UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO TECNOLÓGICO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE

ALIMENTOS

BEATRIZ DE CÁSSIA MARTINS SALOMÃO

DETECÇÃO DE PATULINA E DESINFECÇÃO DE MAÇÃS DESTINADAS À PRODUÇÃO DE SUCO

Florianópolis, maio de 2009

BEATRIZ DE CÁSSIA MARTINS SALOMÃO

DETECÇÃO DE PATULINA E DESINFECÇÃO DE MAÇÃS DESTINADAS À PRODUÇÃO DE SUCO

Tese submetida ao Curso de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia de Alimentos. Área de Concentração: Desenvolvimento de Processos da Indústria de Alimentos Orientadora: Profa. Dra. Gláucia M. F. Aragão Co-orientador: Prof. Dr. Randy W. Worobo Co-orientadora: Profa. Dra. Pilar Rodriguez de Massaguer

Florianópolis, maio de 2009

“Quanto mais o indivíduo aprende, tanto mais útil se torna para si e para a

sociedade” (José Ingenieros)

“Nem que seja para fazer alfinetes, o entusiasmo é indispensável para sermos bons

no nosso ofício” (Denis Diderot)

“Transportai um punhado de terra todos os dias e fareis uma montanha”

(Confúcio)

Dedico todo o esforço empregado na execução deste trabalho ao meu pai Issa

Miguel, à minha mãe Ana Maria e à minha tia Zélia que sempre apoiaram meus estudos,

pois acreditaram que este seria o caminho para o meu sucesso

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todas aquelas pessoas que direta ou indiretamente me ajudaram na execução deste trabalho:

À minha amiga e orientadora Gláucia que não só me incentivou na execução deste trabalho, mas que também me ensinou a sempre enfrentar as dificuldades com otimismo. Seu companheirismo incondicional foi fundamental para que eu pudesse atingir meus objetivos.

À minha co-orientadora Pilar que dividiu comigo seu vasto conhecimento e muito me ensinou.

Ao meu co-orientador Randy que me abriu as portas da Universidade de Cornell e me deu a oportunidade de conhecer um mundo novo e realizar um grande sonho, além de ter acreditato no meu potencial.

Ao John que é, sem dúvida, uma das pessoas mais generosas que já conheci e que me acolheu com amizade e carinho, além de ter me ensinado muito.

À minha amiga e companheira Chalana que esteve comigo durante três anos na execução deste trabalho sempre agindo com total responsabilidade, dedicação, inteligência e entusiasmo.

À Juliana que diretamente me ajudou na execução deste trabalho. Aos professores membros da banca examinadora (João, Nélio,

Maria Antônia e Cleide) que se dispuseram a me ajudar na avaliação e correção deste trabalho.

Aos meus irmãos Laila e Luiz que sempre me ajudaram e torceram pelo meu sucesso.

Ao meu marido Renato que me ajudou na elaboração deste trabalho e me acompanhou durante meu estágio nos Estados Unidos.

À professora Olga que se interessou pelo meu trabalho e me apoiou.

Aos colegas pelo apoio, carinho e amizade: Denise, Mônica, Jaciane, Morgana, Suzane, Daniele, Márcia, Andréia, Andréia P., Beatriz, Jorge, Kelin, Manuela, Gisanara, Andréia Tremarin, Luiza, Américo, Sabrina, Felipe, Ricardo, Siannah, Francieli, Bruna, Rose Marie, Franciny, Francielo, Carmen, Bruno, Vanessa, Anderson e Adriana.

Ao Hudson que foi fundamental para que este trabalho se concretizasse.

A todos os meus colegas do laboratório da Universidade de Cornell que me ajudaram a enfrentar as dificuldades e com os quais dividi grande amizade: David, Guoping, Hyungjae e Dulce Maria.

À Capes pelo apoio financeiro que foi fundamental para a execução deste trabalho.

À Universidade de Cornell e à Estação Experimental de Agricultura do Estado de Nova York por terem me recebido.

Ao CNPq pela bolsa de iniciação científica oferecida à Chalana. Muito Obrigada! Beatriz

RESUMO Quase a totalidade do suco de maçã concentrado produzido no Brasil (>90%) é destinado à exportação. As maçãs não qualificadas para o consumo in natura são utilizadas para a produção de suco. Assim sendo, a boa qualidade da matéria-prima deve ser garantida de forma a se obter um produto que atenda aos rígidos padrões internacionais. Bactérias e fungos podem ser potenciais contaminantes do suco de maçã. Os fungos termorresistentes, como Byssochlamys spp., estão entre os micro-organismos relevantes para os sucos de fruta termoprocessados devido à sua capacidade deteriorante associada à produção de toxinas. As bactérias termoacidofílicas do gênero Alicyclobacillus podem produzir substâncias, como o guaiacol, que são responsáveis pela produção de odores “medicinais” ou “antissépticos” nos sucos de frutas embalados. Penicillium expansum é o mais importante contaminante das maçãs e é também o responsável por causar “podridão azul” nestas frutas. Patulina (PAT) é uma micotoxina termoestável, produzida principalmente por este fungo e também por Byssochlamys spp. Estudos apontam que esta toxina pode causar severos efeitos crônicos e agudos em humanos. As agências regulatórias internacionais recomendam um nível máximo de 50 µg/L (ppb) para suco de maçã. Assim sendo, o objetivo geral deste trabalho foi a detectação da patulina em maçãs e avaliação do processo de lavagem/desinfecção das frutas destinadas à produção de suco. O levantamento inicial mostrou que P. expansum, Byssochlamys fulva e Alicyclobacillus acidoterrestris são os micro-organismos de maior relevância no processo produtivo. Os testes de desinfecção mostraram que o sanitizante clorado dicloroisocianurato de sódio foi mais efetivo que ácido peracético contra P. expansum. Porém, nenhum dos sanitizantes foi eficiente contra os esporos de A. acidoterrestris e B. fulva. Quando hipoclorito de sódio foi testado na redução de esporos de P. expansum, a eficácia aumentou com o decréscimo do pH. Os modelos de Bigelow e de Weibull foram os mais adequados em descrever a inativação de P. expansum pelo calor e por cloro, respectivamente. Todas as variedades de maçãs inoculadas com P. expansum desenvolveram deterioração sob 11°C e 20,5°C, exceto Red Delicious e Empire. Os maiores níves de PAT ocorreram nas variedades Golden Supreme e McIntosh. Verificou-se que PAT não está presente nas frutas durante o período da safra. Entretanto, 86% dos lotes avaliados na entressafra apresentaram níveis de PAT superiores a 50 ppb. O plano de amostragem para a avaliação das frutas durante o

recebimento sugeriu a retirada de uma amostra de 50 maçãs por lote, sendo estabelecido o critério de rejeição quando mais que 8 maçãs podres forem encontradas. São consideradas podres as frutas que apresentarem podridão característica de tamanho superior a 4 cm ou com visível desenvolvimento do “fungo azul” (P. expansum). A etapa de lavagem das frutas com água sob alta pressão reduziu os níveis de PAT em 64 a 100%, entretanto, transferiu a toxina para a água. Os tratamentos com dicloroisocianurato de sódio provaram ser eficientes para reduzir 100% da PAT em solução aquosa. Pode-se concluir que este sanitizante, mesmo quando usado em baixas concentrações (25 ppm), foi eficiente tanto para reduzir PAT, quanto esporos de P. expansum, sendo recomendado para as operações de manejo e lavagem das frutas. Os resultados deste estudo podem causar impacto direto na redução de PAT no suco de maçã, diminuindo assim os riscos à saúde do consumidor e trazendo muitos benefícios para a indústria processadora, além de torná-la mais competitiva no mercado internacional. Palavras-chave: Patulina; PAT; Desinfecção de maçãs; Indústria de alimentos.

ABSTRACT The majority of concentrated apple juice produced in Brazil (>90%) is destined for exportation. Apples rejected for the fresh fruit consumption market are used for juice processing. The quality of this raw material should be attained in order to obtain a juice under the rigid international standards. Heat resistant molds and the thermoacidophilic bacterium from Alicyclobacillus genus are among the microorganisms of importance for heat-processed fruit juices, such as apple juice. Some species of heat resistant molds, such as Byssochlamys spp., are able both to deteriorate packaged fruit juice and to produce mycotoxins. Alicyclobacillus causes medicinal off-flavors in packaged fruit juices. Penicillium expansum is the most important contaminant in apples and is responsible for “blue mold rot” in those fruits. Patulin (PAT) is a thermal stable mycotoxin produced primarily by this mold and also by Byssochlamys spp. PAT has been shown to exhibit severe chronic and acute effects in humans. The regulatory agencies have recommended a PAT maximum level of 50 µg/L (ppb) for apple juice. Then, the aim of this study was to detect PAT in apples and to assess the washing/sanitizing treatments for apples destined for juice. In the initial survey, P. expansum, Byssochlamys fulva and Alicyclobacillus acidoterrestris was the most import microorganisms in the process. In the disinfection test, the chlorine-based sanitizer sodium dichloroisocyanurate was more efficient than peracetic acid against P. expansum spores. None of those sanitizers were efficient against A. acidoterrestris and B. fulva spores. When sodium hypochlorite was tested against P.expansum, the efficacy of chlorine solutions was enhanced by decreasing the pH. For the modeling investigation, the results showed that Bigelow and Weibull were the best models to describe P. expansum thermal and sanitizer inactivation, respectivelly. All P. expansum inoculated apple varieties incubated under 11°C and 20.5°C showed mold spoilage at both temperatures, except Red Delicious and Empire. The highest PAT productions occurred in Golden Supreme and McIntosh varieties. Findings showed that PAT was not detected throughout the harvest season. However, 86% of lots from off-season yielded more than 50 ppb of PAT. The sampling plan developed to evaluate the apples during the receiving step suggested to reject the lot when more than 8 rotten fruits were found in a total of 50 apples, because the risk of > 50 ppb of PAT in the final product. Rotten fruits are those with size lesion > 4 cm or with visible “blue mold”

development. Wash treatments using high-pressured water reduced PAT levels by 64 to 100%, but the toxin was transferred to the water. Treatments using sodium dichloroisocyanurate proved to be efficient in reducing 100% of PAT in aqueous solution. In conclusion, this sanitizer, even at low concentration (25 ppm), is efficient to reduce both PAT and P. expansum spores and should be recommended for apple handling and washing treatments. This investigation provides direct impact in the PAT levels for the final product which reduce the risk for healthy consumers and help in the development of industry international competitiveness. Keywords: Patulin; PAT; Sanitizing for apples; Food industry.

LISTA DE FIGURAS Figura 2.1 - Fluxograma do processo de produção de suco de maçã .... 25 Figura 2.2 - Colheita da maçã ............................................................... 26 Figura 2.3 - Resfriador por circulação de água gelada (Hydrocooler) .. 27 Figura 2.4 - Etapas realizadas dentro das áreas de armazenamento das

frutas (packing houses): (a) Descarregamento das frutas (dentro dos bins) nos tanques de água. (b) Condução das frutas pelas calhas de água até as mesas de seleção. ......... 28

Figura 2.5 - Descarregamento das frutas industriais destinadas à fabricação de suco. ............................................................ 29

Figura 2.6 - Etapa de lavagem das frutas destinadas à fabricação de suco. .................................................................................. 30

Figura 2.7 - Equipamento de ultra-filtração do suco de maçã concentrado ....................................................................... 31

Figura 2.8 - (a) Deterioração característica causada por Penicillium expansum; (b) internalização do fungo; (c) podridão característica do tecido da fruta.......................... 34

Figura 2.9 - Estrutura química da patulina ............................................ 41 Figura 3.1 - Sequência de análise: (a) secagem da fruta lavada, (b)

inoculação da suspensão do micro-organismo, (c) aplicação a da solução sanitizante e (d) massageamento................... 64

Figura 3.2 - Variedades de maçãs: (a) Red Delicious, (b) Golden Supreme, (c) Empire, (d) McIntosh, (e) Fuji e (f) Gala..... 66

Figura 3.3 - Preparação das amostras para as análises de patulina. Procedimento descrito no item 3.6.5. (a; b) suco sendo submetido ao tratamento enzimático; (c; d) filtragem do suco ................................................................................... 77

SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO......................................................... 19

CAPÍTULO 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................. 22 2.1 Maçã .................................................................................. 22 2.2 Suco de maçã ...................................................................... 23 2.3 Microbiologia das maçãs e do suco de maçã ............................. 32 2.3.1 Penicillium expansum em maçãs .......................................... 33 2.3.2 Fungos termoresistentes...................................................... 35 2.3.3 Alicyclobacillus................................................................. 38 2.4 Patulina .............................................................................. 41 2.5 Desinfecção de maçãs ........................................................... 48 2.5.1 Agentes sanitizantes........................................................... 49 2.6 Uso de modelos matemáticos para descrever a inativação de

esporos .............................................................................. 51 CAPÍTULO 3 MATERIAL E MÉTODOS...................................... 55 3.1 Metodologia utilizada no Artigo 1:Survey of molds and

Alicyclobacillus from a concentrated apple juice productive process in Brazil.................................................................. 55

3.1.1 Amostragem ..................................................................... 55 3.1.2 Detecção e enumeração de bolores e leveduras ....................... 56 3.1.3 Detecção e enumeração de fungos filamentosos

termorresistentes .............................................................. 56 3.1.4 Enumeração e detecção de Alicyclobacillus spp. (ATSB) ......... 57 3.1.5 Estocagem das culturas....................................................... 58 3.1.6 Identificação das cepas de fungos filamentosos isolados .......... 59 3.2 Metodologia utilizada no Artigo 2: Aplicação de dicloroisocianurato

de sódio e ácido peracético para redução de esporos de Penicillium expansum, Byssochlamys fulva e Alicyclobacillus acidoterrestris na superfície de maçãs e em soluções aquosas .............................. 60

3.2.1 Micro-organismos e preparo da suspensão de esporos.............. 60 3.2.2 Teste de ativação para os esporos de B. fulva CCT 0056 .......... 61 3.2.3 Determinação do tempo de subida da temperatura................... 61 3.2.4 Preparo das soluções sanitizantes ......................................... 61 3.2.5 Teste sobre a superfície das maçãs........................................ 62 3.2.6 Teste em soluções aquosas .................................................. 64 3.2.7 Análise estatística dos dados................................................ 65

3.3 Metodologia utilizada no artigo 3: Efficacy of sanitizing treatments against Penicillium expansum inoculated on six varieties of apples ................................................................65

3.3.1 Preparação da suspensão de esporos de Pencillium expansum CCT4680 .........................................................................65

3.3.2 Frutas ...............................................................................65 3.3.3 Inoculação na superfície das maçãs .......................................66 3.3.4 Preparo das soluções sanitizantes ..........................................66 3.3.5 Tratamento das maçãs .........................................................67 3.3.6 Análises estatísticas ............................................................67 3.4 Metodologia utilizada nos artigo 4: Modeling Penicillium expansum

resistance to thermal and chlorine treatments ............................68 3.4.1 Preparação da suspensão dos esporos de P. expansum

CCT 4680 ........................................................................68 3.4.2 Preparo das soluções sanitizantes à base cloro.........................68 3.4.3 Teste em soluções aquosas...................................................68 3.4.4 Resistência térmica .............................................................68 3.4.5 Modelagem da inativação de P. expansum..............................69 3.4.6 Comparação estatística dos modelos......................................70 3.5 Metodologia utilizada nos artigo 5: Influence of storage

temperature and apple variety on patulin production by Penicillium expansum ...........................................................71

3.5.1 Preparação da cultura de Pencillium expansum CCT4680 .........71 3.5.2 Frutas ...............................................................................71 3.5.3 Inoculação da suspensão nas frutas........................................71 3.5.4 Extração do suco das maçãs .................................................72 3.5.5 Análise de Patulina .............................................................72 3.5.6 Fermentação do suco de maçã ..............................................72 3.6 Metodologia utilizada nos artigo 6: Development of a sampling

plan at apple receiving step for patulin control in concentrated apple juice ..........................................................................73

3.6.1 Estudo da seleção dos lotes (Etapa de recebimento das frutas) ...73 3.6.2 Estudo dos lotes hipotéticos (Etapa de recebimento das frutas) ..73 3.6.3 Estudo de lavagem e sanitização (Etapa de lavagem das frutas) .74 3.6.4 Análise do suco de maçã após prensagem (Etapa da prensagem)75 3.6.5 Preparação das amostras para as analises de patulina................76 3.6.6 Análises de patulina............................................................76 3.6.7 Preparação das soluções estoque de patulina ...........................76

CAPÍTULO 4 RESULTADOS ......................................................... 78 4.1 Survey of molds and Alicyclobacillus from a concentrated apple

juice productive process in Brazil........................................... 79 4.2 Aplicação de dicloroisocianurato de sódio e ácido peracético para

redução de esporos de Penicillium expansum, Byssochlamys fulva e Alicyclobacillus acidoterrestris na superfície de maçãs e em soluções aquosas ............................................................... 101

4.3 Efficacy of sanitizing treatments against Penicillium expansum inoculated on six varieties of apples ..................................... 127

4.4 Modeling Penicillium expansum resistance to thermal and chlorine treatments ........................................................................ 137

4.5 Influence of storage temperature and apple variety on patulin production by Penicillium expansum .................................... 152

4.6. Development of a sampling plan at apple receiving step for patulin control in concentrated apple juice ....................................... 169

CAPÍTULO 5 CONCLUSÕES ....................................................... 192

CAPÍTULO 6 REFERÊNCIAS...................................................... 194 ANEXO I............................................................................... 224 1. Imagens de Penicillium expansum CCT 7549 nos meios de

identificação .................................................................. 224 2. Imagens da deterioração das maçãs causada pelo “fungo azul”

(P. expansum) ................................................................ 224 3. Imagem de esporos de A. acidoterrestris CCT 7548 .................. 225 4. Laudo de identificação das cepas de P. expansum e A. acidoterrestris

isolados do processo produtivo de suco de maçã concentrado 226 ANEXO II 1. Curva de ativação dos esporos de

Byssochlamys fulva CCT 0056............................................. 232 ANEXO III ............................................................................ 233 1. Meios de Cultura e reagentes utilizados ................................... 233

CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO A cultura da maçã no Brasil é concentrada na Região Sul, sendo o estado de Santa Catarina o maior produtor nacional da fruta (CEPA, 2008). No Brasil, quase toda a produção se concentra em duas cultivares, a Gala e a Fuji (TODA FRUTA, 2003a). Diferentemente, os Estados Unidos cultivam um maior número de variedades de maçã, sendo que as principais são: Red Delicious, Empire, Fuji, Gala, Golden Delicious, McIntosh, Granny Smith, Rome Beauty, Crispin, Jonagold e Cortland (USA APPLE ASSOCIATION, 2005). O Brasil não possui lavouras exclusivas destinadas à produção de maçãs para o processo industrial, sendo que parte das frutas desqualificadas para comercio in natura (15 a 30% de das maçãs produzidas) é destinada ao processamento, principalmente de suco de maçã. Em torno de 90% do suco de maçã produzido no país é concentrado e destinado à exportação. O maior importador do suco de maçã concentrado produzido no país são os Estados Unidos, que destinam este produto à elaboração de suco reconstituído e produtos infantis (NOGUEIRA et al., 2007). Devido às características próprias da maçã, esta fruta apresenta susceptibilidade à contaminação por alguns micro-organismos. Dentre estes, o fungo P. expansum é reconhecido como o maior causador da “podridão azul” que é a mais destrutiva de todas as podridões que afetam as maçãs, principalmente durante a estocagem (JANISIEWICZL; KORSTEN, 2002). Além disso, este é capaz de produzir nas frutas a micotoxina patulina que representa um perigo potencial à saúde humana por seus efeitos agudos e crônicos (HASAN, 2000). Os problemas decorrentes da contaminação do suco de maçã estão diretamente relacionados aos micro-organismos resistentes ao calor, pois estes sobrevivem aos regimes usuais de pasteurização. Os fungos termorresistentes são frequentemente implicados na deterioração de produtos termoprocessados de frutas. Dentre os mais reportados pela literatura, estão as espécies pertencentes aos gêneros Byssochlamys, Neosartorya, Talaromyces e Eupenicillium (PITT; HOCKING, 1999; SALOMÃO et al., 2008b). Além da sua capacidade deteriorante, estes fungos ainda podem produzir micotoxinas. Dentre estas, destaca-se a patulina que pode ser produzida por Byssochlamys fulva e Byssochlamys nivea (TOURNAS, 1994; SANT`ANA, 2007). Durante muito tempo, acreditou-se que os esporos de bactérias não teriam

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habilidade para se desenvolver em alimentos ácidos, como os sucos de frutas (SPLITTSTOESSER et al., 1994). Entretanto, em 1982, na Alemanha, durante uma estação muito quente e prolongada, ocorreu deterioração em suco de maçã durante sua distribuição e estocagem. O suco apresentou um odor desagradável causado pela bactéria identificada como Alicyclobacillus (CERNY et al., 1984; WISOTSKEY et al., 1992). Espécies do gênero Alicyclobacillus são organismos termoacidofílicos produtores de esporos extremamente termorresistentes que, ao se desenvolverem dentro das embalagens de sucos podem causar uma desagradável alteração no seu sabor e odor (cheiro “medicinal” e “antisséptico”) (YOKOTA et al., 2007). A garantia da qualidade do suco de maçã se dará principalmente pelo controle destes micro-organismos e de seus metabólitos. Para tanto, medidas devem ser implantadas desde as etapas inciais de obtenção da matéria-prima até a industrialização final do produto. Uma importante forma de eliminação destes micro-organismos envolve a descontaminação das frutas a serem processadas (SAPERS et al., 2006). Os produtos clorados estão entre os mais amplamente utilizados na sanitização de frutas. O ácido peracético vem assumindo o papel de substituto para compostos clorados e, portanto, também está sendo utilizado nos processos de desinfecção de alimentos (ORR; BEUCHAT, 2000). A produção de patulina gera grande preocupação pois esta apresenta um amplo espectro de toxicidade (WHO, 1998), além de ser relativamente estável ao processo de fabricação do suco de maçã. Os Estados Unidos e a União Européia estipularam o limite máximo de 50 µg/L (ppb) de patulina no suco de maçã (CODEX, 2003a; FDA, 2001b). O Brasil não possui uma legislação vigente para regulamentar esta toxina em alimentos, entretanto, considerando que quase a totalidade da produção de suco concentrado de maçã é exportada, as indústrias processadoras brasileiras necessitam pesquisar a qualidade micotoxicológica de seus produtos a fim de se tornarem competitivas no mercado internacional no fornecimento de alimentos seguros. A eliminação de patulina das maçãs se faz principalmente pelo controle do desenvolvimento de P. expansum durante a estocagem destas frutas e nas etapas iniciais do processamento (JANISIEWICZL; KORSTEN, 2002; FAO, 2003). Este fungo pode crescer e produzir patulina em condições de refrigeração, o que salienta a importância no cuidado do manejo das frutas a serem estocadas durante o período da entressafra (SANHUEZA, 1996). Na indústria, o controle da qualidade das frutas deve ser iniciado na recepção sendo também consideradas

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medidas de controle do fungo as etapas posteriores de lavagem e seleção das frutas (ACAR et al., 1998; SYDENHAM et al., 1995). O objetivo geral deste trabalho foi a detectação da patulina em maçãs e avaliação do processo de lavagem/desinfecção das frutas destinadas à produção de suco. Para se atingir este objetivo geral, foram estabelecidos os seguintes objetivos específicos:

• Realização do levantamento da microbiota do suco de maçã em diferentes etapas do processamento e identificação dos micro-organismos mais relevantes;

• Estudo a eficácia do dicloroisocianurato de sódio e ácido peracético, visando a redução de micro-organismos alvo encontrados no levantamento inicial tanto na fruta como em solução aquosa;

• Desinfecção de seis diferentes variedades de maçã usando hipoclorito de sódio acidificado e não acidificado e ácido peracético, visando a redução de esporos de P. expansum;

• Avaliação da habilidade dos modelos de Weibull e Bifásico em descrever a inativação dos esporos de P. expansum pela ação de compostos clorados e a habilidade dos modelos de Bigelow e Weibull em descrever a inativação térmica de P. expansum;

• Avaliação da influência da temperatura de estocagem na produção de patulina produzida por P. expansum em seis diferentes variedades de maçã;

• Levantamento da produção de patulina em maçãs no período da safra e entressafra;

• Elaboração de um plano de amostragem para a seleção de lotes de maçãs durante o recebimento de forma a garantir a produção de suco dentro do nível máximo de 50 ppb;

• Avaliação da redução dos níveis de patulina durante os processos de lavagem e sanitização da fruta.

CAPÍTULO 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Maçã A maçã (Malus domestica, Borkh.) é pertencente da família Rosaceae, teve sua origem na Europa e Ásia e seu cultivo exige clima temperado (TODA FRUTA, 2006). Considera-se que a maçã é a mais importante fruta de clima temperado comercializada como fruta fresca, tanto no contexto internacional quanto no nacional (MELLO, 2004). Em virtude da sua composição nutricional, a maçã demonstra ser, mundialmente, uma das frutas preferidas para o consumo sendo indicada para a manutenção da saúde (STEINMETZ; POTTER, 1996; SCIENCEDAILY, 2007). As macieiras são cultivadas em todo o mundo, mas estão especialmente concentradas no hemisfério norte. O fator determinante no plantio das macieiras numa região depende do período de baixa temperatura que é necessário para o repouso vegetativo e quebra de dormência (BARRET et al., 2005). Até a década de 60 a cultura das macieiras não teve expressão econômica no Brasil. Entretanto, com o incentivo do Governo Federal deu-se o surgimento dos primeiros pomares comerciais que se iniciaram na região de Fraiburgo - SC e posteriormente no Paraná e Rio Grande do Sul (TODA FRUTA, 2003c). O Brasil começou a aparecer nas estatísticas internacionais na década de 1980, sendo que em 2001 atingiu a auto-suficiência (TODA FRUTA, 2003b). Santa Catarina permanece na liderança do ranking nacional, sendo responsável, de acordo com os dados de 2007/2008, por aproximadamente 51,3% da produção total, seguido por Rio Grande do Sul, com 44,8% (CEPA, 2008). Nestes estados, a produção centraliza-se ao redor dos municípios de Fraiburgo e São Joaquim em Santa Catarina e do município gaúcho de Vacaria. (TOGNON; CABRAL, 2008). A macieira é uma das árvores frutíferas que dispõe de um maior número de variedades. Atualmente, são descritas em torno de 7.500 variedades, porém comercialmente poucas são utilizadas. No Brasil, quase toda a produção se concentra em duas cultivares, a Gala e a Fuji que representam em torno de 90% da área plantada (TODA FRUTA, 2003a). A cultivar Gala é a primeira a ser colhida, em fevereiro e a colheita da Fuji se inicia em março (NOGUEIRA et al., 2004). Diferentemente, os Estados Unidos cultivam um maior número de

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variedades de maçã, sendo que as principais são: Red Delicious, Empire, Fuji, Gala, Golden Delicious, Granny Smith, McIntosh, Rome Beauty, Crispin, Jonagold e Cortland (USA APPLE ASSOCIATION, 2005). De acordo com a FAO (2008), a produção mundial de maçã em 2007 foi de 64,2 milhões de toneladas de maçã. O Brasil ocupou o décimo primeiro lugar na produção mundial, com 1,1 milhão de toneladas, o que representa 1,7% da produção total. A China é a maior produtor mundial, sendo que seus pomares produziram, em 2007, 27,5 milhões de toneladas, representando 42,8% de toda a produção. Os Estados Unidos são o segundo maior produtor e colheram, em 2007, 4,2 milhões de toneladas ou 6,6 % do total. As maçãs podem ser classificadas em comerciais ou industriais, de acordo com a finalidade. As maçãs comerciais são consumidas frescas (in natura) e, portanto, devem atender a padrões rígidos de qualidade. Os Estados Unidos são um dos poucos países produtores de maçã onde existem algumas lavouras específicas para frutas industriais (THE WORLD APPLE REPORT, 2008). No Brasil, os pomares não produzem frutas exclusivas para diferentes classes de maçãs. Assim, as frutas chamadas industriais são resultantes de um processo de seleção e classificação das frutas comerciais. Na comercialização das maçãs, a etapa de classificação gera um descarte de 15 a 30% de frutas que não alcançaram o padrão exigido para o consumo, apresentando algum defeito de ordem física, fisiológica ou fitopatológica (NOGUEIRA et al., 2007). Essas frutas fora do padrão comercial são direcionadas à industrialização, para a elaboração, principalmente, de sucos que são exportados na forma de concentrado (SEBRAE, 2008; NOGUEIRA et al., 2007). O percentual de industrialização de maçãs no país tende a aumentar, devido à demanda crescente pelo suco pronto para consumo no mercado interno (SEBRAE, 2008). As maçãs industriais também são usadas na fabricação de sidra, vinagre, purê, geléias, alimentos infantis e demais produtos (SANTOS et al., 2005, NOGUEIRA et al., 2004). Nos Estados Unidos, em torno de 40% toda maçã produzida é processada, sendo que mais da metade é destinada à produção de suco (THE WORLD APPLE REPORT, 2008). 2.2 Suco de maçã O suco de maçã é definido como uma bebida não fermentada e não diluída, obtida da parte comestível da maçã, através de processo tecnológico adequado. A bebida deve possuir cor branca a translúcida,

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sabor e aroma próprios, sólidos solúveis (20ºC) mínimo de 10,5ºBrix; acidez total expressa em ácido málico mínima de 0,15 g/100 g; açúcares totais naturais da maçã máximo de 13,5 g/100 g e acidez volátil em ácido acético máxima de 0,04 g/100 g (BRASIL, 2000). Existem basicamente dois tipos de suco de maçã, o clarificado e o polposo (não clarificado ou turvo), sendo que ambos podem ser fabricados concentrados (70ºBrix) ou não concentrados (BARRET et al., 2005). Entretanto, é importante ressaltar que os sucos de frutas em geral são principalmente comercializados no mercado global na forma concentrada, pela facilidade de transporte e longa conservação (ROSA et al., 2006). Outra bebida fabricada a partir da maçã é o chamado apple cider. Este é produzido pela direta prensagem de frutas, não sendo filtrado ou adoçado e permanecendo turvo, devido às finas partículas de maçã em suspensão (BARRET et al., 2005). O apple cider pode tanto ser consumido fresco, pasteurizado ou fermentado. Nos Estados Unidos, este produto é principalmente consumido não fermentado (VALOIS et al., 2006; DOWNING, 1989), sendo que o processo de pasteurização pode tanto ocorrer por troca de calor (71°C/6-15 s) (FDA, 2004; BARRET et al., 2005), como por aplicação de radiação ultravioleta UV (14 mJ/cm2) (FDA, 2000). No Brasil, o suco de maçã é pouco comercializado em função da falta de hábito do consumidor brasileiro, bem como pela escassa disponibilidade de produtos no mercado (ROSA et al., 2006). Cerca de 90% desse suco é concentrado para exportação, principalmente para os Estados Unidos, que o destina à elaboração de suco de maçã (através da reconstituição) e produtos infantis, uma vez que a matéria-prima se constitui de variedades de mesa com baixos teores de ácidos e taninos e elevados teores de açúcares, permitindo a elaboração de produtos encorpados e de boa aceitação sensorial (NOGUEIRA et al., 2007). No mercado internacional, o suco de maçã é o segundo mais consumido (ROSA et al., 2006). Devido à alta demanda de consumo, os Estados Unidos são o maior importador mundial de suco concentrado de maçã. Sendo que neste país, as crianças são consideradas os maiores consumidores (ABSOLUTEASTRONOMY, 2009). A China é o maior produtor que conta com mais da metade de todo o suco de maçã fabricado no mundo, além de garantir o título de maior exportador mundial, atingindo, em 2008, aproximadamente 80% da exportação global (USDA/FAS, 2009). Além da China, a Argentina e o Chile são países com tradição no processamento de maçãs e grandes produtores mundiais de suco além de concorrentes com o Brasil na exportação do

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suco concentrado de maçã, principalmente para os Estados Unidos (THE WORLD APPLE REPORT, 2008). A produção do suco de maçã ocorre a partir do processamento direto das frutas ou pela reconstituição do suco concentrado até o teor de sólidos solúveis estipulado (BARRET et al., 2005). A Figura 2.1 apresenta um fluxograma geral do processo de fabricação do suco de maçã concentrado clarificado (70ºBrix) e também do suco de maçã clarificado produzido diretamente sem reconstituição (11,5ºBrix). A seguir será feita uma descrição breve do processo que pode variar dependendo da indústria.

