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Tese de Doutorado

PREPARAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE

NANOCOMPÓSITOS DE QUITOSANA/QUANTUM DOTS

FLUORESCENTES

Thatiana Montenegro Stamford Arnaud

Recife – PE, Brasil.

Setembro, 2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DOS MATERIAIS

Tese de Doutorado

PREPARAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE

NANOCOMPÓSITOS DE QUITOSANA/QUANTUM DOTS

FLUORESCENTES.

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências de Materiais da

Universidade Federal de Pernambuco para obtenção

do Título de Doutor em Ciências de Materiais.

Orientação: Profa. Dra. Patrícia M. A. Farias

Thatiana Montenegro Stamford Arnaud

* Bolsista CNPq

Recife – PE, Brasil.

Setembro, 2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DOS MATERIAIS

Thatiana M. Stamford _________________________________________ Dedicatória

Aos meus pais que me ensinaram

com seus próprios exemplos de vida.

Thatiana M. Stamford ______________________________________ Agradecimentos

AGRADECIMENTOS

À Professora Dra. Patrícia Maria de Albuquerque Farias pela criatividade da elaboração

deste projeto, por sua firmeza em exigir resultados e principalmente por sua sinceridade,

apoio intelectual e persistência por acreditar no meu potencial.

Ao CNPq, pela bolsa concedida.

Ao Magnífico Reitor da Universidade Federal de Pernambuco, Professor Dr. Anísio

Brasileiro de Freitas Dourado e ao Vice- Reitor Prof. Sílvio Romero.

Ao Professor Dr. Eduardo Henrique Lago Falcão, Coordenador do Programa de Pós-

Graduação de Ciências dos Materiais e ao Vice - Coordenador Eduardo Padrón

Hernández pela nova administração.

Ao Professor Dr. André Galembeck por possibilitar o uso do viscosímetro do seu

laboratório, necessário para a caracterização do peso molecular da quitosana.

À Professora Dra. Giovannia Pereira pela ajuda em algumas etapas dos procedimentos

experimentais além do imenso apoio moral e intelectual.

Ao Professor Dr. Celso Pinto de Melo, por permitir a realização das análises de medidas

de tamanho por Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS). Como também alguns espectros

de emissão e excitação dos Quantum Dots.


À Professora Dra. Magali pelo acesso ao freezer de -80ºC do Departamento de

Antibióticos, para acondicionamento das amostras a serem liofilizadas posteriormente

no Departamento de Química Fundamental.

Ao Professor Severino Alves Júnior do Departamento de Química Fundamental, por

disponibilizar o liofilizador do seu laboratório.

A Daniela e Iane por liofilizarem várias amostras de quitosana.

À Central Analítica do Departamento de Química Fundamental, especialmente à técnica

Eliete, pela disponibilidade e ajuda durante as medidas de ressonância magnética

nuclear, análise elementar e espectroscopia vibracional na região do infravermelho.

Ao CETENE que por intermédio da Dra. Cristina Peixoto, possibilitou a realização de

experimentos de Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), dos quais resultou a

aquisição de imagens das nanopartículas de quitosana.

Às técnicas do CETENE Gabriela, Joelma e Conceição, pelo apoio na preparação das

amostras para a visualização no Microscópio Eletrônico de Transmissão.

À Dra. Catarina Raposa que prestou imenso auxílio durante as análises de Microscopia

Eletrônica de Transmissão.

À Dra Horacina que possibilitou a realização do teste do HET-CAM e à Professora

Dra. Terezinha por disponibilizar todo o material dos testes de toxicidade assim como

as células neoplásicas de pulmão.


A técnica Maria e a aluna Sandrine pelo auxílio durante os testes de toxicidade pelo

método de MTT.

Aos colegas do Laboratório de Biofísica-química Professor Ricardo Ferreira,

Giovannia, Antonio, Cida, Rafael, Claudilene, Denise, Diego, Kilmara, Aluizio,

Clayton, Thiago, Bruno, Paulo e Polyana pela agradável convivência. Em especial, aos

colegas Antonio e Paulo Euzébio, pelo auxilio no Microscópio de fluorescência.

Aos funcionários da Secretaria do Programa de Pós-graduação em Ciência de Materiais,

Carlos, Esaú, Heloisa, Maria da Conceição, Andreza e Aylla Tainara.

Ao meu marido, Adrian, por sempre me ajudar nas realizações dos meus sonhos.

Ao meu filho, Gabriel, pela compreensão, apoio, otimismo e principalmente por

ensinar-me a valorizar todos os momentos vividos.

Aos meus pais, Newton e Tânia, pelo apoio incondicional em todas as etapas da minha

vida. A vocês, que me ensinaram princípios como honestidade, responsabilidade e

sempre acreditarem em mim, o meu amor e a minha eterna gratidão.

À minha irmã, Thayza, pela inspiração, ajuda e incentivo nesta jornada.

A todas as pessoas que, com a mais simples palavra, atitude ou auxílio, contribuíram

direta ou indiretamente na elaboração deste trabalho.

Thatiana M. Stamford ____________________________________________________

“A maior recompensa para o trabalho do

homem não é o que ele ganha com isso, mas o

que ele se torna com isso”.

Jhon Ruskin

Thatiana M. Stamford ____________________________________________ Resumo

RESUMO

O desenvolvimento de novos materiais baseados no uso da quitosana, a serem empregados

em aplicações tecnológicas e biomédicas, é um campo de pesquisa que tem despertado grande

interesse. Partículas nanométricas de quitosana têm sido utilizadas com eficiência como carreadores

de fármacos, e recentemente, estão sendo estudadas como funcionalizantes de marcadores tumorais.

Alguns trabalhos relatam a incorporação de compostos fluorescentes, tais como o FITC

(Isotiocianato de Fluoresceína) em nanopartículas de quitosana para a marcação de cultura de

células neoplásicas. No entanto, os fluoróforos orgânicos apresentam elevada fotoinstabilidade,

além de alto grau de toxicidade em relação a sistemas biológicos. Portanto, o presente trabalho

propõe a síntese de quantum dots de semicondutores e sua funcionalização com nanopartículas de

cloridrato de quitosana (NCQ) obtidas através do método de gelificação iônica com o tripolifosfato

de pentasódio (TPP). Para saber qual a NCQ ideal para esta funcionalização foi feito um estudo

preliminar variando o grau de desacetilação e despolimerização a fim de obter nanopartículas com

propriedades específicas para a aplicabilidade sugerida no presente trabalho. As técnicas utilizadas

para obter a caracterização estrutural, grau de desacetilação e despolimerização das quitosanas

foram respectivamente: espectroscopia vibracional na região do infravermelho, análise elementar /

ressonância magnética nuclear e medidas de viscosidade. A caracterização morfológica das

nanopartículas de quitosana e a determinação do tamanho médio das partículas foram realizadas

através da microscopia eletrônica de transmissão (MET) e por medidas de espalhamento dinâmico

de luz (DLS), respectivamente. A estabilidade do nanocompósito foi verificada através de medidas

de Potencial Zeta. Foram feitos testes de biocompatibilidade dos nanocompósitos através da

membrana corialantóide do ovo e pelo método do MTT. A marcação deste nanocompósito inédito

em células neoplásicas pulmonares (linhagem NCI-H292) foi observada pela microscopia de

fluorescência. Os resultados obtidos comprovaram que o CdS passivado com Cd(OH) e

funcionalizado com NCQ na proporção de 50:1 conseguiu marcar culturas de células de câncer de

pulmão. Os testes realizados com as membranas corialantóide do ovo sugeriram que o CdS e o

CdS/Cd(OH)2 são irritantes. No entanto, o método de MTT mostrou que o CdS/Cd(OH)2, as NCQ e

o NC não apresentam atividade citotóxica.

Palavras-chaves: quantum dots, nanopartículas de cloridrato de quitosana, gelificação

iônica, marcação celular, neoplasias pulmonares, HET-CAM, método do MTT.

Thatiana M. Stamford _____________________________________________Abstract

ABSTRACT

The development of new materials based on the use of chitosan, to be used in biomedical

and technological applications, is a field of research that has attracted great interest.

Nanosized particles of chitosan have been used effectively as carriers of drugs, and recently,

are being studied as functionalizing of tumor markers. Some studies have reported the

incorporation of fluorescent compounds, such as FITC (fluorescein isothiocyanate) on

chitosan nanoparticles for marking culture of neoplastic cells. However, organic

fluorophores have high fotoinstabilidade, and high degree of toxicity to biologic systems.

Therefore, this paper proposes the synthesis of semiconductor quantum dots and their

functionalization with nanoparticles of chitosan hydrochloride (NCQ) obtained by ionic

gelation method with pentasódio tripolyphosphate (TPP). To learn what NCQ ideal for this

functionalization was done a preliminary study by varying the degree of deacetylation and

depolymerization to obtain nanoparticles with specific properties for the applicability

suggested in this work. The techniques used for structural characterization, degree of

deacetylation and depolymerisation of chitosans were respectively vibrational spectroscopy

in the infrared region, elemental analysis / NMR and viscosity measurements.

Morphological characterization of chitosan nanoparticles and determining the average

particle size were performed by transmission electron microscopy (TEM) and by

measurements of dynamic light scattering (DLS), respectively. The stability of the

nanocomposite was verified by measurements of Zeta Potential. Tests were made

biocompatibility of the nanocomposites through the membrane and egg chorioallantoic by

the MTT method. The marking of the nanocomposite unprecedented in lung cancer cells

(NCI-H 292 strain) was observed by fluorescence microscopy. The results proved that the

CdS passivated with Cd (OH)2 and functionalized with NCQ at 50:1 ratio to score cell

cultures of lung cancer. The tests performed with the egg chorioallantoic membranes

suggested the CdS CdS and / Cd (OH)2 are irritating. However, the method of MTT showed

that CdS / Cd (OH) 2, and CN NCQ do not exhibit cytotoxic activity.

Keywords: quantum dots, nanoparticles of chitosan hydrochloride, ionic gelation, cell

labeling, lung cancer test, HET-CAM, MTT method.


LISTA DE FIGURAS

Páginas

Figura 01: Estrutura química da quitina e da celulose. ................................................... 22

Figura 02: Esquema da reação de N-desacetilação da quitina para obtenção de

quitosana através de hidrolise por hidróxido de sódio. ....................................................

23

Figura 03: Estrutura química da quitosana. .................................................................... 23

Figura 04: Diferentes nanopartículas com aplicação farmacêuticas: (A) nanoesfera

(sistema matricial) e (B) nanocápsula (sistema reservatório)...........................................

Figura 05: Método de copolimerização interfacial para se preparar nanocápsulas.........

Figura 06: Interação iônica entre a quitosana e o tripolifosfato de sódio (TPP)..............

Figura 07: Esquema de formação de um éxciton. h+ representa o buraco gerado na

banda de valência, pela excitação do elétron e-................................................................

26

27

28

31

Figura 08: Soluções de quantum dots de CdSe, sob iluminação UV............................. 32

Figura 09: Propriedades ópticas de semicondutores - quantum dots .............................. 33

Figura 10: Fotodegração em função do tempo: antígenos nucleares corados com

Alexa Fluor 488 e microtúbulos corados com QD 605- CdSe (Tempos observados: 0s,

20s, 60s, 120s e 180s) ......................................................................................................

35

Figura 11: Espectros de excitação e emissão típicos de quantum dots (esquerda) e

moléculas orgânicas (direita) utilizados como marcadores fluorescentes em

microscopia confocal ........................................................................................................

35

Figura 12: Redução do tamanho de partículas semicondutoras dentro do regime de

confinamento quântico (Eg= energia da banda proibida, “band gap”; BC= banda de

condução e BV= banda de valência) ................................................................................

37

Figura 13: Espectros de absorção (linhas contínuas) e emissão (linhas pontilhadas) de

quantum dots de CdSe com diferentes tamanhos. Os picos de absorção de nanocristais

com diâmetro de 2.3 /4.0 /3.8 /4.6nm estão em 507 /547 /580 /605nm. Os picos da

fluorescência estão em 528 /570 /592 /637 nm ................................................................

42

Figura 14: Representação esquemática da funcionalização do quantum dot .................. 44

Figura 15: Variação do Potencial Zeta de uma solução em função do pH...................... 46

Figura 16: Potenciais aplicações de quantum dot em sistema biológico ........................ 47

Figura 17: Disseminação de células tumorais (metástase) ............................................. 50

Figura 18: Representação do acúmulo de nanopartículas em regiões tumorais devido

ao efeito EPR ....................................................................................................................

51


Figura 19: Obtenção de uma linha celular a partir de um tecido..................................... 53

Figura 20: Estruturas do ovo fertilizado: (a) casca do ovo; (b) membrana

carialantóide; (c) clara e (d) câmara aérea .......................................................................

55

Figura 21: Representação da preparação de quantum dots de sulfeto de cádmio ........... 65

Figura 22: Passivação de quantum dot de CdS com Cd(OH)2 ........................................ 55

Figura 23: Representação da passivação da suspensão de quantum dots de CdS com

hidróxido de cádmio Cd(OH)2 e luminescência após passivação ....................................

65

Figura 24: Síntese (CdS), passivação (CdS/Cd(OH)2) e funcionalização do quantum

dot com NCQ (Nanocompósito: CdS/Cd(OH)2 + NCQ) ...............................................

69

Figura 25: Imagens das etapas experimentais do teste de irritabilidade: (a) Ovos no

10º dia de incubação; (b) Remoção da casca externa; (c) Eliminação de membrana

branca, previamente umidificada com água destilada; (d) Membrana Corialantóide do

ovo; (e) Aplicação da amostra e (f) Observação por 5 minutos........................................

70

71

Figura 26: Frasco de cultura contendo células descongeladas em manutenção ............. 75

Figura 27: Esquema da quitina/quitosana com as numerações dos prótons que

aparecem no RMN 1H.......................................................................................................

75

Figura 28: Interações intramoleculares e intermoleculares em/entre as cadeias de

quitosana ...........................................................................................................................

81

Figura 29: Espectro de RMN 1H da Quitosana Comercial (QC) .................................... 82

Figura 30: Espectro de RMN 1H da quitosana Desacetilada (QD) ................................. 83

Figura 31: Imagens de MET das nanopartículas de quitosana preparadas com

quitosana (a) comercial (b) desacetilada (c) desacetilada e despolimerizada...................

90

Figura 32: Imagens de MET das nanopartículas de quitosana preparadas com (a)

Quitosana Comercial Despolimerizada com peróxido a 5%. (NQCD5%) e (b)

Quitosana Comercial Despolimerizada com peróxido a 15% (NQCD15%) ...................

90


Quitosana Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 5% (NQDD5%) e (b)

Quitosana Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 15% (NQDD15%)................

91

Figura 34: Imagem de MET de nanopartículas de quitosana obtidas por gelificação

iônica usando o Triton X-100 como surfactante...............................................................

92

Figura 35: Histogramas com distribuição de tamanho das nanopartículas de (a)

Quitosana Comerciale Despolimerizada com peróxido a 5%. (QCD5%), (b) Quitosana

Comercial Despolimerizada com peróxido a 15% (QCD15%), (c) Quitosana


Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 5% (QDD5%) e (d) Quitosana

Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 15% (QDD15%) ...................................

94

Figura 36: Distribuição de tamanho das nanopartículas produzidas por quitosana (a)

comercial, (b) despolimerizada (c) desacetilada (d) desacetilada e despolimerizada.......

96

Figura 37: Estrutura do cloridrato de quitosana .............................................................. 101

Figura 38: Espectro de absorção da suspensão de nanopartículas de CdS/Cd(OH)2..... 102

Figura 39: Espectros de excitação (a) e emissão (b) da suspensão de CdS/Cd(OH)2

representados pela intensidade normalizada (u.a) versus comprimento de onda (nm).....

103

Figura 40: Microfotografia da membrana corioalantóide. (A) Aparência normal do

epitélio e de seus componentes e (B) Controle positivo de irritação NaOH a 0,1N,

visualizando hemorragia (H), lise vascular (L) e coagulação (C) ....................................

109

Figura 41: Imagem da microscopia de fluorescência de células neoplásicas

pulmonares com meio de cultura DMEN (Grupo:BRANCO)..........................................

111

Figura 42: Imagens de microscopia de fluorescência de células neoplásicas

pulmonares com meio de cultura DMEN e NCQ

(2,5mg/mL)..........................................

112


pulmonares com meio de cultura DMEN e CdS/Cd(OH)2...............................................


pulmonares com meio de cultura DMEN e NC (CdS/Cd(OH)2 com Glutaraldeído)......

113

114

Figura 45: Imagens de microscopia de fluorescência no visível de células neoplásicas

pulmonares com: a) meio de cultura DMEN e b) DMEN com NC (1:10) ......................

115


pulmonares com meio de cultura DMEN e NC (50:1)......................................................

116


pulmonares com meio de cultura DMEN e NC (100:1)....................................................

116


LISTA DE TABELAS

Páginas

Tabela 01: Parâmetros físicos para semicondutores.................................................. 38

Tabela 02: Classificação do potencial de irritação das substâncias de acordo com

o teste de irritabilidade HET-CAM ...........................................................................

72

Tabela 03: Classificação do potencial citotóxico das amostras de acordo com o

Método do MTT ........................................................................................................

73

Tabela 04: Atribuição das bandas do infravermelho da Quitosana Comercial (QC)

e da quitosana Desacetilada (QD) .............................................................................

78

Tabela 05: Integração dos picos do espectro de RMN 1H da Quitosana antes e

depois da desacetilação para o cálculo do grau de desacetilação...............................

83

Tabela 06: Valores dos graus de desacetilação em porcentagem da quitosana

determinados por RMN 1H, a partir de duas equações distintas.................................

84

Tabela 07: Percentuais de carbono, nitrogênio, hidrogênio, a relação carbono /

nitrogênio e o grau de desacetilação das amostras de Quitosana Comercial (QC) e

da Quitosana Desacetilada (QD) ...............................................................................

85

Tabela 08: Valores da viscosidade intrínseca e da massa molar viscosimétrica

média das quitosanas estudadas .................................................................................

88

Tabela 09: Atribuições das bandas do infravermelho das nanopartículas de

cloridrato de quitosana (NCQ) ...................................................................................

88


nitrogênio e o grau de desacetilação da amostra de nanopartículas de cloridrato de

quitosana (NCQ) ........................................................................................................

99

Tabela 11: Valores da viscosidade intrínseca e da massa molar viscosimétrica

média das nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ) ....................................

99

Tabela 12: Valores de potenciais encontrados para as amostras testadas ................ 105

Tabela 13: Potencial de irritação da água destilada (AD), Solução salina 0,9% (SS

0,9%), Sulfeto de cádmio (CdS) , Sulfeto de cádmio passivado com camada de

hidróxido de cádmio (CdS/Cd(OH)2), Nanopartícula de cloridrato de quitosana

(NCQ), Nanocompósito (NC) para o teste da Membrana Corialantoide do ovo

HET-CAM) para vasoconstricção, hemorragia e coagulação. Controle positivo:

lauril sulfato de sodio 1% (LSS1%). ........................................................................

106


Tabela 14: Valores de absorbância (Abs.) e percentual de Inibição de Crescimento

Celular (% IC) obtidos para o grupo controle, CdS/Cd(OH)2, NCQ e NC.................

110


LISTA DE ABREVIATURAS

A Absorbância

A 1655 Absorbância no comprimento de onda 1655 cm-1

A 3450 Absorbância no comprimento de onda 3450 cm-1

C % Percentual de carbono

C/N Relação entre carbono e nitrogênio

EPR Enhanced Permeation and Retention

CCS Centro de Ciências da Saúde

D2O Óxido de deutério

DLS Espalhamento Dinâmico de Luz

EA Análise Elementar

GD% Percentual do Grau de Desacetilação

H% Percentual de hidrogênio

H2 Núcleo de hidrogênio na posição 2 do anel glicopiranosídico

HET-CAM Hen’s Egg Test on Chorio- Allantoic Membrane

MET Microscopia Eletrônica de Transmissão

MTT Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]

µm Micrômetro(s)

Nm Nanômetro(s)

QC Quitosana Comercial

QCD5% Quitosana Comercial Despolimerizada 5%

QCD15% Quitosana Comercial Despolimerizada 15%

QDs Quantum dots

QD Quitosana Desacetilada

QDD5% Quitosana Desacetilada e Despolimerizada 5%

QDD15% Quitosana Desacetilada e Despolimerizada 15%

NQCD5% Nanopartícula de Quitosana Comercial Despolimerizada 5%

NQCD15% Nanopartícula de Quitosana Comercial Despolimerizada 15%

NQDD5% Nanopartícula de Quitosana Desacetilada e Despolimerizada 5%

NQDD15% Nanopartícula de Quitosana Desacetilada e Despolimerizada 15%

NCQ Nanopartícula de Cloridrato de Quitosana

NC Nanocompósito

TPP Tripolifosfato de pentasódio

Thatiana M. Stamford __________________________________________________

SUMÁRIO

Páginas

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 20

1.1. QUITINA E QUITOSANA.......................................................................... 20

1.1.1. Histórico ............................................................................................ 20

1.1.2. Considerações ................................................................................... 21

1.1.3. Propriedades ..................................................................................... 24

1.2. NANOPARTÍCULA DE QUITOSANA .................................................... 25

1.2.1. Método de Gelificação Iônica........................................................... 28

1.3. QUANTUM DOTS...................................................................................... 29

1.3.1. Nanopartículas de semicondutores: quantum dots ......................

1.3.2. Confinamento quântico dos quantum dots ....................................

1.3.3. Obtenção e características dos quantum dots ................................

1.3.4. Colóides .............................................................................................

1.3.5. Propriedades ópticas dos quantum dots .........................................

1.3.5.1. Espectros de absorção e emissão .............................................

1.3.6. Passivação .........................................................................................

1.3.6.1. Sulfeto de Cádmio (CdS) ........................................................

1.3.7. Funcionalização ................................................................................

29

30

36

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41

41

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43

44

1.3.6.1. Potencial Zeta .........................................................................

1.3.8. Aplicação do Quantum Dot em Sistema Biológico ........................

1.4. ALGUMAS CONSIDERAÇÕES BIOLÓGICAS SOBRE O SISTEMA

ESTUDADO ...........................................................................................................

