Los fármacos inhibidores de la enzima HMG-CoA reductasa, poseen un efecto

limitado en la reducción de los triglicéridos. La suplementación con AGPIs

omega-3 disminuye levemente el colesterol total sin incrementar el contenido

en lipoproteínas de baja densidad (LBD)-colesterol. Por tanto, cuando la

síntesis de colesterol es inhibida por las estatinas, los efectos de omega-3

favoreciendo la conversión de las lipoproteínas de muy baja densidad (LMBD)

en LBD se mantienen al margen (Lu et al., 1999).

I.3.1.1.6. Neurotransmisores: Acetilcolina (Ac).

La reducción de acetilcolina en torno a un 50%, está asociada con la pérdida

de neuronas sinápticas en un orden similar, identificando a los déficits

neuroquímicos con un reflejo de la desaparición neuronal. Los precursores de

Ac como la colina, han demostrado un beneficio a corto plazo en estudios de

demencias (Fioravanti, 1998). La administración de derivados de piridina, que

son agentes bloqueantes de canales de potasio, como la linopirdina o la

besipirdina, no son efectivos como liberadores de Ac. En cuanto a los

agonistas de receptores de Ac, como la xanomelina, sabcomelina, milamelina

y talsaclidina, presentan cierto beneficio pero están actualmente en fase

experimental. Agonistas nicotínicos como la galantamina, uno de los

inhibidores de la colinesterasa, ha demostrado ser eficaz en ensayos clínicos

mediante modulación alostérica.

Capítulo I. Introducción 98

I.3.1.1.7. Moduladores del receptor NMDA.

La excitotoxicidad provocada por la desrregulación de la actividad del

receptor NMDA, que provoca muerte neuronal, ha llevado al uso de

antioxidantes y desarrollo de moduladores efectivos de los receptores NMDA

para actuar sobre el daño neuronal.

La memantina es un antagonista no competitivo del receptor NMDA de

moderada afinidad, capaz de bloquear los canales del receptor NMDA en

estado de reposo, de manera similar al bloqueante fisiológico Mg2+,

disociándose del canal una vez activado. Esta capacidad para bloquear-

desbloquear tan rápidamente, priva a los pacientes de la EA de los efectos

secundarios asociados con los antagonistas de elevada afinidad. Los estudios

iniciales realizados en Estados Unidos, revelan un beneficio estadísticamente

significativo en pacientes con demencia moderada a severa (Rogawski, 2003).

Capítulo I. Introducción 99

I.3.1.2. Aplicada a la EP.

Los estudios realizados con agentes potencialmente neuroprotectores como la

vitamina E, selegilina (deprenil) y coenzima Q, ralentizan la progresión de la

enfermedad, aunque queda por verificar si se trata de un auténtico efecto

neuroprotector. Los ensayos con inhibidores de MAO-B selectivos han

provisto de evidencias suficientes para apoyar su acción como anti-depresivos,

posibles neuroprotectores y frente a la EP. La acción selectiva de estos

inhibidores sobre las formas específicas de MAO, resulta en la elevación de los

niveles de noradrenalina y serotonina (inhibición de MAO-A) y de DA y

feniletilamina (inhibición de MAO-B) (Shoulson, 2002). Los resultados de los

ensayos controlados con agonistas de DA frente a levodopa, indican que los

pacientes que comenzaron el tratamiento con tales agonistas mostraban una

tasa más lenta de pérdida de neuronas nigroestriatales con respecto a aquéllos

que recibieron levodopa. Sin embargo, la terapia con estos agonistas es eficaz

únicamente para tratar el primer par de años de la enfermedad. La levodopa

continúa siendo la droga antiparkinsoniana mas potente, a pesar de los

efectos colaterales (Luquin, 1992).

I.3.1.3. Aplicada a la EM.

El propósito más importante en cualquiera de los tratamientos terapéuticos de

la EM, es la prevención o pospuesta de la discapacidad a largo plazo.

Actualmente, los tratamientos disponibles son (revisados en (Goodin, 2002):

1) Inmunomoduladores: Interferon Beta, Cannabioides, Glatiramer

acetato.

2) Inmunosupresores: Ciclofosfamida, Metotrexato, Azatioprina,

Cladribina, Mitoxantrona.

3) Antiinflamatorios: Glucocorticoides

4) Otros: Inmonuglobulina intravenosa, intercambio plasmático,

vacunación con ADN (Dumont, 2004).

Capítulo I. Introducción 100

I.3.2. Dieta.

I.3.2.1. Antioxidantes.

En 1979, Miquel y Ecónomos fueron los primeros en demostrar que la

administración de algunos antioxidantes era capaz de aumentar la vitalidad y

la longevidad media de ratones. Posteriormente se observó que la

administración de ciertos antioxidantes protegía frente al deterioro de la

función inmune asociada al envejecimiento. El SNC, por su composición rica

en AGPIs, de fácil oxidación, es particularmente sensible a la alteración que

dicho proceso causaría en estructuras nerviosas. Aunque los estudios

epidemiológicos aún son muy parciales, se están realizando algunos ensayos

con suplementos de vitamina E para retardar la evolución de la EA o la EP.

I.3.2.1.1. Búsqueda de antioxidantes.

Por definición, una sustancia que está presente a bajas concentraciones en

comparación con las de un sustrato oxidable, puede ser considerada como un

antioxidante.

La intensa investigación relacionada con los mecanismos responsables de la

muerte neuronal, ha conducido a la utilización de antioxidantes como terapia

que podría actuar contra el envejecimiento y las enfermedades

neurodegenerativas.

Capítulo I. Introducción 101

Los antioxidantes contenidos en la dieta, especialmente los polifenoles,

presentan actividades anti-inflamatorias, son quelantes de hierro y son

capaces de eliminar radicales libres. La dieta Mediterránea, rica en frutas,

vegetales, cereales y legumbres y relativamente poca cantidad de carne, se

asocia desde hace años con una reducida incidencia en enfermedad coronaria

y algunos tipos de cáncer (Willet, 1995). Las grasas de la dieta son

determinantes ambientales significativos de aterosclerosis, y el aceite de oliva

es la grasa elegida en la región Mediterránea, donde es consumida en grandes

cantidades. El aceite de oliva es rico en ácido oleico (18:1n-9), que es también

el ácido graso monoinsaturado más abundante en todas las dietas y tejidos.

Una mayor ingesta de ácido oleico junto a una concomitante reducción en la

ingesta de grasa saturada, constituye uno de los pilares más importantes de

los efectos favorables de la dieta Mediterránea sobre la salud humana (Visioli,

1998a).

I.3.2.1.1.1. Aceite de oliva: DOPET.

El aceite de oliva se obtiene de las aceitunas del Olea Europea, un árbol que

crece fundamentalmente entre los paralelos 30 y 45. Forman parte importante

de la dieta Mediterránea y son reconocidas como fuente de la denominada

“comida funcional” por su contenido en antioxidantes fenólicos naturales.

Posee una composición única, a base de un 56%-84% de ácido oleico y un 3%-

21% de ácido linoleico (18:2n-6). Algunos estudios atribuyen un efecto

modesto pero directo en la reducción de los niveles de colesterol para las

grasas monoinsaturadas cuando se toman de manera independiente y

reemplazando equicalóricamente a la ingesta de carbohidratos (Mensink,

1992).

Capítulo I. Introducción 102

Entre las actividades biológicas atribuídas a los fenoles del aceite de oliva

figuran la inhibición de la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad,

tanto in vitro como ex vivo, la inhibición de la derivatización de apoproteínas

y de la agregación plaquetaria, la reducción de los tromboxanos B2 y

leucotrienos B4 producidos por leucocitos humanos activados, la eliminación

de las especies superóxido y reactivas de oxígeno, la inhibición del daño al

ADN, de la nitración inducida por tirosina activadas por peroxinitrito y acción

hipotensiva, entre otras muchas (Visioli, 2001).

La fracción polifenólica del aceite de oliva supone de 500 a 800 mg/kg, en

función de otros factores clave, como la manera de producción y almacenaje

del aceite (Tsimidou, 1992). La estructura de los compuestos fenólicos,

formados por anillos aromáticos con sustituyentes hidroxilos, es

especialmente adecuada para ejercer una actividad antioxidante (donador de

hidrógeno o electrones, o captador de radicales libres). Es un hecho bien

establecido, el que la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas

acumulan hierro en las regiones donde tiene lugar la muerte neuronal. Por

tanto la capacidad de los compuestos fenólicos como quelantes de metales,

especialmente cobre y hierro, les permite actuar indirectamente como

antioxidantes mediante la inhibición de la acción de los metales como

catalizadores en la formación de radicales libres (Conner and Grisham, 1996).

Además, la quelación de hierro es una aproximación terapéutica prominente

en la neuroprotección de la EP, la EA y la EM.

Capítulo I. Introducción 103

Entre esos compuestos fenólicos se encuentran los fenoles simples de C6-C2,

flavonoides y seicoiridoides. La oleuropeína, el principal seicoiridoide amargo

que debe ser eliminado de las aceitunas para hacerlas comestibles, y sus

derivados hidrolíticos, como el DOPET (3,4-dihidroxifeniletanol), oleuropeína

aglicanos y oleodio-11-metil ester, son los componentes fenólicos

predominantes en la pulpa de la aceituna (Panizzi, 1960). Otros compuestos

fenólicos que son cuantitativamente importantes son el tirosol y ácidos

fenólicos como el ácido vanílico y cafeico. Todos estos fenoles están

implicados en la prevención de la formación de otros productos de

peroxidación lipídica, como los isosprostanos, malondialdehido y

lipoperóxidos, manteniendo sus niveles cercanos a los basales. Otras

actividades biológicas atribuidas a estos polifenoles son la modulación de la

formación de trombos y de la inflamación, la defensa del hospedador ante la

infección por parásitos, propiedades antimutagénicas, anticarcinogénicas y

antiglicémicas (Benavente-Gª, 2000; Visioli, 1998b). La elección de un aceite

vírgen extra, cuyo contenido en polifenoles es el más elevado, permite un

mayor consumo de antioxidantes (aproximadamente 30-50 mg/día) que

poseen potentes actividades biológicas.

El 3,4-dihidroxifeniletanol (DOPET) es el principal o-difenol detectable en el

aceite de oliva virgen extra, tanto en su forma libre como esterificada con ácido

elenólico para formar oleuropeína aglicano (Capasso, 1996).

Fig.I.2.: Estructura química de DOPET.

Capítulo I. Introducción 104

Esta molécula hidrosoluble y liposoluble ejerce su actividad como

antioxidante tanto como quelante de iones metálicos libres como eliminando

radicales peroxilos (Aeschbach, 1994; D'Angelo, 2001). En condiciones

alcalinas, en presencia de cationes metálicos, el contenido de este compuesto

se ve reducido de manera significativa, lo que se atribuye a una oxidación

fenólica, que lleva a la total desaparición de este o-difenol tras 24 horas de

exposición a estos iones (Lattanzio, 1994).

I.3.2.1.1.1.1. Actividades biológicas de DOPET.

Uno de los prerequisitos para demostrar su significancia fisiológica, es la

determinación de dicho compuesto en el plasma humano. Un estudio reciente

en voluntarios confirma que el 98% del DOPET administrado en forma de

aceite de oliva virgen, aparece en plasma y orina en su forma conjugada,

principalmente glucuronoconjugados, sugiriendo un extensivo metabolismo

intestinal/hepático (Miro-Casas, 2003).

Las actividades biológicas del DOPET han sido revisadas recientemente. En

estudios in vitro se ha demostrado su capacidad para prevenir la oxidación de

LBD, la agregación plaquetaria e inhibición de las enzimas 5- y 12-

lipoxigenasas. Igualmente, ejerce un efecto inhibidor en las modificaciones en

las bases del ADN dependientes de peroxinitritos y nitración de tirosina.

Experimentos sobre citotoxicidad, revelan la efectividad de este compuesto

para contrarrestar los efectos citotóxicos ejercidos por especies reactivas de

oxígeno sobre varios sistemas de células humanas, como la protección frente a

la hemólisis y la formación de malondialdehido provocadas por H2O2 en

glóbulos rojos Además, recientemente se ha validado su efecto

antiproliferativo, su capacidad para atravesar la barrera hematoencefálica

(BHE) y la capacidad de permeabilizar las membranas de las células

intestinales humanas, que difunden de manera pasiva (Manna, 2000).

Capítulo I. Introducción 105

I.3.2.1.1.1.2. Metabolismo de DOPET.

Administrado oralmente, el DOPET puede ser absorbido tanto en ratas como

en humanos, aunque no existe información disponible sobre la toxicidad,

distribución orgánica y metabolismo (Bai, 1998). Estudios preliminares para

esclarecer el metabolismo de este compuesto, administrando exógenamente

DOPET-marcado a células intestinales, obtienen como único metabolito

marcado el MOPET, sugiriendo que la metilación podría estar catalizada por

la catecol-O-metiltransfesasa (COMT). Visioli y colaboradores aportan datos

en humanos, indicando que tras la ingesta del aceite de oliva de la dieta, este

fenol es absorbido de manera dosis-dependiente y excretado en la orina,

presumiblemente como un conjugado glucurónido (Visioli, 2000). Las

principales rutas metabólicas conocidas para el DOPET administrado

oralmente en ratas, quedan recogidas en la figura I.3.

Capítulo I. Introducción 106

Fig.I.3: Rutas metabólicas de DOPET. Los compuestos indicados se han

detectado en los órganos de rata, excepto MOPAL. La conversión de MOPET en

HVA a través de MOPAL se presupone (D'Angelo, 2001). Los compuestos, flechas y

conectores indicados en rojo pertenecen a la conexión entre DOPET y el

metabolismo de las catecolaminas [revisado en (Eisenhofer, 2001)]. COMT=

Catecol-O-metiltransferasa.

Los metabolitos oxidados (HVA y DOPAC) son las principales moléculas

derivadas del metabolismo de la DA, mediante la acción de la MAO y COMT en el

SNC. La conversión de DOPAC a DOPET a través de la DOPAC reductasa y de

DOPAC a MOPET ha sido descrita en cerebro de rata (Xu, 1995). Recientemente,

se ha detectado un incremento en los niveles de DOPAL y DOPET en el medio de

cultivo de células PC12 catecolaminérgicas incubadas en presencia de inhibidores

de la cadena respiratoria mitocondrial (Lamensdorf, 2000a; Lamensdorf,

2000b). Para confirmar si los metabolitos derivados de DOPET conservan las

propiedades biológicas de la molécula, se realizaron estudios in vitro que

confirman que la capacidad antioxidante se asocia con la integridad del motivo

ortodifenólico (Kohyama, 1997). La metilación del grupo hidroxil fenólico hace

perder dicha actividad. De hecho, DOPET reduce la proliferación celular e induce

MAO

DDOOPPEETTAldehído

deshidrogenasa

Aldehído reductasa DOPAL

Sulfotransferasa

Derivados sulfo-conjugados

COMT

Aldehído DH

DOPACHVA

COMTMOPAL

Derivados sulfo-conjugados

Sulfotransferasa

DOPAC

DOPAMINA

MAO

MOPET

Capítulo I. Introducción 107

apoptosis en leucocitos en respuesta a una rápida liberación del citocromo C

desde el espacio intermembranoso de la mitocondria (Della Ragione, 2000). A

pesar de los estudios que avalan la capacidad antioxidante de DOPET y sus

metabolitos, permanece aún por definir las bases moleculares de todos sus

efectos biológicos.

El hierro es uno de los metales más abundantes en el cerebro. Cierto nivel de

hierro debe estar disponible para actuar como cofactor en la síntesis de proteínas

y ácidos nucleicos, para las enzimas implicadas en la respiración mitocondrial y

la síntesis de neurotransmisores, al igual que para la síntesis de mielina (Ward,

1995). Sin embargo, cuando el hierro aparece en niveles superiores a los

necesarios, puede derivar en un componente tóxico para la célula. Se han

detectado tanto hierro como transferrina y ferritina en PN de la EA. Como metal

catalizador de reacciones oxidativas, algunos estudios sugieren que las proteínas

de unión a hierro, implicadas en la reacción de Fenton, se presentan en menor

cantidad en los pacientes de la EA (Evans, 1996). La administración oral de un

quelante de hierro biodisponible como el clioquinol, tanto en modelos animales

de la EP como en transgénicos de la EA, es significativamente beneficiosa para

ambas patologías (Cherny, 2001; Kaur, 2003).

La literatura que soporta los efectos biológicos beneficiosos de DOPET, lo

convierten en un buen candidato para diseñar estrategias terapéuticas noveles.

I.3.2.1.1.1.3. Relación de DOPET con catecolaminas.

Las catecolaminas son metabolizadas por múltiples enzimas, incluyendo la MAO,

COMT y sulfotransferasa. La aldehído reductasa y aldehído deshidrogenada,

actúan en secuencia con la MAO en la producción de los respectivos metabolitos,

resultando en una multiplicidad de rutas metabólicas. Como se observa en la

figura I.3., el principal metabolito procedente de la desaminación de la DA es

DOPAC, metabolizado a HVA mediante la acción de COMT.

Capítulo I. Introducción 108

I.3.2.1.2. Colesterol.

I.3.2.1.2.1. Metabolismo del colesterol: Latosterol C5-

desaturasa.

La ruta de biosíntesis de colesterol en mamíferos implica a más de 19

reacciones enzimáticas, comenzando con la condensación de acetil-CoA para

formar mevalonato, que se convierte en escualeno. A continuación y por

ciclación, se obtiene lanosterol. El colesterol se origina desde el lanosterol a

través de numerosas reacciones multienzimáticas, incluyendo

desmetilaciones, isomerización, desaturación y tres reducciones de puentes-

dobles (Figura I.4.) (Brunetti-Pierri, 2002). Los defectos en la biosíntesis de

colesterol, caracterizados por la acumulación de precursores metabólicos

específicos en los tejidos, están siendo implicados en numerosos síndromes de

malformación en humanos.

Las enzimas implicadas en la biosíntesis hepática de colesterol desde el

escualeno, se localizan en los microsomas (Bloch, 1965).

La enzima denominada latosterol C5-desaturasa (LC5D) cataliza la

introducción de un puente delta 5 en la molécula de latosterol (colest-7-en-3 -

ol) para formar 7-dehidrocolesterol (7-DHC), con la participación de oxígeno

molecular, nucleótidos reducidos de piridina y el sobrenadante obtenido tras

centrifugar a 105.000 x g (S105), que facilita la transferencia del sustrato

exógeno lipofílico desde los liposomas a la membrana que contiene la enzima,

asociada a las membranas microsomales al igual que su sustrato, el latosterol

(Ishibashi, 1981). La LC5D debe estar organizada en un sistema

multienzimático en la membrana, ya que la reacción requiere la presencia de

un sistema de transferencia de electrones desde el NADH hasta la desaturasa.

La hidropatía de LC5D sugiere que se trata de una enzima integral de

membrana con cuatro a cinco regiones de anclaje en la membrana (Kyte,

1982).

El retículo endoplásmico del hígado de rata es pobre tanto en el sustrato como

en el producto de la reacción de la LC5D, por lo que es un buen modelo para el

Capítulo I. Introducción 109

estudio de la cinética de enzimas de membrana. Para estudiar la cinética y las

propiedades de una enzima de membrana, donde uno de los sustratos es

también componente integral de la membrana, es necesario alterar la cantidad

de sustrato en la membrana mientras que se minimizan las ateraciones en el

ambiente de la membrana o en la conformación de la enzima. En este caso, se

preincorpora latosterol en las membranas microsomales mediante la

utilización de liposomas en presencia de una proteína citosólica, cuya

manipulación elimina la inserción cinética del sustrato lipofílico. La porción

de sustrato incorporado, es alcanzado por la enzima mediante difusión lateral

dentro del plano de la membrana (Takakuwa, 1994).

Fig I.4: Metabolismo del colesterol. A partir del latosterol, y mediante la enzima

LC5D, se obtiene el precursor del colesterol, 7-dehidrocolesterol.

Lanosterol Colest-8(9)- en-3 -ol

Colest-7-en-3 -ol (latosterol)

LC5D

7-dehidrocolesterol

COLESTEROL

4,4-dimetilcolest-8(9)-en-3 -ol

Capítulo I. Introducción 110

I.3.2.1.2.2. Colesterol y la EA.

El cerebro es el órgano del cuerpo humano que contiene mayor cantidad de

colesterol. Presenta una media de 20 miligramos de colesterol por gramo de

tejido, que es bastante más en comparación con los 3,2 miligramos de

colesterol por gramo de tejido presentes en el hígado (Sampugna, 1975). Una

de las razones que explican la relativa insensibilidad de las enfermedades que

afectan al SNC a los niveles séricos de colesterol, podría basarse en la

regulación independiente del metabolismo del colesterol en el SNC con

respecto a la periferia.

El factor de riesgo más prevalente en la EA identificado hasta la fecha es la

Apo 4, que es una isoenzima de la proteína de transporte de colesterol Apo E,

presente tanto en el cerebro como en la periferia (Mahley, 1988). Hay

multitud de enzimas implicadas en el metabolismo del colesterol que también

muestran una conexión putativa con el inicio tardío de la EA. Entre ellas

figuran la enzima colesterol 24-hidroxilasa asociada al citocromo P450

(Cyp46), implicada en la oxidación del colesterol a 24(s)-hidroxi-colesterol

(Papassotiropoulos, 2003).

El consumo de niveles elevados de colesterol y grasas saturadas está asociado

con un mayor riesgo de demencia, mientras que el consumo de pescado,

fuente importante de AGPIs, se asocia con la reducción de dicho riesgo y la

protección frente a la demencia (Kalmijn et al., 1997).

El nivel medio de colesterol total y de LBD-colesterol, están significativamente

elevados en pacientes de la EA con respecto a los controles sanos de avanzada

edad y relacionado con el estatus Apo 4 (Kuo et al., 1998; Notkola et al.,

1998). Los niveles de colesterol cerebral también aparecen elevados en la

corteza frontal de pacientes de la EA y enfermedad coronaria arterial (Sparks,

1997).

Un mayor consumo de ácidos grasos saturados y monoinsaturados y de

colesterol en la dieta, se relaciona con un aumento en el nivel de triglicéridos y

colesterol en suero y en cerebro y se asocia con un deterioro cognitivo (Oner et

al., 1991; Ortega et al., 1997).

Capítulo I. Introducción 111

En individuos de avanzada edad, los niveles plasmáticos de colesterol se

correlacionan con la presencia de lesiones en la materia blanca (Breteler et al.,

1994).

La distribución asimétrica del colesterol entre la cara exofacial y citofacial de

las membranas plasmáticas sinápticas, se va modificando a medida que

aumenta la edad, en base a la reducción en la fluidez de membrana y la

inhibición concomitante de la actividad ATPasa Ca2+/Mg2+, ya que ambas

dependen del contenido en colesterol y de un incremento en los productos de

peroxidación (Mecocci, 2004).

El colesterol procedente de la dieta, afecta el metabolismo del colesterol

cerebral, acelerando el envejecimiento cerebral con un incremento en los

niveles cerebrales de colesterol, a consecuencia de un mayor estrés oxidativo

(Sparks, 1997).

Las membranas de cerebros afectados por la EA, presentan una mayor

degradación de fosfolípidos, ya que la peroxidación lipídica altera la

composición de las membranas en contraste con el proceso normal de

envejecimiento, provocando una reducción en el ratio molar

colesterol:fosfolípidos que reduce la anchura de las membranas (Mason et al.,

1993; Nitsch et al., 1992).

El incremento en colesterol puede ser un mecanismo de defensa celular para

proteger las membranas del daño oxidativo. El colesterol es un débil

antioxidante y estabilizante de la estructura de las membranas (Urano et al.,

1997). Se ha sugerido que el colesterol formaría parte del sistema antioxidativo

jerárquico (incluyendo melatonina, ascorbato, ubiquinol, vitamina E, tioles

como el glutatión y los AGPIs) que protege a las células de las acciones

detrimentes de los oxirradicales (Joseph et al., 1997; Vatassery et al., 1997).

Cuando este sistema está sometido a estrés y deficiencias, el colesterol se oxida

y moviliza indicando que el colesterol de la membrana se intercambia con las

reservas exógenas cuando tiene lugar la peroxidación lipídica. Por tanto,

cuando el estrés oxidativo es suficiente, disminuye el contenido en colesterol

mitocondrial y microsomal e incrementa la fluidez de las membranas en las

sinapsis del cerebro (Wood et al., 1995).

Capítulo I. Introducción 112

En base a evidencias, existe un nexo de unión entre el metabolismo del

colesterol y la PPA. Los metabolitos de PPA en cerebro pueden ser modulados

por el colesterol de la dieta, un efecto que requiere la presencia de ApoE

(Howland et al., 1998). El colesterol incrementa los niveles celulares de PPA,

disminuye el metabolismo y la liberación de -PPAs e incrementa la

producción y deposición amiloidogénica de A (Bodovitz and Klein, 1996). A

disminuye la síntesis de varios lípidos, en particular de colesterol y

fosfolípidos.

El vínculo directo entre las alteraciones en el metabolismo del colesterol y

otros lípidos de membrana en la EA, permanece aún por esclarecer, ya que

aún no se conoce si tales alteraciones son responsables de la disfunción y

muerte neuronal. Los microdominios de membrana ricos en colesterol y

esfingolípidos son claves en varias rutas de señalización celular (Tsui-

Pierchala, 2002). La esfingomielina es la principal fuente de ceramidas, que

son generadas cuando la esfingomielina es procesada por las

esfingomielinasas, enzimas que son activadas por citoquinas inflamatorias

(Kronke, 1999). Las ceramidas desempeñan un papel destacado en la

regulación de procesos fisiológicos como la apoptosis (proceso que pueden

activar tanto en situaciones fisiológicas como patológicas) y están implicadas

en patologías como la EA y la EP (Alessenko, 2000). Se relaciona el

incremento en los niveles de estrés oxidativo asociado a las membranas, las

ceramidas de cadena larga y el colesterol libre de las células cerebrales,

durante el envejecimiento normal en neuronas en cultivo, en ratones y en

pacientes de la EA (Cutler et al., 2004). El modelo propuesto por el autor

sobre la patogénesis de la EA contendría la secuencia de eventos representada

en la figura I.5.

Capítulo I. Introducción 113

Fig. I.5.: Relación entre estrés oxidativo, colesterol y la patogénesis de

la EA. Datos recientes in vitro e in vivo sugieren la existencia de una interconexión

entre el estrés oxidativo generado como consecuencia del proceso normal de

envejecimiento, en combinación con la composición genética y la influencia del

ambiente, actuarían favoreciendo la acumulación de A , que a su vez

retroalimentaría dicho proceso oxidativo. El metabolismo del colesterol y la

producción de ceramidas aumentaría en respuesta a la oxidación, activando la

disfunción y muerte neuronal y propiciando la producción de A 42.

Estudios realizados en células no neuronales, avalan estos resultados.

Nuevamente, el estrés oxidativo y la producción de ceramidas generan la

acumulación de colesterol en estas células. Niveles elevados de colesterol en

cultivos celulares son capaces de inducir apoptosis, y el uso de estatinas

protege a las neuronas frente al daño oxidativo/isquémico (Buxbaum et al.,

2001; Honjo, 2002).

Producción y agregación de

AGenes,envejecimiento

y ambiente

Estrés oxidativo (Asociado a

membranas) Disfunción neuronal y muerte celular

Alteración de ceramidas y metabolismo del colesterol

Capítulo I. Introducción 114

I.3.2.1.2.3. Colesterol y la EM.

El perfil transcripcional de la EM indica que pueden estar involucrados

numerosos genes implicados en el metabolismo de los lípidos y el colesterol

(Lock, 2002). En cerebros de pacientes con la EM, se observa una menor

expresión de HMG-CoA reductasa, estearoil CoA desaturasa, acetoacetil-CoA

tiolasa, propionil CoA carboxilasa y enoil-CoA hidratasa. Dado el papel

pleiotrópico de HMG-CoA reductasa sobre el sistema inmune y la capacidad

de las estatinas para reducir los niveles de colesterol, mediante la inhibición

de esta enzima, se ha postulado la posible eficacia de las estatinas en el

tratamiento de la EM, y ya se han llevado a cabo prometedores estudios pre-

clínicos (Neuhaus, 2002; Youssef, 2002). Estudios con atorvastatina en el

modelo animal EAE de la EM, demuestran prevenir o revertir la patología

crónica, lo que lo convierte en una herramienta útil para actuar tanto en el

inicio de la fase inflamatoria como de la neurodegenerativa. La lovastatina

suprime la fase aguda de EAE en ratas (Stanislaus, 1999). En base a los

potenciales efectos neuroprotectores y anti-inflamatorios de las estatinas, se

las relaciona tanto con la EA como con la EM.

I.3.2.1.3. Ácidos grasos poliinsaturados (AGPIs).

Los ácidos grasos son componentes esenciales de la dieta humana, implicados

en el crecimiento y la reproducción. Están asociados con la obesidad y

numerosas patologías, como la enfermedad cardiovascular. El sistema

nervioso presenta el mayor contenido lipídico a continuación del tejido

adiposo. Entre el 50 y el 60% del peso seco del cerebro adulto son lípidos, 35%

de los cuales están representados por los ácidos grasos poliinsaturados y entre

los que los fosfolípidos son los componentes cuantitativamente más

significativos de las membranas lipídicas. Los ácidos grasos de la dieta son

importantes para el cerebro, influenciando tanto al tejido adulto como al

envejecido.

Capítulo I. Introducción 115

I.3.2.1.3.1. Clasificación de los ácidos grasos de la dieta.

Hay dos grupos principales de ácidos grasos dietarios, en función de su

metabolismo en mamíferos. El primero está formado por los ácidos grasos

saturados, responsables de proveer energía a la célula y el segundo lo

componen los ácidos grasos insaturados, precursores de numerosas hormonas

y generadores y/o controladores de procesos inflamatorios. Según el número

de dobles enlaces, pueden sub-clasificarse en (i) ácidos grasos

monoinsaturados, formados por una cadena de átomos de carbono con un

doble enlace, y (ii) AGPIs, con una cadena de dos o más dobles enlaces. Los

AGPIs, se subdividen, a su vez, en el grupo omega-3 y en el grupo omega-6

(Harris, 2004). La nomenclatura de los principales AGPIs omega-3 y omega-6

queda compilada en la figura I.6. (Yoshida et al., 1998). La mayoría de los

efectos beneficiosos se atribuyen a los omega-3, aunque es necesario

mantener un balance apropiado entre ambos tipos de AGPIs para el normal

desarrollo y mantenimiento del organismo. El balance óptimo de

omega6:omega3 para un adulto sano se aproxima a una relación 6:1

(Wijendran and Hayes, 2004). Algunos de los AGPIs son denominados ácidos

grasos esenciales (AGEs), ya que deben ser obtenidos de la dieta debido a la

imposibilidad para ser sintetizados por el organismo.

Capítulo I. Introducción 116

I.3.2.1.3.2. Funciones fisiológicas de AGPIs.

Los AGPIs son constituyentes de los lípidos como el colesterol y los

fosfolípidos, regulando funciones asociadas a las membranas, como las

actividades de enzimas, receptores y canales iónicos asociad unión de están

implicados en la regulación de la excitabilidad neuronal y la alteración de la

permeabilidad de las membranas celulares (Penzo et al., 2002). Hay una

correlación positiva entre la actividad molecular de las unidades (Na+, K+)-

ATPasa y la cantidad de ácido docosahexaenoico (ADH), uno de los AGPIs

omega-3 más beneficiosos, localizado en la bicapa lipídica circundante de los

tejidos. La suplementación de ratas envejecidas con elevadas cantidades de

ADH, revierte la reducción en la liberación de neurotransmisores relacionada

con la edad (McGahon et al., 1999). Además, los AGPIs son capaces de

modificar el comportamiento, actuando sobre la neurotransmisión

dopaminérgica (Chalon et al., 2001). La mejora de la función cortical

dopaminérgica, observada en ratas alimentadas con aceite de pescado, podría

ser una consecuencia del incremento en los niveles de ADH en la corteza. Sin

embargo, estos animales mostraban una reducida locomoción, que se

relacionó con los bajos niveles del principal AGPIs omega-6 en el estriado, el

ácido araquidónico (AA). Estos resultados contradicen a los observados en

ratas alimentadas con una dieta crónicamente deficiente en ácido -linolénico

(AAL) (Delion et al., 1996). Los animales alimentados con AA y ADH

presentaban mayores niveles de DA en las áreas cerebrales de

“procesamiento-integración” de la información visual-auditiva. Los AGPIs,

como moduladores putativos de la neurotransmisión en el cerebro y en el eje

hipotalámico-pituitario-adrenal, al igual que de las citoquinas en el sistema

inmune (SI), quedan recogidos en la figura I.7 (Yehuda et al., 1999). Controlan

la expresión génica de los tejidos lipogénicos, hígado y SI, cuya regulación

afecta a determinados procesos cognitivos y fisiológicos (Sessler and Ntambi,

1998). Los estudios en humanos y animales sobre los efectos de los AGPIs

omega-3 en en triglicéridos, LAD-colesterol, agregación plaquetaria, función

endotelial y vascular, presión sanguínea, excitabilidad cardiaca, estrés

Capítulo I. Introducción 117

oxidativo, citoquinas pro- y anti-inflamatorias y función inmune, revelan que

poseen efectos anti-inflamatorios clínicamente importantes (Mori and Beilin,

2004).

I.3.2.1.3.3. Metabolismo de los AGPIs.

Las rutas biosintéticas de los AGPIs omega-3 y omega-6 quedan detalladas en

la figura I.6. El metabolismo de los precursores, ácido linoleico (AL) y AAL,

involucra a las mismas enzimas, permitiendo una competición entre ambos

sustratos para la desaturación, aunque hay un-.a enzima que desatura/elonga

preferentemente a AAL, incrementando así la producción de omega-3 con

respecto a omega-6. La BHE desempeña un papel destacado durante el

transporte de AA y ADH desde la circulación hasta que penetran en el

cerebro. Estudios cuantitativos in vivo demuestran, que aproximadamente un

5% del contenido en ADH y AA del cerebro es metabolizado y reemplazado

por ácidos grasos provenientes de la dieta a través de la circulación sanguínea

(Rapoport, 2003). El cerebro es autónomo, con una lipogénesis activa de

novo de ácidos grasos monoinsaturados, produciendo AA y ADH en

diferentes regiones en función de los requerimientos metabólicos y los

procesa de una manera muy exclusiva.

Capítulo I. Introducción 118

18:2n-6 Ácido linoleico (AL)

4Desaturasa

ELO

6

18:3n-6 Ácido -linolénico

Aceites de girasol, maíz, soja, sésamo, cáñamo, onagra, borraja, semilla de grosella

20:3n-6Ácido dihomo- -linolenico

20:4n-6Ácido araquidónico (AA)

24:4n-6

24:5n-6

ELO

ELO

AGPIs OMEGA-6

22:5n-6 Ácido Docosapentaenoico

22:4n-6Ácido adrénico

18:3n-3 Ácido -Linolénico (AAL)

18:4n-3

20:4n-3

22:5n-3

24:5n-3

ELO

ELO

5

ELO

6

4Desaturasa

20:5n-3

Figura I.6: Rutas biosintéticas de los ácidos grasos dietarios en

mamíferos. Principales pasos de la biosíntesis de los ácidos grasos dietarios en

hígado, células del endotelio cerebrovascular y astrocitos: desaturación en el RE ( 6 y

5-Desaturasas), elongación de la cadena (Elongasa, ELO) y acortamiento de la

cadena ( 4 –Desaturasa o “ -oxidación parcial”). La vía más probable seguida por los

metabolitos es una -oxidación peroxisomal, antes de regresar al RE para completar

la síntesis y ser esterificados en fosfolípidos de membrana. El 1er nº= nº de átomos de

carbono/molécula ácido graso y el 2º= nº de dobles enlaces. La posición del 1er

carbono= n-6 o n-3 (Haag, 2003).

-oxidación parcial

5

ELO

24:6n-3

Aceite de lino, soja, calabaza, nueces, vegetales de hoja verde, pescado azul

22:6n-3 Ácido Docosahexaenoico

AGPIs OMEGA-3

Capítulo I. Introducción 119

I.3.2.1.3.4. AGPIs y colesterol.

Hace más de 30 años que dos científicos daneses, Bang y Dyerberg,

determinaron que las diferencias observadas en las tasas de mortalidad por

enfermedad coronaria, entre dos grupos poblacionales estudiados, uno de

esquimales de Groenlandia y otro de daneses, se debían a la ingesta de grasa

de foca, ballena y pescado, ricas en EPA y ADH, por parte de los esquimales

frente a la ingesta de grasas saturadas y productos ricos en colesterol de los

daneses (Bang et al., 1976; Dyerberg et al., 1975). Bang y Dyerberg también

observaron la efectividad de los AGPIs omega-3 para reducir los niveles de

colesterol y triglicéridos en el suero, y años después se han corroborado que

tanto EPA como ADH reducen las concentraciones plasmáticas de colesterol,

en estudios realizados en monos Resus (Davis et al., 1987).