Suco concentrado de maçã (70ºBrix)

Formulação

Pasteurização

Envase

Suco de maçã (11,5ºBrix)

Seleção

Moagem

Prensagem/ Extração do suco

Clarificação/Filtragem

Pasteurização

Concentração

Resfriamento 0ºC

Campo

Armazenamento 0ºC em ACc

Transporte para a Fábrica

Recepção na Fábrica

Lavagem

Safrad

Recepção no packing housea

Resfriamento das frutas em água geladab

Estocagem da fruta na Fábricae

Suco concentrado de maçã (70ºBrix)

Formulação

Pasteurização

Envase

Suco de maçã (11,5ºBrix)

Seleção

Moagem

Prensagem/ Extração do suco

Clarificação/Filtragem

Pasteurização

Concentração

Resfriamento 0ºC

Campo

Armazenamento 0ºC em ACc

Transporte para a Fábrica

Recepção na Fábrica

Lavagem

Safrad

Recepção no packing housea

Resfriamento das frutas em água geladab

Estocagem da fruta na Fábricae

apacking house é o nome dado aos armazéns onde as maçãs são estocadas durante os meses da entressafra; bO resfriamento em água gelada circulante se dá no hydrocooler; cMuitas câmaras-frias possuem o sistema de atmosfera controlada (AC); dNo período da safra, as frutas são encaminhadas diretamente para a fábrica e não vão para os packing houses; eEm algumas indústrias ocorre a estocagem das frutas lavadas antes destas seguirem para as etapas posteriores, porém, em outras indústrias essa estocagem não ocorre.

Figura 2.1 - Fluxograma do processo de produção de suco de maçã

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As frutas são colhidas geralmente pelo método manual (Fig. 2.2) para evitar danos mecânicos. As frutas caídas no chão, não devem ser colocadas junto com as colhidas na planta. A colheita é realizada utilizando sacolas de fundo falso, sendo as frutas depositadas em bins, que são caixas feitas geralmente de madeira com capacidade para comportar aproximadamente 350 a 400 kg. (TODA FRUTA, 2009).

Fonte: TRICITYHERALD, 2009.

Figura 2.2 - Colheita da maçã Após a colheita, as frutas que não são qualificadas para a utilização in natura são classificadas como frutas industriais. As demais frutas são enviadas para beneficiamento e estocagem em áreas de armazenamento (packing houses) (NOGUEIRA et al., 2007). O fluxograma completo do processo do suco está esquematizado na Fig. 2.1. e inclui tanto as etapas que envolvem o armazenamento das frutas nos packing houses, como o processo de elaboração do suco na fábrica. Todas as etapas serão detalhadas a seguir, sendo estas destacadas pelas palavras em negrito. Manejo das frutas no packing house: Durante a recepção no packing house, as caixas contendo as frutas (bins) são descarregadas e levadas para resfriamento no hydrocooler, que é um resfriador que trabalha por circulação de água gelada a 0ºC (Fig. 2.3). Este resfriamento ocorre com o objetivo de diminuir a temperatura das frutas que chegam do campo e

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colocá-las em temperaturas próximas à de estocagem (BARRET et al., 2005). Os bins contendo as frutas são levados ao hydrocooler onde recebem um banho com água gelada durante aproximadamente 20-30 min, causando assim o abaixamento da temperatura das frutas de aproximadamente 25ºC para 3ºC (BRACKMANN et al., 1996). A água do resfriador geralmente é clorada com hipoclorito de sódio em concentração máxima de 25 ppm. Porém, cabe ressaltar que o circuito é fechado e a água é trocada em torno de 2 vezes por turno, indicando que o nível de cloro livre pode diminuir devido à inativação pela matéria orgânica.

Fonte: Fischer S/A, 2006 Figura 2.3 - Resfriador por circulação de água gelada (Hydrocooler)

Após o pré-resfriamento, os bins contendo as frutas são levados para o armazenamento a 0ºC em um prazo máximo de até 18 h após a colheita (CODEX, 2003). As maçãs apresentam atividade metabólica depois de colhidas o que reduz sua vida útil durante o armazenamento. Portanto, o armazenamento das frutas ocorre sob refrigeração e, muitas vezes, em atmosfera controlada de forma a diminuir a taxa de respiração das maçãs e retardar seu metabolismo, amadurecimento e deterioração (BRACKMANN et al., 2005). A estocagem é realizada geralmente à temperatura de 0ºC, podendo variar de -0,5ºC até 2ºC, dependendo da variedade. A atmosfera das câmaras pode ser normal ou controlada (AC). Dependendo dos padrões de armazenagem exigida para cada

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variedade, o teor de oxigênio pode ser reduzido para a faixa de 1,0 a 2,5% e o teor de gás carbônico elevado para 0,5 a 4,5% (GIRARDI; BENDER, 2003; SANT`ANA et al. 2008). Para atingir estes níveis, é preciso injetar nitrogênio na forma gasosa dentro da câmara, o qual ocupa o lugar do oxigênio e fica desta maneira, inerte. A umidade relativa (UR) é controlada entre 92 e 96%. (GIRARDI; BENDER, 2003). A atmosfera controlada fornece vantagens ao prolongar em 50 a 80% o período de conservação da fruta, mantendo sua qualidade através do retardamento do amadurecimento. As variedades Gala e Fuji podem ser estocada em AC por até 8 a 12 meses, respectivamente (GIRARDI, BENDER, 2003). Após o período de estocagem refrigerada, as frutas são levadas à classificação que determinará seu tipo de comercialização. O procedimento se inicia pela retirada das frutas de dentro dos bins. Para tanto, os bins são descarregados em tanques de água, promovendo assim a flutuação das frutas, que são conduzidas pela água dentro de calhas até as mesas selecionadoras (Fig. 2.4).

Fonte: Fischer S/A, 2006

Figura 2.4 - Etapas realizadas dentro das áreas de armazenamento das frutas (packing houses): (a) Descarregamento das frutas (dentro dos bins) nos tanques de água. (b) Condução das frutas pelas calhas de água até as mesas de seleção.

A água destes tanques é clorada com hipoclorito de sódio (20-25 ppm). Porém, como o circuito é fechado, esta concentração não é constante. No processo de seleção, as maçãs são separadas pelos defeitos em diferentes categorias. As frutas desqualificadas para a comercialização in natura serão consideradas frutas industriais (GIRARDI; BENDER, 2003). Essas frutas de categoria industrial são recolhidas e transportadas para a fábrica após serem reunidas em quantidade suficiente para encher os caminhões. Geralmente, as frutas

a ba b

b

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permanecem nos packing houses em torno de 3 a 4 dias antes de serem transportadas para a indústria. Entretanto, neste caso, estas maçãs são, em sua maioria, estocadas à temperatura ambiente durante este período. O transporte para a fábrica processadora de suco ocorre dentro de caminhões. Processamento das frutas na fábrica produtora de suco: A recepção na fábrica ocorre em plataformas onde os caminhões descarregam as maçãs dentro dos “silos” (Fig. 2.5).

Figura 2.5 - Descarregamento das frutas industriais destinadas à

fabricação de suco. Ao entrarem no silo, as frutas recebem o primeiro contato com água proveniente das etapas posteriores de fabricação que é chamada de “água de transporte” que tem como função a retirada das sujidades grosseiras. No processo de lavagem, as frutas deslizam por esteiras abrasivas e recebem jatos de água sob pressão através de bicos aspersores com a finalidade de remover sujidades mais aderidas e também retirar as partes apodrecidas da fruta (BARRET et al., 2005; SHIRMER; MARCINKOWSKI, 2003). Geralmente, podem ocorrer duas etapas de lavagem usando bicos aspersores (Fig 2.6). Neste caso, a água utilizada na última etapa é reutilizada na etapa anterior e fica armazenada em um reservatório para a circulação em circuito fechado.

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Em muitos casos, não é comum a utilização de sanitizantes neste processo. O tempo total de lavagem desde o primeiro contato com a água de transporte e as subsequentes etapas de lavagem com os bicos aspersores dura em média 2,5 min, sendo que as etapas de contato direto da fruta com os bicos aspersores pode durar em torno de 30 segundos. Dependendo da logística, algumas indústrias realizam ainda uma breve estocagem das frutas na fábrica, até que possam ser processadas. Esta estocagem deve ser realizada em temperaturas inferiores a 10ºC ou, quando não há controle de temperatura, o tempo máximo (temperatura ambiente) deve ser de 48 h (FAO, 2003).

Figura 2.6 - Etapa de lavagem das frutas destinadas à fabricação de suco.

Na etapa de seleção, as frutas lesionadas ou apodrecidas podem ser inteiramente descartadas ou então ter aproveitamento parcial, através do corte das porções comprometidas (BARRET et al. 2005). As frutas selecionadas seguem para a etapa da moagem onde são trituradas em moinhos especiais, transformando-se em polpa (purê). Este purê sofre prensagem para permitir a máxima extração do suco (FISCHER, 2006). A clarificação inclui o tratamento enzimático de despectinização e adição de carvão ativado para propiciar a retirada dos compostos que deixariam turvo o produto final (DOWNING, 1989). A clarificação é finalizada pela filtração, feita com o auxílio de agentes filtrantes, como

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terra diatomácea ou pelo uso da ultrafiltração (Figura 2.7) (BARRET et al., 2005).

Fonte: Fischer S/A, 2006

Figura 2.7 - Equipamento de ultra-filtração do suco de maçã concentrado

Seguindo o fluxograma de fabricação do suco concentrado (Fig. 2.1), após a filtração, ocorre a pasteurização a temperaturas entre (118ºC e 120ºC) por um tempo de retenção de aproximadamente 30 s. Na mesma temperatura em que o suco sai da etapa de pasteurização, este segue para o processo de concentração por evaporação, preferivelmente até 70ºBrix (DOWNING, 1989). Devido à sua sensibilidade ao calor, evaporadores de múltiplo-efeito, com recuperação do aroma, são os mais comumente usatilizados. Visando a manutenção da qualidade, o suco segue para o resfriamento a 0ºC que é mantido durante a estocagem e comercialização do suco concentrado de maçã a 70ºBrix (DOWNING, 1989). O suco de maçã pronto para beber (11,5ºBrix) pode ser feito tanto a partir do suco recém extraído quanto do suco concentrado (BARRET et al., 2005). Para tanto, na etapa onde ocorre a formulação, utilizam-se antioxidantes, como ácido ascórbico e acidulantes, como ácido cítrico (BRASIL, 1988; IHA, 2006). A pasteurização do suco (11,5ºBrix) ocorre geralmente em temperaturas entre 90-95ºC por 15-30 s, o que permite posteriormente sua estocagem à temperatura ambiente (BAHÇECI; ACAR, 2007).

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Após o tratamento térmico, o envase do suco pasteurizado pode tanto ser a quente, em um processo chamado de hot fill, ou ser submetido ao envase asséptico. No processo hot fill, o suco pasteurizado é envasado ainda a quente (82ºC-85ºC) e mantido nesta temperatura por 2-3 min com o objetivo de descontaminar as embalagens. O resfriamento do suco dentro da embalagem ocorre geralmente em túneis por aspersão de água gelada (FREITAS et al., 2006; BAHÇECI; ACAR, 2007). No envase asséptico, o suco pasteurizado é primeiramente resfriado até a temperatura ambiente e então envasado em embalagens cartonadas previamente esterilizadas com água oxigenada, sendo mantida também a assepsia do ambiente de envase (FREITAS et al., 2006). Existe ainda um outro regime de pasteurização mais branda que é utilizado para o suco de maçã que deve ser mantido refrigerado durante a comercialização. Este é um produto muito requisitado nos Estados Unidos, principalmente por ter sido submetido a processos térmicos mais amenos, o que altera menos suas características sensoriais e nutricionais (BARRET et al., 2005). O FDA (Food and Drug Administration) recomenda o binômio de 71ºC/6 s para a pasteurização destes sucos que devem ser imediatamente resfriados e mantidos sob refrigeração durante sua vida de prateleira (FDA, 2004). 2.3 Microbiologia das maçãs e do suco de maçã As maçãs são produtos altamente perecíveis e susceptíveis à ação de micro-organismos, que são responsáveis por perdas consideráveis nestes produtos. Dentre estes, os bolores e leveduras os constituem agentes de maior impacto em frutas armazenadas causando perdas substanciais (KHURDIYA, 1995; HUSSEIN; BRASEL, 2001; CHAN; TIAN, 2005). Maçãs sadias carregam uma carga de bolores da ordem de 103 a 105 organismos por fruta, sendo Penicillium, Aspergillus, Mucor spp. as espécieis mais comuns (DOORES, 1983). As podridões de maçã são causadas principalmente por Penicillium expansum, ocasionalmente por Alternaria alternata e por Botrytis cinera. Estes fungos ocorrem na maior parte dos países produtores de pomáceas (SANHUEZA, 1996). A espécie Penicillium expansum, além de colonizar o fruto e causar dano à polpa, é capaz de produzir patulina (PAT) que é uma micotoxina considerada potencialmente teratogênica e cancerígena (LIU et al., 2003; PRIETA et al., 1994).

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Devido à natureza ácida dos sucos de fruta industrializados e ao processamento térmico a que são submetidos, acreditou-se que estes fossem seguros do ponto de vista microbiológico. Entretanto, micro-organismos como os fungos termorresistentes e, mais recentemente, bactérias esporuladas do genero Alicyclobacillus encontraram condições de desenvolvimento nestes produtos (SPLITTSTOESSER et al., 1994; TOURNAS, 1994). Assim, a grande preocupação na indústria de sucos está principalmente relacionada aos micro-organismos capazes de sobreviver às condições de pasteurização. Desta forma, a investigação da microbiologia dos sucos engloba o desafio de avaliar a capacidade de sobrevivência e multiplicação de micro-organismos resistentes ao calor. Foi verificada ainda a ocorrência de surtos associados aos sucos de frutas com patógenos como Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7 ou parasitas como Cryptosporidium parvum que ajudaram a dar um novo enfoque e um maior impulso ao estudo da microbiologia dos sucos de fruta (SIVAPALASINGAM et al., 2004). A microbiota presente no suco de maçã será determinada pelo tipo e quantidade de micro-organismos presentes nas frutas, associada à higiene do ambiente de fabricação e dos equipamentos (DOORES, 1983). 2.3.1 Penicillium expansum em maçãs As maçãs são susceptíveis a algumas desordens e injúrias que tornam o fruto mais susceptível ao ataque de fungos. Dentre as doenças associadas à maçã, a “podridão azul” (“blue rot”) (Fig. 2.8; imagem 2 do anexo I), causada por P.expansum, é a mais comum e destrutiva de todas as podridões que afetam as maçãs, principalmente durante a estocagem (JANISIEWICZL; KORSTEN, 2002). Entretanto, essa doença não é importante como uma doença de pomar, uma vez que a podridão azul é raramente encontrada nas frutas enquanto estas ainda não foram colhidas, a não ser em casos de injúria causada por insetos, granizo ou outros agentes. Em condições de alta umidade, a doença normalmente ocorre em frutas caídas no solo (TREE FRUIT PRODUCTION GUIDE, 2008). O inóculo inicial do patógeno pode encontrar-se na população superficial da maçã e/ou das folhas que ocasionalmente acompanham as frutas na colheita (SANHUEZA, 1996).

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b c

a

b c

a

Figura 2.8 - (a) Deterioração característica causada por Penicillium expansum;

(b) internalização do fungo; (c) podridão característica do tecido da fruta. As frutas infectadas têm odor e gosto característicos de mofo, desenvolvendo massas verde-azuladas de esporos que aparecem na superfície das frutas (Fig. 2.8 a). O apodrecimento se caracteriza por áreas moles, amarronzadas e úmidas (Fig. 2.8 b, c) que se iniciam ao redor das injúrias da fruta (TREE FRUIT PRODUCTION GUIDE, 2008). Devido à sua estrutura, a maçã permite a internalização de micro-organismos (BARTS, 2005) através das aberturas do calix e da pedúnculo (Fig 2.8 b). Os esporos do fungo P. expansum disseminam a doença pois podem sobreviver e contaminar o ambiente onde as frutas são manipuladas, como a superfície de equipamentos, as caixas que comportam as frutas (bins), a água que entra em contato com as maçãs ou até mesmo as câmaras-frias de armazenamento (SANHUEZA, 1996). No solo, encontra-se o principal reservatório de esporos deste fungo, onde este pode sobreviver entre as estações. As injúrias causadas nas frutas, especialmente durante as operações de colheita e manejo, auxiliam a manutenção do ciclo da doença (SANHUEZA, 1996; TRAVIS; RYTTER, 2003). O controle da podridão azul das maçãs tem sido a preocupação de produtores ao redor de todo o mundo. Medidas como a colheita das frutas nas condições ótimas de maturação, o adequado manejo e resfriamento, a sanitização dos bins e das câmaras frigoríficas, bem como a lavagem e sanitização das frutas, são medidas

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para o controle da disseminação dos esporos de P. expansum e da podridão azul (TRAVIS; RYTTER, 2003). 2.3.2 Fungos termoresistentes Os fungos termoresistentes pertencem à classe dos ascosmicetos e produzem esporos resistentes (ascósporos) que os permitem sobreviver à exposição das usuais temperaturas utilizadas durante o processo de pasteurização de sucos de frutas (TOURNAS, 1994; PIECKOVÁ et al., 1994). Muitos relatos mostram que estes fungos são capazes de sobreviver a temperaturas superiores a 90ºC por muitos minutos, dependendo da espécie ou do meio de aquecimento (PIECKOVÁ; SAMSON, 2000). Na literatura, o primeiro caso de deterioração de alimentos associados a bolores termoresistentes ocorreu na Inglaterra na década de 30, cujo agente causador foi B. fulva (TOURNAS, 1994). Depois disso, muitas outras ocorrências foram evidenciadas, sendo que, além do gênero Byssochlamys, são reportados na literatura casos de deterioração de produtos de frutas associados às espécies pertencentes aos gêneros Neosartorya, Talaromyces, Eupenicillium (PITT; HOCKING, 1999). Entre as menos comumente relatadas podem ser citadas as espécies pertencentes ao gênero Eurotium, que também produz ascósporos e devem ser adicionadas à lista dos fungos termorresistentes (EICHER; LUDWIG, 2002; SPLITTSTOESSER et al., 1989). Os ascomicetos apresentam fases do ciclo de vida em que se reproduzem sexuadamente e assexuadamente. Os estágios do ciclo de vida sexuados são denominados de teleomorfos e os assexuados são os anamorfos. Frequentemente, anamorfos (ou imperfeitos) e teleomorfos (ou perfeitos) são descritos como entidades taxonomicamente distintas, ou seja, em gêneros e espécies diferentes (PITT; HOCKING, 1999). Estes fungos possuem estruturas chamadas ascos que são similares a sacos, dentro dos quais é produzido um grupo de oito ascósporos (PITT; HOCKING, 1999). A forma, tamanho e ornamentação dos ascósporos podem variar com o gênero, espécie, cepa do fungo e condições ambientais de formação dos esporos (TOURNAS, 1994). Os ascos da maioria das espécies formam-se dentro de corpos frutíferos conhecidos como ascocarpos. Estes corpos podem ser chamados de cleistotécios quando são estruturas grandes com paredes sólidas ou ainda gimnotécios quando os ascos são circundados por hifas finas e entrelaçadas. Os ascos das espécies de Byssochlamys nascem

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separadamente e livres destes corpos de frutificação (PITT; HOCKING, 1999). A deterioração por bolores termoresistentes geralmente caracteriza-se pelo crescimento visível do fungo, produção de odor desagradável, sabor ácido, formação de gás, desintegração das frutas e solubilização da pectina por enzimas pectinolíticas, gerando a separação de fases em sucos (SPLITTSTOESSER, 1991; SALOMÃO, 2002). Os fungos termoresistentes têm como habitat natural o solo (PITT, HOCKING, 1999). Nas frutas e seus produtos, estes fungos apresentam baixa incidência com, no máximo, 10ºesporos/100 g (SANT`ANA, 2007; BEUCHAT; PITT, 1992; WOROBO; SPLITTSTOESSER, 2005). Os ascósporos destes fungos apresentam-se em um estado de dormência e necessitam ser ativados para germinarem. A ativação dos ascósporos dormentes se dá pela aplicação de um choque térmico (TOURNAS, 1994). Assim sendo, durante a pasteurização dos sucos de frutas, os ascósporos destes fungos são ativados em um meio repleto de nutrientes, o que leva à sua germinação com consequente crescimento e deterioração dos produtos durante a estocagem (HOCKING; PITT, 1984). Além da sua capacidade deteriorante, muitas espécies pertencentes a estes gêneros são capazes de produzir micotoxinas, como patulina, ácido bissoclâmico, bissotoxina A, assimetrina, variotina, fumitremorginas A e C, verrucológeno, fischerina, talaromicina e eupenifeldina (TOURNAS, 1994). Uma breve descrição das espécies de fungos termorresistentes é feita a seguir. Byssochlamys: Dentre as espécies de Byssochlamys já isoladas, B. fulva e B. nivea são as mais significantes na deterioração de produtos de frutas. Este gênero é caracterizado pela ausência de cleistotécio, gimnotécio ou quaisquer estruturas de proteção de seus ascos durante o desenvolvimento e maturação. Os ascos livres deste gênero são produzidos em cachos irregulares e abertos. O estágio imperfeito (anamorfo) deste gênero é conhecido como Paecilomyces, sendo Paecilomyces fulvus e Paecilomyces niveus as fases imperfeitas do B. fulva e B. nivea, respectivamente. Para a distinção das duas espécies, existem características que podem ser verificadas. B. nivea geralmente forma colônias brancas em Ágar Extrato de Malte (MEA) ou Ágar Czapeck Extrato de Levedura (CYA), sendo seus ascos de dimensões menores que de B. fulva. As colônias deste último, por sua vez,

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apresentam coloração marrom oliva nestes mesmos meios, podendo apresentar filamentos brancos no meio CYA (PITT; HOCKING, 1999). Neosartorya fischeri: Os ascos desta espécie estão recobertos por cleistotécios, causando uma aparência granular às colônias. Estes ascos podem sofrer ruptura instantânea de modo que só os ascósporos livres sejam observados. A única espécie deterioradora conhecida é N. fischeri, que possui diferentes variedades, sendo cada uma distinta na ornamentação de seus ascósporos (NIELSEN, 1991; UGWUANYI; OBETA, 1991). Os ascósporos, extremamente resistentes, são biconvexos com divisão equatorial. As colônias em (MEA) são brancas-creme, e sua fase anamorfa é conhecida por Aspergillus fischeri (PITT; HOCKING, 1999). Talaromyces spp.: O nome Talaromyces vem da palavra em grego, que significa “cesta” de forma a descrever o corpo de frutificação (gimnotécio) no qual o fungo no seu estado teleomorfo produz os seus ascos. Assim, a característica principal deste gênero é a produção de gimnotécios amarelos (menos comumente brancos) em associação com um estado anamorfo característico de Penicillium, Paeciloyces ou Geosmithia. O gimnotécio é formado por hifas finas entrelaçadas resultando em uma estrutura de tamanho mais ou menos indeterminado. Os ascósporos podem ser elipsoidais ou esféricos e possuem, algumas vezes, paredes rugosas. Talaromyces é o gênero de aproximadamente 25 espécies e a maioria habita o solo (PITT; HOCKING, 1999; ENIGL et al., 1993). Eupenicillium spp.: Produz cleistotécio que, em muitos casos, torna-se extremamente rígido e pode permanecer por semanas ou meses até finalmente amadurecer para assim produzir numerosos ascos com oitos ascósporos em seu interior. Devido à sua tardia maturação, sua taxonomia é muito difícil se baseada na morfologia de seus ascósporos maduros. Os ascósporos são elipsoidais possuindo uma leve ruga longitudinal além de apresentar superfície áspera. Estes fungos são habitantes do solo cuja sobrevivência ocorre em processos térmicos. Foram identificadas 37 espécies de Eupenicillim, sendo que as mais comumente isoladas de alimentos são: E. brefeldianum, E. cinnamopurpureum, E. hirayamae e E. javanicum. A fase anamorfa deste gênero é o Penicillium (PITT; HOCKING, 1999).

