Universidade de So Paulo Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto

Rodrigo Alexandre Panepucci

DIFERENAS NA EXPRESSO GNICA DE CLULAS CD34+ DE MEDULA SSEA E DE SANGUE DE CORDO UMBILICAL

Ribeiro Preto 2006

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Rodrigo Alexandre Panepucci

DIFERENAS NA EXPRESSO GNICA DE CLULAS CD34+ DE MEDULA SSEA E DE SANGUE DE CORDO UMBILICAL

Tese apresentada Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto da

Universidade de So Paulo para obteno do Titulo de Doutor em Clnica Mdica

rea de Concentrao: Investigao Biomdica Orientador: Marco Antnio Zago Co-orientador: Wilson Arajo Silva Jr

Ribeiro Preto 20062

Esta

tese

recebeu

fomento

da

Fundao de Amparo a Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP), processo 02/07759-8.

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Dedico esta tese a meu pai Horacio e a minha me Lucia; a minha esposa Giovana e a meu filho Enzo; a meus irmos Roberto, Ezequiel e Luciano; a suas esposas Mayra, Gisele e Patrcia; a meus sogros Nivaldo e Julia; a meus cunhados Alexandre e Daniela; e a meus sobrinhos Pietro, Beatriz, Isabela, Angelina, Sofia, Maria Julia e Joo Pedro; por representarem o que a de mais valioso em minha vida, minha famlia. Obrigado a todos pelo apoio fundamental.

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AgradecimentosA meu mestre e orientador Prof. Dr. Marco A. Zago pela formao e pelas oportunidades. Autores e colaboradores envolvidos nos trabalhos Marco A. Zago, Dimas T. Covas, Wilson A. Silva-Jr, Rodrigo Proto-Siqueira, Jorge L. C. Siufi, Luciano Neder, Vanderson Rocha, Maristela Orellana, Ane R. L. Silva, Amlia G. Arajo, Anemari R. D. Santos, Dalila L. Zanette, Edgar G. Rizzatti, Carlos E. Piccinato, Aparecida M. Fontes, Karen L. Prata, Luiz C. Perez, Rita C. Carrara, Patrcia Palma, Aglair B. Garcia, Rodrigo T. Calado, Marli H. Tavela, Adriana A. Marques, Cristiane A. Ferreira e Fernanda G. Barbuzano, Israel T. Silva, Marco V. Cunha, Daniel G. Pinheiro, Carlos A. Scrideli e Rita C.V. Carrara. Unidades e Departamentos envolvidos na realizao deste trabalho: Departamento de Clnica Mdica da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto Centro de Terapia Celular e Fundao Hemocentro de Ribeiro Preto Laboratrio de Hematologia do Hospital das Clnicas de Ribeiro Preto Unidade de Transplante de Medula ssea do Hospital das Clnicas de Ribeiro Preto Unidade de Transplante de Medula ssea do Hospital Saint Louis, Paris, Frana. Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto Hospital Amaral de Carvalho de Ja (Mair P. Souza e Vergilio Colturato) Universidade Estadual de Campinas (Carmino A. Souza) Faculdade de Medicina de So Jos do Rio Preto (Milton Ruiz) Entidades financiadoras apoiando este trabalho: Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) Aos mdicos e enfermeiros que direta ou indiretamente colaboraram para este estudo, sempre pensando no bem estar dos pacientes e doadores envolvidos. Aos pacientes e doadores por acreditarem e participarem nesta pesquisa.

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Agradecimentos

Nomear cada um dos novos amigos que fiz durante esta jornada uma tarefa difcil, o medo de deixar algum de fora me impede. Por isso, me refiro a todos de maneira geral.

Obrigado aos amigos do Laboratrio de Hematologia e do Hemocentro pela amizade e pelas conversas sempre agradveis.

Apesar de no nomear todos os amigos, alguns merecem ser mencionados, no apenas pela amizade, mas por terem me acolhido como filho ou como irmo.

Obrigado Amlia, Marli, Dalvinha e Rodrigo (o Gacho). Tambm considero vocs como famlia. Serei sempre grato. VALEU !!!

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As cada maana de mi vida traigo del sueo otro sueo Pablo Neruda

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PrefcioO papel das clulas tronco na ontogenia e na fisiologia normal dos tecidos humanos foi trazido recentemente para o foco da ateno pblica e da mdia, em virtude das propostas de utilizao destas clulas para tratamento de doenas as mais variadas. Em alguns casos esta capacidade est bem demonstrada, e sua aplicao j faz parte do arsenal mdico no mundo todo, como o transplante de clulas tronco hematopoticas, conhecido mais simplesmente por transplante de medula ssea, enquanto que as vantagens e viabilidade prtica de muitas outras aplicaes potenciais precisam ainda ser demonstradas. Apesar dessa notoriedade recente, o conceito das clulas tronco bastante antigo. O fundador da citologia hematolgica italiana, Adolfo Ferrata, a partir da dcada de 1920, difundiu entre os hematologistas o conceito de um tipo de clula primitiva indiferenciada (hemocitoblasto ou clula de Ferrata) da medula ssea, que seria a responsvel pela contnua reposio de clulas maduras diferenciadas das mltiplas linhagens do sangue. Foi a partir desse conceito simples que se desenvolveu o transplante de medula ssea: se na medula existem clulas indiferenciadas, capazes de se expandir, manter sua prpria populao e ao mesmo tempo originar clulas maduras do sangue, ento se destruirmos a medula ssea de um paciente (por exemplo, com quimioterapia), a capacidade de produo de sangue poder ser restaurada pelo transplante dessas clulas precursoras hematopoticas multipotenciais. Entre o conceito e sua aplicao prtica foi necessria uma imensa massa de trabalhos experimentais, dos quais

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os mais representativos so dos de E. Donnall Thomas que recebeu o Prmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1990 (juntamente com J.E. Murray). Apesar da ateno que outros tipos de clulas tronco atraem atualmente, tanto adultas como embrionrias, as clulas tronco hematopoticas continuam ocupando uma posio de mximo interesse na medicina. Alm do tratamento de doenas hematolgicas, numerosas abordagens teraputicas novas tm sido testadas com base no uso de clulas obtidas de medula ssea, notoriamente para tratamento de doenas cardacas, neurolgicas, do diabete melito, entre outras. Clulas multipotentes como a precursora hematopotica, que origina clulas maduras do sangue circulante como granulcitos, linfcitos e eritrcitos, no so obtidas unicamente da medula ssea ps-natal. O sangue de cordo umbilical rico nestes precursores e representa uma importante alternativa para a obteno destas clulas. Nos ltimos trs anos participei de estudos que visam esclarecer mecanismos moleculares bsicos que explicariam o comportamento e as propriedades das clulas destas duas fontes, que so descritos no presente trabalho. Entendo que esse tipo de conhecimento indispensvel para contribuir para o progresso e fundamentar a aplicao prtica dessas clulas em usos teraputicos em humanos.

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PrembuloOs dados resultantes desta tese e a participao em outros trabalhos que utilizaram metodologias semelhantes foram submetidos ou publicados em revistas cientificas internacionais. Alguns destes trabalhos foram premiados em congressos nacionais ou receberam auxlios em congressos internacionais. Finalmente, os artigos referentes a clulas tronco adultas (mesenquimais ou hematopoticas), fazem parte do trabalho agraciado com o terceiro lugar do Prmio Jovem Cientista 2005 do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq). As separatas dos principais trabalhos encontramse no captulo de anexos.

Artigos:1) Panepucci RA, Calado RT, Rocha V, Proto-Siqueira R, Silva-Jr WA, Zago MA. HIGHER EXPRESSION OF TRANSCRIPTION TARGETS AND COMPONENTS OF THE NF-B PATHWAY IS A DISTINCTIVE FEATURES OF UMBILICAL CORD BLOOD CD34+ PRECURSORS. Submetido. 2) Covas DT, Panepucci RA, Proto-Siqueira R, Neder L, Orellana M, Rocha V, Silva Jr WA, Zago MA. CLOSE FUNCTIONAL SIMILARITIES BETWEEN HUMAN MESENCHYMAL STEM CELLS, PERICYTES AND FIBROBLASTS. Manuscrito em preparao. 3) Proto-Siqueira R, Figueiredo-Pontes LL, Panepucci RA, Garcia AB, Rizzatti EG, Nascimento FM, Ishikawa HCF, Larson RE, Falco RP, Simpson AJ, Gout I, Filonenko V, Rego EM, Zago MA. PRAME IS A MEMBRANE AND CYTOPLASMIC PROTEIN ABERRANTLY EXPRESSED IN CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA AND MANTLE CELL LYMPHOMA. Leukemia Research. 2006. (In Press) 4) Pieroni F, Oliveira FM, Panepucci RA, Voltarelli JC, Simoes BP, Falcao RP. DEVELOPMENT OF DONOR CELL DERIVED ACUTE MYELOID LEUKEMIA AFTER STEM CELL TRANSPLANTATION FOR CHRONIC MYELOID LEUKEMIA. Bone Marrow Transplant. 2006 Apr;37(8):801-2. PMID: 16501585

Continua...

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5) Rizzatti EG, Falcao RP, Panepucci RA, Proto-Siqueira R, Anselmo-Lima WT, Okamoto OK, Zago MA. GENE EXPRESSION PROFILING OF MANTLE CELL LYMPHOMA CELLS REVEALS ABERRANT EXPRESSION OF GENES FROM THE PI3K-AKT, WNT AND TGFBETA SIGNALLING PATHWAYS. Br J Haematol. 2005 Aug;130(4):516-26. PMID: 16098065 6) Panepucci RA, Siufi JL, Silva WA Jr, Proto-Siquiera R, Neder L, Orellana M, Rocha V, Covas DT, Zago MA. COMPARISON OF GENE EXPRESSION OF UMBILICAL CORD VEIN AND BONE MARROW-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS. Stem Cells. 2004;22(7):1263-78. PMID: 15579645 7) Silva WA Jr, Covas DT, Panepucci RA, Proto-Siqueira R, Siufi JL, Zanette DL, Santos AR, Zago MA. THE PROFILE OF GENE EXPRESSION OF HUMAN MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS. Stem Cells. 2003;21(6):661-9. PMID: 14595126

Prmios:1) EHA Travel Grant Panepucci RA, Calado RT, Rocha V, Proto-Siqueira R, Scrideli CA, Carrara RCV, Santos ARD, Garcia AB, Araujo AG, , Silva-Jr WA, Zago MA. HIGHER CONSTITUTIVE NF-KB SIGNALING IS A DISTINCTIVE FEATURE OF UMBILICAL CORD BLOOD CD34+ PRECURSORS. 11 Congresso Europeu de Hematologia 2006 (EHA), 15 a 18 de Junho de 2006, Amsterdam, Holanda. A ser realizado.

2) Prmio Jovem Cientista CNPq 2005 Rodrigo Alexandre Panepucci. BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA DE CLULAS TRONCO ADULTAS DO SISTEMA HEMATOPOTICO.

3) Prmio Michel Jamra de Melhor Trabalho em Hematologia Geral Proto-Siqueira R, Panepucci RA, Araujo AG, Rizzatti EG, Silva-Jr WA, Falco RP, Zago MA. Serial analisys of gene expression of purified CLL cells reveals similar profiles despite Ig mutational status and altered apoptosis related genes. Congresso Brasilero de Hematologia e Hemoterapia 2005, realizado no perodo de 6 a 9 de Novembro de 2005, em So Paulo SP. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, vol 27, supp 2, Novembro de 2005.

Continua...