El principal mecanismo de actuación neuroprotectora y cardioprotectora de

los ácidos grasos omega-3 (ver figura I.7.), podría basarse en la supresión de la

síntesis y liberación tanto de FNT- como de IL-10, en la modulación de las

respuestas anti-inflamatorias del eje hipotalámico-pituitario-adrenal y en el

incremento de la liberación de acetilcolina. Por tanto parece existir una

estrecha interacción entre el SNC, los órganos endocrinos, citoquinas y AGPIs

omega-3. Esta podría ser una de las razones que explicasen el beneficio de

estos ácidos grasos en condiciones tales como la EA, la EP, enfermedades

inflamatorias, diabetes mellitus, hipertensión, septicemia y arteriosclerosis

(Das, 2000).

Capítulo I. Introducción 120

Figura I.7.: Efectos de los ácidos grasos de la dieta en funciones fisiológicas

y cognitivas. Los AGPIs om-6 y om-3 tienen un papel pivotante en el eje hipotálamo-

pituitaria-adrenal (Yoshida et al., 1998). El grupo omega-6 (flechas punteadas) y

omega-3 (flechas con guión largo) son moduladores putativos de neurotransmisores

como la dopamina (DA), serotonina (5-HT) y norepinefrina (NE) y hormonas como la

hormona liberadora de corticotropina (CRH), hormona adrenocorticotrópica (ACTH) y

cortisol y citoquinas del sistema inmune. La regulación de vías de señalización y

producción afecta a funciones mediadas por el cerebro como la cognición (aprendizaje

y memoria) y procesos fisiológicos (dolor, termorregulación y sueño). Flechas finas y

completas= vías de excreción/recepción de diferentes componentes; flechas gruesas y

completas= conexión cerebro y eje hipotálamo-pituitaria-adrenal.

Funciones mediadas por cerebro

Fluidez membrana/Receptores/Integridad mielina

Termorregulación/Sueño/Dolor/Estrés/Aprendizaje y memoria

Colesterol

P450

Prostaglandinas

Barrera hematoencefálica cruzada por AGPIs

omega-6 y omega-3

Cerebro 5-HTDA, NE

HipotálamoCRH

PituitariaACTH

AdrenalesCORTISOL

Sangre

Sistemainmune

Capítulo I. Introducción 121

La composición de ácidos grasos de la grasa de la dieta desempeña un papel

fundamental en la determinación del nivel de colesterol plasmático. Tanto la

serie omega-3 como la serie omega-6 reducen los niveles de colesterol, pero

ambos actúan mediante mecanismos diferentes y los omega-3 son más

potentes, variando el efecto sobre las lipoproteínas y el metabolismo de los

ácidos grasos si se trata de EPA o de ADH (Takahashi and Horrobin, 1988).

Los niveles circulantes de colesterol y las tasas de mortalidad generales, son

significativamente menores en el área Mediterránea, correlacionadas

positivamente con el consumo de aceite de oliva (Rubba et al., 1987; Trevisan

et al., 1990).

La discrepancia existente entre numerosos estudios en relación al efecto del

aceite de pescado sobre los niveles de colesterol, se basa en 6 factores

(revisado en (Harris, 1989).

1) Presencia o no de una enfermedad relacionada con laslipoproteínas.

2) Tipo de enfermedad en su caso: en muchos estudios el descenso en

colesterol observado en pacientes hipertrigliceridémicos es debido

enteramente a la reducción en los niveles de LMBD-colesterol, sin verse

afectados los de LBD-colesterol.

3) Relación entre los niveles de colesterol total y de LMBD-colesterol.

4) Tipo de grasa en la dieta control: cuando el contenido en grasa

saturada de la dieta control es superior al de la dieta de aceite de pescado, es

más probable que los niveles de LBD en la dieta omega-3 sean más bajos.

5) Dosis y composición del aceite de pescado administrado.

6) La variedad de efectos de EPA frente a DHA: a diferencia de los

niveles plasmáticos de ADH, los de EPA son un buen marcador de la ingesta

de omega-3.

Capítulo I. Introducción 122

La revisión de los ensayos al azar controlados sobre el estudio de la efectividad

de los omega-3 como agentes secundarios para la prevención de

enfermedades cardiovasculares, realizados entre los años 1994 y 2003,

concluyen que aunque algunos estudios aportan datos sobre el beneficio sobre

reducción en colesterol, triglicéridos, LBD y LMBD, se necesitan estudios a

más largo plazo y que empleen una mejor metodología, para poder

recomendar la suplementación con omega-3 como tratamiento para la

hipertrigliceridemia (Lewis et al., 2004). En cualquier caso, la recomendación

sobre incrementar la ingesta en pescado puede conducir a efectos beneficiosos

a largo plazo mediados por mecanismos actualmente desconocidos. De hecho,

no se conoce una droga hipotrigliceridémica con mejor relación

riesgo:beneficio que los AGPIs omega-3.

I.3.2.1.3.5. Ácido docosahexaenoico (ADH).

El ácido docosahexaenoico (cis-4, 7, 10, 13, 16, 19 ADH; 22:6n-3), a pesar de

representar una pequeña fracción lipídica en el resto de los tejidos, representa

más del 17% del peso de los ácidos grasos totales en el cerebro adulto de ratas y

más del 33% del total de ácidos grasos en la retina (Hamano et al., 1996). Es

uno de los AGPIs omega-3 presente en los fosfolípidos de membrana de las

células retinales, membranas de las células excitables, corteza cerebral,

mitocondrias, sinaptosomas y vesículas sinápticas del cerebro, mediando la

señalización neuronal y la transmisión sináptica colinérgica (Jones et al.,

1997). Especialmente relevante para la maduración cerebral, tanto en roedores

como en humanos (Haag, 2003). Una de las funciones únicas de ADH en el

SNC es la síntesis de fosfolípidos necesarios para la estructura de la membrana

celular y consecuentemente, para la elongación de las neuritas.

Hay dos fuentes principales de ADH: endógenamente, se sintetiza

principalmente en el hígado y es transportado al cerebro como precursor, como

muestra la fig.I.8. Todos los mamíferos, humanos incluidos y felinos excluidos,

son capaces de sintetizar ADH a partir de AAL (presente en aceites vegetales,

Capítulo I. Introducción 123

no en el pescado) en el retículo endoplasmático. A diferencia del tejido adiposo

y del hígado, el cerebro no es un reservorio de AGPIs.

Exógenamente, se encuentra en vegetales y animales de origen marino, como

el pescado graso en la nutrición humana, principal fuente de ADH (Harris,

2004).

El ADH es necesario para el crecimiento y desarrollo funcional del cerebro

humano infantil y el mantenimiento normal del cerebro adulto. La

mielinización en los vertebrados es uno de los procesos principales durante el

desarrollo del SNC, tiene lugar en una dirección caudocraneal que involucra a

diferentes regiones a distintos tiempos. Ciertos factores ambientales, como la

dieta, podrían modificar este proceso. El hecho de que el cerebro contenga

uno de los contenidos lipídicos más elevados, hace que la deficiencia en AGEs

durante la fase más activa de la síntesis de mielina pueda generar

amielinización, desmielinización o demielinización. Los estudios animales

realizados con dietas suplementadas con aceite de pescado, revelan un efecto

negativo sobre la mielinización, mediante la ralentización de la velocidad de

conducción a través de la vía auditiva del tronco cerebral, así como de la

actividad 2’-3’-nucleótido cíclico-3’-fosforilasa, marcador de mielinización

(Saste et al., 1998). Sin embargo, se propone que la disrupción de la

mielinización se debería al desequilibrio en el ratio omega-3:omega-6, más

que a una influencia directa de omega-3 en la síntesis de mielina (Salvati et

al., 2000). Deacuerdo con este argumento, otro estudio aporta que un elevado

contenido en lípidos en la dieta prenatal afectaría a la expresión del gen de la

mielina, reduciendo la vulnerabilidad de la mielina a las alteraciones

nutricionales en el período postnatal, independientemente de su composición

en ácidos grasos. Algunas enfermedades demielinizantes, como la

adrenoleucodistrofia y la EM, podrían ser modificadas de manera beneficiosa

a través de la dieta (el “aceite de Lorenzo” o terapia de gliceril-trierucato-

trioleato), aunque esta hipótesis necesita confirmación. (Moser et al., 2003).

Los efectos beneficiosos de los AGPIs omega-3 pueden ser reforzados con la

adición apropiada de antioxidantes, con objeto de reducir la peroxidación

Capítulo I. Introducción 124

lipídica que tendría lugar tras la ingesta de estos ácidos grasos dietarios.

(Meydani, 1996).

Estudios in vitro realizados en astrocitos aislados de corteza cerebral de

hámster, demuestran la necesidad de una concentración adecuada de ADH en

el medio de cultivo para un crecimiento correcto, así como de un balance

apropiado entre omega-3:omega-6 en los fosfolípidos de sus membranas para

mantener un funcionamiento adecuado.

Teniendo en cuenta los estudios in vitro e in vivo, se estima que un

suplemento de unos 180 miligramos de ADH por cada 100 gramos de dieta, en

forma de leche humana o fórmulas infantiles suplementadas, podrían proveer

un 0,4% de los requerimientos energéticos (Alessandri et al., 2003).

I.3.2.1.3.6. AGPIs y la EA.

El inicio de la EA es la dificultad para recordar sucesos recientes. Conforme

avanza la enfermedad, lo7272s pacientes desarrollan un comportamiento

errático, alucinaciones y pérdida de control sobre sus funciones corporales. El

efecto de variables ambientales en combinación con la susceptibilidad genética

podría incrementar el riesgo de desarrollar la EA. Los estudios realizados en

cerebros de pacientes de la EA, muestran una reducción en los fosfolípidos de

membrana derivados de ácidos grasos totales (fosfatidiletanolamina y

fosfatidilinositol pero no en fosfatidilcolina) en comparación con los controles,

ligando así el incremento en la degradación de los fosfolípidos cerebrales en la

EA con el estrés oxidativo. (Prasad et al., 1998). A pesar de la elevada

vulnerabilidad de los AGPIs al ataque por radicales libres, los AGPIs omega-3

suprimen la inflamación y reducen el curso de una infección mediante el

descenso en la producción de citoquinas inflamatorias, lo que permite

correlacionarlos positivamente con el retraso en la evolución de enfermedades

como la EP y la EA (Christen, 2000; Youdim et al., 2000). Hace muchos años

que se estableció la “teoría de los radicales libres” como posible mecanismo

implicado en la patogénesis de los síndromes demenciales (Clausen, 1984). Los

AGPIs forman malondialdehido tras una auto-peroxidación, facilitando la

Capítulo I. Introducción 125

deposición de lipofuscina, considerado como un marcador del proceso de

envejecimiento, y de 4-hidroxinonenal, producto neurotóxico de la oxidación

de los AGPIs (Lamb and Simon, 2004).

Tanto el AA como el ADH incrementan los niveles de acetilcolina, en parte

debido a la estimulación de la captación de glucosa por el cerebro, lo que

supone una mejora en las habilidades de aprendizaje y memoria de los modelos

animales de experimentación (Minami et al., 1997).

Un incremento en los niveles de acetilcolina provoca un aumento en la síntesis

de óxido nítrico, beneficiando la consolidación de la memoria mediante la

prevención de la apoptosis. Los AGPIs incrementan el número de receptores de

insulina e influyen en la síntesis de óxido nítrico endotelial (eNO),

favoreciendo que la insulina proteja a las neuronas de la citotoxicidad causada

por el factor alfa de necrosis tumoral (FNT ). Cualquier modificación en la

conexión entre los AGPIs, insulina, receptores de la insulina, óxido nítrico,

acetilcolina, y FNT , puede generar tanto pérdida de memoria como muerte

neuronal, aumentando así el riesgo de iniciar la EA (Das and Fams, 2003).

Hogyes y colaboradores alimentaron ratas antes, durante y tras el embarazo,

con una dieta enriquecida con un exceso de ADH y otros AGPIs, acompañados

o no de los precursores AL y AAL (Hogyes et al., 2003). Los resultados

obtenidos compilaban una reducción en las células colinérgicas y pérdida de

neuronas y fibras, así como un incremento en la cantidad de ADH de los

fosfolípidos cerebrales. Tras estas observaciones, se han propuesto numerosos

mecanismos para explicar los efectos protectores de ADH sobre la muerte

celular: interferencia con la apoptosis, promoción del crecimiento de las

neuritas activado por el factor de crecimiento nervioso, incremento de la

eliminación de los radicales libres y reducción de la peroxidación lipídica y/o

modificando la sensibilidad de los receptores NMDA y disminuyendo el flujo

iónico a través de los canales de Na+, permitiendo así que haya una menor

actividad epileptiforme (Green et al., 2001). El hipocampo participa

activamente en el procesado de la formación espacial y el ADH está implicado

en la formación de la memoria (Morris et al., 1982). Un estudio sobre los

efectos de los déficits de AAL concluye, que la reducción en el recambio de las

Capítulo I. Introducción 126

vesículas sinápticas en la región CA1 del hipocampo afecta directamente a la

capacidad de aprendizaje de las ratas (Yoshida et al., 1997).

Los experimentos de alimentación de ratones jóvenes y viejos con ADH y

fosfatidilcolina de huevo, demuestran una clara mejora en las habilidades de

aprendizaje de ambos grupos. ADH parece reducir los niveles de AA y

fosfatidilcolina e incrementar la cantidad de colina en cerebro (Lim and Suzuki,

2001).

La administración crónica de ADH en ratas causa un incremento significativo

del ratio omega3:omega6 (indicador de la acción antioxidante de ADH) tanto

en hipocampo como en corteza frontal, mejorando la capacidad de aprendizaje

relacionada con la memoria y el déficit espacial que sigue al daño ocasionado

por hipoxia o isquemia. Curiosamente, se observa un descenso en la

peroxidación lipídica únicamente en el grupo ADH, solo en la corteza cerebral y

no en el hipocampo de los animales jóvenes, en oposición a los resultados

obtenidos en ratas envejecidas, lo que indica que la administración crónica de

ADH contribuye a la protección del daño neuronal, aunque Gamoh y

colaboradores sugieren que la administración de ADH podría mejorar la

memoria a cualquier edad en ratas (Gamoh et al., 2001). Okada y

colaboradores no consiguen probar ninguna diferencia en el contenido de ADH

en cerebro tras 3 semanas de administración en ratas (Okada et al., 1996). Por

tanto, se establece que para obtener efectos significativos se requiere un

período más prolongado de manipulación dietaria, como el realizado por

Gamoh y colaboradores tras 10 semanas de estudio. Sin embargo, estos autores

no pueden asegurar que las dosis empleadas puedan restaurar el daño por el

déficit de omega-3 en la capacidad de aprendizaje. Fukui y colaboradores

comprueban, mediante estudios del estrés oxidativo en ratas, que este proceso

contribuye al déficit en aprendizaje y memoria asociados al envejecimiento, y

que la suplementación de ADH combinado con catequinas mejora esas

capacidades en ratones adultos y envejecidos (Fukui et al., 2001; Shirai and

Suzuki, 2004). Por tanto, se establece que la efectividad de ADH es edad-

dependiente en el cerebro de animales alimentados con dietas enriquecidas con

aceite de pescado, evidenciada por el hecho de que en períodos pre- y post-

Capítulo I. Introducción 127

natales, el contenido de este ácido graso raramente sufre modificaciones en el

cerebro adulto. El ADH de la dieta protege del deterioro en las funciones

cognitivas en ratas con la EA.

Se necesitan dos generaciones para reducir el nivel de ADH en el cerebro de

rata y solamente dos meses para recuperarlo en las vesículas sinápticas

cerebrales (Barcelo-Coblijn et al., 2003).

En un modelo de rata de la EA, generado por infusión de A , la pre-

administración crónica de ADH reduce el deterioro en el aprendizaje, así como

el estrés oxidativo y la apoptosis propia de este modelo (Hashimoto et al.,

2002). Los estudios en ratones transgénicos de EA que sobreexpresan PPA,

sugieren una efectividad potencial de los ácidos grasos de la dieta, en relación a

la capacidad para eliminar péptidos A desde el cerebro a la circulación

(Friedland, 2002).

Calon y colaboradores demuestran que la reducción en el contenido en AGPIs

omega-3 en la dieta administrada a un modelo de ratón transgénico de EA,

resulta en una reducción de un 80-90% de la subunidad p85 de la

fosfatidilinositol-3-kinasa y de la debrina post-sináptica (proteína dendrítica), al

igual que ocurre en los pacientes de la EA. En este estudio, además, se

comprueba cómo la administración de ADH protege de las alteraciones

bioquímicas y comportamentales observadas en el grupo deficitario. La

vulnerabilidad selectiva de las proteínas dendríticas tanto a factores de riesgo

ambientales (ej: reducida ingesta de ADH) como genéticos (ej: PPA humana

mutante), conducen al desarrollo de la EA tanto en modelos animales como en

pacientes (Calon, 2004).

Recientemente, Roher et al evaluan la sustancia blanca de pacientes de la EA,

observando un daño axonal, en oligodendrocitos y en mielina análogo a la materia

gris (Roher et al., 2002). Comparando la sustancia blanca de individuos no-

dementes con los pacientes de la EA, se halló una reducción significativa en los

niveles de colesterol (12%) y niveles elevados de ácidos grasos en torno a las

lesiones propias de la EA. En contraposición a estos resultados, un estudio previo

encontró un descenso en los niveles de EPA, ADH y en el ratio omega-3:omega-6

en relación con el daño cognitivo y el envejecimiento (Conquer et al., 2000).

Capítulo I. Introducción 128

Finalmente, otro estudio no encuentra diferencias significativas en la

composición de ácidos grasos de la sustancia blanca, pero sí una reducción en

los plasmalógenos de la corteza frontal e hipocampo de los pacientes de la EA

(Guan et al., 1999). El descenso en AA y ADH está relacionado con el

incremento en componentes saturados en la sustancia gris del hipocampo de

pacientes de la EA (Soderberg et al., 1991).

Las concentraciones de los ésteres de colesterol, fosfatidilcolina,

fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina de los AGPIs, tanto en suero como en

corteza parahipocampal de pacientes de la EA estan significativamente

reducidas, probablemente por la incapacidad para el anabolismo de acetil CoA

(Tully et al., 2003).

El consumo de pescado, al menos una vez por semana, reduce el riesgo de la

EA en un 60% y este efecto se atribuye a ADH, ya que su precursor AAL

protege a sujetos portadores del alelo apo 4 (Morris et al., 2003). Una gran

ingesta de pescado tiende a estar inversamente relacionada con el declive y

deterioro cognitivo, en base a la reducción en la inflamación del sistema

cerebrovascular. Sin embargo hay cierta controversia a este respecto. Los

datos obtenidos en animales indican que el consumo de AGPIs omega-3, en

general, afecta positivamente el estado cognitivo. Hasta la fecha, no se han

podido replicar esos resultados en ensayos clínicos. Algunos autores han

aportado datos sobre una correlación positiva entre la ingesta de pescado y la

reducción en el daño cognitivo, mientras que otros no ven ningún efecto

(Engelhart, 2002; Kalmijn, 2000).

II. OBJETIVOS

Capítulo II. Objetivos 130

La neurodegeneración en enfermedades como la enfermedad de Alzheimer

(EA), la enfermedad de Parkinson (EP) y la Esclerosis Múltiple (EM) parece

ser multifactorial, incluyendo reacciones tóxicas, inflamatorias,

neurotoxicidad glutamatérgica, eliminación de los antioxidantes endógenos,

reducción en los factores tróficos y expresión de las proteínas pro-

apoptóticas que conducen a la pérdida neuronal. Son algunas de las

patologías neurodegenerativas más devastadoras y que mayor gasto

económico suponen para la sociedad actual.

Los mecanismos de neuroprotección pueden ser afrontados desde

modificaciones dietarias.

Algunos componentes de la dieta Mediterránea han adquirido bastante

importancia en las últimas décadas en base a la demostración de su

efectividad frente a cardiopatías, envejecimiento y ciertos tipos de cáncer.

Entre esos componentes destacamos a los ácidos grasos poliinsaturados

(AGPIs) omega-3, presentes en el aceite de pescado, como ingredientes

capaces de reducir la presión sanguínea, proteinuria, niveles lipídicos e

inflamación. Así mismo, a los polifenoles se les atribuyen propiedades

plurifarmacológicas: mediante quelación de hierro, eliminación de radicales

libres responsables del daño oxidativo, activación de genes de supervivencia

y rutas de señalización celular, entre otras actividades.

Se ha demostrado recientemente el poder protector frente a la demencia de la

ingesta de flavonoides, compuestos fenólicos contenidos en el vino, vegetales,

frutas y te. Igualmente, se ha comprobado que la ingesta de vitaminas C y E

reduce el riesgo de desarrollar la EA y mejoran la función cognitiva.

Por tanto, se decidió estudiar tanto el efecto de una dieta enriquecida en AGPIs

omega-3 como de un compuesto fenólico como DOPET, contenido en el aceite

de oliva y de demostrado poder antioxidante, en sistemas in vitro e in vivo.

Hasta la fecha, se ha estudiado la capacidad protectora como antioxidante de

DOPET frente al cáncer, enfermedad cardiovascular y envejecimiento mediante

inhibición del estrés oxidativo. Sin embargo, no hay estudios concretos y

Capítulo II. Objetivos 131

contrastados aplicados a patologías como la EA, la EP ni la EM. Dado el

creciente interés suscitado por la dieta Mediterránea en nuestra sociedad actual,

unido a la dificultad para hallar tratamientos naturales verdaderamente

efectivos frente a enfermedades neurodegenerativas, se establecieron una serie

de objetivos:

A. Estudiar la relación entre colesterol y la EA:

1) Modulación ejercida por los AGPIs omega-3 de la dieta sobre los niveles de

colesterol y la patología de la EA en un modelo animal de la EA.

2) Influencia de parámetros como la edad y/o el género en los niveles de

colesterol en diferentes modelos animales de la EA.

B. Demostrar el efecto neuroprotector de DOPET en sistemas in vitro e in

vivo.

3. Efecto neuroprotector de DOPET in vitro.

4. Efecto neuroprotector de DOPET in vivo.

5. Relación de DOPET y el colesterol.

6. Influencia de DOPET sobre la actividad MAO, implicada en la EP.

III. MATERIALES Y MÉTODOS

Capítulo III. Materiales y Métodos 133

III.1. MATERIAL.

III.1.1. Modelos animales experimentales.

Todos los animales recibieron alimentación y agua ad libitum y fueron

mantenidos en ciclos de 12 h de luz y 12 h de oscuridad.

La manipulación y sacrificio de los animales transgénicos y mutantes se llevó

a cabo bajo la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de

Aventis, al igual que de acuerdo con los estándares de la guía para el cuidado

y el uso de los animales de laboratorio (CNRS ILAR) y con respecto a las

reglas de la Comunidad Europea y Francesa.

Los modelos animales transgénicos y mutantes fueron:

A) Se utilizaron ratones transgénicos simples denominados PPA-Tg53,

generados y establecidos siguiendo los procedimientos estándares utilizados

para los híbridos CBA/C57B16 previamente descritos (Czech et al., 1997). Se

emplearon 5 tríos para gestar, formados por 1 macho transgénico y 2

hembras no transgénicas. Las crías fueron separadas con 4 semanas de edad

y mantenidas con las diferentes dietas (control y omega-3) durante 4 meses.

B) Se utilizaron las razas C57BL6 y C3H, de ambos géneros y de 3 meses y 6

meses de edad. Así mismo, se emplearon ratones transgénicos simples PPA-

Tg53 de la EA. Se establecieron varios grupos: de la raza C57BL6, C3H,

C57xC3H y Kozack-colesterol 16. Todas las razas fueron sumistradas por

Aventis (Francia).

Para optimizar el sitio de iniciación de translación de PPA, se introdujo una

secuencia consenso Kozack mediante mutagénesis dirigida por PCR: forward

primer, 5 -CCC GGG TCC ACC ATG CTG CCC GGT TTG G-3 ; reverse

primer, 5 -TTC AGG GTA GAC TTC TTG GC-3 . El producto de la PCR fue

subclonado en pCR2 (INVITROGEN, France), secuenciado y

subsecuentemente clonado dentro de un vector que contenía el cADN de

PPA751SL cADN empleando SmaI y AccI, reemplazando el 5 UTR de PPA por

el elemento Kozack.

Capítulo III. Materiales y Métodos134

Para crear la línea Kozack-Colesterol-16, se cruzaron incialmente las líneas

C57BL6 con C3H y a la descendencia se le inyectó Etil-nitrosa-urea (ENU),

que indujo una mutagénesis al azar. Posteriormente, los machos ENU fueron

cruzados con hembras C3H para obtener una línea que se denominó “Col-

16”. Finalmente, se realizaron cruces de “Col-16” con un modelo transgénico

simple de la enfermedad de Alzheimer, denominado PPA-Tg53. Los

descendientes que se obtuvieron fueron denominados Kozack-Colesterol-16.

El grupo estuvo formado por 25 animales, 17 hembras y 8 machos. La biopsia

de la cola para realizar el genotipado se llevó a cabo en el momento de

separar los animales de los progenitores, con 4 semanas de edad. Solamente

10 de estos animales (4 machos y 6 hembras) resultaron ser transgénicos.

Fueron sacrificados a los diferentes tiempos (3 meses de edad las líneas base

y 6 mese de edad los ratones mutantes).

C) Se utilizaron ratones transgénicos dobles de la EA, denominados

PPA/PS1, suministrados por Aventis (Francia) (Blanchard et al., 2003). Se

establecieron 3 grupos de hembras de 3 (n = 6), 8 (n = 7) y 13 meses (n = 10),

así como 2 grupos de hembras no transgénicas de 3 (n = 5) y 13 meses (n = 6)

de edad.

Los ratones dobles transgénicos PPA/PS1 empleados, expresan PPA-751 con

las mutaciones Swedish y London (promotor Thy1), al igual que la

Presenilina-1 humana mutante (M146L, promotor HMG) (Blanchard et al.,

2003).

La manipulación y sacrificio del resto de animales (sin modificación

genética), se llevó a cabo siguiendo la “Guía para el cuidado y la utilización de

animales de laboratorio” promulgada por el Instituto Nacional de Salud y

aprobado por el Comité Ético de la Universidad de Granada.

D) Se utilizaron ratones de la raza Balb/c, machos y de entre 20-30 g de peso

medio.

E) Se utilizaron ratas de la raza Wistar, machos, de unos 250 g de peso

medio.

Capítulo III. Materiales y Métodos 135

F) Se utilizaron ratones de la raza 129/Sv, H-2b de ambos sexos y ratones

salvajes. Todos los animales tenían entre 8 y 14 semanas de edad. En este

estudio, los animales se establecieron en dos grupos: control (con agua de

mineralización muy débil) y DOPET (con agua de mineralización muy débil

suplementada con DOPET). En esta ocasión fueron anestesiados mediante

una inyección intraperitoneal de 37 mg/kg de ketamina y 5,5 mg/kg de

xylazina.

Los procesos de inmunización, evaluación clínica y procesado de tejidos se

basó en los protocolos descritos previamente (Espejo et al., 2001).

G) Se utilizaron conejos de la raza New Zealand White, machos de unos 2,5

kg de peso medio.

III.1.2. Modelos celulares experimentales.

A) Se utilizaron células gliales C6, de morfología tipo fibroblasto y derivadas

del glioma de rata (Rattus Novergicus) (Benda et al., 1968).

B) Se utilizó la línea celular de fibroblastos L-929, procedente de tejido

conectivo subcutáneo, areolar y adiposo de ratón macho de 100 días de edad

y de la raza C3H/An (Sanford et al., 1950).

C) Las células PC12 que se utilizaron fueron obtenidas del “Riken Cell Bank”

(Instituto de Investigación Física y Química de Japón). Este estudio fue

realizado en colaboración con la Dra. S. Hilfiker (Universidad de Manchester,

Inglaterra).

D) Células neuronales de hipocampo de rata, de morfología tipo fibroblasto.

Línea H19-7/IGG-IR.

III.1.3. Dietas experimentales.

A) Dieta enriquecida en AGPIs omega-3: proteínas (Caseína) 20%;

metionina 0,3%; almidón 63,7%; fibra (celulosa) 5%; grasa 5% (de la cual el

15% son AGPIs omega 3 en la dieta omega-3); mix de vitaminas 1%;

Capítulo III. Materiales y Métodos136

sacarosa 5%; colesterol 0%; aceite omega-3: EPA: DHA (proporción 2:1)

(EUMEGA-EPA, Puleva Biotech, S.A.).

B) Dieta chow estándar comercial (PANLAB, Barcelona).

C) Dieta chow (95% mezcla estándar, 5% aceite girasol) y dieta chow con

1,5% colesterol.

D) Dieta conejo 112 (PANLAB, Barcelona): Humedad (11.0%), proteína

(13.5%), grasa (3%), glúcidos (50%), fibra (15.5%), minerales (7%). Energía

estimada según fórmula: 2321 kcal/kg. Contenido en ácidos grasos: ácido

palmítico (4700 mg/kg), ácido palmitoleico (330 mg/kg), ácido esteárico

(1020 mg/kg), ácido oleico (4800 mg/kg), ácido linoleico (5200 mg/kg),

ácido linolénico (1500 mg/kg). Aceites añadidos a las dietas: Aceite de

Girasol Alto Oleico (casa comercial de Guadix). La elaboración de las

distintas dietas se realizó mezclando la dieta base pulverizada con la grasa

atomizada, calentando levemente para mejorar el contacto entre ambas

fases. Las dietas fueron peletizadas y almacenadas en oscuridad a 4ºC hasta

su uso. Al comienzo y al final del estudio se recogió una alícuota para su

análisis en contenido de grasa y composición en ácidos grasos. Se adicionó

un 3% extra de grasa de diversas fuentes para conseguir un 6% de grasa

total.

Tipo de dieta Composición

Control 30 días (CO) 97% dieta estándar + 3% aceite girasol

Control 60 días (CF) 97% dieta estándar + 3% aceite girasol

Aterogénica 30 días (CA) 95.7% dieta estándar + 3% manteca de cerdo + 1,33% colesterol

Aterogénica 60 días (AA) 95.7% dieta estándar + 3% manteca de cerdo + 1,33% colesterol

Aterogénica 30 días + chow 30 días (AC) 1 mes dieta de CO y 1 mes dieta de CA

Aterogénica con DOPET 30 días (ADT) Dieta aterogénica con 3% grasa + sondaje con DOPET

Chow con DOPET (DT) Dieta estándar + sondaje con DOPET (10 mg/kg)

Tabla III.1.: Clasificación y composición de las dietas empleadas para

el estudio realizado en conejos.

Capítulo III. Materiales y Métodos 137

III.2. MÉTODOS.

III.2.1. Técnicas.

III.2.1.1. Sacrificio de los animales.

Los animales transgénicos y mutantes fueron sacrificados por asfixia dentro

de una cámara con hielo seco y posterior translocación cervical. El resto de

animales (ratones no modificados genéticamente, ratas y conejos) fueron

sacrificados mediante anestesia con pentotal sódico y guillotina.

En todos los casos, se diseccionó la cabeza mediante un corte entre el calotte

y la primera cervical y la piel y músculos se eliminan del cráneo.

Comenzando por el foramen magnum, se corta el cranium en dirección

anterior y el cráneo se retira cuidadosamente. Se ejerce presión con las

pinzas bajo el cerebro, en la región de la médula oblongata para poder retirar

el cerebro con cuidado desde la base del cerebro. Posteriormente se

diseccionan tanto el nervio óptico como los nervios en la región de la médula

oblongata. La sangre se recogió por punción cardiaca en viales de recolección

(Sarstedt, Nümbrecht, Germany). Tras una extracción rápida del cerebro, el

hemisferio derecho se congeló en nitrógeno líquido y el hemisferio izquierdo

se conservó en hielo seco para su posterior almacenamiento a –80°C. Se

obtuvo una muestra de la cola para ratificar el genotipado de cada animal con

anterioridad a todos los análisis.

III.2.1.3. Extracción de ADN.

Las biopsias de las colas se incuban a 55 °C durante toda la noche en

agitación continua (350 r.p.m.) en buffer de lisis (Tris HCl 100mM pH=8.5,

EDTA 5mM, SDS 0,4%, NaCl 400mM) y 10-15 µL/mL de Proteinasa K (300

µg/mL). Al día siguiente, se agitan y centrifugan a 13.000 r.p.m. durante 10

min a tª ambiente.

Capítulo III. Materiales y Métodos138

El sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo que contiene 500 µL de

isopropanol. Tras agitar y repetir la centrifugación, el sobrenadante es

eliminado y el pellet se lava con 500 µL de etanol 70%. Después de

centrifugar, el pellet se seca durante 20 min a 55 °C y se resuspende en 70

µL de H2O estéril. Mantener el ADN a 4 °C durante toda la noche.

III.2.1.3. PCR.

El programa de PCR (Termociclador PTC-200, MJ Research) utilizado fue

específico para la amplificación de la proteína precursora del amiloide

(isoforma PPA 695) de 360 pb, PPA con “KPI domain larger”. El

programa consistió en: 94ºC (5min) y 35 ciclos: 94°C (1 min), 55°C (1

min), 72°C (1.5 min), 72ºC (5 min). El master mix preparado para esta

PCR consta de:

Cada muestra se compone de 1 µL de ADN (dilución 1:20 µL) y 9 µL de

master mix (10% Taq polimerasa (5 U/µL), 10% dNTP-mix (200 µM

dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 10% PPA-forward primer(1:10), 10% PCR-

buffer (10x), 10% PPA-reverse primer(1:10), 100 mM Tris-HCl, pH 8.5,

500 mM KCl 0,1% gelatina, MgCl2 (50 mM) en H2O esteril). Las

secuencias de oligómeros (PEQLAB) empleadas fueron:

PPA-forward primer: 5’-GTA GCA GAG GAG GAA GAA GTG-3’

PPA-reverse primer: 5’-CAT GAC CTG GGA CAT TCT C-3’

Pares de bases: 682-703

1006-987

Finalmente, se realiza una electroforesis en gel de agarosa durante 10 min

a 180V en running buffer TBE 0,5x (buffer TBE 10x= Tris-Borato-EDTA;

108 g Tris base, 55 g ácido bórico, 9,3 g Na4EDTA y H2O destilada hasta 1

L, pH 8.3) para identificar los animales transgénicos.

Capítulo III. Materiales y Métodos 139

III.2.1.4. Lisados de proteínas.

Se pesa el hemisferio izquierdo y se homogeniza en potter mecánico en 8

volúmenes de PBS 0,01M con una tableta de inhibidor de proteasas

(ROCHE-Diagnostics GmbH, Manheim-Germany) por 50 mL de PBS.

Detección de la fracción soluble e insoluble de A con ácido

fórmico:Se mezclan 300 µL del homogenado en PBS inicial con 700 µL de ácido

fórmico (88% en H2O destilada). Se mantienen en agitación durante toda la noche a

4°C. Se centrifugan a 28.000 x g durante 1 h a 4°C y se añaden al sobrenadante 11 x

volúmenes de ácido fórmico (8.8 mL en total) de Tris-base 2 M para neutralizar el

ácido fórmico. Se ajusta el pH entre 6.0 y 8.0 y se guarda el sobrenadante a –80 °C.

Detección de fracción soluble de A con SDS: se mezclan 200 µL del

homogenado en PBS con 2% de SDS (50µL de SDS 10%) y se dejan 30 min en hielo,

tras los que se centrifugan a 16000 x g 10 min antes de guardar el sobrenadante a –

80°C.

Detección de fracción soluble de A con PBS: se centrifuga el resto del

homogenado en PBS durante 10 min a 14000 r.p.m. y se conserva el sobrenadante a

–80°C.

La concentración de proteínas en los diferentes lisados se realizó en base al

ensayo de Bradford (DC protein-assay (Bio-Rad), empleando el kit BCA

(PIERCE, Rockford, USA).

III.2.1.5. Western Blot.