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Eurotium spp.: Este gênero é caracterizado pela formação de cleistotécio amarelo. O estado anamorfo é representado por Aspergillus cujas cabeças produzem somente fiálides. Todas as espécies de Eurotium são xerofílicas. No estudo de sua indentificação, é necessário incorporar 20% de sacarose no meio CYA para diminuir a atividade de água e permitir seu desenvolvimento. Seus ascósporos geralmente possuem dois sulcos longitudinais ou apenas um. Existem em torno de 20 espécies de Eurotium conhecidas (PITT; HOCKING, 1999). Além das espécies de fungos citadas, também foi verificado que alguns fungos anamorfos como Paecilomyces variotti e algumas cepas de Fusarium spp. podem causar deterioração em alimentos após pasteurização. Estas cepas mostraram ser capazes de sobreviver a tratamentos de 95ºC por 10-20 s, provavelmente devido à existência de estruturas de resistência (SANSOM et al., 1996). Cepas de Paecilomyces variotti isoladas de alimentos deteriorados sobreviveram ao aquecimento a 96ºC por 10 min em suco de laranja (PIECKOVÁ; SAMSON, 2000). 2.3.3 Alicyclobacillus Durante muito tempo, acreditou-se que os esporos de bactérias não teriam habilidade para germinar e reproduzir suas células vegetativas em alimentos ácidos, como os sucos de frutas (SPLITTSTOESSER et al., 1994). Entretanto, nos anos 80, na Alemanha, uma bactéria foi isolada do suco de maçã e identificada como uma nova espécie deteriorante (CERNY et al., 1984). Originalmente denominada de Bacillus acidoterrestris (DEINHARD et al., 1987), esta bactéria foi mais tarde realocada em um novo gênero chamado Alicyclobacillus baseado na presença exclusiva dos ácidos graxos ω-alicíclicos ( ω-ciclohexano; ω-cicloheptano) na sua membrana celular e também devido aos resultados de análises comparativa da sequência do RNA ribossomal 16S (rRNA) (WISOTSKEY et al., 1992). Em 1990 e 1995 na Austrália, foi detectado um odor desagradável em 40% das amostras de suco de maçã analisadas, o qual foi considerado fruto de alguma contaminação microbiológica (EGUCHI et al., 1999). Splittstoesser et al. (1994) reportaram que a cepa acidentalmente isolada em 1990 a partir de suco de maçã, produzido por hot fill, com odor desagradável tratava-se de Alicyclobacillus. Esta foi considerada a

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primeira detecção de Alicyclobacillus nos Estados Unidos em produtos de fruta. Na Europa, em um verão atípico (1994) foi verificado que algumas embalagens de sucos e néctares de fruta produzidos por hot fill desenvolveram sabores e odores poucos dias depois de embalados. Esta deterioração foi reconhecida posteriormente como causada por Alicyclobacillus (EGUCHI et al., 1999). Estudos realizados no Brasil, descreveram o isolamento de Alicyclobacillus spp. a partir de vários substratos e etapas do processamento industrial de suco de laranja no estado de São Paulo (ABREU FILHO, 2005). Além disso, foi constatada a presença de bacterias termoacidófilas em suco de maracujá comercial procedente do estado de São Paulo (McKNIGHT, 2003). A ocorrência desta bactéria em produtos processados a base de frutas vem sendo reportada frequentemente (YAMAZAKI et al., 1996; JENSEN, 2000; WALLS; CHUYATE, 2000; MATSUBARA et al., 2002; GROENEWALD et al., 2009). Atualmente, são reconhecidas 17 espécies de Alicyclobacillus, sendo que as três reportadas em produtos de frutas são Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus acidocaldarius e Alicyclobacillus pomorum (GOTO et al., 2003; JENSEN; WHITFIELD, 2003; GROENEWALD et al., 2009). Algumas abreviações são usadas para descrever estas bactérias. ATSB é uma abreviação que significa “bactéria termoacidofílica formadora de esporos”. TAB também é uma abreviação bastante utilizada no Japão que significa “Bactéria termoacidofílica”. Estas abreviações são usadas para designar as bactérias pertencentes ao gênero Alicyclobacillus e são aceitas como sinônimo destas bactérias (YOKOTA et al., 2007). O termo “aliciclo” se refere ao ácido graxo circular (ω-alicíclico) cuja presença é majoritária na membrana celular destas bactérias. São organismos acidofílicos obrigatórios que crescerem na faixa de pH entre 2,5 e 6,0 (ótimo pH entre 3,5 e 4,0). A faixa de temperatura de crescimento destas bactérias fica em torno de 40 a 65°C, sendo o crescimento ótimo entre 42-50ºC. (YOKOTA et al., 2007). Apresentam-se em forma de bastonetes e são aeróbios ou anaeróbios facultativos, Gram positivos ou Gram variáveis. Seus esporos são formados sob condições ambientais e nutricionais adversas (WISOTZKEY et al., 1992). Os produtos geralmente associados à deterioração por esporos de Alicyclobacillus são alimentos e bebidas ácidas como sucos e néctares de fruta, processados termicamente (EIROA et al., 1999). Por serem

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termofílicas, estas bactérias não crescem em temperaturas menores que 20°C. A estocagem comercial de sucos de fruta pasteurizados à temperaturas inferiores a 20°C é adequada para prevenir a germinação dos esporos e pode ser uma medida de controle para a indústria. Entretanto, sucos de fruta pasteurizados são principalmente distribuídos à temperatura ambiente, pois seu resfriamento significaria um fator adicional de custo (CHANG; KANG, 2004). Dentre as características de deterioração causadas por Alicyclobacillus destaca-se a alteração no sabor e odor (cheiro “medicinal”, “antisséptico” ou similar a desinfetante). Não é evidenciada a formação de gás e existe pouca ou nenhuma mudança no pH. Ocasionalmente pode ser verificada turbidez e/ou formação de sedimentos brancos no fundo da embalagem. Desta forma, sua deterioração é somente detectada no momento do consumo. Uma das principais causas das alterações no sabor e odor se deve à formação de traços de 2-6 di-bromofenol, 2-6 di-cromofenóis (halofenóis) e 2-metoxifenol (guaiacol) em suco de fruta e bebidas (BORLINGHAUS; ENGEL, 1997; ORR et al., 2000). Resultados mostraram que a alteração sensorial nos produtos foi detectada quando níveis de Alicyclobacillus estavam em torno de 103 UFC/mL (EGUCHI et al., 1999). Alguns dados de resistência térmica apontam que os esporos deste gênero apresentaram valores de D (tempo para causar uma redução decimal) entre 16-23 min a 90ºC e 2,4-2,8 min a 95ºC (SPLITTSTOESSER et al. 1994). Estes dados sugerem que os tratamentos de pasteurização dos sucos a 90-95ºC/15-30 s não suficientes para reduzir a população de esporos. A ótima ativação dos esporos destas bactérias geralmente ocorre a 80ºC/10 min (MURRAY et al., 2007; PEÑA; MASSAGUER, 2006; SILVA; GIBBS, 2001; GROENNEWALD et al., 2009; WALLS; CHUYATE, 2000; ORR; BEUCHAT, 2000). Considerando estes dados, pode-se afirmar que o envase a quente (hot fill) significa um risco do desenvolvimento destas bactérias, pois ocorre a manutenção de temperaturas (82-85ºC) que podem propiciar a ativação dos esporos, permitindo assim a germinação e crescimento de células vegetativas (FREITAS et al., 2006). Spinelli (2006) verificou que o processo hot fill do suco de laranja seguido de manutenção a 85ºC/2,5 min permitiu a sobrevivência de A. acidoterrestris, e causou menos de 0,5 redução decimal na sua população.

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2.4 Patulina Patulina (PAT) é uma micotoxina produzida por algumas

espécies de fungos. As primeiras pesquisas sobre PAT se iniciaram na década de 40 quando esta toxina foi investigada como um antibiótico. Entretanto, posteriormente vários estudos sugeriram que a PAT tratava-se, na realidade, de um composto tóxico (MOAKE et al., 2005). Esta toxina tem sido detectada em algumas frutas, sucos, vegetais e outros alimentos (LARSEN et al., 1998; DELAGE et al., 2003; DRUSCH; RAGAB, 2003; ANDERSEN et al., 2004). Entretanto, a maior fonte de contaminação por PAT são maçãs e seus derivados (CODEX, 2003b).

PAT é uma lactona que apresenta fórmula molecular C7H6O4 e estrutura química {4-hidroxi-4H-furo[3,2-c]piran-2(6H)-ona}. Sua forma estrutural molecular está representada pela Figura 2.9 (MOAKE et al., 2005). Esta toxina forma cristais incolores e possui máxima absorção no UV a 276 nm. Além disso, apresenta ponto de fusão de 111ºC e peso molecular é 150,12 g/mol. É solúvel em água, etanol, acetona, acetato etílico, éter e clorofórmio.

Figura 2.9 - Estrutura química da patulina

PAT não é destruída pelo calor e é estável em pH ácido. Entretanto, pode ser reduzida por estocagem prolongada, pela ação de sulfito, ácido ascórbico, fermentação alcoólica e pelo tratamento com carvão ativado. A patulina perde sua atividade biológica em meio alcalino e na presença de moléculas abrangendo os sulfidrila (ASKAR, 1999). O efeito do pH na destruição térmica da PAT foi investigado através de testes realizados em soluções aquosas a pH 3,5; 4,5 e 5,5 contendo a toxina. Estas soluções foram submetidas às temperaturas de 105, 110, 115, 120, 125ºC. Os dados mostraram que a destruição da micotoxina em todas as temperaturas foi sempre maior em pH 5,5 do que em pH 3,3, indicando que a PAT é mais estável em solução ácida.

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Desta forma, pode-se concluir que a PAT possui relativa estabilidade aos tratamentos térmicos geralmente aplicados a alimentos ácidos (LOVETT; PELLER, 1973). PAT é produzida por algumas espécies de fungos dos gêneros Penicillium, Aspergillus e Byssochlamys, destacando-se o P. expansum como o principal produtor (SANT`ANA, 2007; BARKAI-GOLAN; PASTER, 2008; CODEX, 2003b). A produção de PAT por P. expansum pode ocorrer geralmente entre 0º e 25ºC (BARKAI-GOLAN; PASTER, 2008). Assim, o armazenamento de frutas à baixa temperatura não é suficiente nem para inibir o crescimento deste fungo, tampouco para evitar produção de toxina (WELKE et al., 2009). Altos níveis de PAT (538-1822 ppb) foram detectados em apple cider inoculado com P. expansum (105esporos/mL) depois de incubação por 14 dias de 25ºC. Mesmo quando o mesmo produto foi incubado a 4ºC, níveis de PAT variando de 75 a 396 ppb foram detectados após 24 dias de incubação (MAcCALLUM et al., 2002). P. expansum é considerado o principal responsável pela produção de PAT em maçãs e não no seu suco. Esta afirmação é baseada na baixa resistência térmica de outras espécies de Penicillium já estudadas (SHEARER et al., 2002). Entretanto, não existem na literatura informações sobre a resistência térmica específica de P. expansum. De acordo com a FAO (2003), o processo de pasteurização do suco de maçã não deve ser considerado um ponto crítico de controle somente para bactérias, mas também para a produção de PAT, pois o tratamento térmico irá reduzir esporos de P. expansum o que irá prevenir seu crescimento e a produção de PAT dentro da embalagem. Como os sucos de maçã mantidos refrigerados recebem um tratamento térmico ameno (71ºC/6 s), deveriam existir mais dados específicos de resistência para este fungo. B. fulva e B. nivea são considerados potenciais produtores de PAT nos sucos pasteurizados devido à alta termorresistência de seus esporos (SANT`ANA, 2007). O estudo realizado por SANT`ANA (2007) mostrou que uma cepa de B. fulva (IOC 4518) apresentou valores de D nas temperaturas de 85ºC, 90ºC, 92ºC e 95ºC iguais a 64,58; 16,68; 6,31 e 3,10 min, respectivamente. Estudos mostraram que B. nivea foi capaz de produzir PAT em suco de maçã a 20ºC, após 21 dias de incubação, sendo que a produção da micotoxina também ocorreu a 12ºC (ROLAND; BEUCHAT, 1984). Outro estudo comprovou que B. fulva produziu PAT em suco de maçã mantido a 21ºC e 30ºC em embalagens cartonadas (SANT`ANA, 2007).

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A biossíntese de patulina ocorre quando a taxa de crescimento do fungo diminui em virtude das limitações do consumo de nitrogênio (GROOTWASSINK; GAUCHER, 1980). A síntese desta toxina envolve uma série de reações de condensação e de oxiredução que são catalisadas por enzimas. Sua síntese é iniciada com uma unidade de acetil-Coenzima A e três unidades de malonil-Coenzima A, sendo condensados em ácido 6-metilsalicilico (6-MAS) pela ação da enzima ácido 6-metilsalicilico sintetase (6-MAS sintetase). A etapa seguinte envolve a conversão de 6-MAS em m-cresol pela atividade da 6-MAS descarboxilase. O m-cresol é convertido em álcool m-hidroxibenzil através da m-cresol hidrolase. O próximo passo é conversão do álcool m-hidroxibenzil a gentisaldeido pela enzima álcool m-hidroxibenzil desidrogenase, tendo como intermediário de reação o m-hidroxibenzaldehido ou o álcool gentisil. Uma vez formado o gentisaldeido, é convertido em isopoxidona, filostina, neopatilina, E-ascladiol e, finalmente, em patulina (DEMAIN, 1986). A avaliação da toxicidade da PAT é baseada em vários estudos. Sua dose letal-DL50 (quantidade ingerida que provoca a morte de pelo menos 50% da população em estudo) em ratos varia de 15 a 35 mg/kg, dependendo do modo de administração. A PAT apresenta efeito citotóxico que lhe confere propriedades antibiótica, antifúngica e antiprotozoárica. Esta citotoxicidade é facilitada pelo aumento na permeabilidade da membrana. A PAT desorganiza os microfilamentos citoplasmáticos. Ela inibe in vitro várias enzimas incluindo a ácido ribonucléico e a ácido desoxirribonucléico (DNA) polimerases. Isto também afeta a transcrição e a tradução tendo um efeito direto no DNA (MOAKE et al., 2005; WHO, 1998). A Agência Internacional para Pesquisa de Câncer (IARC, 1986) concluiu, em 1986, que não há evidências suficientes sobre a carcinogenicidade da PAT em animais e que não se pode fazer afirmação sobre sua carcinogenicidade em humanos. Entretanto, vários estudos têm evidenciado a toxicidade desta micotoxina. Dentre estes, alguns apontaram a PAT como causadora de efeitos crônicos apresentando sintomas genotóxicos capazes de induzir aberrações cromossômicas (PFEIFFER et al., 1998). Estudos de células mamárias in vitro forneceram evidências de que a PAT exibe genotoxicidade e possível atividade mutagênica (SCHUMACHER et al., 2005). Também as investigações de Schumacher et al. (2005) evidenciaram a mutagenicidade da PAT em culturas de células de hamster chinês. Foi demonstrado ainda que PAT possui habilidade em causar dano oxidativo ao DNA em células humanas, o que implica na capacidade de propiciar

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metagêneses e o início de câncer (LIU et al., 2003). Além disso, outros estudos evidenciaram que PAT pode causar também sintomas neurotóxicos (HOPKINS, 1993), imunotóxicos, imunosupressivos (WICHMANN et al., 2002) e teratogênicos (ROLL et al., 1990). Vários sintomas agudos também estão associados à PAT, incluindo úlceras e inflamação do estômago e intestino (MAHFOUD et al., 2002). Além disso, podem ocorrer convulsões, agitação, congestão pulmonar, edema, hiperemia e degenaração de células epiteliais (ESCOULA et al., 1977; HAYES et al., 1979). Devido às evidências de efeitos adversos da PAT, agências regulamentadoras internacionais determinaram limites aceitáveis de PAT nos produtos de maçã. O limite para esta toxina é baseado na quantidade do alimento ingerida diariamente e no peso corpóreo do indivíduo. A Organização Mundial de Saúde – OMS estabeleceu um limite provisional máximo de tolerância para ingestão diária (Provisional maximum tolerance daily intake - PMT-DI) de 0,4 µg/kg de peso corpóreo (WHO, 1998; FDA, 2001b). O nível máximo de PAT para sucos de maçã e produtos derivados foi estabelecido em 50 µg/L (ppb) (CODEX, 2003a) (FDA, 2001b). Este mesmo nível máximo foi também adotado pela União Européia para sucos de maçã, porém também foi estipulado o nível de 25 µg/kg para produtos sólidos de maçã e ainda o nível máximo de 10 µg/kg para produtos de maçã destinados às crianças (Baby foods) (EUROPEAN UNION, 2003). De acordo com a FAO (2004), 44 países possuem regulamentação para PAT. Nestes países foi estabelecido o nível máximo de 50 µg/L. No entanto, na Armênia, Lituânia, República Tcheca e China os limites são de 5 µg/L, 25 µg/L, 30 µg/L e 100 µg/L, respectivamente. O consumo de sucos prontos para beber no Brasil vem crescendo bastante, sendo que, no ano de 2008, houve um aumento de 8% sobre o ano anterior (SICONGEL, 2008). O consumo interno de suco de fruta gira em torno de 5 a 7 litros anuais por habitante, o que é ainda inferior ao observado na Europa e nos Estados Unidos onde o consumo de sucos de fruta chega a 30 litros anuais por habitante, destacando-se o suco de maçã que é muito popular (CELLI et al., 2009). Talvez por esta razão, o Brasil ainda não possua uma legislação para regulamentar o nível máximo e PAT em alimentos. Entretanto, muitos países têm adotado a recomendação das agências internacionais e esse fato deve estimular países exportadores, como o Brasil, a pesquisar a qualidade micotoxicológica dos seus produtos, a fim de se tornarem competitivos

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no mercado internacional no fornecimento de alimentos seguros (NOGUEIRA et al., 2007). Estudos sobre a incidência de PAT têm sido realizados em diversos países como Itália (BERETTA et al., 2000; RITIENI, 2003; PIEMONTESE et al., 2005), Reino Unido (MONTIMER et al., 1985), Espanha (MURILLO-ARBIZU et al., 2009), Turquia (GÖKMEN; ACAR, 1998; YURDUN et al., 2001), Brasil (SYLOS; RODRIGUEZ-AMAYA, 1999), África do Sul (LEGGOT; SHEPHARD, 2001), Bélgica (TANGNI et al., 2003; BAERT et al., 2006), Iran (CHERAGHALI, et al. 2005), Japão (WATANABE; SHIMIZU, 2005), Argentina (FUNES; RESNIK, 2009), Estados Unidos (TRUCKSESS; TANG, 1999) e Austrália (BURDA, 1992). Em todos os países foram encontradas amostras contaminadas com PAT. Nestes estudos, o nível máximo de contaminação dos produtos de maçã foi de 1150 µg/L. A frequente incidência desta toxina nestes produtos mostra que, até certo nível, a PAT é resistente aos processos de fabricação (LEGGOTT et al., 2001). Acredita-se que a eliminação da PAT não se dará somente por uma medida isolada, mas por um conjunto de procedimentos que envolvam a fabricação do suco desde a colheita da matéria-prima até a obtenção do produto final (MOAKE et al., 2005). Vários métodos são frequentemente utilizados na tentativa de reduzir os níveis de PAT em sucos de maçã, dentre eles destaca-se o tratamento com carvão ativado. Devido às suas propriedades adsorventes, o carvão ativado foi usado para reduzir os níveis desta toxina em suco de maçã. No entanto, verificou-se que a aparência e o sabor do suco podem ser afetados pelo tratamento com esse composto (LEGGOTT et al., 2001). O efeito da quantidade e do tempo de contato do carvão ativado sobre a concentração de PAT em suco de maçã foi estudado por Kadakal e Nas (2002). O melhor resultado foi obtido quando utilizaram 3 gramas de carvão ativado por litro de suco com tempo de contato de 5 minutos, obtendo redução na concentração da micotoxina de 62,3 para 30,8 µg/kg. PAT é instável ao processo de fermentação do suco. Estudos mostraram que esta micotoxina tem sua concentração reduzida e praticamente desaparece (redução de 99% da quantidade inicial), após processo fermentativo (STINSON et al., 1978). Sucos fermentados como a sidra, apresentam menor contaminação devido à degradação da PAT pela levedura Saccharomyces cereviae (HARRISON, 1989; MOSS; LONG, 2002). Da mesma forma, Celli (2006) verificou a degradação da toxina em suco de maçã ao cultivar esta levedura em

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meio contendo 7µg de PAT/mL. Neste estudo foi observado que nas primeiras 19,5 h, não houve degradação. Entretanto, após esse período ela passou a ser eliminada, com velocidade de 0,078 µg/mL.h. Os tratamentos térmicos, por sua vez, aplicados aos produtos de maçã pasteurizados contribuem muito pouco para a eliminação desta toxina que é relativamente resitente ao calor. Uma investigação simulou o efeito da aplicação de tratamentos de pasteurização na destruição de PAT presente no suco de maçã. Verificou-se que o tratamento a 90ºC/10 s reduziu os níveis desta toxina em 19%, mostrando que o equivalente processo industrial não assegura sua completa eliminação (WHEELER et al., 1987). Estudos demonstram que o nível de contaminação no produto final depende diretamente da qualidade da matéria-prima e, portanto, esforços devem ser realizados de forma a reduzir os níveis de PAT das maçãs destinadas ao processamento industrial (JANISIEWICZL; KORSTEN, 2002). A recepção das frutas deve ser considerada a primeira medida de controle da PAT aplicada efetivamente pela indústria processadora do suco. A recepção dos lotes de frutas com a menor taxa possível de podridão, é de extrema importância para se evitar a contaminação das frutas sadias. Nesta etapa, lotes de maçãs, que apresentem elevada proporção de frutas apodrecidas, não devem ser aceitos para o processamento, já que seria muito difícil selecioná-los manualmente de forma a reduzir o número de maçãs podres a um nível aceitável de PAT no produto final (FAO, 2003). As etapas de lavagem das frutas, bem como a seleção das mesmas antes da sua moagem mostraram ser procedimentos baratos e eficazes na redução de PAT, uma vez que a produção desta toxina é confirmada primariamente nos tecidos infectados de maçãs podres (MOSS, 2002; RYCHLIK; SCHIEBERLE, 2001). Uma redução significativa dos níveis de PAT foi obtida na etapa de lavagem das maçãs (SYDENHAM et al., 1995). Neste estudo, o nível médio da micotoxina foi reduzido de 920 ppb para 190 ppb após a lavagem (redução de aproximadamente 80%). Outro estudo observou que a quantidade de PAT nas frutas não processadas estocadas ao ar livre atingiu 90 ppb, 395 ppb e 2245 ppb após 5, 15 e 33 dias, porém diminuiu para valores de 75 ppb, 100 ppb e 695 ppb, respectivamente, após a etapa de lavagem (SYDENHAM et al., 1997). Investigações mostraram que o hipoclorito de sódio, ao ser usado na lavagem de frutas, não permite a colonização de fungos, reduzindo assim a produção de PAT (HASAN, 2000). Frutas lavadas em soluções

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cloradas a 100 ppm e 200 ppm por 2 min tiveram os níveis de PAT reduzidos entre 10% e 100%, dependendo da quantidade inicial da micotoxina e das soluções utilizadas (JACKSON et al., 2003). Okull e Laborde (2004) estudaram a contaminação cruzada de esporos de P. expansum entre maçãs e verificaram que, quando as frutas previamente “machucadas” foram submersas em água contendo em torno de 106 esporos/mL, 100% destas desenvolveram apodrecimento durante armazenamento. Porém, quando as frutas foram subsequentemente tratadas por imersão em solução contendo 200 ppm de hipoclorito de sódio acidificado/5 min, em torno de 16,7 a 43,4% delas se mostraram infectadas durante estocagem. Tais resultados demonstram a importância em se reduzir a contaminação por P. expansum antes das frutas serem encaminhadas ao armazenamento dentro dos packing houses ou dentro da indústria. A lavagem das frutas na indústria de suco é comumente realizada com água sob pressão. Foi verificado que a água aplicada em alta pressão conseguiu retirar total ou parcialmente as partes podres das frutas e reduziu os níveis de PAT no suco de maçã em até 54% (ACAR et al., 1998). Desta forma, esta etapa pode ser considerada como uma medida de controle da PAT. Entretanto, esta toxina e os esporos fúngicos poderão ser introduzidos na água de limpeza e nos aerossóis, o que pode causar o risco de proliferação dos fungos, caso as frutas sejam estocadas depois da lavagem (FAO, 2003). Mesmo que ocorra a remoção total das lesões da fruta através da lavagem com água sob pressão, as maçãs ainda podem conter altos níveis de PAT, pois estudos mostraram que esta toxina pode se difundir em 1 a 2 cm a partir da parte lesionada em direção ao tecido sadio (TANIWAKI et al., 1992; RYCHLIK; SCHIEBERLE, 2001). Celli (2006) quantificou a concentração de patulina em podridões de maçã, bem como o tecido sadio ao redor da lesão (1 cm). Encontrou patulina em todos os tecidos deteriorados e sadios analisados, chegando a 115,65 e 5,02 µg de PAT/g de tecido, respectivamente. O processo de seleção das frutas dentro da planta processadora é realizado em esteiras giratórias onde as frutas são inspecionadas visualmente e, aquelas lesionadas são descartadas total ou parcialmente. A quantidade de PAT nos sucos pode ser reduzida de uma concentração média de 190 ppb (após a lavagem) para 55 ppb após a remoção das frutas apodrecidas (SYDENHAM et al., 1995). Foi verificado que o corte (trimming) das partes podres da fruta foi capaz de reduzir entre 93 a 99% do total da PAT presente nas maçãs (LOVETT et al., 1975).

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O diâmetro das lesões pode afetar os níveis de PAT (MARIN et al., 2006). Foi observada uma correlação direta entre a quantidade de PAT e o tamanho das lesões (MARTINS et al., 2002). Investigações mostraram que, em geral, a concentração de PAT nas amostras de suco de maçã aumentou proporcionalmente com o uso de maçãs lesionadas. Frutas sãs produziram suco de maçã com níveis inferiores a 50 ppb, enquanto que o suco obtido a partir maçãs com 30, 60 e 100% de maçãs lesionadas apresentou PAT superior a 50 ppb (KADAKAL; NAS, 2002). Diferentes métodos vêm sendo desenvolvidos para a detecção e quantificação de patulina em produtos de fruta (MOAKE et al., 2005). Atualmente, os métodos mais utilizados para quantificar patulina são baseados na separação da toxina por cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV (ultravioleta). Este é o método oficial adotado pela AOAC para suco de maçã (método 995.10) (BRAUSE et al., 1996; AOAC, 2000) com um limite de quantificação de 5 µg/L. Neste método o suco é extraído 3 vezes com acetato de etila, seguido de desidratação com sulfato de sódio. O solvente é evaporado sob fluxo de nitrogênio gasoso a 40°C e o resíduo é dissolvido em acetonitrila:água (10:90). A cromatografia líquida utiliza coluna C18 de fase reversa (5 µm, 250 x 4,6 mm) e detector UV fixado em 276 nm. O sistema é isocrático, com fluxo de a 1 mL/min e fase móvel acetonitrila:água (5:95). 2.5 Desinfecção de maçãs Uma lavagem simples com água não pressurizada pode ter um efeito mínimo na remoção dos micro-organismos da superfície de uma fruta. O uso de sanitizantes melhora a eficiência do processo de limpeza. Os grandes problemas associados a este uso estão relacionados à associação negativa da aplicação de produtos químicos e ao custo de sua utilização (KOZEMPEL et al., 2002). A escolha do agente de desinfecção deve ser baseada no resultado efetivo a baixas concentrações, baixo custo e baixo impacto ambiental. A eficácia do método usado para reduzir a população microbiana é usualmente dependente do tipo de tratamento, tipo e fisiologia do micro-organismo alvo, características dos alimentos, e condições de aplicação dos sanitizantes (tempo de exposição, concentração, pH e temperatura), sendo que estes não devem alterar as características sensoriais dos alimentos (PARISH et al., 2003).

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Testes para determinar a eficiência destes agentes são necessários para descobrir as concentrações a serem recomendadas para um determinado tratamento (KELSEY, et al., 1974; COATES, 1996; WINNICZUK; PARISH, 1997; VIJAYAKUMAR; WOLF-HALL, 2002). A necessidade de padronização de métodos para determinação da eficácia de desinfetantes contra micro-organismos patogênicos em frutas e vegetais tem sido destacada (BEUCHAT, 2002; SILVA et al., 2003). 2.5.1 Agentes sanitizantes 2.5.1.1 Compostos clorados Compostos clorados são amplamente utilizados como agentes sanitizantes, principalmente nas formas de hipoclorito de sódio (NaClO) ou de cálcio Ca(ClO)2, dióxido de cloro (ClO2) e cloro gás (Cl2), que são derivados clorados de origem inorgânica. Além destes, existem os compostos clorados orgânicos, denominados “cloraminas orgânicas”, cuja representação pode ser destacada pelo dicloisocianurato de sódio e o ácido tricloro isocianúrico. Os derivados clorados orgânicos são considerados mais estáveis que compostos inorgânicos (ANDRADE; MACÊDO, 1996; MACÊDO, 2004; RUSSEL et al. 1992). A hidrólise dos compostos clorados orgânicos e inorgânicos libera cloro na forma de ácido hipocloroso (HClO), que é considerado a substância germicida por possuir alta capacidade oxidante. O ácido hipocloroso é um ácido fraco, que em solução aquosa se dissocia para formar o íon hidrogênio e o íon hipoclorito (Equação 2.1).