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4) Prmio de Melhor Trabalho em Hematologia Geral Abreu e Lima RS, Scheucher OS, Santana BAA, Pinto M, Saggioro F, Teixeira H, Panepucci RA, Falco RP, Rego EM. ANLISE IN VITRO DA AO DO ALFA-TOCOFEROL NA LEUCEMIA PROMIELOCTICA AGUDA. Congresso Brasilero de Hematologia e Hemoterapia 2005, realizado no perodo de 6 a 9 de Novembro de 2005, em So Paulo SP. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, vol 27, supp 2, Novembro de 2005.

5) EHA Travel Grant Proto-Siqueira R, Rizzatti EG, Panepucci RA, Silva-Jr WA, Vasconcelos Y, Falco RP, Dighiero G and Zago MA. SERIAL ANALYSIS OF GENE EXPRESSION (SAGE) OF PURIFIED CLL CELLS REVEALS SIMILAR PROFILES DESPITE IG MUTATIONAL STATUS, AND ALTERED APOPTOSIS-RELATED GENES. 10 Congresso Europeu de Hematologia 2005 (EHA), realizado no perodo de 2 a 5 de Junho, Estocolmo, Sucia. Haematologica The Hematology Journal, vol 90, supp 2, June 2005.

6) Prmio Michel Jamra de Melhor Trabalho em Hematologia Geral Rizzatti EG, Panepucci RA, Proto-Siqueira R, Anselmo-Lima WT, Okamoto OK, Falco RP, Zago MA. Perfil de expresso gnica do linfoma de clulas do manto revela a expresso aberrante de genes da superfamlia TGF. Congresso Brasileiro de Hematologia e Hemoterapia 2004, realizado no perodo de 3 a 6 de Novembro de 2004, em So Paulo SP. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, vol 26, supp 2, Agosto de 2004.

7) EHA Travel Grant Panepucci RA, Siufi JLC, Proto-Siqueira R, Araujo AG, Zanette DL, Santos ARD, Silva-Jr WA, Covas DT, Zago MA. THE COMPARISON OF GENE EXPRESSION OF UMBILICAL CORD VEIN AND BONE MARROW DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS. 9 Congresso Europeu de Hematologia 2004 (EHA), realizado no perodo de 10 a 13 de Junho de 2004, Genebra, Sua. Haematologica The Hematology Journal, vol 89, supp 2, June 2004.

8) Prmio Jos ria de Melhor Trabalho do Congresso. Panepucci RA, Siufi JLC, Proto-Siqueira R, Araujo AG, Zanette DL, Santos ARD, Silva-Jr WA, Covas DT, Zago MA. ANLISE SERIAL DA EXPRESSO GNICA (SAGE) DE CLULAS TRONCO MESENQUIMAIS. Congresso Brasileiro de Hematologia e Hemoterapia 2003. 6 a 9 de Agosto de 2003. So Paulo, SP. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, vol 25, supp 2, Agosto de 2003.

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ResumoUma maior produo e diversidade de linfcitos T e menor incidncia da doena do enxerto contra o hospedeiro (Graft Versus Host Disease, GVHD), so caractersticas associadas aos transplantes que utilizam sangue de cordo umbilical (SCU), quando comparados com os que utilizam medula ssea (MO). Estas diferenas se devem em parte s diferenas nas clulas tronco hematopoticas (CTH) destes tecidos. Para compreender os mecanismos moleculares responsveis por estas diferenas intrinsecas, ns analisamos os genes diferencialmente expressos entre as CTH CD34+ de MO e SCU. A expresso de aproximadamente 10.000 genes foi comparada pela tcnica de anlise serial da expresso gnica (SAGE, Serial Analysis of Gene Expression) de clulas CD34+ de MO e SCU. A expresso diferencial de genes selecionados foi avaliada por PCR em tempo real em amostras adicionais de clulas CD34+ de MO (n=22), SCU (n=9) e de sangue perifrico mobilizado por G-CSF (SPM, n=6). A grande representatividade de componentes da via NF-kB foi a caracterstica principal encontrada nas CTH de SCU. Uma maior expresso de transcritos codificadores para ativadores (IL1B, TNF e TGFB1), efetores (NFKB2, RELA e RELB) e alvos transcricionais (ICAM1, IL8 e CCL4L) da sinalizao por NF-kB foi encontrada nas CTH de SCU e confirmada por PCR em tempo real. Anlise adicional nos promotores de 41 genes mais expressos em CTH de SCU revelou um nmero significativamente maior do que o esperado de elementos cisregulatrios de NF-kB (presentes em 22 genes).

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Nossos resultados apontam para um papel central da via NF-kB nas diferenas moleculares e funcionais observadas entre as CTH de MO e de SCU. Nosso estudo define uma base para estudos futuros e para estratgias potencialmente novas para a manipulao de enxertos de clulas tronco.

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AbstractDelayed engraftment, better reconstitution of progenitors, higher thymic function, and a lower incidence of the graft versus host disease (GVHD) are characteristics associated with umbilical cord blood (UCB) transplants, when compared to bone marrow (BM). These distinct outcomes are in part due to the behavior of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC). To understand the molecular mechanisms causing these intrinsic differences we analyzed the differentially expressed genes between BM and UCB HSPC. The expression of approximately 10,000 genes was compared by serial analysis of gene expression (SAGE) of magnetically sorted CD34+ cells from BM and UCB. Differential expression of selected genes was evaluated by real-time PCR on additional CD34+ samples from BM (n=22), UCB (n=9) and G-CSF mobilized peripheral blood (MPB, n=6). The overrepresentation of NF-kB pathway components was found to be a major characteristic of UCB HSPC. Higher expression of transcripts coding for activators (IL1B, TNF and TGFB1), effectors (NFKB2, RELA and RELB) and transcriptional targets (ICAM1, IL8 and CCL4L) of NF-kB signaling were found in UCB HSPC and confirmed by real-time PCR. Additional promoter analysis of 41 UCB

overrepresented genes revealed a significantly higher number of NF-kB cisregulatory elements (present in 22 genes) than expected by chance. Our results point to a central role of the NF-kB pathway on the molecular and functional differences observed between BM and UCB HSPC. Our study sets the basis for future studies and to potentially new strategies to stem cell graft manipulation.

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Lista de AbreviaturasCD: CGAP: CTH: CTM: FTOC: GVHD: HSPC: Cluster Designation antigens Cancer Genome Anatomy Project Clula Tronco Hematopotica (HSC, hematopoietic stem cell) Clula Tronco Mesenquimal (MSC, mesenchymal stem cell) Fetal Thymic Organ Cultures (culturas organotipicas de timo fetal) Graft Versus Host Disease (doena do enxerto contra o hospedeiro) Hematopoietic Stem/Progenitor Cells (clula tronco/progenitora hematopotica) ISHAGE MO: NCBI: pb: PCR: SAGE: gnica) SCU: Sangue de Cordo Umbilical (ou placenta) International Society of Hematotherapy and Graft Engineering Medula ssea National Center for Biotechnology Information pares de base (de nucleotdeos no DNA, no RNA ou em primers) Polymerase Chain Reaction (reao em cadeia da polimerase) Serial Analysis of Gene Expression (anlise serial da expresso

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Nota sobre a nomenclatura de genesDevido sua natureza, o presente trabalho inclui grande nmero de nomes de genes. Em muitos casos so genes bastante conhecidos, com nome firmemente estabelecido em lngua portuguesa, como colgeno e fibronectina; outros so nomes cuja traduo ou transcrio em portugus no oferece dificuldade, como vimentina. Finalmente, h um grande nmero de genes para os quais no h traduo ou transcrio bvia, e cujos nomes sero mantidos em ingls, seguindo a nomenclatura do HUGO (Human Genome Organization), como por exemplo TGFBI (transforming growth factor beta induced).

Nota sobre termos tcnicosPelo mesmo motivo, o presente trabalho inclui grande nmero de termos tcnicos referentes a tcnicas de biologia molecular ou de anlises

bioinformticas. Quando possvel, foi realizada a traduo ou transcrio destes termos, nos demais casos, foram adotados os termos em ingls.

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SumrioINTRODUO .............................................................................................................................................. 19 CLULAS TRONCO HEMATOPOTICAS - CTHS ............................................................................................. 20 Hematopoese Fetal e Adulta ................................................................................................................... 23 Fontes Alternativas de CTHs .................................................................................................................. 24 Diferenas Entre CTH de MO e de SCU ................................................................................................ 25 DELINEAO DO ESTUDO ............................................................................................................................. 28 MATERIAIS E MTODOS.......................................................................................................................... 34 AMOSTRAS - SANGUE DE CORDO UMBILICAL E MEDULA SSEA ............................................................... 35 Seleo Imunomagntica das Clulas CD34+ ....................................................................................... 35 Citometria de Fluxo ................................................................................................................................ 36 EXTRAO DO RNA..................................................................................................................................... 42 Quantificao do RNA ............................................................................................................................ 44 Anlise de Qualidade do RNA ................................................................................................................ 44 SAGE ANLISE SERIAL DA EXPRESSO GNICA ...................................................................................... 45 Clonagem e Seqenciamento dos Concatmeros.................................................................................... 53 ANLISES BIOINFORMTICAS ...................................................................................................................... 55 Anlise Serial da Expresso Gnica ....................................................................................................... 55 Anlise de Promotores............................................................................................................................ 55 PCR EM TEMPO REAL .................................................................................................................................. 57 RESULTADOS............................................................................................................................................... 60 AMOSTRAS UTILIZADAS NAS BIBLIOTECAS DE SAGE.................................................................................. 61 Clulas CD34+ de Medula ssea .......................................................................................................... 61 Clulas CD34+ de Sangue de Cordo Umbilical................................................................................... 62 AMOSTRAS UTILIZADAS NO PCR EM TEMPO REAL ...................................................................................... 64 Amostras de Medula ssea..................................................................................................................... 65 Amostras de Sangue de Cordo Umbilical ............................................................................................. 65 Amostras de Sangue Perifrico Mobilizado............................................................................................ 65 PERFIS DE EXPRESSO GNICA .................................................................................................................... 66 GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS ...................................................................................................... 66 COMPARAO COM DADOS PUBLICADOS..................................................................................................... 71 ALVOS TRANSCRICIONAIS DE NFKB EM CTH DE SCU................................................................................ 74 Anlise de Promotores............................................................................................................................ 74 PCR Quantitativo dos Genes Selecionados ............................................................................................ 75 DISCUSSO ................................................................................................................................................... 77 A VIA NF-KB................................................................................................................................................ 79 GENES MAIS EXPRESSOS NAS CTH DE SCU E A VIA NF-KB ....................................................................... 80 NF-KB E CTH CD34+ .................................................................................................................................. 85 PAPEL DE NF-KB NAS DIFERENAS ENTRE CTH DE MO E SCU .................................................................. 87 GENES MAIS EXPRESSOS EM CTH DE MO .................................................................................................... 88 CONCLUSES .............................................................................................................................................. 89 PERSPECTIVAS FUTURAS........................................................................................................................ 92 REFERNCIAS ............................................................................................................................................. 95 ANEXOS ....................................................................................................................................................... 109

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Introduo__________________________________________________________________