1.4.1. Câncer ...............................................................................................

1.4.2. Cultura Celular.................................................................................

1.4.3. Carcinoma de Células Escamosas de Câncer de Pulmão ...........

1.5. TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE .......................................................

1.5.1. Teste de irritabilidade por HET-CAM .........................................

1.5.2. Teste de Toxicidade pelo Método do MTT ....................................

1.6. APLICAÇÃO DE NANOCOMPÓSITO EM SISTEMA BIOLÓGICO ........

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55

55

56

56


2. OBJETIVOS ...................................................................................................... 58

2.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................... 58

2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO ........................................................................... 58

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ......................................................... 59

3.1. OBTENÇÃO DA QUITOSANA ................................................................. 59

3.1.1. Desacetilação da quitosana ................................................................. 59

3.1.2. Despolimerização da quitosana .......................................................... 59

3.2. PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA ............ 60

3.2.1. Método de Gelificação Iônica ........................................................... 60

3.3. OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE CLORIDRATO DE

QUITOSANA .....................................................................................................

61

3.4. CARACTERIZAÇÃO DAS QUITOSANAS............................................... 62

3.4.1. Caracterização estrutural ................................................................ 62

3.4.1.1. Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho ............ 62

3.4.2. Grau de desacetilação ...................................................................... 62

3.4.2.1. Ressonância Magnética Nuclear ................................................ 62

3.4.2.2. Análise Elementar ...................................................................... 63

3.4.3. Massa Molar ..................................................................................... 63

3.4.3.1. Medidas de Viscosidade .............................................................. 63

3.5. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPATÍCULAS DE QUITOSANA ....... 63

3.5.1. Medidas de Tamanho por Espalhamento Dinâmico de Luz ........ 63

3.5.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão ....................................... 64

3.6. SÍNTESE DE QUANTUM DOTS ................................................................ 64

3.6.1. Síntese do sulfeto de cádmio (CdS) ................................................. 64

3.6.2. Passivação do CdS com Cd(OH)2 ................................................... 65

3.7. CARACTERIZAÇÃO DO QUANTUM DOT ............................................ 66

3.7.1. Espectroscopia de Absorção ............................................................ 66

3.7.2. Espectroscopia de Excitação e Emissão .........................................

3.7.3. Medidas de Tamanho por Espalhamento Dinâmico de Luz ........

67

67

3.8. OBTENÇÃO DO NANOCOMPÓSITO .....................................................

3.8.1. Funcionalização do quantum dot: Biocompatibilização ...............

67

67


3.8.1.1. Glutaraldeído (Controle) .............................................................

3.8.1.2. Nanopartículas de cloridrato de quitosana (Nanocompósito) .....

3.8.1.3. Potencial Zeta ..............................................................................

3.9. TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE DO NANOCOMPÓSITO ..............

3.9.1. Teste de irritabilidade por HET-CAM ..........................................

3.9.1.1. Materiais e Equipamentos ..........................................................

3.9.1.2. Procedimento do teste HET-CAM ..............................................

3.9.2. Teste de Toxicidade pelo Método do MTT ....................................

3.9.2.1. Materiais e Equipamentos ..........................................................

3.9.2.2. Ensaio do MTT ...........................................................................

3.10. APLICAÇÃO DO NANOCOMPÓSITO EM SISTEMA BIOLÓGICO...

3.10.1. Sistema Biológico ............................................................................

3.10.1.1. Cultura de células .....................................................................

3.10.1.2. Preparo de placa de cultura de células de câncer de pulmão.....

3.10.2. Caracterização do Sistema Biológico ..........................................

3.10.2.1. Incubação e Preparo das lâminas ..............................................

3.10.2.2. Microscopia de Fluorescência ...................................................

3.10.2.3. Descarte do material biológico .................................................

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................

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4.1. CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA .................................................. 78

4.1.1. Características Estruturais .............................................................. 78

4.1.1.1. Espectroscopia vibracional da região do infravermelho .............. 78


4.1.2.1. Ressonância Magnética Nuclear ................................................. 80

4.1.2.2. Análise Elementar ........................................................................ 85

4.1.3. Massa Molar ..................................................................................... 86

4.1.3.1. Medidas de viscosidade ............................................................... 86

4.2. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA .... 89

4.2.1. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) .......................... 89

4.2.2. Medidas de Tamanho por Espalhamento Dinâmico de Luz ........ 92

4.3. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE CLORIDRATO


DE QUITOSANA ............................................................................................... 97

4.3.1. Características Estruturais .............................................................. 97

4.3.1.1. Espectroscopia vibracional da região do infravermelho .............. 97


4.3.2.2. Análise Elementar ........................................................................ 98

4.3.3. Massa Molar ..................................................................................... 99

4.3.3.1. Medidas de viscosidade ............................................................... 99

4.3.4. Microscopia Eletrônica de Transmissão ....................................... 100

4.4. CARACTERIZAÇÃO DOS QUANTUM DOTS DE CdS/Cd(OH)2........... 101

4.4.1. Espectroscopia de Absorção eletrônica........................................... 101

4.4.2. Espectroscopia de Excitação e Emissão ......................................... 103

4.5. OBTENÇÃO DOS NANOCOMPÓSITOS.................................................. 104

4.5.1. Potencial Zeta ................................................................................... 105

4.6. TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE DO NANOCOMPÓSITO.................... 106

4.6.1. Teste de Irritabilidade por HET-CAM........................................... 106

4.6.1.1. Água ............................................................................................. 107

4.6.1.2. Salina 0,9% .................................................................................. 107

4.6.1.3. CdS ............................................................................................... 107

4.6.1.4. CdS/Cd(OH)2 ............................................................................... 108

4.6.1.5. Nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ) ....................... 108

4.6.1.6. Nanocompósito (NC).................................................................... 108

4.6.1.7. Lauril sulfato de sódio à 3% ......................................................... 109

4.6.2. Teste de toxicidade pelo Método do MTT....................................... 110

4.7. APLICAÇÃO DO NANOCOMPÓSITO EM SISTEMA BIOLÓGICO................ 111

4.7.1. Células de câncer de pulmão............................................................ 111

5. CONCLUSÕES ................................................................................................. 119

REFERÊNCIAS ........................................................................................................

PRODUÇÃO CIENTÍFICA DURANTE O DOUTORADO ..........................................

ANEXO – ARTIGO ENVIADO PARA CARBOHYDRATE RESEARCH.....................

121

138

142

Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução

20

1. INTRODUÇÃO

1.1. QUITINA E QUITOSANA

1.1.1. Histórico

A quitina foi descrita pela primeira vez em 1811 na França por Braconnot,

professor de Historia Natural, que durante suas pesquisas ao tratar Agaricus volvaccus e

outros fungos, com solução alcalina, encontrou uma substância com conteúdo maior de

nitrogênio do que a madeira, concluindo que se tratava de uma nova substância

identificada em plantas, a qual denominou de “fungine” (Anjos, 2005). Em 1823, Odier

isolou uma substância contida nas carapaças de insetos semelhante à encontrada em

plantas, a qual chamou de quitina que em grego “khitón” significa túnica, envelope ou

cobertura, contudo não conseguiu detectar nitrogênio. Odier estabeleceu pela primeira

vez uma relação entre as substâncias de suporte encontradas na carapaça de insetos e

nos tecidos vegetais (Muzzarelli, 1977). Payen em 1843 detectou a presença de

nitrogênio da quitina e iniciou a discussão entre a diferença de celulose e quitina.

Ledderhose (1878) identificou a quitina como um composto de glucosamina e ácido

acético e escreveu a equação de hidrólise. Gilson (1894) confirmou a presença de

glucosamina na quitina (Stamford, 2007).

Odier e Childre relataram o isolamento da quitina usando vários tratamentos

com soluções de hidróxido de potássio concentrado o que os levou a um equívoco, pois

na realidade os pesquisadores haviam isolado a quitosana (Campos-Takaki, 2005). Esta

foi descrita pela primeira vez em 1859 por Rouget, como sendo uma quitina modificada,

pois em seus estudos relata que ao ferver a quitina em hidróxido de potássio

concentrado, a mesma fica solúvel em ácidos orgânicos (Muzzarelli, 1977). Em 1894


21

Hoppe-Seyler, ao estudar a quitina modificada, propôs o nome quitosana, pelo fato de

que a quitosana possui a mesma quantidade de nitrogênio da quitina (Hong, 1996).

A quitosana foi produzida industrialmente pela primeira vez em 1971, no Japão.

As pesquisas sobre quitina e quitosana e suas aplicações só começaram a receber

investimentos científicos e tecnológicos em torno de 1979, quando se começou a

perceber o grande potencial de suas aplicações (Monteiro Júnior, 1999). Em 1986, o

Japão já possuía quinze industrias produzindo quitina e quitosana em escala comercial.

Atualmente, a quitosana devido a sua inúmeras aplicações, vem recebendo atenção

especial dos pesquisadores (Roberts, 1992; Monteiro Júnior, 1999; Wang et al., 2008;

Mauro et al., 2009).

1.1.2. Considerações

Quitina é um polímero natural, insolúvel, linear que apresenta o mesmo tipo de

unidade monomérica β-1,4 N-acetilglucosamina e, com exceção da celulose, é o

polissacarídeo mais abundante e largamente distribuído na natureza, (Canela & Garcia,

2001). Sua estrutura é similar à da celulose, exceto pelo fato de que o grupo hidroxila

do carbono na posição 2 do anel glicopiranosídico é substituído pelo grupo acetamida

(Figura 01). Esta semelhança estrutural é refletida nas funções similares exercidas por

estes dois polímeros na natureza, pois ambos atuam como material estrutural e protetor

(Signini, 2002; Campos-Takaki, 2005). A quitina é encontrada no exoesqueleto dos

crustáceos, insetos, artrópodes e na parede celular de fungos.


22

Figura 01: Estrutura química da quitina e da celulose. Fonte: Signini, 2002..

A desacetilação da quitina conduz a um novo polímero denominado quitosana

(Amorim et al, 2000; Andrade et al., 2003). Geralmente o processo de desacetilação

ocorre a partir da hidrólise da quitina, em meio alcalino, em temperaturas elevadas sob

condições heterogêneas (Klug et al., 1998;Tonhi et al., 2002). No entanto, este processo

também pode ocorrer utilizando enzimas específicas, como a quitinase ou pela ação de

microrganismos (Monteiro Júnior, 1999; Kim & Rajapakse, 2005). A reação química

de desacetilação da quitina está representada na figura 02. A quitina pode sofrer vários

graus de desacetilação, resultando em diversos derivados da quitosana (Canela &

Garcia, 2001; Khan et al., 2002). O produto totalmente desacetilado é raramente obtido,

visto que o tempo necessário para completar a reação de desacetilação é longo e acaba

acarretando na despolimerização da cadeia. (Klug et al,1998).

.


23

Figura 02: Esquema da reação de N-desacetilação da quitina para obtenção de quitosana

através de hidrolise por hidróxido de sódio. Fonte: Anjos (2005).

Quitosana é um copolímero natural, composto por unidades β-1,4 D-

glucosamina ligadas a resíduos de N-acetilglucosamina (Figura 02) (Chatterjee et al,

2005). A quitosana não é muito encontrada na natureza, quando comparada à quitina e a

celulose, podendo ser encontrada na parede celular de alguns fungos, principalmente da

Classe Zygomycetes e em alguns moluscos; (Silva et al, 2006). Desta forma, a melhor

maneira de obter quitosana é na indústria através da hidrólise química da quitina

(Pochanavanich & Suntornsuk, 2002; Okawa et al., 2003; Franco et al., 2005; Amorim

et al., 2006). Existem vários derivados da quitosana, os quais podem se diferenciar pelo

grau de desacetilação, assim como pela disposição dos grupos N-acetil residuais, na

cadeia do polímero (Rinaudo, 2006; Stamford et al., 2007).

Figura 03: Estrutura química da quitosana. Fonte: Hiorth et al., 2006

O

CH2

H

H

H

OH

NH2

H

OH

H

O

CH2

H

H

H

OH

NH2

HH

OH

O

n

O

CH2

H

H

H

OH

NH

H

OH

H

O

CH2

H

H

H

OH

NH

HH

OH

O

O

O

n

NaOH

Desacetilação

Quitina Quitosana


24

1.1.3. Propriedades

A quitosana é um polímero caracterizado por propriedades específicas

revelando potencial para inúmeras aplicações em vários produtos comerciais. As

principais propriedades deste polissacarídeo são: bioatividade, biodegradabilidade,

biocompatibilidade, reatividade do grupo amino desacetilado, permeabilidade seletiva,

ação polieletrolítica, habilidade em formar gel e filme, habilidade de quelação e

capacidade adsortiva (Synowieck & Al-Khateeb, 2003; Tharanathan & Kittur, 2003).

No pH biológico a quitosana apresenta-se como um policátion. Em meio ácido

os grupos amino da quitosana captam íons hidrogênio do meio, resultando em uma

carga global positiva no polímero. Esta característica permite a sua interação com

moléculas carregadas negativamente tais como: gorduras, tecido animais ou vegetais,

membrana celular, entre outras formas (Horner et al., 1997; Pawtlowska, 1997). As

possibilidades de aplicações são ainda enriquecidas pelo fato que a quitosana pode ser

preparada em diferentes formas, tais como soluções de viscosidade controlada, géis,

filmes e membranas, microesferas e nanopartículas (Campana Filho et al., 2007,

Javakumar & Mano, 2007; Sezer et al., 2007; Wongpanit et al., 2007).

A quitosana vem sendo extensivamente estudada devido às suas propriedades

peculiares que lhe conferem um aproveitamento bastante versátil, tais como:

regeneração de tecidos epiteliais (Maia et al., 2006; Cho et al., 2007; Olmez

et al., 2007);

confecção de membranas artificiais (Costa et al., 2006);

promotor de osteogênese (Murugan & Ramakrishna, 2004);

coadjuvante da higiene oral (Sano et al., 2002; Sano et al., 2003);

absorção de gordura e redução do colesterol sérico (Gades & Stern, 2005);

componente de cosméticos (Kohei & Maki, 2006);


25

remoção e recuperação de diferentes resíduos (Vivek & Torres, 2000);

biotransformação e detecção de pesticidas (Du et al, 2007)

recobrimento de sementes na agricultura (Velásquez, 2003);

degradação de corantes (Borderías, et al., 2005);

agente de floculação no tratamento de efluentes aquosos (Díaz et al., 2007).

antibacteriano (Ikinci et al., 2002; Chung et al., 2004; Yadav & Bhise, 2004,

Cao & Sun, 2007);

Embora nos últimos anos estas aplicações da quitosana, já estejam em evidência,

têm aumentado exponencialmente o número de pesquisas realizadas focando novas

aplicações da quitosana, principalmente no que diz respeito ao mundo nano. Isto se deve

ao fato de que os materiais nestas dimensões (nano) apresentam novas propriedades e

consequentemente, novas aplicações. É o que ocorre com as nanopartículas de

quitosanas, as quais estão sendo aplicadas em diversas áreas, como na

nanobiotecnologia como carreador de fármacos de liberação controlada (Kim et al.,

2004; Park et al., 2004; Mauro et al., 2009); e no auxilio de biomarcadores visando o

diagnóstico e tratamento de tumores malignos (Guo et al, 2008; Tan et al., 2007; Qi et

al, 2007; Wang et al., 2008).

1.2. NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA

O termo nanopartículas é genérico, sendo usado de acordo com o tamanho da

partícula a que se está referindo. Partículas com tamanho menor que 1µm são

consideradas nanopartículas, enquanto que as partículas maiores são denominadas

micropartículas (Azevedo, 2002). Shaffazick & Guterres (2003) classificaram a relação

de tamanho das partículas em: micropartículas e sistemas coloidais (lipossoma e

nanopartículas). As nanopartículas podem ser preparadas a partir de uma variedade de


26

materiais, tais como: proteínas e polímeros. A seleção deste material depende de muitos

fatores, incluindo: (a) tamanho necessário das nanopartículas, (b) propriedades

intrínsecas da droga, (c) características da superfície como a carga e a permeabilidade,

(d) grau de biodegradabilidade, biocompatibilidade e toxicidade dentre outros. As

nanopartículas, constituídas por polímeros biodegradáveis, como é o caso da quitosana,

têm atraído a atenção dos pesquisadores devido às suas potencialidades terapêuticas e

estabilidade nos fluídos biológicos. O termo nanopartículas inclui as nanocápsulas e as

nanoesferas, as quais diferem entre si segundo a composição e organização estrutural

como mostra a figura 04.

Figura 04: Diferentes nanopartículas com aplicação farmacêuticas: (A) nanoesfera

(sistema matricial) e (B) nanocápsula (sistema reservatório). Fonte: Azevedo, 2002.

Denominam-se esferas aqueles sistemas em que o fármaco encontra-se

homogeneamente disperso ou solubilizado no interior da matriz polimérica. Desta forma

obtém-se um sistema monolítico, onde não é possível identificar um núcleo

diferenciado. Nanocápsula, ao contrário, constituem os chamados sistemas do tipo

reservatórios, onde é possível se identificar um núcleo diferenciado, que pode ser sólido


27

ou líquido. Neste caso, a substância encontra-se envolvida por uma membrana,

geralmente polimérica, isolando o núcleo do meio externo.

Os métodos de obtenção de nanoesferas e nanocápsulas são semelhantes, porém

há diferença nos mecanismos de polimerização, os quais são classificados em métodos

baseados na: (a) dispersão ou precipitação de polímeros pré-formados; (b)

polimerização de monômeros dispersos in situ; (c) copolimerização interfacial que

forma nanocápsula pelo contato entre os monômeros na interface conforme ilustrado na

figura 05; (d) coacervação dos polímeros hidrofílicos ou gelificação iônica. (Azevedo,

2002; Mohanraj & Chen, 2006).

Figura 05: Método de copolimerização interfacial para se preparar nanocápsulas.

Fonte: Mohanraj & Chen, 2006.

A coacervação dos polímeros hidrofílicos ou gelificação iônica é o método

empregado no presente trabalho. No entanto, ao se tratar especificamente da preparação

de nanopartículas de quitosana, também existem na literatura (Liu et al., 2007; Gan &

Wang, 2007) outros métodos empregados para a obtenção de nanopartículas deste

biopolímero, como por exemplo: (a) emulsão “cross-linking”, (b) coalescência de gotas

de emulsão, (c) micela reversa e (d) modificação química da quitosana.

É importante enfatizar que, independentemente do método de preparação

empregado, os produtos são obtidos como suspensões coloidais aquosas.


28

1.2.1. Método de Gelificação Iônica

A gelificação iônica é um método físico-químico de preparação de sistema

nanoparticulado que consiste, de um modo geral, na dissolução de um fármaco,

juntamente com um polímero, em determinado solvente, seguido da adição, sob

agitação constante, de um não-solvente à mistura. O não solvente pode causar a

precipitação do polímero ou a separação de fases (muitas vezes chamados de processo

de coacervação). Estes processos de coacervação podem ser divididos em: (a) simples

(por mudança no pH, força iônica, temperatura) ou (b) complexos (complexação entre

dois polieletrólitos de carga oposta). (Azevedo, 2002). Neste último caso, é o que

acontece entre a estrutura da quitosana (polieletrólito positivo) e a estrutura do

tripolifosfato de pentasódio (TPP), o qual é o surfactante utilizado no presente trabalho.

A interação entre estes dois compostos pode ser visualizada na figura 06.

Figura 06: Interação iônica entre a quitosana e o tripolifosfato de pentasódio (TPP).

Fonte: Azevedo et al., 2010.

.


29

O tripolifosfato de pentasódio (TPP) foi usado para preparar nanopartículas de

quitosana porque é um polieletrólito atóxico, capaz de formar géis com a interação de

suas cargas negativas e a dos grupos aminos da quitosana. Esta interação pode ser

controlada pela densidade de carga da quitosana e do TPP, a qual depende

principalmente, do pH da solução (Berger et al., 2004).

Na literatura, estão disponíveis alguns artigos referentes à preparação de

nanopartículas biodegradáveis com polímeros hidrofílicos, como a quitosana, gelatina e

alginato de sódio (Calvo et al., 1997; Zhang et al., 2004; Du et al., 2007; Du et al.,

2009; Yang et al., 2010). Calvo et al. (1997) desenvolveram um método para preparar

nanopartículas de quitosana por gelificação iônica. O respectivo método envolve uma

mistura de duas fases aquosas, das quais uma é o polímero quitosana e a outra é um

poliânion de tripolifostato de pentasódio. Neste método, o grupo amino da quitosana é

carregado positivamente interagindo com o TPP de carga negativa para formar

coacervados com um tamanho na faixa de nanômetros. Coacervados são formados como

resultado de interação eletrostática entre duas fases aquosas, que, por gelificação iônica,

envolve o material em fase de transição do estado líquido para o gel (Gan & Wang,

2007; Yang et al., 2010).

Nesta pesquisa, as nanopartículas de quitosana serão utilizadas na

funcionalização dos quantum dots de sulfeto de cádmio para obter nanocompósitos de

quitosana/quantum dots fluorescentes de semicondutores.

1.3. QUANTUM DOTS

1.3.1. Nanopartículas de semicondutores: quantum dots

As pesquisas sobre nanopartículas de semicondutores fluorescentes (quantum

dots) evoluíram bastante na ciência de materiais para aplicações eletrônicas e


30

biológicas, tornando possível o melhoramento de imagens para posterior diagnóstico

(Michalet et al., 2005).