HClO ↔ ClO- + H+ (Equação 2.1) O pH da solução clorada é um fator muito importante porque influencia sua ação germicida. No meio alcalino, este se dissocia (Equação 2.1) e sua eficiência diminui. Já em meio ácido, o HClO não está dissociado e é mais eficiente contra micro-organismos (ANDRADE; MACÊDO, 1996). Com relação ao pH dos produtos clorados encontrados no mercado, o hipoclorito de sódio/cálcio apresenta pH entre 11,0 e 12,5, em solução a 1%; e o composto orgânico dicloroisocianurato de sódio, na mesma concentração, apresenta pH entre 6 e 8 (MACÊDO, 2004). Outro fator que aumenta a efetividade das soluções cloradas é o aumento da temperatura. Entretanto, seu uso em temperaturas muito altas não é aconselhável, pois este se volatiliza. A exposição à luz, durante a estocagem, pode provocar decomposição

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fotoquímica, o que evidencia a necessidade do armazenamento em frascos opacos, ao abrigo da luz e do calor. A estabilidade de compostos clorados, como o hipoclorito de sódio, durante a estocagem, é assegurada por adição de hidróxido de sódio, que mantém o pH alto durante o armazenamento. Porém, a solução clorada concentrada de hipoclorito deve apresentar a capacidade de tamponamento quando diluída, favorecendo o decaimento gradativo do valor de pH, tornando o produto ativo na forma de ácido hipocloroso. Pode ainda ocorrer decomposição catalítica na presença de íons, metais pesados, cobalto, manganês, níquel e ferro, produzindo cloreto e oxigênio. Um fator importante com relação ao ácido hipocloroso é o de ser fortemente reativo com substâncias orgânicas, sendo que, para se atingir a concentração de cloro residual livre desejada, é preciso primeiro oxidar estes compostos e ultrapassar o “ponto de quebra”. A cloração acima deste ponto consiste na adição de cloro suficiente para permitir a destruição microbiana (RUSSEL et al. 1992; ANDRADE; MACÊDO, 1996). Cloro líquido e hipocloritos são geralmente utilizados na concentração de 50 a 200 ppm. Concentrações superiores a estas têm sido investigadas para uso na desinfecção de sementes e brotos (PARISH et al., 2003). Os limites máximos de solução sanitizante permitidos para a lavagem direta de frutas é de 100 ppm de cloro livre (quando se utiliza dicloroisocianurato de sódio) e 200 ppm de cloro livre (quando se utiliza hipoclorito de sódio) (FDA, 1998; SAPERS, 2001). Dentre as vantagens na sua utilização estão o baixo custo, a rápida ação não afetada pela dureza da água, o espectro de ação contra uma grande variedade de micro-organismos (bactérias Gram-positivas e negativas, incluindo micobactérias, fungos, vírus lipofílicos e hidrofílicos, e também esporos bacterianos, quando em altas concentrações). Além disso, apresenta facilidade de preparo. Entretanto, o cloro é corrosivo para equipamentos metálicos e irritante para a pele e mucosas quando utilizado em concentrações elevadas. O mecanismo mais provável de ação contra micro-organismos é atribuído à sua combinação com proteínas da membrana celular, formando compostos tóxicos e inibindo as reações enzimáticas essenciais, além da reação com DNA, oxidação de bases purínicas e pirimidínicas e paralisação da síntese protéica. Pode provocar ainda a descarboxilação oxidativa de aminoácidos formando nitrilas e aldeídos; provocação de aberrações cromossomáticas e inibição do consumo de oxigênio que afeta a fosforilação oxidativa. Em relação aos esporos bacterianos, acredita-se que sua cobertura o proteja da ação do cloro, servindo assim como

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barreira à permeabilidade deste sanitizante, Entretanto, esta é a camada onde ele inicia sua ação oxidante (ANDRADE; MACÊDO, 1996; RUSSEL et al., 1992). 2.5.1.2 Ácido peracético O ácido peracético (C2H4O3) é constituído por uma mistura estabilizada de ácido peracético, peróxido de hidrogênio (H2O2), ácido acético (CH3COOH) e um veículo estabilizante. O ácido peracético possui alta capacidade de oxidação dos compostos celulares. Sua ação sobre células vegetativas e também sobre esporos bacterianos, fungos, leveduras e vírus também é devido ao teor de peróxido de hidrogênio presente nas formulações comerciais. O produto tem como vantagem, além da excelente ação sanitizante e atividade esporicida, o fato de agir sob baixas temperaturas, possuir um baixo efeito residual e ter concentração facilmente determinada. As soluções de ácido peracético são mais eficientes em temperaturas abaixo de 35°C e pH entre 2 e 4. Entretanto, pode ser irritante à pele, possui vapores irritantes o que requer cuidados no manuseio. Além disso, é incompatível com o ferro, cobre e alumínio, e possui baixa atividade à estocagem, devendo assim ser mantido em local fresco e ventilado, afastado da luz direta do sol e fontes de calor (ANDRADE; MACÊDO, 1996; RUSSEL et al. 1992). De acordo com o FDA os limites máximos ácido peracético para a lavagem direta de frutas é de no máximo 80 ppm (FDA, 1998). 2.6 Uso de modelos matemáticos para descrever a inativação de

esporos A microbiologia preditiva utiliza modelos matemáticos derivados de estudos quantitativos dos micro-organismos para prever o comportamento microbiano nos alimentos em diferentes condições, sendo que a necessidade de garantir a segurança microbiológica e a qualidade dos alimentos tem sido o maior estímulo à sua aplicação. O uso de modelos matemáticos na microbiologia de alimentos começou em 1920, com desenvolvimento de métodos para calcular o tempo de destruição térmica de micro-organismos (NAKASHIMA et al., 2000). Segundo Whiting e Buchanan (1993), os modelos matemáticos podem ser classificados como modelos primários, secundários e terciários. Os modelos primários são aqueles que descrevem as

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mudanças de número de micro-organismos ou outra resposta microbiana com o tempo. Os modelos secundários descrevem como as repostas de parâmetros obtidos no modelo primário variam com as condições ambientais como pH, temperatura, atividade de água ou concentração de determinado sanitizante, por exemplo. Os modelos terciários combinam o uso de modelos primários e secundários em um pacote de programas. São rotinas de softwares que transformam modelos primários e secundários em modelos na forma de aplicativos, que podem determinar respostas microbianas em diferentes condições ou ainda comparar o crescimento de diferentes micro-organismos. Dentre os modelos primários utilizados para descrever a inativação de micro-organismos, neste trabalho serão destacados: Modelo de Bigelow; Modelo de Weibull e Modelo Bifásico. O Modelo de Bigelow assume que todas as células ou esporos em uma população tenham idêntica resistência para tratamentos letais e que sua inativação é governada por uma equação cinética de primeira ordem (Equação 2.2) (SCHAFFNER; LABUZA, 1997).

Dt

NoN

−=log Equação 2.2

Onde, No = concentração da população inicial de células (UFC/mL); N = concentração de sobreviventes depois de exposto a um tempo t (UFC/mL); D (tempo de redução decimal) =tempo para reduzir em 1 ciclo logarítmico a concentração celular (min); t =tempo (min). Alguns micro-organismos apresentam uma inativação térmica logarítmica, ou seja, quando se grafica o logaritmo do número ou concentração de sobreviventes versus tempo de aquecimento, a uma dada temperatura, obtém-se uma relação linear. Porém, comportamentos não lineares de inativação são bastante comuns, sendo a inativação linear considerada, na realidade, uma exceção (PELEG, 2006). Numerosos micro-organismos apresentam curvas de inativação (Log (N/No) vs time) não lineares, onde se observa um “ombro” no início, seguido de uma fase línea de destruição (parte logarítmica da curva). À medida que a temperatura de inativação aumenta, a fase “lag” ou

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“ombro” vai diminuindo, levando ao aparecimento de uma reta (SALOMÃO et al., 2007; FUJIKAWA et al., 2000). Pode ser ainda observado um comportamento de inativação logarítmica no início seguido de uma cauda (CERF, 1970). O Modelo de Weibull assume que as células e os esporos em uma população têm diferentes resistências e uma curva de sobreviventes é apenas a forma acumulativa de uma distribuição de agentes letais (VAN BOEKEL, 2002) Assumindo que o tempo de inativação t segue a distribuição de Weibull, obtem-se a seguinte equação:

ptNoNLog )(

δ−=

Equação 2.3

O fator p é o parâmetro de forma, sendo que distribuição de Weibull corresponde a uma curva com concavidade voltada para cima se p < 1 e concavidade voltada para baixo se p > 1 e linear se p = 1. O parâmetro δ é o fator de escala e pode ser definido como o “tempo para uma redução decimal”, se p = 1 (PELEG; COLE, 1998). O modelo Bifásico (CERF, 1970) assume a existência de duas sub-populações que são caracterizadas pela diferença nos seus níveis de resistência aos tratamentos (Equação 2.4).

( )tkftkfLogNoNLog ×−×−+×−×=

2maxexp()1()1maxexp(

A fração f é considerada a sub-população sensível ao tratamento e (1-f) é a outra fração da população que é considerada resistente ao tratamento. As taxas específicas de inativação das duas populações são kmax1 (min-1) e kmax2 (min-1), respectivamente. Os modelos secundários descrevem como as respostas de parâmetros primários variam coma as mudanças de condições ambientais. Alguns exemplos são modelos polinomiais ou metodologia de superfície de resposta, equação de Arrhenius, modelo da raiz quadrada ou de Ratkowsky (2002) entre outros (MCMEEKIN et al., 2002; WHITING, 1995). Além destes modelos, Corradini e Peleg (2005) têm demonstrado que modelos empíricos podem ser utilizados para descrever a variação dos parâmetros dos modelos primários com a temperatura e outros fatores como atividade de água, pH, concentração de sanitizantes, dentre outros.

Equação 2

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Um modelo secundário bastante utilizado é o que fornece o valor Z, que significa os graus de temperatura necessários para ocasionar uma variação em 10 vezes no valor de D, fazendo a regressão de (Log D) versus Temperatura (°C). Cabe ressaltar que este modelo só poderá ser utilizado quando a curva de destruição apresentar comportamento linear e, portanto, for possível se calcular o valor de D.

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CAPÍTULO 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Metodologia utilizada no Artigo 1: Survey of molds and

Alicyclobacillus from a concentrated apple juice productive process in Brazil

3.1.1 Amostragem Inicialmente, foi realizado um levantamento prévio da contaminação presente nas diversas etapas do processamento de suco concentrado de maçã. Foram utilizados métodos para “isolamento” e “detecção” dos seguintes micro-organismos: bolores e leveduras, fungos termorresistentes e Alicyclobacillus spp. As amostras retiradas diretamente da planta de processamento no período da safra de 2005 foram as seguintes: maçã sem lavagem prévia (12-13°Brix), maçã após lavagem (12-13°Brix), água de lavagem, mosto (14°Brix; pH 3,6), bagaço (12-13°Brix), produto antes da pré-concentração (9,8°Brix; pH 3,6), produto depois da pré-concentração (14°Brix; pH 3,8), produto durante tratamento enzimático (18,2°Brix; pH 3,5), produto antes da ultra-filtração (17,2°Brix; pH 3,6), produto depois da ultra-filtração (13,8°Brix; pH 3,7), produto antes da concentração (17°Brix; pH 3,7), suco concentrado de maçã (68,2°Brix; pH 3,5) e suco concentrado de maçã estocado (67,6°Brix; pH 3,5). A quantidade de amostra coletada foi de aproximadamente 250 mL, sendo mantida sob refrigeração até o momento da análise, que foi realizada em até 24 horas. Amostras de maçã foram coletadas aleatoriamente para representar o real estado das frutas. Durante as análises, pedaços de diferentes maçãs foram misturados para manter a aleatoriedade dos testes. As codificações das amostras foram as seguintes: maçã sem lavagem prévia (M), maçã após lavagem (ML), água de lavagem (H2O), mosto (MO), bagaço (BA), produto antes da pré-concentração (APC), produto depois da concentração (DPC), produto durante tratamento enzimático (TE), produto antes da ultra-filtração (AUF), produto depois da ultra-filtração (DUF), produto antes da concentração (AC), suco concentrado de maçã (DC) e suco concentrado de maçã estocado (PF). Foi realizada ainda uma análise adicional do produto final (PF) somente para fungos termorresistentes, a partir de uma amostra retirada

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posteriormente no período da safra. Uma amostra de maçã estocada (entressafra) com características visíveis de “mofo azul” foi retirada com o objetivo de realizar a identificação da espécie (Imagem 1; Anexo I). A imagem 2 do anexo I mostra a característica das maçãs com visível “mofo azul”. Todos os meios de cultura e reagentes citados neste capítulo estão descritos no Anexo III. 3.1.2 Detecção e enumeração de bolores e leveduras Vinte e cinco gramas de amostra de maçã e do bagaço foram adicionados a 225 mL de água peptonada estéril 0,1% e homogeneizadas em stomacher (ITR, Modelo 1204), durante 2 minutos. A partir das demais amostras, que eram líquidas, foram retiradas alíquotas de 10 mL as quais foram diluídas em 90 mL de água peptonada estéril. Subsequentemente foram realizadas as demais diluições seriadas e o plaqueamento foi realizado por profundidade usando ágar batata dextrose PDA (Biolife) acidificado com ácido tartário 10% (pH final = 3,5). A incubação ocorreu a 25°C durante 3 a 5 dias sendo a contagem expressa em UFC/mL ou UFC/g (SILVA et al., 1997). 3.1.3 Detecção e enumeração de fungos filamentosos termorresistentes Foi utilizada a metodologia de detecção e enumeração de fungos filamentosos termorresistentes descrita por Beuchat e Pitt (2001). Cem gramas das amostras de maçã e do bagaço foram misturados a 100 mL de água estéril, sendo a maçã previamente triturada em liquidificador estéril. Após diluição, seguiram para o Stomacher onde foram homogeneizadas durante 4 minutos. Então, duas porções de 50 mL foram transferidas para tubos estéreis com tampa rosqueável. As amostras de suco concentrado de maçã foram submetidas a uma diluição previa onde 50 mL da amostra foram adicionados assepticamente a 50 mL de água destilada estéril. A mistura obtida (100 mL) foi homogeneizada, e a partir dela foram retiradas duas porções de 50 mL, que foram transferidas para dois tubos com tampa rosqueável. As demais amostras não necessitaram de nenhum pré-tratamento e duas alíquotas de 50 mL foram colocadas diretamente em dois tubos com

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tampa rosqueável. O choque térmico ocorreu em banho de água agitado (Tecnal 184, precisão +/-0,1°C) mantido a uma temperatura de 80°C por 30 minutos. Terminado o tempo de choque térmico, os tubos foram resfriados em banho de gelo durante, no máximo, um minuto. Para cada uma das amostras, o conteúdo total dos dois tubos (100 mL) foi transferido para um erlemeyer contendo 100 mL de PDA com concentração dupla de ágar, previamente adicionado de 50 mg/L de rosa de bengala e 4 g/L de cloranfenicol. O conteúdo resultante foi acidificado com solução de ácido tartárico a 10% p/v (pH final = 3,5), misturado adequadamente e distribuído em 8 placas de Petri descartáveis de 90 mm de diâmetro. Após solidificação da mistura nas placas, estas foram envolvidas em saco plástico e incubadas a 30ºC por 30 dias. Leituras preliminares da presença de fungos termorresistentes foram realizadas periodicamente a cada 5 dias e o resultado foi expresso em UFC/100mL para amostras líquidas e UFC/100g para as amostras da fruta. 3.1.4 Enumeração e detecção de Alicyclobacillus spp. (ATSB) Os ensaios realizados ocorreram de acordo com a metodologia descrita por Eguchi et al. (1999), que contempla uma metodologia para a enumeração e outra para a detecção de Alicyclobacillus spp. Metodologia para enumeração: Para suco concentrado, foram coletados 10 mL de amostra e colocadas em frasco estéril contendo 90 mL de água estéril (diluição 1:10). Para outras amostras líquidas, os 10 mL de amostra foram adicionados em 90 mL de caldo BAT (caldo Bacillus acidoterrestris). Vinte e cinco mililitros das amostras de maçã (triturada em liquidificador estéril) e de bagaço foram, cada qual, adicionados a 225 mL de água destilada estéril, cuja mistura foi homogeneizada em Stomacher, durante 2 minutos. Em seguida, as amostras foram submetidas a um choque térmico de 80°C/10 minutos em um banho de água agitado (Tecnal 184, precisão +/-0,1°C). Em seguida, as amostras foram rapidamente resfriadas em banho de gelo, até atingir temperatura ambiente. O plaqueamento ocorreu em ágar BAT e a incubação a 50°C durante 4 dias, sendo monitorada até 10 dias. Metodologia de detecção: A fim de recuperar os esporos presentes, que poderiam estar em números bem reduzidos podendo não ser verificados pelo método de enumeração, procedeu-se o enriquecimento da amostra. Assim, as amostras preparadas como descrito anteriormente foram incubadas a 50°C por 24 horas para

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favorecer seu enriquecimento e promover, desta maneira, o crescimento do micro-organismo, mesmo quando em número muito baixo. Após este período, 1 mL de amostra foi adicionado ao meio de cultura (ágar BAT), seguido de incubação a 50°C por 4 dias, sendo monitorado por 10 dias. O resultado final foi expresso como presença ou ausência de Alicyclobacillus (ATSB). A partir das cepas detectadas foi realizada a caracterização morfológica de Alicyclobacillus sp. (ATSB). As colônias que ocorreram na superfície da placa foram espalhadas em placa contendo o mesmo meio usado para o isolamento. As placas foram incubadas a 50°C por 48 a 72 horas e, após este período, as colônias foram caracterizadas em relação à sua morfologia e presença de esporos característicos (Imagem 3, anexo I). Para a confirmação das cepas caracterizadas morfologicamente, estas foram também incubadas em ágar nutriente (Biolife) a pH 7,0 e incubadas a 50°C. A ausência de crescimento nestas condições confirmarou a natureza acidofílica dos isolados e descartou a presença de bacilos ácido tolerantes. As cepas isoladas foram enviadas para a Fundação André Tosello (Campinas, SP) para a identificação e depósito na Coleção de Culturas Tropical (CCT) (Anexo I). 3.1.5 Estocagem das culturas A estocagem das cepas isoladas foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Muro e Luchi (1989). Para estocagem, foram utilizados frascos do tipo penicilina (10 mL), preenchidos até metade de seu volume com sílica gel, tampados com algodão e previamente esterilizados em estufa por calor seco durante 3 horas à temperatura de 180°C. As tampas de borracha utilizadas no fechamento foram autoclavadas por 121°C durante 15 minutos. As cepas de fungos foram cultivadas em meio PDA por 7 dias a 25°C e 30°C (fungos termorresistentes). As colônias de Alicyclobacillus sp., cultivadas em meio BAT durante 7 dias a 50°C. Posteriormente, foram adicionados 8 mL de solução de leite desnatado a 5% sobre placas e foi realizada a retirada superficial da massa celular aderida às placas. Um mililitro da suspensão foi transferido para os frascos de penicilina os quais foram resfriados imediatamente em banho de gelo por 10 minutos. Em seguida, o tampão de algodão do frasco foi retirado sendo o frasco fechado com uma tampa de borracha lacrada com selo de

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alumínio. Todos os procedimentos foram realizados, em duplicata, dentro de uma câmara de fluxo laminar. Para a reativação das linhagens estocadas, alguns fragmentos de sílicas foram removidos assepticamente do frasco original e transferidas para um tubo inclinado contendo o respectivo meio de cultura que foi então incubado nas temperaturas ótimas. 3.1.6 Identificação das cepas de fungos filamentosos isolados A identificação foi realizada a partir das observações macroscópicas e microscópicas dos fungos filamentosos isolados. A análise macroscópica foi baseada nas descrições das colônias nos meios Ágar Czapeck Extrato de levedura (CYA), Ágar Extrato de Malte (MEA), Ágar Glicerol Nitrato 25% (G25N), formulados de acordo com Pitt e Hocking (1999). Após inoculação do fungo nas placas (duplicata), estas foram levadas à incubação nas temperaturas de 25°C. Adicionalmente, placas contendo meio CYA foram incubadas a 5°C e 37°C. A imagem 1 do Anexo I representa o crescimento fúngico nos referidos meios. Para as espécies xerofílicas, uma incubação adicional a 25°C foi realizada utilizando meio CY20S (Ágar Czapeck Extrato de levedura com 20% de sacarose). Após incubação por 7 dias, foram executadas as análises micro e macroscópicas das colônias formadas. A metodologia microscópica para a avaliação morfológica do fungo em lâmina procedeu-se da seguinte maneira: primeiramente foi depositada uma gota de álcool sobre a lâmina; em seguida, usando uma alça de platina, um fragmento do fungo foi colocado sobre o álcool e, no caso dos fungos termorresistentes, suas estruturas foram abertas pela manipulação das agulhas (montadas de forma a ficarem fixas em uma das extremidades de palitos de madeira). Em seguida, procedeu-se a fixação do fungo flambando a lâmina em bico de Bunsen. A coloração foi realizada pingando uma gota de corante lactofucsina 0,1% ou Cotton blue. Pela microscopia, foram verificadas as estruturas de caracterização como conídios, ascocarpos, ascos e ascósporos. Além disso, para os fungos termorresistentes foi identificada a fase anamorfa (assexuada). Todo o processo baseou-se na chave de identificação e nas características dos fungos apresentadas por Pitt e Hocking (1999). Uma cepa suspeita de se tratar de P. expansum foi enviada para a Fundação André Tosello (Campinas, SP) para a identificação e depósito na Coleção de Culturas Tropical (CCT) (Resultado apresentado no

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anexo I). 3.2 Metodologia utilizada no Artigo 2: Aplicação de

dicloroisocianurato de sódio e ácido peracético para redução de esporos de Penicillium expansum, Byssochlamys fulva e Alicyclobacillus acidoterrestris na superfície de maçãs e em soluções aquosas

3.2.1 Micro-organismos e preparo da suspensão de esporos As cepas dos micro-organismos Byssochlamys fulva (CCT 0056), Penicillium expansum (CCT 4680) e Alicyclobacillus acidoterrestris (CCT 4384) foram obtidas da coleção de culturas da Fundação Tropical de Culturas André Tosello (Campinas, SP, Brasil). O preparo da suspensão de esporos dos fungos P. expansum e B. fulva iniciou-se pela pré-esporulação em placas de Petri contendo meio PDA (pH 3,5) por 7 dias a 25ºC e 30ºC, respectivamente. Os esporos coletados foram adicionados às placas de esporulação, contendo meio MEA, e incubados na temperatura indicada para cada micro-organismo por 10 dias (P. expansum) e 30 dias (B. fulva). Após este período, adicionou-se 10 mL de água destilada estéril em cada placa e, depois da raspagem, todo o conteúdo foi filtrado em 4 camadas de gaze estéril e centrifugado a 3500 rpm (2000 x g) por 15 minutos. Este procedimento foi repetido duas vezes ou até a constatação microscópica da ausência de hifas. Ao final, foi feita a resuspensão dos esporos em água estéril, sendo a suspensão mantida sob refrigeração a 4ºC até posterior utilização (SALOMÃO, et al. 2007). A suspensão de esporos de A. acidoterrestris foi pré-esporulada em tubos inclinados (PDA; pH 3,5) e incubados a 44ºC/3 dias. A biomassa obtida foi adicionada a 10 mL de caldo AAM (Meio Alicyclobacillus acidocaldarius), formulado de acordo com Murakami et al., 1998) e incubada a 45ºC por 24 horas. O caldo enriquecido foi espalhado sobre placas de Petri contendo meio AAM (suplementado de 0,05% de MnCl2.4H2O e 1,5% de ágar; pH 4) e incubado por 10 dias a 45ºC. Após a confirmação microscópica da produção de esporos por coloração usando verde de Malaquita (MASSAGUER, 2006), a cada placa foi adicionado 10 mL de água seguida de raspagem. O esporos obtidos foram centrifugados 5 vezes a 3500 rpm (2000 x g) por 15 minutos, sendo eliminado o sobrenadante. Ao final, foi feita a resuspensão dos esporos em água estéril, sendo a suspensão mantida sob refrigeração a 4ºC até posterior utilização (MURAKAMI et al., 1998).

61

3.2.2 Teste de ativação para os esporos de B. fulva CCT 0056 Para a determinação das condições ótimas de ativação dos esporos de B. fulva foi utilizada a temperatura de 80°C, que está dentro da faixa ótima para Byssochlamys spp. (TOURNAS, 1994) durante os tempos 0 (controle), 5, 10 e 15 minutos. Em cada tubo foi adicionado contendo 5,3 mL de água destilada estéril foi adicionado 0,1 mL da suspensão de esporos. Após homogeneização, os tubos foram aquecidos em um banho termostatizado (Tecnal®, Modelo TE-184, ± 0,1ºC de precisão), previamente ajustado à temperatura de 80ºC. O tempo de subida até a temperatura desejada foi determinado previamente conforme item 3.2.3. Transcorridos os tempos de aquecimento definidos, os tubos foram resfriados imediatamente em um banho de gelo. Para a determinação do número de esporos ativados, foram realizadas diluições seriais em água peptonada 0,1%, plaqueamento por profundidade em meio PDA e incubação a 30°C durante 5-7 dias. O resultado foi expresso em esporos/mL. O teste foi realizado em duplicata para cada temperatura testada. O Gráfico 1 do anexo II, mostra a representação da ativação dos esporos de B. fulva CCT 0056. 3.2.3 Determinação do tempo de subida da temperatura Os tubos foram preenchidos com suficiente quantidade de água e adicionados de um termopar, de cobre-constantan tipo T fixado no centro dos tubos, ligado ao sistema de aquisição que gera os dados no programa monitor de termopares. Após esta montagem, o tubo contendo o termopar, foi colocado no banho previamente ajustado na temperatura desejada enquanto o programa monitor produziu o gráfico que representou o aumento da temperatura pelo tempo transcorrido, fornecendo assim, a determinação do tempo exato em que a amostra atingiu a temperatura testada (tempo de subida). O tempo de subida para cada temperatura foi determinado em triplicata. 3.2.4 Preparo das soluções sanitizantes As soluções à base de dicloroisocianurato de sódio foram formuladas a partir do produto Sumaveg® (Johnson Diversey, São Paulo, Brasil) e as soluções à base de ácido peracético a partir do

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produto Tsunami 100® (ECOLAB, São Paulo, Brasil). A concentração dos princípios ativos de cada solução foi confirmada utilizando fitas medidoras específicas para a medição de cloro livre (Test Systems Inc., Rock Hill, SC, Estados Unidos) e ácido peracético (Weber Scientific, Chestertown, Md, Estados Unidos). Todas as soluções foram mantidas nas temperaturas de 25°C e/ou 37°C. 3.2.5 Teste sobre a superfície das maçãs Os testes sobre a superfície das maçãs foram baseados na metodologia adaptada de Lee et al., 2004. As maçãs, da variedade Fuji, foram adquiridas em mercado local, sendo que sempre procurou-se escolher frutas sem lesões aparentes e de calibre semelhante. No laboratório, primeiramente as maçãs receberam lavagem com água potável e, em seguida, foram colocadas dentro de sacos estéreis com 100 mL de água destilada estéril e massageadas por 1 min. Posteriormente, as maçãs foram secas em gaze estéril e sobrepostas em superfície esterilizada com o pedúnculo voltado para cima. A inoculação das maçãs foi feita na região em torno do pedúnculo utilizando-se 0,1 mL de suspensão dos esporos, com concentração de 105, 107 e 106 esporos/mL, respectivamente de P. expansum, B. fulva e A. acidoterrestris. As frutas inoculadas com os fungos permaneceram por duas horas em câmara de fluxo laminar para a fixação dos esporos (tempo baseado em testes prévios) e, as inoculadas com A. acidoterrestris, permaneceram 24 horas (SAPERS, et al., 2001). Para o tratamento, as maçãs foram colocadas individualmente dentro de sacos estéreis e adicionadas de 100 mL das soluções sanitizantes nas concentrações de 0, 50, 80, 150, 200 e 250 ppm de ácido peracético e 0, 50, 100, 150, 200 e 250 ppm de cloro, separadamente para cada concentração. Neste caso, foram testadas soluções estabilizadas à temperatura de 25ºC e 37ºC para os esporos de B. fulva e de A. acidoterrestris. Posteriormente, massageou-se a fruta com as mãos durante 1 minuto e foi coletada a primeira amostra de 4,0 mL. Em seguida, manteve-se o contato do sanitizante com a fruta (sem massageamento) por mais 1 min e coletou-se outra amostra de 4,0 mL. Imediatamente, cada amostra foi neutralizada com 1,3 mL de solução de tiossulfato de sódio 0,6% por 2 minutos. À exceção dos esporos de P. expansum, os demais receberam um choque térmico em banho termostatizado (Tecnal®, Modelo TE-184, Piracicaba, Brasil ± 0,1ºC de precisão) a 80ºC/10 min. Este tratamento de ativação foi baseado em

63

resultados anteriores para os esporos de B. fulva (item 3.2.2; Gráfico 1 do anexo II) e, para os esporos de A. acidoterrestris, utilizou-se o mesmo choque térmico já utilizado por outros autores (MURRAY et al., 2007; PEÑA; MASSAGUER, 2006; SILVA; GIBBS, 2001; GROENNEWALD et al., 2009; WALLS; CHUYATE, 2000 e ORR; BEUCHAT, 2000). Em seguida, as amostras foram diluídas serialmente eplaqueadas em meio PDA (pH 3,5) (OKULL et al., 2006; OKULL; LABORDE, 2004; SPLITTSTOESSER et al., 1993; MURRAY et al., 2007). A incubação ocorreu a 25°C para P. expansum, 30°C para B. fulva e 43°C para A. acidoterrestris durante um período de 4-5 dias. A partir da amostra sem tratamento, foi calculado o número de reduções decimais (RD) segundo a equação 3.1. Cada condição foi testada em triplicata e um teste adicional foi executado para testar uma possível ação do neutralizante na destruição dos esporos. Para tanto, as frutas foram lavadas com 100 mL de água estéril e, após massageamento por 1 min, a amostra de 4 mL recebeu a adição de 1,3 mL de tiossulfato de sódio 0,6%. Após o contato, as amostras foram ativadas (exceto esporos de P. expansum), diluídas, plaqueadas e incubadas conforme descrito anteriormente.

=

NNoRD log (Equação 3.1)

Onde, No é a concentração inicial dos esporos, expressa em (esporos/mL), e N é a concentração de esporos recuperada após cada tratamento (esporos/mL).