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Clulas Tronco Hematopoticas - CTHsNo individuo adulto, diferentes tecidos possuem a capacidade de renovao ou ao menos de reparao total ou parcial; o sangue e a epiderme, por exemplo, esto constantemente se renovando enquanto outros tecidos, como o heptico, podem ser reparados por completo e finalmente outros, como msculos esquelticos e cardacos ou tecidos nervosos, apresentam um potencial reduzido de reparao. Este potencial est relacionado presena de clulas tronco que se encarregam da reparao, proliferando e se diferenciando nos diversos tipos celulares encontrados nos tecido e rgos, as chamadas clulas tronco adultas. A maioria, se no todos, os tecidos adultos tm clulas tronco. Assim, so bem conhecidas clulas-tronco de pele, da mucosa intestinal, do epitlio olfativo, crebro, fgado, gordura, crnea, retina, polpa dentria, pulmes, msculos esquelticos e msculos cardacos. Dentre os tecidos adultos, o tecido sangneo merece destaque em virtude do volume de pesquisa terica e aplicada na rea da medicina. As clulas tronco ou progenitoras hematopoticas (ou HSPC, hematopoietic stem/progenitor cells) so um grupo de clulas sangneas imaturas capazes de se diferenciar em todos os tipos de clulas encontradas no sangue perifrico. CTH podem proliferar extensivamente dando origem a clulas maduras e diferenciadas, ao mesmo tempo que uma parcela delas mantm o pool de CTH (Mayani & Lansdorp, 1998). A definio de uma CTH uma tarefa difcil tanto tecnicamente como conceitualmente (Wognum et al, 2003). Tecnicamente, o estudo das CTH realizado isolando-se uma subpopulao de clulas com base em marcadores de

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superfcie e testando esta subpopulao quanto ao seu enriquecimento em relao a clulas com potencial de diferenciao e auto-renovao. Esta pequena sub-populao de CTH pode ser testada in vitro quanto presena de clulas iniciadoras de culturas de longo prazo (long-term culture-initiating cell - LTC-IC) (Sutherland et al, 1990) ou, idealmente in vivo, em transplantes em hospedeiros imunodeficientes como camundongos NOD/SCID (nonobese diabetic/severe combined immunodeficient) (Larochelle et al, 1996). Estes ensaios in vivo, em teoria, refletem a verdadeira habilidade fisiolgica das clulas testadas; no entanto, uma populao de CTH que falhe na reconstituio do sistema hematopoitico, quando transplantada por via intra-venosa, pode eventualmente faz-lo com sucesso quando transplantada diretamente na medula ssea (Wang et al, 2003), indicando que estes ensaios in vivo podem estar avaliando, no apenas o potencial de auto-renovao e diferenciao, mas tambm o potencial de homing (migrao para o local de origem, medula ssea). As CTH no podem ser diretamente identificadas do ponto de vista morfolgico; no entanto, sabe-se que elas fazem parte das clulas mononucleares do tecido hematopotico (medula ssea), e esto enriquecidas em uma subpopulao caracterizada imunofenotipicamente como clulas CD34+ (Civin et al, 1984;Sutherland & Keating, 1992). Desde sua primeira descrio por Civin e colaboradores, o antgeno CD34 se tornou um dos marcadores mais utilizados na definio dos progenitores hematopoticos (Krause et al, 1996). De fato, CTH CD34+ possuem uma capacidade 100 vezes maior de reconstituir camundongos NOD/SCID do que clulas CD34-, em transplantes intravenosos (Gao et al, 2001).

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O antgeno CD34 uma glicoprotena integral de membrana com 385 aminocidos e cerca de 116 kD. O domnio N-terminal extracelular possui os eptopos que interagem com os anticorpos utilizados na deteco ou purificao das clulas CD34+. Acredita-se que esta protena tenha a funo de adeso celular, controlando a localizao destas clulas por interaes com protenas de membrana de outras clulas (Healy et al, 1995;Sutherland & Keating, 1992). As clulas CD34+ so uma populao heterognea que consiste de clulas tronco multipotentes (HSCs) bem como clulas progenitoras (HPCs) j comprometidas com as diferentes linhagens hematopoticas (Burt, 1999;Mayani & Lansdorp, 1998). Subpopulaes das clulas CD34+ foram posteriormente definidas pela ausncia (ou baixa expresso) de marcadores como CD38 (Terstappen et al, 1991), pela presena de marcadores como HLA-DR (Huang & Terstappen, 1994), KDR (ou VEGFR2, vascular endothelial growth factor receptor 2) (Ziegler et al, 1999), ou CD133 (Shmelkov et al, 2005;Gallacher et al, 2000). Apesar destas subpopulaes representarem CTH mais primitivas, elas correspondem a uma porcentagem muito pequena das clulas mononucleares presentes na medula, dificultando a purificao de clulas em quantias adequadas para seu estudo.

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Hematopoese Fetal e AdultaO sangue tem origem precoce no embrio a partir de clulas da parede de vasos na regio chamada de aorta-gnada-mesonefros (Dzierzak, 1999;Marshall & Thrasher, 2001). As clulas tronco hematopoticas ali originadas produzem clulas sanguneas no local e posteriormente migram para rgos como o bao e o fgado, onde encontram um ambiente (nicho) adequado formao de colnias sanguneas. medida que se aproxima a poca do nascimento, as clulas tronco migram pela corrente sangunea, destes rgos originais para a medula ssea, onde se fixar a hematopoese definitiva no adulto. Na medula ssea, as clulas tronco hematopoticas (CTH) encontram um micro-ambiente capaz de sustentar a constante renovao do tecido sanguneo. Este micro-ambiente se deve principalmente presena de outra populao de clulas, as clulas tronco mesenquimais (CTM). As CTM (ou MSC, mesenchymal stem cells) tm o potencial de se diferenciarem nos quatro principais tipos celulares que formam a microarquitetura da medula: os adipcitos, condrcitos, ostecitos e as clulas estromais (Deans & Moseley, 2000;Gronthos et al, 1994;Pittenger et al, 1999). Estas clulas fornecem sinais, por meio de fatores secretados ou interaes celulares, s clulas tronco hematopoticas, auxiliando na hematopoese. De fato, alguns destes sinais podem ser preditos com base em estudos de expresso gnica (Silva, Jr. et al, 2003). Tambm durante o desenvolvimento, as CTH migram e se fixam em rgos linfides como o timo, onde do inicio produo de linfcitos T (Spits, 2002).

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Fontes Alternativas de CTHsSem dvida, a fonte mais utilizada para obteno das clulas tronco hematopoticas a medula ssea. Clulas da MO so utilizadas h mais de 40 anos em transplantes de medula ssea visando a reconstituio do sistema hematopotico de pessoas submetidas a regimes intensos de quimioterapia ou radioterapia no tratamento de doenas neoplsicas, hematolgicas ou no (Thomas et al, 1959;Thomas et al, 1957). Este procedimento permitiu posteriormente, a substituio do sistema hematopotico de pessoas com doenas imunolgicas ou metablicas, relacionadas a defeitos congnitos afetando o tecido sanguneo (Gatti et al, 1968). Nestes casos, os tratamentos de quimioterapia ou radioterapia resultam em geral na reduo ou eliminao total das clulas sangneas do receptor, incluindo as clulas tronco e progenitoras hematopoticas (Armitage, 1994). Recentemente, o sangue de neonatos, contido no cordo umbilical e placenta, passou a ser considerado uma fonte alternativa de clulas tronco hematopoticas. A presena de HPCs em sangue de cordo umbilical foi demonstrada pela primeira vez por culturas in vitro (Knudtzon, 1974). Quinze anos depois o potencial para o uso clnico deste material foi determinado (Broxmeyer et al, 1989), e no mesmo ano foi realizado o primeiro transplante de clulas hematopoticas de sangue de cordo umbilical para reconstituir o sistema hematopotico de uma criana com anemia de Fanconi (Gluckman et al, 1989). Alm da medula ssea e do sangue de cordo umbilical (e placenta), as CTH podem ser obtidas de sangue perifrico aps tratamento com fatores

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especficos (como G-CSF) ou quimioterpicos, que levam mobilizao das CTH no sangue perifrico do individuo (To et al, 1997). Estas fontes alternativas vm sendo utilizadas de forma crescente nos transplantes de medula ssea com fins teraputicos (Armitage, 1994;Cairo & Wagner, 1997;Korbling & Champlin, 1996).

Diferenas Entre CTH de MO e de SCUO uso de sangue de cordo umbilical como fonte de clulas tronco hematopoticas para transplantes tem se mostrado uma alternativa vlida, tanto para adultos como para crianas (Rocha et al, 2004). No entanto, os resultados em pacientes transplantados com sangue de cordo umbilical (SCU) diferem dos que recebem medula ssea (MO). Doena do Enxerto Contra o Hospedeiro - GVHD Apesar do sucesso no uso de medula ssea em transplantes, algumas barreiras persistem. O sucesso do transplante depende, entre outros fatores, da compatibilidade entre doador e receptor. A incompatibilidade neste caso pode resultar na chamada doena do enxerto contra o hospedeiro ou GVHD (graft versus host disease), quando o sistema imune do doador no reconhece o organismo receptor como prprio, iniciando uma resposta imune disseminada. A resposta aguda da GVHD em grau elevado pode resultar na morte do receptor, enquanto que a chamada GVHD crnica pode resultar numa menor qualidade de vida do paciente (Horwitz & Sullivan, 2006). As transfuses de clulas do sangue perifrico adulto mobilizado apresentam chances similares de causar a doena aguda do enxerto contra o 25

hospedeiro (acute GVHD) no transplantado, quando comparado com transfuses de medula ssea, em doadores e recipientes HLA-compatveis. Alm disso, a coleta para armazenagem deste material (tal como o de medula ssea) no facilitada, dado o desconforto a que os doadores tm que se sujeitar (Cairo & Wagner, 1997;Rowley et al, 2001). Por outro lado, no caso do sangue de cordo umbilical, o doador no apresenta nenhum desconforto, pois o sangue coletado da placenta e do cordo aps o nascimento da criana sem nenhuma interveno adicional. A origem do material permite que sejam criados bancos para sua conservao aumentando as chances de se encontrar material HLA-compatvel quando surge o doente que necessita do transplante (Wagner et al, 1992). Alem disso, pacientes transplantados com SCU apresentam uma menor incidncia da doena do enxerto contra o hospedeiro, em relao aos que recebem medula ssea (Rocha et al, 2004). Adicionalmente, h indcios que os riscos de GVHD so reduzidos, mesmo em transfuses com material no compatvel para um ou mais antgenos HLA (Kurtzberg et al, 1996;Wagner, 1994). Reconstituio dos Progenitores Hematopoticos Apesar da quantidade de clulas ser um fator limitante, crianas ou adultos, sem doadores compatveis, podem se beneficiar desta fonte, no entanto, acreditase que o nmero restrito de clulas resultem numa maior demora na restaurao do sistema imune, mais especificamente no restabelecimento de neutrfilos (Rocha et al, 2004). No entanto, transplantes com SCU proporcionam uma melhor reconstituio dos progenitores mais primitivos e comprometidos em comparao

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com MO, indicando que CTH de SCU privilegiariam auto-renovao ao custo de diferenciao e maturao (Frassoni et al, 2003). Alm destes estudos clnicos, o grande potencial das clulas do SCU tambm apoiado em pesquisas realizadas in vitro e in vivo, utilizando a subpopulao de CTH CD34+ ou a frao mononuclear total. Estudos utilizando transplantes em camundongos NOD/SCID ou ensaios de curto e longo prazo apontam o SCU como uma fonte enriquecida de CTH mais primitivas, comparado MO (Holyoake et al, 1999;Kim et al, 1999;Theunissen & Verfaillie, 2005;Wang et al, 1997). Adicionalmente, CTH CD34+ de SCU apresentam maior migrao, comparado a MO, em ensaios de transmigrao atravs de filtros, indicando um maior potencial de homing (Voermans et al, 1999). Produo de Linfcitos T A funo tmica e a diversidade de receptores de clulas T (TCR) so maiores nos pacientes transplantados com SCU do que nos transplantados com MO (Talvensaari et al, 2002). In vitro, utilizando culturas organotpicas de timo fetal de camundongo (FTOC), CTH CD34+ de SCU se diferenciam prontamente em linfcitos T enquanto que as clulas de MO dependem de estmulos auxiliares (Weekx et al, 2000).