Los extractos totales de proteínas se desnaturalizan a 70 °C durante 10

min, y se reducen y separan en geles de 10 pocillos de 1.00 mm al 16% de

Tris Tricina (ANAMED Elektrophorese GmbH (Darmstadt). Cada muestra

se compone de: 3,75 µL de buffer para muestras (4x; ANAMED

Elektrophorese GMBH, Darmstadt), 1.5 µL de agente reductor

(INVITROGEN) y H2O estéril para un volumen final de 15 µL. Se cargan 4

µL de multimarcador (INVITROGEN). Se prepara el running-buffer (1x):

50 mL de NuPAGE MES buffer 20x con 950 mL de H2O desionizada. Se

Capítulo III. Materiales y Métodos140

mezclan 200 mL de running buffer 1x (ANAMED Elektrophorese GmbH,

Darmstadt) con 500 mL de antioxidante. Se añade esta mezcla a la cámara

que contiene el gel y se deja correr el gel a 60 V durante 10 min, dejándolo

a 200 V durante 35 min más. Se prepara el buffer de transferencia,

añadiendo 50 mL de Nu-PAGE 20x buffer transferencia a 850 mL de H2O

desionizada, 100 mL de metanol y 1 mL de Nu-PAGE antioxidante

(INVITROGEN). Una vez que el gel ha corrido, se coloca sobre dos

esponjas y un papel de transferencia (humedecidos en buffer de

transferencia), y se cubre con una membrana de nitrocelulosa,

completando el sándwich con otro papel y otras dos esponjas. Se deja

transferir durante 1 h a 30V. Tras la transferencia, se calienta la

membrana en PBS durante 5 min a máxima potencia en el microondas. Se

bloquea durante 1 h en 10% leche desnatada en polvo en 1x TBS-T y se

incuba durante toda la noche a 4°C con el anticuerpo primario WO-2

(policlonal, reconoce a un epitopo cercano al extremo C-terminal de PPA,

dentro del dominio A , monoclonal, aunque reconoce ambas especies de

A 1:5000 en TBS-T (Ida et al., 1996).

Al día siguiente, la membrana se lava dos veces durante 15 min con 1x

TBS-T a tª ambiente y en agitación. A continuación se incuba durante 2 h

con el anticuerpo secundario (cabra-anti ratón-HRP, policlonal, 1:3000 en

TBS). Se lava dos veces durante 15 min con 1x TBS-T a tª ambiente. Se

revelan las membranas por quimioluminiscencia (ECL, AMERSHAM).

Tras 1 min en contacto con el revelador, se exponen las membranas con

películas de alta quimioluminiscencia.

III.2.1.6. ELISA A 40 y A 42.

Para la determinación de A 40 y A 42 empleamos los lisados en PBS y

en ácido fórmico del homogenizado cerebral.

Para la cuantificación de los péptidos A 40/42, se siguieron las

instrucciones incluidas por el fabricante de los kits de ELISA (hAmyloid-

Capítulo III. Materiales y Métodos 141

40 y hAmyloid A 42 HS ELISA, The Genetics Company, Schlieren,

Switzerland).

Brevemente, el primer día del ensayo, se añaden los estándares y las

muestras con la solución “anticuerpo conjugado” en una placa de 96 pocillos.

Se incuba a 4°C durante toda la noche. El segundo día, se lava con la solución

“enzima conjugado”, que es eliminada a continuación con la solución

“sustrato conjugado”. Finalmente, se detiene la reacción y se mide la

absorbancia en el lector de placas, a 450 nm con un filtro de referencia de

620-650 nm. Los resultados se expresan como concentración de péptido A

en µg/g tejido.

III.2.1.7. Determinación de ácidos grasos en cerebro y

plasma de ratón.

Los ácidos grasos de cerebro y plasma se determinan mediante GC-MS

(cromatógrado de gases con detector de ionización de llama, AGILENT

TECHNOLOGIES 6890N). Para su extracción, se mezclan 300 µL o de

homogenado de cerebro en H2O destilada o de plasma de ratón con 2 mL de

solución metanol:tolueno (4:1 v/v) en un tubo PIREX. Se agita durante 1

min. Se agregan 200 µL de cloruro de acetilo, lentamente y en agitación

suave pero continuada. Se procede al gaseado con N2 previo al calentamiento

durante 1 h en bloque calefactor a 100ºC. Se detiene la reacción en hielo y se

deja enfriar antes de añadir 5 mL de carbonato potásico 6%, agitando en

vortex. Se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 10 min y se extrae el

sobrenadante. Se agregan 50 µL de ese sobrenadante a un inserto para viales

de cromatografía. En relación al proceso cromatográfico, se inyectan 3 viales

con n-hexano como blanco antes de inyectar la muestra, para limpiar la

columna, así como una disolución patrón de control cada 5-10 muestras para

verificar el buen funcionamiento del equipo. Los parámetros cromatográficos

para la determinación de los ácidos grasos por Gases-Masas, quedan

incluidos en la tabla III.2.:

Capítulo III. Materiales y Métodos142

Matriz Disolución de ésteres metílicos de ácidos grasos en

n-hexano

Volumen de inyección 0.2 µL

Inyector 250ºC, 200 kPa, 50% flujo, 20ml/min flujo, 25

mL/min flujo total, 20ml/min sarver flow, 4 min

sarver time.

Columna 1.7 mL/min flujo, 29 cm/min, presión constante

Detector 280ºC, 45ml/min H2, 400 mL/min Aire, Makeup:

30mL/min He

Gradiente de

temperaturas

Temp. Inicial: 80ºC (sostener 3 min)

Rampa 1: 10 ºC/min

Temp final: 175 ºC (sostener 2 min)

Rampa 2: 3.5ºC/min

Temp final: 250ºC (sostener 4 min)

Tabla III.2.: Parámetros cromatográficos para la medición de ácidos

grasos por Gases-Masas.

III.2.1.8. Determinación de colesterol total en plasma y

cerebro.

La medición se basa en las siguientes reacciones, que producen finalmente

un producto coloreado (fenol quinonaimina):

Colesterol esterificado + H2O Colesterol + Ácido graso

Colesterol + ½ O2 + H2O Colestenona + H2O2

2 H2O2 + 4 – Aminoantipirina + Fenol Quinonaimina + 4 H2O

En plasma: Se determina el colesterol total en suero mediante un

ensayo colorimétrico. Para calibrar, se utiliza un suero de calibración

liofilizado estándares de colesterol (LT-SYS, Berlin, Germany): 0, 25, 50, 75,

100, 125, 150 mg/dL. Se añaden 3 µL de muestra y 3 µL de cada estándar en

placas de 96 pocillos. Se agregan 300 µL de reactivo del kit colorimétrico

para colesterol total (Infinity, Thermo, Melbourne, Australia) por pocillo y se

Capítulo III. Materiales y Métodos 143

incuba la placa durante 10 min en el incubador a 37°C. Finalmente se

determina la absorbancia a 500nm.

En cerebro: Se pesan 100 mg de cerebro de ratón, y se homogenizan

en un potter de vidrio en buffer Tris HCl 20 mM, EGTA 2 mM, EDTA 1 mM,

benzamidina 1 mM, DTT 1 mM y PMSF 1 mM, pH 7.4. Se realiza una primera

extracción en 1 mL de cloroformo:metanol (2:1), se mezcla en el vortex y se

centrifuga durante 10 min a 2500 r.p.m. Se retira la fase acuosa e interfase.

Se repite la extracción dos veces más, con 0.5 mL de cloroformo: metanol

(2:1) en cada ocasión. Se combinan las 3 fases clorofórmicas y se llevan a

sequedad con N2 líquido. Se resuspende en 175 µL de cloroformo:metanol

(2:1) y se toma una alícuota de 10 µL para combinarla con 25 de 2%

tritón:cloroformo. Se vuelve a llevar a sequedad con N2 líquido y se

resuspende en 50 µL de H2O destilada (factor dilución = 4).)

Se mide la absorbancia a 500 nm en espectrofotómetro en 5 µL de muestra

con la ayuda del kit de detección colorimétrica de colesterol total (Bio

Systems) y se determina la concentración de colesterol mediante la siguiente

fórmula:

Nota: El factor 70 procede de la operación: (175 µL/ 10 µL) x factor dilución 4 = 70

III.2.1.9. Disección y parafinación del cerebro de ratón.

El protocolo de parafinación realizado incluye la siguiente secuencia de

tratamiento del tejido incluido en los cassettes histológicos: Formalina, H2O

grifo (30 min), etanol 50% (1 h), etanol 60% (1 h), etanol 70% (1 h), etanol

80% (1 h), etanol 90% (1 h), etanol 100% (1 h), etanol 100% (1 h), xilol (1 h),

parafína (caliente). Se dejan solidificar los bloques a tª ambiente,

resguardados de la luz, al menos 1 día antes de realizar los cortes. Se realizan

30 cortes de 30 µm antes de cambiar a 4 µm y se recogen los cortes en

(Abs muestra/ Abs patrón) x 70

g tejido

[Colesterol total] (mg/g tejido) =

Capítulo III. Materiales y Métodos144

portaobjetos para extenderlos en un baño a 60°C. Se dejan secar durante

toda la noche en una estufa a 37°C.

III.2.1.10. Preparación de las secciones de tejido e

inmunotinción con el kit ABC-Vectastain.

Los hemisferios cerebrales diseccionados se dejan inmersos en el fijador

formalina 4% durante una semana a 4°C, incluídos en los cassettes

histológicos, deshidratados y embebidos en parafina. Los tejidos embebidos

en parafina se cortan en secciones de 4 µm utilizando el microtomo

(MICROM COOL OUT), se montan sobre los portaobjetos y se dejan secar

durante toda la noche a 37°C.

La deparafinación de las secciones de tejido, se realiza siguiendo una

secuencia en alcoholes de gradación decreciente: 2 x 5 min en xilol, 2 x 5 min

en etanol 100% y 1 x 5 min en etanol 95%. A continuación, se bloquea la

actividad peroxidasa endógena con metanol durante 30 min.

Para hidratar el tejido, se lleva a cabo el siguiente orden de inmersiones: 1 x 5

min etanol 95%, 1 x 1 min etanol 70% y 1 x 1 min H2O bidestilada. Se

calientan las muestras durante 10 min en microondas en buffer citrato a

máxima potencia y se dejan enfriar durante 15 min a tª ambiente. Se lavan

durante 1 min en H2O bidestilada, 3 x 5 min en Tritón-PBS (1M PBS + 0.1%

Tritón) y 1 x 1 min en PBS. A continuación se incuban en ácido fórmico 88%

durante 3 min (exactos). Se lleva a cabo un bloqueo inespecifico durante 1 h

para saturar la unión de epitopos inespecíficos. Se incuban durante toda la

noche con el anticuerpo primario [692= policlonal, para A ; 23850 y 40090=

policlonal, para PPA (humano); mx02= monoclonal, frente A (1:5000);

WO-2, monoclonal, que reconoce tanto A 40 como A 42; DAKO, Denmark).

Al día siguiente se lavan 3 x 5 min en Tritón-PBS (1M PBS + 0.1% Tritón) y 1

min en PBS. Se incuban con el anticuerpo secundario (policlonal, cabra-anti-

ratón-AP conjugado o biotina anti-conejo, (DAKO Cytomation, Denmark))

durante 1 h a 37°C. Se realizan 3 lavados de 5 min en PBS, antes de incubar

las secciones con la solución-sustrato diaminobenzimidina (100 µL DAB

Capítulo III. Materiales y Métodos 145

(ROTH) en 5 mL Tris buffer y 2.5 µL H2O2). La tinción tiene lugar bajo

control microscópico y se detiene por incubación en PBS. Se realiza una

contra-tinción con hematoxilina (solución de Harris, MERCK) (25 segundos)

y se lava brevemente en H2O destilada y durante 5 min en H2O corriente.

Para la deshidratación de las secciones, se incluyen en alcoholes de gradación

creciente: 1 x 1 min en etanol 70%, 1 x 5 min en etanol 95%, 2 x 5 min en

etanol 100% y 2 x 5 min en xilol.

Para montar las secciones, se embeben en Corbit-Bálsamo y se protegen con

el cubreobjetos para su sellado. Se dejan secar durante toda la noche en

campana de flujo antes de realizar las microfotografías en microscopio

electrónico (ZEISS).

III.2.1.11. Screening de compuestos naturales con capacidad

antioxidante.

Con objeto de seleccionar un compuesto natural con capacidad antioxidante

y de entrada al cerebro, se estudiaron una serie de compuestos seleccionados

entre un enorme grupo de diferentes extractos naturales y polifenoles (de

descrita capacidad antioxidante por razones estructurales (Mandel and

Youdim, 2004; Moosmann and Behl, 1999).

Capítulo III. Materiales y Métodos146

Analizados

Extractos varios Hoja de olivo, fresa, apio, albahaca y tomillo

(esencia), Ginkgo Biloba, cereza (rabo), arándano,

laurel, ajedrea, alcachofera, cantahueso,

manzanilla, pasiflora, aceite de pepita uva,

zahareña, llantén, perejil, encina, té rojo,

mejorana, cola de caballo, granada, romero, mirra,

enula, hoja de vid

Polifenoles Timol y Carvacrol (Sigma), Ácido 4-

hidroxifenilacético, Ácido cafeico, Ácido cinámico,

Ácido dihidroxibenzoico, Ácido gálico, Ácido

hidroxibenzoico, Ácido homovanílico, Ácido m-

courámico, Ácido metoxifenilacético, Ácido p-

courámico, Ácido sinápico, Ácido siríngico, Ácido

vinílico, 2,(3-4 dihidroxifenil)-etanol (ALDRICH)

Tabla III.3.: Listado de compuestos naturales del screening de

antioxidantes. Se analizó la capacidad para atravesar la BHE y el potencial

antioxidante tanto de extractos de compuestos naturales (HPLC-ABTS) como de

polifenoles (GC).

Capítulo III. Materiales y Métodos 147

III.2.1.12. Biodisponibilidad de DOPET.

El screening se basó en la administración de una dosis por ratón de 20 mg de

cada uno de los extractos naturales analizados. Se establecieron 4 grupos de

3 ratones Balb/c por grupo, cada uno de los cuales recibió 1 mg/mL de

extracto por sonda. Se sacrificaron a 20, 60 y 180 min y los extractos de los

cerebros se realizaron en n-hexano o metanol, y se procesaron mediante

HPLC-ABTS para determinar la capacidad para pasar la BHE así como su

potencial antioxidante.

Se centrifugaron a 12.000 r.p.m. y 4ºC.

III.2.1.12.1. Determinación de DOPET por HPLC-ABTS.

Para establecer la capacidad antioxidante de DOPET, se realizó un protocolo

experimental para la determinación de DOPET por HPLC-ABTS (HPLC-DAD

WATERS).

Se prepara una solución stock (550 µM) disolviendo 6,03 mg de ABTS+

(SIGMA, A1888) en 20 mL de PBS y se ajusta el pH a 7.4 con NaOH. A

continuación, se añaden 1,6 mg de persulfato potásico. Se incuba esta

solución stock durante 12 a 16 h en oscuridad a tª ambiente, para generar el

catión reactivo. Para preparar la solución extemporánea diaria (5.5 µM) a

partir del stock, se diluyen 2 mL de éste en 200 mL de PBS:MeOH (10%),

protegiéndolo de la luz.

Para la determinación cromatográfica, se cargan en primer lugar 10-100 µL

de muestra de extracto (solubilizado en MeOH, filtrado a través de filtro de

45 µM y degaseado con N2) en una columna C18 (5 µm), a un flujo de 0.8

mL/min y se utiliza el método instrumental basado en:

Capítulo III. Materiales y Métodos148

Tiempo Flujo %A %B Curva

0.01 0.80 100 0 6

30.00 0.80 0 100 6

40.00 0.80 0 100 6

50.00 0.80 100 0 6

60.00 0.80 100 0 6

Tabla III.4: Método instrumental de HPLC-ABTS para la medición de la

capacidad antioxidante de DOPET. Nota: A= Acético 2% y B=Metanol

La salida de la columna se une mediante una T a una bomba con el radical

ABTS+, a un flujo de 0.5 mL/min (Presión: 500-600 Psi), y a la salida se

mezclan en un loop de 2 mL que se conecta al final a un detector UV-diodo

array, midiendo la absorbancia a 254 nm y 734 nm, para poder analizar la

capacidad antioxidante de cada pico eluido del extracto natural.

Los datos se procesan dos veces con el software Millenium: la primera con el

método de procesamiento que integra los picos positivos obtenidos a 254 nm,

y la segunda con el método de procesamiento que integra los picos negativos

obtenidos a 734 nm (Koleva et al., 2001).

III.2.1.12.2. Cuantificación de DOPET por HPLC.

A partir de un preparado de DOPET sintético de concentración igual a 10

mM, se prepararon muestras de 3,75 µg, 7,5 µg, 15 µg, 22,5 µg y 30 µg.

Las condiciones del método empleado fueron: flujo de 0,8 mL/min y un

gradiente de 0%-100% (30 min), 100%-0% (35 min) y 100%-0% (40 min),

donde el buffer A: 10% acetonitrilo: acético 0.1%.

Capítulo III. Materiales y Métodos 149

[DOPET] Tiempo retención

(min) Área Altura Área/altura

3,75 µg 8,261 567.147 11.227 50,516

7,5 µg 8,299 848.575 16.736 50,704

15 µg 8,231 1.784.584 34.803 51,277

22,5 µg 8,183 2.747.671 53.204 51,644

30 µg 8,097 3.802.402 72.567 52,399

Tabla II.5.: Valores para la curva patrón de DOPET por HPLC.

La ecuación a la que se ajustó el modelo de regresión simple fue:

y= 50,204 + 0,07*x

El valor de P fue menor a 0,01, por lo que hay una relación estadísticamente

significativa entre las variables, a un nivel de confidencia del 99%.

Por tanto, con este ensayo establecimos la ecuación de ajuste lineal para

determinar la concentración de DOPET por HPLC en nuestras muestras.

III.2.1.12.3. Determinación de DOPET por CG-MS.

Con objeto de establecer el tiempo de absorción de DOPET en cerebro, se

establecieron 11 grupos de 3 ratones Balb/c por grupo que recibieron por

sondaje DOPET purificado (13 mg/kg peso). La administración de la dosis

correspondiente se llevó a cabo mediante sondaje con DOPET purificado y

posteriormente se sacrificaron por dislocación cervical para la extracción

rápida del cerebro a diferentes tiempos: 0 min, 3 min, 4 min, 5 min, 7 min,

10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min y 60 min. Para la identificación de

DOPET en el homogenado, se realizó una extracción con 1 mL de acetato de

etilo. Tras 5 min de centrifugación a 4 ºC, se inyectaron 100 µL del

sobrenadante en CG-MS.

La determinación de DOPET y sus metabolitos se ha llevado a cabo

empleando un cromatógrafo de gases con inyector automático (VARIAN

8200), acoplado a un espectrofotómetro de masas (VARIAN Saturn MS/MS

Capítulo III. Materiales y Métodos150

2000). Las condiciones de análisis optimizadas para la determinación del

compuesto en las muestras problema, se recogen en las tablas III.6. y III.7.

Fase estacionaria CP-Sil 8CB (30 m x 0.25 mm ID)

Fase Móvil Helio Purísimo

Vinyección ( L) 2 L

CG

Horno To = 45ºC (2 min)

T1 = 15ºC (20ºC/min, 8.25 min)

T2 = 270ºC (10ºC/min, 9.75 min)

Duración 30 min

Inyector 150ºC (30 min)

Espectómetro de masas

Temp. Trampa 200ºC

Temp. Manifold 50ºC

Temp. Transfer line 260ºC

Rango masas

Retraso 4.50 min

Hasta 6 min Cerrado

De 6 a 30 min 45 a 400 m/z

Flujo columna 1.0 mL/min

Relación de flujo 10

Modo de Medida Áreas

Réplicas 1

Tabla III.6.: Parámetros instrumentales para la medición de DOPET

mediante cromatógrafo de Gases.

Compuesto Iones

Naftol 201 + 216 m/z

2-(3,4 dihidroxifenil)etanol 267+268+370+371 m/z

Tabla III.7.: Iones seleccionados para el establecimiento del modo de

trabajo SIM.

Capítulo III. Materiales y Métodos 151

Para la elaboración de los patrones (tabla III.8) en el rango 0.05 – 2.5 mg/L,

se procede del siguiente modo: en una serie de eppendorf se adicionan, 1.75,

3.50 y 17.5 L de la disolución etanólica de 10 mg/L y 3.50 y 8.75 L de la

disolución etanólica de 100 mg/L. A continuación se adicionan 1 L de

disolución etanólica de naftol (1 g/L) y 350 L de plasma de ratón. Tras

agitar con vortex durante 1 min a tª ambiente, se realiza una primera

extracción de los analitos con 300 µL de acetato de etilo, agitando durante 1

min. Para separar las fases, se centrifuga a 6000 r.p.m. durante 5 min y se

transvasa el sobrenadante obtenido con una pipeta automática a un

eppendorf limpio y seco. Se repite la extracción del mismo modo y se unen

los extractos orgánicos. Se llevan a sequedad total en Speed Vac y se

redisuelve el residuo resultante en 180 L de acetato de etilo agitando

durante 1 min con vortex. La disolución resultante, se recoge con ayuda de

una pipeta automática y se introduce en un inserto para vial cromatográfico

de 200 L. Se vuelven a llevar a sequedad total y se resuspende en un

volumen final de 30 L de la mezcla derivatizante. Finalmente se inyectan 2

L de la muestra en el CG-MS.

y = 2,59x - 0,02

R2 = 0,98

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Patrón (mg/L)

Áre

a D

OP

ET

Figura III.1: Curva patrón de DOPET obtenida por CG-MS.

Capítulo III. Materiales y Métodos152

Para la preparación de las muestras, se realizaron homogenados de los

cerebros se mezclan 350 l de muestra (homogenado de cerebro de ratón)

con 1 L de disolución etanólica de -Naftol (1 g/L). A continuación se

lleva a cabo el mismo tratamiento que el aplicado a los patrones. Los

resultados se expresan en mg de analito en litro de disolución. Dicha

concentración se determina mediante interpolación del área

correspondiente a cada una de las muestras en la función de calibrado

obtenida con los patrones de concentración conocida. El modelo de

calibración seleccionado es el linear de regresión univariante por mínimos

cuadrados. La precisión del método analítico se ha evaluado a partir de la

reproducibilidad de la señal analítica mostrada por 10 disoluciones de

concentración constante e igual a 7.5 g/L del analito, concentración que

corresponde a la zona central de la función de calibrado. La concentración

de los analitos se calcula por interpolación en las funciones de calibrado

establecidas con anterioridad.

Capítulo III. Materiales y Métodos 153

III.2.2. Obtención de DOPET por síntesis química.

El DOPET utilizado para todos los estudios en modelos in vitro e in vivo, fue

sintetizado en el Departamento de Síntesis Química de Puleva Biotech, S.A.

de acuerdo con el procedimiento descrito en 1999 por Capasso y

colaboradores (Capasso et al., 1999).

El método consiste en una reducción directa del ácido 2,4 dihidroxifenil

acético (ALDRICH) con hidruro de litio y aluminio (ALDRICH) en

tetrahidrofurano anhidro (FLUKA) a reflujo durante 2 h. El procesado

incluye la destrucción del exceso de poder reductor y posterior extracción con

acetato de etilo y purificación cromatográfica por HPLC (WATERS).

Para su administración a los animales, el compuesto se disolvió en H2O

destilada.

III.2.3. Estudios de neuroprotección.

III.2.3.1. Cultivo celular.

A) Para la medida de citotoxicidad:

Se crecen las células C6 en medio Hanks F10 (BIOMOL) con un 10% de suero

bovino fetal y solución antibiótico Penicilina/Estreptomicina (LABCLINICS).

Se tripsinizan las células (solución tripsina, CULTEX 1:2) y se centrifugan, y

finalmente se resuspenden en 10 mL de medio para realizar el contaje en el

hemacitómetro (Becton Dickinson-FACS Calibur).

Para la medición de la muerte celular en un cultivo de C6 sometido a

diferentes tratamientos, se utilizó el Kit “CytoTox 96” para ensayos de

citotoxicidad (PROMEGA, G 1780), cuyo objetivo es la detección

colorimétrica no radiactiva, basada en la medición la enzima lactacto

deshidrogenada, liberada tras la lisis celular. La enzima permite la

conversión de una sal de tetrazolio en un producto rojo de formazan. El color

formado es proporcional al número de células lisadas.

Capítulo III. Materiales y Métodos154

Cada muestra se compuso de 5 µL de células, 50 µL de triptan blue y 500

µL de PBS (1x). Se diluyen a 100.000 células/mL para tener 10.000

células por pocillo en la placa de 96 pocillos. Se incuban las placas durante

4 h para permitir que se adhieran a la placa, y se añade el agente oxidante

(H2O2, glutamato o péptido A , SIGMA) (200 µM, 20 µM y 1,2 mM

respectivamente) y DOPET (concentraciones de 25 µM, 100 µM y 500

µM). Se incuba la placa durante 24 h en un incubador de CO2 (37ºC). Se

añade el buffer de lisis 10x (15 µL/pocillo) y se incuba a 37ºC durante 1 h.

Se recoge el contenido total de cada pocillo y se centrifuga (12000 r.p.m., 1

min). Se agregan 50 µL de sustrato-mix reconstituído y se incuba 30 min a

tª ambiente en oscuridad. Se detiene la reacción con 50 µL de “solución

stop”. Se mide la absorbancia a 490 nm en contador de placas. La fórmula

aplicada para calcular el porcentaje de citotoxicidad correspondiente a la

absorbancia medida para cada ensayo fue:

Citotoxicidad(%)=(A oxidante)-(A sin oxidante)/A máx *100

B) Para el ensayo COMET:

Se cultivan los fibroblastos en medio DMEM-10%-FBS hasta confluencia

en una placa Petri. Se añade el compuesto objeto de estudio al cultivo y se

incuba durante 1 h. Dejar preparada una primera capa de agarosa en

portaobjetos (agarosa normal, 1%) a 4ºC. Se irradian las células a 200 mJ.

Tras la radiación, se lavan las células con PBS y se despegan de la placa

con tripsina. Se centrifugan y se resuspende el pellet en 1 mL de PBS (1x,

pH 7.4). Se añaden 300 µL de agarosa (2% en PBS a 37ºC) a 300 µL de la

suspensión de células. Se prepara la segunda capa de agarosa (esta vez con

las células) utilizando los portaobjetos con la primera capa de agarosa. Se

deposita el cubreobjetos en la superficie durante 20 min a 4 ºC. Se retira el

cubre y se añade la tercera capa de agarosa (1% agarosa normal). Se cubre

de nuevo y se incuba el portaobjetos 10 min a 4ºC hasta que solidifique la

agarosa. Se retira el cubre y se sumerge el portaobjeto en solución de lisis

(cantidades para 0.5 L: 73,1 g NaCl, 0,61 g Tris, 5 g lauril sarcosinato, 20,8

g EDTA, 2,5 mL Tritón X-100 y NaOH hasta pH=10) durante 1 h a 4ºC. Se

Capítulo III. Materiales y Métodos 155

coloca el portaobjetos en una cubeta de electroforesis con buffer de

electroforesis durante 30 min a 4ºC. Se inicia la electroforesis (buffer para

electroforesis (1 L): 0,42 g EDTA, 12 g NaOH, pH=13) a 20 V, 300 mA,

durante 40 min a 4ºC. Se tiñe el ADN en un baño de bromuro de etidio

(20 µg/mL) durante 3 min y se lava con Tris buffer 0.4 M (pH 7.5) en una

placa Petri. Para visualizar el ADN, se utiliza el microscopio de

fluorescencia (HAL 100, ZEISS) y se cuantifica el daño por el tamaño de la

cola mediante el contaje de píxeles en el monitor.

C) Para el efecto de DOPET sobre la captación de dopamina y

norepinefrina in vitro:

Las células fueron cultivadas en base al protocolo descrito por Rajebhosale y

colaboradores (Rajebhosale et al., 2003). Brevemente, las células se cultivan

en placas de 100 mm cubiertas con colágeno (colágeno de cola de rata tipo I,

BD, BIOSCIENCES). Se crecen a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO2 en

medio completo (RPMI 1640: con 10% suero de caballo y 5% de suero bovino

fetal, penicilina 50 U/mL y estreptomicina 50 U/mL). Se despegan las células

confluentes con una solución de 0.125% de tripsina, 0.5 mM EDTA en PBS

sin Ca 2+ ni Mg 2+, y se añaden a placas de 24 pocillos cubiertas por colágeno

hasta el 90% de confluencia, o en medio con 1% de suero y 50 ng/mL NGF

2.5S.

Tras 24 h (110% de confluencia o 4 x 10 5 células/pocillo), se realiza un

marcaje con 640 nM de monoaminas marcadas ([7,8-3H]-Dopamina (52

Ci/mmol), 1-[7,8-3H]-Norepinefrina (36 Ci/mmol), 5-hidroxi [3H] triptamina

trifluoroacetato (122 Ci/mmol) (AMERSHAM)) en DMEM (SIGMA) para los

tiempos indicados, lavando posteriormente 3 veces en DMEM. A

continuación, se recogen las células en 0.3 mL de buffer fosfato salino con 1

mM EDTA y 0.1% Tritón X-100 para el contaje en un contador de centelleo.

Para ensayos de secreción, las células lavadas se recolectan mediante 10

min de incubación con PSS (145 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 2.2 mM CaCl2,

0.5 mM MgCl2, 5.6 mM glucosa, 15 mM HEPES-NaOH, pH 7.4) o con una

solución salina rica en K+ (PSS con 95 mM NaCl y 56 mM KCl) o con

Capítulo III. Materiales y Métodos156

Ionomicina en PSS (concentración final de Me2SO 0.5% v/v). Tras la

incubación, se eliminan los sobrenadantes y se resuspenden los pellets

como se describe con anterioridad, para proceder al contaje en contador

de centelleo (FACSCALIBUR, BECTON DICKINSON), con ordenador

MultiSync Fe 750+ (NEC).

La captación de aminas se determina añadiendo a las células un exceso de

100 veces la molaridad de los neurotransmisores no marcados, antes de

añadir el compuesto marcado. Por tanto, la captación específica se define

por la diferencia entre la captación total y la no-específica. Todos los

experimentos se realizaron en duplicado.

III.2.3.2. Aislamiento de mitocondrias hepáticas.

En base al protocolo descrito por Holt y colaboradores (Holt et al., 1997).

Se anestesia una rata o un ratón mediante inyección intraperitoneal de

pentotal sódico, para proceder a la extracción del hígado.

Se homogenizó el tejido en buffer fosfato sódico (3 mL/g de tejido) en

potter de vidrio. Se centrifuga durante 5 min a 1.000 r.p.m. a 4ºC, para

recoger los sobrenadantes y eliminar los pellets. Se vuelven a centrifugar

los sobrenadantes durante 30 min a 10.000 r.p.m. Se eliminan los

sobrenadantes y se resuspenden los pellets en buffer (1 mL/g tejido). Para

determinar la concentración de proteínas en la resuspensión de

mitocondrias, se lleva a cabo una medición por Bradford (Bradford, 1976).

Cada mezcla de reacción se preparó con 33 µL de mitocondrias, 167 µL de

solución cromogénica (ácido vanílico (1 mM), 4-aminoantipirina (500

µM), peroxidasa (4 U/ml), buffer fosfato potásico (0.2 M, pH 7.6). Se

mezclan, en un eppendorf limpio, 970 µL de la mezcla de reacción y 30 µL

de benzilamina (en aquéllos que lleven sustrato, concentración final de

300 µM). Todos los reactivos fueron obtenidos de SIGMA.

Las reacciones realizadas fueron: Control (sin inhibidor y sin sustrato),

muestras sin inhibidor pero con sustrato y muestras con concentraciones

crecientes de inhibidor con sustrato. Las reacciones se incubaron a 37ºC

Capítulo III. Materiales y Métodos 157

en agitación durante 1 h, tras la cual se detuvo en hielo y se centrifugaron

las muestras a 12.000 r.p.m. durante 5 min.

Para la determinación de la IC 50 de DOPET para la MAO, se midió la

A498 nm en el espectrofotómetro y se representó el porcentaje de

actividad enzimática frente al logaritmo de la concentración del inhibidor.

III.2.4. Microarrays en ratones sondados con DOPET.

Este estudio se realizó en colaboración con MedPlant Genetics (Bilbao,

España).

Durante 14 días se realizó el sondaje de 15 ratones hembra Balb/c

divididas en 3 grupos de 5 animales por grupo:

-Control: sondados con H2O mill-Q

-DOPET: recibieron 1 mg/mL en H2O milli-Q

-DOPET: sondados con 10 mg/mL en H2O milli-Q

Se midió la estabilidad de DOPET (Puleva Biotech, S.A.) en HPLC-ABTS y

se controló el peso de cada animal diariamente.

Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical para una extracción

rápida del hipocampo, corteza cerebral e hígado. Todos los tejidos se

extrajeron en un tiempo inferior a 2 min para evitar la degradación del

ARN y se almacenaron a -80ºC.

Para el aislamiento de ARN, se homogenizaron 50-100 mg de tejido en 1

mL de Trizol y se centrifugaron a 12000 x g 10 min a 4ºC, pasando el

sobrenadante a otro tubo. Se incubaron las muestras durante 5 min a tª

ambiente y se añadieron 0.2 mL de cloroformo, agitando durante 15

segundos. Tras una incubación de 2 min a tª ambiente, se centrifugaron

(Ultracentrífuga (5804R, EPPENDORF) a 12000 x g, 15 min y a 4ºC. Se

transfirió la fase acuosa a un nuevo tubo y se añadieron 0.5 mL de alcohol

isopropílico. Tras 10 min a tª ambiente, se repitió la centrifugación, se

eliminó el sobrenadante y se lavó el pellet con 1 mL de 75% etanol.

Finalmente se centrifugó a 7500 x g, 5 min a 4ºC y se secaron los pellets a

tª ambiente durante 10 min, tras los cuales se resuspendieron en 20 µL de

Capítulo III. Materiales y Métodos158

agua mill-Q. Se midió la concentración de ARN (A260=1 40 µg/mL,

A260/A280 entre 1.6 y 1.8). Para verificar la presencia y pureza del ARN,

se corrieron las muestras en un gel de agarosa.

III.2.5. Estudios de antioxidación.

III.2.5.1. Detección de MDA en cerebro.

Las muestras se realizaron por duplicado, incluyendo el homogenado de

cerebro de rata, solución de SO4Cu (125 µM) y DOPET (5 mM). Se incubaron

a 37 ºC durante 2 h. Se llevó a cabo una calibración para la determinación

por espectrofotometría de la cantidad de MDA en cerebro, utilizando

concentraciones crecientes de MDA (20 µM; Solución stock de MDA: 8.15 µL

de disolución comercial de MDA-ALDRICH-en H2O milli-Q hasta 1 mM. Se

toman 200 µL de esta disolución y se enrasan hasta 10 mL en un matraz

aforado obteniendo de esta forma una disolución 20 mM). Del reactivo de

SRATs (0.19 g de ácido tiobarbitúrico (TBA) disueltos en 1.08 mL de HCl. Se

añaden 7 g de ácido tricloroacético y se disuelven en 30 mL de H2O milli-Q.

Se completa con H2O milli-Q hasta un volumen final de 50 mL. Finalmente

se añaden 50 µL de la disolución de BHT (2,6-di-ter-butil-4-metilfenol,

MERCK) al 10% en etanol) se incluyó 1 mL en las muestras y en los patrones.

Se agitó vigorosamente y se calentaron las muestras en el bloque calefactor a

100ºC durante 15 min. Se dejaron enfriar y se centrifugaron a 4000 r.p.m.

durante 10 min. Finalmente se midió la absorbancia en el sobrenadante a 535

nm.

III.2.5.2. Detección de MDA en plasma.

Se establecieron varios grupos de ratones alimentados con diferentes dietas:

grupo control (dieta chow), grupo colesterol (chow+1,5% colesterol), grupo

DOPET (chow+ DOPET en agua bebidade baja mineralización) y grupo

DOPET+colesterol (dieta con 1,5% colesterol y DOPET en agua). La

Capítulo III. Materiales y Métodos 159

estabilidad de DOPET en el agua fue controlada diariamente mediante la

toma de una alícuota del bebedero, y se comprobó por HPLC-Masas la pérdida

de un 16,6% de capacidad antioxidante transcurridas 24 h, por lo que fue

renovado diariamente.

Se determinó la concentración de MDA en plasma de ratón mediante HPLC-

FLD (HPLC 2695 WATERS provisto de: Inyector automático; bandeja para

muestras termostatizada 4-40ºC; horno de columna termostatizado 20-

60ºC; Detector de fluorescencia Waters 474; Ordenador Pentium III y

Software Millenium 4.0) siguiendo el método basado en el protocolo descrito

previamente (Fukunaga et al., 1998).

Capítulo III. Materiales y Métodos160

Fase

estacionaria

Columna LiChroCart 250-4 (Superspher 100 RP-18) 250 x 4.6

mm

Fase Móvil

(Isocrático)

Fase A: 96% Tampón KH2PO4 50 mM p = 6,8

Fase B: 4% Acetonitrilo/Agua (70/30)

Flujo 0.5 ml/min

Vinyección ( L) 50 L

Profundidad de

la Aguja

0 mm

Tcarrusel muestra

(ºC)

4.0 1.0 ºC

Tcolumna (ºC) 40.0 5.0ºC

Fluorescencia

( medida)

Excitación 515 nm / Emisión 543 nm; Ganancia 10

Duración

(tretencion)

12 min (7.11 min)

Modo de

Medida

Áreas

Réplicas 1

Tabla III.6.: Parámetros instrumentales. Eluyente A: Tampón KH2PO4 50

mM pH 6, Eluyente B (Acetonitrilo Agua (70/30).