64

Figura 3.1 - Sequência de análise: (a) secagem da fruta lavada, (b) inoculação da suspensão do micro-organismo, (c) aplicação a da solução sanitizante e (d) massageamento. 3.2.6 Teste em soluções aquosas Os testes em soluções aquosas foram baseados na metodologia adaptada de Orr e Beuchat (2000). Inicialmente, 0,1 mL da suspensão de esporos foi adicionado aos tubos contendo 5 mL das soluções sanitizantes em diferentes concentrações. Para esporos de P. expansum foram testadas concentrações de 0, 25, 50, 75 e 100 ppm de cloro, nos tempos de contato de 1, 2, 3, 4, 5 e 6 minutos e 0, 250 e 500 ppm de ácido peracético por 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 e 120 minutos. Os esporos de B. fulva foram testados em contato com concentrações de 0, 250, 400, 500, 600, 700 e 800 ppm de cloro nos tempos de 15, 30, 45, 60 e 75 minutos e 0, 500, 800, 1000, 1200, 1500 e 1800 ppm de ácido peracético por 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos. Esporos de A. acidoterrestris foram testados em contato com concentrações de 0, 250, 350, 400 e 500 ppm de cloro nos tempos de contato de 15, 30 45, 60 e 75 minutos e 0, 250, 500, 650, 750, 850 e 1000 ppm de ácido peracético por 15, 30, 45, 60 e 75 minutos. Neste teste, somente foram

b

c d

a

65

usadas soluções sanitizantes estabilizadas a 25ºC. Após contato, foi adicionado 1,6 mL de tiossulfato de sódio 0,6 % deixando-se agir por 2 minutos com o objetivo de neutralizar a ação dos sanitizantes. Após a neutralização, as amostras contendo esporos de B. fulva e A. acidoterrestris receberam um choque térmico de 80oC/10 min. Seguidamente, cada amostra foi resfriada, diluída, plaqueada e incubada conforme descrito já descrito. Cada condição foi testada individualmente em triplicata. A partir da contagem das colônias (esporos/mL), realizou-se o cálculo do número de reduções decimais de acordo com a equação 3.1. Um ensaio adicional (triplicata) foi realizado para testar uma possível ação do neutralizante (tiossulfato de sódio 0,6%) sobre os esporos, adicionando-se 1,6 mL deste reagente a 5 mL de água e 0,1 mL da suspensão de esporos de micro-organismo. Após o contato de 2 min, as amostras foram ativadas (exceto esporos de P. expansum), diluídas, plaqueadas e incubadas conforme descrito anteriormente. 3.2.7 Análise estatística dos dados Utilizando o programa MINITAB® 14 (Minitab Inc., State College, PA, Estados Unidos) os dados foram avaliados estatisticamente pela análise de variância (ANOVA) sendo que os resultados foram interpretados de acordo com o Teste de Tukey, onde as diferenças a α=0,05 foram consideradas significativas. 3.3 Metodologia utilizada no artigo 3: Efficacy of sanitizing

treatments against Penicillium expansum inoculated on six varieties of apples

3.3.1 Preparação da suspensão de esporos de Pencillium expansum CCT4680 A suspensão foi preparada de acordo com o descrito na seção 3.2.1. 3.3.2 Frutas Foram testadas as seguintes variedades: Red Delicious, Golden Supreme, Empire, McIntosh, Fuji e Gala. Todas foram obtidas de

66

pomares pertencentes à Estação Experimental de Agricultura de Nova York, Universidade de Cornell, Geneva, NY, Estados Unidos. Após a colheita estas foram estocadas a 2ºC até uso.

a b c

d e f

a b c

d e f

Figura 3.2 - Variedades de maçãs: (a) Red Delicious, (b) Golden Supreme, (c)

Empire, (d) McIntosh, (e) Fuji e (f) Gala. 3.3.3 Inoculação na superfície das maçãs Inicialmente as maçãs foram lavadas e esfregadas com água corrente. Cada maçã foi então individualmente lavada com água deionizada estéril e seca em gase estéril, dentro da câmara de fluxo laminar. Ao redor do pedúnculo desenhou-se uma circunferência dentro da qual foi depositado 0,1 mL (105 esporos/mL) da suspensão de esporos de P. expansum. As maçãs inoculadas foram colocadas dentro de uma câmara de fluxo laminar por 2 h para a fixação da suspensão. 3.3.4 Preparo das soluções sanitizantes Foram preparadas soluções cloradas utilizando hipoclorito de sódio (Ultra Bleach®) nas concentrações de 50, 100 e 200 ppm de cloro livre. Depois da preparação, o pH das soluções atingiu 8,8, 9,3 e 9,7 para as três respectivas concentrações. Soluções cloradas, nas mesmas concentrações foram acidificadas até pH 6,5 utilizando ácido fosfórico

67

0,25 N. Amostras controle foram preparadas utilizando água não acidificada e acidificada a pH 6,5, usando o mesmo ácido. Soluções à base de ácido peracético foram também testadas, sendo estas elaboradas a partir do produto (Vortexx®, Ecolab) nas concentrações de 50 e 80 ppm. A concentração de cada solução foi confirmada utilizando fitas medidoras específicas para a medição de cloro livre e ácido peracético. Todas as soluções foram utilizadas imediatamente após o preparo e mantidas nas temperaturas de 25°C. 3.3.5 Tratamento das maçãs Cada variedade de maçã foi colocada, com a pedúnculo voltada para baixo, dentro de um becker de 500 mL contendo 100 mL das soluções sanitizantes ou água. Cada becker foi agitado manualmente por 30 s. Posteriormente, cada maçã foi imediatamente rinsada com 100 mL de água deionizada para sessar a reação. A seção inoculada da maçã foi removida assepticamente e a concentração de esporos restante nesta foi extraída em água peptonada 0,1% em volume 10 vezes superior ao peso da fruta cortada (diluição 1:10). Essa mistura foi agitada e, em seguida, diluída serialmente em água peptonada 0,1% e plaqueada por profundidade (duplicata) em PDA (Criterion) acidificado até pH 3,5. A incubação ocorreu por 4-5 dias a 25ºC. O teste foi realizado em triplicata. 3.3.6 Análises estatísticas Os tratamentos foram analisados usando ANOVA e o teste Student-Newman-Keuls. As diferenças significativas (P ≤ 0,05).

68

3.4 Metodologia utilizada nos artigo 4: Modeling Penicillium expansum resistance to thermal and chlorine treatments

3.4.1 Preparação da suspensão dos esporos de P. expansum CCT 4680 Foi realizada como descrito na seção 3.2.1. 3.4.2 Preparo das soluções sanitizantes à base cloro As soluções cloradas foram preparadas como descrito no item 3.2.4, sendo os testes realizados à temperatura de 25ºC. 3.4.3 Teste em soluções aquosas Os testes foram realizados como descrito no item 3.2.6 para P. expansum, nas concentrações de 0, 25, 50 e 75 ppm de cloro. 3.4.4 Resistência térmica A resistência térmica foi determinada em tubos capilares com dimensões de 1,5 x 1,8 x 90 mm. O meio de aquecimento foi preparado pela diluição de 1 mL da suspensão de esporos em 9 mL de suco de maçã pasteurizado a 121ºC/5 min (pH 3,25; 12,2°Brix; acidez 0,45%). Uma seringa equipada com um dispenser do tipo “Hamilton” foi usado para injetar 0,04 mL do suco inoculado nos tubos capilares (FUJIKAWA, et al., 2000; SPLITTSTOESSER; CHUREY, 1989). Depois da selagem, 5 tubos foram aquecidos a 50, 52, 54, 56 e 60°C em banho termostatizado (Haake® C1, ± 0,1ºC de precisão). Os tubos foram removidos em vários intervalos sendo imediatamente resfriados em banho de gelo e colocados em contato com álcool 95%, para reduzir o nível de contaminação nos tubos capilares. O residual de álcool foi então seco em papel filtro e os tubos, referentes ao mesmo tempo de contato, foram transferidos para uma garrafa de diluição contendo água peptonada 0,1% estéril suficiente para render um total de 20 mL de solução. Os tubos capilares dentro das garrafas foram quebrados usando um bastão gerando uma diluição inicial de 102 UFC/mL. Após as

69

subsequentes diluições, ocorreu um plaqueamento em PDA (Criterion®), acidificado a pH 3,5, contendo 50 mg/mL de rosa de bengala para inibir o espalhamento das colônias. A enumeração das colônias ocorreu durante um período de 4-5 dias a 25ºC. Cada experimento foi individualmente analisado em duplicata. 3.4.5 Modelagem da inativação de P. expansum O software GInaFiT®, version 1.4.2 (GEERAERD et al., 2005) foi usado para estimar os parâmetros de inativação. Para modelar a inativação térmica de P. expansum CCT 4680 em suco de maçã, foi comparada a habilidade dos modelos de Bigelow (equação 3.2) e Weibull (equação 3.4) (MAFART et al., 2002). Para descrever a inativação causada pelos tratamentos com sanitizante clorado, foi comparada a habilidade do modelo Bifásico (equação 3.3), descrito por Cerf (1970) e do modelo de Weibull. Os modelos foram comparados utilizando os índices estatítisticos apresentados no item 3.4.6. Os modelos de inativação foram:

Dt

NoNLog −=

(Equação 3.2)

( )tkftkfLog

NoNLog ×−×−+×−×=

2maxexp()1()1maxexp( (Equação 3.3)

pt

NoNLog )(

δ−=

(Equação 3.4)

Onde No é a concentração da população inicial de células (UFC/mL); N é a concentração de sobreviventes depois de exposto a um tempo t (UFC/mL); D é o tempo (min) para reduzir em 1 ciclo logarítmico a concentração celular. No modelo Bifásico, a fração f é considerada a sub-população sensível ao tratamento e (1-f) é a outra fração da população que é considerada resistente ao tratamento. As taxas específicas de inativação das duas populações são kmax1 (min-1) e kmax2 (min-1), respectivamente.

70

Na equação de Weibull, o fator p é o parâmetro de forma, sendo que distribuição de Weibull corresponde a uma curva com concavidade voltada para cima se p < 1 e concavidade voltada para baixo se p >1 e linear se p =1. O parâmetro δ é o fator de escala e pode ser definido como o “tempo para uma redução decimal”, se p = 1 (PELEG; COLE, 1998). Os modelos secundários foram estabelecidos de acordo com o modelo primário selecionados. 3.4.6 Comparação estatística dos modelos

A comparação dos modelos matemáticos foi realizada através dos seguintes índices estatísticos: erro médio quadrático (MSE), fator bias e fator de exatidão. O cálculo do MSE foi realizado através da equação 3.5.

( )n

ValorValorn

RSS MSE2

preditoobservado∑ −== (Equação 3.5)

onde: RSS é a soma dos quadrados residuais e n é o número de graus de liberdade (número de pontos experimentais - número de parâmetros do modelo).

Quanto menor o valor de MSE melhor é o ajuste do modelo aos dados experimentais.

O fator bias representa a diferença média entre os valores observados e preditos. Pode ser calculado através da equação 3.6.

( )

∑

= nValor/Valorlog preditoobservado

10biasfator (Equação 3.6)

O fator bias é um desvio relativo médio. Se bias é igual 1, a resposta observada é igual à resposta predita. No entanto, quando bias é maior que 1, significa que o valor predito é maior que o observado. Quando bias é menor que 1, significa que o valor predito é menor que o observado.

O fator de exatidão (equação 3.7) é uma medida da diferença média absoluta entre os valores preditos e observados.

( )

∑

=n

Valor/Valorlog preditoobservado

10 exatidãofator (Equação 3.7)

71

Quanto maior o valor do fator de exatidão, menor será a exatidão da estimativa da média. 3.5 Metodologia utilizada nos artigo 5: Influence of storage

temperature and apple variety on patulin production by Penicillium expansum

3.5.1 Preparação da cultura de Pencillium expansum CCT4680

A suspensão foi preparada de acordo com o descrito na seção

3.2.1. 3.5.2 Frutas

Foram testadas 6 variedades de maçã: Red Delicious, Golden

Supreme, Empire, McIntosh, Fuji e Gala. Todas foram obtidas de pomares pertencentes à Estação Experimental de Agricultura de Nova York, Universidade de Cornell, Geneva, NY, Estados Unidos e estocadas a 2ºC até uso. 3.5.3 Inoculação da suspensão nas frutas O teste foi realizado com 15 amostras de maçã de cada variedade. Antes de cada experimento, as maçãs foram mantidas à temperatura ambiente. Cada maçã foi lavada e esfregada sob água corrente. Posteriormente, estas foram novamente lavadas com água deionizada estéril e secas em gase estéril dentro de uma câmara de fluxo laminar. As maçãs foram inoculadas, submergindo-as por 10 min dentro de 4 litros de suspensão de P. expansum CCT 4680 contendo 103 esporos/mL. A suspensão foi mantida à temperatura de 4ºC para auxiliar na internalização dos esporos através do cálix e do pedúnculo. A temperatura diferencial entre a maçã e a suspensão de esporos é necessária para produzir uma pressão diferencial que promove a internalização do micro-organismo (BARTZ, 2005; FDA, 1998). O excesso de líquido foi drenado e as maçãs foram então estocadas em duas diferentes temperaturas (11ºC e 20,5ºC). Adicionalmente, 15 maçãs

72

não inoculadas de cada uma das variedades foram mantidas nas mesmas temperaturas para servir de controle. 3.5.4 Extração do suco das maçãs Periodicamente, foram retiradas amostras das maçãs inoculadas e o suco foi extraído para a análise de patulina. Cada fruta testada foi triturada manualmente ou com auxílio de um liquidificador até formar um purê que foi espremido através de quatro camadas de gaze para a obtenção do suco. Todas as amostras de suco foram congeladas antes das análises (-80ºC). 3.5.5 Análise de Patulina As amostras congeladas foram enviadas para um laboratório externo (Trilogy Analytical Laboratory, Inc. Washington, MO, Estados Unidos) para análise de patulina no mesmo dia da extração ou no dia seguinte. Foi utilizada para metodologia oficial adotada pela AOAC para suco de maçã (método 995.10) (FDA, 2001b, BRAUSE et al., 1996). O resultado foi expresso em µg/L ou partes por bilhão (ppb). 3.5.6 Fermentação do suco de maçã Foi realizada uma fermentação do suco de maçã para verificar sua ação em reduzir a patulina presente. Para tanto, utilizou-se uma levedura seca comercial Saccharomyces cerevisiae (Lallemand®, Australia) para fermentar o suco feito a partir de uma maçã da variedade McIntosh. O suco foi preparado de acordo com a metodologia descrita anteriormente (3.5.4) e, uma amostra deste foi enviada para o laboratório externo para as análises de patulina de forma a deternimar a concentração inicial da toxina no suco. Posteriormente, 60 mL deste suco (16,2ºBrix; pH 4,1) foi divido em duas amostras de 30 mL que foram então individualmente adicionadas de 0,5 g de levedura em pó para iniciar o processo de fermentação. As amostras foram deixadas à temperatura ambiente (23 a 25ºC), sendo agitadas duas vezes por dia. A fermentação foi considerada completa (7 dias depois da inoculação) quando acabou a evolução de gás e o teor de sólidos solúveis atingiu 3,4 a 4,0ºBrix.

73

3.6 Metodologia utilizada nos artigo 6: Development of a sampling plan at apple receiving step for patulin control in concentrated apple juice

3.6.1 Estudo da seleção dos lotes (Etapa de recebimento das frutas) Este estudo foi realizado dentro de uma indústria processadora de suco de maçã concentrado localizada na região sul do Brasil. Vinte e três lotes de maçã foram analisados em relação aos níveis de patulina apresentados. Adicionalmente, foi desenvolvido um plano de amostragem baseado na relação entre o número de maçãs apodrecidas e sadias. Esse plano serve para selecionar lotes de maçã na etapa de recebimento de forma que o produto final fique dentro nível máximo de patulina permitido pelas agências regulatórias internacionais que é de 50 ppb (CODEX 2003a, FDA, 2001). As maçãs da variedade Fuji e/ou Gala vieram tanto do campo (durante o período da safra – março a maio) como de um packing house no período da entressafra (de julho até outubro). O tamanho dos lotes foi baseado no volume (peso) das frutas que são recebidas em caminhões (15.000 kg até 27.000 kg de maçã). Considerando que o peso médio de uma maçã seja de 0,130 kg, o tamanho dos lotes (em número de maçãs) foi estabelecido para ser aproximadamente 100.000 até 200.000 maçãs. Cada lote foi analisado (inspeção por atributos) e classificado como aceitável ou não aceitável com base no número de maçãs não conformes. As maçãs não-conformes foram definidas como aquelas com lesão ≥ 4 cm. Inicialmente, o plano de amostragem foi baseado em uma referência normativa (NBR 5426 e MIL STD 105D) (COSTA et al., 2005). O nível de qualidade aceitável (NQA) escolhido foi de 15%, considerando as informações da indústria. Levando-se em conta o número de maçãs recebidos em cada lote (caminhão), uma amostra representativa deveria ser de 50 maçãs. A partir desta amostra, um lote aceitável deveria conter até no máximo 11 maçãs podres. A elaboração do suco feito a partir das amostras e a análise de patulina estão descritos nos itens 3.6.5. e 3.6.6, respectivamente. 3.6.2 Estudo dos lotes hipotéticos (Etapa de recebimento das frutas) Algumas frutas foram intensionalmente reunidas para formar uma amostra (50 maçãs) de forma a determinar os níveis de patulina em

74

diferentes combinações de maçãs podres/sadias. As combinações são explicadas abaixo:

(i) Considerando o tamanho da lesão ≥ 4 cm, os níveis de patulina foram testados em amostras de 50 maçãs com as seguintes combinações de podre/sadia: 5/45; 8/42 (duplicata), 11/39 (duplicada); 13/37 (duplicata) e 16/34. As amostras foram tratadas como descrito no item 3.6.5.

(ii) Considerando o tamanho da lesão < 4 cm, os níveis de patulina foram testados em amostras de 50 maçãs com as seguintes combinações de podre/sadia: 8/42 (duplicata); 11/39 (duplicada); 13/37 (duplicata) e 16/34. As amostras foram tratadas como descrito no item 3.6.5.

(iii) As frutas foram também combinadas para compor uma amostra cujas maçãs podres contivessem alto nível de contaminação por P. expansum: 11/39 (duplicada); 18/32 e 32/0. As amostras foram tratadas como descrito no item 3.6.5.

(iv) Três amostras (50 maçãs em cada amostra) contendo somente frutas sadias sem nenhum visível desenvolvimento de fungo foram montadas e preparadas como descrito no item 3.6.5.

3.6.3 Estudo de lavagem e sanitização (Etapa de lavagem das frutas)

(i) O primeiro estudo foi desenvolvido na etapa de lavagem durante o processamento de suco concentrado de maçã, de forma a verificar a eficácia da água sob alta pressão em remover a toxina da fruta. A partir de cada lote recebido, uma amostra de 50 maçãs foi retirada antes e depois da lavagem. As amostras foram tratadas como descrito no item 3.6.5.

(ii) Quatro amostras de 250 mL da água usada durante a etapa de lavagem foram coletadas do reservatório de recirculação de água. Estas amostras foram congeladas a -18ºC e enviadas para análise de patulina.

Adicionalmente, foi realizado um estudo da eficácia de agentes sanitizantes em reduzir níveis de patulina. As soluções foram preparadas a partir de dicloroisocianurato de sódio (Sumaveg®, Jonshon Diversey) e ácido peracético (Tsunami 100®, ECOLAB). Estes testes são descrito a seguir:

(iii) Esta investigação avaliou a eficácia dos sanitizantes em reduzir níveis patulina de soluções aquosas. Um mililitro de patulina (solução estoque B – item 3.6.7) foi adicionado a um

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balão volumétrico de 100 mL e o volume restante foi completado com soluções de cloro (0, 25, 50, 100 and 200 ppm) e ácido peracético (0, 80 and 100 ppm). Imediatamente, cada amostra (duplicata) foi congelada à temperatura de - 18ºC e enviada para análise.

(iv) Esta investigação avaliou a eficácia dos sanitizantes em reduzir patulina de superfície de maçãs. Amostras de maçã Fuji (compradas em um mercado local) foram submetidas aos seguintes procedimentos: Primeiro, as frutas foram lavadas em água corrente e depois novamente lavadas com água destilada estéril e secas em gaze. Cada maçã foi colocada com dentro de uma câmara de fluxo laminar e 100 µL da solução estoque (solução estoque A – seção 3.6.7.) foi depositada ao redor da pedúnculo. As maçãs artificialmente contaminadas foram deixadas por 1 h dentro da câmara para permitir a fixação da solução de patulina. Cada maçã individualmente (duplicata) foi acondicionada em um saco e 100 mL de soluções cloradas (0, 50, 100 e 200 ppm) foram adicionadas. As frutas foram então massageadas por 30 s e 2 min manualmente e, após o tempo de contato, o líquido dos sacos foi transferido para um recipiente já contendo 5 mL de tiossulfato 0,6% com o objetivo de impedir que o sanitizante continuasse agindo. As soluções resultantes foram imediatamente congeladas (-18ºC) e enviadas para um laboratório externo para análises.

3.6.4 Análise do suco de maçã após prensagem (Etapa da prensagem) Paralelamente, um estudo foi conduzido para investigar os níveis de patulina presentes no suco após a prensagem, de forma a avaliar quanto de patulina, vinda das frutas, pode permanecer no suco prensado. A etapa de prensagem ocorre logo após a moagem das frutas. Durante este processo contínuo de moagem, quatro amostras do suco resultante foram retidas. É importante salientar, que depois da prensagem o suco é conduzido para etapas subsequentes, porém estas não foram amostradas neste trabalho. Cada amostra foi tratada de acordo com o descrito no item 3.6.5.

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3.6.5 Preparação das amostras para as analises de patulina As amostras de maçã foram trituradas em uma centrífuga caseira e o produto resultante foi tratado enzimaticamente (Pectinex®, YieldMASH, Novozymes) para a extração do suco. O processo ocorreu sob aquecimento atingindo a temperatura de 80ºC com o objetivo de descontaminar o suco e evitar futuras fermentações com consequente degradação de patulina. Subsequentemente, cada amostra foi filtrada em um filtro de papel (Fig. 3.3) sendo o suco resultante imediatamente congelado a -18ºC e enviado para análises de patulina no laboratório (The National Food Laboratory, Dublin, CA, Estados Unidos). As amostras dos testes de lavagem e sanitização foram também congeladas a temperatura de - 18ºC e enviadas para análises de patulina tanto no laboratório citado anteriormente, quanto no Laboratório de Análises – LABCAL, UFSC, Brasil. 3.6.6 Análises de patulina Foi utilizada para metodologia oficial adotada pela AOAC para suco de maçã (método 995.10) (FDA, 2001b, BRAUSE et al., 1996). O resultado foi expresso em µg/L ou partes por bilhão (ppb), sendo o nível de detecção de 10 ppb. 3.6.7 Preparação das soluções estoque de patulina A patulina foi adquirida da empresa Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo, Estados Unidos). Uma solução estoque foi preparada dissolvendo 3 mg de patulina pura (cristalina) em 10 mL de água destilada (solução estoque A). Outra solução estoque B foi preparada dissolvendo 10 vezes a solução estoque A. Todas as soluções ficaram mantidas congeladas a -18ºC.

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Figura 3.3 - Preparação das amostras para as análises de patulina. Procedimento descrito no item 3.6.5. (a; b) suco sendo submetido ao tratamento enzimático; (c; d) filtragem do suco

c

a b

d

b d

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CAPÍTULO 4 RESULTADOS Os resultados serão apresentados na forma de artigos como descrito a seguir: 4.1 Artigo 1: Submetido à revista International Journal of Food

Microbiology. Survey of molds and Alicyclobacillus from a concentrated apple juice productive process in Brazil.

4.2 Artigo 2: Submetido à revista Ciência e Tecnologia de Alimentos. Aplicação de dicloroisocianurato de sódio e ácido peracético para redução de esporos de Penicillium expansum, Byssochlamys fulva e Alicyclobacillus acidoterrestris na superfície de maçãs e em soluções aquosas.

4.3 Artigo 3: Publicado na revista Journal of Food Protection, v. 71, n. 3, p. 643-647, 2008.

Efficacy of sanitizing treatments against Penicillium expansum inoculated on six varieties of apples

4.4 Artigo 4: Aceito para publicação na revista Journal of Food Protection, In Press.

Modeling Penicillium expansum resistance to thermal and chlorine treatments

4.5 Artigo 5: Publicado na revista Journal of Food Protection, v. 72, n. 5, p. 1030-1036, 2009.

Influence of storage temperature and apple variety on patulin production by Penicillium expansum

4.6 Artigo 6: Submetido à revista Food Control Development of a sampling plan at apple step for

patulin control in concentrated apple juice

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4.1 Survey of molds and Alicyclobacillus from a concentrated apple juice productive process in Brazil

Apresentação:

Este trabalho inicial teve o objetivo de realizar o levantamento da microbiota do processo produtivo de suco de maçã concentrado de forma a conhecer seus micro-organismos prevalentes e mais relevantes.

Survey of molds and Alicyclobacillus from a concentrated apple juice productive process in Brazil

Beatriz de Cássia Martins SALOMÃO, Chalana MÜLLER, Gláucia

Maria Falcão de ARAGÃO* Department of Chemistry Engineering and Food Engineering, Federal University of Santa Catarina – UFSC, 88040-900, Florianópolis - SC, Brazil *Phone: (48) 37219448 r.245 Fax: (48) 48 37219687 glaucia@enq.ufsc.br

ABSTRACT

Bacteria and molds may spoil and/or contaminate apple juice either by direct microbial action or indirectly by the uptake of metabolites as off-flavours and toxins. Some of these microorganisms and/or metabolites may remain in the food even after extensive procedures. This study seeks to identify the presence of molds (including heat resistant species) and Alicyclobacillus spp., during concentrated apple juice processing. Molds were isolated at different steps and then identified by their macroscopic and microscopic characteristics after cultivation on CYA, MEA and G25N media at 5, 25 and 37°C, during 7 days. ATSB were identified as A. acidoterrestris by a further investigation based on 16S rRNA sequence similarity. Among the 19 genus found, 63% were identified as Penicillium with 50% belonging to the P. expansum specie. With regards to heat resistant molds, the species Neosartorya fischeri, Byssochlamys fulva and also the genus Eupenicillium sp., Talaromyces sp. and Eurotium sp. were isolated. The large contamination found indicates the need for methods to eliminate or prevent the presence of these microorganisms in the processing plants in order to avoid both spoilage of apple juice and toxin production. Keywords: Concentrated apple juice. Alicyclobacillus acidoterrestris. Heat resistant mold. Penicillium expansum.

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1 Introduction

Apple juice belongs to the most frequently consumed types of fruit juices worldwide (ZIERLER et al., 2004). The necessity to implement and optimize fast and efficient methods for quality control appears as a consequence of this use (SILVA et al., 2007), and should be done throughout the whole processing procedure, beginning in the orchard (KUPFERMAN, 1986). Some species of fungi may cause serious postharvest diseases in apples (KUPFERMAN, 1986). Among them, Penicillium expansum is reported as being responsible for major decay on apples. Studies show that its inoculum is found in soil, on plant surfaces, in dump tank or flume water (SPOTTS et al., 1988; SPOTTS; CERVANTES, 1993), in contaminated wooden bins (SANDERSON; SPOTTS, 1995) and in the atmosphere (AMIRI; BOMPEIX, 2005). Furthermore, this mold has the ability to produce patulin (DOORES, 1983), a mycotoxin reported to cause oxidative damage to the DNA in human cells, which plays a role in mutagenesis and cancer initiation (LIU et al., 2003).

Heat resistant molds (HRM) are among the microorganisms of great importance in the spoilage of heat-processed fruit juices, such as apple juice. Representative species are found in the genera Byssochlamys, Neosartorya, Eupenicillium, Talaromyces, (PITT; HOCKING, 1999; TOURNAS, 1994, SURESH et al, 1996), Eurotium (SPLITTSTOESSER et al., 1989, YILDIZ; COKSÖYLER, 2002) and Paecilomyces (PIECKOVÁ; SAMSON, 2000; PEÑA et al., 2004). Some of the heat resistant molds can cause both spoilage of fruit products and produce toxic and sometimes carcinogenic compounds (UGWUANYI; OBETA, 1999, TOURNAS, 1994). Alicyclobacillus acidoterrestris is a thermoacidophilic spore-forming bacterium (ATSB) which is able to spoil acidic juices (YAMAZAKI et al., 1996; CHEN et al., 2006; EGUCHI, et al., 1999; GROENEWALD et al., 2009; BAHÇECI; ACAR, 2007). Spoilage by Alicyclobacillus has become a problem for the apple juice industry and effective solutions for its control can be found to control its development. The spoilage generally is manifested as an off-flavour and an off-odour of a medicinal or chemical nature due to the formation of guaiacol and halophenols (CHANG; KANG, 2004; CHEN et al., 2006; YAMAZAKI et al., 1996), leading to consumer rejections (ZIERLER et al, 2004).

Apples rejected by the rigid selection criteria for the fresh fruit consumption market are used for juice processing and those

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microorganisms mentioned above may be present leading to a health risk for consumers and/or high economic losses due to juice deterioration. This study aims to survey molds (including heat resistant ones) and Alicyclobacillus in a concentrated apple juice manufacturing process.

2 Materials and methods 2.1 Sampling

Samples were obtained at different stages from a concentrated

apple juice processing plant in Brazil in 2005. The samples (collected in the off-season period) were taken at the following steps: apples in the reception (A); washed apples (WA); wash water (W) (recycled in a close system); must (M); bagasse (B); before pre-concentration (BPC); after pre-concentration (APC); enzymatic treatment (ET); before ultra-filtration (BUF); after ultra-filtration (AUF); before concentration (BC); after concentration (AC) and final product (FP). All samples were collected (approximately 250 mL per step) on the same day, then stored under refrigeration in sterile sampling containers and analyzed within 24 h. Samples of apples were collected randomly to represent the real state of the fruits. During the analysis, pieces of different apples were mixed to maintain the randomness of the tests. A diverse range of samples were tested in order to provide comprehensive data on the occurrence of molds and yeasts, heat resistant molds (HRM) and Alicyclobacillus at different stages of processing. A duplicate trial from the final product (FP) was analyzed in regards to heat resistant molds in another sampling made during harvest-season. In addition, a sample of a stored rotten apples (SA) with a visible blue mold damage was taken from the packing house (at the off-season) in order to identify the mold specie. Figure 1 presents the flow diagram of the production process indicating the sample codes and their localization.

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Figure 1. Concentrated apple juice flow diagram with samples codes.

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2.2 Molds and Yeasts isolation Molds and yeasts were detected by diluting 25 g of apples and

bagasse samples in 225 mL of 0.1% peptonated water, followed by a two minute homogenization in a stomacher (ITR, Model 1204). Juice and liquid samples were just diluted in water (10 mL of the sample in 90 mL of the diluent). Subsequently, serial dilutions were made and then samples were plated in duplicate, using Potato Dextrose Agar (PDA, Biolife®, Milan, Italy) acidified to pH 3.5 with 10% tartaric acid solution. All plates were then incubated at 25ºC and colonies were counted after 3-5 days. The results were expressed as CFU ml-1or CFU g-1, depending on the kind of sample (SILVA et al., 1997).