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Delineao do EstudoA posio promissora e o uso crescente do sangue de cordo umbilical, como uma alternativa para os transplantes alognicos, reforam nosso interesse pela biologia das CTH de cordo umbilical e pelas diferenas entre as CTH de cordo umbilical e as de medula ssea. Apesar de muitos trabalhos estarem sendo desenvolvidos nesta imensa rea de conhecimento, o pleno potencial destas clulas s pode ser alcanado com um amplo e profundo conhecimento da sua biologia funcional e molecular. As caractersticas distintas mencionadas refletem diferenas na composio celular dos enxertos assim como caractersticas moleculares intrnsecas das CTH de ambas as fontes. As clulas CD34+ derivadas de MO e SCU constituem uma populao imunofenotipicamente heterognea (Bender et al, 1994;Fritsch et al, 1996;Kinniburgh & Russell, 1993;Nimgaonkar et al, 1995). De fato, o subconjunto CD38- (mais primitivo) das CTH CD34+ mais abundante em SCU (D'Arena et al, 1996;Gigant et al, 2001;Hao et al, 1996). No entanto, mesmo esta subpopulao possui caractersticas intrnsecas distintas dependendo da idade ontolgica (Shojaei et al, 2004), e as diferenas entre o subconjunto CD38- e CD38+ so menos evidentes em clulas CD34+ de SCU do que MO (Hao et al, 1995;Timeus et al, 1998;Weekx et al, 1998). Estas ltimas observaes destacam o componente intrnseco destas diferenas. As diferenas existentes entre os transplantes com clulas de sangue de cordo umbilical e as clulas de medula ssea ressaltam a importncia dos estudos que tentem identificar as causas destas diferenas. Apesar de vrios

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estudos de imunofenotipagem, atividade metablica e ciclo celular indicarem diferenas quantitativas e qualitativas entre as clulas destas duas fontes (Mayani & Lansdorp, 1998), identificar os componentes moleculares responsveis por tais diferenas tem uma grande importncia tanto conceitual como prtica. Por representarem uma populao de clulas tronco e progenitores hematopoticas, as clulas CD34+ da MO e do SCU so potenciais candidatas a serem responsveis pelas diferenas mencionadas (ou ao menos parte delas). Dado que as caractersticas biolgicas das clulas so fortemente determinadas ao nvel da expresso gnica, uma ferramenta poderosa para o estudo do problema proposto a anlise da expresso gnica diferencial. Estudos de expresso gnica de larga escala se encaixam perfeitamente nesta proposta, uma vez que por meio deles pode-se obter um panorama amplo e compreensivo dos diversos genes expressos, estabelecendo as bases

moleculares responsveis pela biologia funcional destas clulas. Por sua vez, a comparao de perfis transcricionais obtidos de clulas tronco hematopoticas de diferentes fontes pode ajudar a entender as bases moleculares das diferenas funcionais existentes, firmando uma base slida e permitindo um ponto de partida para estudos futuros. Poucos so os trabalhos que comparam a expresso gnica diferencial entre as clulas CD34+ de cordo umbilical e de medula ssea de maneira abrangente. Em geral, eles se baseiam na anlise de poucos genes (Mayani & Lansdorp, 1998). Os nicos estudos abrangentes relacionados foram feitos entre clulas CD34+ de medula ssea e de sangue perifrico mobilizado utilizando

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DNA Macro Arrays (Steidl et al, 2002;Steidl et al, 2003), ou Oligonucleotide Array Chips (Graf et al, 2001). Entre as diversas tcnicas disponveis para a anlise de expresso diferencial, a tcnica de SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) ou Anlise Serial da Expresso Gnica possui caractersticas importantes frente ao estudo proposto. Diferindo dos Arrays de hibridizao, esta tcnica no depende de comparaes diretas entre diferentes amostras. Ao contrrio, ela gera um padro de expresso absoluto (transcriptoma), podendo ser armazenado em bancos de dados para posterior comparao com novos transcriptomas. A tcnica de SAGE, inicialmente concebida por Keneth Kinzler e Victor Velculescu (Velculescu et al, 1995), tem um potencial de larga escala por se basear na gerao de pequenos tags (aproximadamente 13 pb) especficos de cada cDNA da populao inicial de RNAm, que so concatemerizados, clonados e seqenciados (Figura 1). Desta forma, com uma nica reao de seqenciamento pode-se obter at 50 tags, reduzindo em at 50 vezes o esforo para obteno de amostragens significativas, comparado com o seqenciamento de ESTs (Velculescu et al, 2000).

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Obteno dos "tags" Concatemerizao Sequenciamento

Contagem e Anlises Estatsticas

Condio A

Condio B Nveis de Expresso

Produtos GnicosFigura 1. Esquema geral da tcnica de SAGE (adaptada do Site www.sagenet.org/).

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Objetivos__________________________________________________________________

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Apesar de ambas serem utilizadas na restaurao da medula ssea em transplantes, as clulas tronco hematopoticas de medula ssea e de sangue de cordo umbilical divergem quanto a algumas propriedades. Com o intuito de explorar as causas moleculares destas diferenas, tivemos como objetivos especficos deste estudo:

Purificar clulas tronco hematopoticas CD34+ a partir de amostras de medula ssea e de sangue de cordo umbilical. Determinar os perfis de expresso gnica das clulas tronco hematopoticas obtidas pela tcnica de SAGE. Identificar os genes diferencialmente expressos entre estas clulas. Validar as diferenas observadas em amostras independentes por PCR quantitativo em tempo real. Correlacionar os perfis especficos dos genes diferencialmente expressos com as diferenas funcionais conhecidas entre estas clulas. Identificar os mecanismos responsveis pelas diferenas.

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Materiais e Mtodos__________________________________________________________________

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Amostras - Sangue de Cordo Umbilical e Medula sseaAs amostras de clulas CD34+ de sangue de cordo umbilical e de medula ssea foram obtidas com consentimento aps total esclarecimento dos doadores ou responsveis, de acordo com protocolos aprovados pelo Comit de tica em Pesquisa do Hospital das Clnicas da U.S.P de Ribeiro Preto. Os experimentos referidos neste trabalho esto inseridos no projeto Diferenas na Expresso Gnica de Clulas CD34+ de Medula ssea e de Cordo Umbilical. Processo HCRP no 6775/2002.

Seleo Imunomagntica das Clulas CD34+As clulas CD34+ foram isoladas imuno-magneticamente a partir das amostras utilizando o kit MACS (Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit, human; No130-046-702 Miltenyi Biotec). Resumidamente, as clulas mononucleares eram isoladas por centrifugao em gradiente de densidade utilizando Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, No.17-1440-02) e, em seguida, as clulas CD34+ eram marcadas magneticamente com anticorpos monoclonais anti-CD34 (clone QBEND/10) acoplados a partculas magnticas. As clulas eram ento filtradas em uma coluna especial (Miltenyi Biotec, No. 130-042-201) sob o campo magntico de um potente m SuperMACS (Miltenyi Biotec), que leva reteno das clulas CD34+ marcadas. A coluna, ainda sob o campo magntico, era lavada, eliminando clulas no marcadas, sendo ento retirada do campo para eluio das clulas CD34+. A pureza destas era ento, avaliada por citometria de fluxo.

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Citometria de FluxoAs porcentagens iniciais (quantificao) e finais (pureza) das clulas CD34+ foi avaliada por citometria de fluxo, utilizando o sistema FACScan, e analisadas com o software Cell Quest (Becton Dickinson; San Jose, CA). Para a quantificao inicial de clulas CD34+ em medula ssea e sangue de cordo umbilical, duas alquotas de 100l da amostra eram incubadas separadamente em dois tubos, um controle e um teste. A ambos os tubos, eram adicionados 5l do anticorpo anti-CD45 (anti-Hle-1, Becton Dickinson) conjugado a PerCP (peridinium chlorophyll protein). Ao tubo teste, era adicionado 5l do anticorpo anti-CD34 (anti-HPCA-2, Becton Dickinson) PE (phycoerythrin), e ao tubo controle era adicionado 5l do anticorpo controle inespecifico 1 conjugado a PE (isotipo IgG1, Becton Dickinson). Os tubos eram ento incubados em geladeira por 20 min e, logo aps, era adicionada 2 ml de soluo para lise dos eritrcitos a cada tubo, sendo incubados novamente em geladeira por mais 15 minutos. Aps a lise dos eritrcitos, os tubos eram centrifugados por 5 min a 2000 RPM a 5oC, o sobrenatante era descartado e o pellet de clulas era ressuspendido em 2 ml de PBS azida contendo SBF, e os tubos eram novamente centrifugados por 5 min a 2000 RPM a 5oC. Finalmente, o sobrenadante era descartado e o pellet de clulas era ressuspendido em 500 l de PBS Formol sendo guardado em geladeira at o momento de aquisio das clulas pelo citmetro (FACScan, Becton Dickinson).

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Quantificao Inicial A aquisio das clulas foi feita com o citmetro FACScan (Becton Dickinson) utilizando o software especfico CellQuest. O protocolo para a determinao da populao de clulas tronco/progenitoras hematopoticas CD34+ e posterior quantificao foi baseado nas diretivas do ISHAGE (Sutherland et al, 1996). Em resumo, 20.0000 eventos eram coletados para garantir resultados mais robustos (estatisticamente). Inicialmente, os eventos eram plotados em funo dos parmetros de SSC (side scatter) e de sinal de CD45 PerCP. Todos os eventos positivos para o marcador pan-leucocitrio CD45 eram selecionados constituindo o primeiro gate (R1) de anlise (Figura 2A). Os eventos selecionados correspondem aos leuccitos mononucleares sobre os quais se calculam a porcentagem final de clulas CD34+, enquanto os eventos no selecionados correspondem a eritroblastos ou a artefatos (partculas de sujeira). As clulas selecionadas em R1 eram ento plotadas em funo dos parmetros de SSC (side scatter) e de sinal de CD34 PE. Os eventos positivos para o marcador de clulas tronco hematopoticas CD34 formando uma populao com baixo SSC eram selecionadas constituindo o segundo gate (R2) de anlise (Figura 2A). O parmetro de SSC representa de forma geral o tamanho das clulas, assim somente a populao de clulas CD34+ menores era selecionada em R2. Os eventos em R2 eram novamente plotados em funo dos parmetros de SSC (side scatter) e de sinal de CD45 PerCP e somente a populao de clulas com baixa expresso do antgeno CD45 eram selecionadas constituindo o terceiro gate (R3) de anlise (Figura 2A). Finalmente, as clulas em R3 eram plotadas em funo dos parmetros de SSC (side scatter) e de FSC (forward scatter), e a 37

populao de clulas seguindo um perfil linfocitrio era selecionada constituindo o quarto e ltimo gate (R4) de anlise (Figura 2A). A definio desta populao de clulas CD34+ com base em mltiplos parmetros permite uma comparao interlaboratorial minimizando as variaes de origem subjetiva. Para o clculo da porcentagem de clulas CD34+ (quantificao), o nmero de clulas obtidos em R4 no tubo controle (Figura 2B) era subtrado do numero de clulas em R4 do tubo teste, sendo ento dividido pelo nmero em R1, sendo multiplicado por 100 para obteno de valores em porcentagem.