As propriedades ópticas dos quantum dots foram intensamente estudadas na

década de 90. Desde que, o uso de ligantes conjugados com estes marcadores foi

relatado por Bruchez et al.(1998) e Chan and Nie (1998), muitas aplicações no campo

bioanalítico foram realizadas (Nagasaki et al., 2004). Os quantum dots, nanocristais de

semicondutores, apresentam várias vantagens em relação aos marcadores de moléculas

orgânicas. Além de serem altamente luminescentes, apresentam larga faixa de

comprimento de onda para excitação e um comprimento de fluorescência ajustável pelo

tamanho da partícula. Sob circunstâncias ideais, estes nanocristais podem ter um

elevado rendimento quântico, elevada absorbância e faixas estreitas de emissão,

podendo também fornecer diferentes emissões usando um único comprimento de onda

para excitação (Ballou et al., 2004).

1.3.2. Confinamento quântico dos quantum dots

Os quantum dots apresentam diâmetros na escala de 1 a 10nm. Por serem tão

pequenos, os elétrons e buracos, sofrem um forte confinamento quântico, modificando

as propriedades ópticas desses materiais. Uma nanopartícula de semicondutor encontra-

se em regime de confinamento quântico, quando suas dimensões são reduzidas a ponto

da diferença entre os valores de energia entre a banda de valência (BV) e a banda de

condução (BC), estejam próximas ou menores do que as dimensões do raio de Bohr do

seu éxciton (Figura 07).


31

Figura 07 - Esquema de formação de um éxciton. h+ representa o buraco gerado na

banda de valência, pela excitação do elétron e-. Fonte: Chaves (2006).

O confinamento quântico pode ser interpretado de forma simples utilizando-se o

modelo de partícula na caixa. Segundo o modelo, um elétron encontra-se confinado

dentro de uma caixa virtual, onde as funções de onda do elétron se restringem ao

interior da caixa, não permitindo ao elétron que se desloque para além das limitações de

suas paredes. Quanto menor forem as dimensões da caixa, maior a separação energética

entre os diferentes subníveis de energia.

Fazendo-se uma analogia ao cristal de um semicondutor e definindo as cargas

elétricas nas BVs e nas BCs por funções de onda apropriadas, quando as dimensões do

cristal se reduzem a poucos nanômetros, há um distanciamento energético entre as

bandas, que se reflete no aumento do valor energético de seu band gap (Eg).

Além disso, ocorre uma discretização dos níveis de energia da BV e da BC,

podendo ocorrer o surgimento de novas bandas durante o processo de quantização

(Michalet et al., 2005). A sintonização do comprimento de onda de emissão, para um

mesmo material, controlando-se o tamanho dos quantum dots, ocorre devido ao fato de

que as diferenças entre os estados energéticos da BV e da BC (Energia do Band gap:

Eg), variam de acordo com o tamanho da partícula, para um mesmo material. Assim,

quanto menor a partícula de um dado semicondutor, maior a diferença de energia entre


32

os estados da BV e da BC, ou seja, maior a Eg. Assim, partículas menores tendem a

luminescer em regiões próximas ao azul, enquanto que, as maiores apresentam

luminescência em regiões mais próximas ao vermelho. A Figura 08, ilustra emissão, no

visível, obtida para amostras contendo diferentes tamanhos de quantum dots de seleneto

de cádmio (CdSe), excitadas através de fonte de radiação eletromagnética na região do

ultravioleta.

Figura 08: Soluções luminescentes de quantum dots de CdSe, sob iluminação UV.

Fonte:http://lqes.iqm.unicamp.br/canal_cientifico/lqes_news/lqes_news_cit/lqes_news_

2008/lqes_news_novidades_1179.htmL

Os primeiros trabalhos que exploraram as características dos quantum dots de

semicondutores para fins de utilização como marcadores biológicos, foram publicados

simultaneamente por Bruchez et al. (1998) e Chan & Nie (1998). Desde então,

surgiram diversas aplicações dessa classe de materiais como biomarcadores (Farias et

al., 2005 ; Bera et al., 2010).

Esses novos métodos vêm apresentando algumas vantagens em relação aos

métodos convencionais para marcação celular e diagnóstico. Dentre elas, podem ser

citadas: emissão sintonizável em diversos comprimentos de onda, para um mesmo

material, variando apenas o tamanho da partícula; elevada fotoestabilidade; baixa

toxidade e marcação múltipla simultânea de diversos componentes e estruturas

celulares. Além do fato de que, os resultados podem ser obtidos com tempos de

http://lqes.iqm.unicamp.br/canal_cientifico/lqes_news/lqes_news_cit/lqes_news_2008/lqes_news_novidades_1179.html

http://lqes.iqm.unicamp.br/canal_cientifico/lqes_news/lqes_news_cit/lqes_news_2008/lqes_news_novidades_1179.html


33

incubação da ordem de alguns minutos e o material biológico pode ser analisado no

próprio meio de cultura.

A distribuição dos estados de energia das bandas de valência e das bandas de

condução varia entre os diferentes tipos de semicondutores. Assim, o limite de tamanho

para a condição de confinamento quântico, varia de um semicondutor para outro.

A Figura 09 mostra um quadro de diferentes quantum dots com a região de

energia/comprimento de onda do primeiro pico de absorção permitido pelo controle do

tamanho entre 3 a 10nm para diferentes semicondutores.

As aplicações biológicas desse tipo de material, usualmente, restringem-se aos

semicondutores para os quais se obtém emissão na região do visível (400-800 nm). No

entanto, o comprimento de onda de emissão para aplicações em dispositivos de

comunicações ópticas, deve estar na região do infravermelho, ou seja, entre 1300 a

1600nm.

Figura 09: Propriedades ópticas de semicondutores - quantum dots.

Fonte: Harrison et al., 2000


34

O principal problema que impedia a utilização de quantum dots como

marcadores fluorescentes em sistemas biológicos era a baixa eficiência de

luminescência. Esta baixa luminescência pode estar relacionada com: (a) presença de

níveis de impurezas localizados na superfície do material; (b) ausência de emissão por

interface e/ou (c) pelo correto tratamento de sua superfície (funcionalização). O

problema da baixa luminescência foi solucionado com uma camada extra de outro

semicondutor de gap óptico maior (passivação) e posterior funcionalização do quantum

dot. Isto pode ter acontecido devido: (a) ao deslocamento das impurezas para a região

mais externa ou (b) à emissão por interface e/ou (c) a associação do quantum dot com as

biomoléculas específicas viabilizada no processo de funcionalização. No final da década

de 90 aprendeu-se a funcionalizar a superfície dos quantum dots. E, atualmente,

quantum dots funcionalizados com estreptavidina, proteína A e biotina já podem ser

adquiridos no mercado.

Os estudos e aplicações dos quantum dots de semicondutores revelam que são

eficazes como novas sondas luminescentes com a finalidade de diagnóstico. O

direcionamento bem sucedido da partícula, para marcar um determinado tipo de

biomolécula, inclui a habilidade de alcançar tecidos e tipos específicos de células

(Watson et al. 2003; Wu et al.2003). Assim, surge um grande interesse na correta

funcionalização destes quantum dots para que eles escapem dos filtros biológicos, como

o sistema retículo endotelial.

Dentre os marcadores fluorescentes atuais, utilizam-se corantes orgânicos,

compostos de coordenação de íons lantanídeos e proteínas fluorescentes. As principais

desvantagens envolvidas nestes tipos de marcação são a rápida fotodegradação (Figura

10), alta toxicidade, indução de processos celulares indesejados, morte celular com

utilização de UV, além da presença de autofluorescência.


35

Figura 10: Fotodegração em função do tempo: antígenos nucleares corados com Alexa

Fluor 488 e microtúbulos corados com CdSe (Tempos observados: 0s, 20s, 60s, 120s e

180s) – Fonte: Medintz et al. 2005.

Conforme mencionado anteriormente, os marcadores fluorescentes de quantum

dots apresentam várias vantagens em relação aos marcadores de moléculas orgânicas. A

Figura 11 mostra espectros de absorção e de emissão, típicos de quantum dots e

moléculas orgânicas. Um único laser pode excitar a luminescência em diferentes

comprimentos de onda de quantum dots com tamanhos diferentes, enquanto que, cada

corante orgânico precisa ser excitado num comprimento de onda único, o mesmo

acontecendo com os compostos de íons lantanídeos.

Figura 11: Espectros de excitação e de emissão típicos de quantum dots (esquerda) e

moléculas orgânicas (direita), utilizados como marcadores fluorescentes em

microscopia confocal. Fonte: Smith et al., 2004

Quando os elétrons são confinados em uma camada suficientemente estreita, o

princípio da incerteza torna-se relevante (Osvaldo, 2003). Assim, a posição do elétron e

a sua quantidade de movimento não podem ser determinados simultaneamente. Se um

elétron for confinado numa camada infinitamente fina, sua energia de confinamento


36

deverá ser infinitamente alta. Mas, se os elétrons não tiverem energia suficiente para se

liberarem da camada, eles permanecerão num regime de confinamento, em um "poço

quântico". Essa característica nos estimula para a síntese, visando à obtenção de

materiais nanoestruturados, para que suas propriedades sejam moldadas de acordo com

suas dimensões (Farias et al., 2005). Os materiais comercialmente disponíveis ainda não

oferecem muitas vantagens, pois demandam um tratamento de superfície bastante

aprimorado, o que requer bastante conhecimento específico. Também, é importante

destacar que existem certas dificuldades para produção e reprodução de quantum dots

de qualidade.

1.3.3. Obtenção e características dos quantum dots

Os quantum dots de semicondutores são sistemas cristalinos obtidos por

crescimento controlado de um cristal pré-existente.

As características físico-químicas de um semicondutor variam com a redução do

seu tamanho, quando estes atingem dimensões de alguns nanômetros e encontram-se em

regime de confinamento quântico. A partir daí, propriedades como temperatura de

transição de fase, condutividade elétrica, absorção eletrônica dentre outras, tornam-se

dependentes do tamanho do material. Os grandes fatores responsáveis pela dependência

das propriedades com o tamanho dos quantum dots são os efeitos termodinâmicos de

superfície e efeitos quânticos.

Em cristais maiores, a superfície do material corresponde a uma pequena fração

do corpo do material; já em nanocristais, o número de átomos presentes em sua

superfície representa uma fração expressiva do total de átomos da partícula. Sendo

assim, estes átomos de superfície contribuem para a maior energia livre e determinam as

variações termodinâmicas. Foi observado, em partículas de CdS, que a temperatura de


37

fusão pode variar (de 1750ºC - 444ºC para 1600ºC - 400ºC) quando macrocristais

passam para dimensões abaixo de 10nm (Santos, 2002).

Em semicondutores, a excitação de elétrons da banda de valência (BV) para

banda de condução (BC), separados pelo band gap, resulta em largas bandas no espectro

de absorção. À medida que as partículas diminuem de tamanho, o band gap, aumenta

(Figura 12), acarretando na alteração de algumas propriedades do material.

Figura 12: Redução do tamanho de partículas semicondutoras dentro do regime de

confinamento quântico (Eg= energia da banda proibida, “band gap”; BC= banda de

condução e BV= banda de valência). Fonte: Chaves (2006).

Quando os elétrons da banda de valência são excitados para a banda de

condução do semicondutor as vacâncias de elétrons, denominados buracos (h+) que

surgem na banda de valência, podem interagir com os elétrons excitados, através de

forças coulombianas fracas, formando um estado ligado. Este par ligado (éxciton de

Wannier) comporta-se como uma espécie independente, apresentando um conjunto de

níveis de energia distintos do semicondutor e um raio de Bohr (ɑB) característico

(Santos, 2002):


38

A expressão 01 é utilizada para o cálculo do raio de Bohr, onde: ε0 é a

constante dielétrica no vácuo; ε∞ é a constante dielétrica do meio; me e mh são

respectivamente as massas efetivas do elétron e do buraco no semicondutor; m0 é a

massa do elétron em repouso.

A Tabela 01, segundo Santos (2002), apresenta alguns parâmetros para os

materiais semicondutores mais comuns.

Tabela 01 - Parâmetros físicos para semicondutores. Fonte: Chaves, 2006.

Os efeitos de confinamento quântico podem se basear na aproximação da massa

efetiva e é descrita por Santos (2002), através da expressão (02):

Onde: R= Raio; Eg= band gap do material macrocristalino; me e mh são respectivamente

as massas efetivas do elétron e do buraco no semicondutor; m0 é a massa do elétron em

repouso; ε0 é a constante dielétrica no vácuo; ε∞ é a constante dielétrica do meio.

Eq. 01

Eq. 02


39

Através da equação (02) podemos visualizar que a variação da energia de band

gap observado nos espectros de absorção e emissão dos semicondutores é proporcional

a 1/R2. Ela descreve partículas no limite de confinamento quântico fraco e moderado,

mas apresenta desvios para partículas extremamente pequenas.

Um dos fatores limitantes para a preparação destes materiais é a necessidade de

preparar um número suficientemente grande de partículas monodispersas.

1.3.4. Colóides

A ciência de colóides estuda sistemas nos quais um ou mais dos componentes

apresentam pelo menos uma de suas dimensões dentro do intervalo de 1nm a 1μm

(Gunter Schmid, 2004).

O aspecto característico da ciência de colóides reside na importância relativa

atribuída às várias propriedades físico-químicas dos sistemas em investigação. Os

fatores que mais contribuem para a natureza global de um sistema coloidal são: as

dimensões das partículas; a forma; as propriedades superficiais; interações partículas-

partícula e interações partículas-solvente. Os princípios relacionados com os diferentes

sistemas coloidais baseiam-se no tamanho e elevada relação área/volume de partículas.

Se as partículas têm tamanhos diferentes, o sistema coloidal é denominado polidisperso

(Melo et al., 2010).

Como a área da superfície dispersa é elevada devido ao pequeno tamanho das

partículas, as propriedades da interface entre as duas fases, dispersas e de dispersão,

determinam o comportamento dos diferentes sistemas coloidais. Geralmente as

dispersões coloidais são termodinamicamente instáveis, devido à sua elevada energia

livre de superfície. Estas dispersões, segundo Souza et al. (2008), constituem sistemas

irreversíveis que não podem ser reconstituídos facilmente após a separação das fases.


40

A síntese de nanopartículas coloidais ocorre por reações que permitam controlar

a nucleação e crescimento. O precursor é uma molécula ou um complexo que contêm

um ou mais átomos necessários para o crescimento do nanocristal. Uma vez que os

precursores são introduzidos na reação, eles se decompõem, dando forma a uma nova

espécie reativa (os monômeros). Estes irão causar a nucleação e o crescimento dos

nanocristais. A energia necessária para decomposição dos precursores é fornecida pelo

líquido na reação, por colisões térmicas ou por uma reação química entre o meio líquido

e os precursores, ou por uma combinação destes dois mecanismos (Murray et al., 1993).

Um parâmetro chave no crescimento controlado dos nanocristais é a presença de

surfactante o qual pode ser adsorvido dinâmicamente à superfície do quantum dot. O

surfactante é capaz de fornecer acesso para a adição de unidades monoméricas e

também consegui impedir a agregação dos nanocristais (Santos, 2002).

A escolha dos surfactantes varia em cada caso. Uma molécula que se ligue

fortemente à superfície do quantum dot não seria apropriada, porque impediria o

crescimento do nanocristal. Por outro lado, uma molécula de coordenação renderia

partículas grandes, ou agregados (Peng et al., 2000). Dentre alguns exemplos de

surfactantes incluem: alquil tióis, fosfinas, fosfatos, fosfonatos, amidas ou aminas,

ácidos carboxílicos e compostos aromáticos contendo nitrogênio. Este revestimento

permite uma grande flexibilidade e pode ser trocado por moléculas orgânicas ou grupos

funcionais com polaridade diferente. Além disso, os surfactantes podem ser

temporariamente removidos e uma camada de outro material com propriedades

eletrônicas, ópticas, ou magnéticas diferentes pode ser crescida no nanocristal

(Dabbousi et al., 1997; Peng et al., 1997). Controlando a mistura das moléculas do

surfactante pode-se controlar o tamanho e a forma dos quantum dots (Shaw, 1975;

Puntes et al., 2002).


41

É possível revestir a superfície dos quantum dots com moléculas biológicas tais

como proteínas ou oligonucleotídeos. Muitas moléculas biológicas executam tarefas de

reconhecimento molecular com uma alta eficiência quando se ligam, especificamente, a

determinadas moléculas de receptores. Deste modo, foi possível fazer pequenos

agrupamentos de quantum dots mediados pelo reconhecimento molecular (Zanchet et

al., 2002) e marcar compartimentos específicos de uma célula com diferentes tipos de

quantum dots (Dubertret et al., 2002).

1.3.5. Propriedades ópticas dos quantum dots

1.3.5.1. Espectros de absorção e emissão

As propriedades ópticas de partículas coloidais de semicondutores e suas

alterações dependem do tamanho das partículas (Jaeckel, 1926). Um efeito interessante

nas nanopartículas de semicondutores é o alargamento da faixa entre os estados

eletrônicos ocupados e os estados desocupados. Isto afeta diretamente as propriedades

ópticas dos quantum dots em comparação com a maioria dos materiais.

A Figura 13 mostra que quantum dots menores têm um espectro de absorção

deslocado para comprimentos de onda mais curtos quando relacionados a quantum dots

maiores e à maioria dos materiais.


42

Figura 13: Espectros de absorção (linhas contínuas) e emissão (linhas pontilhadas) de

quantum dots de CdSe com diferentes tamanhos. Os picos de absorção de nanocristais

com diâmetro de 2.3 /4.0 /3.8 /4.6nm estão em 507 /547 /580 /605nm. Os picos da

fluorescência estão em 528 /570 /592 /637 nm. Fonte: Gunter Schmid, 2004.

Nos quantum dots, o deslocamento Stokes é explicado pelo éxciton o qual é

definido como sendo a energia mínima necessária para criar um par de elétron-buraco

em um ponto quântico (quantum dot). (Reboredo et al., 2000; Jonhston-Halperin et al.,

2001).

O tamanho médio do quantum dot depende da posição do pico de luminescência,

e a largura deste pico está correlacionada à distribuição de tamanho dos nanocristais.

Conseqüentemente, o máximo no espectro de emissão e a sua largura podem ser usados

para estimar o tamanho médio e a distribuição de tamanho durante o crescimento do

nanocristal.

1.3.6. Passivação

A redução do volume da partícula resulta num aumento da relação área

superficial ⁄ volume, aumentando assim a contribuição de efeitos de superfície. A

superfície possui um grande número de defeitos resultantes da interrupção da rede


43

cristalina e da maior energia livre dos átomos ali localizados (impurezas, vacâncias,

defeitos cristalográficos, etc.), os quais podem agir como centros de decaimento não

radiativo, resultando no decréscimo do rendimento quântico da luminescência, com a

diminuição do tamanho (Santos, 2002).

Através da passivação (recobrimento da superfície do quantum dot com camada

de outro semicondutor), podemos alterar a estrutura externa das partículas “passivando

as ligações químicas não balanceadas”. Com isso, novos estados energéticos podem ser

criados, promovendo transições radiativas eficientes. Para a passivação, geralmente,

utiliza-se uma camada de outro semicondutor de bandgap maior sobre a partícula

original.

Para quantum dots de sulfeto de cádmio (CdS), a passivação com hidróxido de

cádmio, Cd(OH)2, tem se mostrado eficiente no sentido de aumentar significativamente

a intensidade da emissão (Farias et al., 2005; Gunter Schmid, 2004). A natureza da

luminescência observada nas suspensões de CdS, antes da passivação, é explicada em

termos da recombinação excitônica em defeitos de superfície relacionados à vacância de

íons enxofre nas ligações terminais de CdS do cristal ou radicais HS.

1.3.6.1. Sulfeto de Cádmio (CdS)

À medida que a camada de Cd(OH)2 se forma, os defeitos profundos são

substituídos por defeitos mais rasos, formados a partir das ligações Cd-OH. Isto

melhora a estabilidade das partículas em solução. É importante destacar que, após a

passivação, não há precipitação das partículas em solução. Desta forma, pode-se dizer

que existe estabilidade das partículas em meio aquoso (Santos, 2002).


44

1.3.7. Funcionalização

A funcionalização é caracterizada pela modificação química da superfície para

manter uma fotoestabilidade elevada, alta luminescência e, principalmente, baixa

toxicidade. Ela proporciona condições ótimas para marcações em materiais biológicos e

permite o monitoramento através da luminescência dos quantum dots (Chaves,2006).

A síntese geral dos quantum dots para bioimagem consiste no núcleo (Core) do

semicondutor (por exemplo, CdS) com uma concha (shell) inorgânica e orgânica (por

exemplo, Cd(OH)2 e glutaraldeído, respectivamente) como apresentado na Figura 14. O

shell inorgânico melhora as propriedades ópticas do núcleo (por exemplo, aumenta o

rendimento quântico) e minimiza a citotoxicidade induzida pelo semicondutor (Core)

após a fotodegradação. A concha orgânica (funcionalizante) é capaz de formar ligações

químicas com a superfície do quantum dot para que possa se complexar aos

componentes biológicos (Jiang et al., 2004).

Figura 14: Representação esquemática da funcionalização do quantum dot.

Fonte: Nascimento, 2009.


45

O glutaraldeído é uma molécula orgânica que possui dois grupamentos

funcionais tipo aldeído e que pode se ligar às aminas primárias presentes nas

biomoléculas (proteínas, ácido nucléico, etc). Reações entre aldeídos e aminas primárias

podem gerar as bases de Schiff que, após redução, resultam em aminas secundárias

estáveis (Walt & Agayn, 1994).

O recobrimento de quantum dot com polímeros vem sendo empregado devido ao

crescimento de cadeias poliméricas sobre sua superfície. A força da ligação química

entre o semicondutor e a cobertura de polímero torna o nanocompósito mais estável,

podendo ser submetido a processos industriais (Walt & Agayn, 1994).