2.3 Heat resistant molds isolation Apples (previously mixed in a blender) and samples of bagasse were homogenized (100 g of the samples plus 100 mL of sterile distillated water) in a stomacher for 4 min. Two 50 mL portions of homogenized samples were then transferred to sterile test tubes and heat shocked in a water bath (Tecnal®, Model 184, +/- 0.1°C) at 80°C for 30 min. Concurrently, 50 mL samples of concentrated apple juice (70°Brix) were diluted with 50 mL of sterile distillated water and then also heated shocked. Liquids samples (35°Brix or less) were analyzed without any previous dilution and two 50 mL aliquots of each sample were subjected to the same heat treatment previously described. After heating, duplicate samples of 50 mL were cooled and combined with 100 mL of acidified (pH 3.5) PDA (double agar concentration) supplemented with 50 mg/L of rose bengal and 4 mg/L of cloranfenicol. Subsequently, samples were distributed in eight Petri dishes which were loosely sealed in a plastic bag to prevent drying and incubated at 30°C for up to 30 days. Most viable ascospores germinated and formed visible colonies within 7 to 10 days (BEUCHAT; PITT, 2001). 2.4 Alicyclobacillus isolation The methodology of isolation was based on Eguchi et al. (1999) which suggested one method for counting and another one for detecting Alicyclobacillus spp. (ATSB).

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In order to count ATSB, samples of concentrate juice were diluted prior to analysis (10 mL of juice in 90 mL of sterile distilled water). The other liquid samples (10 mL) were diluted in 90 mL of BAT (Bacillus alicycloterrestris broth). Samples of apples and bagasse (25 g) were blended with 225 mL of distillated water in a stomacher for 2 min and 10 mL of these samples were then diluted in 90 mL of BAT broth. The diluted samples were heated shocked at 80°C for 10 min, and aliquots were plated on BAT agar by the pour plate technique. All plates were incubated at 50°C for 4 days (plates were monitored for up to 10 days) for enumeration if the colonies grew on the plates. Concurrently, a technique for detecting was also performed with the same samples. In the detection method, the samples were prepared and heated shocked at 80ºC for 10 min as described above and were subsequently incubated at 50°C for 24 h to enrich the cultures. An aliquot of 1 mL of the enrichment culture was directly pour plated with BAT and incubated at 50°C for 4 days (plates were monitored for up to 10 days). This result was express as the absence or presence of Alicyclobacillus (ATSB). 2.5 Mold identification

The mold identification was made by macroscopic and

microscopic observations using identification keys as described by Pitt and Hocking (1999). Each strain isolated on PDA was transferred to MEA (Malt Extract Agar) and CYA (Czapek Yeast Extract Agar) and G25N (25% Glycerol Nitrate Agar) media in duplicate trials. Cultures were grown on these three standard media at 25ºC for 7 days. Those inoculated on CYA was additionally incubated at 5 ºC and 37ºC for the same period. Furthermore, Czapek agar with 20% sucrose (CY20S) was prepared to help in the identification of genera suspected to be xerophilic. After incubation, the diameters of macroscopic colonies from the underside were measured and macroscopic characteristics such as color, texture and exudates, were analyzed for each colony. Microscopic structures were investigated with a microscopic (Bioval®) by using 0.1% lactofuchsin stain or lactophenol fungal stain (Cotton blue). Yeasts were not identified in this study; only molds were identified (heat resistant or not).

In addition, this investigation identified the fungus present in a storage apple (SA) with visual signs of blue mold invasion. For this, a colony of mold from an apple were scraped and transferred to PDA and

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incubated for 5 days at 25ºC. After the isolation, the strain was sent to André Tosello Foundation (Campinas, SP, Brazil) for further identification and to be deposited at the Collection of Tropical Cultures (CCT).

2.6 Alicyclobacillus morphological characterization and identification Single colonies present at the surface of BAT agar were picked

off and streaked onto the same medium used for isolation. Plates were incubated at 50ºC for 48 to 72 h and then, the overall microscopic morphology and the presence or characteristics of spores were investigated. Strains with characteristic morphology were inoculated onto Nutrient agar (Biolife®, Milan, Italy) at pH 7 and incubated at 50°C to confirm the acidophilic nature of the isolates and discard the presence of acid tolerant bacilli.

The isolated Alicyclobacillus strains were sent to André Tosello

Foundation (Campinas, Brazil) for further identification on basis of standard biochemical and morphological tests and also based on 16S rRNA sequence similarity. Also, the isolated strains were deposited at the Collection of Tropical Cultures (CCT).

3 Results The occurrence of molds and yeast from the tested samples is summarized on Table 1. In order to express the results, each strain was encoded according to the initial letters of the sample which was isolated and preceded by a number that represents the sequence of isolation. A total of 13 strains of molds were isolated of which 12 were identified as belonging to the genus Penicillium: 1 strain from sample SA (1SA), 1 strain from sample A (1A), 2 strains from sample W (1W; 2W), 2 strains from sample WA (1WA; 2WA), 3 strains from sample B (1B; 2B; 3B), 1 strain M (1M) and 2 strains BPC (1BPC; 2BPC). From this total, the species was encoded as SA, 1A, 1W, 1WA, 1B and 2BPC was identified as Penicillium expansum. The strain SA was deposited in the Tropical Collection Cultures and re-encoded as Penicillium expansum CCT 7549. The strain isolated from sample AC

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was identified as Talaromyces sp. (1AC). Only yeasts (not identified in this study) were verified in the samples from ET, BUF, AUF and BC. Table 1. Average number of molds and yeasts from different stages of a concentrated apple juice process

Sample (code) Average number of molds and yeasts

Apples at the reception (A) 1.3 x105 CFU/g Wash water (W) 6.6 x 105 CFU/mL Washed apples (WA) 1.3 x 107 CFU/g Bagasse (B) 4.5 x 105 CFU/g Must (M) 9.3 x 104 CFU/mL Before pre-concentration (BPC) 7.0 x 105 CFU/mL After pre-concentration (APC) < 10 CFU/mL Enzymatic treatment (ET); 1.5 x 102 CFU/mL Before ultra-filtration (BUF) 3.0 x 102 CFU/mL After ultra-filtration (AUF) 2 CFU/mL Before concentration (BC) 5 CFU/mL Concentrate apple juice (AC) 1.7 x 102 CFU/mL Final product (FP) < 10 CFU/mL

The six strains of HRM isolated and identified in this investigation are shown in Table 2. Table 2. Average number of heat resistant molds (HRM) found at different stages of a concentrated apple juice process and the strains identified

Sample (code) Average

number of HRM

HRM identified (code)

Wash water (W) 1 CFU/100mL Eupenicillium cinnamopurpureum (1Wr)

Washed apples (WA) 3 CFU/100g Eurotium sp. (1WAr )

Neosartorya fischeri (2WAr) Eurotium sp. (3WAr)

Before pre-concentration (BPC) 1 CFU/100mL Eupenicillium sp. (1BPCr)

Final Product (FP) 2 CFU/100mL Byssochlamys fulva (1FPr)

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The methodology used to verify the incidence of Alicyclobacillus included two different techniques. One technique involved counting Alicyclobacillus and the other one was used only to detect their presence. The incidence of Alicyclobacillus was only verified in those samples that were subjected to the detection method, so that the result was expressed based only on the presence or absence of Alicyclobacillus (ATSB). The detection of Alicyclobacillus was observed in the two following samples: enzymatic treatment (ET) and before ultra-filtration (BUF). The strains ET and BUF were submitted for analysis based on the 16 S rRNA sequence which indicated (98 and 99%) similarity with the same gene of the A. acidoterrestris. The identified strains ET and BUF were deposited at the Tropical Collection Cultures as A. acidoterrestris CCT 7547 and A. acidoterrestris CCT 7548, respectively.

The macroscopic and microscopic description of molds isolated in this study is shown below. Furthermore, some images of their structures are exhibited in Figure 2. The isolates identified as Penicillium sp. (2W, 2WA, 2B, 3B, 1M and 1BPC) showed macroscopically colonies with different characteristics of color, texture and size, depending on the strain. It was observed that all strains grow on CYA, MEA and G25N at 25ºC but not on CYA at 37ºC and 5ºC. Microscopic observation revealed the presence of different types of penicilli and spherical or ellipsoidal conidia. The P. expansum isolated (1A, 1W, 1WA, 1B and 2BPC) on CYA (25-35 mm diameter) showed colonies centrally colored from dull green to slightly brown, surrounded (annularly) by a thick external layer of white color, clear to pale yellow exudates, tufted surface velutinous to floccose, moderate sporulation and a deep brown underside (caramel). The colors of colonies on MEA (20-35 mm diameter) ranged as seen on CYA to slightly greyer with orange exudates and a pale underside. Colonies on G25N (15-20 mm diameter) were centrally cream colored, surrounded by a thin external layer of white with a dull brown underside. No growth was observed at 5ºC and 37ºC. Microscopically, conidiophores with smooth walls bearing terminal penicilli terverticullate (P. expansum CCT 7549 represented in the Fig. 2 a) and smooth walled ellipsoidal conidia (4 to 5 µm long) were observed. In addition, 14.5-19.0 µm long metula and 10.0 - 14.0 µm long phialides were observed. The strain codified as 1AC showed colonies on CYA of 60-70 mm of diameter, a floccose appearance, uniformly pale olive brown

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color and a pale underside. Colonies on MEA (covering the whole Petri dish) were very similar to those in CYA. Colonies on G25N (15-17 mm of diam) were similar to those on CYA. At 37°C on CYA, colonies covering the whole Petri dish were similar to those at 25°C. No germination was observed at 5°C. Microscopically (Fig. 2 k, l, m, n) the strain developed the characteristic of a HRM showing yellow gymnothecia with closely interwoven hyphae and ascus characteristic of the teleomorph Talaromyces. The conidia (around 5 µm long) were strictly cylindrical to pyriform. Talaromyces is associated with an anamorphic state characteristic of Penicillium, Paecilomyces or Geosmithia. The observation of the anamorph showed phialides alone characteristically swollen at the base and gradually narrowing into a long beak. Based on this, considering the characteristic of the conidiophores borne and conidia shape, the anamorph state was identified as Paecilomyces.

On CYA at 25°C, the strain of Neosartorya fischeri (2WAr) showed colonies (around 70 mm of diam) colored white to pale yellow (centrally) with plane and sparse surface with a floccose texture and pale underside. Similarly on MEA, colonies (75 mm of diam) were white to pale cream showing a plane surface with a floccose texture and pale underside. Colonies on G25N (15 mm diameter) were colored white with a pale underside. At 37°C on CYA, colonies covering the whole Petri dish were white to pale cream, sulcate, floccose and a pale underside. No growth was observed at 5ºC. Microscopic observations showed (Fig. 2 h, i, j) clear cleistothecia, ascus and ornamented ascospores (7.5 µm long) with two longitudinal flanges. The anamporph Aspergillus with the head formed from phialides was alone observed.

Eupenicillium cinnamopurpureum (1Wr) presented colonies on CYA (10-20 mm of diam) of dense texture, sulcate, clear exudate of white color and pale cinnamon underside. Colonies on MEA (12-17 mm of diam) were colored white with a pale underside. Colonies on G25N (12-15 mm of diam) were colored white with a cinnamon-colored central region and a pale cinnamon underside. At 37ºC on CYA, colonies with a diameter of 5-7 mm were colored white. No growth was observed at 5ºC. Microscopic observations showed a strictly monoverticulate penicillin with ampulliform phialides (Fig. 2 c) and ellipsoidal spores. It was not possible to observe cleistothecia, however, Pitt and Hocking (1999) affirmed that some isolates fail to produce cleistothecia at all.

Colonies of Eupenicillium sp. (1BPCr) on CYA (45-50 mm of diam), were colored white, radially sulcate, with a dense texture and

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pale yellow underside. Colonies on MEA (50-55 mm of diam) were similar to CYA. On G25N (5-7 mm of diam) colonies were colored white with a floccose texture and pale yellow underside. At 37°C, white colonies with a diameter of 25-30 mm were radially sulcate with a pale yellow underside. No germination was observed at 5ºC. Microscopic observations showed yellow cleistothecia (Fig. 2 b), however it was difficult to observe ascospores.

The colonies of Eurotium sp. (1WAr) on CYA (17-20 mm of diam) were dense, sulcate with an intense yellow color and an orange underside. Both the colonies and the underside on MEA (5-10 mm of diam) were orange. Colonies on G25N (30-35 mm of diam) were pale yellow in color with a yellow underside. Colonies on CY20S (30-35 mm) were sulcate, with white mycelium at the margins, becoming yellow with an intense orange center and an orange underside. No growth was observed at 5ºC. Microscopically (Fig. 2 d, e, f, g), ascospores were not evident within 7 days, however after 14 days of incubation, ascospores (around 5 µm long) showing smooth walls with two prominent, parallel longitudinal flanges were observed. Furthermore, yellow cleistothecia, ascus and the anamorph Aspergillus producing only phialides was found.

Eurotium sp. (3WAr) showed colonies on CYA (20-22 mm of diameter), sulcate with yellow at the margins, becoming orange brown in the central area with a very intense orange underside. Colonies on MEA (27-30 mm of diam) were sulcate, showing an intense orange color and the same color on the underside side. No growth was observed at 5ºC or 37ºC. Colonies on CY20S showed a diameter of 20 mm after 7 days of incubation reaching 40 mm after 14 days. These colonies showed a texture plane, sulcate with a clear color at the margins becoming intensely orange at the center with the same color on the underside. Microscopic observations showed (after 14 days of incubation) ellipsoidal ascospores without double flanges. The anamorph Aspergillus with the head formed from phialides alone and also cleistothecium enveloped in yellow hyphae was observed.

Byssochlamys fulva (1FP) showed colonies on CYA and MEA covering the whole Petri dish with sparse, low floccose, heavy conidial production and were colored olive brown on MEA and on CYA with white filaments on CYA. The underside color was pale brown. Colonies on G25N (5-8 mm of diam) were olive brown. No growth was observed at 5ºC. Microscopically (Fig. 2 o), there were not any kind of bodies typically present in most of ascomycetes. Furthermore, ellipsoidal ascospores (5 µm long) with smooth walls and also asci (10 µm) were

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observed. Anamorphic reproductive structures of penicillin were observed.

Figure 2. Microscopic structures: (a) P. expansum CCT7549; (b) Eupenicillium sp. 1BPFr (cleistotecium structure); (c) Eupenicillium cinnamopurpureum 1Wr (Penicillium anamorph state); Eurotium sp. 1WAr structures: (d) cleistotecia, (e) ascospores, (f) Aspergillus (anamorph state), (g) asci; Neosartorya fischeri 2WAr structures: (h) cleistotecia, (i) Aspergillus (anamorph state), (j) asci and ascospores; Talaromyces sp. 1AC structures: (k) Paecilomyces (anamorph state), (l) conidia, (m) gymnotheciium, (n) ascus; (o) B. fulva 1FP structures (asci, ascospores and Paecilomyces (anamorph state). All microscopic observations were made in 400 X, except to for pictures of cleistotecium and gymnotecia (b; d; h and m) which were made 40 X.

a b c

h i j

o

k l

m

n

d e f g

91

4 Discussions The survey of mold and yeasts from a concentrated apple juice process showed a high contamination mainly on the steps before heat treatment. The mold Penicillium was the prevalent genera. However, the pre-concentration step was enough to completely destroy Penicillium spores since they were not found in the following stages. LABUDA et al. (2005) investigated the incidence of toxinogenic fungi in fruits and also reported Penicillium as the major contaminant. WELKE (2008) also observed Penicillium (93%) as the predominant fungal genus in apples used for juice, of which P. expansum represented 66% of the isolates. Other researchers observed that P. expansum (30–62%) was the most prevalent species on apples in storage rooms (AMIRI; BOMPEIX, 2005). In this present study, half of the Penicillium strains were identified as P. expansum representing a concern for apple juice processing since it is the typical contaminant of apple brown rot having the ability to grow at low temperatures and to produce patulin on decayed fruits (DOORES, 1983; SALOMÃO, et al., 2009; JACKSON et al., 2003). During the off-season, juice companies are supplied with apples stored in packing houses. Therefore, the presence of P. expansum in apples should be considered a possible consequence of postharvest handling of fruits associated with the extension and conditions of storage. During the present investigation, as cited by other authors (SYDENHAM et al., 1995), it was observed that at several times the apples are not processed as soon as received in the processing plant. This situation leads to a deck storage (under no refrigerated conditions) for sometimes more than 5 days, resulting in serious implications in the level of patulin (SYDENHAM et al., 1997). Therefore, monitoring the quality of apple lots under a rigid selection criterion during the reception step and minimizing storage at room temperature should be considered important measures to control this toxigenic mold (FAO, 2003).

The sample of wash water also showed a high contamination by molds and yeast (> 105 CFU/mL, including P. expansum (CODEX, 2003). In the wash step, the high-pressure water sprayed against apples helps in the removal of rotten parts which contain high levels of toxin (ACAR et al., 1998). Therefore, is important to use a sanitizer, such as chlorine, during this step in order to reduce P. expansum spores (SALOMÃO et al., 2008a). However, spores will be suspended in the water causing a possible cross contamination and also increasing the risk of mold growth during bulk storage (FAO, 2003). The apple sorting should be rigorous enough to remove, as far as possible, rotten fruits,

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even those with only small areas of rot (CODEX, 2003). However, in the sample of washed apples P. expansum was again found, proving the high prevalence of this mold in this fruit and the possibility of cross contamination caused by contaminated water. Talaromyces sp. (1AC) was the mold isolated from the concentrated juice. This mold is a HRM that has been isolated on several occasions in screening fruit juices (PITT; HOCKING, 1999). The sequence of heat shocks applied during the process probably caused the activation of its spores from the asexual to a sexual state. The presence of Talaromyces species in the concentrated apple juice implies a concern because they cause spoilage in heat-treated products and members of this genus are known to produce the mycotoxin talaromycin (ENIGL et al., 1993). SALOMÃO (2002) observed that Talaromyces sp. was the prevalent genus of HRM found in frozen strawberry pulp. Their ascospores are extremely heat resistant and can survive 5 to 12 min of heating at 100ºC (PITT; HOCKING, 1985; TOURNAS, 1994).

The genus Eupenicillium was isolated from wash water (1Wr) and before concentration treatment (1BPCr). Other authors also found the same mold in a screening of processed apple nectar and also from frozen strawberry pulp (SALOMÃO, 2002; ARAGÃO, 1989). This mold showed D80°C of 14.5 min in strawberry juice (ARAGÃO, 1989).

N. fischeri was detected in washed apples. Other studies also related the presence of this same HRM species with apple products (GUMERATO, 1995; SALOMÃO et al., 2008b). N. fischeri ascospores showed high resistance in juices and survived a heat treatment of 94ºC for 20 min in apple juice (SALOMÃO et al., 2008b; SALOMÃO et al., 2007; SALOMÃO et al., 2004). Some strains of N. fischeri are capable of producing toxins such as fumitremorgins and verruculogen (TOURNAS, 1994). Eurotium species also were detected among the HRM and their presence in the apples was unusual. Some species of Eurotium also produces ascopores which would include them to the list of resistant fungi (SPLITTSTOESSER et al., 1989; YILDIZ; COKSÖYLER, 2002). Their xerophilic characteristic is probably the major reason for their stability during dormancy (EICHER et al., 2002). The heat resistance of Eurotium haerbariorum, isolated from a spoilage outbreak involving grape preserves, showed D70°C of 2.5 min in 5°Brix grape juice and D71°C of 5.2 min in 65°Brix juice (SPLITTSTOESSER et al., 1989). The presence of B. fulva in the concentrated juice demonstrated the ability of its ascospores to remain viable after being submitted to the high temperatures applied during processing. A strain of B. fulva IOC

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4518, isolated from apples, survived heating at 95ºC for 20 min (SALOMÃO et al., 2008b) and its D values in apple juice at 85ºC, 90ºC, 92ºC and 95ºC were 64.5, 16.6, 6.3 and 3.1 min, respectively (SANT`ANA et al., 2009). B. fulva also was detected from a pasteurized strawberry juice supplemented with chemical additives, demonstrating its thermal and chemical resistance (SALOMÃO, 2002). An investigation showed that from 16 samples of apple juice concentrate analyzed, 25% belonged to the Byssochlamys genera. Three strains were identified as B. fulva and one strain as B. nivea (WELKE et al., 2009). In addition to patulin, other metabolites have been reported to be produced by B. fulva such as byssochlamic acid and byssotoxin A (TOURNAS, 1994). Although the incidence of HRM in the apple juice concentrate was low (Table 2), all heat resistant genus cited in the literature were detected in this investigation. Based on this, control measures should be studied in order to minimize the contamination by these microorganisms. The presence of A. acidoterrestris in the samples are in agreement with other studies that report its incidence in a wide range of fruit juices as well as processing facilities, where it enters most probably on fruit surfaces contaminated from soil during production and harvesting (SPLITTSTOESSER et al., 1994; MURAKAMI et al. 1998; CHEN et al., 2006; GRANDE et al., 2005). Therefore, considering that Alicyclobacillus are soil-borne, its control should start in the fields along with proper cleaning of fruits at the beginning of processing (GROENEWALD et al., 2009). Groenewald et al. (2009) also reported the isolation of A. acidoterrestris from wash water and flume water, which increases the risk of possible recontamination by this bacterium through the water. In this present survey, A. acidoterrestris was also detected in the step before ultra filtration (A. acidoterrestris CCT 75481) showing the high resistance of its spores in remaining viable even after submitted to the heat treatments applied in the pre-concentration stage (110-115ºC for 30 s) and in the first pasteurization stage (85-90ºC for 30s). The D values for A. acidoterrestris in apple juice at 85, 90 and 95ºC were 56, 23 and 2.8 min, respectively (SPLITTSTOESSER et al., 1994). Since A. acidoterrestris is a thermoacidophilic and spore-forming bacterium they can survive in acid media (such as apple juice) and grow at temperatures higher than 20ºC, thereby having the potential to spoil the shelf stable products during storage (CHEN et al., 2006).

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Although A. acidoterrestris is not pathogenic, it is recognized as a problem in the juice industries world-wide since spore-related juice spoilage may result in offensive-smelling compounds (JENSEN; WHITFIELD, 2002; WALLS; CHUYATE, 2000; SPLITTSTOESSER et al., 1998). 5 Conclusion

The presence of P. expansum in the raw material represents a likely risk of patulin in the final product, since this toxin shows relatively high heat stability in an acidic environment. The detection of B. fulva and A. acidoterrestris CCT 7548 in the stages after heat treatment demonstrated their high heat resistance and also the possibility of toxins and off-flavors remaining in the apple juice. Therefore, this research concluded that P. expansum, B. fulva and A. acidoterrestris are the most important biologic hazards for apple juice products. Furthermore, considering that the application of more severe thermal treatments to inactivate resistant spores and toxin is impracticable for fruit juices, further investigations should attempt to discover strategies aimed at reducing the target microorganisms from the raw material by controlling the initial contamination of fruits during storage and also at the beginning steps of production (receiving, wash and sorting steps). Acknowledgements The authors gratefully acknowledge the Capes Foundation (Brazil) and CNPQ (National Counsel of Technological and Scientific Development, Brazil) for Beatriz C. M. Salomão and Chalana Müller scholarships, respectively. Besides, we would like to thank David C. Manns for assistance with the manuscript preparation. References

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101

4.2 Aplicação de dicloroisocianurato de sódio e ácido peracético para redução de esporos de Penicillium expansum, Byssochlamys fulva e Alicyclobacillus acidoterrestris na superfície de maçãs e em soluções aquosas

Apresentação: Com base no trabalho anterior, verificou-se que os micro-organismos relevantes para o processo produtivo de suco de maçã foram Penicillium expansum, Byssochlamys fulva e Alicyclobacillus acidoterrestris. Considerando que as maçãs são importantes fontes iniciais de contaminação, esta etapa do trabalho visou avaliar a eficácia de sanitizantes em maçãs e também em soluções aquosas. Neste trabalho, além do ácido peracético, foi também utilizado o composto clorado orgânico dicloroisocianurato de sódio.

Aplicação de dicloroisocianurato de sódio e ácido peracético para redução de esporos de Penicillium expansum, Byssochlamys fulva e

Alicyclobacillus acidoterrestris em maçãs e em soluções aquosas

Beatriz de Cássia Martins SALOMÃO1, Chalana MÜLLER1; Pilar Rodriguez de MASSAGUER 2, Gláucia Maria Falcão ARAGÃO1*

1 Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos - Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, 88040-900,

Florianópolis - SC, Brasil 2 Departamento de Processos Químicos, Faculdade de Engenharia Química da Unicamp – FEQ Universidade Estadual de Campinas –

UNICAMP, 13081-970, Campinas - SP, Brasil *Fone: (48) 37219448 r.245 Fax: (48) 48 37219687

glaucia@enq.ufsc.br

RESUMO A eficácia do sanitizante clorado orgânico dicloroisocianurato de sódio (Dicloro) e do ácido peracético foi testada contra esporos de Penicillium expansum, Byssochlamys fulva e Alicyclobacillus acidoterrestris em superfície de maçãs e em solução aquosa. Os esporos de P. expansum foram eficazmente eliminados em ambas as condições usando dicloro, sendo que mais que 6 reduções decimais (RD) foram obtidas a 25 ppm/6 min em solução aquosa. Entretanto, o ácido peracético

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mostrou-se ineficaz na redução de esporos de P. expansum. Na superfície da maçã, os demais micro-organismos sofreram < 1 RD com ambos os sanitizantes. Em solução aquosa o dicloro mostrou-se mais eficaz que ácido peracético. B. fulva apresentou-se mais resistente que A. acidoterrestris sendo este mais resistente que P. expansum. Concluiu-se que dicloroisocianurato de sódio foi o sanitizante mais eficaz, sendo recomendado na concentração de 25 ppm para uso na água de resfriamento das maçãs destinadas à estocagem e também na água de lavagem, visando, assim, destruir esporos de P. expansum e reduzir o risco de produção de patulina no produto final. Nenhum sanitizante foi eficaz contra os esporos de A. acidoterrestris e B. fulva. Palavras-chave: Sanitização. Dicloroisocianurato de sódio. Ácido peracético. Microbiota da maçã. Bolores termorresistentes.

ABSTRACT

The efficacy of sodium dichloroisocyanurate (Dichloro) and peracetic acid (against Penicillium expansum, Byssochlamys fulva and Alicyclobacillus acidoterrestris was evaluated on apples surface and aqueous solution. P. expansum spores were efficiently destroyed in both conditions using dichloro and more than 6 decimal reductions (DR) were observed at 25 ppm/6 min in aqueous solution. However, low efficacy was observed using peracetic acid against P. expansum spores. In apple surface, the other microorganisms were reduced in < 1 logarithmic cycle, using both sanitizers. In aqueous solution dichloro was more effective than peracetic acid. B. fulva was the most resistant microorganism following by A. acidoterrestris and finally by P. expansum. It follows that sodium dichloroisocyanurate was the most efficient sanitizer and its use is recommended at 25 ppm in water used for cooling apples designated for storage, and in the wash water, in order to destroy P. expansum spores and to reduce the risk of patulin production in juice. None sanitizer used were efficient against A. acidoterrestris and B. fulva spores. Keywords: Sanitizing treatments. Sodium dichloroisocyanurate. Peracetic acid. Apple microbiote. Heat resistant molds.