En tubos eppendorf de rosca, se añadieron 20 L de patrón

(Malondialdehido-bis-(dimetil)-acetal 99%, ALDRICH; Disolución Madre 1

mM de MDA= 8.25 L de MDA en 50 mL de agua milli-Q) o de la muestra

respectiva, 500 L de un tampón Acetato sódico (2M, pH=3.5; >99%, PA-

Panreac; 118 mL de acético glacial con 600 mL de agua milliQ, se ajusta el

pH a 3.5 con NaOH 10 M y se añaden 2 g de TBA. Se ajusta de nuevo el pH=

Capítulo III. Materiales y Métodos 161

3.5 con NaOH 10 M y se enrasa con agua milli-Q a 1 L) que contiene a su vez

un 0,2% (Peso/Volumen) de TBA (Scharlau) y se agitó vigorosamente. Se

incubaron en el bloque calefactor a 95ºC durante 1 h y se centrifugaron a

10.000 r.p.m. durante 2 min a 4ºC para condensar vapores. Se adicionaron

500 L de del tampón KH2PO4 (50 mM pH=6.8; 3,4 g de KH2PO4, en 400

mL de agua milli-Q y se ajusta el pH a 6,8 con KOH 2M.) y se volvió a

centrifugar durante 10 min a 13.000 r.p.m en frío (4ºC). A continuación se

tomaron 600 L del sobrenadante y se mezclaron con otros 600 L de

tampón KH2PO4 (50mM pH=3.5; 3,4 g KH2PO4 en 400 mL de agua milli-Q.

Se ajusta el pH a 3,5 con HCl 1 M= 4,14 mL HCl 37% en 50 mL) y tras pasarlo

a un vial se inyectaron en HPLC.

Figura III.2.: Cromatograma de MDA en plasma por HPLC-FLD. El pico

obtenido para MDA se obtuvo a los 6,9 min.

Los resultados se expresan en µmoles/L de MDA en plasma. Dicha

concentración se determina mediante interpolación del área correspondiente

a cada una de las muestras en la función de calibración obtenida con los

patrones de concentración conocida. La concentración de MDA se calcula por

interpolación en las funciones de calibrado establecidas con anterioridad.

)()(

1 bPendienteaordenadaSeñalC

Capítulo III. Materiales y Métodos162

El modelo de calibración seleccionado es el linear de regresión univariante

por mínimos cuadrados. En la tabla III.7. se muestran los parámetros

analíticos principales.

Parámetro MDA

*n 10

*k 8

Ordenada en origen (a) 3.08·104

sa 1.12·104

Pendiente (b) (L·µmol-1) 1.39·105

sb (L·µmol -1) 2.30·103

Coeficiente R2 (%) 99.78

Desviación estándar SRC 2.34·104

Test de fallo de ajuste (Plof %) 34.56

Tabla III.7: Parámetros de la función de calibrado.* k= nº de niveles de

calibración; n=nº de inyecciones totales.

A(X 10000

Capítulo III. Materiales y Métodos 163

El intervalo de concentraciones seleccionado para la aplicación del método es

de 0,10 a 10,0 µmoles/L. En este rango, la linealidad calculada es 98,34%.

La precisión del método analítico se ha evaluado a partir de la

reproducibilidad de la señal analítica mostrada por 10 disoluciones de

concentración constante e igual a 5,0 µmol/L del analito, concentración que

corresponde a la zona central de la función de calibrado.

N Señal media D.E D.E.R.

MDA 10 6,997·105 1,69·105 2,42%

Tabla III.8.: Cálculo del coeficiente de variación del método.

En la tabla III.9. se muestran los valores de las sensibilidades del calibrado y

analíticas para cada uno de los componentes de la mezcla, de acuerdo con las

definiciones propuestas.

SRC Sensibilidad (L/µmol) Res Analitica

(µmol/L)

MDA 2,34·104 1,39·105 0,17

Tabla III.9.: Cálculo de la sensibilidad del calibrado y del método.

Se ha estudiado la estabilidad de las muestras una vez procesadas y dentro

del carrusel de inyección a 4ºC. Para ello se han tomado tres muestras reales

y tres patrones de distinta concentración y se han inyectado varias veces a lo

largo del tiempo. En ningún caso el porcentaje de pérdida de área superó el

5%, lo que indica que las muestras pueden ser mantenidas en el carrusel de

inyección a esa tª durante el tiempo necesario para la realización del análisis.

Capítulo III. Materiales y Métodos164

III.2.5.3. Cuantificación de la actividad catalasa en cerebro

de conejo.

Se homogenizó el hemisferio cerebral izquierdo con buffer (20 mM Tris-

HCl, 2 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM benzamidina, 1 mM DTT, 1 mM

PMSF, pH= 7.4; 1 mL/ mg de tejido). A continuación se centrifugó a

12.000 r.p.m. durante 40 min a 4ºC.

Tiempo de medida 2 min

Tiempo de retraso 0

Mostrar absorbancia relativa

Pendiente positiva

Rango 0.500

Factor 1.000

Prog. Cubetas auto

Ref. modo off

Tabla III.10.: Parámetros instrumentales del espectrofotómetro para

determinar la actividad enzimática Catalasa a 240 nm.

Cada muestra se elaboró con 900 µL de tampón fosfato sódico (50 mM

pH=7.4: NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, tritón 1 % y SDS 0.5%) y 100 µL de

H2O2 (30%). Se añadieron 5 µL de cada muestra de proteínas y se mezclaron

rápidamente. Los parámetros de medida programados en el

espectrofotómetro fueron: tiempo de medida= 2 min; tiempo de retraso=0

min; absorbancia relativa; pendiente=positiva; rango=0.500; factor=1.000;

ref.modo=off. Tras determinar la absorbancia (A) a 240 nm, se expresa la

actividad como la caída de A240 durante el primer min por mg de proteína.

Capítulo III. Materiales y Métodos 165

III.2.7.4. Modelo de ácido kaínico: Laberinto acuático de

Morris.

Basándonos en el protocolo previamente descrito por Morris y colaboradores

(Morris, 1984), se dividió una piscina circular (1 metro diámetro) en 4

cuadrantes: sur, oeste, norte y este y se rellenó diariamente con unos 25 cm

de agua opaca, mediante la adición de unos 100 g de leche en polvo. La tª del

agua se mantuvo alrededor de los 25ºC y se colocaron referencias externas a

la piscina y al alcance visual de los animales. Se colocó una plataforma

circular y de superficie rugosa en posición suroeste e inmersa en la piscina,

cubierta por 1 cm de agua.

Se realizaron 2 bloques de entrenamiento diarios, con 4 pruebas por bloque,

durante 7 días y 1 h entre ambos bloques. Cada prueba se cronometró desde

el momento en que el animal entraba en el H2O hasta que tocaba la

plataforma con las patas delanteras. El inicio de cada una de las 4 pruebas

era la colocación del ratón en el agua, mirando hacia la pared, siguiendo el

orden: sur, oeste, norte, este. El tiempo máximo permitido para la

localización de la plataforma fue de 90 segundos. Si no era localizada, el

animal era guiado hacia ella y mantenido sobre la misma durante 15

segundos. Si la encontraba sin ayuda en el tiempo concedido, igualmente se

dejaba durante 15 segundos antes de ser retirado de la piscina.

Cada día y con anterioridad a la ejecución del entrenamiento, cada grupo de

ratones (n=10) fue sometido a un tratamiento concreto: el control de Ácido

Kaínico (SIGMA) recibieron 0,6 mg/día de la neurotoxina mediante

inyección intraperitoneal; el grupo sondado con DOPET (sintético) recibió 5

mg/día y el grupo “DOPET+AK” fue sondado e inyectado diariamente con las

dosis anteriormente especificadas. Así mismo, se estableció un grupo control

que no recibió ningún tipo de tratamiento.

Capítulo III. Materiales y Métodos166

III.2.7. Estudios de estabilidad de DOPET en agua.

Se planificó evaluar el efecto de DOPET disuelto en el agua de bebida, para

ser administrado en diferentes estudios, analizando la estabilidad del

compuesto en función del tipo de agua empleada.

Se escogieron 4 tipos de agua: Destilada, agua de mineralización débil

(500 mg/L de contenido global en minerales), agua de mineralización muy

débil (35 mg/L de residuo seco) y agua corriente del grifo. Se realizó un

calibrado para determinar la concentración de DOPET en cada tipo de

agua, utilizando cantidades igual a 0, 100, 200, 500, 1000, 1500, 2000 y

3000 ng de DOPET. Se adicionó una concentración de 0,2 g/L de DOPET

en cada tipo de agua, y se tomaron muestras a 0, 1, 3, 6, 9, 12, 24, 48 y 120

h. Se analizaron mediante HPLC-Masas (WATERS Alliance 2695m, con

detector de masas WATERS Micromass ZQ) en UV a 280 nm y en UV-MP.

La curva de calibrado obtenida para el análisis por UV-MP, se ajustó a la

ecuación:

y= 1865,8x + 129008; R2= 0,99

La curva de calibrado para el análisis mediante UV (280nm), correspondió

a:

y= 56,2x + 109,2; R2= 0,99

En la figura III.3. se muestran los porcentajes de la degradación de

DOPET a lo largo del tiempo en cada tipo de agua analizada mediante

HPLC-UV (280nm).

Capítulo III. Materiales y Métodos 167

0

20

40

60

80

100

0 30 60 90 120

Tiempo (h)

Deg

rad

ació

n D

OP

ET

(%)

Destilada

Grifo

Mineralz.débil

Minerlz.muy débil

Figura III.3.: Representación de la degradación de DOPET en cada tipo

de agua con el paso del tiempo. El análisis por HPLC-UV (280 nm) demostró

que el agua más apropiada para mantener la estabilidad del compuesto a lo largo

del tiempo era el agua de mineralización muy débil.

Una vez establecida como óptima el agua de mineralización muy débil para

mantener durante más tiempo la estabilidad de DOPET, se llevaron a cabo

estudios de la estabilidad en este tipo de agua, pero en condiciones de frío,

congelación, luz y oscuridad. A partir de una disolución de DOPET de 200

ppm, se estableció que su estabilidad no resultó alterada de manera

significativa bajo ninguna de las condiciones a las que se sometió el

compuesto.

Capítulo III. Materiales y Métodos168

III.2.7. Estudios del metabolismo del colesterol.

III.2.7.4. Determinación de actividad Latosterol-C5-

Desaturasa por HPLC.

El método se basa en los protocolos descritos previamente (Ishibashi and

Bloch, 1981; Kawata et al., 1985; Takakuwa, 1994).

Se realizó un homogenado de hígado de rata en hielo en 2,5

volúmenes/mg de tejido con buffer fosfato potásico 100 mM (11,7 g de

K2HPO4 en 200 mL de H2O destilada y 6,8 g de KH2PO4 en 0,5 L de H2O

destilada. Se ajustó el pH a 7.4 con la solución de KH2PO4 y se completó

con H2O hasta 0.5 L). En tubos con tapón de rosca (BECKMAN), se

centrifugó el homogenado a 13000 x g 10 min a 4ºC (Ultracentrífuga

OPTIMA L-90 K; Rotores Vti 50 y Vti 70). Se recogió el sobrenadante y se

centrifugó en los tubos con tapón de ajuste durante 1 h a 105000 x g a

4ºC. El sobrenadante (S105) fue sometido a diálisis en tubos de diálisis

(SIGMA) en buffer P (150 mL de buffer fosfato potásico 100 mM en 850

mL de H2O destilada y 0.042 g de EDTA; 3 cambios de buffer a 4ºC,

durante 4 h). La membrana de diálisis se lavó e hirvió previamente con

H2O destilada y EDTA durante 30 min. El pellet resultante de la

centrifugación se lavó y resuspendió en Tris HCl (pH=7.5, BIORAD) para

obtener microsomas. Se midió la concentración de proteínas por Bradford

y se llevó hasta una concentración de 10 mg/mL.

Para preparar liposomas, se mezclaron 2.5 mg de fosfatidilcolina de huevo

(SIGMA), 1 mg de latosterol (SIGMA) y 25 µg hidroxitolueno (SIGMA) en

cloroformo. Esta solución se secó con N2 y se mezcló con 2 mL de solución

A (8.55 g sacarosa, 0.12 g Tris en 100 mL de H2O destilada, pH=7.4, 0.042

g EDTA). Las muestras se sometieron a sonicación a 100 vatios durante 30

min en hielo hasta eliminar la turbidez.

Para preparar cada muestra de reacción (volumen final de 200 µL) se

mezclaron 40 µL de S105, 60 µL de liposomas (400 µM), 50 µL de

microsomas (0.5 mg de proteína) y 50 µL de buffer P. Se incubaron

Con formato: Fuente: 12pt

Capítulo III. Materiales y Métodos 169

durante 3 h a 37ºC en agitación en un termomixer. Transcurrido este

tiempo, se fueron añadiendo alícuotas de 2 µL de NADH (245 mM,

SIGMA) cada 10 segundos sobre la muestra. Transcurridos 5 min desde

que el inicio de la reacción para la primera muestra, se detuvo la misma

mediante la adición de la muestra sobre una solución de 0.5 mL de 20%

KOH en 50% metanol (11 g de KOH en mezcla de 25 mL de H2O destilada

y 25 mL de metanol) y 0.4 mL de buffer P. Se recogieron las muestras en

serie cada 10 segundos y se dejaron saponificar a tª ambiente durante 1 h.

Se realizaron 3 extracciones con 1 mL de n-hexano. Se reunieron las tres

fases orgánicas en un tubo de vidrio con tapón de rosca. Se secaron con N2

líquido y se resuspendieron en 100 µL de n-hexano. Finalmente, las

muestras fueron filtradas y preparadas en viales cromatográficos para ser

inyectados en HPLC 2695 (HPLC A, WATERS, nº Serie D98SM7647M

provisto de: inyector automático, horno de columna termostatizado 20-60

ºC y detector de PDA 2695, ordenador Pentium III y Software Millenium

4.0). Los parámetros instrumentales quedan recogidos en la siguiente

tabla III.11.:

Capítulo III. Materiales y Métodos170

Fase estacionaria Columna SupelcoSil LC-18-DB 150x4.1 mm,

5 m

100% Hexano/Isopropanol

Fase Móvil (Isocrática) Fase A: MeOH/Agua/AcN (55/5/40)

Flujo 1,0 mL/min

Vinyección 40 L

Profundidad Aguja 2 mm

Tcarrusel muestra (ºC) 5,0 5,0 ºC

Tcolumna (ºC) 50,0 5,0 ºC

Duración (tretencion) 20 min (t7-DHC = 11,29 min)

PDA Rango ( medida) 230 – 350 nm (280 nm)

Modo de Medida Áreas

Réplicas 1

Tabla III.11.: Parámetros instrumentales de HPLC para la

determinación de LC5D. Se utilizó como patrón el 7-dehidrocolesterol (7-DHC,

disolución madre de 1 g/L en metanol calidad HPLC).

La curva de calibración se realizó con concentraciones crecientes de 7-DHC

disuelto en hexano: 1 µg/mL; 10 µg/mL; 50 µg/mL; 100 µg/mL y 200

µg/mL. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla III.12. y figura III.4.

Capítulo III. Materiales y Métodos 171

Patrón 7-DHC ng Área

1 10 30349

10 100 351784

50 500 1740055

100 1000 3480178

200 2000 6839381

Tabla III.12.: Valores obtenidos por HPLC-PDA para la curva patrón de

7-DHC. La ecuación a la que se ajustó la curva fue: y=-5,048 + 0,00029*x. R2=

0,9999.

Figura III.4.: Cromatograma para la identificación de 7-DHC en

microsomas hepáticos de rata, por HPLC-PDA (280nm). La

detección se realizó empleando como eluyente 100% de una mezcla

hexano/isopropanol. El tiempo de retención fue de 8,58 min.

Capítulo III. Materiales y Métodos172

III.2.7.4. Efecto de diferentes dietas en el metabolismo del

colesterol de conejos.

El estudio se llevó a cabo en 56 conejos alimentados durante 30 días con

una dieta aterogénica (dieta chow 95%, grasa saturada 3% (manteca de

cerdo), colesterol 1,33%) (Ramirez-Tortosa et al., 1998). Recibieron 150 g

de cada dieta al día y H2O ad libitum. La ingesta diaria se controló por

pesada diaria del sobrante. El peso de los animales se controló

semanalmente. El esquema de trabajo se recoge en la figura III.5. El

DOPET se administró por sondaje, 10 mg/conejo/día, resuspendido en

H2O ELIX al 0.9 % de NaCl y filtrado con filtro de 0.22 µm.

Se anestesiaron con pentotal sódico inyectado por vía intravenosa en la

vena marginal de la parte posterior de la oreja izquierda, se sacrificaron

por dislocación cervical y se extrajo sangre y cerebro.

Figura III.5.: Esquema del estudio realizado en 56 conejos alimentados

con diferentes dietas.

Dieta chow Dieta aterogénica

Dieta aterogénica + DOPET16 conejos Grupo ADT

(n=8)30 días

Chow + DOPET Grupo DT

(n=8)

16 conejos

Dieta aterogénica

Dieta aterogénica

30 días 30 días

Grupo AA (n=8)

Grupo CA (n=8)

16 conejos

Dieta chow 6% materia grasa

30 días 30 días

Grupo CF (n=8)

Grupo CO (n=8)

Dieta chow 6% materia grasa

30 días

8 conejos

30 días 30 días

Grupo AC (n=8)

Capítulo III. Materiales y Métodos 173

III.2.7.4. Determinación de la concentración de colesterol en

cerebro y plasma.

Cada hemisferio cerebral se pesó y homogenizó en buffer de homogenización

(1 mL/g tejido; 20 mM Tris-HCl, 2 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM

benzamidina, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, pH= 7.4). La extracción de colesterol se

realizó con 40 mL de cloroformo:metanol (2:1, v/v) en un tubo falcon. Tras

mezclar bien, se centrifugó durante 10 min a 2500 r.p.m. La fase superior e

interfase se transfirieron a un nuevo tubo nuevo para repetir la extracción en

20 mL de cloroformo:metanol (2:1). Tras una última extracción para combinar

las 3 fases clorofórmicas, se llevaron a sequedad en rotavapor (BUCHI) a 45-

50ºC. A continuación se resuspendieron en 7 mL de cloroformo:metanol (2:1),

y se mezclaron 400 µL de esta resuspensión con 1 mL de una solución 2%

Triton X-100:cloroformo. Nuevamente se llevaron a sequedad para una

resuspensión final de las muestras en 0.5 mL de H2O. La cantidad de

colesterol total se determinó en 5 µL de muestra mediante la realización de un

ensayo colorimétrico-enzimático, siguiendo las instrucciones del kit (Bio

Systems). La concentración de colesterol total se expresó en mg/g de tejido

húmedo.

Para la determinación de la concentración de colesterol total, LAD-

colesterol, LBD-colesterol y triglicéridos en plasma, se siguió el protocolo

suministrado por el fabricante de los kits (Bio Systems). Tras la punción

cardiaca a los animales, la sangre se centrifugó durante 10 min a 3500 rpm

para obtener el plasma. Tanto para la determinación de colesterol total

como de triglicéridos (TG), se mezclaron 10 µL de muestra con el reactivo

del kit, y tras 10-15 min de incubación a tª ambiente se determinó la

absorbancia (A) a 500 nm en espectrofotómetro. La concentración de la

muestra se estableció mediante la fórmula: (A muestra /A patrón)*

Concentración patrón, donde la concentración del patrón era de 200

mg/dL. En el caso de la determinación de la concentración de LAD-

colesterol, se tomaron 200 µL de muestra iniciales, y la concentración del

patrón era de 52,5 mg/dL. Finalmente, el cálculo de la concentración de

Capítulo III. Materiales y Métodos174

LBD-colesterol se estableció según la fórmula de Friedewald: LBD= Col-

(TG/5) + LAD.

III.2.7.4. Concentración de latosterol en cerebro por CG-

MS.

El latosterol es un metabolito en el metabolismo del colesterol, que es

degradado por la enzima LC5D en 7-DHC. La determinación de latosterol

se llevó a cabo en base a estudios previos (Fassbender et al., 2001; Folch et

al., 1957) utilizando un cromatógrafo de gases con inyector automático,

acoplado a un espectrofotómetro de masas (CG-MS Varian provisto de:

Inyector automático Varian 8200; Cromatógrafo de gases Varian 3400;

Espectrómetro de masas Varian Saturn MS/MS 2000; Ordenador

Pentium II y Software Saturn 5.5.1). A continuación se muestran las

condiciones de análisis optimizadas para la determinación del compuesto

en las muestras problema.

Capítulo III. Materiales y Métodos 175

Fase estacionaria Supelco Sil ODS 2

Fase Móvil Helio Purísimo

Vinyección ( L) 2 L

CG

Horno To = 150 ºC (3 min)

T1 = 290 ºC (30ºC/min, 17.33 min)

Duración 25 min

Inyector 150 ºC (25 min)

Espectómetro de masas

Temp. Trampa 200ºC

Temp. Manifold 50ºC

Temp. Línea transferencia 260ºC

Rango masas

Retraso 4.50 min

De 4.5 min a 13.0 min Cerrado

De 13.0 a 14.5 min 45 a 650 m/z

Flujo columna 1.0 mL/min

Relación de flujo 10

Modo de Medida Áreas

Réplicas 1

Tabla III.13.: Parámetros instrumentales de GC-MS para la

determinación de latosterol en cerebro. Los iones de los compuestos

seleccionados para el método de trabajo SIM fueron: Naftol (201, 216 m/z),

Latosterol (443, 458, 459 m/z), Antraceno (178 m/z).

Capítulo III. Materiales y Métodos176

Para elaborar las muestras, se utilizó una alícuota de 0,5 mL de las

muestras obtenidas mediante el protocolo descrito anteriormente para la

determinación del colesterol total en cerebro, y se llevó a sequedad en

evaporador-Speed Vac. A continuación se disolvieron en 250 µL de acetato

de etilo. Las muestras se someten a sonicación durante 15 min y se agitan

en vortex durante 1 min. Por último se adicionan 10 µL del patrón interno

( -naftol (1 g/L) disuelto en etanol) y se derivatizan 25 µL de cada muestra

adicionando una mezcla constituida por 15 µL de BSTFA (N,N-Bis

(trimetilsilil)-trifluoroacetamida), 5 µL de piridina, 2.5 µL antraceno (500

mg/L) y 2,5 µL acetato etilo.

Los resultados se expresan en g de analito por litro de disolución. La

concentración se determina mediante interpolación del área

correspondiente a cada una de las muestras en la función de calibrado

obtenida con los patrones de concentración conocida.

El modelo de calibración seleccionado es el linear de regresión univariante

por mínimos cuadrados.

La curva patrón se ajustó a la ecuación: y= 0,025 + 0,088*x, y el valor

de R2= 99.66 %.

Recta de patrones disueltos en acetato de etilo, donde C= 0.1 mg/L; 0.5

mg/L; 1 mg/L; 5 mg/L; 10 mg/L; 20 mg/L. Sin embargo los resultados

finales son relativos, ya que la recta de patrones no está realizada en las

mismas condiciones que las muestras. Sería necesario trabajar con adición

de patrón.

IV. RESULTADOS

Capítulo IV. Resultados 178

IV.1. Estudios en modelos animales de la EA.

IV.1.1. Estudios con dietas enriquecidas en AGPIs

omega-3 en modelo transgénico simple PPA de la EA.

Con objeto de determinar la influencia de los AGPIs omega-3 de la dieta

sobre ciertos parámetros bioquímicos relacionados con el desarrollo de la

patología de la EA (niveles de colesterol, ácidos grasos y de péptido A ), se

decidió utilizar el modelo de ratón transgénico simple de la EA

denominado PPA-Tg53. Este modelo se caracteriza por expresar la proteína

PPA en un factor igual a 7, desarrolla los depósitos de A -40 en torno a los

6 meses de edad, y presenta neuritas. Lo escogimos para poder evaluar el

efecto de la dieta en un tiempo relativamente breve pero suficiente para

dejar actuar a los AGPIs.

IV.1.1.1. Determinación de ácidos grasos en cerebro y

plasma.

El 60% del cerebro está formado por lípidos estructurales. El ácido

araquidónico (AA; omega-6) y los ácidos docosahexaenoico y

eicosapentaenoico (DHA y EPA; omega-3) son necesarios para el

crecimiento y el neurodesarrollo (sensorial, perceptivo, cognitivo y motor)

(Clandinin, 1997). La relación ADH:AA se utiliza como indicador de la

maduración cerebral (Innis et al., 1997) y la relación AA:EPA como

indicador de la disponibilidad de precursores de eicosanoides,

determinantes en los procesos inflamatorios (Adams et al., 1996).

Los AGPIs son componentes de los fosfolípidos de membrana, y están

ligados a la EA por ser especialmente vulnerables al estrés oxidativo,

habiéndose descrito una mayor degradación de los fosfolípidos cerebrales

en estos pacientes (Prasad et al., 1998). Los AGPIs omega-3 contenidos en

la dieta suprimen la inflamación y disminuyen la producción de citoquinas

Capítulo IV. Resultados 179

pro-inflamatorias, por lo que se decidió estudiarlos en un modelo animal

de la EA, para analizar el beneficio de este tipo de dieta (EPA:ADH, en

proporción 2:1) sobre esta patología.

La determinación de ácidos grasos en cerebro se realizó mediante Gases-

Masas en 3 animales de cada género, genotipo y grupo de dieta. La distinción

por géneros (en este y otros parámetros), se estableció por la mayor incidencia

de la EA en el género femenino (Andersen K and L, 1999.; Miech RA and AS,

2002.).

Los resultados obtenidos en porcentajes de ácidos grasos totales para AA,

DHA y EPA, quedan recogidos en la tabla IV.1. y representados en las figuras

IV.1. (para AA) y IV.2. (para ADH).

Cerebro

AA

(Media) Error

ADH

(Media) Error

Machos_wt_control 10,2 0,55 15,9 0,36

Machos_PPA_control 11,1 0,30 16,5 0,23

Hembras_wt_control 9,67 0,08 15,2 0,25

Hembras_PPA_control 10,1 0,11 15,3 0,40

Machos_wt_omega3 9,89 0,08 16,6 0,53

Machos_PPA_omega3 9,77 0,20 16,7 0,24

Hembras_wt_omega3 10,1 0,26 16,5 0,29

Hembras_PPA_omega3 10 0,31 16,5 0,24

Tabla IV.1.: Valores para los niveles de ácidos grasos en cerebro en los

diferentes grupos de dietas. Se muestran los porcentajes de AA y ADH (totales)

en cada uno de los grupos, desglosados por tipo de dieta (control y omega3), género

y genotipo (wt= no transgénico, PPA=transgénico).En todos los subgrupos

estudiados se obtuvo un 0% de EPA en cerebro.

Capítulo IV. Resultados 180

6

9

1 2

AA

(%

)

Ma He

PPA

Ma He

Wt

Ma He

PPA

Ma He

Wt

CONTROL OMEGA-3

* *

*

Figura IV.1.: Representación del nivel medio de AA total en cerebro (%)

en cada uno de los grupos. Se representan ambos grupos de dietas,

distinguiendo entre géneros (Ma=machos y He=hembras) y genotipo (Wt=no

transgénicos y PPA= transgénicos). Se obtuvo un descenso estadísticamente

significativo (P<0,05; representado con un asterisco) entre el grupo omega-3

comparado con el grupo control en su conjunto, así como entre los machos

alimentados con omega-3 con respecto a los machos mantenidos con dieta control.

Capítulo IV. Resultados 181

9

12

15

18

AD

H(%

)

Ma He

PPA

Ma He

Wt

CONTROL OMEGA-3

Ma He

PPA

Ma He

Wt

*

*

Figura IV.2.: Representación de los porcentajes del nivel medio de ADH

(%) en cerebro en cada uno de los grupos. Se obtuvo un incremento

significativo (P=0,01) en el grupo omega-3 comparado con el grupo control, así

como un aumento significativo en el grupo de hembras transgénicas alimentadas

con omega-3 en relación a las hembras transgénicas con dieta control (P<0,05).

En relación a los niveles medios de AA en cerebro, el análisis estadístico por

ANOVA (Un factor) reveló un descenso estadísticamente significativo

(P<0,05) entre los ratones machos alimentados con dieta omega-3 en relación

a los animales del mismo género que recibieron dieta control. Así mismo,

comparando conjuntamente al grupo omega-3 con el grupo control, se obtuvo

una reducción estadísticamente significativa (P= 0,01) en el valor obtenido

para este ácido graso. No se observó una bajada significativa (P= 0,76) entre

las hembras alimentadas con cada tipo de dieta.

Con respecto a los niveles medios de ADH, la aplicación de ANOVA (Un

factor) demostró un incremento estadísticamente significativo entre el

grupo dieta omega-3 en relación al grupo control (P= 0,01). También se

obtuvo un aumento significativo de ADH entre las hembras PPA-control y

Capítulo IV. Resultados 182

las hembras PPA-omega-3 (P<0,05). Sin embargo, no se obtuvo ninguna

diferencia significativa entre los grupos de ratones machos (P= 0,57).

La extracción de ácidos grasos en plasma, se llevó a cabo en grupos de 4

animales por tipo de dieta, genotipo y género. Los resultados se muestran

en la tabla IV.2. y se representan en la figura IV.3.

Plasma

AA

(%) ADH (%)

EPA

(%)

Machos_wt_control 10,5 4,73 0

Machos_PPA_control13,5 5,92 0

Hembras_PPA_control 9,9 4,97 0

Machos_wt_omega36,8 5,99 2,99

Machos_PPA_omega34,69 5,14 2,87

Hembras_wt_omega3 5,85 5,95 2,7

Hembras_PPA_omega3 8,15 7,67 2,8

Tabla IV.2.: Valores medios (%) de ácidos grasos AA, ADH y EPA en

plasma. Debido al reducido volumen de plasma obtenido de cada ratón, se

utilizó el tejido de los 4 animales que representaban cada grupo para realizar la

extracción, salvo para el grupo de hembras no transgénicas de la dieta control,

que no pudo realizarse por falta de plasma.

Capítulo IV. Resultados 183

Figura IV.3: Representación de los valores medios de AA, ADH y EPA en

plasma. Se identificaron los picos por CG-Masas correspondientes a AA, ADH y

EPA en el plasma de cada grupo de ratones, diferenciados por genotipo, género y

dieta. Se obtuvo un descenso significativo (P<0,05) de los niveles de AA en el grupo

omega-3 con respecto al grupo control. No hubo distinción entre géneros ni

genotipos.

El análisis estadístico determinó una reducción estadísticamente significativa

(P<0,05) en los niveles de AA en plasma en el grupo omega-3 con respecto al

grupo control, aunque no se obtuvo ninguna diferencia significativa para los

niveles de ADH (P= 0,22). La aparición exclusiva de EPA en plasma del grupo

omega-3 se asocia con la composición de la dieta omega-3, elaborada con 10

g/kg EPA.

Por tanto, el análisis de los niveles de ácidos grasos en este estudio demostró

que no existían diferencias significativas entre el grupo de no-transgénicos y

de animales PPA, aunque al comparar los diferentes géneros se obtuvo una

reducción de los niveles de AA en machos omega-3 con respecto a los machos

alimentados con dieta control, mientras que en las hembras se observó un

incremento en los niveles de ADH cerebral entre hembras PPA-omega3

0

2

4

6

8

10

12

14

Áci

dos

gras

os t

otal

es(m

edia

,%)

CONTROL OMEGA-3

AA EP

A

AA

AA

AA

AA

AA

AA

AD

H

AD

H

AD

H

AD

H

AD

H

AD

H

AD

H

EP

A

EP

A

EP

A

Ma_Wt Ma_PPA He_PPA Ma_Wt Ma_PPA He_Wt He_PPA

*

**

*

Capítulo IV. Resultados 184

respecto a las hembras PPA-control. La suplementación de la dieta con AGPIs

omega-3 supuso una reducción de los niveles de AA (omega-6) totales, tanto

en plasma como en cerebro y un incremento de los niveles de ADH (omega-3)

totales en cerebro, independientemente de su género y genotipo.

IV.1.1.2. Determinación de colesterol total en cerebro y

plasma.

La determinación de colesterol en cerebro, mediante kit colorimétrico (Bio

Systems), dio lugar a los resultados incluidos en la tabla IV.3. y

representados en la figura IV.4.

0

5

10

15

20

25

[CO

L](

mg/

dL

)

CONTROL OMEGA-3

Ma He

PPA

Ma He

Wt

Ma He

PPA

Ma He

Wt

*

** *

*

Figura IV.4.: Representación de los valores medios de colesterol total

en cerebro. Se compararon ambos grupos de dietas y cada uno de los

subgrupos establecidos en base al género y genotipo. Se obtuvieron reducciones

significativas (P<0,05) en el grupo omega-3 respecto al control, así como entre

las hembras con dieta control respecto a los machos de su grupo, y finalmente un

descenso en los niveles de colesterol en los machos alimentados con omega-3

respecto a los machos mantenidos con dieta control.

Capítulo IV. Resultados 185

El análisis comparativo mediante ANOVA (Un factor) de los niveles de

colesterol total en cerebro, dio como resultado una reducción

estadísticamente significativa para el grupo omega-3 con respecto al grupo

control en su conjunto (P<0,05). Analizando los subgrupos, se obtuvo un

descenso en los niveles de colesterol de los machos alimentados con omega-3

en relación a los machos control. Finalmente se observó un descenso de este

parámetro en las hembras control en comparación con los machos

mantenidos con el mismo tipo de dieta.

Para la determinación de la concentración de colesterol total en plasma se

empleó un kit colorimétrico (Infinity, Thermo, Melbourne, Australia).

Los datos obtenidos se representan en la figura IV.5.

0

20

40

60

80

100

120

140

[CO

L](

mg/

dL)

CONTROL OMEGA-3

Ma He

PPA

Ma He

Wt

Ma He

PPA

Ma He

Wt

*

Figura IV.5.: Representación de los niveles de colesterol total en

plasma. Se muestran los valores medios para la concentración de colesterol total

determinada en plasma mediante espectrofotometría (500 nm). Tamaño de

muestra: PPA_contr (5xHe, 6xMa); Wt_contr (7xHe, 7xMa); PPA_om3 (9xHe,

6xMa); Wt_om3 (8xMa). Se obtuvo un descenso significativo (P<0,05) en el grupo

de hembras PPA alimentadas con omega-3 frente a las hembras PPA con dieta

control.

Capítulo IV. Resultados 186

El análisis estadístico demostró una reducción estadísticamente

significativa (P<0,05) entre el grupo de hembras PPA-control y las

hembras PPA-omega 3.

En resúmen, podemos establecer que los análisis de colesterol dieron como

resultado una reducción de los niveles de colesterol cerebral en el grupo

omega-3 en comparación con el grupo control, independientemente de su

genotipo y género. Esto es muy importante, ya que el contenido en

colesterol cerebral es difícilmente modificable, y con este tipo de dieta

hemos observado un efecto beneficioso. Al hacer la distinción por géneros,

se obtuvo una reducción del colesterol en cerebro de hembras alimentadas

con dieta control y de machos con dieta omega-3, con respecto a sus

respectivos géneros opuestos en sus grupos e independientemente de sus

genotipos. Sin embargo, el único grupo que sufrió un descenso de los

niveles de colesterol en plasma fueron las hembras PPA alimentadas con

omega-3, lo que hace pensar en que la sobreexpresión del gen PPA unida a

la dieta enriquecida en AGPIs omega-3 facilitó el descenso de dicho

parámetro.

IV.1.1.3. ELISA A 40.

El modelo animal utilizado en este estudio, PPA-Tg53, se caracteriza por

desarrollar depósitos cerebrales formados predominantemente por la

acumulación del péptido A 40, de manera prominente a partir de los 6

meses de edad.

El estudio tuvo que ser finalizado antes de que los animales cumplieran los

6 meses, en base a las muertes prematuras espontáneas (por causas

desconocidas y ajenas al estudio). Por tanto, se decidió determinar la

presencia de A 40 en los lisados de PBS (fracción soluble) mediante un

Western blot (geles “NU_PAGE”, (ANAMED Elektrophorese GmbH

(Darmstadt)) ya que los lisados de ácido fórmico se utilizan en animales de

mayor edad, que ya presentan depósitos peptídicos que necesitan ser

solubilizados. La fotografía del gel se muestra en la figura IV.6.