É importante destacar que, os funcionalizantes não podem interferir nas

propriedades espectroscópicas, estabilidade coloidal e coalescência dos quantum dots

(Chaves, 2006). Uma técnica de caracterização rotineiramente utilizada para verificar a

estabilidade de nanocompósito é a determinação do Potencial Zeta.

1.3.7.1. Potencial Zeta

Potencial Zeta é uma abreviação de potencial eletrocinético em sistemas

coloidais. Do ponto de vista teórico, todos os materiais macroscópicos ou particulados

em contato com um líquido, adquirem uma carga elétrica em sua superfície. A carga

líquida na superfície da partícula afeta a distribuição de íons na sua vizinhança,

aumentando a concentração de contra-íons junto à superfície. Assim, forma-se uma

dupla camada elétrica na interface da partícula com o líquido (Schaffazick et al., 2003).

Essa dupla camada divide-se em duas regiões: uma região interna que inclui íons

fortemente ligados à superfície e uma região exterior onde a distribuição dos íons é

determinada pelo equilíbrio entre forças eletrostáticas e movimento térmico. Dessa

forma, o potencial nessa região decai com o aumento da distância da superfície até, a


46

uma distância suficientemente segura, atingir o potencial da solução. Esse potencial é

convencionado como Potencial Zero (Bedê, 2010).

Em um campo elétrico, como em microeletroforese, cada partícula e os íons

mais fortemente ligados à mesma se movem como uma unidade, e o potencial no plano

de cisalhamento entre essa unidade e o meio circundante é chamado Potencial Zeta.

Esse potencial é função da carga superficial da partícula, de qualquer camada adsorvida

na interface com o meio, e da natureza e composição do meio que a circunda. Como

esse potencial reflete a carga efetiva nas partículas, ele se relaciona com a repulsão

eletrostática entre elas e com a estabilidade da suspensão. Segundo Andrade et al.,

(2008), o Potencial Zeta também varia em função do pH da solução que se deseja

analisar. A regra geral para a estabilidade eletrostática da solução é a faixa de Potencial

Zeta de +/- 30 mV. Se o potencial da solução estiver fora dessa faixa, então a solução

pode ser considerada instável conforme ilustrado na Figura 15.

Figura 15: Variação do Potencial Zeta de uma solução em função do pH.

Fonte: Andrade, 2008.


47

A capacidade de se colocar diferentes tipos de grupos químicos em conjunto

sobre uma superfície amplia enormemente as possíveis aplicações dos quantum dots.

1.3.8. Aplicação dos Quantum Dots em Sistemas Biológicos

As propriedades ópticas dos quantum dots como marcadores biológicos têm

atraído muita atenção e superam algumas limitações encontradas pelos marcadores

orgânicos convencionais. A Figura 16 destaca as possíveis aplicações dos quantum dots

em sistemas biológicos.

Figura 16: Potenciais aplicações de quantum dots em sistema biológico.

Fonte: Chaves, 2006.

É possível detectar a fluorescência dos quantum dots em células vivas. Assim

como, estudar a interação destas células com os receptores de membrana e possíveis

afinidades. Eles também podem ser utilizados como biosensores para investigar

processos celulares como, por exemplo, a endocitose (processo pelo qual as células


48

vivas absorvem materiais, através da membrana celular). Para células nervosas, a

endocitose dos quantum dots ocorre rapidamente, à temperatura fisiológica (Gomez et

al., 2005).

Estudos de materiais vivos ou fixados, utilizando nanopartículas de

semicondutores também são destacados em marcações de células, tecidos, órgãos e

investigação de tumores ou lesões (Chatterjee & Zhang, 2007; Liang & Gundersen,

2007; Yuang et al., 2010).

1.4. ALGUMAS CONSIDERAÇÕES BIOLÓGICAS SOBRE O SISTEMA

ESTUDADO

1.4.1. Câncer

Crescimento e diferenciação celular são processos essenciais para os seres vivos.

O crescimento celular é indispensável durante o desenvolvimento dos organismos e

necessário para repor as células que morrem pelo processo natural de envelhecimento.

A diferenciação por sua vez, refere-se à especialização morfológica e funcional das

células, permitindo o desenvolvimento de cada organismo como um todo integrado. Os

distúrbios do crescimento ou diferenciação celular, podem ter graves repercussões,

como, por exemplo, o surgimento de neoplasias (Souto, Falhari & Cruz, 2005).

Define-se neoplasia como a proliferação anormal de células que se multiplicam

com independência e descontrole. Isto é, não respondem aos mecanismos de controle

(por exemplo: apoptose) a que estão submetidos todas as células normais do organismo

e tendem a perder sua diferenciação. Carcinogênese é o termo utilizado para designar a

transformação de células normais em células cancerosas (Oliveira & Alves, 2002).

O termo câncer é genericamente utilizado para denominar todas as neoplasias

malignas. É a tradução latina da palavra grega carcinoma (de karkinos = crustáceo,


49

caranguejo), foi utilizada pela primeira fez por Galeno (aproximadamente 138-201 d.

C.) para indicar um tumor maligno da mama, na qual as veias superficiais desse órgão

eram ramificadas, lembrando as patas de um caranguejo. O termo, hoje, é usado para

qualquer neoplasia maligna (Amar et al., 2005).

O câncer ocorre por uma alteração genética que pode ser transmitido a uma

célula normal através da transferência de genes tumorais. No entanto, os fatores

ambientais também desenvolvem o câncer. Segundo Belizário (2002), o

comportamento humano (tabagismo, maus hábitos alimentares, sedentarismo) é o

responsável por quatro em cada cinco casos de câncer.

Quanto à localização, aproximadamente 85% dos cânceres ocorrem em células

epiteliais e são classificados em carcinomas. Cânceres derivados de células mesodermas

(ex. ossos, músculos) são denominados sarcomas e cânceres de tecido glandular são

chamados de adenocarcinomas (Percorino,2008).

Quanto ao comportamento e evolução os tumores são divididos em duas

categorias: benignos e malignos. No primeiro caso, o tumor se desenvolve no seu lugar

de origem, não atingindo outros tecidos e no segundo caso, uma célula cancerosa se

desprende do tumor atingindo a corrente sanguínea e, desta maneira, o tumor se torna

capaz de invadir outros tecidos do corpo, causando a chamada metástase (Lopes,

Oliveira & Prado, 2002) representada na Figura 17. Um aglomerado de células tumorais

obtém nutrientes para o crescimento por difusão passiva até atingir um volume

aproximado de cerca de 2 mm3. Após este estágio, para continuarem crescendo é

necessária à formação de vasos sanguíneos para se nutrirem (angiogênese). Uma

variedade de sinais biológicos, enviados pelo tumor, dá início a angiogênese tumoral.

Os vasos sanguíneos formados para a nutrição do tumor são anormais, havendo

ramificações aberrantes, possuindo grande porosidade e tortuosidade no tecido


50

endotelial. No entanto, o tumor desenvolve-se rapidamente. O tumor maligno figura

como sendo o mais grave, em termos de sequelas, e tem sido uma das principais causas

de morte da população mundial (Brannon-Peppas & Blanchette, 2004).

Figura17: Disseminação de células tumorais (metástase).

Fonte: http://cancervc.org.au/about-cancer/for=schools/general_cancer, acessado em

19/12/2009.

Quanto às características e propriedades das células neoplásicas, pode-se

destacar:

Características bioquímicas: As células neoplásicas possuem os mesmos

constituintes bioquímicos das células normais. Nestas células, o conjunto enzimático é

mais pobre do que o das células normais, já que suas vias metabólicas são mais simples

e têm mais água do que as normais. Elas possuem pH mais baixo por causa da intensa

atividade glicolítica e do resultante aumento do ácido lático. A quantidade de glicose

geralmente é pequena, devido à rápida metabolização. A quantidade total de

aminoácidos é menor, devido à alta síntese proteica (Nascimento, 2009).

Adesividade e Funções celulares: As células malignas têm menor adesão entre

si, devido às modificações e irregularidades da membrana plasmática. Por causa da

http://cancervc.org.au/about-cancer/for=schools/general_cancer


51

perda da diferenciação celular, as células neoplásicas tendem a perder suas funções

específicas, podendo adquirir funções novas não existentes nas células normais. Além

disso, os sítios tumorais apresentam um aumento da permeabilidade vascular e baixa

drenagem linfática. Isto resulta no efeito de permeabilidade e retenção aumentada -

EPR (Enhanced Permeation and Retention Effect) o qual facilita o acúmulo de

nanopartículas preferencialmente nestes locais (Kyeongsoon et al.,2009). A Figura 18

mostra como ocorre o acúmulo de nanopartículas em regiões tumorais devido ao efeito

EPR.

Figura 18: Representação do acúmulo de nanopartículas em regiões tumorais devido ao

efeito EPR.

Fonte: POLLETO http://scienceblogs.com.br/bala_magica/2009/11/quando-a-

desuniao-pode-ajudar-a-salvar-vidas.php

http://scienceblogs.com.br/bala_magica/2009/11/quando-a-desuniao-pode-ajudar-a-salvar-vidas.php

http://scienceblogs.com.br/bala_magica/2009/11/quando-a-desuniao-pode-ajudar-a-salvar-vidas.php


52

Segundo o Ministério da Saúde (INCA, 2011), o câncer representa a segunda

maior causa de morte na população masculina do Brasil. Devido a estes altos índices de

impacto na população, grandes são os esforços para se encontrar formas mais eficazes

de combater a doença. Uma das frentes mais importantes no tratamento do câncer é o

aprimoramento do diagnóstico. Tendo em vista que, a detecção precoce auxilia os

médicos a planejarem o tratamento adequado e a determinar o prognóstico da doença.

Neste sentido, têm sido desenvolvidos nanocompósitos fluorescentes com alta

sensibilidade e especificidade para auxiliar no diagnóstico precoce de neoplasias (Junior

et al., 2005; Farias et al., 2006; Liang & Gundersen, 2007; Yuang et al., 2010).

1.4.2 Cultura Celular

A cultura de células tem sido utilizada com frequência na pesquisa de

marcadores, permitindo a análise imediata do impacto destes compostos sobre a célula e

fornecendo respostas rápidas.

A cultura de células animais (cultura de tecidos ou de células

sanguíneas/hematopoiéticas ou outras) inicia-se pela dispersão das células obtidas a

partir de um fragmento de tecido (hematopoiético, muscular, epitelial ou outro) num

meio nutritivo apropriado, colocado em frasco ou placa de cultura. Após o que se

verifica que a maioria das células adere à superfície sólida e cresce em monocamada ou

em suspensão. Ou seja, para obter uma linhagem celular, primeiro é necessário consegui

células através da desagregação do tecido e depois colocá-las em um meio de cultura

(cultura primária). Posteriormente, são feitas subculturas com baixa densidade celular

para obter as culturas secundárias. E desta forma estabelecer uma determinada linhagem

celular (Cruz et al., 2009). A Figura 19 resume a forma de obtenção de culturas

celulares primárias e secundárias (linhas celulares) a partir de um fragmento de tecido.


53

A cultura de células pode ser feita em monocamada ou em suspensão. Na cultura

em monocamada, as células vão aderir a um substrato e propagam-se. É o método mais

usado e tem como condição essencial a adesão ao substrato. A cultura em suspensão é

usada para células que sobrevivem e proliferam sem necessidade de adesão (Cruz et al.,

2009).

Figura 19: Obtenção de uma linha celular a partir de um tecido.

Fonte: Cruz et al., 2009.

1.4.3 Carcinoma de Células Escamosas de Câncer de Pulmão

Os pulmões são dois órgãos de estrutura esponjosa que têm forma de pirâmide,

estando a base de cada pulmão apoiada no diafragma. A função principal do pulmão é a

hematose que consiste na troca dos gases respiratórios (gás oxigênio e gás carbônico).

Também participa na regulação da temperatura corporal (Nascimento, 2009).


54

O câncer do pulmão é um problema importante de saúde pública mundial, sendo

responsável por uma das maiores taxas de mortalidade por câncer em ambos os sexos.

Esse tipo de câncer é, geralmente, detectado em estágios avançados, uma vez que a

sintomatologia nos estágios iniciais da doença não é comum. Em decorrência disso, o

câncer de pulmão permanece como uma doença altamente letal (BRASIL, Ministério da

Saúde. INCA, 2010).

Segundo Uehara et al. (1998) os quatro tipos histológicos principais que

abrangem 95% dos casos são: carcinoma epidermóide, adenocarcinoma, carcinoma

indiferenciado de pequenas células e carcinoma indiferenciado de grandes células. Os

tipos mais comuns de neoplasia de pulmão são: (1) o carcinoma epidermóide e o

adenocarcinoma, representando 40 e 30%, respectivamente; (2) o carcinoma

indiferenciado de pequenas células que varia de 15 a 20%, e (3) o carcinoma

indiferenciado de grandes células com aproximadamente 10%. Outros tipos histológicos

incluem: tumores mistos, tumores carcinóides, mesoteliomas, sarcomas.

Segundo Morandi (2006), a Organização Mundial da Saúde (OMS) classifica as

neoplasias pulmonares, histologicamente, em:

Tumores epiteliais

o Benignos

Papilomas

Adenomas

o Lesões pré-invasivas

Displasia escamosa e carcinoma in situ

Hiperplasia adenomatosa atípica

Hiperplasia pulmonar difusa idiopática de células

neuroendócrinas

o Malignos

Carcinoma de células escamosas (epidermóide)

Carcinoma de pequenas células

Adenocarcinoma

Carcinoma de grandes células

Carcinoma adenoescamoso

Tumor carcinóide


55

O carcinoma epidermóide de pulmão também é conhecido como carcinoma de

células escamosa. Representa 50 a 70% dos casos de carcinoma do pulmão,

apresentando íntima interação com o hábito de fumar (Morandi, 2006).

A linhagem celular abordada, neste trabalho, é a de células de carcinoma

epidermóide de pulmão humano (NCI-H 292), com cultura de crescimento em

monocamadas.

1.5. TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE

1.5.1. Teste de irritabilidade por HET-CAM

A membrana corioalantóide é uma típica membrana de ovos (fertilizados de

aves) que representa o órgão embrionário responsável pelas trocas gasosas enquanto o

embrião se desenvolve no interior do ovo (Steiling et al 1999).

Figura 20: Estruturas do ovo fertilizado: membranas extraembrionárias.

Fonte:http://www.sobiologia.com.br/conteudos/embriologia/reproducao14.php

http://www.sobiologia.com.br/conteudos/embriologia/reproducao14.php


56

A forma como esta membrana responde a aplicação tópica de substâncias em

sua superfície corresponde um importante parâmetro para avaliar a biocompatibilidade e

toxicidade de drogas (Vargas et al 2007).

O modelo da membrana corioalantóide do ovo pode ser utilizado como

alternativa para estudo de angiogenesi e resposta inflamatória a biomateriais (Zwadlo-

Klarwasser et al 2001 e Valdes et al 2002). Similarmente na área de cosméticos sendo

usado para avaliar propriedades irritantes das formulações dos cosméticos e seus

ingredientes (Steiling et al 1999).

1.5.2. Teste de Toxicidade pelo Método de MTT

O princípio deste método consiste na absorção do sal MTT {brometo de [3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio]} pelas células, sendo reduzido no interior da

mitocôndria a um produto chamado formazan (cor azul). Este produto, acumulado

dentro da célula, é extraído através da adição de dimetilsulfóxido (DMSO) que é um

solvente apropriado para solubilizar os cristas de formazan (Mosmann, 1983). . Este

método tem sido muito utilizado para medir a sobrevivência e proliferação celular já

que permite determinar a funcionalidade mitocondrial das céluals tratadas. A quantidade

de células vivas é proporcional à quantidade de formazan produzida (Silva, 2009).

1.6. APLICAÇÃO DE NANOCOMPÓSITOS EM SISTEMA BIOLÓGICO

As propriedades ópticas dos quantum dots como biomarcadores têm atraído

muita atenção e superam algumas limitações encontradas nos marcadores orgânicos

convencionais.Desde a sua primeira apresentação em 1998, os quantum dots têm sido

sistematicamente testado em marcações fluorescentes in vitro e em procedimentos de

imagem in vivo (Michalet, 2005).


57

Diversos autores mostraram marcações de células e de tecidos inteiros usando

diferentes modificações na superfície de distintos quantum dots o que permitiu o

entendimento e visualização de marcações em sistemas biológicos. O uso de

funcionalizantes, como gluteraldeído e poli(etilenoglicol) permitiu observar diferentes

interações dos marcadores com os sistemas biológicos (Jaiswal et al., 2002; Menezes,

2006; Kyeongsoon et al., 2009).

Conforme referido, para utilização de quantum dots em aplicações biológicas

são necessários estudos para obtenção do revestimento adequado da superfície dos

mesmos, o qual deve manter elevada luminescência e fotoestabilidade, assim como,

uma baixa toxicidade. Neste trabalho, destacamos o uso de nanocompósitos de

quitosana/quantum dots de semicondutores na marcação de células neoplásicas

pulmonares.


58

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Neste trabalho, destacamos o uso das nanopartículas de semicondutores de

sulfeto de cádmio (CdS), passivadas com hidróxido de cádmio Cd(OH)2 e

funcionalizadas com nanopartículas de cloridrato de quitosana para marcação de

células neoplásicas de pulmão (linhagem de carcinoma epidermóide NCI-H292).

2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO

I. Obter e caracterizar nanoparticulas de quitosana com diferentes graus de

desacetilação e despolimerização;

II. Obter e caracterizar o quantum dot de semicondutor (CdS/Cd(OH)2);

III. Obter nanopartículas de quitosana ideais para a funcionalização dos

quantum dots;

IV. Obter nanocompósito de quantum dot funcionalizado com nanoparticulas

de quitosana;

V. Avaliar o potencial de irritabilidade dos componentes do nanocompósito;

VI. Determinar o possível efeito citotóxico do nanocompósito utilizando o

método do MTT.

VII. Verificar a marcação de células neoplásicas pulmonares com este

nanocompósito.

Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental

59

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

3.1. OBTENÇÃO DA QUITOSANA

A quitosana utilizada neste trabalho foi extraída de exoesqueletos de caranguejo

e é comercializada pela empresa Aldrich como sendo quitosana Sigma-Aldrich® obtida

de carapaça de carangueijo. O fabricante forneceu a viscosidade como sendo maior que

200 000 cps. Contudo, o grau de desacetilação, bem como qualquer outra informação,

não foi mencionado.

3.1.1. Desacetilação da quitosana

Foram suspensos 5g de Quitosana Comercial (QC) em 220 mL de solução

aquosa de NaOH 40% (p/v) e mantidos sob agitação mecânica a 350 rpm, por 6 hs a

temperatura de 115ºC. Após, este período, o meio reacional foi filtrado e o sólido

lavado com água destilada até atingir um pH próximo a 7,0. Em seguida, a quitosana foi

lavada com 30 mL de metanol (PA) e seca a temperatura de 25ºC (Battisti & Campana

Filho, 2008). Nesta etapa, foi obtida a quitosana desacetilada (QD).

3.1.2. Despolimerização das quitosanas

Foram dissolvidos 2g de quitosana de cada grupo (QC e QD) em 100 mL de

0,1M HCl e agitado por 24 hs. Após este período, foram adicionados 20 mL de H2O2

(5% ou 15%) para cada 100 mL das soluções de quitosana e mantidos sob agitação

mecânica a 350 rpm por 2 hs a temperatura de 60ºC (Yang et al., 2010). Em seguida, os

meios reacionais foram filtrados à vácuo com três papéis de filtros quantitativo da

VETEC apresentando porosidade de 3, 0.8 e 0.45 µm, respectivamente.


60

Após a última filtração, parte da solução foi retirada para a medida de

viscosidade. Na parte restante, foi adicionado etanol na proporção de 1:1 (v/v) para

cada grupo (QCD5%; QCD15%; QDD 5% e QDD15%).

Depois de 48 hs observou-se a precipitação das quitosanas. Para retirar todo o

sobrenadante, foi necessário centrifugar as quitosanas despolimerizadas a 4500 rpm por

10 minutos a temperatura de 25ºC. Em seguida, os precipitados forma transferidos para

uma placa de vidro e armazenados em um dissecador contendo sílica, até que as

amostras ficassem completamente secas para depois seguir com o método de gelificação

iônica.

3.2. PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANAS

3.2.1. Método de Gelificação Iônica

Foram dissolvidas 0,5g das quitosanas (QCD5%; QCD15%; QDD5% e

QDD15%) em 50 mL de ácido acético 2% e agitadas por 30 minutos. Em seguida, foi

adicionado lentamente a cada grupo 20 mL de TPP 1% e mantidos sob agitação durante

2 hs. Depois as soluções foram centrifugadas a 13 400 rpm por 10 minutos e os

sobrenadantes foram sendo retirados e acrescentado mais soluções nos mesmos

eppendorfs. Na última alíquota da solução, ao retirar o sobrenadante, foi acrescentado

água destilada e homogeinizada cada amostra com a finalidade de retirar o excesso de

reagentes utilizados nos processos de despolimerização e/ou preparação de

nanopartículas. Esta lavagem foi repetida 5 vezes sempre intercalando com a

centrifugação a 13.400 rpm por 5 minutos. Após a última lavagem, foram retirados os

sobrenadantes e os precipitados foram liofilizados. Nesta etapa, foram obtidas as

nanopartículas de cada grupo que apresentam as respectivas abreviações: NQCD5%;


61

NQCD15%; NQDD5% e NQDD15% (metodologia adaptada por Yang et al., 2010 e

Ginani et al.,1999).

3.3. OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE CLORIDRATO DE

QUITOSANA

O cloridrato de quitosana foi obtido por dissolução da amostra QCD15% (1,0g

de quitosana/100 mL de ácido acético 1%) após agitação contínua durante 18 hs. Após

este período a solução obtida foi filtrada à vácuo com papel de filtro quantitativo da

VETEC com porosidade de 0.45 µm. Em seguida foi realizada diálise com membrana

de celofane com limite de exclusão de 12.000 Dalton por dois períodos consecutivos de

36 hs. O primeiro período, contra solução aquosa de NaCl 0,2mol/L e o segundo, contra

água deionizada (Signini & Campana Filho, 1998).