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A

BFigura 2. Quantificao inicial de clulas CD34+. Estratgia seqencial de gates utilizados para a determinao de clulas CTH CD34+. Em A, o tubo teste, em B o tubo controle. 20.0000 eventos foram adquiridos. Em A, R1 =175238 e R4 =1444. Em B, R4 =131. Porcentagem de CTH = (1444 131) / 175238 *100 = 0,75%. O exemplo corresponde a uma amostra de medula ssea.

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Pureza Final Para a determinao da pureza final de clulas CD34+, o mesmo procedimento de marcao era utilizado dispensando-se, no entanto, o passo de lise, j que os eritrcitos eram eliminados no passo de centrifugao em gradiente de ficoll. Como estas clulas haviam sido selecionadas imunomagneticamente utilizando anticorpos anti-CD34 (clone QBEND/10), foi utilizado um anticorpo monoclonal anti-CD34 diferente (clone 8G12), que reconhece um epitopo distinto. A aquisio das clulas foi feita com o citmetro FACScan (Becton Dickinson) utilizando o software especfico CellQuest. A seqncia de gates utilizados foi a mesma descrita anteriormente mas utilizando o software PaintaGate (Figura 3).

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Figura 3. Pureza final de clulas CD34+. Grficos mostrando a distribuio das clulas purificadas em funo de mltiplos parmetros. Porcentagem de CTH CD34+ com perfil linfocitrio, baixa expresso de CD45 e baixo SSC = 96%. Note que poucas clulas so negativas para CD34. O exemplo corresponde a uma amostra de medula ssea.

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Extrao do RNADepois de isoladas, as clulas CD34+ eram centrifugadas e ressuspendidas em 250 l de PBS (tratado com DEAPC) para at 3x106 clulas, em seguida 750l de TRIZOL-LS eram adicionados e a mistura era completamente homogeneizada com a pipeta e transferida para um tubo de microcentrifuga sendo ento armazenado em freezer a -80oC para posterior extrao do RNA. Dado o pequeno nmero de clulas CD34+ de cada amostra, e a reduzida quantia de RNA presente nestas clulas, o protocolo de extrao com o reagente TRIZOL foi modificado de forma a minimizar as perdas. A mistura de PBS e TRIZOL contendo as clulas era descongelada e homogeneizada e, aps 5 minutos temperatura ambiente, o tubo era ento centrifugado a 4oC por 10 minutos a 12.000 g e a mistura era transferida para um novo tubo. Este passo (em geral no utilizado na extrao de RNA) foi introduzido para precipitar parte do DNA, reduzindo a contaminao sem interferir no RNA. Logo aps, 200 l de clorofrmio eram adicionados mistura e o tubo era agitado manualmente por 15 segundos sendo ento incubado por 15 minutos temperatura ambiente. Em seguida, o tubo era centrifugado a 4oC por 15 minutos a 12.000 g e a fase aquosa superior, que se formava, era transferida para um novo tubo. A fase orgnica inferior (fenol) e a interface (contendo DNA genmico) eram evitadas. Em seguida, a fase aquosa (cerca de 500 l) era novamente misturada com outros 500 l de TRIZOL, a mistura era homogeneizada e 200 l de clorofrmio eram adicionados e misturados agitando-se o tubo manualmente. O tubo era incubado por 15 minutos temperatura ambiente e novamente o tubo era centrifugado a 4oC por 15

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minutos a 12.000 g, e a fase aquosa superior era transferida para um novo tubo. A re-extrao com o reagente TRIZOL foi utilizada para reduzir a contaminao por DNA, lipdeos e protenas. Para precipitar o RNA presente na fase aquosa obtida, 10 g de glicognio eram adicionados e misturados por agitao manual. Em seguida, 500 l de Isopropanol eram adicionados e misturados por agitao manual. A mistura era incubada durante a noite a 20oC sendo ento centrifugada a 4oC por 15 minutos a 12.000 g descartando-se o sobrenatante. O uso do glicognio como carreador do RNA, e a longa incubao durante a noite, garantem uma precipitao mais eficiente das quantidades reduzidas de RNA. O RNA era lavado (para retirada de sais) com a adio de 1ml de etanol 75% ao pellet de RNA, o tubo era agitado e centrifugado a 12.000 g por 15 minutos a 4oC e o sobrenatante era descartado. Finalmente, o pellet era secado levemente e o RNA era ressuspendido em gua (tratada com DEAPC) e incubado por 10 minutos a 60oC sendo ento guardado em freezer a -80oC at ser utilizado. De acordo com o previsto pela literatura, obtivemos cerca de 2x106 clulas CD34+ por amostra de sangue de cordo umbilical (Graf et al, 2001) e de medula ssea (Kinniburgh & Russell, 1993). Pela literatura, 106 clulas CD34+ fornecem cerca de 1 g de RNA total (Graf et al, 2001). Com as modificaes, obtivemos rendimento mdio de 2,5 g (ver resultados).

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Quantificao do RNAO RNA total obtido das amostras foi quantificado em espectrofotmetro utilizando uma equivalncia de 40 g/mL para 1 unidade de Absorbncia (obtida em espectrofotmetro) a 260 nM (Sambrook & Russell, 2001).

Anlise de Qualidade do RNAA pureza do RNA foi avaliada em espectrofotmetro com base na razo A260/A280 (Sambrook & Russell, 2001), e foi adequada para todas as amostras (entre 1,6 e 1,8). A qualidade (integridade) do RNA dos pools utilizados na confeco das bibliotecas de SAGE foi verificada em gel de agarose 1% corado com Brometo de Etdio. Adicionalmente, a qualidade do RNA destas amostras tambm foi verificada por RT-PCR durante o protocolo do SAGE.

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SAGE Anlise Serial da Expresso GnicaAs bibliotecas de SAGE foram produzidas com o uso do kit I-SAGE (Invitrogen, no Cat. T5000-01), seguindo o protocolo do fabricante. Dado o grande nmero de passos envolvidos no protocolo, apenas uma viso geral da abordagem experimental adotada pela tcnica de SAGE ser apresentada a seguir (Figura 4).

Figura 4. Esquema da abordagem experimental adotada pela tcnica de SAGE. (figura obtida do protocolo original, disponvel no Site www.sagenet.org/). Os passos da tcnica de 1 a 13 esto descritos no texto.

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O RNA total de clulas CD34+ de medula ssea e cordo umbilical foi obtido e aps estabelecimento dos pools, sua qualidade foi verificada em gel de agarose com a deteco de ambas as bandas 18S e 28S, indicando a integridade do RNA do pool (Figura 4.1 e 5).

M

MO SCU

28S 18S

Figura 5. Checagem do RNA dos pools. MO, medula ssea. SCU, sangue de cordo umbilical. M, marcador. Cerca de 500ng de RNA total de ambos pools foram aplicados. A maior intensidade da banda 28S e os tamanhos apropriados de 4,5 e 1,9Kb so indicativos de um RNA de boa qualidade.

O RNA total de ambos os pools foi ligado a partculas magnticas revestidas de ligo-dT (Figura 4.2). Os oligos-dT hibridizam com os RNA mensageiros por meio de sua cauda poli-A. Em seguida, foi feita a sntese da primeira fita de cDNA, a partir do RNAm ligado s partculas magnticas (Figura 4.3), utilizando-se a enzima transcriptase reversa SuperScript TM II (Invitrogen). A seguir, foi sintetizada a segunda fita com o uso das enzimas RNAse H, DNA polimerase e DNA ligase. A sntese do cDNA foi confirmada por PCR utilizando primers para amplificar os genes GAPDH e EEF1A1, gerando produtos de 540 e 350 pb, respectivamente, quando o cDNA gerado utilizado como molde (Figura

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6). Como controle positivo e negativo foram realizadas amplificaes com cDNA transcrito a partir de RNA controle de clulas Hela, e sem molde (branco), respectivamente. Os primers de EEF1A1 pertencem a uma regio mais a 3 em seu cDNA enquanto os primers de GAPDH so de uma regio mais a 5 de seu cDNA. Esta diferena permite avaliar a eficincia da transcrio que normalmente tende a favorecer uma melhor representatividade da regio mais a 3dos cDNA.

Figura 6. Avaliao da sntese do cDNA. Em A, PCR em gel de agarose para GAPDH em 2, 3, 4 e 5. PCR para EEF1A1 em 6, 7, 8 e 9. Controle Hela, 2 e 6. Controle Branco, 5 e 9. MO, 3 e 7. SCU, 4 e 8. Em B, esquema dos primers. Marcador em 1.

Aps a confirmao da sntese, o cDNA foi clivado com a enzima de ancoragem (AE) Nla III (Figura 4.4). Para confirmar a clivagem do cDNA, os mesmos primers utilizados na verificao da sntese de cDNA so utilizados. Enquanto os primers de EEF1A1 amplificam uma regio que no possui stio para a enzima Nla III, os primers de GAPDH amplificam uma regio que possui o stio, de tal forma que aps a clivagem do cDNA, a reao de PCR utilizando o produto da reao de clivagem como molde deve ser positiva para EEF1A1 e negativa para GAPDH como pode ser visto (Figura 7).

47

1

2

3

4

5

6

7

8

540pb

GAPD

NlaIIEEF1A1350pb

A

B

Figura 7. Avaliao da clivagem do cDNA com Nla III. . A, PCR em gel de agarose. PCR para GAPDH em 1, 2, 3 e 4 e para EEF1A1 em 5, 6, 7 e 8. PCR utilizando cDNA antes da clivagem como molde, 1, 3, 5 e 7. PCR utilizando cDNA aps a clivagem como molde, 2, 4, 6 e 8. MO, 1, 2, 5 e 6. SCU, 3, 4, 7 e 8. B, Esquema dos primers e da regio clivada por NlaIII.

O cDNA clivado ligado s partculas foi ento dividido em duas fraes iguais, e o cDNA de cada uma delas ligado aos adaptadores A ou B, contendo um stio de reconhecimento para a enzima de etiquetagem, e stios para os primers A (DTP-1) e B (DTP-2), respectivamente (Figura 4.5). Para confirmar a ligao de ambos adaptadores ao cDNA, foi realizado um PCR utilizando o primer reverso para o gene EEF1A1 (EF Anti-sense) e primers especficos para os adaptadores A e B, utilizando o produto da ligao de ambos adaptadores (A e B). A ligao ocorreu com ambos adaptadores, como evidenciado pela amplificao do gene EEF1A1 com os pares de primers mencionados (Figura 8).

48

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

DTP-1

AEF Anti-sense DTP-2

BPrimer DTPAdaptador 1 A 1 B 2 A 2 B 1 A 1 B 2 A 2 B EF Anti-sense

Figura 8. Ligao do cDNA aos adaptadores A e B. MO, 1-4. SCU, 6-9. Na figura esto indicados as combinaes do primer e do adaptador da reao de ligao utilizada como molde. O diagrama mostra as combinaes onde deve haver amplificao. Marcador em 5 e 10.

Uma vez ligados, os cDNAs de ambas fraes foram ento clivados com a aes enzima de etiquetagem (TE) BsmF1. Esta enzima do tipo 2 reconhece o stio do adaptador, adjacente ao sitio de Nla III dos cDNAs da amostra, e cliva aproximadamente 14 pares de bases adiante. Como resultado, o adaptador liberado ligado a um fragmento especfico do cDNA (tag) onde estava ligado (Figura 4.6). As extremidades 5 protuberantes deixadas por BsmF1 nos tags ligados aos adaptadores foram ento preenchidas com o fragmento Klenow da DNA polimerase (Figura 4.7). Com as extremidades preenchidas, os tags (10 a 14pb) ligados aos adaptadores (~40pb) de ambas as fraes foram ligados entre si para a formao de "ditags" de cerca de 100pb (Figura 4.8), a modificao amino terminal na regio 5 do adaptador evita que a ligao ocorra de outra forma que no tag com tag. Os ditags formados foram ento utilizados como molde em 49

diversas reaes de amplificao por PCR com os "primers" A e B. O produto total destas reaes foi ento submetido a uma eletroforese em gel de poliacrilamida, e eletroforese as bandas de cerca de 100 pares de bases foram recortadas do gel, para recuperao e purificao dos fragmentos (Figura 4.9 e figura 9).M

Medula ssea

M

Sangue de Cordo Umbilical

Figura 9. Amplificao e recuperao dos ditags ligados aos adaptadores. As setas em branco indicam a regio do gel recortada correspondendo aos ditags de cerca de 100pb. Marcador 10pb em M.