Capítulo IV. Resultados 187

Figura IV.6.: Western blot de los lisados de PBS de cerebro en ambos

grupos de dietas. Se seleccionaron los animales de edad más avanzada para

determinar la banda correspondiente a A 40 en los animales del estudio. Ya que la

banda que nos interesaba observar era la correspondiente al péptido A 40 y

esperábamos niveles bajos, tuvimos que exponer la membrana del gel durante más

tiempo del adecuado para observar las dos bandas correspondientes a la proteína

PPA. Anticuerpo primario =WO-2 (detecta PPA, C99 y ambas especies de A ) , que

revela que los animales transgénicos expresaban el transgén de 12 kDa (PPA) y

adicionalmente la banda de A de4 kDa correspondiente al procesado por las -

secretasas.

A pesar de obtener una banda muy tenue la consideramos suficiente para

proceder a la determinación por ELISA, utilizando el kit ELISA hAmyloid-

40 kit (The Genetics Company, Schlieren, Switzerland). Los resultados

obtenidos se representan en la figura IV.7.

Capítulo IV. Resultados 188

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Edad (semanas)

A4

0 (

µg/

g)

Ma_contr

He_contr

Ma_om3

He_om3

†

†

Figura IV.7.: Niveles de péptido A 40 (µg/g) en cada subgrupo de

ratones PPA. Se representa la concentración de A 40 (µg/g) en los lisados de

PBS. Se obtuvieron reducidos niveles de péptido, probablemente por la temprana

edad a la que fueron analizados estos animales. Tamaño de muestra: n=6 (todos

los grupos).

Se observa una tendencia (representada por una cruz) al descenso de este

parámetro en las hembras de cada dieta, siendo más pronunciada en la dieta

omega-3. Dilución lisados PBS=1:10 en animales de 15 y 16,5 semanas y dilución

1:5 en los demás). Dilución del lisado en el buffer de homogenización=8 y factor

de neutralización= 11.

Al analizar los valores de A 40 obtenidos en los cerebros de cada uno de

los subgrupos establecidos por género y tipo de dieta, no se obtuvieron

diferencias significativas entre ambos tipos de dietas, aunque se observó

una diferencia de género, basada en la tendencia al descenso de este

parámetro en el grupo de las hembras conforme al incremento de la edad.

Esta tendencia resultaba más fuerte en las hembras alimentadas con

omega-3, en las que los niveles se ven reducidos en un factor 10 entre los

11,5 y los 16,5 meses de edad. Por tanto, podríamos hipotetizar que la dieta

Capítulo IV. Resultados 189

enriquecida con AGPIs omega-3 podría haber ejercido un claro descenso de

los niveles peptídicos si los animales hubieran sido sacrificados con 6

meses de edad, dado su efecto significativo sobre los niveles de colesterol y

ácidos grasos (cerebrales y plasmáticos) y su tendencia a la reducción en

los niveles de A 40.

IV.1.1.4. Correlación entre colesterol y A 40.

Hay numerosa bibliografía que relaciona el aumento en los niveles de

colesterol con un incremento del riesgo para desarrollar la patología de la

EA, aunque hasta la fecha continúa existiendo cierta controversia al

respecto.

Por tanto se plantearon dos objetivos: i) determinar si podría establecerse

una relación entre el incremento de colesterol (plasmático y/o cerebral) y el

aumento de A 40 en cada grupo de ratones (control y omega-3) y ii)

establecer si la dieta influyó en dicha relación.

Para ello, se analizaron estadísticamente los valores de todos los parámetros

mediante modelos de regresión linear, y se pudo concluir: i) en el grupo

alimentado con dieta control, no se pudo establecer una relación

significativa entre el incremento de colesterol y el aumento de A 40 y ii) en

el grupo con dieta omega-3 se obtuvo una tendencia al descenso de A 40

acompañado de la reducción en colesterol plasmático. Este resultado

coincide con el descenso de colesterol plasmático observado en hembras

PPA y su tendencia a la reducción en depósitos de A 40.

Finalmente, compilando todos los resultados de este estudio establecimos

las siguientes comparaciones:

1) Entre la dieta omega-3 y dieta control: el grupo om-3 presentó un

descenso significativo en los niveles cerebrales y plasmáticos de AA (om-6) y

un incremento en los niveles cerebrales de ADH y plasmáticos de EPA (om-

3). Así mismo, los niveles de colesterol en cerebro se vieron reducidos tras la

ingesta de esta dieta om-3. Se ha demostrado que un incremento en la

relación om-3:om-6 indica la actividad antioxidante de ADH y supone una

Capítulo IV. Resultados 190

mejora en funciones cognitivas como el aprendizaje y la memoria

(Hashimoto et al., 2002). Estos resultados indican una mejora evidente en

el metabolismo lipídico de los animales mantenidos con la dieta enriquecida

en AGPIs om-3, en los que el contenido en om-3 incrementaría a expensas

de una disminución en la composición de om-6, lo que supondría una

mejora en las membranas celulares, reforzada por la reducción en el

contenido en colesterol en cerebro. El hecho de que los animales presenten

modificaciones en los ácidos grasos y el colesterol cerebral indica la eficacia

de la dieta a corto plazo y su capacidad para atravesar la BHE.

2) Entre los ratones no transgénicos y transgénicos: no se obtuvieron

diferencias relevantes entre los animales salvajes y los transgénicos,

mientras que en el grupo de transgénicos se observó un beneficio en el

grupo alimentado con om-3 frente al control a nivel de una reducción en el

colesterol plasmático y un incremento en los niveles de ADH cerebral. Estos

resultados soportan el beneficio de este tipo de dieta enriquecida aplicada a

este modelo animal capaz de sobreexpresar el gen PPA en una magnitud de

7 veces con respecto al nivel normal de expresión.

3) Entre ambos géneros: mientras que los machos alimentados con om-3

presentan una disminución en los niveles de AA cerebral en relación a los

machos controles, las hembras om-3 mostraron una reducción del colesterol

plasmático, un aumento en los niveles de ADH cerebral y una tendencia a

reducir los niveles de A 40. Todos estos datos refuerzan las ventajas de la

suplementación con una dieta omega-3 en un modelo animal de la EA, y

especialmente para las hembras PPA, en base a la posible sustitución de los

omega-6 por los omega-3 de la dieta, lo que supone un claro y demostrado

beneficio para el equilibrio plasmático y cerebral a través del incremento en

la fluidez de las membranas celulares.

Capítulo IV. Resultados 191

IV.1.2. Estudios en ratones mutantes KOZACK-colesterol

16.

Tras los resultados obtenidos en el estudio anterior, nos pareció interesante

continuar con el estudio de la relación entre el colesterol en sangre y los

niveles de A en cerebro, utilizando otro modelo animal de la EA. Se

desarrolló un modelo mutante de la EA, denominado Kozack-Colesterol-16,

creado a partir del cruce de la línea denominada “Colesterol-16” (Col-16) con

un modelo transgénico simple de la EA, denominado PPA-Tg53.

Se determinaron los niveles de colesterol sérico tanto en los ratones mutantes,

mutantes no transgénicos (Kozack-Col16 sin expresar PPA) y en las líneas

progenitoras base y posteriormente se midieron los niveles de A 40 y de A

42 en cerebro.

En esta ocasión, volvimos a distinguir los subgrupos basados en el género

(Ma=machos, He=hembras) para comprobar si de nuevo se observaban

diferencias entre ambos.

IV.1.2.1. Determinación de la concentración de colesterol en

suero.

Para analizar el efecto causado por el cruce de dos líneas puras (C57 con bajos

niveles de colesterol y C3H con elevados niveles de colesterol), junto con la

mutación provocada por la inyección de ENU y el cruce con un modelo de la

EA, sobre los niveles de colesterol en suero, se determinó este parámetro en los

ratones mutantes Kozack-Col 16, Kozack-Col16 sin expresar PPA y en 3 grupos

de ratones: i) la línea progenitora C57Bl6/NCrl (6 meses de edad, n=5xMa y

n=5xHe), ii) la otra línea progenitora C3H/NCrl (6 meses de edad, n=5xMa y

n=5xHe) y iii) animales híbridos C57xC3H (3 meses de edad, n=10xMa y

n=10xHe). La determinación de los niveles de colesterol en estos 3 últimos

grupos nos daría una idea de los niveles basales de dicho parámetro en las

líneas puras.

Capítulo IV. Resultados 192

Los resultados obtenidos para los valores de colesterol en suero

determinados mediante kit colorimétrico (Infinity, Thermo; Melbourne,

Australia) en todos los grupos mencionados con anterioridad, se muestran

en la tabla IV.3. y se representan en la figura IV.8.

Género Raza

Edad(meses)

Media colesterol suero (mg/dL) Error

Ma C57Bl6/NCrl 6 91,7 13,8

He C57Bl6/NCrl 6 98,8 14,2

Ma C3H/NCrl 6 142,6 5,46

He C3H/NCrl 6 173 28,1

Ma C57xC3H 3 123,2 10,3

He C57xC3H 3 104,9 8,74

MaKoz-Col16-

PPA 6 106,9 33,5

HeKoz-Col16-

PPA 6 104,3 19,6

MaKoz-Col-16-

Wt 6 150,1 4,6

HeKoz-Col16-

Wt 6 115,7 12,5

Tabla IV.3.: Niveles de colesterol total en suero para todos los

animales incluidos en el estudio. Se muestran los valores medios

(±desv.promedio) del colesterol en suero (mg/dL) para cada grupo (por

genotipo) y subgrupo (por género). Las razas C57Bl6/NCrl y C3H/NCrl fueron

las líneas progenitoras iniciales, de los que se obtuvieron los híbridos C57xC3H

a partir de los cuales se crearon los mutantes Colesterol 16 que fueron cruzados

con los transgénicos simples de la EA, generando los mutantes transgénicos

Kozack-Col16.

Capítulo IV. Resultados 193

Estos resultados nos permitieron establecer que los niveles de colesterol en

suero alcanzaban un valor intermedio entre los niveles atribuidos a las líneas

base puras, tanto para los híbridos sin mutación, los animales Kozack-Col16

no transgénicos y los animales Kozack-Col16 PPA. Podríamos apuntar la

tendencia al descenso de estos niveles en los animales mutantes y

transgénicos (Kozack-Col16-PPA), quizás por la sobreexpresión de PPA en

relación a los no mutantes no transgénicos. No se observaron diferencias

significativas entre los géneros de cada subgrupo.

Figura IV.8.: Representación de la concentración media de colesterol en

suero en las 4 razas utilizadas en este estudio. Aunque no se obtuvieron

diferencias significativas entre los grupos de híbridos (C57xC3H) con respecto a los

grupos de mutantes Kozack-col16, transgénicos (PPA) y no transgénicos (Wt), se

observó una tendencia (cruz) a reducirse los niveles de colesterol en el grupo de

Kozack-PPA respecto a los Kozack-Wt, así como una tendencia a que los machos

Kozack-Wt presenten mayores niveles que los machos híbridos y mutantes PPA.

Al comparar los 4 grupos mediante la prueba de comparación múltiple de

Dunn, se obtuvieron diferencias significativas entre la línea C57 frente a

C3H (P<0,001), entre C3H y C57xC3H (P<0,01) y C3H frente a Kozack-

Col16 (P<0,01). Sin embargo, ni se hallaron diferencias significativas entre

C57 y C57xC3H, ni C57 frente a Kozack-Col16, ni entre C57 xC3H frente a

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

Col

este

rol (

mg/

dL)

C 5 7 B l C 3 H C 5 7 x C 3 H K o z -P P A †

K o z -

Ma

He

Ma

He

Ma

He

Ma

He

Ma

He

†

Capítulo IV. Resultados 194

Kozack-Col16 (P>0,05). Tampoco se obtuvieron diferencias

estadísticamente significativas entre los géneros de cada grupo.

Por tanto, el análisis de los niveles de colesterol en el suero de los animales

mutantes Kozack-Col16–PPA reveló cierta tendencia a reducir este

parámetro en relación a los niveles observados en los mutantes no

transgénicos.

IV.1.2.2. Inmunotinción de secciones de tejido embebidas

en parafina.

Para visualizar los niveles de PPA y A , se realizaron secciones de 4 µm

mediante microtomo (MICROM COOL OUT), a partir de los bloques de

parafina del hemisferio cerebral derecho fijado en formalina tras su

extracción.

Tras la inmunotinción con diferentes anticuerpos primarios específicos

para cada una de las proteínas de interés (23850 y 40090 para detectar

PPA; mx02 y 692 para visualizar A ), se realizaron micrografías de las

regiones más comprometidas en la patología de EA: corteza e hipocampo.

En estas zonas se localizan los depósitos de A , muy brillantes y

birrefringentes.

En la figura IV.9. se muestran las micrografías realizadas en microscopio

de fluorescencia (OLYMPUS D50; Software= Viewfinder Lite)

comparativas entre ratones de ambos géneros, tanto a nivel de corteza

como de hipocampo.

Capítulo IV. Resultados 195

Machos Hembras

PPA

A

A

A

Figura IV.9. Tinciones inmunohistoquímicas de ratones mutantes

Kozack-Col 16. Tinciones de corteza frente PPA (23850) muestran la abundancia

de esta proteína en las neuronas piramidales (asterisco) de las hembras (B) frente a

los machos (B. Tinciones frente A (692) de corteza (C, D) e hipocampo (E, F)

revelan una mayor deposición de amiloide en hembras (D, F) que en machos (C, E).

Tinción de corteza frente A (692) de ratón control mutante no transgénico (G) y

detalle de un depósito de amiloide (H). Contra tinción con hematoxilina

(magnificación: 100x (A, B, C, D, E, F, G), 400x (H).Anticuerpo 2º= Biotina anti

conejo.

B

*

A

C D

E F

G H

Capítulo IV. Resultados 196

A nivel de corteza, se observa una mayor cantidad de cúmulos granulares

de PPA en torno a las neuronas piramidales de esta región, en una sección

de una hembras en relación a la de un macho. Para las secciones de corteza

inmunomarcadas con anticuerpo anti-A , se detecta poca diferencia entre

un ratón macho mutante y un control mutante pero no transgénico,

mientras que una sección de una hembra mutante revela numerosos

depósitos de A dispersos por toda la corteza, como es característico de

este modelo a los 6 meses de edad, momento en que ya han desarrollado

plenamente la morfopatología de la enfermedad. Algo similar se aprecia en

las secciones de hipocampo. Mientras que la imagen obtenida del cerebro

de un animal macho muestra escasos depósitos de A , la mostrada para

una hembra evidencia la formación de numerosas agregaciones insolubles

de este péptido.

Estos resultados histoquímicos indican una diferencia entre ambos géneros

a nivel de abundancia de placas neuríticas en cerebro, siendo las hembras

las que mayor cantidad de depósitos presentaron. Para confirmar esta

distinción entre ambos géneros, se realizaron Western Blot y ELISA A 40

y A 42.

IV.1.2.3. ELISA A 40 y 42.

En primer lugar se realizó un Western Blot (Nu-PAGE) a partir de los

lisados de proteínas extraídas con SDS (fracción soluble). Los resultados se

muestran en la figura IV.11.

Capítulo IV. Resultados 197

Figura IV.10: Análisis de la expresión de PPA, C99 y A en ratones

Kozack-Col 16: Western Blot de lisados de proteínas realizados en 2% de SDS en

geles del 16% Tris-tricina. El anticuerpo WO-2 que confirma la expresión de la

banda de PPA (12 kDa), la banda C99 y la de A (4 kDa). La banda de A en las

muestras de animales hembras resultó más pronunciada que en los lisados de

machos.

Como se apreciaba en las micrografías, los animales hembra presentaban

mayores acumulaciones de A que los ratones macho, fenómeno que pudimos

corroborar mediante Western Blot, donde se aprecia una clara diferencia entre

ambos géneros a nivel de la banda de 4 kDa correspondiente al péptido A . Ya

que el anticuerpo utilizado es inespecífico y reconoce tanto la especie A 40

como A 42, decidimos realizar un un test de alta sensibilidad ELISA para cada

una de las especies del péptido amiloidogénico.

Para los ELISA se utilizaron los lisados de cerebro realizados en ácido fórmico

(fracciones soluble e insoluble de A ), dado que la edad de los animales era la

adecuada para el desarrollo completo de la patología, como confirman las

micrografías. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla IV.4.

Capítulo IV. Resultados 198

Aß40 Aß42 Aß ratio=

(µg/g) (µg/g) (Aß42/Aß40)

Machos 0,28 ± 0,06 0,03 ± 0,02 0,098

Hembras 1,02 ± 0,55 0,12 ± 0,04 0,11

Tabla IV.4.: Concentraciones en µg/g de A 40 y 42 en ratones de ambos

géneros. Valores obtenidos para las concentraciones de A 40 (dilución 1:30) y A

42 (dilución 1:10) para lisados de ácido fórmico de ratones macho (n=4) y hembras

(n=6) mutantes de 6 meses de edad. Dilución del lisado (x8) y factor de

neutralización (x11).

El análisis por ELISA de las muestras confirmó la diferencia observada entre

machos y hembras en las micrografías y en el Western Blot. Las hembras

mutantes Kozack-Col 16-PPA presentaban mayores niveles en ambas

variantes de A , 40 y 42. El cálculo del denominado A ratio, se estableció en

base a estudios clínicos previos que permitieron establecer (Ida et al., 1996).

-Riesgo claro de padecer EA, si el ratio <1,0; valor en el límite que llevaría a la

repetición del test, cuando el ratio oscila entre 1,0 y 1,5, y ningún riesgo

declarado, cuando el ratio es >1,5. Por tanto con este barómetro establecimos

que ambos géneros presentaban un elevado riesgo de desarrollar la patología,

aunque las hembras mostraban mayores niveles del péptido amiloidogénico.

Capítulo IV. Resultados 199

IV.1.3. Estudios en modelo de ratón transgénico doble

PPA/PS1 de la EA.

Tras los dos estudios anteriores, en los que observamos que los ratones

transgénicos de la EA del género femenino presentaban diferencias con los

del género masculino en varios parámetros (colesterol, depósitos de

amiloide), decidimos planificar el presente estudio. Nos propusimos

analizar la relación existente entre los niveles de colesterol plasmático y de

A cerebral, a lo largo del tiempo. Para ello, se escogió un modelo de ratón

de la EA, transgénico doble PPA/PS1 (Blanchard et al., 2003), que

expresan la isoforma APP751 con las mutaciones Swedish y London

(promotor Thy1), al igual que la Presenilina-1 humana mutante (M146L,

promotor HMG). Se trata de un modelo diseñado para investigar la

formación y progresivas alteraciones de neuritas distróficas relacionadas

con los depósitos de A . En este modelo, los depósitos aparecen a una edad

muy temprana (2-4 meses de edad) porque la mutación en PS1 acelera la

acumulación de péptido amiloide en una magnitud igual a 2. Desde el inicio

de la deposición, la mayoría de los cúmulos peptídicos se rodean de un

elevado número de neuritas distróficas PPA-, ubiquitín- y MnSOD-

inmunorreactivas.

Por tanto, y con objeto de analizar los niveles de colesterol plasmático y de

A (40 y 42) cerebrales a diferentes tiempo, se establecieron 3 grupos de

animales hembra transgénicos de 3 (n=6), 8 (n=7) y 13 (n=10) meses de

edad y 2 grupos de animales hembra controles no transgénicos de 3 (n=5) y

13 (n=7) meses de edad.

IV.1.3.1. Inmunotinción de secciones de tejido embebidas

en parafina.

Se realizaron secciones de 4 µm mediante microtomo, a partir de los

bloques de parafina del hemisferio cerebral derecho fijado en formalina

Capítulo IV. Resultados 200

tras su extracción. La inmunotinción se llevó a cabo con los anticuerpos

específicos para cada una de las proteínas de interés y finalmente se

realizaron micrografías (figura IV.10) donde se aprecia la evolución de la

patología.

PPA A A

3meses

8meses

13meses

Figura IV.10. Tinciones inmunohistoquímicas de ratones PPA/PS1.

Tinciones de corteza frente PPA (23850; A, D, G) muestran una acumulación

progresiva con el incremento de edad de los animales. Tinciones frente A de

hipocampo (mx02; B, E, H) y corteza (mx02; C, F, I) revelan el incremento en

las deposiciones de amiloide, teñidas en marrón y muy birrefringentes. Contra

tinción con hematoxilina (magnificación: 100x (A, D, E, G, I), 200x (B, C, F, I).

A B C

D E F

G H I

Capítulo IV. Resultados 201

Las micrografías anteriores confirman la progresiva acumulación de PPA y

péptidos A en el hipocampo y la corteza de los animales PPA/PS1, desde que

se inicia la patología a los 3 meses hasta los 13 meses de edad, confirmando el

empeoramiento de la patología con el avance de la edad.

IV.1.3.2. ELISA A 40 y 42.

Según Blanchard y colaboradores (Blanchard et al., 2003), en el modelo

animal utilizado en el presente estudio todas las formas de Aß se agregan de la

misma manera. Por tanto, decidimos cuantificar los niveles de A 40 y A 42

en cada uno de los grupos de ratones establecidos por edades, para lo que

realizamos pruebas de ELISA a partir de los lisados de ácido fórmico (kits

facilitados por The Genetics Company, Switzerland). Los resultados obtenidos

se muestran en la tabla IV.5. y se representan en la figura IV.11.

Aß40 Aß42 Aß ratio=

Edad (meses) (µg/gr) (µg/gr) (Aß42/Aß40)

3 0,35 ± 0,12 1,7 ± 0,33 4,86

8 19,66 ± 5,42 22,22 ± 7,12 1,13

13 66,13 ± 12,81 40,96 ± 5,19 0,62

Tabla IV.5.: Niveles de A -40 y A -42 para cada uno de los grups de

ratones PPA/PS1. Los valores obtenidos revelaron el incremento de deposiciones

amiloideas (ambas especies de A ) conforme los ratones envejecieron. Los factores

de dilución para A 40 fueron 1:50 (3 meses), 1:1000 (8 meses) y 1:2000 (13 meses)

y para A -42: 1:100 (3 meses), 1:3000 (8 meses) y 1:5000 (13 meses). Factor de

dilución de los lisados= 10, dilución neutralización= 11.

Capítulo IV. Resultados 202

0

1 0

20

30

40

50

60

7 0

80

A t

otal

(µ

g/g)

8 meses3 meses 13 meses

A 40 A 42 A 40 A 42 A 40 A 42

***

Figura IV.11.: Valores medios de A total en ratones PPA/PS1 de todos

los grupos. Se representan los valores medios (µg/g) para A -40 y A -42 en

cada uno de los grupos de ratones PPA/PS1 establecidos por edades. Se confirma

el incremento de deposiciones observado en las micrografías.

Como esperábamos a la vista de las micrografías obtenidas en cada uno de

los grupos de animales, donde pudimos comprobar la acumulación

creciente de péptido amiloide conforme al envejecimiento de los ratones,

corroboramos este incremento mediante la cuantificación por ELISA, que

nos permitió concluir que en el avance de la edad, entre 3 y 13 meses de

edad en ratones hembra transgénicos dobles PPA/PS1 se ve acompañado

por un empeoramiento en uno de los principales rasgos de la patología de

la EA como son las deposiciones amiloideas en hipocampo y corteza

cerebral.

Capítulo IV. Resultados 203

IV.1.3.3. Determinación de la concentración de colesterol

en plasma.

A continuación se decidió analizar el nivel de colesterol plasmático en cada

grupo de transgénicos PPA/PS1 y de no transgénicos, para determinar la

influencia del envejecimiento y del genotipo sobre este parámetro. Para

ello, se empleó un kit de determinación colorimétrica para la medición de

la concentración de colesterol total en plasma obtenido por punción

cardiaca.

[Col]

(mg/dL) 3 meses 8 meses 13 meses

PPA-PS1

84,02 ±

3,39 76,25 ± 3,14

69,63 ±

2,63

Wt

91,04 ±

3,19 —

88,42 ±

6,28

Tabla IV.6.: Concentración de colesterol total en plasma para en

transgénicos PPA/PS1 y ratones controles. Se determinó la

concentración de colesterol en el plasma de los ratones PPA/PS1 de 3 (n= 6), 8

(n= 7) y 13 (n= 10) meses de edad, así como en los ratones no transgénicos (Wt)

de 3 (n=5) y 13 (n=7) meses de edad. No se utilizaron ratones Wt de 8 meses

porque solamente nos interesaban las dos edades extremas.

Capítulo IV. Resultados 204

0

1 0

20

30

40

50

60

7 0

80

90

1 00

Edad (meses)

[Co

lest

ero

l med

io]

(mg/

dL

)P P A/P S1 Wt

3 3 8 1 3 1 3

*

Figura IV. 12: Representación de los valores medios de colesterol total

en plasma en animales PPA/PS1 y controles. Se obtuvo un descenso

estadísticamente significativo entre los ratones PPA/PS1 de 3 meses y los de 13

meses de edad, mientras que entre los animales controles (Wt) de 3 meses y los de

13 meses de edad no se observó ninguna reducción en los niveles de este

parámetro. Curiosamente, se obtuvo una diferencia significativa (P<0,01) entre

los animales de 13 meses transgénicos respecto a los de 13 meses no transgénicos.

El análisis estadístico de la varianza mediante ANOVA de los niveles de

colesterol plasmático en cada grupo y en cada genotipo, nos permitió

establecer una diferencia significativa (P<0,05) entre los ratones PPA/PS1 de

3 meses y los de 13 meses de edad. La varianza observada se confirmó

mediante test C de Cochran, test de Bartlett y test de Hartley. Aunque no se

observó diferencia significativa ni entre los animales transgénicos de 3 y los de

8 meses, ni entre los de 8 y 13 meses de edad, el hecho de observar una

reducción de colesterol plasmático asociada con la edad, nos hizo pensar en la

influencia de las mutaciones sobre PPA y PS1 sobre este parámetro en plasma,

ya que no se encontraron diferencias significativas en los niveles de colesterol

Capítulo IV. Resultados 205

de los animales no transgénicos, lo que nos permitió descartar la bajada de

colesterol por razones debidas exclusivamente al envejecimiento. Otro

argumento a favor de esta teoría, es que a pesar de la bibliografía que apoya la

idea de que ni el colesterol ni sus precursores sufren modificaciones entre

ratones transgénicos PPA y no transgénicos durante el envejecimiento

(Lutjohann et al., 2002), encontramos una diferencia significativa entre los

PPA/PS1 de 13 meses y los no transgénicos de la misma edad lo que nos llevó

a argumentar la influencia del genotipo y no solamente de la edad sobre los

niveles de colesterol.

Capítulo IV. Resultados 206

IV.2. Estudios con DOPET.

IV.2.1. Screening de compuestos naturales con

capacidad antioxidante y potencial neuroprotector.

Las neuronas son extremadamente sensibles al ataque destructivo de los

radicales libres generados por peroxidación lipídica, oxidación de las

proteínas, daño al ADN, glicosilación y/o la actividad catalítica de metales

como el hierro, cinc, cobre y aluminio. En base al potencial de los AGPIs

omega-3 para actuar sobre el SNC (Chalon et al., 2001), se han realizado

estudios recientes que apoyan la suplementación de pacientes de

Esquizofrenia con dietas enriquecidas en omega-3 y antioxidantes como la

vitamina C y E (Arvindakshan et al., 2003). Así mismo, se han obtenido

resultados prometedores en pacientes de la EA tratados con agentes

quelantes de hierro y antioxidantes (Christen, 2000).

Por tanto, y tras la ausencia de un efecto directo sobre los niveles de A , en

el estudio realizado en un modelo animal de la EA alimentado con una

dieta enriquecida con AGPIs omega-3, nos planteamos la búsqueda de un

compuesto natural con capacidad antioxidante. Tras esa selección,

analizaríamos su capacidad neuroprotectora con la idea de utilizarlo como

compuesto individual y en un futuro poder complementar los beneficios

ejercidos por los AGPIs omega-3 de la dieta sobre los niveles de colesterol y

el perfil de ácidos grasos con un efecto antioxidante, y lograr una

neuroprotección por combinación de ambos tipos de compuestos.

Con tal objeto, se llevó a cabo un amplio screening para seleccionar un

compuesto natural, de fácil acceso en la dieta Mediterránea y con

capacidad antioxidante y para atravesar la BHE.

El screening se basó en la administración de una dosis (20 mg/ratón) de

cada uno de los extractos de diferentes compuestos naturales. Tras el

sacrificio a diferentes tiempos (20, 60 y 180 min), los extractos de los

cerebros se procesaron mediante HPLC-ABTS (HPLC-DAD, WATERS)

Capítulo IV. Resultados 207

para determinar tanto su capacidad para cruzar la BHE como su potencial

antioxidante.

En la tabla II.2. (Capítulo II de esta Memoria), se recogen los diferentes

extractos naturales y polifenoles que se analizaron. Entre los compuestos

positivos obtenidos, se encontraron:

Compuestos Positivos (antioxidantes que cruzan BHE) Extractos naturales:

Hoja de olivo; esencia de tomillo (Granadiet, 500µL/ratón);

Aceite de pepita uva (500µL/ratón, comercial)

Polifenoles:

Timol (Sigma, 10mg/ratón disuelto en aceite virgen);

Carvacrol (Sigma, 20mg/ratón en aceite girasol; muy tóxico); Ácido homovanílico;

Ácido hidroxibenzoico; Ácido siríngico, 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol

Tabla IV.7: Compuestos naturales positivos tras el análisis por HPLC-

ABTS. Listado de los extractos naturales y polifenoles que tras ser administrados a

los animales demostraron cruzar la BHE y presentar capacidad antioxidante. =

254 nm y 734 nm.

Se seleccionó a 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol (DOPET), por su elevada

capacidad antioxidante residente en el motivo o-difenol (Manna, 1997), la

importancia del aceite de oliva del que procede en la dieta Mediterránea, y la

relevancia de ésta en la sociedad actual.

IV.2.2. Biodisponibilidad de DOPET.

IV.2.2.1. Determinación de DOPET por HPLC-ABTS.

Antes de comenzar los diferentes estudios de neuroprotección con DOPET,

el Dpto. de Química (Puleva Biotech, S.A) consiguió sintetizar este

compuesto con una elevada pureza ( 99%) y fue el que utilizaríamos para

la ejecución del resto de esta Memoria. Por tanto, para confirmar la

capacidad antioxidante observada para DOPET natural en nuestro

Capítulo IV. Resultados 208

compuesto purificado, éste se analizó mediante HPLC-ABTS, para

establecer su espectro y facilitar su posterior reconocimiento en las

muestras biológicas.

El cromatograma obtenido para la capacidad antioxidante de DOPET en

comparación con la vitamina C, se muestra en la figura IV.13.

Figura IV.13.: Cromatograma de DOPET obtenidos por HPLC-ABTS.

El análisis de DOPET por HPLC-ABTS confirmó la capacidad antioxidante del

compuesto comparado con Vitamina C. El pico obtenido a 6,3 min corresponde a

10 µg de DOPET. Tiempo de análisis=60 min, utilizando PDA a 280 nm.

IV.2.2.2. Determinación de DOPET por CG-MS.

Dentro del ensayo de biodisponibilidad de este compuesto, se identificó por

CG-MS para determinar el tiempo de absorción en cerebro de ratón. Para

ello, se establecieron 11 grupos de 3 ratones Balb/c cada uno, sondados con

DOPET purificado (13 mg/kg peso). Los animales fueron sacrificados

mediante dislocación cervical y el cerebro se extrajo con rapidez a

diferentes tiempos: 0 min, 3 min, 4 min, 5 min, 7 min, 10 min, 15 min, 20

min, 25 min, 30 min y 60 min. EL compuesto fue identificado mediante

extracción con acetato de etilo en CG-MS. Los resultados se muestran en la

figura IV.14.

Capítulo IV. Resultados 209

0

0,0001

0,0002

0,0003

0,0004

0,0005

0,0006

0,0007

0,0008

0 3 4 5 7 10 15 20 30 60

Tiempo absorción (min)

DO

PE

T (µg

/g p

eso)

Figura IV.14.: Tiempos de absorción de DOPET en cerebro de ratón por

CG-MS. Se obtuvo un primer pico en las muestras de los animales sacrificados a los 3

min, mientras que a los 60 min el compuesto ya no aparecía en cerebro.

En base a estos resultados, se estableció que DOPET aparecía en cerebro

transcurridos 3 min tras el sondaje, y que desaparecen a los 60 min.

Capítulo IV. Resultados 210

IV.2.3. Estudios de antioxidación.

IV.2.3.1. Detección de malondialdehido (MDA).

IV.2.3.1.1. MDA en cerebro de rata.

Basándonos en la demostrada capacidad antioxidante de DOPET in vitro,

se establecieron una serie de ensayos para analizar la influencia de este

compuesto sobre la peroxidación lipídica in vivo, utilizando cerebro de

rata para estudiar uno de los marcadores de este proceso como es la

producción de SRATs, medida a través de MDA.

Se desarrolló el protocolo descrito en esta Memoria para la curva patrón

de MDA y para la medición de SRATs, empleando las membranas de

cerebro de rata. El agente oxidante utilizado fue el SO4Cu (20 µL y 80 µL

de solución stock 125 µM) y las cantidades utilizadas también para DOPET

fueron 2 y 10 µL (solución 5 mM). Se realizaron 2 grupos de muestras:

Control (negativo y positivo) y DOPET (cada cantidad establecida,

adicionada con cada una de las cantidades elegidas para el agente

oxidante). Todas las muestras se realizaron en triplicado. Los resultados

obtenidos mediante medición de la D.O. (535 nm), se representan en la

figura IV.15.

Capítulo IV. Resultados 211

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

Abs

(53

5nm

)

20 µL SO4Cu 80 µL SO4Cu

** ** **

C- C+ C+DOPET (2µL)

DOPET (2µL)

DOPET (10µL)

DOPET (10µL)

Figura IV.15: Efecto de DOPET como antioxidante frente al daño

provocado en las membranas por la producción de MDA. Se generó un

daño oxidativo en las membranas de cerebro de rata mediante la adición de SO4Cu,

responsable de la producción de SRATs. DOPET fue capaz de proteger de esta

agresión mediante la reducción de MDA, medido por espectrofotometría.

El análisis estadístico mediante prueba T reveló que DOPET ejerció un efecto

antioxidante significativo (P<0,001) frente al daño generado por un oxidante

com SO4Cu sobre las membranas lipídicas en cerebro de rata.

Por tanto se estableció que DOPET a bajas dosis era capaz de proteger de la

peroxidación lipídica en las membranas cerebrales, medida como MDA.

IV.2.3.1.2. MDA en plasma de ratón.

Para determinar si el efecto protector de DOPET sobre la peroxidación

lipídica observado in vitro era reproducible in vivo, se establecieron 4

grupos de 10 ratones cada uno alimentados durante 30 días con dieta

control, dieta enriquecida en colesterol (1,5%), dieta control con DOPET en

Capítulo IV. Resultados 212

el agua de bebida (1 mg/ratón/día) y dieta rica en colesterol más DOPET

diluido en el agua de bebida de baja mineralización. El objetivo era

conseguir que la dieta suplementada con un 1,5% de colesterol generase un

incremento exagerado de la peroxidación lipídica en estos animales para

poder determinar si DOPET ejercía in vivo su poder antioxidante y

neuroprotector.

Se determinaron las concentraciones de colesterol total, LAD-colesterol y

LBD-colesterol (para lo cual necesitamos determinar también los

triglicéridos) en plasma en cada grupo mediante ensayo colorimétrico (kit

de Bio Systems). Los datos se muestran en la tabla IV.8.

Grupos [Col total]

(mg/dL)

[LAD-col]

(mg/dL)

[LBD-col]

(mg/dL)

Control 121,6 ± 7,0 48,6 ± 12,6 137,9 ± 20,9

Colesterol 121,5 ± 14,9 41,3 ± 12,3 131,4 ± 19,7

Colesterol+DOPET 116,1 ± 6,2 39,8 ± 8,7 124,4 ± 11,0

DOPET 110,5 ± 13,4 50,4 ± 11,2 133,4 ± 19,3

Tabla IV.8. Concentraciones medias de colesterol total, LAD-col y

LBD-col en plasma de ratones alimentados con diferentes dietas. Todos

los parámetros se determinaron mediante espectrofotometría (500 nm) siguiendo

las instrucciones suministradas en cada kit (Bio Systems). No se obtuvieron

diferencias significativas entre ninguno de los grupos para ninguno de los

parámetros (P>0,05).

Los resultados para cada uno de estos parámetros plasmáticos no revelaron

diferencias estadísticamente significativas entre ninguno de los 4 grupos

(P>0,05). Sin embargo, se analizó la cantidad de MDA en plasma por HPLC

con detección fluorométrica y se obtuvo un descenso significativo de este

parámetro de peroxidación lipídica entre el grupo colesterol y el grupo

colesterol con DOPET en el agua de bebida (P<0,05). Los datos se

representan en la figura IV.16.