Após a diálise, a amostra de cloridrato de quitosana comercial despolimerizada

a 15% (CQ) teve o pH ajustado para 7,0 com NaOH a 0,1M. Em seguida, foi

acrescentado lentamente 1,2 mL de TPP 1% em 3,0 mL de CQ o que alterou o aspecto

da solução de transparente para leitosa. Depois, a solução foi centrifugada a 13.400 rpm

por 5 minutos a 25ºC e os sobrenadantes foram sendo retirados e acrescentado mais

soluções nos mesmos eppendorfs. Na última alíquota da solução - ao retirar o

sobrenadante - foi acrescentado água destilada e cada amostra foi homogeinizada com a

finalidade de retirar o excesso de reagentes utilizados na diálise. Esta lavagem foi

repetida 5 vezes sempre intercalando com a centrifugação a 13.400 rpm por 5 minutos.

Após a última lavagem, foi retirado o sobrenadante e o precipitado foi liofilizado. Nesta

etapa, foram obtidas as nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ) as quais serão

utilizadas na funcionalização do quantum dots.


62

3.4. CARACTERIZAÇÃO DAS QUITOSANAS

Diversas técnicas foram realizadas para a caracterização das quitosanas. As

características estruturais das quitosanas foram observadas por espectroscopia

vibracional na região do infravermelho. Os graus de desacetilação foram determinados

utilizando duas técnicas: RMN 1H e análise elementar. As massas molares foram

estimadas através de medida de viscosidade.

3.4.1. Caracterização estrutural

3.4.1.1. Espectroscopia vibracional na região do infravermelho

Os espectros no infravermelho foram obtidos em um espectrofotômetro com

transformada de Fourier da Bruker, modelo IF66, na região entre 4.000 cm-1

e 400 cm-1

.

Aproximadamente 1,5mg de cada quitosana foi seca em estufa a vácuo durante 15 hs a

60°C. Em seguida, foi adicionado 100mg de KBr e a mistura homogeneizada em

almofariz de ágata. As pastilhas de KBr foram preparadas e deixadas na estufa a vácuo a

110°C durante 20 hs. Por tanto, o espectro do pó das quitosanas foram obtidos

utilizando pastilha de KBr como suporte. As medidas foram realizadas na Central

Analítica do Departamento de Química Fundamental da UFPE (Signini e Campana

Filho, 1998).

3.4.2. Grau de desacetilação

3.4.2.1. Ressonância Magnética Nuclear

Os espectros de RMN 1H foram obtidos a partir de um procedimento descrito

por Signini e Campana-Filho (2000). O equipamento utilizado foi o da Varian Unity

Plus em 300 MHz. As soluções de quitosanas foram preparadas pela dissolução de

10mg de cada quitosana em 1mL de solução de HCl/D2O 1% (v/v), durante 24 hs

formando uma solução viscosa. Uma alíquota dessa solução foi colocada em um tubo de


63

5mm de diâmetro para a análise a 50°C, com tempo de relaxação de 6 segundos e pulso

de 90º.

3.4.2.2. Análise Elementar

As análises elementares das quitosanas foram obtidas no equipamento

Analisador elementar modelo EA 1110 da Carlo Erba Instruments, na Central Analítica

do Departamento de Química Fundamental da UFPE.

3.4.3. Massa molar

3.4.3.1. Medidas de Viscosidade

Os pesos moleculares foram determinados por viscosidade, segundo a

metodologia proposta por Santos et al (2003). As medidas de viscosidade foram

realizadas utilizando um capilar de vidro tipo Cannon-Fenske (dinterno=1,01mm)

termostatizado a (25± 0,01)ºC, em um viscosímetro AVS-350 da Schott-Geräte. Para a

determinação da viscosidade intrínseca, [], foram preparadas soluções de quitosanas

(utilizando tampão de ácido clorídrico como solvente) com concentrações variando de

2,0 x 10-3

a 9,0 x 10-3

g/mL. Os tempos de escoamento foram determinados em

segundos. Foram feitas três medidas de cada amostra e calculada a média.

3.5. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA

3.5.1. Medidas de Tamanho por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)

Os tamanhos dos raios hidrodinâmicos das nanopartículas foram determinados

por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) usando Zetasizer (Nano-ZS, Malvern, UK).

As medidas de DLS foram operadas com o comprimento de onda de 633nm a

25ºC com um ângulo de detecção de 90º. As amostras foram diluídas em ácido acético

1% (16 µmol/L) em água MilliQ. Três medidas subseqüentes foram determinadas para

cada amostra.


64

3.5.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET - FEI Morgagni) foi usada para

observar a morfologia das nanoparticulas de cada quitosana. As suspensões de

nanopartículas foram diluídas em água MiliiQ para 1:20 (v/v) e depois foi feito o

contraste negativo com solução de ácido fosfotungstico 1% (PTA). As amostras foram

gotejadas em grades de cobre e para remover o excesso foi usado papel de filtro.

3.6. SÍNTESE DE QUANTUM DOTS

3.6.1. Síntese de sulfeto de cádmio (CdS)

Em um balão contendo 95,5mL de água deionizada foram adicionados 2,0mL de

uma solução à 0,0051g/mL do estabilizante polifosfato de sódio [(NaPO3)]n (Sigma

Aldrich), com n igual à 9 e 2,5mL de uma solução 0,01 mol/L perclorato de cádmio

Cd(ClO4)2 (Sigma Aldrich).

O perclorato de cádmio foi preparado a partir de 0,642g de óxido de cádmio

(CdO). Para 0,005 mols de CdO, foi utilizado 0,01 mol de HClO4. Após pesar o CdO,

acrescentou-se água deionizada e, aos poucos, foram adicionados aproximadamente

1,44mL de HClO4, sob agitação constante. Na medida em que o material foi secando,

foi sendo acrescentada mais água. E em seguida, o pH da solução foi elevado com

NaOH de 4,0 para 8,5 (valor necessário para uma luminescência no comprimento de

onda de 500nm após passivação). O balão foi vedado com um septum de borracha. Com

auxílio de uma seringa foram adicionados à solução aproximadamente 750μL de gás

sulfídrico H2S (White Martins 98%). A solução resultante foi agitada continuamente

durante 10 minutos (Figura 21):


65

Figura 21: Representação da preparação de quantum dots de sulfeto de cádmio (CdS).

Fonte: Chaves, 2006.

Após o tempo de agitação observamos a mudança da coloração da solução de

incolor para amarelo. Através desta observação verificamos a formação das

nanopartículas de sulfeto de cádmio.

A solução foi mantida à temperatura de aproximadamente 10ºC até a passivação.

Segundo Santos (2002), temperaturas mais baixas parecem retardar o crescimento das

nanopartículas. Isso pode ser explicado analisando a variação do Kps (Produto de

solubilidade) do CdS que diminui com a diminuição da temperatura.

3.6.2. Passivação do CdS com Cd(OH)2

A passivação se caracteriza pela formação de uma camada (casca) ao redor da

nanopartícula (núcleo), (Figura 22).

Figura 22: Passivação de quantum dots de CdS com Cd(OH)2. Fonte: Chaves, 2006.

Ao final da síntese das nanopartículas de CdS é necessário a formação de uma

camada de hidróxido de cádmio Cd(OH)2, com um semicondutor de gap maior. A


66

passivação foi realizada aproximadamente após 24 hs de preparação das nanopartículas

de sulfeto de cádmio.

O pH da suspensão foi novamente ajustado com solução de NaOH, elevando-o

para 10,5. Em seguida, foi adicionado lentamente 6mL de perclorato de cádmio

Cd(ClO4)2 à 0,01mol/L, sob agitação constante (Figura 23). A adição lenta do

Cd(ClO4)2 evita a formação de grandes aglomerados de hidróxido de cádmio.

Figura 23: Representação da passivação de quantum dots de CdS com hidróxido de

cádmio Cd(OH)2 e luminescência após passivação. Fonte: Chaves, 2006.

A passivação pode ser inicialmente confirmada através de uma lâmpada de luz

UV (Figura 22) e posteriormente através de espectros de emissão e absorção, uma vez

que se observa facilmente uma identificação na emissão no verde.

3.7. CARACTERIZAÇÃO DO QUANTUM DOT

3.7.1. Espectroscopia de Absorção

As medidas de caracterização das nanopartículas foram realizadas utilizando o

instrumento UV/VIS Spectro-photometer, Perkin-Elmer modelo Lambda6, com

resolução de 0,5nm, na região de 190 a 900nm, utilizando a água como referência. As

medidas foram realizadas no laboratório do Professor Ricardo Ferreira do Departamento

de Biofísica da UFPE.


67

3.7.2. Espectros de Excitação e Emissão

Foram utilizados 5mL da suspensão de CdS/Cd (OH)2 em uma cubeta de quartzo

durante as medidas de excitação e emissão. As medidas foram realizadas no

espectrofluorímetro Vinci- Instrument control ISS (K2), com resolução de 1,0 nm e

lâmpada de xenônio de 300W como fonte de excitação. As medidas foram realizadas no

Departamento de Física da UFPE.


Os tamanhos dos raios hidrodinâmicos das nanopartículas foram determinados

por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) usando Zetasizer (Nano-ZS, Malvern, UK).

As medidas de DLS foram operadas com o comprimento de onda de 633nm a

25ºC com um ângulo de detecção de 90º. As amostras não foram diluídas e três medidas

subsequentes foram determinadas para cada amostra.

3.8. OBTENÇÃO DO NANOCOMPÓSITO

3.8.1. Funcionalização do quantum dot: Biocompatibilização

Através da funcionalização do CdS/Cd(OH)2 com as NCQ, obteve-se o

nanocompósito inédito apresentado no presente trabalho. Para poder verificar a

intensidade da marcação deste nanocompósito (NC), foi preparado um controle com

glutaraldeído. Os procedimentos de funcionalização por glutaraldeído e pelas NCQ

estão descritas a seguir:

3.8.1.1. Glutaraldeído (Controle)

O glutaraldeído é usado como agente de fixação de células para microscopia,

mas utilizado em pequenas quantidades, pode-se observar sua interação com as

nanopartículas de CdS e uma possível ligação com materiais biológicos.


68

Em um erlenmeyer de 100mL, foi adicionado 10mL de suspensão de

CdS/Cd(OH)2. Em seguida, adicionou-se lentamente 100μL de uma solução de

glutaraldeído a 0,01%, à temperatura de 25ºC e mantido em agitação por 10 minutos.

3.8.1.2. Nanopartículas de cloridrato de quitosana (Nanocompósito)

Após verificar a luminescência do quantum dot, foi preparado uma solução de

nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ) na concentração de 2,5mg/mL

utilizando água Milli-Q. Foram medidos o pH do quantum dot e da solução de NCQ

(pH=8,5; pH= 5,5 respectivamente). A seguir, ajustou-se o pH de ambos para 7,5. O pH

das NCQ foi ajustado com solução de 0,1M de NaOH e a solução de CdS/Cd(OH)2 foi

ajustada com ácido perclórico (HCLO4) 0,1M.

Antes do processo de funcionalização, foram realizados vários testes de

diluições para verificar a “eficiência da luminescência” do quantum dot na presença da

solução de NCQ. Segundo Santos (2002), em amostras de CdS/Cd(OH)2, temos

aproximadamente 1013

nanopartículas/mL.

Foram preparadas as seguintes diluições:

• 0,5mL CdS/Cd(OH)2 + 5mL NCQ (1:10)

• 1mL CdS/Cd(OH)2 + 5mL NCQ (1: 5)



• 2,5mL CdS/Cd(OH)2 + 100µL NCQ (25: 1)

• 5mL CdS/Cd(OH)2 + 100µL NCQ (50: 1)

• 10mL CdS/Cd(OH)2 +100µL NCQ (100:1)


69

A Figura 24, mostra um esquema que representa a síntese, passivação e

funcionalização do quantum dot.

Figura 24: Síntese (CdS), passivação (CdS/Cd(OH)2) e funcionalização do quantum dot

com NCQ (Nanocompósito: CdS/Cd(OH)2 + NCQ). Fonte: Chaves, 2006(Adaptado).

Para escolha da melhor diluição, foi observado se o sistema manteve:

1- As suas propriedades espectroscópicas (quando excitado com lâmpada na região do

Ultra Violeta) e;

2- Estabilidade coloidal (determinada através do Potencial Zeta).

3.8.1.3. Potencial Zeta

Utilizou-se o equipamento Zetasize localizado no Departamento de Física da

UFPE para medir o potencial zeta das nanopartículas de CdS/Cd(OH)2 funcionalizadas

com glutaraldeído e com as diferentes diluições de NCQ.

Para análises de potencial zeta foram utilizadas, em temperatura de 25ºC,

aproximadamente 4mL das mesmas suspensões descritas acima e citadas no item

3.8.1.2.

NCQ

NCQ


70

3.9. TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE DO NANOCOMPÓSITO

3.9.1. Teste de Irritabilidade por HET-CAM

3.9.1.1. Materiais e Equipamentos: Tubos de ensaio, lupa, espátula, ovos

fertilizados, algodão, sistema de água do tipo MilliQ, solução salina 0,9%, amostras a

serem testadas (CdS; CdS/Cd(OH)2; NCQ; Nanocompósito (NC) e lauril sulfato de

sódio à 3%).

3.9.1.2. Procedimento do teste HET-CAM

No décimo dia de incubação, o reservatório acima do espaço aéreo do ovo foi

removido. A membrana corioalantóide do ovo foi exposta e umedecida com salina

fisiológica a 0,9%. A salina foi cuidadosamente removida com algodão, expondo a

membrana corioalantóide. Uma alíquota de 200µL da substância testada foi aplicada na

membrana corioalantóide do ovo fertilizado. Durante 5 minutos foram avaliados efeitos

irritantes como: hemorragia, coagulação e vasoconstricção. As etapas do procedimento

do teste da membrana corialantóide do ovo podem ser visualizadas na Figura 25.

(a) (b)

(c) (d)


71

Figura 25: Imagens das etapas experimentais do teste de irritabilidade: (a) Ovos no 10º

dia de incubação; (b) Remoção da casca externa; (c) Eliminação de membrana branca,

previamente umidificada com água destilada; (d) Membrana Corialantóide do ovo; (e)

Aplicação da amostra e (f) Observação por 5 minutos.

Fonte: http://www.invitrocells.com.br/interna.php?area=servico&escolha=17

Foi observado o tempo (em segundo) que iniciava os processos de hemorragia,

coagulação e vasoconstricção. Estes tempos foram aplicados na fórmula a seguir:

(301- Hemorragia) x5 + (301- vasoconstricção) x7 + (301-Coagulação) x9

300 300 300

Onde:

Hemorragia → Representa o tempo (em segundo) quando primeiro apareceu à

hemorragia sanguínea.

Vasoconstricção → Representa o tempo (em segundo) quando primeiro surgiu à

vasoconstricção dos vasos.

Coagulação → Representa o tempo (em segundo) quando primeiro apareceu à

coagulação.

É possível quantificar, através desta fórmula, o potencial de irritação observado.

Além de obter a média ± desvio padrão da média para realizar a análise conforme a

classificação indicada na Tabela 02.

(e) (f)

http://www.invitrocells.com.br/interna.php?area=servico&escolha=17


72

Tabela 02: Classificação do potencial de irritação das substâncias de acordo com

o teste de irritabilidade HET-CAM.

FAIXA DE PONTUAÇÂO CATEGORIA DE IRRITAÇÃO

0 - 0,9 Não Irritante

1 – 4,9 Ligeiramente irritante

5 – 8,9 Irritante

9 – 21 Muito irritante

3.9.2. Teste de Toxicidade pelo Método do MTT

3.9.2.1. Materiais e Equipamentos: linhagem de células tumorais; amostras a

serem testadas; dimetilsulfóxido; meio de cultura DMEN; tripsina; soro fetal bovino;

penicilina-estreptomicina; MTT; placas de cultura com 96 poços; pipetas de vidro;

micropipetas; câmara de fluxo laminar; microscópio óptico; centrifuga; leitor de ELISA;

incubadora a 37 °C e CO2 a 5%.

3.9.2.2. Ensaio do MTT

Células: A linhagem tumoral utilizada, NCI H-292 (câncer de pulmão–

humano), foi obtida do Banco de células do Rio de Janeiro, tendo sido cultivada em

meio DMEN, suplementados com 10 % de soro fetal bovino e 1 % de antibióticos,

mantidas em estufa a 37 C e atmosfera contendo 5% de CO2.

Amostras: As amostras foram diluídas em DMSO puro estéril e testadas na

concentração de 25 µg/mL.


73

Análise de citotoxicidade pelo método do MTT vem sendo utilizada no

programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI), que

testa mais de 10.000 amostras a cada ano (SKEHAN et al., 1990). É um método rápido,

sensível e barato. Foi descrita primeiramente por Mosman (1983), tendo a capacidade

de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula. É uma análise colorimétrica

baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de

tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes

somente nas células metabolicamente ativas. O estudo citotóxico pelo método do MTT

permite definir facilmente a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação (BERRIDGE

et al., 1996).

As células foram plaqueadas na concentração de 1 x 105 células/mL. A

suspensão foi distribuída em placas de cultura com 96 poços (100µL em cada poço). As

placas foram incubadas a 37ºC em estufa de CO2. Após 24h as substâncias testes foram

adicionadas (10 µL/poço) e as placas foram reincubadas a 37ºC por 72 horas em estufa

a 5% de CO2. Em seguida, foram adicionados 25 L da solução de MTT (5mg/mL em

PBS), e as placas foram incubadas por 3h. Ao final desse período o meio de cultura,

juntamente com o excesso de MTT foram aspirados e em seguida, 100 µL de DMSO foi

adicionado a cada poço para dissolução dos cristais formazan (Mosmann,1983 ; Alley et

al.,1988). A leitura óptica foi realizada em leitor automático de placas a 540 nm.

Estes valores foram processados pelo programa GraphPard-Prism 5.0 levando

em consideração que o controle utilizado foi o DMSO a 0,1%. Os ensaios foram

realizados em duplicata e expressos em percentagem de Inibição de Crescimento

Celular (%IC).

A Tabela 03 mostra uma escala de intensidade utilizada para avaliar o potencial

citotóxico das amostras testadas.


74

Tabela 03: Classificação do potencial citotóxico das amostras de acordo com o

método do MTT.

INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO

CELULAR (IC%)

CLASSIFICAÇÃO DO

POTENCIAL CITOTÓXICO

0 – 19% Sem atividade

20 – 49% Pouca atividade

50 – 69% Atividade moderada

70 – 100% Muita atividade

3.10. APLICAÇÃO DO NANOCOMPÓSITO EM SISTEMA BIOLÓGICO

3.10.1. Sistema Biológico

As células utilizadas, neste estudo, são da linhagem NCI-H 292, provenientes

de câncer de pulmão. Estas células foram fornecidas pelo Laboratório de Cultura

Celular do Departamento de Antibióticos, Centro de Ciências Biológicas da UFPE.

As células utilizadas foram cultivadas através de cultura celular em

monocamada.

3.10.1.1. Cultura de Células

São processos onde as células se mantém vivas em recipientes plásticos ou de

vidro, por determinado tempo, com a intenção de utilizá-las em diversos experimentos.

Neste processo, as células são mantidas em meio de cultura líquido e enriquecido, para

o seu melhor desenvolvimento e multiplicação, além de promover as condição ideais de

temperatura, pressão, umidade e pH (Farias et al., 2005).


75

Utilizou-se o meio de cultura DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium,

Gibco), ao qual foi adicionado Soro Bovino Fetal, 1% de aminoácido L-glutamina, 1%

de antibiótico (Estreptomicina e Penicilina).

As células em cultura foram mantidas no Laboratório de Cultura de Células do

Departamento de Antibióticos da UFPE, onde as amostras foram adquiridas.

O procedimento descrito a seguir (3.10.1.2.) é utilizado para as células de câncer

de pulmão por terem um crescimento em monocamada, ou seja, quando as células se

multiplicam aderidas em uma das paredes do frasco de cultura onde são cultivadas

(Figura 26).

Figura 26: Frasco de cultura contendo células descongeladas em manutenção.

Fonte: Nascimento, 2009.

3.10.1.2. Preparo de placa de cultura de Células de câncer de pulmão

Foi retirado, com auxilio de uma bomba à vácuo, o meio de cultura antigo do

frasco que continha células de câncer de pulmão descongeladas em manutenção.

Depois, foi adicionado, ao frasco, 5 mL de tripsina (na superfície de crescimento

celular) sendo incubado na estufa a 35ºC por 3 minutos. Neste período, ocorre o

processo de tripsinização o qual destrói a trama proteica que liga as células promovendo


76

a individualização celular. Em seguida, a tripsina foi retirada e a separação das células

foi confirmada pelo microscópio óptico. Adicionou-se 2,0 mL do meio de cultura

DMEM, fazendo jatos fortes, com a pipeta, contra a parede do frasco onde as células

estavam aderidas. Estes jatos auxiliam no descolamento das células da parede do frasco.

Acrescentou mais 2,0 mL do meio de cultura DMEM e uma alíquota desta suspensão

celular foi transferida para um eppendorf.. A seguir, foi colocado 90µL da suspensão e

10µL do corante azul de Tripan em uma câmara de Neubauer para observar a

viabilidade celular e prosseguir com a contagem de células. Esta contagem levou em

consideração o fator de correção da câmara para ajustar a suspensão em 105 células/mL.

3.10.2. Caracterização do sistema biológico

3.10.2.1. Incubação e Preparo das lâminas

Os materiais utilizados nesta etapa do experimento foram: suspensão celular

contendo 105 células/mL; lamínulas (18 x 18 mm); placas de cultura com 6 poços

(diâmetro de 30mm); meio de cultura DMEM; amostras testadas (CdS/Cd(OH)2; NCQ

na concentração de 2,5mg/mL e NC); solução de PBS e lâminas.