Uma

vez

recuperados

em

grande

quantidade,

os

ditags

de

aproximadamente 26 pb foram separados dos adaptadores utilizando novamente a enzima Nla III (Figura 4.10), e submetendo o produto da clivagem a uma nova eletroforese em gel de poliacrilamida para recuperao e purificao dos ditags (Figura 2.11 e 10).

50

M

Medula ssea

M

Sangue de Cordo Umbilical

100pb 60pb 40pb 26pb

Figura 10. Separao dos adaptadores e recuperao dos ditags de 26pb. Os fragmentos gerados a partir da digesto esto indicados. 100pb, ditags no digeridos. 40pb, adaptadores. 60pb, digesto parcial. Marcador 10pb em M.

Aps a purificao, os ditags foram ligados para formao dos concatmeros. A reao de ligao dos ditags contendo os concatmeros foi submetida a uma nova eletroforese em gel de poliacrilamida para recuperao e purificao dos concatameros apartir de trs regies distintas do gel, correspondendo aos fragmentos com tamanhos entre: 300-500 pb, 500-800 pb e 800-1000 pb (Figura 4.12 e 11).

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M100

300 500

M

MO 800-1000 500-800 300-500

SCU

M100

300

500

M

Figura 11. Recuperao dos concatmeros. As regies recortadas esto indicadas. Alm dos marcadores de 100pb e , fragmentos de tamanhos conhecidos (aprox. 300 e 500 pb) foram aplicados para garantir uma boa delimitao das regies recortadas.

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Clonagem e Seqenciamento dos ConcatmerosOs concatmeros obtidos foram ento ligados ao vetor pZero-1 (Invitrogen), e as ligaes foram transformadas por eletroporao em bactrias competentes E. coli One Shot TOP10 EletrocompTM (Invitrogen) obtendo as bibliotecas de SAGE (Figura 4.13). As regies dos concatmeros inserida nos clones transformantes foram amplificadas diretamente por PCR de colnia. Resumidamente, as colnias transformantes crescendo no meio seletivo contendo Zeocina, portadoras do concatamero, eram repicadas em placas de cultura de 96 poos com meio liquido para crescer durante a noite. Alquotas das culturas eram ento utilizadas diretamente nas reaes de PCR em placas de 96 poos. Os primers M3 forward e M3 reverse, externos ao stio de clonagem do plasmidio pZero-1, foram utilizados na amplificao. De cada placa de PCR, algumas amostras eram retiradas e aplicadas em gel de agarose para verificar a amplificao antes de proceder purificao dos produtos de PCR (Figura 12).

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Figura 12. Amplificao dos concatameros para sequenciamento. Os produtos aplicados derivam de 2 placas. Os tamanhos dos produtos de PCR refletem a regio dos concatameros recuperados utilizados na ligao com o vetor pZero-1 (de 300 a 500pb). Marcador no primeiro poo.

Os produtos de PCR purificados foram finalmente utilizados como molde na reao de seqenciamento com o uso de Kits DYEnamics ET Terminator Kit (Amersham-Biosciences) sendo ento seqenciados pelo Laboratrio de

Seqenciamento do Hemocentro de Ribeiro Preto, utilizando seqenciadores MegaBace (Amersham-Biosciences).

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Anlises BioinformticasAnlise Serial da Expresso GnicaAs tabelas de freqncia dos tags foi obtida a partir das seqncias utilizando o software Tag SAGE Analysis Software (Invitrogen), com a contagem mnima de tags ajustada para 1 e o tamanho mximo do ditag ajustado para 28 bases; os outros parmetros foram deixados no ajuste padro. A anotao dos tags foi baseada na tabela de associao (mapeamento) disponvel no site SAGEGenie do CGAP (http://cgap.nci.nih.gov/SAGE). A anlise estatstica foi realizada pelo software SAGEstat (Ruijter et al, 2002), que implementa um teste-Z para a comparao entre duas bibliotecas de SAGE.

Anlise de PromotoresPara realizar a anlise de promotores, ns utilizamos um conjunto de ferramentas de bioinformtica on-line chamado Toucan (Aerts et al, 2003) numa abordagem similar de Mayer et al. (Mayer et al, 2004). O nome dos 43 genes expressos em maior nvel na biblioteca de clulas tronco hematopoticas de sangue de cordo umbilical, em comparao com a biblioteca de medula ssea, foram utilizados na obteno das regies promotoras destes genes, que consistiram no trecho de 600 pb acima (ou seja, 5) do primeiro exon. Quarenta e um promotores foram obtidos e submetidos a uma busca por stios de ligao de fatores de transcrio (Transcription Factor Binding Sites - TFBS) utilizando a ferramenta MotifScanner. Como parmetros desta busca, nos selecionamos a

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base de dados TRANSFAC de vertebrados (Wingender et al, 2001) como fonte das matrizes ponderadas por posio (position weight matrices - PWM), e utilizamos um modelo de fundo de 3a ordem derivado de mamferos da base de dados de promotores eucaritico (Eukaryotic Promoter Database - EPD) (Schmid et al, 2004), ajustando o valor do parmetro prior para 0,2. Depois que os stios de ligao de fatores de transcrio foram encontrados, ns realizamos uma anlise na busca de quais stios estariam estatisticamente melhor representados entre os promotores dos genes diferencialmente expressos. Esta anlise leva em conta as freqncias esperadas para stios de ligao dos fatores de transcrio, dado o nmero de pares de base sendo analisado. Estas freqncias so derivadas de buscas de stios de ligao de fatores de transcrio em todos os promotores humanos da base de dados de promotores eucariticos (EPD) utilizando o mesmo valor do parmetro prior.

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PCR em Tempo RealUm micrograma do RNA total de cada amostra foi utilizado na sntese de 50l de cDNA, utilizando o kit High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). O cDNA foi ento diludo 5 vezes para uso nas reaes. A metodologia de PCR em tempo real consiste em acompanhar o nmero de cpias formado na reao de PCR, a cada ciclo. O nmero de cpias proporcional fluorescncia quantificada pelo aparelho que pode ser oriunda da liberao (e ativao) de um fluorocromo prezo a uma sonda especifica (mtodo TaqMan) ou pelo intercalamento (e aumento de fluorescncia) de molculas fluorescentes nos produtos de PCR formados (mtodo SYBRGreen). Uma vez feita a amplificao, um limite de fluorescncia (na fase exponencial da amplificao) estipulado de forma a determinar o ciclo em que cada amostra alcana este limite de deteco, chamado de CT (Cycle Threshold). Para normalizar os valores de CT determinados para as diferentes amostras, de forma a considerar diferenas causadas por quantidades distintas de cDNA, utilizadas nas reaes, o CT determinado para uma amostra (para um determinado gene) subtrado do CT determinado para um gene house-keeping (GAPDH no nosso caso) na mesma amostra, originando o chamado CT. Para um mesmo gene, os valores de CT podem ser diretamente comparados de maneira a obtermos uma quantificao relativa da expresso deste gene em diferentes amostras (MO, SCU e SPM). A cada ciclo, o numero de cpias numa reao de PCR duplica, assim, o numero de ciclos que separa o CT de uma amostra do

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CT de uma outra amostra de referencia (CT), reflete a diferena existente entre as amostras. Esta diferena, em termos de nvel de expresso gnica relativa, obtida de forma aproximada, aplicando a formula 2-CT (Pfaffl, 2001). Para cada gene avaliado, o valor mediano de CT das amostras de MO, foi utilizado como referencia, de modo a obtermos valores de expresso relativos amostra central de MO. Realizamos a quantificao relativa dos genes RELA (p65), RELB, NFKB2 (p52), CCL4 (e CCL4L), IL8, IL1B, TNF e TGFB1, e ICAM1 utilizando o gene GAPDH como normalizador. As reaes de PCR em tempo real foram realizadas em duplicata utilizando mix de sonda e primers TaqMan (Assay on demand) em conjunto com o reagente MasterMix ou primers especficos em conjunto com o reagente SYBrGreen Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). A amplificao foi realizada em um volume final de 20l, utilizando 10l do reagente especfico TaqMan Master Mix (ou SYBrGreen Master Mix), 1l do mix especifico de sonda e primers TaqMan (ou 0,5l de de cada primer especifico), 4l de H2O, e 5l de cDNA diludo (equivalente a aproximadamente 20 ng de RNA total). Um aparelho de deteco de PCR em tempo real 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems) foi utilizado juntamente com o software Sequence Detection System V1.3 para obteno dos valores de CT. Os dados foram ento exportados para planilhas do software Excel para clculo dos valores de CT. O software GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) foi utilizado para gerar os grficos e para calcular a significncia estatstica, aplicando o teste no-paramtrico de Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunns. As condies

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padro de amplificao foram 50C por 2 min, 95C por 10 min, seguidos por 40 ciclos de 95C por 15 seg e 60C por 1min (anelamento e extenso simultneos). As sequencias 5`-3` dos primers forward (-f) e reverse (-r) utilizados em conjunto com o Master Mix SYBrGreen, foram: IL1B-f (TCAGCCAATCTTCATTGCA), IL1B-r (TGGCGAGCTCAGGTACTTCT), ICAM1-f (GCCAACCAATGTGCTATTCA), ICAM1-r (GCCAGTTCCACCCGTTCT), RELA-f (CCACGAGCTTGTAGGAAAGG), RELA-r (CTGGATGCGCTGACTGATAG), TNFA-f (CTCTTCTGCCTGCTGCACTT), TNFA-r (GCCAGAGGGCTGATTAGAGA).

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Resultados__________________________________________________________________

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Amostras Utilizadas nas Bibliotecas de SAGEClulas CD34+ de Medula sseaNove amostras de medula foram selecionadas para realizao do SAGE (Tabela 1). Destas amostras, obtivemos uma mdia de 2*106 clulas CD34+ por amostra, correspondendo a um total de 17,7 *106 clulas. O nmero de clulas por amostra variou de 1 a 3,2 *106. A pureza das amostras variou entre 84 e 99% e a pureza final do pool foi de 94% (Tabela 1). O rendimento de RNA por 106 clulas foi maior do que o esperado variando entre 1,2 a 4,7g com uma mdia de 2,2g de RNA por 106 clulas CD34+. Destas 9 amostras foi possvel obtermos um total de 34g de RNA. Um micrograma de cada amostra foi inicialmente separado com o intuito de validarmos os resultados encontrados pelas anlises do SAGE, por mtodos independentes. Os 25g restantes foram unidos em um nico pool de amostras e deste pool, 5g foram retirados com o mesmo intuito de validao posterior. Os 20g de RNA restante do pool foram utilizados na confeco de uma primeira biblioteca de SAGE. Devido a problemas tcnicos, esta biblioteca no alcanou um nmero mnimo de tags para ser analisado, o que nos obrigou a utilizar as alquotas de RNA inicialmente separadas para validao, para a realizao de uma segunda biblioteca. Desta forma, os 5g de RNA separados do pool, mais os 9g de RNA das diferentes amostras foram unidos em um segundo pool, totalizando um total de 14g de RNA que foram utilizados na confeco da nova biblioteca de RNA.