Capítulo IV. Resultados 213

Figura IV.16.: Valores medios de MDA obtenidos por HPLC-FLD en

plasma para cada grupo. Se observó un incremento significativo de MDA en el

grupo alimentado con un exceso de colesterol frente al resto de grupos. El grupo que

recibió DOPET en el agua de bebida (con dieta enriquecida en colesterol) presentó

una disminución significativa (P<0,05) en los niveles de MDA en plasma en

comparación con el grupo colesterol.

Por tanto, aunque no pudimos observar ningún efecto beneficioso de DOPET

sobre el metabolismo del colesterol en plasma, quizás por la breve duración

del estudio, si pudimos demostrar que el compuesto ejerció un efecto

neuroprotector y antioxidante en los animales que recibieron el compuesto

disuelto en el agua de bebida.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

x10

12[M

DA

] (µ

M)

Chow Colest DOPET DOPET+Colest

*

Capítulo IV. Resultados 214

IV.2.3.1.3. Cuantificación de la actividad catalasa en

cerebro de conejo.

Tras los dos estudios anteriores sobre el efecto de DOPET en procesos de

peroxidación lipídica, nos planteamos analizar el efecto del compuesto

sobre la catalasa, una de las enzimas implicadas en la eliminación de una

molécula tóxica como la del peróxido de hidrógeno (H2O2). Esta enzima es

capaz de descomponer H2O2 en H2O y O2 evitando así el daño oxidativo a

los tejidos. Por este motivo, se emplearon los cerebros de los conejos

estudiados en el apartado IV.4.6.3. de este capítulo por tratarse de

animales sometidos a estrés oxidativo durante varios meses. En resumen,

los conejos fueron alimentados con una amplia gama de dietas

(especificadas en el capítulo II de esta Memoria) con objeto de inducir un

proceso aterogénico, provocando así un estrés oxidativo que nos permitiera

determinar el efecto de DOPET y de cada tipo de dieta sobre una serie de

parámetros del metabolismo del colesterol, como detallaremos en el

apartado correspondiente. Los resultados obtenidos para la medición de la

cinética de la actividad catalasa se muestran en la tabla IV.9.

Capítulo IV. Resultados 215

Grupos Tipos de dietas Catalasa(actividad media/mg)

Grupo 1 Control 30 días (CO) 0,29 ± 0,12

Control aterogénico (CA) 0,30 ± 0,15

DOPET (ADT) 0,27 ± 0,10

Control 60 días (CF) 0,27 ± 0,09

Aterogénica 60 días (AA) 0,29 ± 0,07

Grupo 2 Control 30 días (AC) 0,19 ± 0,09 Extra-vírgen (V) 0,26 ± 0,09 Refinado con omega3 (RW) 0,26 ± 0,07 Refinado (R) 0,22 ± 0,07 Omega-3 (W) 0,19 ± 0,03 (DOPET) DT 0,23 ± 0,10

Tabla IV.9.: Valores de actividad Catalasa en conejos alimentados con

diferentes dietas. Se determinó la absorbancia (A240 nm) en cada muestra

(proteínas+tampón fosfato sódico+H2O2) para expresar la actividad como la caída

de A240 durante el primer minuto de la cinética por cada mg de proteína.

El análisis estadístico de los datos de actividad Catalasa en cada grupo

mediante Prueba T, demostró que ninguno de los diferentes tipos de dietas

consiguió ejercer un efecto significativo sobre esta actividad enzimática.

Capítulo IV. Resultados 216

IV.2.4. Estudios de neuroprotección.

Una vez comprobada la capacidad de DOPET para cruzar la BHE y

penetrar en el cerebro, comenzamos con una serie de ensayos in vitro para

estudiar sus propiedades neuroprotectoras.

IV.2.4.1. Medida de citotoxicidad de DOPET.

Mediante la realización del protocolo descrito en el capítulo II de esta

Memoria para la medición de la citotoxicidad (1 día con 100.000

células/pocillo), se propuso determinar la capacidad neuroprotectora de

DOPET en astrocitos C6, tratadas en primer lugar con concentraciones

crecientes de DOPET, para ser incubadas seguidamente con un agente

causante de muerte celular por daño oxidativo. La medición de la

absorbancia nos permitió determinar el porcentaje de viabilidad en los

diferentes sistemas ensayados.

Se realizaron 6 placas de 96 pocillos y cada muestra se realizó en triplicado.

Los agentes oxidantes utilizados fueron: H2O2 (200 µM), péptido A 22-35

(20 µM) y glutamato (1,2 mM). Se incubaron las placas durante 2 h a 37 ºC

en atmósfera de 5% de CO2, se añadió DOPET y se dejó actuar entre 2 y 4 h

en las mismas condiciones de incubación. Finalmente, se adicionó el

compuesto oxidante, a la concentración establecida. Se incubaron durante 1

día (citotoxicidad) o 4 días (viabilidad) y se evaluaron los resultados

mediante la determinación de la absorbancia a 490 nm en un contador de

placas.

A continuación se representan los resultados en la figura IV.17. A partir de

estos datos, se puede establecer que una concentración de DOPET igual o

superior a 100 µM comenzaría a ser citotóxica, aunque hay que tener en

cuenta que el porcentaje de citotoxicidad correspondiente a esta

concentración fue únicamente del 2% y que el tiempo de retención de

DOPET en el cerebro es inferior a 1 h. Dada la enorme diversidad celular

Capítulo IV. Resultados 217

presente en el cerebro, serían necesarios numerosos ensayos en otros tipos

celulares para generalizar el efecto citotóxico de DOPET a todo el cerebro.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 5 10 25 50 75 100 500

[DOPET] (µM)

Via

bil

idad

(%

)

Sin H2O2

Con H2O2

A)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1 ,1

0 5 10 25 50 7 5 100 500

[DOPET] (µM)

Via

bili

dad

(%)

( ) Sin A

(x) Con A

B)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 5 10 25 50 75 100 500

[DOPET] (µM)

Via

bil

idad

(%

)

Sin Glutamato

Con Glutamato

C)

Capítulo IV. Resultados 218

(Viene de página anterior) Figura IV.17: Viabilidad celular (factor

100) en células C6 sometidas a diferentes oxidantes frente a

diferentes concentraciones de DOPET. Se observa como a partir de

concentraciones de DOPET iguales a 100 µM, la neuroprotección desciende para

los sistemas dañados con H2O2 (A) y glutamato (C), mientras que A (B) no

parece afectar a la viabilidad de estas células, lo que dificultó la interpretación

del efecto de DOPET sobre este sistema. Escala expresada en porcentajes,

multiplicados por el factor 100.

Se realizaron una serie de micrografías con el microscopio de fluorescencia

para los ensayos de citotoxicidad en células C6 (figura IV.18. y IV.19). En la

figura IV.16. se aprecia cómo el cultivo sufre el daño generado tanto por

H2O2 como por A 22-35, así como la incubación previa de las células con

DOPET (100 µM) parece proteger de la muerte celular generada por los

oxidantes.

Sin embargo, en la figura IV.17, las células fueron incubadas durante 4 días

con glutatión, en presencia o no de DOPET, y en esta ocasión los cultivos

demostraron estar protegidos del daño por glutatión hasta concentraciones

de DOPET de 100 µM. Por tanto pudimos establecer esta concentración de

DOPET como la máxima por debajo de la cual el compuesto era capaz de

ejercer neuroprotección sobre un cultivo celular.

Capítulo IV. Resultados 219

Oxidante Sin DOPET Con DOPET (100 µM)

Ninguno

(controles)

H2O2

(200 µM)

A 22-35

(20 µM)

Figura IV.18.: Micrografías de astrocitos C6 incubados con diferentes

oxidantes y DOPET para ensayos de neuroprotección. Las fotografías

fueron tomadas a las 24 h de inicio del ensayo. Células que crecen con normalidad en

el control negativo (A) y en el control positivo con DOPET (100 µM) (B), ven

reducida notablemente su población tras la exposición con H2O2 (200 µM) (C) y con

A (20 µM) (E). La incubación previa con DOPET antes del daño parece proteger en

ambos (D y F, respectivamente). Magnificación= 400x.

A B

D

F

C

E

Capítulo IV. Resultados 220

Tratamiento Controles Con Glutatión

(1,2 mM)

Ninguno

DOPET

(50 µM)

DOPET

(100 µM)

Figura IV.19.: Micrografías sobre la viabilidad de células C6, tras 4

días de ensayo. Frente al control negativo (A), se observa una marcada

disminución de la población celular tras la incubación con glutamato 1,2 mM

(B). El tratamiento con concentraciones de DOPET de 50 µM (C) y100 µM (E)

muestra cómo el efecto neurotóxico no es apreciable hasta concentraciones de

100 µM. El tratamiento conjunto de glutamato y DOPET a 50 µM (D) parece

mejorar el estado del cultivo con respecto al daño generado por glutamato,

efecto que no se observa con DOPET 100 µM (F). Magnificación= 400x.

A B

C D

E F

Capítulo IV. Resultados 221

Se decidieron realizar el mismo tipo de ensayos en células neuronales

procedentes de hipocampo de rata, en las que se determinó la

neurotoxicidad de DOPET aplicado junto a péptido A 22-35 . Los datos se

representan en la figura IV.20.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 25 50 100 200 300 500 1000

[DOPET] µM

Via

bili

dad

(%

)

Figura IV.20: Representación de la viabilidad en cultivos neuronales

sometidos a daño oxidativo por A . (20 µM).Hasta concentraciones de

100 µM el compuesto es capaz de mantener la viabilidad celular a niveles

cercano al 100%.

Estos resultados, muestran cómo DOPET hasta concentraciones de 100 µM

no perdería su capacidad neuroprotectora induciendo muerte celular, como

observamos en los sistemas celulares de C6 ensayados con anterioridad.

Capítulo IV. Resultados 222

IV.2.4.2. Ensayo COMET.

Para confirmar si DOPET induce muerte celular por apoptosis, se llevó a

cabo el protocolo descrito en esta Memoria para mutagenicidad, basado en

la los métodos descritos previamente (Olivares et al., 2003; Qiu et al.,

2003). El fundamento de la técnica es la cuantificación del daño al ADN

mediante el marcaje de los núcleos con bromuro de etidio (20 µg/mL) de

manera que los núcleos de las células cuyo material genético ha sufrido

fragmentación por efecto de la radiación, muestran una cola o rastro de

ADN que se cuantifica tras la electroforesis mediante el software CASP

(Comet Assay Software Project).

Se realizó la exposición de un cultivo de fibroblastos L-129 a radiación UV-

C (2000 µJ) como control positivo, al que se adicionó DOPET (100 µM)

para comparar las micrografías mediante microscopio de fluorescencia

(510-595 nm). En las fotos y en el contaje posterior se apreció que DOPET

no logró proteger de la fragmentación del ADN de las células, con respecto

a los controles Definitivamente, este ensayo confirmó que concentraciones

de DOPET iguales a 100 µM inducen apoptosis en cultivos celulares.

Control

Negativo (a)

Control

Positivo

(UV-C) (b)

Frente a un cultivo no irradiado

(a), el control positivo (b)

evidencia

las colas de ADN (b) que la adición

de DOPET (c) no logró evitar.Control positivo

con DOPET

(100 µM) )(c)

Capítulo IV. Resultados 223

IV.2.4.3. Modelo de excitotoxicidad con ácido kaínico:

Laberinto acuático de Morris.

La muerte neuronal responsable de la neurodegeneración puede iniciarse

mediante la sobreexcitación de neuronas en respuesta a la acumulación

extracelular de elevados niveles de glutamato (aminoácido excitatorio)

(Lipton, 1994). Este mecanismo de neurodegeneración se denomina

excitotoxicidad En base a este concepto se estableció un modelo que induce

neurodegeneración en el SNC mediante la inyección de un agonista del

receptor del glutamato, el ácido kaínico (AK).

Uno de los métodos comúnmente utilizado para la evaluación de la memoria

en roedores, es el denominado Laberinto acuático de Morris, descrito en ratas

hace más de 20 años (Morris, 1984). Alguna bibliografía soporta la idea de la

mayor sensibilidad de los ratones de la raza Balb/c al estrés provocado por

este tipo de pruebas en relación a otras razas (Francis, 1995). Sin embargo,

estudios posteriores no encuentran diferencias entre los ratones negros

C57BL/6 y los albinos Balb/c, a pesar de ser los ratones negros los

recomendados para este tipo de prueba (Wehner, 1988, Royle, 1999 #1027).

Por todos estos argumentos, nos pareció interesante someter a la raza Balb/c

al Laberinto acuático de Morris, con objeto de analizar el efecto de DOPET

sobre la memoria de animales intactos y alterados mediante la inyección de la

neurotoxina ácido kaínico (AK). Los resultados beneficiosos obtenidos de

DOPET como antioxidante y neuroprotector en los sistemas in vitro e in vivo

analizados hasta el momento, nos impulsó a aplicarlo en un modelo de

neurodegeneración con el objetivo de probar su capacidad para prevenir de la

pérdida de memoria asociada al daño provocado por AK.

Inicialmente, se puso a punto el protocolo de entrenamiento para apreciar

el aprendizaje de la prueba en los animales y la dosis máxima de AK

aplicable a esta raza. Se estableció que la prueba debía durar 7 días

consecutivos, 2 bloques por día y 4 pruebas por bloque. Cada día se

administraba el tratamiento (AK= 0,6 mg/kg peso/día; DOPET= 5 mg/kg

Capítulo IV. Resultados 224

peso/día) previamente a la realización de las 8 pruebas diarias. Los

resultados se representan en la figura IV.22.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 1 2 3 4 5 6 7

Tiempo (días)

Tie

mp

o la

ten

cia

(seg

)

CONTROL

A K

DOPET

DOPET+A K

Figura IV.22.: Representación del aprendizaje de todos los grupos de

animales en el Laberinto acuático de Morris. Se muestran los valores

medios del tiempo de latencia (segundos en alcanzar la plataforma) en cada

grupo durante los 7 días del estudio. Se observan diferencias significativas entre

el grupo control y AK (P<0,001), así como entre el grupo con toxina (AK) y el

grupo DOPET+AK (P<0,05). No hubo diferencias entre el grupo DOPET y el

grupo DOPET+AK.

Tras el análisis estadístico de los datos mediante ANOVA, se obtuvieron

diferencias estadísticamente significativas al comparar el grupo control y el

grupo AK, lo que confirmaba el daño provocado en la memoria de los

animales. Pero lo más importante fue observar que ni hubo diferencias entre

los dos grupos que recibieron DOPET, y que si hubo diferencias

significativas (P<0,05) entre el grupo que sólo recibió la toxina (AK) y el que

además de ser inyectado diariamente con la neurotoxina fue sondado

Capítulo IV. Resultados 225

previamente con DOPET, lo que apoyaba el potencial neuroprotector del

compuesto.

IV.2.5. Microarrays en ratones sondados con DOPET.

Tras los resultados obtenidos en el transcurso de la Memoria en relación a las

propiedades neuroprotectoras y antioxidantes de DOPET, decidimos que sería

de gran interés conocer la influencia del compuesto sobre la expresión génica.

Con tal fin, se analizó el efecto de 2 dosis del compuesto (1 y 10 mg/ratón

/día) sobre la expresión génica del cerebro e hígado de ratón mediante

microarrays (MedPlant Genetics) Se establecieron 3 grupos (n=5 por grupo)

de ratones Balb/c hembras que durante un período de tiempo de 14 días se

sondaron con agua (grupo control) y con cada una de las dosis establecidas de

DOPET disuelto en agua, cuya estabilidad fue analizada durante el desarrollo

del experimento mediante HPLC-ABTS. Los pesos de los animales se

controlaron diariamente, sin observar ninguna anomalía a lo largo del

estudio, como se observa en la figura IV.23.

Capítulo IV. Resultados 226

15

17

19

21

23

25

27

29

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Tiempo (días)

Pes

o (g

)

Control 1 Control 2 Control 3

Control 4 Control 5

15

17

19

21

23

25

27

29

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Tie mpo (dí a s)

DOPET1 0 mg-1 DOPET1 0 mg-2DOPET1 0 mg-3 DOPET1 0 mg-4DOPET1 0 mg-5

15

17

19

21

23

25

27

29

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Tiempo (días)

Pes

o (g

)

DOPET1mg-1 DOPET1mg-2 DOPET1mg-3

DOPET1mg-4 DOPET1mg-5

Figura IV.23: Pesos de los ratones

incluidos en el estudio de la expresión

génica en cerebro e hígado. No se observó

ningún cambio en ningún grupo, salvo la

ganancia normal de peso con el tiempo.

Tras el agrupamiento de las muestras de cerebro de ratón, la similitud entre la

dosis baja de DOPET y su control fue mayor, mientras que las muestras de

hígado de ratón presentan una mayor similitud entre dosis alta y baja que con

respecto al control. El análisis global de los GeneChips mostró un número

muy bajo de genes sobreexpresados o reprimidos de manera significativa,

sugiriendo que las dosis de DOPET utilizadas tuvieron una acción muy leve

sobre los tejidos estudiados. Los principales genes alterados en hígado se

muestran en las tablas IV.10.y IV.11., y los modificados en cerebro en la tabla

IV.12.

Capítulo IV. Resultados 227

GENES_Hígado

Sobreexpres_1mg Proceso biológico (a);ruta (b)

caspasa-9 a)inducción apoptosis, proteolisis, peptidolisis, actividad hidrolasa y peptidasa

b) -oxidación mitocondrial trombospondina-1 a)adhesión celular, regulación negativa Angiogénesis b) respuesta inflamatoria angiogenina-3 a)regulación negativa de biosíntesis proteínas calponina-2 a) contracción musculo liso Sobreexpres_10mg Proceso biológico proteína periférica mielina detención ciclo celular angiopoyetina-4 regulación negativa de Apoptosis

Tabla IV. 10.: Selección de los genes sobreexpresados en hígado de

ratones tratados con DOPET. Listado de los genes más relevantes en

relación con esta Memoria, que resultaron sobreexpresados en hígado de

ratón tras el sondaje con 1 mg y 10 mg de DOPET. De toda la selección

escogimos al gen de la proteína periférica de la mielina, con un factor de

expresión=2 2.1

Capítulo IV. Resultados 228

GENES_Hígado

Reprimd_1mg Proceso biológico (a); ruta (b)

citocromo P450 a)transporte electrones (familia-2, subfamilia-b) y (familia-3, subfamilia-a)

fosfatidilserina sintasa-1 a)biosíntesis/ metabolismo

fosfolípidos

receptor LBD a)homeostasis/metabolismo

de colesterol; transporte lípidos b)ruta señalización del

Factor-crecimiento-tumoral Beta

ornitina aminotransferasa a)actividad transferasa mitocondrial

factor de unión a elementos reguladores de esteroles a)metabolismo colesterol proteína tipo unión oxisterol-1A a)transporte/metabolismo esteroides y lípidos proteína precursor A -2 a)unión a proteínas y ADN sintasa de ácidos grasos a)biosíntesis/metabolismo ácidos grasos b)glicolisis y gluconeogénesis Reprimd_10mg Proceso biológico

esterol-C5-desaturasa metabolismo/ biosínt.esteroles

hidroxisteroide (17 beta)

deshidrogenasa-12metabolismo/ biosínt.esteroides

muerte celular programada-8 fragmentación ADN apoptosis presenilina-2 glicosilación-N terminal

Tabla IV.11.: Genes reprimidos en hígado de ratones sondados con

DOPET. Selección de los genes cuya expresión resultó reprimida por la

administración de 1 mg y 10 mg de DOPET en hígado de ratón. De entre todos

estos genes, se escogió el de la esterol-C5-desaturasa para estudios posteriores, con

un factor de represión= 2 -1.0.

Capítulo IV. Resultados 229

GENES_Cerebro Sobreexpres_1mg Proceso biológico glutatión S-transferasa mu5 metabolismo glutatión S-transferasa microsomal actividad transferasa proteína Tau estabilización microtúbulos Sobreexpres_10mg

metalotioneina-2 transducción señales mediadas por óxido nítrico

receptor transferrina endocitosis ión hierro semaforina A4 neurogénesis

proteína periférica mielina Aislamiento iónico de neuronas a través de células gliales

pro-opiomelanocortin-alfa ruta señalización neuropéptidos interleukina-5 respuesta inmune Reprimid_1mg receptor calcitonina receptor acoplado proteínas G Reprimd_10mg proteína kinasa II-alfa Ca2+/Calmodulina dependiente transición fase G1 a S en ciclo mitótico proteína kinasa IV Ca2+/Calmodulina dependiente transmisión sináptica entre nervios oncogen osteosarcoma neurogénesis y/o crecimiento celular

Tabla IV.12. Selección de genes alterados en cerebro de ratón. Listado de

genes sobreexpresados y reprimidos por ambas dosis de DOPET en cerebro de

ratón. Nuevamente se sobreepxpresó el gen de la Mielina con la dosis de 10 mg de

DOPET, al igual que en hígado. El factor de expresión de la mielina en cerebro=2 0.9.

Se escogieron dos genes para continuar con los estudios con DOPET:

-Gen de la Esterol C5 desaturasa: se trata de un gen implicado en el

metabolismo del colesterol, que resultó reprimido en hígado por la dosis más

elevada de DOPET. Se seleccionó por nuestro interés en la relación entre

DOPET y el metabolismo del colesterol, dada la relevancia de este esterol en

numerosas patologías, como la EA, y la importancia de encontrar un beneficio

directo del compuesto sobre el metabolismo del colesterol.

-Gen de la proteína periférica de la Mielina: es un gen implicado en

el aislamiento iónico de las neuronas por medio de células gliales,

sobreexpresado en hígado por la dosis de 10 mg de DOPET. Nos pareció

muy interesante analizar el efecto que el compuesto podría tener en un

Capítulo IV. Resultados 230

modelo animal de la EM, enfermedad desmielinizante y neurodegenerativa

de gran importancia en nuestra sociedad, de causa desconocida y aún sin

tratamiento curativo.

IV.2.6. Efecto de DOPET en un modelo animal de

Esclerosis Múltiple (EM).

Gracias a los resultados obtenidos en los microarrays de hígado de ratón,

en los que observamos que 10 mg de DOPET por ratón era capaz de generar

una sobreexpresión del gen de la Mielina, decidimos estudiar el efecto del

compuesto en una enfermedad desmielinizante como la Esclerosis

Multiple.

El presente estudio en un modelo de ratón de EM, denominado

Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE), se llevó a cabo en

colaboración con la Unidad de Neuroinmunología Clínica del Hospital Vall

d’Hebrón (Barcelona) siguiendo un protocolo de inmunización descrito

anteriormente (Espejo et al., 2001), y que cursa con un EAE crónica. Este

estudio fue realizado en 2 grupos de ratones de la raza 129/Sv, H-2b (n=9,

cada grupo): Control (con agua de mineralización muy débil) y DOPET

(con el compuesto disuelto en agua de mineralización muy débil, 10

mg/ratón/día), con el objeto de comprobar la capacidad de DOPET para

mejorar la enfermedad y/o modificar alguno de los parámetros analizados.

El estudio duró 28 días, contando con el período de inmunización (que

tuvo lugar entre los días 0 y 7 del estudio). Los animales fueron pesados

diariamente y evaluados sus signos neuro-motrices siguiendo los criterios

descritos por Espejo y colaboradores (Espejo et al., 2001).

Los parámetros analizados durante el estudio fueron los siguientes:

-Incidencia: Número de ratones con algún síntoma de la enfermedad en

cualquier momento del estudio.

-Mortalidad: Número de ratones fallecidos a consecuencia de la

enfermedad.

Capítulo IV. Resultados 231

-Inicio: Día de inicio de la enfermedad contando desde la primera

inmunización (media del grupo, sólo animales enfermos).

-Cronicidad: Sumatoria de los scores diarios (media del grupo, todos los

animales inmunizados, valor= 0 para los no enfermos).

-Duración: Número de días con signos de enfermedad (media del grupo, todos

los animales inmunizados, valor= 0 para los no enfermos).

-Gravedad: Score máximo (media del grupo, todos los animales inmunizados,

valor= 0 para los no enfermos).

-Morbilidad: Número de días con pérdida de peso respecto al día anterior

(media del grupo, todos los animales inmunizados, valor= 0 para los no

enfermos).

Los resultados obtenidos se muestran en las tablas IV.13. y IV.14 y en la

figura IV.24.

Capítulo IV. Resultados 232

Día Control DOPET

(10mg/ratón/día)

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 0 0

11 0 0

12 0,1 0,1

13 0,1 0,2

14 0,2 0,2

15 0,6 0,4

16 1,2 0,4

17 1,4 0,4

18 1,5 0,7

19 1,5 0,4

20 1,6 0,7

21 1,7 0,7

22 1,7 0,7

23 1,7 0,7

24 2 0,9

25 2,3 0,9

26 2,3 0,9

28 2,3 0,9

Tabla IV.13.: Valores de score diario para el grupo control y el grupo

DOPET. Se recogen los valores medidos diariamente para cada animal

inmunizado de cada grupo, siguiendo el criterio de evaluación: 0=no signos

clínicos; 0,5=parcial pérdida del tono de la cola durante 2 días consecutivos;

1=parálisis de la cola entera; 2= suave paraparesis de 1 o ambos miembros

traseros; 3=paraplejia; 4=tetraparesis; 5=tetraplegia; 6=muerte.

Capítulo IV. Resultados 233

Incidencia Mortalidad Inicio Cronicidad Duración Gravedad Morbilidad

Control 7/9;78% 0/9;0% 16+4,02 22+21,59 8+5,98 2+1,93 3+4,13

DOPET 2/9;78% 0/9;0% 15+4,24 9+18,38 3+5,93 1+1,76 1+2,20

P 0,045 nd 0,4 0,093 0,044 0,052 0,077

Tabla IV.14.: Valores para los parámetros analizados en el estudio. Se

obtuvo una reducción estadísticamente significativa en el grupo DOPET frente al

control, en cuanto a la incidencia de la enfermedad y la duración de la misma

(P<0,05).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

22 23

24 25

26

28

Tratamiento (días)

Scor

e ac

um

ula

do

DOPET

Control

Figura IV.24.: Representación del score diario para cada grupo a lo

largo del estudio. La diferencia obtenida para el grupo DOPET con respecto al

control presentó tendencia estadística (P= 0,06).

Los resultados mostrados en la Tabla IV.14. representan los valores de los

parámetros analizados en el estudio utilizando a todos los animales

inmunizados (n=9 por grupo) independientemente de si mostraban signos

o no de enfermedad. Puesto que la incidencia en el grupo DOPET fue muy

Capítulo IV. Resultados 234

baja (2 de 9), se corrigieron los valores anteriores utilizando sólo los

valores obtenidos en aquellos animales donde se detectó la enfermedad. En

este sentido, el valor para la cronicidad en el grupo control fue de 29±20,25

y de 41±7,42 para el grupo DOPET, aunque la diferencia entre estos valores

careció de significación estadística (P= 0,22). Igualmente, los valores para

la duración de los brotes, corregidos con esta consideración, fueron de

10±4,5 (control) y de 13±4,24 (DOPET), aunque nuevamente el valor de P

no fue significativo (P= 0,24). Finalmente, la corrección de la medición de

la gravedad resultó en valores de 3±1,59 (control) y 4±0 (DOPET) con una

P igual a 0,23 (no significativa).

Estos resultados sugieren la capacidad de DOPET para disminuir la

incidencia de esta enfermedad en el modelo animal utilizado, aunque

aquéllos animales que enfermaron lo hicieron con la misma intensidad que

los controles.

El hecho de que DOPET sobreexpresara al gen de la proteína Mielina pudo

ser la razón por la que el compuesto mostró un efecto en este modelo

animal de EM.

Capítulo IV. Resultados 235

IV.2.7. Estudios del metabolismo del colesterol.

A continuación se decidió abordar el análisis de la capacidad

hipocolesterolemiante del compuesto, en base a los resultados obtenidos en

los microarrays realizados en hígado de ratones tratados con el compuesto, en

los que una dosis de 10 mg reprimía la expresión del gen que expresa la

Esterol C5-desaturasa. Por tanto comenzamos estudiando la enzima

denominada Latosterol C5-desaturasa (LC5D), que cataliza la introducción de

un puente delta 5 en la molécula de latosterol (colest-7-en-3 -ol) para formar

7-dehidrocolesterol (7-DHC), con la participación de oxígeno molecular y

nucleótidos reducidos de piridina. El objetivo era determinar el potencial de

DOPET para inhibir la producción de colesterol en sistemas in vitro e in vivo,

confirmando así su efecto a nivel genético comprobado con anterioridad.

IV.2.7.1. IC50 de DOPET para la actividad enzimática LC5D.

En primer lugar, se determinó la constante de Michaelis-Menten (Km) de la

enzima LC5D, siguiendo el protocolo descrito en el capítulo II de esta

Memoria. La Km nos permitiría conocer la concentración del sustrato

(latosterol) a la que la reacción tenía lugar a la mitad de la velocidad máxima

(Vmáx), ajustándose a la ecuación: v/Vmáx= [Sustrato]/ (Km + [Sustrato]

Por tanto, la Km de la LC5D sería un indicador de la afinidad de la enzima por

el sustrato dado, y por tanto de la afinidad de la enzima por formar el

complejo enzima-sustrato.

Se aisló la enzima a partir de microsomas hepáticos de rata, por tratarse de los

orgánulos celulares en los que se aloja la proteína. Tras la puesta a punto de la

cantidad óptima de proteína microsomal (0,5 mg/mL), se realizaron todas las

reacciones en triplicado y se analizaron las muestras por HPLC-PDA (280

nm). Se obtuvieron los siguientes valores, representados en la figura IV.25.

Km= 157,3 µM; Vmáx= 107,03 µmol/mg proteína

Capítulo IV. Resultados 236

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

5 55 105

155

205

255

305

355

40

5

455

505

555

[Latosterol] (µM )

Vel

ocid

ad (

nm

ol/m

g)

Figura IV.25.: Curva de Michaelis-Menten para determinar el valor de

la Km de LC5D en microsomas de hígado de rata. Los valores se

obtuvieron a partir de las áreas obtenidas para 7-DHC (producto de la reacción

catalizada por LC5D) mediante HPLC-PDA (280 nm) frente a diferentes

concentraciones de latosterol (sustrato).

La reacción catalizada por la actividad enzimática LC5D supone la

formación de colesterol en hígado, por lo que una vez determinada la Km de

la enzima, analizamos si DOPET era capaz de inhibir esa reacción mediante

una actuación directa sobre LC5D.

Se determinó la IC50 de DOPET para LC5D o concentración de compuesto

capaz de con estableció un protocolo para determinar la concentración del

producto de la reacción, 7-DHC, mediante HPLC-PDA (280nm), de manera

que pudiéramos medir la inhibición de la LC5D ejercida por DOPET a través

de una reducción en la producción de 7-DHC.

Las reacciones se realizaron de la misma manera que las muestras para la

determinación de la Km de la enzima (microsomas que llevan la enzima,

liposomas que contienen el sustrato, sobrenadante-105 que facilita la

Capítulo IV. Resultados 237

reacción y buffer fosfato potásico), salvo que en esta ocasión se adicionó

DOPET (diferentes concentraciones de un stock 6,5 mM).

A continuación se determinó la IC50 de DOPET para la LC5D. Los

resultados obtenidos para los diferentes ensayos se muestran en la figura

IV.26.

Figura IV.26.: Representación de los 3 ensayos seleccionados para

determinar la IC50 de DOPET para LC5D. Se representan los valores para la

actividad enzimática LC5D, expresada en porcentaje de pérdida de actividad en

función del incremento de la concentración de DOPET y por tanto de su capacidad

inhibidora. El valor medio para la IC50 de DOPET fue de 187 µM.

Se seleccionaron 3 de los ensayos realizados y se realizó la media,

concluyendo que el valor de la IC50 de DOPET para la enzima LC5D equivalió

a:

IC50 = 187 µM

Una vez conocida la capacidad inhibidora de DOPET sobre la enzima LC5D,

y teniendo en cuenta que LC5D es una metaloenzima, capaz de ser inhibida

por compuestos quelantes de hierro (Kawata et al., 1985), nos propusimos

0

25

50

7 5

100

125

150

0 50 100 150 200 250 300

[DOPET](µM)

Act

ivid

ad L

C5D

(%

)

*

IC50

Capítulo IV. Resultados 238

descartar que la inhibición ejercida por DOPET sobre la enzima se debiese a

su poder quelante de hierro. Para ellos, se incubaron las muestras con FeCl3

(10 µM, 30 µM y 100 µM), descartando esta posibilidad porque ni la

actividad enzimática ni la inhibición ejercida por DOPET resultaron

modificadas por la adición de FeCl3, como se observa en la figura IV.27.

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 00

1 2 0

1 4 0

1 6 0

0µM

DO

PE

T

10 µ

M F

eCl3

30 µ

M F

eCl3

100µM

FeC

l3

100µM

DO

PE

T

300µM

DO

PE

T

100µM

DO

PE

T+

10µM

FeC

l3

100µM

DO

PE

T+

30µM

FeC

l310

0µM

DO

PE

T+

100µM

FeC

l3

300µM

DO

PE

T+

100µM

FeC

l3

Act

ivid

ad L

C5D

(%

)

Figura IV.27.: Influencia del FeCl3 sobre capacidad inhibidora de

DOPET sobre LC5D. Se evaluó si la inhibición de DOPET (100 µM y 300 µM

sobre la metaloenzima LC5D era debida a su poder quelante de hierro. Su

capacidad inhibidora no resultó modificada tras la adición de FeCl3 (10 µM, 30 µM

y 100 µM).

Por todos estos resultados se estableció que DOPET era capaz de inhibir a la

enzima LC5D por mecanismos que no estaban basados en su poder quelante

de hierro.

Capítulo IV. Resultados 239

IV.2.7.2. Efecto de diferentes dietas en el metabolismo del

colesterol de conejos.

Tras los ensayos in vitro anteriores realizados en la enzima LC5D, en los que

DOPET demostró inhibir la enzima LC5D implicada en el metabolismo del

colesterol, se diseñó un estudio in vivo para analizar el efecto de este

compuesto aplicado con la dieta. El objetivo del estudio, fue la creación de un

modelo de aterogenia en conejo, por ser un animal en el que podía inducirse el

proceso de manera fácil y rápida mediante manipulación dietaria.

Se diseñaron 7 grupos de 8 conejos cada uno: 2 con dieta control (CO= 30 días

y CF= 60 días), 2 con dieta aterogénica (CA= 30 días y AA= 60 días), 1 con

dieta aterogénica 30 días y dieta control los 30 días siguientes (AC), 1 con

dieta aterogénica más sondaje con DOPET 30 días (ADT) y el último con dieta

control y DOPET durante 60 días (DT).

En primer lugar se realizó la extracción de colesterol total tanto en plasma

como en cerebro, LAD-colesterol y triglicéridos en plasma, determinados en

ambos tejidos mediante ensayo colorimétrico por espectrofotometría (kit Bio

System).

Los resultados obtenidos para los parámetros determinados en plasma, se

muestran en las figuras IV. 28-30.

Capítulo IV. Resultados 240

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

CO CA ADT CF AA AC DT

Gr u pos seg ú n dieta

[Co

lest

ero

l] (

mg/

dL

)

*

Figura IV.28.: Colesterol total en plasma de cada uno de los grupos de

conejos del estudio. Se obtuvo un descenso significativo (P<0,05) en el grupo DT

(dieta aterogénica 1 mes y dieta chow más sondaje con DOPET durante 1 mes más)

con respecto a su control AC (igual que DT pero sin DOPET) y al grupo AA (2 meses

con dieta aterogénica).

Estos resultados demuestran la efectividad del modelo, dado el incremento de

los niveles de colesterol en los grupos con dieta aterogénica CA y AA con

respecto a sus controles CO y CF. La reducción del colesterol en el grupo DT,

sondado con DOPET durante 2 meses y alimentado con dieta aterogénica 1

mes y dieta control el mes siguiente, fue del 40% con respecto al grupo AC, lo

cual era significativo (P<0,05) y demostraba la eficacia del compuesto en los 2

meses de tratamiento.

Capítulo IV. Resultados 241

0

100

200

300

400

500

600

CO CA ADT CF AA AC DT

Grupos según dieta

[Tri

glic

érid

os]

(mg/

dL)

*

Figura IV.29.: Triglicéridos en plasma de conejo en cada grupo del

estudio. Se obtuvo una reducción significativa (P<0,05) de los triglicéridos en el

plasma de los animales del grupo DT con respecto a su grupo control AC y al grupo

AA, alcanzando valores muy similares al grupo control de 2 meses (CF =66 ±11

mg/dL; DT= 61±9 mg/dL).

Nuevamente, se observó un incremento significativo de los triglicéridos en

plasma de los grupos AC y AA. Sin embargo, en el grupo DT se produjo una

reducción significativa (P<0,05) del 50% en los niveles de este parámetro

plasmático. En esta ocasión también quedaba demostrada la eficacia de

DOPET en el tratamiento a 2 meses para mejorar el perfil lipídico en plasma

de los conejos.