Todo o procedimento foi realizado na câmara de fluxo laminar e as lâminas e

lamínulas usadas foram devidamente esterilizadas.

Uma lamínula foi colocada em cada poço da placa e acrescentado 2mL do meio

de cultura DMEM. A placa foi incubada a 37ºC, CO2 a 5% por 2 hs para permitir a

aderência das células na lamínula. Após este período, retirou-se 500µL/poço do meio e

adicionou (500µL/poço) de cada amostra, sendo então incubada por 2 hs para permitir

que a substância atuasse em todas as células. Em seguida, o sobrenadante foi descartado

e cada lamínula foi retirada e colocada sobre uma lâmina recoberta com 20µL de PBS.


77

As lâminas preparadas foram visualizadas no microscópio de fluorescência

convencional.

3.10.2.2. Microscopia de Fluorescência

A microscopia de fluorescência é uma das técnicas de imagem mais utilizada

para o estudo da dinâmica de células vivas, devido à sua capacidade de isolar diferentes

proteínas com um alto grau de especificidade. Baseia-se no fenómeno que certo material

emite energia detectável como luz visível quando irradiado com luz de um comprimento

de onda específico.

As análises por microscopia de fluorescência foram realizadas com o sistema

Leica CRT4000 do Laboratório de Biofísica-química Professor Ricardo Ferreira do

Grupo de Pesquisa em Nanoestruturas e Interfaces Biológicas da UFPE.

3.10.2.3. Descarte do material biológico

O descarte foi feito fazendo uma limpeza do material utilizado (ex. placas de

cultura de células e ponteiras plásticas) com hipoclorito de sódio a 2 % por 24 hs,

seguido de lavagem manual e descarte do material, sem posterior reutilização.

Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão

78

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A apresentação dos resultados foi dividida em sete tópicos que serão discutidos

na seguinte ordem: (4.1) Caracterização da quitosana; (4.2) Caracterização das

nanopartículas de quitosana; (4.3) Caracterização das nanopartículas de cloridrato de

quitosana; (4.4) Caracterização do quantum dot; (4.5) Obtenção do nanocompósito;

(4.6) Testes de irritabilidade e toxicidade do nanocompósito e (4.7) Aplicação do

nanocompósito em sistema biológico.

4.1. CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA

4.1.1. Características Estruturais


A espectroscopia na região do infravermelho permite observar e classificar

algumas bandas relativas a vibrações características dos grupos funcionais presentes na

estrutura da quitosana. A Tabela 04 mostra as bandas observadas nos espectros da

quitosana comercial (QC) e a quitosana desacetilada (QD) e suas respectivas

atribuições.

Tabela 04: Atribuição das bandas do infravermelho da Quitosana Comercial (QC) e da

Quitosana Desacetilada (QD).

Atribuições Intensidade Nº de onda (cm-1

)

QC QD QC QD

Anéis

Piranosídicos

0,675

0,706

0,966

0,918

1099,22

1152,29

895,33

1250,65

(-CH2 – OH)C-O 0,783 0,938 1384,64 1324,91

amidaC-N 0,787 0,924 1423,21 1430,34

amida IINH 0,781 0,917 1598,69 1588,46

amida IC=O 0,780 0,921 1594,84 1641,18

C-H 0,605 0,885 2923,56 2891,42

O-H 0,474 0,831 3448,09 3444,06

aminaNH 0,474 0,831 3448,09 3444,06


79

Os espectros obtidos para a quitosana comercial (QC) e para a quitosana

desacetilada (QD) mostram respectivamente um pico largo em 3448,09 e 3444,06 cm-1

,

na região correspondente ao estiramento OH. Esta aparece sobreposta à banda de

deformação axial NH do grupo amina (Nunthanid et al., 2001). No entanto, Figueiredo

(2002) relata que o grupo amina primária livre (-NH2) na posição C2 da glucosamina

apresenta outro pico na região entre 1220 e 1020 cm-1

.

Os picos em 2923,56 e 2891,42 cm-1

representam o estiramento C-H alifático

das amostras QC e QD respectivamente. Os picos em 1594,84 e 1641,18 cm-1

correspondem ao grupo amina acetilado da quitina indicando que as amostras não estão

totalmente desacetiladas (Figueiredo, 2002). Contudo, Anjos (2005) especifica este pico

em torno de 1655 cm-1

como sendo referente à banda de deformação axial C=O (amida

I) e o modo vibracional da deformação angular da ligação N-H (amida II) aparece como

um ombro em 1607 cm-1

.

Os picos em 1384,64 e 1324,91 cm-1

representam respectivamente o estiramento

C-O do grupo alcoólico primário (-CH2 – OH) das amostras QC e QD. A deformação

axial de C-N da amida aparece em 1423,21 e 1430,34 cm-1

para a quitosana comercial e

desacertilada, respectivamente. A banda intensa entre 800 e 1200 cm-1

está relacionada

aos anéis piranosídicos (Shigemasa et al., 1996).


O grau de desacetilação é considerado um dos principais parâmetros na

caracterização da quitina e da quitosana. Ele é definido como sendo o número de grupos

amina em relação ao número de grupos amida da cadeia polimérica.

Vários métodos já foram propostos para a sua determinação tais como:

espectroscopia no infravermelho, no ultravioleta, RMN 1H, RMN

13C, análise elementar


80

e titulações potenciométrica e condutimétrica. Entretanto, existe certa discrepância entre

os valores encontrados pelas diferentes técnicas. Por isso, até hoje, ainda busca-se

método mais adequado para sua determinação.

No presente trabalho, dois destes sete métodos foram realizados para determinar

o grau de desacetilação da quitosana: ressonância magnética nuclear de hidrogênio

(RMN 1H) e análise elementar.

4.1.2.1. Ressonância Magnética Nuclear

A ressonância magnética nuclear de 1H é uma técnica que permite a

quantificação de alto grau de desacetilação. A preparação da amostra é simples por

diversos motivos, tais como: não há necessidade de preparar curva analítica; utiliza uma

pequena quantidade de substância (miligramas) e não precisa purificá-la (caso os picos

de impurezas não tenham o mesmo deslocamento químico dos picos relevantes da

quitosana).

Segundo Lavertu, et al. (2003) a determinação do grau de desacetilação por

RMN 1H é feita utilizando uma relação entre os picos referentes aos prótons do grupo

acetoamido da quitina e os outros prótons, exceto o próton do carbono anomérico (C1)

da quitosana/quitina (Figura 27).

Figura 27: Esquema da quitina/quitosana com a numeração dos prótons que aparecem

no RMN 1H. Fonte: Anjos (2005).

OH4

OD

OD

H1

H2

NDH3

OD

C

H5

OD

C

H6

H6'

Hac

OH3C

D Deutério

Carbono

anomérico (C1)


81

Nesta técnica, a amostra de quitosana é dissolvida em solução de ácido

clorídrico deuterado resultando em uma solução viscosa, fazendo-se necessário que a

medida seja realizada a 50ºC para impedir interações intermoleculares e

intramoleculares (Figura 28), que modificam a integração dos picos, influenciando o

valor do grau de desacetilação. Assim, também, é necessário que as medidas sejam

realizadas rapidamente, de modo a minimizar problemas causados pela hidrólise da

quitosana, ou seja, a quebra das ligações glicosídicas que formam o biopolímero.

Figura 28: Interações intramoleculares e intermoleculares em/entre as cadeias de

quitosana. Fonte: Anjos (2005).

A Figura 29 mostra o espectro de RMN 1H para a Quitosana Comercial.

O

NH2

O

HOH2C

O

O

H

n

O

NH2

OO

HOH2C

O

O

H2N

OHO

CH2OH

HOH

n

n

Interações intramoleculares

Interações intermoleculares


82

Figura 29: Espectro de RMN

1H da Quitosana Comercial (QC).

A Figura309 mostra o espectro de RMN 1H para a Quitosana Desacetilada.

26.07 4.67 3.00

Ha

c

H3,4,

5

HD

O

H1

H2

H6,6

’


83

Figura 30: Espectro de RMN

1H da Quitosana Desacetilada (QD).

Tabela 05.: Integração dos picos do espectro de RMN 1H da Quitosana antes e depois da

desacetilação, para o cálculo do grau de desacetilação.

O grau de desacetilação foi calculado pela equação 03, proposta por Hirai et al.

(1991), que utiliza os sinais dos prótons H2, H

3, H

4, H

5, H

6, H

6’ (H

2-6) de ambos os

monômeros e o pico referente aos núcleos do hidrogênio do grupo acetoamido (Hac

).

Hidrogênios

Integração dos picos

QC QD

Hac

3,00 3,00

H2 4,67 44,72

Σ H2,3,4,5,6,6’

30,74 242,1

1006

1

3

11% 62

HHGD ac

197.38 44.727

3.00

Eq. 03


84

Segundo a equação 04 proposta por Signini e Campana Filho (2000), que utiliza

a área do pico na região de 2ppm atribuído aos núcleos de hidrogênio do grupo

acetoamido (Hac

) e a área do pico em 3,4ppm referente ao núcleo de hidrogênio na

posição 2 do anel glicopiranosídico (H2).

Eq.04

Segundo a equação 04 só leva em conta os picos do grupo acetoamido (Hac

) e

dos hidrogênios do carbono na posição 2 do anel glicopiranosídico (H2). A escolha

desses dois picos se deve ao fato de que as áreas relativas aos núcleos dos grupos

metila, presentes no grupo acetamido e ao núcleo na posição 2 do anel

glicopiranosídico, estão relativamente livres das influências do pico de HOD. O

deslocamento químico (δ) de HOD, obtido nos espectros da quitosana antes e depois da

desacetilação, foram semelhantes entre si 4,4 e 4,5 ppm respectivamente. Estes valores

são semelhantes aos relatados por Anjos (2005) e Lavertu et al. (2003) que foi de 4,8

ppm. Estes diferem de Santos et al. (2003) que encontrou um valor próximo a 3,8 ppm.

Os valores dos graus de desacetilação variaram utilizando as equações 03 e 04,

como mostrado na Tabela 06.

Tabela 06: Valores dos graus de desacetilação em porcentagem da quitosana

determinados por RMN 1H, a partir de duas equações distintas.

Quitosana Eq.(03) Eq. (04)

QC 80% 79%

QD 97,5% 98%

1003

1%2

H

HGD

ac


85


A análise elementar é uma ferramenta que pode ser utilizada para a

determinação do grau de desacetilação da quitosana. Apesar de ser um método preciso,

deve ser usado com muita cautela em virtude dos diferentes teores de hidratação, que

variam de acordo com as condições de armazenamento e tratamento prévio da amostra.

A equação 05 foi proposta por Kassai et al. (2000) para determinar o grau de

desacetilação da quitosana, tendo em vista a relação entre carbono e nitrogênio, a qual

pode ser obtida pela análise elementar.

Eq.05

Onde C/N é a razão de carbono/nitrogênio. Esta razão, de acordo com Kassai et

al. (2000), varia de 5,145 em quitosana completamente desacetilada (monômero da

quitosana) a 6,816 em quitina inteiramente acetilada (monômero da quitina).

A Tabela 07 mostra os percentuais de carbono, nitrogênio, hidrogênio, a relação

carbono/nitrogênio e o grau de desacetilação encontrados nas amostras de quitosanas

analisadas.


nitrogênio e o grau de desacetilação das amostras de quitosana comercial (QC), da

quitosana desacetilada (QD).

Quitosana C % N % H % C/N GD%

QC 39,01 7,12 10,58 5,478 80%

QD 36,66 7,08 7,71 5,178 98%

Este método só apresenta resultados precisos para a quitosana que não tem

resíduos de proteínas, caso contrário, é necessário à purificação da mesma. No presente

100

145,5816,6

145,51%

NCGD


86

trabalho não foi preciso purificar as amostras de quitosana, já que os resultados obtidos

na análise elementar foram semelhantes aos encontrados pela ressonância magnética

nuclear de hidrogênio. Por tanto, a próxima etapa do experimento foi à

despolimerização do polímero, a qual foi avaliada através das medidas de viscosidade

determinadas para cada grupo.

4.1.3. Massa Molar

4.1.3.1. Medidas de Viscosidade

As propriedades físico-químicas da quitosana dependem não somente do grau de

desacetilação, mas também da sua massa molar média. As determinações da massa

molar média de polímeros podem ser realizadas por cromatografia de permeação em gel

(GPC) ou por medidas de viscosidades.

A cromatografia de permeação em gel também chamada de cromatografia de

exclusão de tamanho é o método mais utilizado para a determinação da distribuição da

massa molar de polímeros (Stevens, 1999). Uma coluna cromatográfica separa as

frações cujas massas molares apresentam pequena variação. No caso da quitosana, tem

sido discutido o efeito da natureza química dos padrões de calibração sobre a

determinação de massa molar por GPC. Segundo Tsaih & Chen (1999), os melhores

resultados são obtidos através de padrões de calibração da própria quitosana. Entretanto,

a maior dificuldade surge da inexistência de amostras comerciais desses padrões.

Assim, para a determinação da massa molar média da quitosana utilizada neste estudo,

realizou-se medida de viscosidade.

A viscosidade de soluções poliméricas é a medida do volume hidrodinâmico

(tamanho ou extensão no espaço) do polímero em solução. A viscosidade de soluções

poliméricas diluídas é consideravelmente maior que a do solvente puro, ou de soluções


87

diluídas de pequenas moléculas. Isso se deve à grande diferença de tamanho entre as

moléculas do polímero e a do solvente. A viscosidade aumenta à medida que as

dimensões das moléculas poliméricas em solução aumentam. Assim, a viscosidade

polimérica é o resultado da comparação entre o tempo de escoamento do solvente em

um capilar e o tempo de escoamento da solução polimérica a determinada concentração

e temperatura. Embora seja um método não absoluto, a medida de viscosidade pode ser

utilizada para estimar/determinar a massa molar média de polímeros, utilizando-se um

viscosímetro e um capilar tipo Cannon-Fenske.

A medida de viscosidade foi realizada com soluções de quitosana de

concentrações na faixa de 2,0 a 9,0 mg/mL.

A razão do tempo de escoamento da solução do polímero pelo tempo de

escoamento da solução do solvente é chamada de viscosidade relativa. As viscosidades

específicas de cada quitosana foram calculadas aplicando a média dos tempos de

escoamento na expressão descrita abaixo (equação 06). Ambas as viscosidades são

adimensionais.

Eq.06

Onde:

η esp = viscosidade específica da amostra

t = tempo de escoamento da solução no viscosímetro

t0= tempo de escoamento do solvente puro no viscosímetro

Viscosidade reduzida é a viscosidade específica dividida pela concentração e

tem como dimensão o inverso da concentração.

C

esp

red

0

0

t

ttesp

Eq. 07


88

Onde:

η red = viscosidade reduzida da amostra.

C = concentração em gramas de polímero em 100 mL de solução.

As viscosidades intrínsecas das quitosanas foram encontradas pela extrapolação

do gráfico de viscosidade reduzida versus concentração à diluição infinita, com base na

equação 08 de Huggins (1942) mostrada abaixo:

ηred = [η] + KH [η]2 C Eq.08

A viscosidade intrínseca de uma solução polimérica está relacionada com a

massa molar viscosimétrica média (Tabela 08), através da equação de Mark-Houving

(Eq. 09). O valor da constante K e a dependem do polímero, do solvente e da

temperatura. Neste trabalho o solvente utilizado foi o ácido clorídrico na temperatura de

25ºC o qual apresenta os valores de 1,81x 10-5

e 0,93 para K e a, respectivamente.

(Eq.09)

Tabela 08: Valores da viscosidade intrínseca e a massa molar viscosimétrica média das

quitosanas estudadas.

Quitosana Viscosidade intrínseca []

(mL/g)

Massa molar média

(g/mol)

QC 3,8278 5,6 x 105

QC D5% 0,0326 3,2 x 103

QC D15% 0,0168 1,6 x 103

QD 0,4005 4,9 x 104

QD D5% 0,0500 5,2 x 103

QD D15% 0,0088 8,0 x 102

A massa molar média da quitina está entre 1,03 x 106 a 2,5 x 10

6 g/mol. Na

obtenção da quitosana pela reação de desacetilação, este valor é reduzido para 5 x 105 a

5 x 104 g/mol. Os valores das massas molares média das quitosanas QC e QD,

a

MK

_


89

apresentados na Tabela 08, estão de acordo com os relatados na literatura por Santos et

al. (2003) e Anjos (2005). No entanto, os valores dos grupos QC D15% e QD D15%

estão inferiores aos encontrados por Yang et al. (2010), ao empregarem a mesma

metodologia de despolimerização com concentração de 15%. Yang et al. (2010)

conseguiram reduzir a massa molar viscosimétrica de 2,4 x 105 para 3,6 x 10

3,

enquanto que, o presente trabalho, alterou a massa molar de 4,9 x 104 para 8,0 x 10

2.

4.2. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA

4.2.1. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) tem sido muito empregada na

obtenção de informações relativas à forma e ao tamanho das nanopartículas (Yoo et

al.1999; Jeon et al., 2000). A MET pode permitir também a diferenciação entre

nanocápsulas e nanoesferas, possibilitando, inclusive, a determinação da espessura da

parede das nanocápsulas (Mosqueira et al., 2000). Rollot et al. (1986) demonstraram

que as nanoesferas apresentam uma estrutura polimérica sólida, ao passo que, as

nanocápsulas são formadas por um fino (cerca de 5nm) invólucro polimérico ao redor

do núcleo oleoso (Palumbo et al., 2002). Gouvender et al. (2000), através da MET,

mostraram que a incorporação de quantidades baixas ou elevadas de fármacos não altera

a morfologia de nanopartículas de quitosana.

Zhang et al. (2004) realizaram experimentos a fim de encontrar nanopartículas

de quitosana adequadas para liberação de fármaco mucosal. Para isto, os autores

avaliaram a influência do processo de desacetilação e despolimerização na obtenção do

tamanho destas nanopartículas. As imagens de MET das nanopartículas de quitosana

preparadas com quitosana comercial, desacetilada, assim como a desacetilada e

despolimerizada apresentaram respectivamente os seguintes tamanhos: 150-340nm,


90

145-158nm e 98nm. As nanopartículas de quitosana ideais para esta aplicabilidade,

sugerida pelos autores, foram as que obtiveram tamanho de aproximadamente de 98nm

através da MET.

Figura 31: Imagens de MET das nanopartículas de quitosana preparadas com quitosana

(a) comercial ; (b) desacetilada; (c) desacetilada e despolimerizada. Fonte: Zhang et al.

(2004).

As imagens de MET obtidas, neste trabalho, foram as do grupo NQCD5%,

NQCD15%, NQDD5% e NQDD15% visualizadas nas figuras 32(a), 32(b), 33(a) e

33(b), respectivamente. A escolha destes grupos teve como objetivo aprimorar as

descobertas de Zhang et al. (2004) e focar em outra aplicabilidade para estas

nanopartículas.

Figure 1:


Quitosana Comercial Despolimerizada com peróxido a 5%. (NQCD5%) e (b) Quitosana

Comercial Despolimerizada com peróxido a 15%. (NQC D15%).

(b)

150nm

150nm

(a)


91

A morfologia das nanopartículas de quitosana preparadas por gelificação iônica

usando QCD5% apresentou certa agregação entre as partículas, enquanto que, as obtidas

por QCD15% mostraram-se mais individualizadas. A distribuição do tamanho das

partículas é mais homogênea na imagem 32(b) indicando nanoesferas mais uniformes

entorno de 150 nm. A Figura 32(a) mostra as NQCD5% com tamanho entre 160 a

200nm.


Quitosana Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 5%. (NQDD5%) e (b)

Quitosana Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 15%. (NQDD15%).

As imagens de MET dos dois grupos de nanopartículas obtidos pela quitosana

desacetilada não apresentaram agregações entre as partículas. No entanto, mostraram

diferenças na distribuição do tamanho: as NQDD5% são mais heterogêneas

apresentando partículas com tamanho entre 100 e 175nm (Figura 33a) e as NQDD15%

são mais homogêneas com tamanho entorno de 130nm (Figura 33b). Contudo, houve

alteração na morfologia destas partículas, já que, observamos que suas nanoesferas não

são tão bem definidas quanto às visualizadas pelas NQCD15% (Figura 32b).

A morfologia das NQCD15% é semelhante à encontrada por Liu et al. (2007),

que obtiveram nanopartículas de quitosana por gelificação iônica utilizando o

Triton X-100 como surfactante em vez do TPP. No entanto, o tamanho das NQCD15%

(a)

300nm

300nm

(a) (b)


92

apresenta-se 25nm maior do que o encontrado por Liu et al. (2007). Este pequeno

aumento no tamanho é desejável, tendo em vista que o objetivo deste trabalho é

encontrar nanopartículas ideais para o diagnóstico e tratamento do câncer.

Figura 34: Imagem de MET de nanopartículas de quitosana obtidas por gelificação

iônica usando o Triton X-100 como surfactante. Fontes: Liu et al., 2007


Os métodos usuais para a determinação da distribuição de tamanho das

nanopartículas consistem em Microscopia eletrônica de varredura (MEV), Microscopia

Eletrônica de Transmissão (MET) e Medidas de tamanho por Espalhamento Dinâmico

de Luz (DLS) também conhecida por Espectroscopia de correlação de fótons e Difusão

quase elástica de luz. Conforme o método empregado na sua determinação, diferenças

de tamanho de partículas podem ser verificadas, uma vez que a microscopia eletrônica

fornece uma imagem da partícula isolada do meio, enquanto que a espectroscopia de

correlação de fótons possibilita a determinação do raio hidrodinâmico das partículas em

suspensão (Schaffazick et al., 2003).