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Tabela 1. Amostras utilizadas na elaborao da biblioteca de clulas CD34+ de medula ssea. Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 No clulas (106) 1.8 2.0 3.2 2.4 2.5 1.2 2.0 1.6 1.0 Media 2.0 Pureza 96% 97% 97% 99% 90% 95% 99% 84% 90% Mdia 94% RNA Total Amostra (g) 3.9 3.6 3.7 4.0 4.9 3.3 3.8 2.2 4.7 Total 34.0 RNA Total (g) / 106cells 2.2 1.8 1.2 1.7 2.0 2.7 1.9 1.4 4.7 Media 2.2 RNA Total Pool 2.9 2.6 2.7 3.0 3.9 2.3 2.8 1.2 3.7 Total 25.0 Alquota (g) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Total 9.0

Clulas CD34+ de Sangue de Cordo UmbilicalSete amostras de sangue de cordo umbilical foram utilizadas na formao do pool utilizado na confeco da biblioteca de SAGE. Destas amostras, obtivemos uma mdia de 2,3 *106 clulas CD34+ por amostra, correspondendo a um total de 16,3x106 clulas. O nmero de clulas por amostra variou de 0,8 a 66 *10 .

A pureza das amostras variou entre 85 e 92% e a pureza final do pool foi de

89% (Tabela 2). O rendimento de RNA por 106 clulas variou entre 1,2 a 4,4 g com uma mdia de 2,8 g de RNA por 106 clulas CD34+. Destas amostras foi possvel obtermos um total de 35 g de RNA. Da mesma forma que para medula ssea, 1 g de cada amostra foi inicialmente separado para validao posterior. Os 28 g restantes foram reunidos em um nico pool de amostras do qual foram retirados 8 g tambm para validao posterior. Os 20 g de RNA restantes do pool foram utilizados na confeco de uma primeira biblioteca de SAGE. Devido a problemas tcnicos, esta biblioteca tambm no alcanou um mnimo de tags para ser analisado. Desta forma, os 8 g de RNA separados do pool, mais os 7 g de

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RNA das diferentes amostras foram reunidos em um segundo pool, totalizando um total de 15 g de RNA que foram utilizados na confeco da nova biblioteca de RNA.

Tabela 2. Amostras utilizadas na elaborao da biblioteca de clulas CD34+ de sangue de cordo umbilical. Amostra 1 2 3 4 5 6 7 No clulas (106) 6.0 4.0 2.5 1.0 0.8 1.0 1.0 Mdia 2.3 Pureza 91% 89% 92% 92% 87% 85% 85% Mdia 89% RNA Total Amostra (g) 7.3 9.4 5.9 4.2 3.5 2.9 2.1 Total 35.3 RNA Total (g) / 106cells 1.2 2.4 2.4 4.2 4.4 2.9 2.1 Media 2.8 RNA Total Pool 6.3 8.4 4.9 3.2 2.5 1.9 1.1 Total 28.3 Alquota (g) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Total 7.0

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Amostras Utilizadas no PCR em Tempo RealUm total de trinta e sete (37) amostras foram obtidas e utilizadas na validao por PCR em tempo real (Tabela 3): Vinte duas de MO, nove de SCU e seis amostras de sangue perifrico mobilizado com GM-CSF (SPM) foram obtidas para comparao. Um micrograma de cada amostra foi separado para sntese de cDNA e posterior validao.

Tabela 3. Amostras de clulas CD34+ utilizadas na validao por PCR em tempo real. ID MO-1 MO-2 MO-3 MO-4 MO-5 MO-6 MO-7 MO-8 MO-9 MO-10 MO-11 MO-12 MO-13 MO-14 MO-15 MO-16 MO-17 MO-18 MO-19 Nota * Mesmo que MO-2 Mesmo que MO-1 Pureza 96% 88% 97% 96% 92% 82% 85% 97% 92% 94% 92% 86% 55% 75% 88% 90% 92% 90% 89% ID Nota * MO-21 MO-22 MO-23 SCU-1 SCU-2 SCU-3 SCU-4 Dois doadores SCU-5 SCU-6 SCU-7 Pool SAGE-a SCU-8 Pool SAGE-b SCU-9 Pool SAGE-ab SPM-1 SPM-2 SPM-3 Diabetes (autologo) SPM-4 Lupus (autologo) SPM-5 SPM-6 Mieloma (autologo) Total de Amostras Pureza 95% 97% 95% 80% 80% 83% 76% 81% 73% 90% 88% 89% 93% 92% 90% 80% 96% ? 37

Traos falciformes Pool SAGE-a Pool SAGE-b Pool SAGE-ab

* Ver descrio no texto a seguir.

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Amostras de Medula sseaUm total de 22 amostras de medula foram utilizadas para realizao da validao por PCR em tempo real (Tabela 3). As amostras MO-1 e MO-2 correspondem a duas amostras do mesmo doador processadas separadamente e com purezas finais distintas. As amostras MO-8 e MO-9 correspondem, respectivamente, s amostras 1 a 4 e 5 a 9, utilizadas no pool da biblioteca de SAGE (Tabela 1). A amostra MO-10 corresponde ao pool total da biblioteca de SAGE (amostras 1 a 9, Tabela 1). O doador da amostra MO-7 era heterozigoto para anemia falciforme.

Amostras de Sangue de Cordo UmbilicalUm total de 9 amostras de sangue de cordo umbilical foram utilizadas na validao por PCR em tempo real (Tabela 3). A amostra SCU-4 corresponde a clulas de duas amostras de sangue distintas. As amostras SCU-7 e SCU-8 correspondem, respectivamente, s amostras 1 a 2 e 3 a 7, utilizadas no pool da biblioteca de SAGE (Tabela 2). A amostra SCU-9 corresponde ao pool total da biblioteca de SAGE (amostras 1 a 7, Tabela 2).

Amostras de Sangue Perifrico MobilizadoUm total de 6 amostras de sangue perifrico mobilizado foram obtidas (Tabela 3) e utilizadas na validao por PCR em tempo real. As amostras SPM-3, SPM-4 e SPM-6 correspondem a pacientes submetidos a transplante autlogo.

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Perfis de Expresso GnicaUm total de 61.302 e 60.745 tags foram seqenciados das bibliotecas derivadas de medula ssea e de sangue de cordo umbilical correspondendo, respectivamente, a 24.274 e 22.094 tags nicas. Destas, 15.398 e 14.518 tags nicas corresponderam a 10.439 e 9.973 clusters distintos do UniGene, enquanto 8.876 e 7.576 tags no tiveram o transcrito de origem identificado (no matches ou genes desconhecidos). Os perfis completos de ambas as bibliotecas esto disponveis no site http://gdm.fmrp.usp.br/h2g/supplements.html. A comparao direta dos primeiros 1.000 transcritos mais expressos de CTH CD34+ de medula ssea e de sangue de cordo umbilical revelou uma grande semelhana geral. Dos primeiros 1.000 transcritos de CTH de SCU, 977 tambm foram encontrados em CTH de MO (698 destes, tambm entre os primeiros 1.000), por sua vez, dos primeiros 1.000 transcritos de CTH de MO, 985 tambm foram encontrados em CTH de MO (726 entre os primeiros 1.000).

Genes Diferencialmente ExpressosUma comparao direta entre os transcriptomes de ambas as fontes resultou num total de 61 tags expressas com diferenas maiores ou iguais a 2,5 e um valor de p igual ou menor que 0,001. Entre os tags diferencialmente expressos, 45 (correspondendo a 43 genes) estavam mais expressos em SCU (Tabela 4), vrios deles relacionados com a sinalizao por NF-kB (Figura 13A), enquanto que apenas 16 tags estavam mais expressos em MO (Tabela 5).

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Tabela 4. Tags mais expressos nas CTH de SCU em relao a MO. Tag UniGene Descrio ATGCAGAGCT Hs.530049 Hemoglobin, gamma A (HBG1) ATTCAGAGCT Hs.530049 Hemoglobin, gamma A (HBG1) GATAACACAT Hs.75703 Chemokine (C-C motif) ligand 4 CTTCTTGCCC Hs.398636 Hemoglobin, alpha 2 CCCAACGCGC Hs.398636 Hemoglobin, alpha 2 ACTCAGCCCG Hs.525607 Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2 GAAAGATGCT Hs.398989 Brain expressed X-linked 2 GCACCAAAGC Hs.512304 Chemokine (C-C motif) ligand 3-like, centromeric CAATTTGTGT Hs.126256 Interleukin 1, beta CTTCTGCCCC Hs.76480 Ubiquitin-like 4 TTGAAGCTTT Hs.75765 Chemokine (C-X-C motif) ligand 2 CCTGTAATCT Hs.148584 Mesenchymal stem cell protein DSC43 GAATTAACAT Hs.513851 Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5monooxygenase activation protein, epsilon polypeptide ACATTTCCAA Hs.432132 Putative lymphocyte G0/G1 switch gene (G0S2) ATAATAAAAG Hs.89690 Chemokine (C-X-C motif) ligand 3 GGAAGGGGAG Hs.73090 Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 2 (p49/p100) ACACTAAAAT Hs.458276 Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, epsilon GTTCACTGCA Hs.515126 Intercellular adhesion molecule 1 (CD54), human rhinovirus receptor CTAAACTTTT Hs.180919 Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein TCCTTGCTAC Hs.75256 Regulator of G-protein signalling 1 AATGAGCAAC Hs.386567 Guanylate binding protein 2, interferoninducible GCCACCATCA Hs.284244 Fibroblast growth factor 2 (basic) GGAAAAGTGG Hs.525557 Serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 1 TAGTTGGAAA Hs.524430 Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 1 (NR4A1) CTGAGGTGTG Hs.170019 Runt-related transcription factor 3 TGGAAGCACT Hs.624 Interleukin 8 (IL8) TGGGGGCACC Hs.307905 V-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B, nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 3 (avian) TGGGGTTTCC Hs.448223 CDNA FLJ34941 fis, clone NT2RP7007480 AAGGGAGGGT Hs.529892 Sequestosome 1 TCCGTGGTTG Hs.201641 Brain abundant, membrane attached signal protein 1 (BASP1)

SCU 151 61 49 215 118 17 17 66 32 14 14 13 13

MO 1 1 7 6 1 1 4 2 1 1 1 1

Razo 151 61 49 30.7 19.7 17 17 16.5 16 14 14 13 13

12 12 94 11 22 21 21 10 10 10 2 2 2

12 12 11.8 11 11 10.5 10.5 10 10 10

8

19 24 68 26

2 3 9 4

9.5 8 7.6 6.5

32 25 18

5 4 3

6.4 6.3 6 Continua

67

Continuao da tabela 4 TGTTTTCATA Hs.512305 CCAGGCCGGG Hs.119302 CTTCTGGGGA CTGCATCTTA GTCATAGCTG Hs.501728 Hs.73797 Hs.466759

CGACGAGGAG TTGCGTGTGT TAAAAAAAAA CAGTTCTCTG CTGCCAAGTT GGGGCTGTAT

Hs.9999 Hs.1183 Hs.381126 Hs.521487 Hs.490415 Hs.1103

GCAAGAAAGT Hs.523443 GGCTTTACCC Hs.534314 TCAGATCTTG Hs.550542

GCAGTGGGAA Hs.376208

Chemokine (C-C motif) ligand 4-like C1q and tumor necrosis factor related protein 4 Ras homolog gene family, member G (rho G) Guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha 15 (Gq class) Transcribed locus, weakly similar to XP_510104.1 similar to hypothetical protein FLJ25224 [Pan troglodytes] Epithelial membrane protein 3 Dual specificity phosphatase 2 Ribosomal protein S14 Hypothetical protein MGC8721 Zyxin Transforming growth factor, beta 1 (Camurati-Engelmann disease) Hemoglobin, beta (HBB) Eukaryotic translation initiation factor 5A Mediator of RNA polymerase II transcription, subunit 12 homolog (yeast)like Lymphotoxin beta (TNF superfamily, member 3)