Capítulo IV. Resultados 242

0

5

10

15

20

25

30

35

40

CO CA ADT CF AA AC DT

Grupos según dieta

[LA

D-c

ol]

(mg/

dL)

*

Figura IV.30: Concentración de LAD-colesterol en plasma para cada

grupo de conejos del estudio. Se observó un incremento significativo (P<0,05)

en el grupo DT, sondado con DOPET durante 2 meses, respecto a su control AC.

Se obtuvo un descenso significativo (200%) en los niveles de LAD-colesterol

en el grupo DT suplementado con DOPET en relación al resto de grupos.

Por tanto, los análisis de parámetros plasmáticos demuestran la reducción

significativa de la relación “colesterol total/LAD colesterol” en los animales

tratados con DOPET durante 2 meses, y por ende la eficacia del compuesto en

la mejora del perfil lipídico plasmático en este modelo animal.

A la vista de la mejora observada en plasma, se determinaron los niveles de

colesterol cerebro de los diferentes grupos de conejos y se obtuvieron los

siguientes resultados, recogidos en la figura IV.31.

Capítulo IV. Resultados 243

0

5

10

15

20

25

CO CA ADT CF AA AC DT

Grupos según dieta

[Col

este

rol]

(m

g/g)

Figura IV.31.: Colesterol en cerebro de los diferentes grupos de conejos.

No se obtuvo ninguna diferencia significativa entre los grupos para este parámetro.

En esta ocasión, no se observó ninguna diferencia significativa en los niveles

de colesterol cerebral entre los grupos. Es posible que la larga vida media del

colesterol en este órgano (6 meses) fuera la razón para que en un estudio de 2

meses no percibiésemos ningún efecto de DOPET sobre este parámetro.

Serían necesarios estudios a más largo plazo para poder detectar alteraciones

en el contenido en colesterol en cerebro por modificaciones dietarias.

Por tanto, ante la imposibilidad para detectar algún efecto de DOPET en la

concentración de colesterol en cerebro, se decidió estudiar uno de los

metabolitos intermediarios en el metabolismo del colesterol, como es el

latosterol (colest-7-en-3 -ol). La conversión de latosterol en colesterol pasa

por la formación de 7-dehidrocolesterol (7-DHC), y el ratio de conversión de

latosterol en colesterol se considera un marcador de la síntesis de colesterol

(Heverin et al., 2004).

A partir de las extracciones de colesterol, se realizó la obtención de latosterol

para su posterior detección por CG-MS.

Capítulo IV. Resultados 244

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

CO CA ADT CF AA AC DT

Grupos según dieta

[Lat

oste

rol]

(m

g/g)

**

**

Figura IV.32.: Valores de latosterol en cerebro de conejos. Se obtuvo una

disminución estadísticamente significativa (P<0,01) entre el grupo suplementado

con DOPET durante 1 mes (ADT) respecto a su grupo control (CO), así como una

reducción significativa (P<0,01) en los niveles de latosterol del grupo sondado con

DOPET durante 2 meses (DT) con respecto a su control (AC).

Los resultados obtenidos para los niveles de latosterol en cerebro, confirman

la idea anterior en relación a la ausencia de un efecto en colesterol en cerebro

por la breve duración del estudio. En este caso, se obtuvo una disminución

significativa (P<0,01) en los dos grupos que recibieron DOPET (1 y 2 meses),

lo que demuestra que el compuesto era eficaz en la reducción de los niveles de

un metabolito del colesterol en tan sólo 1 mes de tratamiento, por lo que

probablemente en un estudio a más largo plazo (6 o 7 meses) habríamos

observado una reducción en el colesterol total del cerebro de estos animales.

Por tanto, podemos concluir que DOPET favoreció el metabolismo lipídico en

ambos tejidos mediante la disminución de los niveles de colesterol total, LAD-

colesterol y triglicéridos en plasma, tras 2 meses de tratamiento, así como los

niveles de latosterol en cerebro, precursor del colesterol, en tan sólo 1 mes de

tratamiento.

Capítulo IV. Resultados 245

IV.2.8. Efecto de DOPET sobre la captación de dopamina

y norepinefrina in vitro.

La estructura molecular de DOPET (2, 3-4 dihidroxifeniletanol) es muy

similar a la molécula de Dopamina, como puede apreciarse en la figura IV.33.

OHOH

OH

OHOH

NH2

DOPAMINA (C8H11NO2)DOPET (C8H10O3)

Figura IV.33. Similitud estructural de DA y DOPET. Se trata de dos

moléculas formadas por un anillo fenólico, solamente diferenciadas por un grupo

NH en la molécula de la DA y un oxígeno en la estructura de DOPET.

En base a esta similitud molecular, se pensó que DOPET podría estar

implicado en el metabolismo de la DA, participando en reacciones catabólicas

de eliminación de la DA catalizadas por la enzima MAO, y/o en procesos de

reconocimiento por parte de los receptores de DA. Si el compuesto participara

en alguno de estos procesos, podría ser de gran relevancia en patologías como

la Enfermedad de Parkinson, donde la inhibición de la actividad Monoamino

Oxidasa (MAO) o la potenciación de la captación de DA por parte de sus

receptores suponen dos puntos clave en la búsqueda de terapias para la

enfermedad.

Por tanto, se diseñó un estudio en colaboración con la Dra. Hilfiker

(Universidad Manchester, Inglaterra) para probar los efectos de DOPET sobre

la captación y liberación de catecolaminas por parte de las células PC12. Estas

células representan un modelo catecolaminérgico adecuado, ya que secretan

monoaminas y desarrollan un fenotipo-tipo neuronal bajo tratamiento con

factor de crecimiento nervioso (FCN) (Greene and Tischler, 1976).

Capítulo IV. Resultados 246

Las monoaminas Dopamina (DA), Norepinefrina (NE) y Serotonina (5-

HT), son captadas por las células a través de diferentes transportadores

proteicos asociados a la membrana plasmática, y se concentran en

vesículas.

Las células PC12 expresan el transportador de DA (DAT) sensible a cocaína

y anfetamina (Zhu and Hexum, 1992), el transportador de NE membrana

sensible a la cocaína y Na+/Cl+ dependiente (NET) (Bruss et al., 1997) y el

transportador de 5-HT (SERT) (Yoffe and Borchardt, 1982).

El transporte de catecolaminas en neuronas, a través de la membrana

plasmática, está estrechamente acoplado al transporte vesicular hacia las

vesículas de almacenamiento, de manera que sólo una pequeña fracción de

las monoaminas es metabolizada por la MAO (Bonisch and Eiden, 1998).

La MAO se localiza dentro de las neuronas catecolaminérgicas,

metabolizando DA y NE a través de O-metilación. En roedores, NE y 5-HT

son sustratos exclusivos de MAO-A, mientras que la DA es sustrato tanto

de MAO-A como de MAO-B (Garrick and Murphy, 1982).

Tanto las PC12 indiferenciadas como las células diferenciadas por FCN,

derivadas de tejido de rata, contienen predominantemente MAO-A

(Youdim et al., 1986) y una baja actividad MAO-B (Wei et al., 1997).

Las PC12 expresan grandes cantidades de catecol-O-metiltransferasa, capaz

de metabolizar NE y DA en este sistema celular (Offen et al., 2001). En

resumen, este sistema celular contiene todas las proteínas relevantes para

el transporte y el metabolismo de DA y NE.

Para el estudio de DOPET en células PC12, se marcaron con [3H]-DA o

[3H]-NE, durante 1 h, en presencia o en ausencia de DOPET 5 µM (figura

IV.34)

Para asegurar la especificidad de la captación de los neurotransmisores

marcados, se incluyó un control en cada ensayo, con un exceso de 1000

veces la concentración molar de transmisor no marcado. La captación no

específica fue de <10% tanto para DA como para NE, y se restó de todos los

valores experimentales. DOPET no tuvo efecto en la cantidad de

neurotransmisor captado de manera no específica.

Capítulo IV. Resultados 247

DOPET incrementó la captación de [3H]-DA, aunque en un rango variable

(n=7; 71 ±48%). Este efecto era más pronunciado para [3H]-NE (n=5; 322

± 157%).

En base a la capacidad de las células PC12 para inducir la expresión de una

serie de proteínas implicadas en la diferenciación del FCN, se crecieron

durante 24 h en medio enriquecido con 1% de suero y 50 ng/mL de FCN antes

de medir la captación. Bajo estas condiciones, la mejora en la captación

inducida por DOPET era menos variable ([3H]-DA (n=4; 84 ±32%); [3H]-NE

(n=5; 588 ±304%).

Figura IV.34.: Captación de DA y NE en los sistemas tratados con

DOPET, con y sin pretratamiento con FCN. Se midió la captación de DA y NE

en células PC12 sin diferenciar y en células incubadas previamente con FCN que

inducía la diferenciación de las células y la expresión de una serie de proteínas,

obteniéndose un incremento en la captación de los neurotransmisores.

Las curvas dosis-dependientes sugieren que DOPET es muy potente para

incrementar el contenido de catecolaminas radiomarcadas dentro de las

células, con una Ki de aproximadamente 0.1 µM tanto para DA (n=2) como

para NE (n=3). Además, dicho incremento era tiempo-dependiente, con una

saturación igual a 3 h.

0

200

400

600

800

1000

Cap

taci

ón n

euro

tran

smis

or (

%)

DOPET DOPETDOPET+FCN

DOPET+FCN

DA NE

Capítulo IV. Resultados 248

Con objeto de establecer el mecanismo de acción de DOPET, se provocó la

secreción de [3H]-DA y de [3H]-NE por KCl, que evoca una secreción

dependiente de Ca 2+ por despolarización de la membrana y un influjo de Ca

2+ a través de los canales voltaje-dependientes de Ca 2+, y con ionomicina,

que actúa como un ionofóro para incrementar globalmente los niveles

intracelulares de Ca2+. Sin embargo, como se observa en la figura IV.35., los

valores de secreción fueron variables (debido a la sensibilidad de las células

diferenciadas con FCN a ser lavadas en placa) por lo que no pudimos

observar ningún efecto de DOPET sobre la secreción. Podríamos sugerir que

DOPET no modulase directamente la maquinaria de secreción, o que lo

haría modulando una serie de vías de transducción de señales que

impactaran en la eficacia de la maquinaria de secreción.

0

1 0

20

30

C

C+

DO

PE

T

KC

l

KC

l+D

OP

ET

Ion

o

Ion

o+

DO

PE

T

Sec

reci

ón

DA

(%

to

tal)

0

10

20

30

C

C+

DO

PE

T

KC

l

KC

l+D

OP

ET

Ion

o

Ion

o+D

OP

ETS

ecre

ción

NE

(%

tot

al)

Figura IV.35. Efecto de DOPET sobre la secreción de DA y NE

provocada por KCl y por ionomicina. En ningún sistema DOPET

incrementó la secreción ni de DA ni de NE inducidas por KCl o por ionomicina

(iono), como se observa al comparar los niveles secretados por cada uno de los

compuestos y el control (C) incubado únicamente con DOPET.

A continuación, para analizar el efecto de DOPET sobre la MAO, se comparó

la actuación del compuesto con el efecto ejercido por inhibidores específicos

de la MAO-A (Clorgilina, 15 µM, SIGMA) y MAO-B ((-)-Deprenil, 100 µM,

TOCRIS) en el sistema celular (figura IV.36). Mientras DOPET (10 µM)

incrementaba de manera efectiva los niveles de catecolaminas

intracelulares, ninguno de los inhibidores alteraba los niveles intracelulares

Capítulo IV. Resultados 249

de [3H]-DA o de [3H]-NE, ensayados en células no diferenciadas o en células

crecidas en suero al 1% con FCN durante 1 día. Estos datos sugieren que

DOPET, a la concentración utilizada, incrementó los niveles de

catecolaminas por un mecanismo que no se puede asociar con la inhibición

de las actividades MAO-A o MAO-B, por lo que su actuación podría tener

lugar sobre los transportadores.

A)

0

50

100

150

200

C

DO

PE

T

Clo

rgil

ina C

DO

PE

T

Clo

rgil

ina

(-)-

depr

enil

x10

3

Cap

taci

ón t

otal

DA

(dp

m)

Medio completo +1 %suero/FCN

B)

0

50

100

150

200

250

C

DO

PE

T

Clo

rgil

ina C

DO

PE

T

Clo

rgil

ina

(-)-

depr

enil

x10

3

Cap

taci

ón t

otal

NE

(dp

m)

Medio completo +1 %suero/FCN

Figura IV.36.: Comparación del efecto de DOPET con inhibidores de la

MAO (A y B). Se observó un incremento en la captación de DA (A) y NE (B) en

presencia de DOPET pero no de los inhibidores específicos de MAO.

Capítulo IV. Resultados 250

Ante la ausencia de un efecto claro sobre la MAO por parte de DOPET, se

quiso comprobar si DOPET actuaba en el transporte de las catecolaminas a

través de la membrana plasmática o modificando las enzimas implicadas

en el metabolismo intracelular de catecolaminas. Para tal efecto, se

marcaron las células en primer lugar con el transmisor y posteriormente se

incubaron con DOPET 1 µM en ausencia de dicho transmisor marcado. Al

proceder así, se produjo un incremento robusto del contenido intracelular

de transmisores radiomarcados. En contraste, al realizar este mismo

ensayo, pero lavando las células antes de incubarlas con DOPET durante 1

h, no se observó el mismo efecto. Estos resultados sugieren que DOPET

podría actuar en el transporte de catecolaminas a través de la membrana

plasmática más que sobre las enzimas del metabolismo de las monoaminas.

El mecanismo de actuación propuesto para DOPET se esquematiza en la

figura IV.37.

Capítulo IV. Resultados 251

Figura IV.37.: Mecanismo de acción propuesto para DOPET en células

PC12. El posible mecanismo de acción de DOPET consistiría en la activación del

transportador TNE que introduciría NE y DA en la célula, facilitando así la

incorporación de éstos en vesículas. No se ha demostrado que esta acción pudiera

ser llevada a cabo a través de la activación del transportador de DA (TDA). Por

otra parte, DOPET (concentraciones superiores a 5 µM) podría inhibir a la

actividad MAO, responsable de la degradación de DA. DBH= Dopamina-beta-

hidroxilasa

NE + DA DA Extacelular

TNE TDA

Intracelular

+

DOPET NE + DA

+

DOPET

vesículas

?

DOPET

MAODOPAL

APOPTOSIS

DOPET

DA HVACOMT

NE

-

DBHNE DA

Capítulo IV. Resultados 252

IV.2.8.1. IC50 de DOPET para la actividad Monoamino

oxidasa (MAO) en mitocondrias aisladas de hígado y cerebro

de rata.

Tras los resultados anteriores, en los que DOPET demostró actuar sobre el

metabolismo de las catecolaminas, bien a través de la activación de los

transportadores y/o inhibición de la actividad MAO, nos pareció interesante

analizar la capacidad de inhibición de diferentes concentraciones del

compuesto, superiores a la concentración empleada en aquél estudio (5 µM),

sobre la actividad MAO-B. Se estudió la inhibición de la MAO-B, porque este

fenómeno se asocia con la mejora en la actividad de la DA, al igual que con

el descenso en la producción de peróxido de hidrógeno (H2O2). Para ello se

realizaron una serie de ensayos in vitro para determinar la concentración

capaz de inhibir el 50% de actividad enzimática MAO-B (IC50), aislada en

mitocondrias de cerebro de rata. En patologías como la EP se emplean

inhibidores de la MAO con objeto de impedir la degradación de la dopamina

y evitar así las alteraciones neuromotoras derivadas de la pérdida de este

neurotransmisor.

La reacción que se desarrolló determinada mediante espectrofotometría, se

basó en métodos descritos previamente (Holt et al., 1997).

Benzilamina+MAO-B=Benzaldehído+H2O2

4-aminoantipirina oxidada+ácido vinílico=quinoneimina (color rojo)

Se aislaron mitocondrias en cerebro de rata por ser los orgánulos en los que

reside la actividad enzimática MAO, y se realizaron las reacciones

pertinentes con concentraciones crecientes de DOPET (0 µM a 125 µM en

cerebro) para la determinación de la IC50 del compuesto para MAO-B en

ambos tejidos. La adición de DOPET y el sustrato benzilamina se realizó

transcurridos 5 min tras la colocación de la mezcla (buffer, mitocondrias y

Peroxidasa 4-aminoantipirina

Capítulo IV. Resultados 253

solución cromogénica) en la cubeta de cuarzo dentro del espectrofotómetro,

para dejarla atemperar. Una vez añadido el inhibidor y el sustrato, se midió

la absorbancia a 498 nm, llevando a cabo una cinética de 20 min para

establecer el descenso en la formación del producto de la reacción a lo largo

del tiempo como consecuencia del efecto inhibidor de DOPET sobre la

actividad enzimática. Los resultados obtenidos para las 3 tandas de

reacciones se recogen en las figuras IV.38 (cerebro).

Figura IV.38.: IC50 de DOPET para la actividad MAO-B en cerebro de

rata. Se representan los valores conjuntos de los 3 ensayos realizados para la

actividad enzimática MAO-B(%), frente al logaritmo de la concentración de

DOPET.

El valor medio para la IC50 de DOPET correspondió a:

IC50 DOPET para MAO-B cerebral= 16.3 µM ± 1.3

Estos resultados demuestran que DOPET era capaz de inhibir a la enzima

MAO-B, a concentraciones un poco más elevadas que las empleadas en el

estudio de las catecolaminas descrito con anterioridad.

0

25

50

7 5

100

0,5 1 ,5 2,5

Log [DOPET] (µM)

MA

O-B

(%

)

IC50

*

V. DISCUSIÓN

Capítulo V. Discusión 255

Las enfermedades neurodegenerativas como la Enfermedad de Alzheimer (EA),

la Enfermedad de Parkinson (EP) y la Esclerosis Múltiple (EM), de origen

multifactorial (reacciones tóxicas, inflamatorias, neurotoxicidad glutamatérgica,

incrementos en el nivel de hierro y de óxido nítrico, eliminación de los

antioxidantes endógenos, reducción en los factores tróficos y pérdida de

neuronas), son algunas de las patologías más devastadoras y que mayor gasto

económico suponen para la sociedad actual (Mayeux, 2003). Los mecanismos de

neuroprotección pueden ser afrontados desde modificaciones dietarias

(Mattson, 2002).

Las características clínicas clásicas de la EA incluyen una pérdida de memoria

amnésica (Greene, 1996; Pillon, 1993) entre otras alteraciones motoras (Kirk,

1991). El péptido A , componente de las placas seniles y molécula clave en la EA

(Bayer et al., 2001) es neurotóxico tanto in vitro como in vivo, mediante la

inducción de un estrés oxidativo asociado a las membranas celulares, que

conduce a perturbaciones en el metabolismo del colesterol que activarían una

cascada neurodegenerativa responsable del desarrollo de la enfermedad clínica

(Bodovitz and Klein, 1996; Cutler et al., 2004). La oxidación y peroxidación

lipídica, inflamación y activación de la cascada apoptótica de muerte celular son

considerados consecuencias secundarias de la generación y deposición de A

(Hardy, 2002).

El parkinsonismo describe un síndrome caracterizado por rigidez, temblor y

bradikinesia, del cual la EP es la principal causa y la enfermedad más común

que afecta a la función motora y al movimiento.

La EM es una enfermedad inflamatoria demielinizante crónica del SNC que

afecta a los jóvenes adultos y que al igual que la EA es de patogénesis

desconocida (Hong, 2004) aunque se ha sugerido que el daño axonal podría

ocurrir de manera independiente a los procesos inflamatorios (Maggs, 2004).

Los polifenoles presentan propiedades plurifarmacológicas, como la quelación

de hierro, el “scavenging” de radicales libres, la activación de genes de

supervivencia y de rutas de señalización celular. Por todo esto, se han elegido

como candidatos para la investigación en enfermedades neurodegenerativas

(Mandel and Youdim, 2004). Un compuesto fenólico como 2-(3,4-

Capítulo V. Discusión 256

dihidroxifenil)-etanol (DOPET), presente en el aceite de oliva, ha demostrado

ser un potente antioxidante, tanto in vitro como in vivo, junto a otras

actividades biológicas que le confieren importancia dentro de la dieta

Mediterránea (Visioli, 2001a). Se ha demostrado recientemente el poder

protector de la ingesta de flavonoides, compuestos fenólicos contenidos en el

vino, vegetales, frutas y te frente a la demencia (Commenges, 2000).

Igualmente, se ha comprobado que la ingesta de vitamina C y E reduce el riesgo

de padecer la EA (Engelhart, 2002) y mejoran la función cognitiva (Grodstein,

2003).

Por otra parte, hay que destacar la importancia de los AGPIs omega-3

contenidos en el aceite de pescado, como componentes dietarios capaces de

reducir la presión sanguínea, proteinuria, niveles lipídicos e inflamación

(Parinyasiri et al., 2004). Se ha demostrado su capacidad neuroprotectora en el

cerebro adulto y su conexión con el retraso de la EA (Kim et al., 2000b;

Lauritzen et al., 2000; Youdim et al., 2000). Recientemente se ha publicado la

eficacia de una dieta enriquecida en AGPIs omega-3 como una estrategia de

neuroprotección en un modelo animal de la EA (Calon, 2004).

El objetivo global de esta Memoria fue el estudio de la capacidad de

neuroprotección de dos componentes naturales habituales de la dieta

Mediterránea, como son los AGPIs omega-3 y el DOPET, aplicados a diferentes

sistemas sometidos a estrés oxidativo, procesos inflamatorios y relacionados con

el metabolismo del colesterol.

Capítulo V. Discusión 257

V. Estudios en modelos animales de la EA.

V.1.1. Estudios con dietas enriquecidas en AGPIs omega-3 en

modelo transgénico simple PPA de la EA.

Se ha demostrado la capacidad de los AGPIs omega-3 para inducir una

reducción en los niveles de colesterol (Contacos et al., 1993). Los AGPIs se

relacionan con el estrés oxidativo por su vulnerabilidad para ser atacados por los

radicales libres (Christen, 2000) y los omega-3 suprimen la inflamación y

mejoran el curso de una infección mediante la disminución de las citoquinas

pro-inflamatorias (Blok et al., 1996). Como consecuencia, se ha conectado a

estos ácidos grasos omega-3 con el retraso en el inicio del desarrollo de

patologías como la EA y la EP (Youdim et al., 2000).

En el momento en que se planificó y desarrolló este estudio no existía ningún

otro en que se analizara el efecto de una dieta enriquecida en AGPIs omega-3 en

un modelo animal de la EA, por lo que se decidió evaluar el efecto de esta dieta

en un modelo animal de ratón simple transgénico PPA.

La composición de ácidos grasos de los fosfolípidos de las membranas

neuronales refleja la ingesta de aquéllos en la dieta. El grado de desaturación de

los ácidos grasos determina la estructura tridimensional y por tanto su fluidez y

función. La enzima fosfolipasa A2 hidroliza los ácidos grasos de los fosfolípidos

de las membranas, liberando los AGPIs omega-6, que son metabolizados a

prostaglandinas, de elevado potencial inflamatorio en comparación con los

eicosanoides liberados por los AGPIs omega-3. El ratio omega-3:omega-6

influye en la neurotransmisión serotoninérgica y catecolaminérgica y en la

formación de las prostaglandinas, que son procesos vitales en el mantenimiento

de la función normal del cerebro (Haag, 2003). Por esta razón, los omega-3

suponen un mayor beneficio en patologías como la EA El hecho de encontrar

una reducción significativa en el nivel de AA tanto en plasma como en cerebro

en el grupo omega-3 con respecto al grupo control, indica una efectividad de la

dieta omega-3 en la composición lipídica de las membranas, que consigue

reducir el contenido en omega-6 propiciando el desarrollo de las propiedades

beneficiosas de los omega-3. Estos resultados se ven reforzados con la ausencia

Capítulo V. Discusión 258

de alteraciones en los niveles de ADH en plasma y con el incremento

significativo de ADH en cerebro, lo que favorece la hipótesis que establecimos de

una posible sustitución de los omega-6 por omega-3 en las membranas

cerebrales inducida por la dieta.

Los niveles de colesterol en cerebro disminuyeron de manera significativa en el

grupo omega-3 con respecto al grupo control, mientras que en plasma

únicamente las hembras transgénicas alimentadas con omega-3 experimentaron

este descenso. Teniendo en cuenta la mayor susceptibilidad de las hembras a

padecer la EA, y aunque la relación entre colesterol y esta patología permanece

aún por elucidar, estos resultados podrían considerarse muy positivos para la

aplicación de los AGPIs omega-3 en este modelo animal, puesto que no

solamente mejora la composición lipídica a nivel cerebral y plasmático, sino que

reduce la concentración de colesterol en ambos tejidos, y con ello la posibilidad

de favorecer la formación de depósitos A con la consecuente acumulación de

placas. Igualmente queda demostrada la capacidad de los omega-3 de la dieta

para cruzar la BHE.

En cuanto al análisis de los niveles de A -40 en cerebro, no se obtuvieron

diferencias relevantes entre ambos grupos alimentados con cada una de las

dietas. Las causas pueden ser varias: en primer lugar hay que tener en cuenta la

muerte prematura de los animales en torno a los 4 meses de edad, por causas

desconocidas y ajenas al estudio. Tratándose de un modelo que comienza a

desarrollar la patología de la EA alrededor de los 5 a 6 meses de edad, es muy

posible que las mejoras observadas a nivel plasmático y cerebral en cuanto a

niveles de colesterol y composición de ácidos grasos hubieran inducido una

reducción en los niveles cerebrales de A -40. Aunque podríamos alegar otra

causa: si en tan sólo 4 meses de edad se obtuvieron beneficios en el metabolismo

graso, los AGPIs omega-3 podrían ser efectivos únicamente en este sentido y

quizás no ser suficientes por sí solos para ejercer una mejora en el desarrollo de

la patología, planteándonos la búsqueda de otro compuesto con posibilidades

antioxidantes además de hipocolesterolemiantes que evitase una posible

peroxidación lipídica y que fuera un buen neuroprotector. Igualmente, nos

planteamos estudiar con mayor profundidad la relación entre los niveles de

Capítulo V. Discusión 259

colesterol y la EA en vista de que en este modelo no conseguimos establecer una

relación entre ambos parámetros. Si los cambios en la concentración de

colesterol en plasma altera el metabolismo de los esteroles en el SNC o si esos

cambios afectan la función cognitiva del cerebro o la incidencia de demencia, es

algo que permanece aún por esclarecer (Dietschy and Turley, 2001).

V.1.2. Estudios en ratones mutantes KOZACK-

colesterol 16.

Se llevaron a cabo estudios en un modelo mutante de la EA, que es un híbrido de

dos razas con niveles séricos de colesterol muy diferentes, C57 y C3H, que

posteriormente fue cruzado con el modelo transgénico simple PPA de la EA. Se

obtuvo una tendencia en los animales Kozack-Col16 –PPA a reducir los niveles

de colesterol en suero en comparación con los niveles observados en los

mutantes no transgénicos. Se observaron diferencias entre ambos géneros en la

acumulación de depósitos de amiloide, a nivel de los cortes

inmunohistoquímicos y en Nu-PAGE-Western blot frente a PPA y A , que

evidenciaron la mayor expresión de la patología en el grupo de las hembras

frente al grupo de los machos, confirmada por los valores obtenidos en la prueba

de ELISA para A (40 y 42). Aunque las diferencias en los niveles de colesterol

sérico entre los géneros no alcanzó significación estadística, quizás por el

reducido número de animales incluidos en el estudio, podemos hablar de una

tendencia en las hembras a presentar menores niveles de colesterol en suero que

los animales macho.

En definitiva, estos resultados nos hicieron continuar interesados en conocer la

relación entre colesterol y la EA, así como la influencia del género en el

desarrollo de la patología.

Capítulo V. Discusión 260

V.1.3. Estudios en modelo de ratón transgénico doble

PPA/PS1 de la EA.

Existen evidencias epidemiológicas, bioquímicas y genéticas que relacionan al

colesterol con la EA. Se ha demostrado que el colesterol modula el procesado de

PPA (Bodovitz and Klein, 1996) y que su contenido puede afectar a la actividad

de las secretasas (Wahrle et al., 2002). El colesterol es el esteroide más

prevalente en humanos y es producido en una multi-cascada, que comienza con

la acción de la -hidroxi- -metilglutaril CoA (HMG-CoA) sintasa y la HMG-CoA

reductasa. Èsta última es una de las dianas de las estatinas, un tipo de drogas

para reducir el colesterol y cuyo efecto benificioso en la EA continúa siendo hoy

día tema de controversia. En relación con estos resultados, hay numerosos

estudios que sugieren que el contenido en colesterol afecta al procesamiento de

PPA y a la generación de A , sin embargo la correlación aún no está bien

definida. Hay un par de estudios sobre la modulación de los niveles de colesterol

y la EA, en los que utilizaron dietas enriquecidas en colesterol o drogas

reductoras de colesterol (Sparks, 1997; Refolo et al., 2001). En el presente

estudio tratamos de elucidar la relación existente entre los niveles plasmáticos

de colesterol y los niveles cerebrales de A durante el envejecimiento normal,

mediante la medida de estos parámetros en ratones dobles transgénicos

PPA/PS1 (Blanchard et al., 2003; Schmitz et al., 2004) y ratones control no

transgénicos, todos ellos sin tratamiento y emparejados por género y edad.

Todos los animales PPA/PS1 mostraban abundantes depósitos de A en el

neuropilo del hipocampo, al igual que en regiones corticales. Los análisis de

varianza sobre los niveles de colesterol plasmático en los grupos de ratones

transgénicos (3, 8 y 13 meses de edad) revelaron una marcada reducción

conforme incrementaba la edad (P<0,005), aunque en el caso de los animales

no transgénicos no se observó ninguna diferencia en los niveles de colesterol

entre los 3 y los 13 meses de edad. Aunque los niveles cerebrales de esteroles,

incluyendo colesterol y sus precursores, no sufren modificaciones entre ratones

transgénicos PPA y no transgénicos durante el envejecimiento (Lutjohann et al.,

2002) se conoce muy poco sobre los niveles plasmáticos de colesterol. Sin

Capítulo V. Discusión 261

embargo, encontramos una diferencia significativa entre los PPA/PS1 de 13

meses y los no transgénicos de la misma edad lo que nos llevó a argumentar la

influencia del genotipo más que de la edad sobre los niveles de colesterol.

El análisis por ANOVA de los niveles de A 42 en la fracción extraída con ácido

fórmico reveló un incremento dramático en los transgénicos de 8 y 13 meses, en

comparación con el grupo de jóvenes transgénicos de 3 meses (P<0,0001).

Encontramos una correlación negativa y significativa (P<0,05) entre A 42 en

cerebro y colesterol en plasma en nuestro modelo, aunque el mecanismo por el

que el colesterol plasmático afecta a los niveles cerebrales de A 42 o viceversa,

actualmente permanece por determinar.

Mientras que la mayoría de los estudios utilizan ciertos protocolos para

influenciar el contenido en colesterol, mediante el uso de estatinas o mediante la

manipulación a través de la dieta, en nuestro estudio no se realizó ninguna

modificación con ese fin. Actualmente siguen existiendo algunas incógnitas en

torno a la relación existente entre los niveles plasmáticos de colesterol durante

el envejecimiento en pacientes de EA o en modelos animales de la enfermedad.

Un estudio clínico en pacientes de la EA y en sujetos controles no dementes,

concluyó que los niveles séricos de colesterol total y de LBD-colesterol estaban

asociados con una mayor deposición de A 42 en individuos con EA

neuropatológicamente confirmada (Kuo et al., 1998). Además observaron un

descenso significativo de los niveles de LAD-colesterol en el suero de pacientes

de la EA, mientras que Launer y colaboradores encontraron una correlación

positiva entre los niveles de LAD-colesterol en la tercera edad y el número de

placas neuríticas en el neocortex (Launer et al., 2001).

Entre los estudios realizados en animales, se han descrito resultados similares a

los nuestros realizados en ratones alimentados con dietas enriquecidas en

colesterol, que experimentaron un incremento significativo de los niveles

plasmáticos de colesterol y una reducción de los niveles cerebrales de A

cerebral (Howland et al., 1998) o de los niveles de A soluble del dominio

intracelular de PPA (George et al., 2004) mientras que en otro estudio

emplearon una dieta para inducir hipercolesterolemia y observaron un

incremento significativo de los niveles de A total (Refolo et al., 2000). Se han

Capítulo V. Discusión 262

realizado experimentos similares en conejos alimentados con ese tipo de dietas,

en los que la hipercolesterolemia incrementada la inmunorreactividad de A en

cerebro (Sparks et al., 1994) lo que genera la duda sobre si los diferentes

modelos animales son comparables. La reducción de colesterol mediante la

administración de un inhibidor de la síntesis de colesterol, se acompañó de la

reducción del procesamiento de PPA y como consecuencia de los niveles de A

en los ratones sometidos al tratamiento (Refolo et al., 2001). El tratamiento de

conejillos de indias con altas dosis de simvastatina resultó en reducidos niveles

de A en LCR (Fassbender et al., 2001). El tratamiento de ratones transgénicos

PPA con lovastatina, sin embargo, resultó en la reducción de los niveles

plasmáticos de colesterol pero incrementaba significativamente los niveles de

A 40 y A 42 en cerebro, al menos en ratones hembra (Park et al., 2003). Una

de las principales diferencias entre todos estos estudios en ratones transgénicos

PPA es la edad de los animales analizados. Se han empleado ratones muy

jóvenes (Refolo et al., 2001; Refolo et al., 2000) y animales de hasta 12 meses de

edad (George et al., 2004; Park et al., 2003) cuestionando la validez de la

comparación debido a las diferencias en los niveles hormonales. Los estudios

con ratones envejecidos encontraron una correlación significativamente

negativa entre los niveles de colesterol en suero (Park et al., 2003) o LAD-

plasmático (Shie et al., 2002) y A en cerebro. Todos los resultados asumen una

correlación negativa entre colesterol en suero/plasma y A en cerebro en las

hembras de ratón transgénico, lo que da una idea de la posible influencia del

género. Nuestros resultados coinciden con los estudios que han analizado

ratones PPA transgénicos envejecidos, ya que nosotros también hemos

encontrado esa correlación negativa, con una importante diferencia como es la

ausencia de tratamiento o de una dieta hipercolesterolémica. Se incluyeron

ratones no transgénicos en el presente estudio, para excluir la posibilidad de que

los efectos se debieran al simple envejecimiento, mientras que la mayoría de

estudios analizados únicamente comparan ratones tratados con no tratados.

Otro problema al intentar comparar los resultados de los estudios mencionados,

es la diversidad de los modelos de transgénicos empleados, desde transgénicos

simples PPA hasta transgénicos dobles PPA/PS1, que están basados en

Capítulo V. Discusión 263

diferentes composiciones genéticas. Nuestro modelo transgénico doble PPA/PS1

presentó una pérdida neuronal significativa cuando envejecieron (Schmitz et al.,

2004), que es una de las características que mejor refleja la patología de la EA

en relación con otros modelos transgénicos PPA, donde la pérdida neuronal no

ha sido confirmada. También utilizamos diferentes tiempos para analizar los

niveles de colesterol en plasma y los de A , mientras que la mayoría de los

estudios únicamente comparan ratones tratados y no tratados a un solo tiempo.

Esto no excluiría que haya cambios en el colesterol plasmático de otros ratones

PPA transgénicos a diferentes tiempos. Como ha sido descrito previamente, los

niveles de PPA completa, así como de C99, no se ven modificados durante el

envejecimiento en nuestro modelo, sin embargo, hay un fuerte incremento en la

deposición de A en los animales envejecidos (Blanchard et al., 2003). Se sabe

que A 40 oligomérico afecta al metabolismo del colesterol, provocando una

inhibición de la síntesis de colesterol y una reducción de sus niveles celulares de

una manera dosis y tiempo dependiente (Gong et al., 2002). La pregunta por

resolver es si los niveles circulantes de colesterol son capaces de regular los

niveles de A en cerebro. El hecho de encontrar una correlación negativa entre

ambos parámetros, y de carecer de los valores de colesterol en cerebro y de A

en plasma, deja la incógnita abierta mientras la compleja interacción entre A

cerebral y colesterol en plasma no esté plenamente establecida.

Capítulo V. Discusión 264

V.2. Estudios con DOPET

Tras los estudios realizados con AGPIs omega-3 en los que no conseguimos

observar un efecto neuroprotector aunque sí sobre el perfil lipídico, nos

planteamos la búsqueda de un compuesto natural que fuera capaz de cruzar la

barrera hematoencefálica y que presentara capacidad antioxidante, con objeto

de analizar su potencial neuroprotector y en un futuro poder trabajar con AGPIs

omega-3 y este compuesto antioxidante de manera conjunta.