103

1 Introdução A cultura da maçã tem apresentado expansão no cenário brasileiro, sendo que o estado de Santa Catarina se destaca como o maior produtor nacional (BRASIL, 2007; CEPA, 2008). As frutas que não alcançam padrão comercial (15-30% das frutas produzidas) são destinadas ao setor industrial para a produção, principalmente, de suco concentrado de maçã que, em sua maioria (> 90%), é destinado à exportação (SANT`ANA, 2007; NOGUEIRA et al., 2007). As maçãs são susceptíveis à contaminação por fungos como Penicillium expansum e Byssochlamys fulva que são reconhecidamente produtores de patulina em maçãs e seus produtos (DRUSCH; RAGAB, 2003; MOAKE et al., 2005; SANT`ANA, 2007; SALOMÃO et al., 2008b). Além disso, o segundo fungo apresenta esporos termorresistentes capazes de se manterem viáveis após a pasteurização do suco, além de possuir habilidade de produzir enzimas pectinolíticas que deterioram o produto final (HOCKING; PITT, 1984; TOURNAS, 1994; SANT`ANA et al., 2009). O suco de maçã também pode ser alvo do desenvolvimento de bactérias termoacidofílicas como o Alicyclobacillus acidoterrestris que, além de possuir esporos altamente termorresistentes, pode causar alteração através da produção de guaicol que é uma substância capaz de conferir ao suco gosto e cheiro descritos como antisséptico, desinfetante ou medicinal (BORLINGHAUS; ENGEL, 1997; BAUMGART et al., 1997; CHANG; KANG, 2004; YAMAZAKI et al., 1996; MURAKAMI et al., 1998; PONTIUS et al., 1998; SPLITTSTOESSER et al., 1998). Durante o período da safra, as frutas fora do padrão comercial para o consumo in natura são destinadas ao processamento do suco, enquanto que as frutas dentro do padrão comercial são destinadas ao beneficiamento e armazenamento em locais conhecidos como packing houses. As frutas chegam nestes locais dentro de caixas de madeira (bins) e, assim estocadas, são levadas ao pré-resfriamento em um resfriador com circulação de água gelada (hydrocooler) por aproximadamente 20 min. Em seguida, as maçãs são encaminhadas ao armazenamento dentro de câmaras-frias, geralmente à temperatura de 1-0°C (92-96% de UR), em atmosfera controlada ou não, por um período que pode variar de 4 a 12 meses, dependendo da variedade. Na entressafra, as frutas retiradas do armazenamento que forem consideradas inadequadas para comercialização são destinadas ao processamento industrial (SANT’ANA, et al., 2008). Na planta de processamento de suco, as maçãs são submetidas à lavagem pela ação de jatos de água sob pressão (geralmente sem adição de sanitizante)

104

(SANT`ANA et al., 2008) Sanitizantes a base de cloro inorgânico, como o hipoclorito de sódio, são os mais amplamente utilizados em processos de sanitização de frutas (ANDRADE; MACÊDO, 1996; JACKSON et al., 2003; OKULL et. al., 2006; SIMMONS et al., 2006; BARAK et al., 2003, CHEN et al., 2004; SALOMÃO et al., 2008a). Nos armazéns de estocagem (packing houses), a cloração da água de manejo das frutas destinadas ao armazenamento é geralmente realizada com hipoclorito de sódio (KUPFERMAN, 1984), porém a concentração deste sanitizante normalmente cai abaixo da mínima efetiva devido à introdução de matéria orgânica (KOTULA et al., 1997; RUSSELL et al., 1992) e à falta de monitoramento (OKULL et al., 2006). O uso de compostos clorados orgânicos tem se expandido no Brasil, destacando-se o dicloroisocianurato de sódio (MEYER, 1994; ANDRADE; MACÊDO, 1996). Entre as vantagens do uso destes está o fato de serem mais estáveis em solução aquosa que os inorgânicos, o que implica numa liberação mais lenta de ácido hipocloroso (agente microbicida) e, consequentemente, em uma eficácia mais duradoura. Além disso, são menos reativos com matéria orgânica e não formam níveis significantes de trialometanos, que são agentes tidos como carcinogênicos (MEYER, 1994; ANDRADE; MACÊDO, 1996). Ácido peracético é o princípio ativo de diversos sanitizantes disponíveis comercialmente que têm sido frequentemente utilizados na indústria de alimentos. Este agente não existe como uma única substância química, mas como uma mistura estabilizada de ácido peracético, peróxido de hidrogênio e ácido acético. O ácido peracético possui baixo efeito residual, além de ser menos reativo com a matéria orgânica (ANDRADE; MACÊDO, 1996; SAPERS, 2001). A temperatura é um fator que pode influenciar na eficácia dos sanitizantes uma vez que, em geral, temperaturas mais elevadas causam aumento na velocidade das reações (MEYER, 1994; RUSSELL et al., 1992). Existe uma escassez de trabalhos científicos que avaliem a eficácia de compostos clorados orgânicos, como o dicloroisocianurato de sódio, sobre esporos de micro-organismos de importância na indústria de alimentos e, até o momento, não há relatos de estudos investigando a ação de qualquer sanitizante sobre esporos de Byssochlamys fulva. Além disso, o ácido peracético vem assumindo o papel de substituto para compostos clorados, o que salienta a importância da comparação da eficácia de ambos os princípios. O objetivo desta pesquisa foi a análise da resistência dos mais

105

relevantes micro-organismos da microbiota natural da maçã a agentes sanitizantes, sendo que, em alguns casos, o aumento da temperatura foi também testado. Os micro-organismos alvo do estudo foram B. fulva, A. acidoterrestris e P. expansum, devido à sua ocorrência em maçãs e seus produtos e por suas capacidades deteriorantes e/ou toxicológicas que são fatores limitantes para a garantia de comercialização do suco concentrado de maçã. 2 Materiais e Métodos 2.1 Micro-organismos e preparo da suspensão de esporos As cepas dos micro-organismos Byssochlamys fulva (CCT 0056), Penicillium expansum (CCT 4680) e Alicyclobacillus acidoterrestris (CCT 4384) foram obtidas da coleção de culturas da Fundação Tropical de Culturas André Tosello (Campinas, SP, Brasil). O preparo da suspensão de esporos dos fungos P. expansum e B. fulva iniciou-se pela pré-esporulação em placas de Petri contendo meio ágar batata dextrose (PDA, Biolife, Itália) acidificado a pH 3,5 por 7 dias a 25ºC e 30ºC, respectivamente. Os esporos coletados foram adicionados às placas de esporulação, contendo meio Ágar Extrato de Malte (MEA, formulado de acordo com Pitt e Hocking, 1999), e incubados na temperatura indicada para cada micro-organismo por 10 dias (P. expansum) e 30 dias (B. fulva). Após este período, adicionou-se 10 mL de água destilada estéril em cada placa e, depois da raspagem, todo o conteúdo foi filtrado em 4 camadas de gaze estéril e centrifugado a 3500 rpm (2000 x g) por 15 minutos. Este procedimento foi repetido duas vezes ou até a constatação microscópica da ausência de hifas. Ao final, foi feita a resuspensão dos esporos em água estéril, sendo a suspensão mantida sob refrigeração a 4ºC até posterior utilização (SALOMÃO, et al. 2007). (SALOMÃO, et al. 2007). A suspensão de esporos de A. acidoterrestris foi pré-esporulada em tubos inclinados (PDA; pH 3,5) e incubados a 44ºC/3 dias. A biomassa obtida foi adicionada a 10 mL de caldo AAM (Meio Alicyclobacillus acidocaldarius), formulado de acordo com Murakami et al., 1998) e incubada a 45ºC por 24 horas. O caldo enriquecido foi espalhado sobre placas de Petri contendo meio AAM (suplementado de 0,05% de MnCl2.4H2O e 1,5% de ágar; pH 4) e incubado por 10 dias a 45ºC. Após a confirmação microscópica da produção de esporos por coloração usando verde de Malaquita (MASSAGUER, 2006), a cada placa foi adicionado 10 mL de água seguida de raspagem. O esporos

106

obtidos foram centrifugados 5 vezes a 3500 rpm (2000 x g) por 15 minutos, sendo eliminado o sobrenadante. Ao final, foi feita a resuspensão dos esporos em água estéril, sendo a suspensão mantida sob refrigeração a 4ºC até posterior utilização (MURAKAMI et al., 1998). 2.2 Preparo das soluções sanitizantes As soluções cloradas foram formuladas a partir do produto comercial Sumaveg® (Johnson Diversey, São Paulo, Brasil) cujo princípio ativo é o composto clorado orgânico dicloroisocianurato de sódio (dicloro) e as soluções à base de ácido peracético (AP) foram elaboradas a partir do produto Tsunami 100® (ECOLAB, São Paulo, Brasil). A concentração do princípio ativo de cada solução foi confirmada utilizando fitas medidoras específicas para a medição de cloro livre (Test Systems Inc., Rock Hill, SC, USA) e ácido peracético (Weber Scientific, Chestertown, Md, USA). Todas as soluções foram mantidas nas temperaturas de 25°C e/ou 37°C. 2.3 Teste sobre a superfície das maçãs Os testes sobre a superfície das maçãs foram baseados na metodologia adaptada de Lee et al., 2004. As maçãs, da variedade Fuji, foram adquiridas em mercado local, sendo que sempre procurou-se escolher frutas sem lesões aparentes e de calibre semelhante. No laboratório, primeiramente as maçãs receberam lavagem com água potável e, em seguida, foram colocadas dentro de sacos estéreis com 100 mL de água destilada estéril e massageadas por 1 min. Posteriormente, as maçãs foram secas em gaze estéril e sobrepostas em superfície esterilizada com o pedúnculo voltado para cima. A inoculação das maçãs foi feita na região em torno do pedúnculo utilizando-se 0,1 mL de suspensão dos esporos, com concentração de 105, 107 e 106 esporos/mL, respectivamente de P. expansum, B. fulva e A. acidoterrestris. As frutas inoculadas com os fungos permaneceram por duas horas em câmara de fluxo laminar para a fixação dos esporos (tempo baseado em testes prévios) e, as inoculadas com esporos de A. acidoterrestris, permaneceram 24 horas (SAPERS, et al., 2001). Para o tratamento, as maçãs foram colocadas individualmente dentro de sacos estéreis e adicionadas de 100 mL das soluções sanitizantes nas concentrações de 0, 50, 80, 150, 200 e 250 ppm de ácido peracético e 0,

107

50, 100, 150, 200 e 250 ppm de cloro, separadamente para cada concentração. Neste caso, foram testadas soluções estabilizadas à temperatura de 25ºC e 37ºC para os esporos de B. fulva e de A. acidoterrestris. Posteriormente, massageou-se a fruta com as mãos durante 1 minuto e foi coletada a primeira amostra de 4,0 mL. Em seguida, manteve-se o contato do sanitizante com a fruta (sem massageamento) por mais 1 min e coletou-se outra amostra de 4,0 mL. Imediatamente, cada amostra foi neutralizada com 1,3 mL de solução de tiossulfato de sódio 0,6% por 2 minutos. À exceção dos esporos de P. expansum, os demais receberam um choque térmico em banho termostatizado (Tecnal®, Modelo TE-184, Piracicaba, Brasil ± 0,1ºC de precisão) a 80ºC/10 min. Este tratamento de ativação foi baseado em resultados anteriores (para os esporos de B. fulva) e, para os esporos de A. acidoterrestris, utilizou-se o mesmo choque térmico já utilizado por outros autores (MURRAY et al., 2007; PEÑA; MASSAGUER, 2006; SILVA; GIBBS, 2001; GROENNEWALD et al., 2009; WALLS; CHUYATE, 2000 e ORR; BEUCHAT, 2000). Em seguida, as amostras foram diluídas serialmente e plaqueadas em meio PDA (pH 3,5) (OKULL et al., 2006; OKULL; LABORDE, 2004; SPLITTSTOESSER et al., 1993; MURRAY et al., 2007). A incubação ocorreu a 25°C para P. expansum, 30°C para B. fulva e 43°C para A. acidoterrestris por 4-5 dias. A partir da amostra sem tratamento, foi calculado o número de reduções decimais (RD) segundo a equação 1. Cada condição foi testada em triplicata e um teste adicional foi executado para avaliar uma possível ação do neutralizante na destruição dos esporos. Para tanto, as frutas foram lavadas com 100 mL de água estéril e, após massageamento por 1 min, a amostra de 4 mL recebeu a adição de 1,3 mL de tiossulfato de sódio 0,6%. Após o contato, as amostras foram ativadas (exceto esporos de P. expansum), diluídas, plaqueadas e incubadas conforme descrito anteriormente.

=

NNoRD log (Equação 1)

onde, N0 é a concentração inicial dos esporos, expressa em (esporos/mL), e N é a concentração de esporos recuperada após cada tratamento (esporos/mL). 2.4 Teste em soluções aquosas

Os testes em soluções aquosas foram baseados na metodologia adaptada de Orr e Beuchat (2000). Inicialmente, 0,1 mL da suspensão de

108

esporos foi adicionado aos tubos contendo 5 mL das soluções sanitizantes em diferentes concentrações. Para esporos de P. expansum foram testadas concentrações de 0, 25, 50, 75 e 100 ppm de cloro, nos tempos de contato de 1, 2, 3, 4, 5 e 6 minutos e 0, 250 e 500 ppm de ácido peracético por 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 e 120 minutos. Os esporos de B. fulva foram testados em contato com concentrações de 0, 250, 400, 500, 600, 700 e 800 ppm de cloro nos tempos de 15, 30, 45, 60 e 75 minutos e 0, 500, 800, 1000, 1200, 1500 e 1800 ppm de ácido peracético por 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos. Esporos de A. acidoterrestris foram testados em contato com concentrações de 0, 250, 350, 400 e 500 ppm de cloro nos tempos de contato de 15, 30 45, 60 e 75 minutos e 0, 250, 500, 650, 750, 850 e 1000 ppm de ácido peracético por 15, 30, 45, 60 e 75 minutos. Neste teste, somente foram usadas soluções sanitizantes estabilizadas a 25ºC. Após contato, foi adicionado 1,6 mL de tiossulfato de sódio 0,6 % deixando-se agir por 2 minutos com o objetivo de neutralizar a ação dos sanitizantes. Após a neutralização, as amostras contendo esporos de B. fulva e A. acidoterrestris receberam um choque térmico de 80oC/10 min. Seguidamente, cada amostra foi resfriada, diluída, plaqueada e incubada conforme descrito no item 2.3. Cada condição foi testada individualmente em triplicata. A partir da contagem das colônias (esporos/mL), realizou-se o cálculo do número de reduções decimais (RD) de acordo com a equação 1. Um ensaio adicional (triplicata) foi realizado para testar uma possível ação do neutralizante (tiossulfato de sódio 0,6%) sobre os esporos, adicionando-se 1,6 mL deste reagente a 5 mL de água e 0,1 mL de esporos de micro-organismo. Após o contato de 2 min, as amostras foram ativadas (exceto esporos de P. expansum), diluídas, plaqueadas e incubadas conforme descrito anteriormente.

2.5 Análise estatística dos dados Utilizando o programa MINITAB® 14 (Minitab Inc., State College, PA, USA) os dados foram avaliados estatisticamente pela análise de variância (ANOVA) sendo que os resultados foram interpretados de acordo com o Teste de Tukey, onde as diferenças a α=0,05 foram consideradas significativas.

109

3 Resultados 3.1 Teste sobre a superfície das maçãs

O efeito da sanitização na superfície das maçãs, utilizando

dicloroisocianurato de sódio (dicloro) e ácido peracético (AP), está apresentado nas Tabelas de 1 a 3.

Tabela 1. Efeito da sanitização com dicloroisocianurato de sódio (dicloro) e ácido peracético (AP) (25ºC) sobre esporos de P. expansum expresso em logaritmo da população (Log P) e número de reduções decimais (RD) no ensaio sobre superfície de maçãs Fuji após 1 e 2 min de contato.

CL (ppm) Log P ± DP (1 min)

Log P ± DP (2 min)

RD (1 min)

RD (2 min)

0 5,3 ± 0,3a* 5,3 ± 0,3a* 0,0 0,0 50 3,1 ± 0,6b 1,8 ± 0,4b 2,2 3,5

100 1,9 ± 0,6c 1,8 ± 0,1b 3,4 3,5 150 1,8 ± 0,2c 1,2 ± 0,3b 3,5 4,1 200 0,7 ± 0,0d 0,0 ± 0,0c 4,6 >5,3 250 0,2 ± 0,1d 0,0 ± 0,0c 5,1 >5,3

AP (ppm) Log P ± DP (1 min)

Log P ± DP (2 min)

RD (1 min)

RD (2 min)

0 5,2 ± 0,3a* 5,2 ± 0,3a* 0,0 0,0 50 4,8 ± 0,3a, b 4,8 ± 0,3a, b 0,4 0,4 80 4,7 ± 0,3a, b 4,7 ± 0,3a, b 0,5 0,5

150 4,7 ± 0,3a, b 4,7 ± 0,3a, b 0,5 0,5 200 4,7 ± 0,3a, b 4,7 ± 0,3a, b 0,5 0,5 250 4,7 ± 0,3b 4,5 ± 0,3b 0,5 0,7

Log P: Média de 3 resultados; DP: Desvio padrão; RD = log (No/N). *Na mesma coluna, a média dos valores que não são seguidos pela mesma letra são considerados significativamente diferentes (α = 0,05). Teste para avaliar a ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% detectou (Log P ± DP): 5,2± 0,2.

110

Tabela 2. Efeito da sanitização com dicloroisocianurato de sódio (dicloro) e ácido peracético (AP) (25 e 37ºC) sobre esporos de B. fulva expresso em logaritmo da população (Log P) e número de reduções decimais (RD) no ensaio sobre superfície de maçãs Fuji após 1 e 2 min de contato.

25ºC 37ºC CL

(ppm) Log P ± DP

(1min)

Log P ± DP

(2min)

RD (1min)

RD (2min)

Log P ± DP

(1min)

Log P ± DP

(2 min)

RD (1min)

RD (2min)

0 3,7 ± 0,1a*

3,7 ± 0,1a* - - 3,4 ±

0,0a* 3,4 ± 0,0a* - -

50 3,6 ± 0,1a, b

3,6 ± 0,1a, b 0,1 0,1 3,3 ±

0,0a,b 3,2 ± 0,0b 0,1 0,2

100 3,5 ± 0,2a, b

3,4 ± 0,2a, b 0,2 0,3 3,2 ±

0,0b, c 3,1 ± 0,0b, c 0,2 0,3

150 3,4 ± 0,1a, b

3,3 ± 0,1b 0,3 0,4 3,1 ±

0,0c, d 3,0 ± 0,0c, d 0,3 0,4

200 3,3 ± 0,1b

3,3 ± 0,1b 0,4 0,4 3,0 ±

0,0d 3,0 ± 0,0d, e 0,4 0,4

250 3,3 ± 0,1b

3,2 ± 0,1b 0,4 0,5 3,0 ±

0,0d 2,9 ± 0,0e 0,4 0,5

25ºC 37ºC AP

(ppm) Log P ± DP

(1min)

Log P ± DP

(2min)

RD (1min)

RD (2min)

Log P ± DP

(1min)

Log P ± DP

(2min)

RD (1min)

RD (2min)

0 3.7 ± 0,1a

3.7 ± 0,1a - - 3,4 ±

0,0a 3,4 ± 0,0a - -

50 3,6 ± 0,1a,b

3,5 ± 0,1a, b 0,1 0,2 3,3 ±

0,0a, b 3,2 ± 0,0b 0,1 0,2

80 3,5 ± 0,0a, b

3,5 ± 0,1a, b 0,2 0,2 3,2 ±

0,0b, c 3,1 ±

0,1b, c, d 0,2 0,3

150 3,4 ± 0,1b, c

3,3 ± 0,0b, c 0,3 0,4 3,1 ±

0,1c, d 3,1 ± 0,0c, d 0,3 0,3

200 3,3 ± 0,1c

3,3 ± 0,0c 0,4 0,4 3,0 ±

0,1d, e 3,0 ± 0,0d, e 0,4 0,4

250 3,2 ± 0,0c

3,1 ± 0,1c 0,5 0,6 2,9 ±

0,0e 2,8 ± 0,1e 0,5 0,6

Log P: Média de 3 resultados; DP: Desvio padrão; RD = log (No/N). *Na mesma coluna, a média dos valores que não são seguidos pela mesma letra são considerados significativamente diferentes (α = 0,05). Teste para avaliar a ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% (25ºC) detectou (Log P ± DP): 3,6 ± 0,1.

111

Tabela 3. Efeito da sanitização com dicloroisocianurato de sódio (dicloro) e ácido peracético (AP) (25 e 37ºC) sobre esporos de A. acidoterrestris expresso em logaritmo da população (Log P) e número de reduções decimais (RD) no ensaio sobre superfície de maçãs Fuji após 1 e 2 min de contato.

25ºC 37ºC CL

(ppm)Log P ± DP

(1min)

Log P ± DP

(2min)

RD (1min)

RD (2min)

Log P ± DP

(1min)

Log P ± DP

(2min)

RD (1min)

RD (2min)

0 4,5 ± 0,1a*

4,5 ± 0,1a*

- - 4,4 ± 0,0a*

4,4 ± 0,0a*

- -

50 a4,5 ± 0,0a, b

4,4 ± 0,0a, b

0,0 0,1 4,3 ± 0,0a, b

4,2 ± 0,0a, b

0,1 0,2

100 4,5 ± 0,0a, b

4,4 ± 0,0a, b

0,0 0,1 4,2 ± 0,0a, b, c

4,2 ± 0,0b, c

0,2 0,2

150 4,3 ± 0,1a, b

4,3 ± 0,1a, b

0,2 0,2 4,2 ± 0,0b, c

4,2 ± 0,0b, c

0,2 0,2

200 4,3 ± 0,1a, b

4,2 ± 0,1a, b

0,2 0,3 4,1 ± 0,1c, d

4,1 ± 0,1c, e

0,3 0,3

250 4,2 ± 0,1b

4,2 ± 0,1b

0,3 0,3 4,0 ± 0,1d

3,9 ± 0,0e

0,4 0,5

25ºC 37ºC AP (ppm) Log P

± DP (1min)

Log P ± DP

(2min)

RD (1min)

RD (2min)

Log P ± DP

(1min)

Log P ± DP

(2min)

RD (1min)

RD (2min)

0 4,6 ± 0,0a

4,6 ± 0,0a

- - 4,4 ± 0,0a

4,4 ± 0,0a

- -

50 4,5 ± 0,0a, b

4,5 ± 0,0a, b

0,0 0,1 4,3 ± 0,0a

4,2 ± 0,0a, b

0,1 0,2

80 4,4 ± 0,0b

4,4 ± 0,0b

0,1 0,2 4,2 ± 0,0a, b

4,2 ± 0,0a, b

0,2 0,2

150 4,4 ± 0,0b

4,4 ± 0,0b

0,2 0,2 4,1 ± 0,0b, c

4,1 ± 0,1b, c

0,3 0,3

200 4,4 ± 0,0b

4,4 ± 0,0b

0,2 0,2 4,1 ± 0,1b, c

4,0 ± 0,0c, e

0,3 0,4

250 4,3 ± 0,0c

4,2 ± 0,0c

0,3 0,4 4,0 ± 0,1c

3,9 ± 0,1e

0,4 0,5

Log P: Média de 3 resultados; DP: Desvio padrão; RD = log (No/N). *Na mesma coluna, a média dos valores que não são seguidos pela mesma letra são considerados significativamente diferentes (α = 0,05). Teste para avaliar a ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% (25ºC) detectou (Log P ± DP): 4,5± 0,1.

112

Os dois sanitizantes agiram de forma diferenciada sobre os esporos de P. expansum, sendo que as soluções cloradas orgânicas apresentaram-se mais eficazes. O tratamento a 50 ppm de dicloro/1 min foi significativamente diferente de todos os demais tratamentos no mesmo tempo de contato, causando 2,2 RD (Tabela 1). Não houve diferença significativa entre tratamentos a 100 ou 150 ppm de dicloro/1 minuto, assim como não foi verificada diferença entre os tratamentos com dicloro às concentrações de 50, 100 e 150 ppm por 2 minutos. Quando foram comparados os dois tempos de contato (dentro de uma mesma concentração), somente o tratamento de 50 ppm de dicloro/1 min mostrou ser diferente do tratamento de 2 min, sendo que, a partir daí, à medida que a concentração é aumentada, o tempo de contato não influenciou significativamente. Na superfície das maçãs, os esporos de P. expansum tratados com AP não sofreram redução significativa, independente das concentrações e tempos de contato testados.

Na superfície da maçã, os dois sanitizantes testados causaram menos que 1 RD nos esporos de B. fulva (Tabela 2) e A. acidoterrestris (Tabela 3), sendo que o aumento da temperatura de 25ºC para 37ºC não causou diferença perceptível na sua eficácia. Os resultados dos testes que mediram o possível efeito de tiossulfato de sódio 0,6% sobre os esporos não evidenciaram qualquer influência.

3.2 Teste em soluções aquosas Os resultados obtidos nos tratamentos com soluções de dicloro e

de AP estão apresentados nas Tabelas de 4 a 6.

113

Tabela 4. Efeito da sanitização com dicloroisocianurato de sódio (dicloro) e ácido peracético (AP) sobre esporos de P. expansum expresso em logaritmo da população (Log P) após contato e número de reduções decimais (RD) no ensaio em soluções aquosas.

CL (ppm)

Tempo (min) Log P ± DP RD AP

(ppm) Tempo (min)

Log P ± DP RD

0 -

6,0 ± 0,0a* 0,0 0 - 6,0 ±

0,0a* 0,0 1 2,7 ± 0,2b 3,3 15 5,9 ± 0,1a 0,1 2 2,4 ± 0,3c 3,6 30 5,9 ± 0,1a 0,1 3 1,9 ±0,1d, i 4,1 45 3,8 ± 0,1b 2,2 4 1,2 ± 0,2e 4,8 60 3,6 ± 0,2b 2,4 5 0,5 ± 0,1f 5,5 75 2,2 ± 0,1c 3,8

25

6 0,0 ± 0,0g > 6,0 90 1,8 ± 0,0d 4,2 1 2,2 ±0,0c, d 3,8 105 1,1 ± 0,1e 4,9 2 1,8 ± 0,2i 4,2

250

120 0,5 ± 0,2f 5,5 3 1,2 ± 0,1e 4,8 15 0,0 ± 0,0g > 6,0 4 0,4 ± 0,0f 5,6 30 0,0 ± 0,0g > 6,0 5 0,0 ± 0,0g > 6,0 45 0,0 ± 0,0g > 6,0

50

6 0,0 ± 0,0g > 6,0 60 0,0 ± 0,0g > 6,0 1 1,6 ± 0,0i 4,4 75 0,0 ± 0,0g > 6,0 2 0,0 ± 0,0g > 6,0 90 0,0 ± 0,0g > 6,0 3 0,0 ± 0,0g > 6,0 105 0,0 ± 0,0g > 6,0 4 0,0 ± 0,0g > 6,0

500

120 0,0 ± 0,0g > 6,0 5 0,0 ± 0,0g > 6,0

75

6 0,0 ± 0,0g > 6,0 1 0,0 ± 0,0g > 6,0 2 0,0 ± 0,0g > 6,0 3 0,0 ± 0,0g > 6,0 4 0,0 ± 0,0g > 6,0 5 0,0 ± 0,0g > 6,0

100

6 0,0 ± 0,0g > 6,0 Log P: Média de 3 resultados; DP: Desvio padrão; RD = log (No/N). *Na mesma coluna, a média dos valores que não são seguidos pela mesma letra são considerados significativamente diferentes (α = 0,05). Teste para avaliar a ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% detectou (Log P ± DP): 6,0 ± 0,1

114

Tabela 5. Efeito da sanitização com dicloroisocianurato de sódio (dicloro) e ácido peracético (AP) sobre esporos de B. fulva expresso em logaritmo da população (Log P) e número de reduções decimais (RD) no ensaio em soluções aquosas

CL (ppm) Tempo (min) Log P ± DP RD AP

(ppm) Tempo (min) Log P ± DP RD

0 - 3,7 ± 0,0a* 0,0 0 0 3,6 ± 0,0a* 0,0 15 3,6 ± 0,0a 0,1 30 3,5 ± 0,0a 0,1 30 3,6 ± 0,0a 0,1 60 3,5 ± 0,0a 0,1 45 3,6 ± 0,0a 0,1 90 3,5 ± 0,0a 0,2 60 3,6 ± 0,0a 0,1 120 3,5 ± 0,0a 0,2

250

75 3,6 ± 0,0a 0,1 150 3,4 ± 0,1a 0,2 15 3,6 ± 0,0a 0,1

500

180 3,3 ± 0,1a 0,3 30 3,6 ± 0,0a 0,1 30 3,5 ± 0,1a 0,1 45 3,5 ± 0,0a 0,2 60 3,5 ± 0,1a 0,2 60 3,5 ± 0,0a 0,2 90 3,5 ± 0,0a 0,2

400

75 3,5 ± 0,0a 0,2 120 3,4 ± 0,0a 0,2 15 3,5 ± 0,0a 0,2 150 3,4 ± 0,0a 0,2 30 3,5 ± 0,0a 0,2

800

180 3,3 ± 0,1a 0,3 45 3,5 ± 0,0a 0,2 30 2,6 ± 0,1b 1,0 60 3,5 ± 0,0a 0,2 60 2,3 ± 0,1c 1,3

500

75 3,5 ± 0,0a 0,2 90 2,3± 0,1c 1,3 15 2,5 ± 0,1b 1,2 120 2,3 ± 0,0c 1,3 30 2,5 ± 0,0b 1,2 150 2,3 ± 0,0c 1,3 45 1,8 ± 0,0c 1,9

1000

180 2,2 ± 0,1c 1,4 60 1,2 ± 0,1d 2,5 30 2,2 ± 0,0c 1,5

600

75 0,6 ± 0,1e 3,1 60 2,2 ± 0,0c 1,5 15 0,5 ± 0,0e 3,2 90 2,0 ± 0,0c 1,6 30 0,1 ± 0,2f 3,6 120 1,6 ± 0,1d 2,0 45 0,1 ± 0,1f 3,6 150 1,5 ± 0,0d 2,1 60 0,0 ± 0,0f > 3,7

1200

180 1,2 ± 0,0e 2,5 700

75 0,0 ± 0,0f > 3,7 30 1,0 ± 0,1e, f 2,6 15 0,5 ± 0,1e 3,2 60 1,0 ± 0,0e, f 2,6 30 0,0 ± 0,0f > 3,7 90 1,0 ± 0,1e, f 2,6 45 0,0 ± 0,0f > 3,7 120 0,9 ± 0,1e, f 2,7 60 0,0 ± 0,0f > 3,7 150 0,8 ± 0,1f, g 2,8

800

75 0,0 ± 0,0f > 3,7

1500

180 0,8 ± 0,1f, g 2,8 30 1,0 ± 0,0e, f 2,6 60 0,9 ± 0,1e, f 2,7 90 0,9 ± 0,1e, f 2,7 120 0,8 ± 0,1f, g 2,8 150 0,7 ± 0,1f, g 2,9

1800

180 0,5 ± 0,1g 3,1 Log P: Média de 3 resultados; DP: Desvio padrão; RD = log (No/N). *Na mesma coluna, a média dos valores que não são seguidos pela mesma letra são considerados significativamente diferentes (α = 0,05). Teste para avaliar a ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% detectou (Log P ± DP): 3,6 ± 0,0.