93

Vários estudos têm sido desenvolvidos para avaliar os principais fatores que

afetam o diâmetro das partículas de sistemas nanoestruturados (Zhang et al., 2004; Gan

& Wang 2007; Liu et al., 2007; Atyabi et al., 2008; Du et al., 2009; Yang et al.,2010).

Geralmente, as nanopartículas, mesmo preparadas através de diferentes métodos,

apresentam diâmetros médios entre 100 e 300nm. No entanto, partículas com diâmetros

entre 50 e 70nm podem ser obtidas (Du et al., 2008). A composição quali-quantitativa e

o método de preparação das nanopartículas são fatores determinantes do diâmetro

médio e da polidispersão das partículas. Segundo Ginani et al. (1999) e Liu et al.

(2007), um fator que também pode interferir no método de gelificação iônica é o tipo de

surfactante empregado.

Medidas de distribuição de tamanho foram realizadas para as NQCD5%,

NQCD15%, NQDD5% e NQDD15%. Verificou-se que os histogramas encontrados

para estes grupos (Figura 35) apresentam resultados ligeiramente inferiores aos obtidos

pela MET. No entanto, como a microscopia fornece apenas uma imagem de uma

pequena porção das nanopartículas isoladas do meio, pode-se dizer que, os resultados de

ambas as técnicas de caracterização estão compatíveis.

No presente trabalho, os histogramas de distribuição de tamanho obtidos para as

NQCD5%; NQCD15%; NQDD5% e NQDD15% estão apresentados na Figura 35 (a,b,c

e d) respectivamente.


94

Figure 35: Histogramas com distribuição de tamanho das nanopartículas de (a)

Quitosana Comerciale Despolimerizada com peróxido a 5%. (QCD5%), (b) Quitosana

Comercial Despolimerizada com peróxido a 15% (QCD15%), (c) Quitosana

(c)

(d)

(b)

(a)


95

Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 5% (QDD5%) e (d) Quitosana

Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 15% (QDD15%).

A figura 35 apresenta uma distribuição bimodal granulométrica das partículas

para as quitosanas que foram despolimerizada com peróxido na concentração de 5%

apresentando tamanhos de 68 e 190nm para as nanopartículas obtidas pela QCD5%

(Fig.35 a) e de 167nm (60%) e 418nm (40%) para as nanopartículas obtidas pela

QDD5% (Fig. 35 c). No entanto, para as quitosanas despolimerizadas a 15% a

distribuição é unimodal granulométrica com tamanho médio das partículas entorno de

122nm e 137nm para as nanopartículas obtidas pela QCD15% (Figura 35b) e pela

QDD15% (Figura 35d) respectivamente. Enquanto que, na MET observam-se poucas

nanoesferas de tamanho próximo a 70nm e a maioria das nanopartículas entre 160 e

200nm para as nanopartículas obtidas pela QCD 5% (Figura 32a), nanoesferas entorno

de 150nm pela QCD15% (Figura 32b), nanopartículas entre 100 e 175nm pela QDD5%

(Figura 33a) e nanoesferas entorno de 130nm pela QDD 15% (Figura 33b).

Os resultados obtidos por DLS para as NQCD5% e 15% apresentaram tamanhos

inferiores aos encontrados por Zhang et al. (2004). Estes pesquisadores observaram

tamanhos diferenciados para as nanopartículas de quitosana comercial (150-340nm),

nanopartículas de quitosana despolimerizada (190-520nm), nanopartículas de quitosana

desacetilada (145-158nm) e para nanopartículas de quitosana desacetilada e

despolimerizada (98 nm) através do método de gelificação iônica conforme observado

na figura 36.


96

Figure 36: Distribuição de tamanho das nanopartículas produzidas por quitosana (a)

comercial, (b) despolimerizada (c) desacetilada (d) desacetilada e despolimerizada

(Zhang et al., 2004).

O resultado de DLS encontrado por Zhang et al (2004) para as nanopartículas

obtidas com as quitosanas desacetiladas obtiveram tamanho médio de 150nm. No

entanto, estas nanopartículas não seriam adequadas para o diagnóstico e/ ou tratamento

de neoplasias devido à presença de dois picos menores encontrados no histograma da

distribuição de tamanho correspondendo a nanopartículas entorno de 20 e 50nm (Figura

36c). Estes tamanhos de nanopartículas são exatamente os que provocam os efeitos

colaterais nas quimioterapias já que não atingem apenas as células cancerígenas como

também as células sadias. Portanto, o presente trabalho teve o objetivo de eliminar estas

nanopartículas menores e obter nanopatículas com 150nm homogêneas e com a

morfologia bem definida. Dessa forma, as nanopartículas de quitosanas ideais para a

aplicabilidade sugerida neste trabalho são as obtidas pela QCD15%.


97

Estas NQCD15% foram utilizadas para funcionalizar os quantum dotss. No

entanto, durante esta etapa experimental, observou-se que as NQCD15% interferiram

nas propriedades de estabilidade coloidal e coalescência dos quantum dots. Isto pode ter

ocorrido devido a incompatibilidade de pH entre as nanopartículas de quitosana (pH

5,0) e do marcador fluorescente (pH 8,5). Por tanto, foi necessário modificarmos estas

nanopartículas a fim de que as mesmas ficassem solúveis em meio aquoso e não

precipitassem em pH fisiológico (7,5). Levando em consideração, estes fatores, foi

elaborado um protocolo inédito (patente) para obter nanopartículas de cloridrato de

quitosana (NCQ).

Estas NCQ foram testadas na funcionalização dos quantum dotss e

posteriormente na marcação das células neoplásicas de pulmão e obtiveram bons

resultados. Resultados estes descritos no tópico 4.7.1.

A caracterização destas nanopartículas inéditas está apresentada no item 4.3,

descrita a seguir.

4.3. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE CLORIDRATO DE

QUITOSANA

Como as NQC, preparadas no presente trabalho, são consideradas inéditas, então

não podemos discutir os resultados obtidos. No entanto, iremos comparar com dados

encontrados na literatura para o cloridrato de quitosana (CQ) e/ ou com os próprios

grupos realizados nesta pesquisa.

4.3.1. Características Estruturais



98

A espectroscopia na região do infravermelho permite observar e classificar

algumas bandas relativas a vibrações características dos grupos funcionais presentes na

estrutura das nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ). A Tabela 09 mostra as

bandas observadas nos espectros da NCQ e suas respectivas atribuições.

Tabela 09: Atribuição das bandas do infravermelho das Nanopartículas de Cloridrato de

Quitosana (NCQ).

Atribuições Intensidade Nº de onda (cm-1

)

NCQ NCQ

Anéis

Piranosídicos

0,639

0,801

1080,84

1149,96

(-CH2 – OH)C-O 0,842 1378,41

amidaC-N 0,948 1514,71

Amida II NH 0,853 1606,86

Amida IC=O 0,829 1652,94

C-H 0,874 2998,72

O-H 0,554 3432,59

AminaNH 0,554 3432,59

O espectro obtido para as NCQ mostra um pico largo em 3432,59 cm-1

, na

região correspondente ao estiramento OH. Esta aparece sobreposta à banda de

deformação axial NH do grupo amina (Nunthanid et al., 2001). Provavelmente ocorre

uma incorporação de íons cloreto (Cl) ao grupamento amina protonado. Esta diferença

estrutural implica em alterações de propriedades que refletem na aplicabilidade deste

material.



O grau de desacetilação das NCQ foi determinado através da análise elementar

de acordo com Kassai et al. (2000), como descrito no tópico 4.1.2.2.


99

A Tabela 10 mostra os percentuais de carbono, nitrogênio, hidrogênio, a relação

carbono/nitrogênio e o grau de desacetilação encontrado para as NCQ.


nitrogênio e o grau de desacetilação da amostra de nanopartículas de cloridrato de

quitosana (NCQ).

Quitosana C % N % H % C/N GD%

NCQ 39,97 7,34 10,37 5,446 82%

Signini & Campana-Filho (1998) determinaram o grau de desacetilação do

cloridrato de quitosana (GDCQ= 77,3%) enquanto que, no presente trabalho foi

encontrado um GDNCQ= 82%. Isto sugere um aumento de 4,7% do GD após as

preparações das nanopartículas através do processo de gelificação iônica.

4.3.3. Massa Molar

4.3.3.1. Medidas de viscosidade

A medida de viscosidade foi realizada com soluções de nanopartículas de

cloridrato de quitosana (NCQ) nas concentrações de 2,0 a 9,0 mg/mL.

O protocolo usado para obter a massa molar viscosimétrica desta NCQ foi à

mesma descrita no tópico 4.1.3.1.

Tabela 11: Valores da viscosidade intrínseca e a massa molar viscosimétrica média das

nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ).

Quitosana Viscosidade intrínseca []

(mL/g)

Massa molar média

(g/mol)

NCQ 0,0132 1,2 x 103


100

Na obtenção da NCQ foi utilizada a QCD15%, portanto se faz necessário

comparar as duas massas molares. Os valores encontrados para as massas molares

média da QCD15% e da NCQ foram de 1,6x103

e 1,2 x 103

g/mol, respectivamente.

Então, pode-se dizer que a modificação da estrutura da quitosana de comercial para

cloridrato associada ao processo de gelificação iônica acarretou uma pequena redução

da massa molar deste polímero. No entanto, observou-se uma redução maior na massa

molar da QDD15% que apresentou o processo de desacetilação associado ao de

despolimerização com peróxido a 15% (8,0 x 102g/mol).

Os valores das massas molares viscosimétricas das QCD15% e da QDD15%

estão apresentados na Tabela 08.

É importante reforçar que as NCQ são um material novo (patente) e por isto não

existe na literatura resultados que possamos comparar. No entanto, o cloridrato de

quitosana (CQ) é abordado em alguns artigos (Signine & Campana Filho, 1998; Signine

& Campana Filho 2001; Gonçalves et al., 2005). A massa molar viscosimétrica do

cloridrato de quitosana já foi determinada por Signini & Campana Filho, (1998) e por

Bezerra (2011) que encontraram valores de 1,26 x 106

g/mol e 6,9 x 105 g/mol

respectivamente. Estes valores são superiores ao encontrado para as NCQ (1,2 x 103

g/mol).

4.3.4. Microscopia Eletrônica de Transmissão

As imagens de MET obtidas para as NCQ estão visualizadas nas figuras 38(a) e

38(b). A escolha deste grupo teve como objetivo melhorar a funcionalização dos

quantum dots e consequentemente focar na aplicabilidade proposta neste trabalho.

Finalidade esta, que seria encontrar um material capaz de diagnosticar neoplasias


101

pulmonares e que futuramente possa ser associado a fármacos a fim de reduzir,

consideravelmente, os efeitos colaterais dos tratamentos quimioterápicos.

Figura 37: Imagens de MET das nanopartículas de cloridrato de quitosana (a) a barra de

tamanho é de 145nm e (b) a barra de tamanho é de 50nm.

A morfologia das NCQ preparadas por gelificação iônica usando QCD15% não

apresentou agregação entre as partículas. Neste aspecto foi semelhante as imagens

obtidas para as NQCD15% as quais mostraram-se bem individualizadas (Figura 32b).

A distribuição do tamanho das partículas é considerada homogênea em ambos os grupo

(Figura 32b e 37ª) indicando nanoesferas entorno de 150 e 145nm respectivamente.

A morfologia das NCQ observada na Figura 38b é bem diferente do encontrado

para os outros grupos desta pesquisa e também para outras imagens de nanopartículas

de quitosana apresentadas na literatura. Acredita-se que estes aspecto “de filamentos”

visualizados na superfície destas NCQ pode ser responsável pela peculiaridade das

propriedades e consequentemente aplicabilidade deste novo material. No entanto, outras

caracterizações e futuros experimentos fazem-se necessários antes de considerarmos

que estas nanopartículas são ideais para o diagnóstico e tratamento do câncer.

4.4. CARACTERIZAÇÃO DOS QUANTUM DOTS DE CdS/Cd(OH)2

4.4.1. Espectroscopia de absorção eletrônica


102

A suspensão foi analisada através de espectroscopia de absorção na região do

ultravioleta-visível. Através desta técnica pode-se verificar a qualidade da suspensão

coloidal com relação à sua homogeneidade. Mesmo sendo um método de preparação

relativamente simples e reprodutível, pequenas variações nas condições de síntese

resultam em grandes modificações na estabilidade da suspensão e no tamanho, assim

como na dispersão das partículas obtidas.

No espectro de absorção pode-se verificar, por exemplo, se ocorre espalhamento

causado por partículas maiores do que 1μm.

Segundo Santos (2002), relações Cd/S>1, durante a síntese, resultam no

deslocamento da banda de absorção para energias maiores, indicando uma diminuição

do tamanho das partículas. Um espectro representativo da suspensão de CdS/Cd(OH)2

está evidenciado na Figura 39.

300 400 500 600

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Ab

s. (

u.a

.)

Comprimento de onda (nm)

Figura 38: Espectro de absorção da suspensão de nanopartículas de CdS/Cd(OH)2

Segundo Vossmeyer (1994), o tamanho da partícula pode ser relacionado

diretamente com o valor do primeiro máximo do comprimento de onda de absorção. Em


103

476nm foi descrito um tamanho de aproximadamente 9,6nm e um band gap de 2,6eV,

destacando o regime de confinamento quântico fraco.

O espectro obtido apresenta absorção em torno de 471 nm, valor próximo a

valores descritos na literatura (Vossmeyer, 1994;Santos, 2002; Chaves, 2006).

4.4.2 Espectros de Excitação e Emissão

Os espectros de excitação e emissão da amostra de CdS passivada com Cd(OH)2

estão apresentados na figura 40 (a) e (b). Através destes espectros, podem-se verificar

os possíveis comprimentos de onda usados para excitar a amostra. No caso, pode excitar

as nanopartículas de CdS, passivadas por Cd-OH, nas regiões mais intensas do espectro

(375, 420 e 468nm), destacadas na figura 40 (a).

O espectro de emissão se constitui em um registro das intensidades de emissão

nos diversos comprimentos de onda da banda de emissão, em um comprimento de onda

fixo de excitação. Para suspensões de nanopartículas de CdS/Cd(OH)2 o espectro de

emissão foi obtido excitando a amostra em 365nm.

280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500

600000

700000

800000

900000

1000000

1100000

1200000

Figura 39: Espectros de: (a) excitação e (b) emissão da suspensão de CdS/Cd(OH)2

representados pela intensidade normalizada (u.a) versus comprimento de onda (nm).

400 450 500 550 600

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000(a) (b)

Excitação

Em 365nm

Intensidade

Máxima de

1200000nm

ʎ = 490nm


104

A posição do máximo (490nm) no espectro de emissão visualizado na figura

40(b) dá informações sobre a estrutura eletrônica do semicondutor e do tamanho das

partículas. Já a intensidade do pico revela os efeitos de superfície e de impurezas.

Para a Figura 40 (b), observamos uma intensidade máxima em torno de

1200000. O espectro de emissão informa características como à homogeneidade das

populações de nanopartículas envolvidas no processo de luminescência. A largura de

banda caracteriza qualitativamente os diferentes tamanhos existentes nas populações de

nanopartículas.

É importante destacar que o aumento da diluição das suspensões de

nanopartículas de CdS/Cd(OH)2 causa uma diminuição na intensidade da

luminescência, segundo observado no laboratório durante as tentativas de

funcionalização do quantum dots com as nanopartículas de quitosana. Além de haver

precipitação das quitosana durante este processo devido ao pH básico do meio.Tendo

sido, portanto, este o motivo da obtenção dos cloridrato de quitosana a fim de evitar

este efeito indesejável.

4.5. OBTENÇÃO DOS NANOCOMPÓSITOS

4.5.1. Potencial Zeta

O potencial zeta reflete o potencial de superfície das partículas, o qual é

influenciado pelas mudanças na interface com o meio dispersante, em razão da

dissociação de grupos funcionais na superfície da partícula ou da adsorção de espécies

iônicas presentes no meio aquoso de dispersão (Schaffazick et al., 2003).

Para caracterização da superfície das nanopartículas realizamos medidas para

verificar o potencial zeta das suspensões apresentadas na Tabela 12.


105

Tabela 12: Valores de potenciais encontrados para as amostras testadas.

pH Amostras Potencial Zeta

4,5

7,5

NQCD15%

NCQ

+ 40,63 mV

- 39,76 mV

8,5 CdS/Cd(OH)2 -26,12 mV

7,5 CdS/Cd(OH)2 + Glutaraldeído (0,01%) - 29,34 mV

7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (1:10)* - 26,42 mV

7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (1:5)* - 26,66 mV

7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (1:2)* - 26, 98 mV

7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (1:1)* - 27,34 mV

7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (5:1)* - 27,64 mV

7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (25:1)* - 29,55 mV

7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (50:1)* - 37,86 mV

7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (100:1)* - 29,75 mV

*Relação volume/volume como referido no item 3.8.1.2.

Na Tabela 12, estão descritos os valores de pH e de cada potencial zeta

encontrados para as amostras de NQCD15%, CdS passivadas com Cd(OH)2 e

funcionalizadas com glutaraldeído e com diferentes diluições de NCQ.

Chaves (2006) e Nascimento (2009) ao determinarem o potencial zeta do

CdS/Cd(OH)2 encontraram valores de ζ= -25,66 mV e ζ= -28,20 mV, respectivamente.

No presente trabalho, foi verificado um valor de ζ= -26,12. Estes três resultados

provavelmente diferem devido ao valor de pH da suspensão. Os autores citados acima

também obtiveram valores de potencial zeta para o CdS/Cd(OH)2 funcionalizado


106

com Glutaraldeído (0,01%) e encontraram os seguintes resultados: ζ= -27,64 mV e

ζ= -32,00mV.

Os resultados obtidos, nesta pesquisa, para suspensões de CdS/Cd(OH)2, sem

funcionalizante (ζ= - 26,12), e com funcionalizantes (ζ= -26,42 entre ζ= -37,86),

comprovaram um aumento da estabilidade das suspensões quando funcionalizadas com

glutaraldeído ou com as diferentes concentrações das NCQ. No entanto, Observou que a

proporção entre quantum dot e funcionalizante altera a estabilidade da amostra. O grupo

considerado mais estável, através do potencial zeta, foi o CdS/Cd(OH)2 + NCQ (50:1)

com pH= 7,5. Por tanto, estes quantum dots funcionalizados com estas NCQ foram

aplicados na marcação de células neoplásicas pulmonares.

4.6. TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE DO NANOCOMPÓSITO

4.6.1. Teste de Irritabilidade por HET-CAM

Tabela13. Potencial de irritação da água destilada (AD), Solução salina 0,9% (SS

0,9%), Sulfeto de cádmio (CdS) , Sulfeto de cádmio passivado com camada de

hidróxido de cádmio (CdS/Cd(OH)2), Nanopartícula de cloridrato de quitosana (NCQ),

Nanocompósito (NC) para o teste da Membrana Corialantoide do ovo (HET-CAM) para

vasoconstricção, hemorragia e coagulação. Controle positivo: lauril sulfato de sodio 1%

(LSS1%). Os ensaios foram repetidos 5 vezes.

Parâmetros AD SS 0,9% CdS CdS/Cd(OH)2 NCQ NC LSS 1%

Vasoconstrição ND ND 22.0 ± 5.2 30.2 ± 3.5 ND ND 6.0 ± 1.0

Hemorragia ND ND 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 ND ND 48.0 ± 3.0

Coagulação ND ND 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 ND ND 63.0 ± 3.0

Potencial de irritação ND ND 6.51 ± 0.12 6.32 ± 0.08 ND ND 17.74 ± 0.4

ND: Não detectado; Não-irritate: ND-0.9; pouco irritante: 1.0-4.9; Irritante: 5.0-8.9 e Severamente irritante: 9.0-21.0.


107

4.6.1.1. Água destilada

Após administração de 200 µL de água na membrana corioalantóide do ovo e

transcorridos 5 minutos de observação, foi constatado que a água não proporcionou

hemorragia sanguínea, coagulação ou vasoconstricção dos vasos. O mesmo resultado

foi observado nas 5 repetições. Portanto, a água pode ser considerada não irritante, uma

vez que não proporcionou nenhum efeito irritante na membrana corioalantóide do ovo

em um período de observação de 5 minutos.

4.6.1.2. Salina 0,9%

Após administração de 200µL de salina 0,9% na membrana corioalantóide do

ovo e transcorridos 5 minutos de observação, foi constatado que a salina 0,9% não

proporcionava hemorragia sanguínea, coagulação ou vasoconstricção dos vasos. O

mesmo resultado foi observado em 5 repetições. Logo, a solução salina 0,9% também é

considerada não irritante.

4.6.1.3. CdS

Após administração de 200µL de CdS na membrana corioalantóide do ovo e

transcorridos 5 minutos de observação, foi constatado que esta substância

proporcionava vasoconstricção. O mesmo resultado foi observado nas 5 repetições.

Os tempos iniciais dos processos de vasoconstricção foram inseridos na fórmula

abaixo:

(301- Hemorragia) x5 + (301- vasoconstricção) x7 + (301-Coagulação) x9

300 300 300

A Tabela 13 mostra a média das cinco repetições e o desvio padrão dos

resultados numéricos que indicam o potencial de irritação do sulfeto de cádmio (CdS);

do hidróxido de cádmio (CdS/Cd(OH)2) e do controle positivo lauril sulfato de sodio

1% (LSS1%).


108

No caso específico do teste com o CdS a observação da membrana

corioalantóide prosseguiu além dos 5 minutos, em 10, 15 e 20 minutos. Foi observado

que aos 20 minutos possivelmente a amostra de CdS promove hemorragia o que não foi

observado nos 5 minutos iniciais da observação. Onde fica evidente o agravamento da

irritação com o transcorrer do tempo.