18 23 22 32 20

3 4 4 6 4

6 5.8 5.5 5.3 5

39 25 28 40 31 37 101 35 51

8 6 8 12 10 12 34 12 18

4.9 4.2 3.5 3.3 3.1 3.1 3 2.9 2.8

62

23

2.7

Tabela 5. Tags mais expressos nas CTH de MO em relao a SCU. Tag UniGene Descrio AGCATCTCCA Hs.535791 LOC441069 AAGATTGGTG Hs.114286 CD9 antigen (p24) TCTGCAAAGG Hs.434953 High-mobility group box 2 ATCACGAAGG Hs.369921 Vav 2 oncogene TTTATGACTG Hs.534206 Deoxynucleotidyltransferase, terminal GCCTGCTATT Hs.380781 Defensin, alpha 1, myeloid-related sequence GGCTGGGGCC Hs.99863 Elastase 2, neutrophil (ELA2) TGTTTGTGTG Hs.440494 Chemokine-like factor super family 7 GAAGAGGGTG Hs.247979 Pre-B lymphocyte gene 1 CTGGCCCGAG Hs.504877 Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) beta CACGAAGGGA Hs.348935 Immunoglobulin lambda-like polypeptide 1 GACCCAACTG Hs.89575 CD79B antigen (immunoglobulinassociated beta) GTGCGCTGAG Hs.534125 Major histocompatibility complex, class I, C GCTCCCCTTT Hs.458272 Myeloperoxidase GTAATCCTGC Hs.443609 Solute carrier organic anion transporter family, member 5A1 AAGGTCGAGC Hs.477028 Ribosomal protein L24

SCU 1 1 1 1 2 1 2 2 7 6 20 11 12 15 19 12

MO 30 29 19 16 30 15 22 19 61 39 121 61 61 61 76 38

Razo 30 29 19 16 15 15 11 9.5 8.7 6.5 6.1 5.5 5.1 4.1 4 3.2

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Baseado em comparaes com dados publicados por Ng e colaboradores (veja abaixo), um valor de p menos estringente (0,05) foi utilizado para dar uma viso geral das diferenas moleculares entre as CTH destas duas fontes. Com esse valor de p, um total de 493 tags foram diferencialmente expressos com diferenas maiores ou iguais a 2,5, dos quais 271 eram mais expressos em SCU e 222 em MO. Entre os genes com valores de p maiores, estavam outros genes relacionados com a via NF-kB como RELA, NFKB1, IL1A, TNF, e os receptores de TNF (TNFRSF1B e TNFRSF4) (Figura 13A).

69

Figura 13. Sinalizao por NF-kB e alvos transcricionais nas CTH de SCU. (A) Representao esquemtica da sinalizao por NF-kB com alguns dos genes mais expressos nas CTH de SCU. (B) Heatmap ilustrando o nmero de ocorrncias de diferentes stios de ligao de NF-kB. A anlise de promotores revelou cinco stios de ligao de NF-kB significativamente bem representados nos promotores de 22 dos 43 genes analisados. O nmero de ocorrncias de cada stio representado como se segue: nenhum (branco), um (cinza claro), dois (cinza escuro) e trs (preto). Os stios de ligao esto em ordem decrescente de significncia da esquerda para a direita. Os nmeros de acesso das matrizes de identificao dos stios (Transfac) esto em parnteses. M00208 no estava entre os stios considerados significativos. Nucleus (ncleo), transcription targets (alvos transcricionais).

70

Comparao com Dados PublicadosDois estudos de expresso previamente publicados de CTH CD34+ de MO e SCU nos permitiram comparar diretamente e validar nossos dados preliminares de SAGE. O Primeiro consistiu de experimentos de microarray baseados em chips Affymetrix (Ng et al, 2004) e o segundo se baseou em bibliotecas no normalizadas de ESTs (Expressed Sequence Tags) (Gu et al, 2000;Mao et al, 1998). A comparao dos 51 genes, selecionados por Ng e colaboradores, com nossos dados corroborou expressos, amplamente encontramos, nosso em estudo. nossos Dos dados, 51 15 genes genes

diferencialmente

diferencialmente expressos com valor de p menor ou igual a 0,05 (Tabela 6). Todos, menos um, eram altamente concordantes, o restante dos genes no eram expressos suficientemente (baixo nmero de tags) e conseqentemente no puderam ser comparados com confiana estatstica. Apesar disso, a grande maioria dos genes mostrou contagem diferencial de tags concordante com os resultados de Ng e colaboradores. Dos oito genes apontados por Gu e colaboradores, um era de origem mitocondrial e no aparece na anlise de SAGE; dos sete restantes, trs genes eram concordantes com valor de p menor ou igual a 0,05 e incluram timosina beta 4 (TMSB4X), mais expressa em CTH de MO, e as globinas beta e gamma (HBB e HBG), mais expressas em CTH de SCU. Os genes discordantes incluram os antgenos HLA de classe II (DR e DP), a subunidade VIc da citocromo C oxidase

71

(COX6C) e a interleucina 8 (IL8), tambm em desacordo com os resultados de Ng e colaboradores (Tabela 6). Adicionalmente, entre os genes selecionados por ns (Tabela 4), 5 eram comuns aos genes selecionados por Ng e 2 eram comuns aos selecionados por Gu. Dado o fato de que nosso critrio de seleo com valor de p igual ou menor que 0,001 excluiu genes validados do estudo independente realizado por Ng, ns decidimos reduzir a estringncia, aumentando o valor de p para 0,05, que era suficiente para indicar diferenas reais, como evidenciado pela concordncia entre 14 entre 15 genes co-selecionados em ambos estudos.

72

Tabela 6. Genes para os quais nossos resultados e os de Ng et al. concordam quanto s diferenas de expresso em clulas tronco hematopoticas de medula ssea e sangue de cordo umbilical.

UniGene Hs.99863 Hs.728

Gene ELA2 RNASE2

Melhor tag GGCTGGGGCC TGACAACAGA

Ng et al. Razo 10 4.4

Hs.421724 Hs.515122 Hs.409065 Hs.512680

CTSG TK1 FEN1 SCGF

AGGAGGGGAA CTCCCTCCTC CGCTGTTTTT GGGCTCGGGG

4.2 2.9 2.8 2.8

Hs.201641 Hs.78824

BASP1 TIE1

TCCGTGGTTG CCCTGTTCAG

2.7 3.0

Hs.315177 Hs.524430 Hs.432132 Hs.128433 Hs.282376 Hs.112405 Hs.624

IFRD2 NR4A1 G0S2 PGDS RPS4Y1 S100A9 IL8

GGGTGGGTAG TAGTTGGAAA ACATTTCCAA CTCCCTCCCC TGAAGGATGC GTGGCCACGG TGGAAGCACT

3.0 3.6 5.3 6.8 6.9 6.9 10.3

Nossos dados Descrio SCU MO 2 22 Elastase 2, neutrophil 1 8 Ribonuclease, RNase A family, 2 (liver, eosinophil-derived neurotoxin) 4 Cathepsin G 4 Thymidine kinase 1, soluble 4 Flap structure-specific endonuclease 1 2 12 Stem cell growth factor; lymphocyte secreted C-type lectin 18 3 Brain abundant, membrane attached signal protein 1 5 Tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGFlike domains 1 5 Interferon-related developmental regulator 2 19 2 Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 1 12 Putative lymphocyte G0/G1 switch gene 4 Prostaglandin D2 synthase, hematopoietic 1 10 Ribosomal protein S4, Y-linked 1 63 29 S100 calcium binding protein A9 (calgranulin B) 68 9 Interleukin 8

Dos 51 genes apresentados no estudo de Ng e colaboradores (Ng et al, 2004), 15 puderam ser comparados com nossos dados (ver texto). Destes, apenas o gene RPS4Y1 (em negrito) foi discordante. A descrio dos genes fornecida por Ng foi utilizada para identificar o cluster de identificao do gere (Unigene). O melhor tag representando este cluster foi utilizado para comparao direta com nossos dados de SAGE. O valor negativo da razo (obtida do estudo de Ng) indica a expresso reduzida deste gene em CTH de SCU.

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Alvos Transcricionais de NFKB em CTH de SCUEntre os genes diferencialmente expressos mais abundantes nas CTH de SCU, ns encontramos duas subunidades do complexo transcricional de NFKB, NFKB2 e RELB, o que nos fez estudar o papel da sinalizao por NFKB nas diferenas moleculares observadas entre as CTH destas diferentes fontes.

Anlise de PromotoresDado os indcios da participao do fator transcricional NFKB na ativao dos genes diferencialmente expressos abundantes nas clulas tronco

hematopoticas CD34+ de sangue de cordo umbilical, ns decidimos avaliar se outros genes abundantes em CTH de SCU poderiam tambm ser alvos transcricionais de NFKB. Para isso, ns utilizamos uma abordagem similar de Mayer e colaboradores (Mayer et al, 2004), utilizando o conjunto de ferramentas bioinformticas on-line Toucan para investigar a presena (e sua significncia) de stios de ligao de NFKB nos promotores dos genes cuja expresso estava aumentada em CTH de SCU, em relao a MO (41 dos 43 na Tabela 4). Aps identificar os stios de ligao para diferentes fatores de transcrio nos promotores, foi realizada uma anlise para identificar entre estes quais eram estatisticamente mais freqentes em relao ao esperado, com base nas freqncias determinadas para um amplo conjunto de promotores de mamferos. A anlise revelou que cinco stios de ligao de NF-kB estavam entre os stios mais significativamente representados, distribudos entre os promotores de 22 dos 41 genes avaliados (Figura 13B). Buscando na literatura, ns pudemos

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identificar, entre estes genes, no apenas outros participantes na ativao e sinalizao de NFKB, mas tambm vrios alvos transcricionais conhecidos deste fator, incluindo CXCL2, CXCL3, ICAM1, IL8, IL1B, NFKB2 e RELB (Anisowicz et al, 1991;Bren et al, 2001;Collins et al, 1995;Jaramillo et al, 2005;Liptay et al, 1994;Stein & Baldwin, Jr., 1993). Alem destes alvos conhecidos, outros alvos transcricionais de NFKB, em potencial, foram identificados (Figura 13B).

PCR Quantitativo dos Genes SelecionadosAs diferenas observadas pela anlise serial da expresso gnica para os nove genes selecionados, foram validadas por PCR em tempo real (Figura 14), dando suporte nossa idia de que uma maior sinalizao constitutiva de NF-kB uma caracterstica distintiva das CTH CD34+ de SCU. Adicionalmente, os resultados obtidos nas amostras de SPM, foram similares aos obtidos nas amostras de MO, exceto para o gene TGFB1, que se portou como nas amostras de SCU (Figura 14).

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Figura 14. Validao dos genes relacionados com a via NF-kB por PCR em tempo real. PCR quantitativo foi realizado em amostras de CTH CD34+ isoladas de MO (n=22), SCU (n=9) e SPM (n=6). A expresso gnica mostrada como a razo (Fold) relativa expresso gnica mediana das amostras de MO (em log de base 2). As diferenas entre MO e SCU foram todas significantes (P