Se realizó un screening entre numerosos extractos naturales y compuestos

polifenólicos, y finalmente se escogió un polifenol incluido en el aceite de oliva,

dadas las propiedades organolépticas y la potente capacidad antioxidante que

los polifenoles le confieren a esta grasa. El polifenol elegido fue el 2-(3,4-

dihidroxifenil)-etanol (DOPET), un o-difenol con declarado poder antioxidante

(Visioli, 2001b, de la Puerta et al., 2001), que nos pareció interesante estudiar

en mayor detalle por los beneficios descritos en la bibliografía, la importancia

del aceite de oliva en la sociedad actual, y el hecho de haber demostrado que

pasaba al cerebro nos abría la posibilidad de analizarlo como neuroprotector.

Por tanto, se plantearon una serie de estudios en relación a su capacidad

antioxidante, neuroprotectora e hipocolesterolemiante aplicándolo en sistemas

in vitro e in vivo.

Capítulo V. Discusión 265

V.2.1. Estudios de antioxidación.

Los radicales libres son mediadores del daño oxidativo en enfermedades

neurodegenerativas y uno de los marcadores de dicho daño es el MDA. El que

este tipo de marcadores contengan algún valor diagnóstico, es algo que debe

considerarse conforme progresa la enfermedad. Existe cierta evidencia sobre la

vinculación entre el incremento de los niveles periféricos de MDA y patologías

tipo EA y EP (Polidori et al., 2004).

La medición de los niveles de MDA es simple y económica, por lo que su

incorporación en los ensayos clínicos supondría una poderosa herramienta de

diagnóstico (Dib et al., 2002).

En un primer estudio in vitro se determinó la capacidad de DOPET para reducir

la producción de SRATs, marcador de lipoperoxidación. Los ensayos realizados

en presencia de DOPET revelaron la efectividad antioxidante del compuesto

frente al daño oxidativo provocado a las membranas cerebrales de rata.

A continuación se realizó un estudio en ratones alimentados con dietas

enriquecidas con colesterol y suplementadas con DOPET disuelto en el agua de

bebida, para determinar el efecto protector del compuesto sobre la peroxidación

lipídica provocada. Los grupos que recibieron DOPET mostraron una protección

significativa en los niveles plasmáticos de MDA, determinados mediante HPLC-

FLD.

En definitiva, estos resultados confirman la capacidad antioxidante del

compuesto tanto in vitro como in vivo, protegiendo a las membranas de un

daño oxidativo como la peroxidación lipídica.

Tras los estudios anteriores, se decidió analizar una de las actividades

enzimáticas que forma parte de las defensas antioxidantes naturales por la

eliminación del peróxido de hidrógeno formado en los tejidos, la catalasa. Se

utilizó el modelo de conejo creado para estudiar el efecto de DOPET sobre el

metabolismo del colesterol en esta Memoria, basado en la inducción de

aterogenia a través de la dieta para evaluar el beneficio de DOPET a 1 y 2 meses

de tratamiento. El hecho de ser un modelo sometido a un elevado estrés

Capítulo V. Discusión 266

oxidativo, nos pareció ideal para determinar la capacidad antioxidante del

compuesto sobre las membranas cerebrales, favoreciendo la actividad catalasa.

Sin embargo no se obtuvo ninguna diferencia significativa en los análisis de la

cinética de la enzima, quizás por el reducido período de tiempo del estudio, o

bien por la falta de eficacia del compuesto en este modelo a pesar de haber

demostrado su eficacia antioxidante en otros modelos animales como la rata y el

ratón.

V.2.2. Estudios de neuroprotección.

Basándonos en la capacidad antioxidante descrita para DOPET (Visioli, 2001b),

los resultados obtenidos para MDA y su capacidad para cruzar la BHE,

decidimos ampliar el conocimiento de las propiedades de este compuesto

mediante la determinación de su capacidad neuroprotectora en una serie de

ensayos in vitro utilizando diferentes concentraciones de DOPET frente a

diversos agentes oxidantes.

Se confirmó la efectividad del compuesto en concentraciones inferiores a 100

µM, favoreciendo la viabilidad celular. Sin embargo por encima de 100 µM el

preparado inducía muerte celular. Por tanto, se atribuyó capacidad

neuroprotectora al compuesto, dentro de las concentraciones permitidas.

La muerte celular puede tener lugar mediante procesos necróticos o apoptóticos.

Recientemente, se ha propuesto que han de ser otros mecanismos de muerte

celular diferentes a la clásica apoptosis los implicados en la progresión de las

enfermedades crónicas como la EA y la EP. La cascada intracelular que lleva a la

muerte neuronal en este tipo de patologías permanece aún por elucidar

(Jellinger and Stadelmann, 2001). Se ha descrito que DOPET puede inducir

apoptosis mediante el incremento de la fosforilación de Bcl-2 (proto-oncogén

humano localizado en el cromosoma 18) (Della Ragione et al., 2002).

Para verificar que la neurotoxicidad inducida por DOPET a concentraciones

superiores a 100 µM se debía a procesos apoptóticos, se llevó a cabo el ensayo

COMET, basado en la irradiación de un cultivo celular con UV-C, generadora del

daño en el material genético responsable de mutaciones y muerte por apoptosis.

Capítulo V. Discusión 267

Se estudió la capacidad de DOPET (100 µM), para modificar el tamaño de la

cola de ADN generada en las células irradiadas.

Se confirmó que la concentración empleada de DOPET generaba muerte por

apoptosis.

V.2.2.1. Modelo de excitotoxicidad con ácido kaínico: laberinto

acuático de Morris.

Uno de los rasgos más característicos y devastadores de la EA es la afectación

de la memoria, asociada fundamentalmente a la región cerebral denominada

hipocampo (Buckner, 2004). El laberinto acuático de Morris (LAM) es una

técnica muy efectiva para la evaluación del proceso conocido como

“empeoramiento de la memoria”, consistente en una prueba realizada en una

piscina dividida en 4 cuadrantes para evaluar la capacidad de aprendizaje y

memorización de los animales sobre la localización de una plataforma

sumergida en el agua, que les permite liberarse del estrés que el agua supone

para un roedor.

Se han descrito diferencias significativas entre las numerosas razas de ratón

que se utilizan normalmente para evaluar el neuro-comportamiento, ya que la

composición genética de cada especie conlleva una serie de rasgos propios

(Francis, 1995). La exposición prenatal a metilmercurio perturba a los ratones

Balb/c de manera distinta a la raza C57Bl/6J, alterando la actividad espontánea

de aquéllos y prolongando la latencia en la ejecución del LAM en éstos,

demostrando en definitiva las diferencias entre ambas razas (Kim et al., 2000a;

Wehner, 1988).

Ante la mayor sensibilidad de la raza Balb/c frente a pruebas como el LAM, se

decidió utilizar esta raza con la intención de comprobar si en un sistema tan

vulnerable DOPET era efectivo, para lo que se puso a punto un protocolo de

afectación hipocampal mediante la inyección intraperitoneal de Ácido kaínico

(AK), que es una neurotoxina que daña la memoria (Ben-Ari, 1985). Esto nos

permitió crear un modelo animal sobre el que determinar si DOPET era capaz

Capítulo V. Discusión 268

de prevenir de la pérdida de memoria y /o de mejorar el daño provocado por

AK.

Los datos recogidos en esta Memoria demuestran que el modelo funcionó, en

cuanto a que observamos un déficit de memoria en los animales que recibieron

AK, y que los animales sondados con DOPET ejecutaron el LAM correctamente

y de igual manera que los controles. Se obtuvo una diferencia significativa entre

los animales sometidos únicamente a AK y los que además de la toxina

recibieron la protección previa de DOPET, ya que estos últimoms mejoraron su

memoria y por tanto la ejecución de la prueba, lo que demostraba la efectividad

del compuesto en este modelo y en la neuroprotección frente al daño causado

con AK.

V.2.3. Microarrays en cerebro de ratones sondados con DOPET

Se ha descrito la capacidad de los compuestos fenólicos de la dieta para prevenir

de respuestas celulares vitales como la apoptosis y la diferenciación por

activación de una cascada de eventos moleculares. Existe un interés creciente

sobre la mejora de la eficacia de estos compuestos antioxidantes sobre dianas

terapéuticas (Narayanan et al., 2002).

Se decidió realizar un estudio genómico sobre la influencia de dos

concentraciones diferentes de DOPET en dos tejidos de ratón tan importantes

como cerebro e hígado. Para ello, se realizó un sondaje diario (n=15, 14 días)

para determinar el efecto de 1 mg y 10 mg del compuesto sobre la expresión

génica en esos tejidos.

Tras analizar todos los resultados obtenidos (ver tablas IV.10-12 en el capítulo

IV de esta Memoria), que demostraron que las dosis de DOPET utilizadas no

resultaron tóxicas, tanto por el mantenimiento de los pesos de los animales

como por la falta de influencia sobre genes implicados en procesos tóxicos, se

seleccionó la información relevante para la continuidad de esta Memoria,

resaltando la influencia de DOPET sobre la expresión de la Esterol-C5-

desaturasa (reprimido) y la del gen de la Mielina (sobreexpresado), ambos en

hígado.

Capítulo V. Discusión 269

V.2.4. Efecto de DOPET en un modelo animal de

Esclerosis Múltiple (EM).

La EM es una enfermedad desmielinizante crónica del SNC y es la mayor causa

de disfunción neurológica traumática en los adultos jóvenes. Las lesiones se

caracterizan por infiltraciones de linfocitos y macrófagos fundamentalmente,

así como por varios grados de pérdida axonal y desmielinización (Espejo et al.,

2001).

Tras haber obtenido mediante microarrays un efecto de DOPET sobre el gen de

la Mielina, que resultaba sobreexpresado en hígado por una dosis de 10 mg del

compuesto, y tras haber demostrado la capacidad antioxidante de DOPET en

varios sistemas, nos planteamos aplicarlo a un modelo de una enfermedad tan

compleja como la EM, en la que confluyen procesos de oxidación, inflamación y

neurodegeneración y donde la pérdida de la capa de mielina axónica es una de

las principales características de la patología.

Se eligió un modelo de EAE (Encefalitis Autoinmune Experimental), por tratarse

de un reconocido modelo animal con signos clínicos y lesiones que asemejan los

observados en la EM (Martin et al., 1992) para estudiar el efecto de DOPET sobre

los brotes de la enfermedad. Comenzamos analizando el efecto sobre el

neurocomportamiento y la progresión de la enfermedad de los animales. Los

resultados se basaron en la medición diaria de los scores de cada animal en cada

uno de los grupos (control y DOPET). Los datos recogidos mostraron una mejora

con tendencia a ser significativa en el grupo que recibió agua con DOPET frente

al grupo control, lo que sugiere el potencial de DOPET para disminuir la

incidencia de esta enfermedad en este modelo animal, aunque aquéllos animales

que enfermaron lo hicieron con la misma intensidad que los controles.

Capítulo V. Discusión 270

Los fármacos que se utilizan en la actualidad frente a la EM son

inmunosupresores, inmunomoduladores y antiinflamatorios, pero ninguno

de los tratamientos actuales contra la enfermedad utiliza antioxidantes como

DOPET, a pesar de existir numerosa bibliografía en la que DOPET aparece

únicamente como reactivo para la síntesis de compuestos aplicados a esta

patología pero no como componente único de un tratamiento. Nuestros

resultados confirman los argumentos que se propusieron hace un par de años

por Aruoma y colaboradores (Aruoma, 2003) sobre el potencial de sustancias

alimentarias como DOPET para combatir el estrés oxidativo en

enfermedades como la EM. Por tanto, con los resultados obtenidos nos

planteamos estudios futuros en este modelo animal, para analizar en mayor

detalle algunos de los parámetros bioquímicos marcadores de la patología,

que nos confirmaran la validez de DOPET como un potencial compuesto

terapéutico en la EM.

Capítulo V. Discusión 271

V.2.5. Estudios del metabolismo del colesterol.

El colesterol no esterificado es un componente estructural esencial de la

membrana plasmática de cada célula. Durante la evolución, esta membrana

pasó a ejercer un papel tremendamente especializado en el SNC como

componente principal de la arquitectura de la mielina compacta. Como

consecuencia, el SNC en los humanos contiene unos 23 mg colesterol /g de

tejido a pesar de suponer el 2,1% del peso corporal. En todos los animales, la

mayoría del proceso de crecimiento y diferenciación del SNC tiene lugar

durante los primeros años de vida, y el colesterol es necesario para ello,

proveniente de manera casi exclusiva de la síntesis de novo.

Se ha sugerido la relación directa entre los niveles plasmáticos de colesterol y la

incidencia de demencia, incluyendo la EA (Sparks et al., 1994; Evans et al.,

2000; Kivipelto et al., 2001). El tratamiento con agentes farmacéuticos que

reducen la concentración del colesterol plasmático parece asociarse con una

menor incidencia de tales demencias (Jick et al., 2000; Wolozin et al., 2000).

Sin embargo hay que enfatizar que la mayoría de estas asociaciones no han sido

verificadas en los estudios epidemiológicos más recientes y rigurosos. Por tanto,

de confirmarse la relación entre ambos parámetros, las lipoproteínas

transportadoras de colesterol (LAD y LBD) contribuirían de manera muy

destacada en los pools de colesterol de cerebro y médula espinal, afectando

directa o indirectamente al procesado de proteínas como la PPA o los receptores

de neurotransmisores (Howland et al., 1998).

Entre los objetivos de esta Memoria se encontraba el estudio de las

propiedades de DOPET como hipocolesterolemiante, tras los resultados

obtenidos en los microarrays que desvelaban su capacidad para reprimir al gen

de la Esterol-C5 desaturasa en hígado, que es una de las enzimas implicadas en

la formación de colesterol. Aparte de nuestros resultados, algunas referencias

previas apoyan la capacidad del compuesto para inhibir la peroxidación

provocada por la oxidación de las LBD (Salami, 1995), por lo que nos

propusimos desarrollar una serie de ensayos in vitro e in vivo para determinar

su influencia en el metabolismo del colesterol.

Capítulo V. Discusión 272

V.2.5.1. Estudios sobre LC5D.

Los resultados obtenidos en el estudio con Microarrays realizados con el

compuesto, nos llevaron a estudiar la enzima Latosterol –C5 desaturasa, cuyo

gen fue reprimido en hígado por la dosis más elevada de DOPET (10 mg).

LC5D es una enzima implicada en el metabolismo del colesterol, mediando la

transformación de latosterol en 7-DHC, que posteriormente se convierte en

colesterol. Por tanto, la inhibición en ese punto del metabolismo podría resultar

de interés para evitar un incremento en los niveles de colesterol.

Se determinó la IC50 de DOPET para la LC5D para conocer la potencia de la

inhibición ejercida, y se obtuvo un valor igual a 187 µM, lo que indica que

DOPET es capaz de inhibir la enzima, pero que es necesaria una cantidad

relativamente elevada del compuesto para lograrlo. Estos datos concuerdan con

los resultados obtenidos en el análisis de la influencia sobre la expresión génica,

en los que la dosis más alta (10 mg) era la más efectiva en la inhibición de este

gen.

Para concluir el estudio bioquímico de esta enzima, se determinó su Km

mediante la realización de una curva patrón y mediciones de la concentración

del producto de reacción (7-DHC) mediante HPLC frente a diferentes

concentraciones de sustrato (latosterol). Se obtuvo un valor de Km igual a 157,3

µM.

Capítulo V. Discusión 273

V.2.5.2. Efecto de diferentes dietas en el metabolismo del

colesterol de conejos.

A continuación se llevaron a cabo una serie de experimentos en conejos,

alimentados a dos tiempos (30 y 60 días) con dieta control y/o aterogénica, para

evaluar el efecto de DOPET sobre una serie de parámetros bioquímicos

relacionados con el metabolismo del colesterol (colesterol total, LAD y

triglicéridos en plasma y colesterol y latosterol en cerebro). De todos los

modelos animales, se escogió el conejo por la rapidez y facilidad con que

desarrollan un perfil aterogénico mediante la alimentación (Moghadasian,

2002). Los resultados obtenidos en plasma demostraron la eficacia del

tratamiento con DOPET durante 60 días respecto al resto de grupos controles y

aterogénicos, ya que se obtuvo un descenso significativo en los niveles de

colesterol total, LAD-colesterol y triglicéridos. En cuanto a los niveles de

colesterol en cerebro no se observaron diferencias significativas en ningún

grupo, lo que atribuimos a la reducida duración del estudio (2 meses) en

comparación con la vida media del colesterol en cerebro (6 meses). Este motivo

pudo ser suficiente para no permitirnos observar ningún efecto, ya que los

análisis de los niveles de latosterol, precursor de colesterol y de vida media más

reducida que éste, fueron muy diferentes, ya que se obtuvo una reducción

significativa en los niveles de latosterol para los animales suplementados con

DOPET (30 y 60 días), lo que indicaba la efectividad del compuesto para

modificar el perfil lipídico en plasma y en cerebro de animales sometidos a un

estrés oxidativo provocado por la dieta.

Capítulo V. Discusión 274

V.2.6. Efecto de DOPET sobre la captación de dopamina y

norepinefrina in vitro.

En base a la similitud molecular de DOPET (2, 3-4 dihidroxifeniletanol;

C8O3H10) y la molécula de Dopamina (DA; C8H11NO2), se pensó que DOPET podría

estar implicado en el metabolismo de la DA, participando en reacciones

catabólicas de eliminación de la DA catalizadas por la enzima MAO, y/o en

procesos de reconocimiento por parte de los transportadores de monoaminas

(transportador de DA y transportador de Norepinefrina). El hecho de obtener

un efecto de este compuesto sobre las posibles vías de retirada de DA, podría ser

de utilidad terapéutica en patologías como la EP, donde la inhibición de la

actividad Monoamino Oxidasa (MAO) o la potenciación de la captación de DA

por parte de sus receptores suponen dos puntos clave en la búsqueda de terapias

para la enfermedad.

El presente estudio se realizó en colaboración con la Dra. S. Hilfiker

(Universidad de Manchester, Inglaterra). Se diseñó para probar los efectos de

DOPET en la captación y liberación de dopamina (DA) desde las células PC12.

Este sistema celular es un modelo catecolaminérgico muy útil, que contiene

todas las proteínas relevantes para el transporte y metabolismo de DA y NE, y es

un excelente modelo para elucidar los efectos de compuestos noveles sobre la

captación, secreción y degradación de monaminas.

Los resultados obtenidos en los ensayos realizados demuestran que DOPET es

un compuesto potente incrementado las cantidades tanto de DA como de NE

intracelulares. Los principales puntos que evidencian el papel de DOPET en la

regulación del TNE, transportador de membrana plasmática antidepresivo y

cocaína-sensible Na+/Cl-Norepinefrina dependiente, fueron:

a) Al añadir DOPET a las células tras la carga con DA o NE radiomarcadas, el

compuesto resultaba inefectivo.

b) El principal transportador expresado en la superficie de las células PC12 no

diferenciadas es TDA. Tras la diferenciación con el factor de crecimiento

nervioso, tanto TNE como TDA mostraron un incremento en su localización en

el interior de las neuritas (Kadota et al., 1996; Kippenberger et al., 1999), con el

Capítulo V. Discusión 275

concomitante aumento en el consumo de radio-marcaje, sugiriendo un aumento

en el número de transportadores localizados en la membrana plasmática. Los

efectos de DOPET sobre la cantidad captada de DA-radiomarcada siempre

fueron menos pronunciados que aquéllos observados con NE-radiomarcada. Se

ha descrito que mientras que TDA solamente media la captación de DA, TNE

transporta DA y NE (Moron et al., 2002). Por tanto, los efectos de DOPET sobre

el consumo de DA podrían estar mediados por un efecto del compuesto sobre

TNE, que también transporta DA.

c) No se obtuvieron efectos de DOPET sobre la captación de serotonina.

d) Algunos inhibidores de MAO no tuvieron ningún efecto sobre la captación de

catecolaminas radiomarcadas, lo que reveló el incremento en DA marcada

dentro de las células no se debía a la inhibición de MAO. La MAO-A asociada a

las células PC12 ha demostrado ser sensible a clorgilina (IC50 1) (Youdim et al.,

1986; Tatton et al., 1994) y completamente inhibida a 15 µM. Aunque es un

hecho bien establecido que los inhibidores de MAO-A y MAO-B ejercen efectos

neuroprotectores en neuronas y células PC12 (Youdim et al., 2001; Boland et al.,

2002), estos efectos únicamente se observaban bajo prolongadas incubaciones y

de manera no tan acusada como los efectos de DOPET. Por tanto, si DOPET era

capaz de permitir la captación de DA en presencia de inhibidores específicos de

MAO, indicaba que el compuesto debía favorecer la actividad de los

transportadores.

Sin embargo hay otras dianas posibles, como la Catecol-O-metiltransferasa

(COMT), por dos razones: En primer lugar, la actividad COMT en células PC12

es muy elevada. Aunque las catecolaminas sean secuestradas muy rápidamente

desde el citosol al interior de las vesículas localizadas en las terminales

nerviosas, las catecolaminas radiomarcadas que permanecen en el citosol

pueden ser metabolizadas por COMT para formar un producto lipofílico capaz

de cruzar la membrana plasmática y abandonar las células por difusión.

En segundo lugar, la COMT de las PC12 puede ser inhibida por 1 mM de

tropolona (Tuler et al., 1989). Al aplicar tropolona durante 1 h, incrementa en

un 30% los niveles intracelulares de DA y NE radiomarcadas en células crecidas

en un medio completo.

Capítulo V. Discusión 276

La inhibición de COMT puede aumentar significativamente la acumulación

intracelular de los sustratos de la enzima (DA y NE pero no serotonina)

(Eshleman et al., 1997), pero hay que reseñar que estos estudios se han

realizado en líneas celulares con actividad COMT endógena y que expresan los

transportadores aminos por recombinación. Es probable que en otro tipo de

células como las PC12, el secuestro de catecolaminas en vesículas pudiera, al

menos en parte, prevenir semejante incremento.

En resumen, los resultados de este estudio indican que DOPET podría actuar

modulando el TNE, que es uno de los lugares de acción de un rango de drogas

con potencial terapéutico. Bajo condiciones patológicas, los cambios en la

función de TNE podrían actuar en la progresión de enfermedades como el fallo

cardiaco, asociado con la reducción en la función y densidad de TNE. Una

intervención dirigida a la mejora de TNE en esta patología cursaría con efectos

beneficiosos. Finalmente, el esquema del modo de actuación propuesto para

DOPET en este estudio se muestra en la figura E.1.

Capítulo V. Discusión 277

Figura E.1.: Mecanismo de acción propuesto para DOPET en células PC12.

El posible mecanismo de acción de DOPET consistiría en la activación del

transportador TNE que introduciría NE y DA en la célula, facilitando así la

incorporación de éstos en vesículas. No se ha demostrado que esta acción pudiera ser

llevada a cabo a través de la activación de TDA. Por otra parte, DOPET inhibiría la

actividad MAO, responsable de la degradación de DA. DBH= Dopamina-beta-

hidroxilasa

Existe un elevado volumen de estudios focalizados en la búsqueda de

inhibidores de la actividad Monoamino oxidasa, y algunos de ellos demuestran

la efectividad de algunos compuestos (fenólicos y alcaloides) en la inhibición de

MAO (Kong et al., 2004). Sin embargo, hasta la fecha no se ha analizado la

capacidad de un compuesto como DOPET, relacionado estructuralmente con la

Dopamina y sus metabolitos, para inhibir a la MAO.

Tras los resultados anteriores, se realizaron una serie de ensayos in vitro con

mayores concentraciones de DOPET, para determinar la concentración capaz de

NE + DA DA Extacelular

TNE TDA

Intracelular

+

DOPET NE + DA

+

DOPET

vesículas

?

DOPET

MAODOPAL

APOPTOSIS

DOPET

DA HVACOMT

NE

-

DBHNE DA

Capítulo V. Discusión 278

inhibir el 50% de actividad enzimática MAO-B (IC50), aislada en mitocondrias

de cerebro de rata. En base a la hipótesis propuesta como mecanismo de acción

(Figura E.1), en la que DOPET podría actuar facilitando la internalización de DA

y evitando la degradación de la misma mediante la acción de la MAO, y en base

a los estudios que avalan la efectividad de algunos compuestos fenólicos como

inhibidores de MAO, analizar la capacidad de DOPET como inhibidor de la

MAO-B.

Todos los ensayos se realizaron por triplicado y con un amplio rango de

concentraciones de DOPET para determinar finalmente que se trata de un

compuesto con un elevado potencial inhibidor sobre la actividad MAO-B en

cerebro (IC50 = 16,3), lo que sugiere que el compuesto presenta un potencial

inhibidor sobre MAO suficiente para ser estudiado en mayor detalle en un

futuro.

VI. CONCLUSIONES

Capítulo VI. Conclusiones 280

Tras la realización de esta Memoria, se establecieron las siguientes

conclusiones:

A. Para establecer la relación entre colesterol y la EA:

1) Una dieta dieta enriquecida con AGPIs omega-3 (Eicosapentaenoico y

Ácido Docosahexaenoico, EPA y ADH respectivamente) es capaz de mejorar

el perfil lipídico en un modelo de ratón transgénico simple PPA de la EA. Se

obtuvo una reducción en los niveles de colesterol plasmático y cerebral, que

reportaría los beneficios derivados de un bajo contenido de colesterol en las

membranas, como podría ser una menor producción de A a partir de PPA,

lo que favorecería el procesado normal de la proteína y con ello la

disminución del riesgo de desarrollar la patología. Así mismo, se observó una

sustitución de los ácidos grasos omega-6 por los omega-3 en las membranas

celulares plasmáticas y cerebrales, gracias a una disminución del contenido

en Ácido Araquidónico (AA, omega-6) y a un incremento en ADH y EPA

(omega-3). Pero no solamente se obtuvieron diferencias entre la dieta control

y la dieta enriquecida en omega-3, sino que se comprobaron tanto diferencias

de genotipo como de género. En relación al genotipo, los animales

transgénicos que recibieron dieta omega-3 mejoraron sus niveles de

colesterol y ADH en relación a los transgénicos con dieta control, lo que

indica una influencia de la sobreexpresión de PPA que en este caso los hizo

más susceptibles a los beneficios de la dieta enriquecida, lo que podría haber

supuesto una mejora en la deposición de amiloide si el estudio hubiera

podido llegar a término. En cuanto a la diferencia de géneros, destacable la

mejora observada en las hembras transgénicas om-3, que no solo mejoraron

su perfil lipídico respecto a los machos, sino que mostraron tendencia a

reducir los niveles de A -40. Todos estos datos refuerzan las ventajas de la

suplementación con una dieta omega-3 en un modelo animal de la EA, ya que

un incremento en la relación om-3:om-6 supone una mejora en funciones

cognitivas como el aprendizaje y la memoria [Hashimoto, 2002 #342] y el

hecho de encontrar un mayor beneficio en las hembras PPA, unida a la mayor

prevalencia de la EA en este género, reforzaría la suplementación de este tipo

de ácidos grasos en esta patología.

Capítulo VI. Conclusiones 281

2) Los estudios realizados en diferentes modelos transgénicos de la EA

(mutantes Kozack-colesterol16 y transgénicos dobles PPA/PS1) para analizar la

relación entre los niveles de colesterol en sangre y los de péptido A en cerebro,

ponen de manifiesto que el género femenino era el más proclive a la

manifestación de la patología. Así mismo, se obtuvo una correlación negativa

entre los parámetros estudiados: conforme progresaba la enfermedad,

incrementaban los depósitos de amiloide en cerebro (demostrado mediante

prueba ELISA y micro-secciones) y disminuían los niveles de colesterol en

sangre. Estos resultados son contrarios a los descritos en algunos estudios

[Refolo, 2001 #36][Simons, 1998 #32] [Sparks, 1994 #21] pero coinciden con los

observados por otros autores [Howland, 1998 #4] [George, 2004 #14] [Park,

2003 #5] lo que genera la duda sobre si los diferentes modelos animales son

comparables y la verdadera relación entre colesterol y nivel de amiloide. Hay que

tener en cuenta las diferencias entre todos estos estudios y con respecto al

nuestro, tanto en los tratamientos empleados como las edades de los animales, lo

que llevaría a la conclusión que realmente la relación entre colesterol, A y

parámetros como la edad y el género permanece aún por elucidar.

B. Efecto neuroprotector de DOPET en sistemas in vitro e in vivo.

3. Un compuesto natural presente en el aceite de oliva como el 2-(3,4-

dihidroxifenil)-etanol (DOPET) es capaz de atravesar la BHE en menos de 5

minutos y permanecer en el cerebro durante 1 h. Se ha puesto de manifiesto su

capacidad antioxidante mediante HPLC-ABTS y su potencial neuroprotector

hasta concentraciones de 100 µM en sistemas in vitro.

Se ha demostrado la capacidad antioxidante de DOPET, reduciendo el daño

oxidativo provocado por peroxidación lipídica mediante la disminución de los

niveles de MDA tanto in vitro como in vivo. Por tanto, se puede establecer que

el compuesto tiene propiedades neuroprotectoras debidas en gran medida a su

capacidad antioxidante.

Capítulo VI. Conclusiones 282

4. Se ha conseguido demostrar un efecto neuroprotector de DOPET en un

modelo de excitotoxicidad provocado por la inyección de ácido kaínico (AK)

que fue capaz de alterar la memoria en ratones sometidos a la ejecución del

Laberinto acuático de Morris. Los animales pretratados con DOPET e

inyectados posteriormente con AK demostraron aprender la prueba al igual

que los controles. El interés de este estudio es doble, por el efecto

neuroprotector del compuesto sobre el hipocampo dañado con la

neurotoxina, y por tratarse de una raza de ratón descrita como muy sensible

al estrés causado por este tipo de pruebas, por lo que haber observado un

efecto a pesar de no ser la raza más recomendada para pruebas de memoria,

incrementa el valor de los resultados obtenidos.

En base a estudios sobre la influencia de DOPET en la expresión génica de

hígado y cerebro mediante microarrays, se observó que el compuesto era

capaz de inducir la sobreexpresión del gen de la Mielina, por lo que se analizó

el efecto de DOPET en un modelo animal de Encefalitis Autoinmune

Experimental, modelo animal de Esclerosis Múltiple crónica. Se demostró la

efectividad de DOPET para mejorar la incidencia y duración de los brotes de

la enfermedad.

Por tanto, ambos estudios in vivo reforzaron la capacidad neuroprotectora de

DOPET y su potencial para ser utilizado como complemento en terapias

frente a enfermedades como la EM.

5. Basándonos en la inhibición de DOPET sobre el gen de la Esterol-C5-

desaturasa, revelada por los microarrays en hígado, se llevaron a cabo

estudios en la enzima Latosterol-C5 desaturasa, responsable de la

transformación de latosterol en 7-DHC, precursor del colesterol,

confirmando la capacidad de DOPET para inhibir la enzima en los ensayos

realizados in vitro.

Capítulo VI. Conclusiones 283

Por tanto, se analizó la capacidad de DOPET para modificar el metabolismo del

colesterol en un modelo de aterogenia en conejos, alimentados con dietas

suplementadas con DOPET durante 30 y 60 días. Se obtuvo una mejora en el

perfil lipídico plasmático de los animales suplementados con DOPET durante 60

días, mediante la reducción de los niveles de colesterol total, LAD-colesterol y

triglicéridos. Aunque no se observó ninguna diferencia en el contenido de

colesterol cerebral en los diferentes grupos de conejos, el hecho de observar una

reducción en los niveles de latosterol en cerebro, precursor del colesterol de

menor vida media, parece demostrar que el compuesto era efectivo en la mejora

del metabolismo del colesterol en plasma y en cerebro.

6. En estudios realizados con DOPET y su efecto en el metabolismo de las

catecolaminas, por razones de similitud estructural-molecular con la Dopamina,

sugieren que DOPET podría modular al transportador de Norepinefrina (TNE)

más que al de Dopamina, lo que podría actuar en la progresión de enfermedades

como el fallo cardiaco, asociado con la reducción en la función y densidad de

TNE. Tras la ausencia de efecto sobre la Dopamina, se determinó la IC50 de

DOPET para la actividad MAO-B en cerebro e hígado, demostrando su potencial

inhibidor sobre esta enzima, responsable de la degradación de la Dopamina,

pieza clave en la Enfermedad de Parkinson.

VII. PROYECTOS DE FUTURO

Capítulo VII. Proyectos de futuro 285

La realización de esta Memoria ha dejado una serie de preguntas que no

pudieron ser abordadas por falta de tiempo en el período destinado para la

ejecución de la misma, 4 años. Por tanto, se han planteado a modo de planes

para el futuro.

1) Relación entre el colesterol y A en modelos animales de la

Enfermedad de Alzheimer (EA). Hasta la fecha se han realizado numerosos

estudios a este respecto, pero continúa existiendo cierta controversia al respecto.

Los estudios realizados en esta Memoria han demostrado que el incremento de

amiloide iba acompañado de un descenso en colesterol sanguíneo (estudios en

mutantes y ratones PPA/PS1) o bien el descenso de colesterol cerebral no

pareció modificar los niveles de amiloide (probablemente porque el modelo

utilizado, ratón con dieta omega-3, no pudo completar el desarrollo de la

enfermedad). Por tanto, la ejecución de los 3 estudios en modelos animales de la

EA, nos hizo plantearnos la necesidad de analizar un modelo de la EA sin

tratamientos o dietas que alterasen los niveles naturales de colesterol, evaluando

ambos géneros, a diferentes edades y con animales controles no transgénicos

para considerar la influencia del genotipo. Se analizaría colesterol y amiloide,

ambos parámetros a nivel sérico y cerebral, realizando mediciones del contenido

en 24-S-hidroxicolesterol cerebral y plasmático, por tratarse de la forma en que

el colesterol cerebral pasa a sangre, con objeto de establecer el intercambio entre

ambos tejidos y conocer cómo el desarrollo de la patología afecta al metabolismo

de colesterol en sangre y en cerebro y su correlación con los niveles de amiloide.

2) Efecto de una dieta suplementada con DOPET y AGPIs omega-3 a

un modelo animal de la EA. Estudiar el efecto conjunto de dietas

suplementadas con AGPIs omega-3 y DOPET disuelto en el agua de bebida, en

un modelo de ratón de la EA, nos permitiría unificar los beneficios sobre el

metabolismo del colesterol de ambos componentes y la capacidad antioxidante

de DOPET para analizar todos los parámetros relacionados con la patología

(micro-secciones teñidas frente PPA y A ; ELISA A y niveles séricos y

cerebrales de colesterol).

Capítulo VII. Proyectos de futuro 286

3) Suplementar con DOPET un modelo animal de Esclerosis

Múltiple (EM) para estudios bioquímicos. El estudio realizado en esta

Memoria demostró una mejora significativa en los brotes de los animales,

por lo que sería muy interesante disponer de este modelo, suplementado con

DOPET a diferentes tiempos, y analizar parámetros bioquímicos e

inmunohistoquímicos, realizando micro-secciones de cerebro y médula

espinal para determinar la inmunorreactividad a la óxido nítrico sintasa

inducible (ONSi). Se trata de una enzima que produce óxido nítrico, aparece

en células microgliales y macrófagos y se expresa en las placas,

contribuyendo a la patología de la enfermedad (Hill et al., 2004). Así mismo,

también podrían realizarse una tinción mediante TUNEL (para detectar la

fragmentación del ADN por apoptosis) y triple fluorescencia para marcar los

macrófagos y astrocitos reactivos.

4) Administrar DOPET y ácido kaínico a ratas para realizar el

laberinto acuático de Morris. Para confirmar la efectividad del

compuesto en uno de los animales considerados más inteligentes para la

ejecución de pruebas de memoria y neuro-comportamiento, se realizaría el

mismo protocolo de tratamientos con AK y DOPET, e incluso durante más

largo tiempo para comprobar si la mejora de la memoria se mantendría con

el paso de varias semanas entre una prueba y la siguiente.

5) DOPET y el metabolismo de las catecolaminas. Hasta la fecha no

se ha descrito la aplicación de un compuesto como DOPET en la patología de

la EP. Tan sólo hay un par de artículos en la bibliografía que asocian a

DOPAL (precursor de DOPET) con el incremento del estrés metabólico en

células PC12 (Burke et al., 2003; Lamensdorf, 2000a). La ausencia de

estudios, junto con nuestros resultados, nos llevaría a la utilización de un

modelo de la EP, ratones de la raza C57Bl6 inyectados con la neurotoxina

MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropirindina), para analizar el efecto de

la suplementación con DOPET, evaluando tanto los rasgos propios asociados

con la aplicación de la neurotoxina (rigidez, temblor de reposo) como

parámetros inmunohistoquímicos en micro-secciones de sustancia negra,

para evaluar la protección ejercida por DOPET en estos animales.

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