4.6.1.4. CdS/ Cd(OH)2

Após administração de 200µL de CdS/Cd(OH)2 na membrana corioalantóide do

ovo e transcorridos 5 minutos de observação, foi constatado que esta substância

proporciona vasoconstricção. O mesmo resultado foi observado nas 5 repetições. Os

dados numéricos apresentados na Tabela 13 indicam o potencial de irritação do

CdS/Cd(OH)2 com um valor da média ± desvio padrão igual á 6,32 ± 0,08. Deste modo,

o CdS/Cd(OH)2 pode ser considerado irritante.

4.6.1.5. Nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ).

Após administração de 200µL de NCQ na membrana corioalantóide do ovo e

transcorridos 5 minutos de observação, fiu constatado que esta substância não

proporciona vasoconstricção, hemorragia e coagulação. O mesmo resultado foi

observado nas 5 repetições. Assim, de acordo com os resultados apresentados na tabela

13 as nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ) podem ser consideradas não

irritantes.

4.6.1.6. Nanocompósito (NC).

Após administração de 200µL de NC na membrana corioalantóide do ovo e

transcorridos 5 minutos de observação, foi constatado que esta substância não

proporciona vasoconstricção, hemorragia e coagulação. O mesmo resultado foi

observado em 5 repetições. Por isto, de acordo com os resultados observados na Tabela

13, os nanocompósitos (NC) podem ser considerados não irritantes.


109

4.6.1.7. Lauril sulfato de sódio á 3%

Após administração de 200µL de lauril sulfato de sódio à 3% em solução aquosa

na membrana corioalantóide do ovo e transcorridos 5 minutos de observação, foi

constatado que esta substância proporciona vasoconstricção, hemorragia sanguínea e

coagulação. O mesmo resultado foi observado nas 3 repetições. Os dados numéricos

apresentados na Tabela 13 indicam o potencial de irritação do lauril sulfato de sódio à

3% com um valor da média ± desvio padrão igual á 19,10 ± 0,06. Deste modo, o lauril

sulfato de sódio à 3% é considerado um irritante grave ou severo como visualizado na

Figura 40.

Figura 40: Microfotografia da membrana corioalantóide. (A) Aparência normal do

epitélio e de seus componentes e (B) Controle positivo de irritação NaOH a 0,1N,

visualizando hemorragia (H), lise vascular (L) e coagulação (C). Fonte: Bessa, 2010.


110

4.6.2. Teste de Toxicidade pelo Método de MTT

Após obter a absorbância de cada grupo através do leitor ELISA no

comprimento de onda de 540nm, foi elaborada a Tabela 23 apresentada abaixo. O

percentual de Inibição de Crescimento Celular (% IC) foi calculado pelo programa

GraphPard-Prism.

Tabela 14: Valores de absorbância (Abs.) e percentual de Inibição de

Crescimento Celular (% IC) obtidos para o grupo controle, CdS/Cd(OH)2, NCQ e NC.

Grupo Abs. 1

λ(nm)

Abs. 2

λ(nm)

Ʃ Abs. % IC

GraphPard-

Prim

Controle 0,689 0,660 0,675 0

CdS/Cd(OH)2 0,715 0,746 0,731 0

NCQ 0,662 0,648 0,655 0

NC 0,723 0,699 0,711 0

NCQ: nanopartícula de cloridrato de quitosana; NC: nanocompósito.

A Tabela 14 mostra resultados numéricos que indicam a ausência de atividade

citotóxica do CdS/Cd(OH)2; NCQ e NC.

Por tanto, pode-se dizer que o CdS/Cd(OH)2 foi considerado irritante, mas sem

atividade citotóxica de acordo com o método do HET-CAM e MTT, respectivamente. A

NCQ e o NC não são irritantes nem citotóxicos segundo os resultados encontrados pelos

ensaios biológicos utilizados no presente trabalho.


111

4.7. APLICAÇÃO DO NANOCOMPÓSITO EM SISTEMA BIOLÓGICO

O sistema biológico estudado foi à linhagem de cultura de células de câncer de

pulmão e para avaliar a aplicabilidade dos nanocompósitos verificou-se a luminescência

através da microscopia de fluorescência convencional dos respectivos grupos:

1) Meio de cultura DMEN (BRANCO);

2) CdS/Cd(OH)2 sem funcionalizante;

3) NCQ na concentração de 2,5mg/mL;

4) CdS/Cd(OH)2 funcionalizado com glutaraldeído a 0,01% (CONTROLE);

5) CdS/Cd(OH)2 funcionalizado com NCQ na relação de (1:10);

6) CdS/Cd(OH)2 funcionalizado com NCQ na relação de (50:1) e

7) CdS/Cd(OH)2 funcionalizado com NCQ na relação de (100:1);

4.7.1. Células de Câncer de Pulmão

A incubação das células de câncer de pulmão foi realizada por um período de 2

horas e observou-se luminescência facilmente detectável na região do vermelho (560-

700nm), devido à autofluorescência destas células. Sabe-se que alguns materiais

biológicos contêm compostos aromáticos e a ressonância destes pode gerar

luminescência.

Figura 41: Imagem da microscopia de fluorescência de células neoplásicas pulmonares

com meio de cultura DMEN (Grupo:BRANCO). A) Fluorescência no visível; B)

Fluorescência no vermelho e C) Sobreposição das imagens A e B.


112

A Figura 41 mostra a imagem das células vivas do câncer de pulmão com o meio

de cultura DMEN. Este grupo é denominado de BRANCO por não apresentar nenhuma

amostra a ser analisada.

As células da linhagem NCI-H 292 foram incubadas com NCQ (2,5mg/mL) por

um período de 18 horas para permitir que a substância atuasse em todas as células. Foi

visualizado, também, fluorescência apenas no vermelho (620-770nm). Isto demonstra

que as NCQ sem o quantum dot não são capazes de marcar as células de câncer de

pulmão.

A figura 42 apresenta imagem de microscopia de fluorescência de células

neoplásicas pulmonares cultivadas em 1,5mL de meio de cultura DMEN e tratadas com

500µL de NCQ (2,5mg/mL).

Figura 42: Imagens de microscopia de fluorescência de células neoplásicas pulmonares

com meio de cultura DMEN e NCQ (2,5mg/mL) na proporção de (3:1) por 18 horas.

A) Fluorescência no visível; B) Fluorescência no vermelho e C) Sobreposição das

imagens A e B.

O sistema biológico estudado foi marcado com o CdS passivado com Cd(OH)2

sem funcionalizante por 18 horas. As imagens confirmaram que o quantum dot não

conseguiu marcar bem as células, possivelmente, por não apresentar interação com as

mesmas, ficando, por tanto, disperso no meio de cultura o que acarretou na marcação do

fundo e não das células.


113

A figura 43 mostra imagens obtidas pela microscopia de fluorescência em

cultura de células de câncer de pulmão incubadas com 1,5mL de meio de cultura

DMEN e 500µL de CdS/Cd(OH)2. Ao excitar a amostra na região do azul (450-490nm),

observa-se emissão no verde (500-565nm) e excitando no verde, verifica emissão no

vermelho (620-770nm). A imagem apresentada na figura 43D representa a sobreposição

destas contribuições, originando colorações diferenciadas.


com meio de cultura DMEN e CdS/Cd(OH)2 na proporção de (3:1) por 18 horas. A)

Fluorescência no visível; B) Fluorescência no vermelho; C) Fluorescência no verde e D)

Sobreposição das imagens A, B e C.

O presente trabalho utilizou como grupo CONTROLE o quantum dot

funcionalizado com glutaraldeído já que este funcionalizante é conhecido e empregado

em marcações de células neoplásicas (Chaves, 2006; Nascimento, 2009). De tal forma

que primeiro foi preparado o NC na proporção de 50:1 (1mL de CdS/Cd(OH)2 com

20µL de Glutaraldeído 0,01%). Depois, retirou-se 500µL deste NC e acrescentou á

cultura de células da linhagem NCI-H292 com 1,5mL de meio de cultura DMEN.

As células de câncer de pulmão foram marcadas com CdS/Cd(OH)2

funcionalizadas com glutaraldeído a 0,01% durante 18horas. Detectou-se uma leve

fluorescência no verde (500-565nm) o que sugere uma possível ligação do glutaraldeído

com as proteínas presentes nas membranas das células neoplásicas pulmonares.


114

A Figura 44 apresenta imagens obtidas pela microscopia de fluorescência das

células vivas do câncer de pulmão com CdS/Cd(OH)2 funcionalizado com

glutaraldeído.


com meio de cultura DMEN e NC (CdS/Cd(OH)2 com Glutaraldeído – Grupo:

CONTROLE) na proporção de (3:1) por 18 horas. A) Fluorescência no visível; B)

Fluorescência no vermelho; C) Fluorescência no verde e D) Sobreposição das imagens

A, B e C.

Chaves (2006) observou imagens de MET de astrócitos e glioblastomas

marcados com CdS/Cd(OH)2 + glutaraldeído a 0,01% com diferentes tempos de

incubação e sugeriu que dois processos competiam cineticamente entre si: a interação

do marcador com proteínas da superfície celular e a sua endocitose.

Como descrito no item 3.8.1.2., antes do processo de funcionalização, foram

realizados, no presente trabalho, vários testes de diluições para verificar a “eficiência da

luminescência” do quantum dot na presença da solução de NCQ. Os nanocompósitos

preparados foram:

• 0,5mL CdS/Cd(OH)2 + 5mL NCQ (1:10)




• 2,5mL CdS/Cd(OH)2 + 100µL NCQ (25: 1)

• 5mL CdS/Cd(OH)2 + 100µL NCQ (50: 1)

• 10mL CdS/Cd(OH)2 +100µL NCQ (100:1)


115

No entanto, depois de observar a baixa luminescência de alguns destes NC e

comprovar a instabilidade dos mesmos através dos resultados obtidos pelo potencial

zeta, ficou decidido realizar a marcação celular de apenas três destes NC:

1º) CdS/Cd(OH)2 com NCQ na proporção de 1:10; 2º) CdS/Cd(OH)2 com NCQ na

proporção de 50:1 (mais luminescente e estável) e 3º) CdS/Cd(OH)2 com NCQ na

proporção de 100:1. A Figura 45, 46 e 47 apresentam imagens obtidas pela microscopia

de fluorescência das células vivas do câncer de pulmão com os respectivos

nanocompósitos (NCs) citados anteriormente.

Figura 45: Imagens de microscopia de fluorescência no visível de células neoplásicas

pulmonares com: a) DMEN com NC (0,5mL de CdS/Cd(OH)2 e 5mL de NCQ – relação

1:10) na proporção de (3:1) por 18 horas e b) meio de cultura DMEN.

Não foi detectada luminescência na região no azul, verde ou vermelho para as

células de câncer de pulmão marcadas com o NC (relação 1:10). Contudo, observou-se

no visível que as células só com o meio de cultura continuaram a se movimentar, mas

não foi capturado imagens da fluorescência, devido à baixa intensidade de emissão.

Pode-se observar na imagem da Figura 45A uma quantidade significativa concentrada

do NC em determinados pontos (com formação de ilhas e aglomerados de

nanopartículas) entre as células de câncer de pulmão.


116

A figura 46 destaca imagens obtidas para marcação das células de câncer de

pulmão funcionalizadas com NC (50:1). Após 18 de incubação, verificou-se uma boa

marcação na região do vermelho (620-770nm) e do verde (500-565nm) em

determinadas regiões das células neoplásicas.

O elevado índice de luminescência para este NC (50:1), bem como a diferença

morfológica observada nestas células, parece indicar que este NC não encontra barreira

para sua interação com o sistema biológico estudado.


com meio de cultura DMEN e NC (1mL de CdS/Cd(OH)2 com 20µL de NCQ – relação

50:1) na proporção de (3:1) por 18 horas.

A figura 47 mostra imagens de microscopia de fluorescência obtidas para

marcação das células de câncer de pulmão funcionalizadas com NC (100:1). Após 18 de

incubação, observou uma discreta marcação das células neoplásicas na região do

vermelho (620-770nm) e do verde (500-565nm).


com meio de cultura DMEN e NC (1mL de CdS/Cd(OH)2 com 10µL de NCQ – relação

100:1) na proporção de (3:1) por 18 horas.


117

O nosso grupo de pesquisa NIB (Nanoestruturas e Interfaces Biológicas)

realizou recentemente experimentos in vivo de acordo com o que segue:

- Um grupo de 120 camundongos foi submentido à inalação de aerosol

suspensão aquosa de quantum dots de CdS/Cd(OH)2 e CdS/Cd(OH)2 funcionalizados

com glutaraldeído (CdS/Cd(OH)2/Glut). Durante três dias esse grupo de animais foi

submetido à inalação, aspirando à atmosfera saturada de suspensão contendo quantum

dots. Tal procedimento foi realizado para os dois tipos de quantum dots aqui

mencionados.

- Um grupo de 120 camundongos foi mantido nas mesmas condições de

temperatura, alimentação, e demais parâmetros, exceto pela atmosfera do ambiente, que

foi mantida normal, sem a presença de quantum dots.

- Um grupo de 12 camundongos recebeu injeção subcutânea de suspensão de

quantum dots não funcionalizados (0,5 mg/ml).

- Um grupo de 12 camundongos recebeu injeção subcutânea de suspensão de

quantum dots subcutâneos (0,5mg/ml).

O volume utilizado para a injeção subcutânea foi o mesmo que vem sendo

utilizado pela BASF no estudo toxicológico de outros tipos de nanomateriais.

Observou-se que:

1- Os camundongos submetidos à aspiração e à injeção de quantum dots

não funcionalizados apresentaram uma pequena quantidade de íons Cd+2

no pulmão e

no fígado, implicando, por tanto certa toxicidade para este grupo experimental;

2- Em ambos os casos, o cádmio foi excretado nas fezes e não na urina;

3- O grupo submetido ao quantum dot funcionalizado com glutaraldeído

não apresentou toxicidade significativa.


118

O resultado obtido, pelo presente trabalho, em relação à toxicidade encontrada

através do método do MTT, concorda com o terceiro resultado encontrado por nosso

grupo de pesquisa realizado com a BASF. Embora, os funcionalizantes usados tenham

sido diferentes. Sugere-se realizar novos estudos in vivo com os nanocompósitos de

CdS/Cd(OH)2 funcionalizados com nanopartículas de cloridrato de quitosana.

Thatiana M. Stamford __________________________________________ Conclusões

119

5. CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos e considerando as condições

empregadas no presente estudo, pode-se concluir que:

O processo de desacetilação utilizado nesta pesquisa é eficaz para o

aumento do grau de desacetilação da quitosana comercial;

O processo de despolimerização com peróxido nas concentrações

utilizadas é eficaz tendo em vista que altera a massa molar viscosimétrica da

quitosana comercial;

O processo de desacetilação associado ao de despolimerização

apresenta ótimos resultados na redução da massa molar viscosimétrica da

quitosana comercial.

O grau de desacetilaçaõ e despolimerização influenciam na obtenção das

nanopartículas de quitosana ao empregar o método de gelificação iônica com

tripolifosfato de sódio (TPP);

A morfologia e a distribuição de tamanho das nanopartículas de

quitosana observadas por MET e DLS, respectivamente, sofrem alterações de acordo

com os diferentes valores de desacetilação e despolimerização.

As nanopartículas de quitosanas com grau de desacetilação de 80% e

98% seguidas de despolimerização com peróxido de hidrogênio de 5% ou 15% não são

capazes de funcionalizar o CdS/Cd(OH)2. No entanto, verifica-se nanopartículas com

morfologia mais definidas, assim como, uma distribuição mais homogênea nas

NQCD15%;

Thatiana M. Stamford __________________________________________ Conclusões

120

As nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ) obtidas a partir das

NCD15% são capazes de funcionalizar o CdS passivado com Cd(OH)2;

As células neoplásicas pulmonares da linhagem NCI-H292 apresentam

uma autofluorescência no vermelho;

O CdS passivado com Cd(OH)2 não é capaz de aderir-se as células

neoplásicas pulmonares;

Segundo as imagens obtidas pela microscopia de fluorescência, as NCQ

provavelmente interagem com as células da linhagem NCI-H292;

O CdS/Cd(OH)2 funcionalizado com as NCQ conseguem marcar as

células neoplásicas pulmonares quando utilizados na proporção de 50:1.

O CdS e o CdS/Cd(OH)2 são considerados irritantes e que as NCQ e o

NC não são irritantes segundo o método HET-CAM.

O CdS, o CdS/Cd(OH)2, a NCQ e o NC não apresentam atividade

citotóxica de acordo com o método de MTT.


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138

PRODUÇÃO CIENTÍFICA DURANTE O DOUTORADO (2008-2012)

ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS

1. Physico-Chemical Characteristics and Functional Properties of Chitin and Chitosan

Produced by Mucor circinelloides Using Yam Bean as Substrate. Molecules (Basel.

Online), v. 16, p. 7143-7154, 2011. doi:10.3390/molecules16087143

2. Chitosan effect on dental enamel de-remineralization: An in vitro evaluation. Journal

of Dentistry, v.38, p.848 - 852, 2010 doi:10.1016/j.jdent.2010.06.004

3. Estudo experimental da ação do flúor na prevalência de cárie. Revista Brasileira de

Ciências da Saúde. , v.12, p.159 - 168, 2008.

CAPÍTULOS DE LIVROS PUBLICADOS

1. Influence of carbon and nitrogen source on the chitin and chitosan production by

Rhizopus arrhizuz–Factorial design

In: MICROBES IN APPLIED RESEARCH Current Advances and Challenges.1ed.

Espanha : World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, 2012, p. 412-416.

ISBN 1397898144050

2. Caracterização da quitosana e sua aplicação na nanotecnologia

In: Biotecnologia aplicada à agricultura: textos de apoio e protocolos experimentais.1

ed.Brasilia\Recife : EMBRAPA \ IPA, 2010, v.1, p. 733-760.

ISBN 9788573834956

TRABALHOS COMPLETOS PUBLICADOS EM ANAIS DE

CONGRESSOS

1. Physico-chemical characterization of chitosan from M. circinelloides.

In: 9th International Conference of the European Chitin Society, 2009, Veneza.

Conference Book EUCHIS 2009, 2009

http://dx.doi.org/10.3390/molecules16087143


139

RESUMOS EXPANDIDOS PUBLICADOS EM ANAIS DE

CONGRESSOS

1. Biocompatibility and antifungal potential of chitosan with differents molecular weight

against Penincillium

In: 6th Iberoamerican Chitin Society (VI SIAQ) and 12th International Conference on

Chitin and Chitosan (XII ICCC), 2012, Fortaleza. General Program and Book of

Abstracts. , 2012. p.105 - 105

2. Antimicrobial activity of chitosan with differents molecular weight mouthwash against

Streptococcus mutans: Comparative study with commercial mouthwashes

In: 6 th Iberoamerican Chitin Symposium, 12 th International Conference on Chitin and

Chitosan, 2012, Fortaleza. General Program and Book of Abstracts. , 2012. p.122 - 122

3. Antimicrobial activity and biocompatibility of chitosan with differents molecular weight

as alternative natural compound to inhibit Candida

In: 6 th Iberoamerican Chitin Symposium, 12 th International Conference on Chitin and

Chitosan, 2012, Fortaleza. General Program and Book of Abstracts. , 2012. p.120 -

120

4. Physico-chemical analyses of distintc chitosan and their potential as quantum dots

biocompatibilization agents

In: 11ª International Conference on Advanced Materials, 2009, Rio de

Janeiro. Conference book of 11ª ICAM. , 2009.

5. Physico-chemical analyses of distintc chitosan and their potential as quantum dots

biocompatibilization agents.

In: 11ª International Conference on Advanced Materials, 2009, Rio de Janeiro.

Conference book of 11ª ICAM 2009, 2009


140

RESUMOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSOS

1. Influence of carbon and nitrogen source on the chitin and chitosan production by

Rhizopus arrhizus - FACTORIAL DESIGN.

In: IV International Conference on Environmental, Industrial and Applied

Microbiology, 2011, Malaga. Abstract Book BIOMICROWORLD 2011, 2011. p. 303-

303.

2. Estudo in vitro da ação do gel dentário à base de quitosana microbiologica como agente

preventivo e terapêutico para a doença cárie.

In: 27º Reunião da Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica, 2010, Águas de

Lindoia. Brazilian Oral Research. São Paulo: Imprensa Científica, 2010. v. 24. p. 45-45.

3. Viabilidade do verniz dentário a base de quitosana microbiologica como agente

preventivo e nterapeutico para a doença cárie.

In: 27º Reunião da Sociedade Brasileira de Pesqusia Odontologica, 2010, Aguas de

Lindoia. Brazilian Oral Research. São Paulo: Imprensa Científica, 2010. v. 24. p. 132-

132.

4. Nanospheres of chitosan and CdTe quantum dots for the development of drug carrier

systems

In: IX Brazilian MRS Meeting, 2010, Ouro Preto. Book Abstract of IX Brazilian MRS

Meeting. , 2010.

5. Physico-chemical caracterization of chitosan from shrimp Litopenaeus vannamei.

In: 9th International Conference of the European Chitin Society, 2009, Veneza.

Conference Book EUCHIS 2009, 2009.

6. Bioatividade da quitosana como agente anticariogênico.

In: 26º Reunião da Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica, 2009, Aguas de

Lindoia. Anais do 26º SBPqO, 2009.


141

7. Redução da formação da placa bacteriana dentária por quitosana na presença de

sacarose.

In: 26º Reunião da SBPqO, 2009, Aguas de Lindoia. Anais do 26º SBPqO, 2009

DEMAIS PRODUÇÕES TÉCNICAS

1. Palestra “O biopolímero do século” no programa de Pós-Graduação em Nutrição

da UFPE, nível mestrado e doutorado, 2010.

2. Curso de quitosana na agricultura e no meio ambiente, 2008. (Extensão, Curso de

curta duração ministrado)


142

ANEXO

ARTIGO ENVIADO PARA

CARBOHYDRATE RESEARCH

tese de doutorado - repositorio.ufpe.br · tese de doutorado apresentada ao programa de pós- ......

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