115

Tabela 6. Efeito da sanitização com dicloroisocianurato de sódio (dicloro) e ácido peracético (AP) sobre esporos de A. acidoterrestris expresso em logaritmo da população (Log P) e número de reduções decimais (RD) no ensaio em soluções aquosas

CL (ppm)

Tempo (min)

Log P ± DP RD AP

(ppm) Tempo (min)

Log P ± DP RD

0 0 4,6 ± 0,1ª* 0,0 0 0 4,6 ± 0,0a* 0,0 15 4,6 ± 0,1a 0,0 15 4,6 ± 0,0a 0,0 30 3,5 ± 0,1b 1,1 30 4,6 ± 0,0a 0,0 45 3,5 ± 0,0b 1,1 45 4,5 ± 0,1a 0,1 60 3,5 ± 0,1b 1,1 60 4,5 ± 0,0a 0,1

250

75 3,5 ± 0,1b 1,1

250

75 4,4 ± 0,1a 0,2 15 3,3 ± 0,1b 1,3 15 4,6 ± 0,0a 0,0 30 3,3 ± 0,1b 1,3 30 4,6 ± 0,0a 0,0 45 3,3 ± 0,0b 1,3 45 4,4 ± 0,0a 0,2 60 2,9 ± 0,0c 1,7 60 4,1 ± 0,0b 0,5

350

75 2,6 ± 0,1d 2,0

500

75 3,8 ± 0,1c 0,8 15 1,4 ± 0,2e 3,2 15 4,1 ± 0,0b 0,5 30 1,4 ± 0,2e 3,2 30 4,1 ± 0,0b 0,5 45 1,4 ± 0,1e 3,2 45 3,9 ± 0,0c 0,7 60 1,2 ± 0,0e 3,4 60 3,6 ± 0,0d 1,0

400

75 1,0 ± 0,0f 3,6

650

75 3,2 ± 0,1e 1,4 15 0,1 ± 0,1g 4,5 15 4,1 ± 0,0b 0,5 30 0,0 ± 0,0g > 4,6 30 4,1 ± 0,0b 0,5 45 0,0 ± 0,0g > 4,6 45 3,6 ± 0,1c, e 1,0 60 0,0 ± 0,0g > 4,6 60 2,8 ± 0,0f 1,8

500

75 0,0 ± 0,0g > 4,6

750

75 1,8 ± 0,1g 2,8 15 3,9 ± 0,1c 0,7

30 3,8 ± 0,1c,

d 0,8 45 3,3 ± 0,2e 1,3 60 2,5 ± 0,0h 2,1

850

75 1,5 ± 0,1i 3,1 15 2,9 ± 0,1f 1,7 30 2,8 ± 0,1f 1,8 45 1,5 ± 0,0i 3,1 60 0,0 ± 0,0j > 4,6

1000

75 0,0 ± 0,0j > 4,6 Log P: Média de 3 resultados; DP: Desvio padrão; RD = log (No/N). *Na mesma coluna, a média dos valores que não são seguidos pela mesma letra são considerados significativamente diferentes (α = 0,05). Teste para avaliar a ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% detectou (Log P ± DP): 4,6 ± 0,1.

116

No teste em solução aquosa sobre esporos de P. expansum, verificou-se que os tratamentos a 50 ppm de dicloro/2 min e 25 ppm de dicloro/3 min mostraram-se significativamente iguais e capazes de causar mais de 4 RD. Os tratamentos à base de cloro orgânico, na concentração de 25 ppm de dicloro por 6 min ou 50 ppm por 5 e 6 min, destruíram toda a população presente (> 6 RD). Da mesma forma o fizeram os tratamentos a 75 ppm (dicloro) a partir de 2 min, e todos os tratamentos a 100 ppm. Os esporos de P. expansum mostraram-se mais resistentes ao ácido peracético, tanto que, em soluções aquosas, os tratamentos se iniciaram com concentração 10 vezes superior às usadas com cloro, sendo o tempo de contato inicial 2,5 vezes maior. Comparando a ação dos dois sanitizantes sobre esporos de P. expansum, verificou-se que, para se obter em torno de 5,5 RD, seria necessário um tratamento a 25 ppm de dicloro/5 min ou um tratamento a 250 ppm (AP)/2 horas. Em relação ao B. fulva (Tabela 5), os tratamentos com dicloro até 500 ppm causaram discreta redução de esporos (≤ 0,2 RD). Porém, o tratamento com 600 ppm (dicloro) alcançou 1,2 RD (15 min) e 3,1 RD (75 min). Estes tempos de desinfecção, no entanto, são impraticáveis na indústria. A ação do ácido peracético sobre esporos de B. fulva causou no máximo 0,3 RD até concentrações de 800 ppm. Ao aumentar a concentração de AP para 1000 ppm, no máximo 1,4 RD foram obtidas (180 min). Duas ou mais RD nos esporos de B. fulva somente foram alcançadas a partir do tratamento a 1200 ppm(AP)/120 min. Comparando-se os dois fungos, para se alcançar 3,6 RD foi necessário um tratamento a 700 ppm de dicloro/30 min para B. fulva e 25 ppm (CL)/2 min para P. expansum. Esporos de A. acidoterrestris (Tabela 6) demonstraram ser um pouco menos resistentes que os de B. fulva e, assim como este, muito mais resistentes que os esporos de P. expansum. Por exemplo, para se causar em torno de 3 RD, foi necessário um tratamento a 25 ppm de dicloro/1 min (P. expansum), 400 ppm de dicloro/15 min (A. acidoterrestris) e 700 ppm de dicloro/15 min (B. fulva). Também sobre esporos de A. acidoterrestris, o ácido peracético demonstrou ser menos eficaz que dicloroisocianurato de sódio. Enquanto que 4,5 RD foram obtidas a 500 ppm de dicloro/15 min, a mesma concentração de AP não causou nenhuma destruição na população de esporos. Não foi verificada ação do neutralizante tiossulfato de sódio 0,6% sobre os esporos.

117

4 Discussões Nos testes realizados sobre a superfície das frutas, verificou-se

que os esporos de B. fulva e A. acidoterrestris obtiveram uma redução máxima de 0,5-0,6 ciclos logarítmicos (Tabelas 2 e 3). A evolução na redução dos esporos destes micro-organismos somente foi observada nos testes em soluções aquosas quando as concentrações e tempos de contato foram aumentados (Tabelas 5 e 6), ficando clara a superioridade do sanitizante orgânico clorado frente ao ácido peracético.

Na superfície da maçã, o teste com 250 ppm de dicloro/1 min a 25ºC causou 0, 3 RD nos esporos de A. acidoterrestris. Orr e Beuchat (2000) utilizaram hipoclorito de sódio acidificado em concentrações mais altas de 500 ppm/1 min e 1000 ppm/1 min e obtiveram 0,9 RD e 2,27 RD, respectivamente para esporos desta mesma bactéria na superfície das maçãs.

Os esporos de P. expansum foram eficazmente reduzidos em tratamentos com dicloroisocianurato de sódio na superfície das maçãs, porém, conforme observado com os outros micro-organismos, as reduções causadas por ácido peracético não atingiram 1 ciclo logarítmico. Nos testes sobre a maçã, enquanto os tratamentos com 50, 100 e 200 ppm de cloro por 1 min causaram 2,2, 3,4 e 4,6 RD na população de P. expansum, respectivamente, o ácido peracético (Tsunami 100®, Ecolab), nas concentrações de 50 a 250 ppm, reduziu no máximo 0,5 ciclo logarítmico após 1 min de contato. Em pesquisa anterior SALOMÃO et al. (2008a) verificaram que os esporos de P. expansum, tratados com 50, 100 e 200 ppm de hipoclorito de sódio acidificado (pH 6,5) por 30 s, foram reduzidos da superfície de maçã Fuji em 2,46, 2,6 e 3,4 ciclos logarítmicos, respectivamente. No mesmo trabalho também foi testada a eficácia de sanitizante à base de ácido peracético, porém foi utilizado outro produto (Vortexx®, Ecolab) cuja formulação contém o ácido octanóico que possui ação anti-fúngica, e 1,3 RD foram alcançadas a 50 e 80 ppm/30 s.

Os limites máximos de solução sanitizante permitidos para a lavagem direta de frutas é de no máximo 80 ppm de ácido peracético, 100 ppm de cloro livre (quando se utiliza dicloroisocianurato de sódio) e 200 ppm de cloro livre (quando se utiliza hipoclorito de sódio) (FDA, 1998; SAPERS, 2001). Concentrações de ácido peracético e dicloroisocianurato de sódio superiores às recomendadas foram também testadas para se verificar uma possível melhora na eficácia dos tratamentos. Nos testes realizados sobre a superfície das maçãs, descartou-se a possibilidade de se aumentar o tempo de contato de

118

forma a melhorar a eficácia do tratamento, pois na indústria, este processo dura, no máximo, em torno de 2,5 minutos.

Devido à baixa ação do ácido peracético no teste sobre a superfície das maçãs, a princípio, acreditou-se haver alguma barreia natural que pudesse mascarar sua atividade, como por exemplo, a cera da fruta. Porém, os resultados dos testes em solução aquosa descartaram esta possibilidade. Em trabalho anterior (SALOMÃO et al., 2008a), o ácido peracético também mostrou-se menos eficaz que o hipoclorito de sódio acidificado, pois enquanto o tratamento a 50 ppm (cloro) sobre a superfície da maçã Gala causou 1,8 RD, na mesma concentração, o ácido peracético causou apenas 0,9 RD nos esporos de P. expansum.

Orr e Beuchat (2000) testaram a inativação de esporos de A. acidoterrestris (uma mistura de 5 diferentes cepas) em soluções de hipoclorito de sódio e obtiveram 2,4 e 5,6 RD após 10 minutos de contato, nas concentrações de 200 e 500 ppm, respectivamente. Os resultados obtidos no presente trabalho não evidenciaram nenhuma redução nos esporos de A. acidoterrestris (CCT 4384) quando tratados em soluções aquosas 250 ppm de dicloro/15 minutos, demonstrando que a cepa utilizada na pesquisa atual pode ser mais resistente que as cepas testadas por aqueles autores. Porém, foi obtida 4,5 RD quando os esporos entraram em contato com 500 ppm de dicloro/15 min. Os mesmos autores testaram a ação de sanitizante à base de ácido peracético (Tsunami 100®) sobre os esporos de A. acidoterrestris e observaram uma eficácia de 0,11, 0,17 e 0,23 RD após contato de 10 minutos a 40, 80 e 160 ppm, respectivamente. Da mesma forma, os presentes resultados evidenciaram baixa eficiência deste sanitizante, atingindo 0,2 RD em tratamento a 250 ppm/75 min. Farah (2004) também verificou uma pequena destruição, de aproximadamente 0,15 RD, nos esporos de A. acidoterrestris após tratamento a 150 e 200 ppm (AP)/15 s. Kreske et al. (2006) avaliaram a ação de tratamentos sobre esporos de Bacillus (B. cereus e B. thuringiensis) na superfície de maçãs por 5 min de contato e provaram que o ácido peracético (Tsunami 200®) a 40 e 80 ppm causou apenas 0,19 a 0,29 RD, respectivamente. Semelhantemente, na superfície da maçã, Tsunami 100® a 25ºC causou 0,1 e 0,2 RD nos tratamentos a 50 e 80 ppm/1 min. Lee et al. (2004) verificaram que o dióxido de cloro causou 1,2 e 3,3 RD nos esporos de A. acidoterrestris sobre a maçã por 1 e 2 min de contato, respectivamente, porém foi necessária uma concentração de dióxido de cloro (40 ppm) mais de 10 vezes superior à recomendada (FDA, 1998).

Nos testes em solução aquosa sobre os esporos de P. expansum,

119

Chen et al. (2004) verificaram uma redução de aproximadamente 1 log (NMP/mL) na população ao utilizar hipoclorito de sódio a 200 ppm/5 min. O atual trabalho mostrou que dicloroisocianurato de sódio, em concentração 4 vezes menor (50 ppm), causou 3,8 RD em apenas 1 minuto de contato direto com os esporos. Na superfície da maçã, a mesma concentração (50 ppm) causou 2,2 e 3,5 RD após 1 e 2 minutos de contato, respectivamente. Comparando os dois trabalhos, constatou-se que, sobre os esporos de P. expansum foi detectada uma maior eficácia dos sais de cloro orgânicos (dicloroisocianurato de sódio) frente ao hipoclorito de sódio (composto inorgânico).

Okull e Laborde (2004) estudaram a contaminação cruzada de esporos de P. expansum entre maçãs e verificaram que, após imersão em água, de frutas “machucadas”, contendo em torno de 106 esporos/mL, 100 % destas desenvolveram apodrecimento durante armazenamento. Porém, quando as frutas foram subsequentemente tratadas por submersão em 200 ppm de hipoclorito de sódio acidificado/5 min o apodrecimento foi reduzido para 16,7 a 43,4% durante estocagem. Estudos realizados em armazéns de estocagem refrigerada (packing houses) reportaram a ocorrência de até 104 esporos de P. expansum/mL na água que entra em contato com as frutas e relacionaram a presença desses esporos como uma das maiores causas do apodrecimento de maçãs durante o armazenamento (SANDERSON, 2000; SPOTTS; CERVANTES, 1986; SPOTTS; CERVANTES, 1993). Na fruta, outros autores constataram a presença de populações médias de Penicillium na ordem de até 2,6 log de esporos/cm2 (AMIRI; BOMPEIX, 2005). Outra motivação para a adequada cloração da água de resfriamento das frutas, é que, neste procedimento, as frutas vindas do campo (ainda quentes) entram em contato com a água gelada que causa uma contração interna na fruta (pressão diferencial) permitindo a internalização de micro-organismos que estavam na sua superfície ou presentes na água (SAPERS, 2001). Além disso, as caixas de madeira que transportam as frutas “bins” geralmente possuem alta carga de P. expansum (em torno de 106 esporos/bin) e, como as maçãs são resfriadas dentro dos bins, estes, ao entrarem em contato com a água do resfriador, disseminam esporos que irão manter o ciclo das recontaminações pois a mesma água é recirculada para o resfriamento de várias cargas de maçãs (SANDERSON, 2000). Os resultados obtidos no atual estudo, feito em soluções aquosas, mostraram que dicloroisocianurato de sódio a 25 ppm/6 min pode causar mais de 6 RD nos esporos de P. expansum. Estes dados salientam a importância da cloração da água de resfriamento das frutas de forma a diminuir a contaminação cruzada e a incidência de

120

apodrecimento por P. expansum (“podridão azul”). O desenvolvimento deste fungo nas maçãs é acompanhado pela consequente produção de patulina (SALOMÃO et al., 2009) e, sucos de maçã produzidos a partir destas frutas, podem colocar em risco a saúde dos consumidores, uma vez que esta toxina não será eliminada durante a etapa de pasteurização por ser relativamente estável aos processos térmicos (MOAKE et al., 2005).

5 Conclusões Pode-se afirmar que os esporos de A. acidoterrestris e B. fulva não serão eficazmente eliminados pela ação de nenhum dos sanitizantes testados, dentro das concentrações máximas permitidas. Além disso, constatou-se que sanitizantes à base de ácido peracético não devem ser considerados substitutos para compostos clorados, pois não seriam capazes de eliminar esporos de P. expansum dentro das concentrações recomendadas, tanto na superfície das maçãs quanto na água de lavagem e resfriamento das mesmas. O dicloroisocianurato de sódio provou ser um bom substituto para o hipoclorito uma vez que se mostrou efetivo em reduzir populações de P. expansum (como por exemplo a redução de mais de 6 ciclos logarítmicos no tratamento a 25 ppm/6 min). Este sanitizante apresenta ainda a vantagem de não necessitar de correções de pH e ser menos reativo com a matéria orgânica, além de produzir menores níveis de trialometanos. Como no resfriador (hydrocooler) o contato das frutas ocorre por um tempo mais longo (aproximadamente 20 min), recomenda-se o uso de 25 ppm de dicloroisocianurato de sódio para a cloração da água de resfriamento, pois este tratamento irá garantir a redução da população de esporos de P. expansum presentes tanto na fruta como na água. Nas fábricas onde o processamento inclui o armazenamento das frutas lavadas antes do processamento, o uso da mesma concentração de cloro pode auxiliar na redução da carga de esporos de P. expansum presentes tanto na água de lavagem como nas maçãs.

Na planta de processamento de suco, a cloração da água de lavagem não seria suficiente para a causar eliminação de A. acidoterrestris e B. fulva. Outras medidas devem ser tomadas para impedir a contaminação do suco por estes micro-organismos.

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Agradecimentos

Os autores agradecem à Fundação Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e ao CNPQ (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo apoio prestados a este trabalho através do fornecimento da bolsa de doutorado para Beatriz de Cássia Martins Salomão (CAPES), bolsa de pesquisador visitante a Pilar Rodriguez de Massaguer (CNPQ) e bolsa PIBIC para Chalana Müller (CNPQ). Referências

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4.3 Efficacy of sanitizing treatments against Penicillium expansum inoculated on six varieties of apples

Apresentação: Considerando a importância do P. expansum como o maior causador de deterioração/produção de patulina em maçãs, foi realizado um estudo para avaliar a ação de sanitizantes contra este fungo inoculado em seis diferentes variedades de maçãs que estão entre as mais utilizadas para produção de suco nos Estados Unidos. Este trabalho pretendeu verificar a ação do agente clorado mais extensivamente utilizado (hipoclorito de sódio) que foi testado acidificado e não acidificado. Estes resultados foram comparados com os tratamentos realizados com ácido peracético.

Research Note Efficacy of sanitizing treatments against Penicillium expansum

inoculated on six varieties of apples BEATRIZ C. M. SALOMÃO2, GLÁUCIA M. F. ARAGÃO2, JOHN

J. CHUREY1, and RANDY W. WOROBO1* 1Department of Food Science and Technology, New York State

Agricultural Experiment Station, Cornell University, Geneva, NY 14456-0462, USA

2Department of Chemical Engineering and Food Engineering, Federal University of Santa Catarina, UFSC, Florianópolis, SC 88040-900,

Brazil Keywords: Penicillium expansum, apples, sanitizing, sodium

hypochlorite, peracetic acid, patulin *Author for correspondence. Phone: 315-787-2279; Fax: 315-787-2284;

E-mail: rww8@cornell.edu

ABSTRACT The effectiveness of several wash treatments was evaluated

against spores of P. expansum inoculated on six varieties of apples (Red Delicious, Golden Supreme, Empire, Macintosh, Fuji and Gala). The treatments included water, acidified water (pH 6.5), acidified (pH 6.5) sodium hypochlorite, non-acidified (pH 8.8, 9.3, and 9.7) sodium hypochlorite (50, 100 and 200 ppm, respectively), and peracetic acid (50 ppm and 80 ppm) solutions. Spores of P. expansum were dried on the surface of the apples for 2 hours prior to exposure to the different sanitizer

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solutions. Each apple was submerged in 100 ml of each treatment solution for 30 s and the number of spores remaining were recovered and enumerated. The efficacy of chlorine solutions was enhanced by decreasing the pH to 6.5 (up to 5 log reduction, depending on apple variety). Peracetic acid solutions (50 and 80 ppm) resulted in less than a 2 log spores/g reduction and had statistically (P ≤ 0.05) the same efficacy as unacidified chlorine solutions (50, 100 and 200 ppm). Control water solutions showed a 1.34 log spores/g reduction in P. expansum spores. The results show that chlorine solutions at pH 6.5 resulted in the largest reduction of P. expansum spores for all apples varieties tested.

INTRODUCTION

Penicillium expansum is a common contaminant in apples and is

responsible for significant spoilage losses in fresh and stored apples. In addition, P.expansum is the primary patulin producer in apple and apple products. The production of patulin by P. expansum has been shown to be dependent on apple variety and degree of ripeness (10). Patulin, a thermal resistant mycotoxin (6, 11, 21), has been shown to exhibit carcinogenic, teratogenic and mutagenic effects in laboratory animals (3, 6, 11, 18, 22). The presence of P. expansum in or on the surfaces of apples must be controlled or eliminated in an attempt to prevent the spread of this mold to uninfected apples. The elimination or reduction of P. expansum from apple surfaces directly results in the retention of fruit quality and the prevention of patulin production in apples and apple juice produced from fruit that were sanitized prior to storage. Therefore, it is in the interest of the apple industry to develop interventions that reduce the risk of P. expansum growth and production of patulin in apples that may be used for juice or other apple products. In order to improve the safety of these products, an important line of defense is apple decontamination by washing or sanitizing treatments prior to storage (6, 14, 15).

Chlorine is the most widely used sanitizing agent for fruits (1, 2, 4, 5, 8, 9, 12, 16). In water, sodium and calcium hypochlorite are converted to the hypochlorite ion and hypochlorous acid. The latter is present in higher proportions at lower pHs (<8.0) and is responsible for the antimicrobial activity of chlorine solutions (13, 15). Peracetic acid is an equilibrium mixture of the peroxy compound, hydrogen peroxide and acetic acid. This sanitizer is approved by the FDA as an addition to wash water for fruit decontamination (15).

Although P. expansum is commonly found in apples, there are no reports that have evaluated the effectiveness of sanitizer treatments against

129

this potentially hazardous mold in these fruits (5, 12). In one previous study (12), the authors analyzed the effect of chlorine solutions spiked with various surfactants against suspensions of P. expansum in vitro but not on the fruit surface. Other work (5) was undertaken to compare the effectiveness of chlorine solutions with other chemical treatments against P. expansum on Empire apple slices and mold suspensions (in vitro). However, the effectiveness of the most commonly used sanitizers for P. expansum inactivation on whole apple surfaces was lacking and the objective of this study was to determine the effectiveness of chlorine and peracetic acid sanitizers against P. expansum spores on the surface of six different apples varieties (Red Delicious, Gala, Macintosh, Fuji, Empire and Golden Supreme).

MATERIAL AND METHODS

Culture Preparation: Penicillium expansum CCT 4680 was obtained from the André Tosello Foundation, Campinas, S.P., Brazil. The mold was grown on Malt Extract Agar (MEA) (17) plates for 10 days at 25ºC. The inoculum was prepared by adding 10 ml of sterile deionized water followed by gentle swirling to release the spores. The spore suspension was filtered through four layers of sterile cheesecloth to remove mycelial debris and then centrifuged twice at 2000 X g for 15 min at 4ºC. The final pellet was resuspended in sterile deionized water at a concentration of 108 spores/ml. Apples: Red Delicious, Golden Supreme, Empire, McIntosh, Fuji and Gala apple varieties were obtained from orchards at the New York State Agricultural Experiment Station – Cornell University, Geneva, NY, USA and were stored at 2ºC until needed. Apple Inoculation: Initially, the apples were washed in water and brushed to remove surface debris. Each apple was then rinsed with sterile deionized water and dried on sterile cheesecloth in a laminar flow hood. A section having a circumference of 3.5 cm radius was drawn around the stem of each apple and a 100 µl spore suspension was deposited in small, approximately equal volumes at 10 to 12 locations on the skin surface within the target area. Inoculated apples were placed in a biosafety hood for 2 h at room temperature to allow for drying of the spore suspension prior to treatment with sanitizers. All apples varieties were inoculated with approximately 5 log spores/g of P. expansum. Preparation of treatment solutions: Chlorine solutions were prepared from sodium hypochlorite and sterile deionized water to obtain

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concentrations of 50, 100 and 200 ppm of free chlorine. After preparation, the pH of the solutions were 8.8, 9.3 and 9.7, for 50, 100 and 200 ppm free chlorine, respectively. Acidified chlorine solutions at the same concentrations listed above were prepared with the final pH adjusted to 6.5, using sterile 0.25 N phosphoric acid. As a control, water solutions were tested with and without acidification to pH 6.5 using the same acid. Concentrations of free chlorine were confirmed with chorine test strips (Test Systems, Inc. Rock Hill, SC, USA). A peracetic acid-based sanitizer (Vortexx, Ecolab, Inc., St. Paul, MN) was prepared at concentrations of 50 and 80 ppm by dilution with sterile deionized water. The concentration of the solutions was confirmed with peracetic acid test strips (Weber Scientific, Chestertown, MD, USA). Treatment of Apples: Triplicates of the six inoculated apples varieties were placed individually, stem down, in a 1000 ml beaker containing 100 ml of chlorine solution (0, 50, 100 and 200 ppm) or peracetic acid solution (0, 50 and 80 ppm). The temperature of all solutions were 25ºC. Each beaker was agitated for 30 s by gentle hand swirling. Each apple was then immediately rinsed with approximately 100 ml of sterile deionized water to stop the sanitizer action. The inoculated section of the apple was removed using a sterile blade and extracted in a volume of sterile 0.1% peptone water equal to ten times the weight of the apple section. The extracts were serially diluted in sterile 0.1% peptone water, pour plated (1 ml in duplicate) on potato dextrose agar acidified to pH 3.5 with 10% tartaric acid, and incubated for 4-5 days at 25ºC. Triplicates of the six apples varieties inoculated with P. expansum without any sanitizer treatment were also analyzed serving as an untreated control. Statistical analyses: Experiments were replicated three times for each of the six varieties. Each replicate experiment consisted of three samples exposed to the same treatment conditions. Treatments were analyzed for significant differences using ANOVA and Student-Newman- Keuls. Significant differences (P ≤ 0.05) are reported between mean populations of each surviving P. expansum spore counts for water treatments and the various sanitizing solutions as well as between the different apples varieties.

RESULTS AND DISCUSSION

Populations of P. expansum spores recovered from a 30 s wash

at 25°C using the various sanitizer treatment solutions and water wash treatments are shown in Table 1. All wash treatments were significantly

131

different (P ≤ 0.05) from the control except for Macintosh, Empire and Golden Supreme varieties treated with peracetic acid at 50 ppm and for Gala apples washed with tap water.

Treatment with tap water reduced the number of viable spores by 0.23 to 0.78 log spores/g in all apple varieties except for Macintosh, in which the water wash reduced the initial population by 1.34 log spores/g. The treatment using tap water acidified with 0.25 N phosphoric acid served as a control against the potential antimicrobial activity of the acid itself. However, the results show that the acidified water treatment was slightly less effective, but not significantly different than the treatment using non-acidified tap water, reducing the viable spore population by 0.10 to 0.37 log spores/g. Therefore, the phosphoric acid was not responsible for the inactivation that was observed with acidified chlorine solutions. The acid simply decreases the pH of the solutions, resulting in the shift of the reaction equilibrium to yield more hypochlorous acid ion, making the chlorine treatment more effective (2).

The number of spores detected after 30 s of contact with non-acidified chlorine solutions (50, 100 and 200 ppm) equated to reductions ranging from 0.92 to 2.41 log spores/g. All treatments using non-acidified chlorine for the Red Delicious, Gala and Empire varieties and the treatment of non-acidified 200 ppm chlorine for Golden Supreme were significantly more effective than the water treatment alone. However, for the three other varieties there was no significant difference (P ≥ 0.05) between washing with water or any non-acidified chlorine solution. This is in line with another study that showed spores of P. expansum were not significantly affected by treatment with 200 ppm of sodium hypochlorite at pH 9.7 (5). With one exception (the less effective 50 ppm non-acidified chlorine; Red Delicious), there were no significant differences among apple varieties tested with non-acidified chlorine treatments. These results show that for most of apple varieties, a four-fold increase in the non-acidified chlorine concentration does not significantly alter the recovery of P. expansum spores. Furthermore, for two varieties (Macintosh and Fuji), water treatment had the same effect as the non-acidified chlorine solutions at all the concentrations tested. These results exemplify the importance of pH adjustment for chlorine solutions to ensure that hypochlorous acid is formed with hypochlorite-based sanitizing solution (7). Good Agricultural Practice (GAP) guidelines currently recommend a post-harvest wash treatment of fresh produce in 50 to 200 ppm total chlorine solution at a pH range from 6.0 to 7.5 (19). In our

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study, the results of apples treatments with chlorine solutions at a pH 6.5 caused reductions of more than 5 log spores/g for Macintosh, Empire and Golden Supreme at 200 ppm . The treatment at 100 ppm reduced the population by 2.60 log spores/g with Fuji apples, and by 4.22 log spores/g for Macintosh apples. At all acidified chlorine concentrations, Macintosh apples showed the highest spore reductions. Treatments at 50 ppm using acidified chlorine solutions yielded decimal reductions of 1.86 log spores/g, with Gala and 3.5 log spores/g with Macintosh. When comparing treatments using non-acidified versus acidified chlorine solutions, the effectiveness was significantly higher for acidified solutions for all apple varieties at 100 and 200 ppm. At 50 ppm, the effectiveness of the acidified chlorine treatments was higher than non-acidified chlorine treatments for all varieties excluding Gala and Macintosh, where no significant differences were observed. At pH 6.5, higher chlorine concentrations resulted in higher P. expansum spore reductions for all varieties except for Gala and Fuji in which no significant differences were observed between higher concentrations of acidified chlorine solutions. Okull et al. (12), also observed that the activity of acidified sodium hypochlorite solutions were significantly higher (1.1 log cfu/ml) than alkaline solutions (0.4 log cfu/ml) for P. expansum spores (in vitro) using chlorine solutions at 50 ppm for 30 s. Our study shows at the same chlorine concentration markedly higher decimal reduction than that found by Okull et al. Chen et al. (5) observed that sodium hypochlorite at 200 ppm decreased P. expansum spores populations (in vitro) by approximately 1 log MPN/ml after 5 min of contact. For all apples varieties, treatments using acidified chlorine at 50 ppm were more effective than treatments using the same concentration of peracetic acid. The P. expansum spore count reductions due to peracetic acid treatments ranged from 0.85 at 50 ppm to 1.93 at 80 ppm. However, for all varieties the efficacy of the 50 ppm peracetic acid treatment was not significantly different from the 80 ppm treatment. In addition, for all varieties there was no significant difference in the reduction of P. expansum spores when comparing non-acidified chlorine solutions with peracetic acid solutions at any concentration. This supports previous evidence concerning the activity of peracetic acid solutions and chlorine solutions against yeasts and molds in apples (1). Furthermore, P. expansum spore recovery from Macintosh, Empire, and Golden Supreme varieties showed no statistical differences between tap water and 50 ppm peracetic acid treatments. Different apple varieties did not contribute significantly for the results of the treatments since no

133

statistical differences (P ≥ 0.05) were observed among the six apple varieties tested. In summary, chlorine at pH 6.5 was more effective than all other treatments and substantially more effective than non-acidified chlorine at 100 and 200 ppm in killing P. expansum spores on the apple's surface. Peracetic acid at 50 and 80 ppm concentrations, and non-acidified sodium hypochlorite at 50, 100 and 200 ppm were similar in effectiveness in reducing P. expansum spore populations. The US Food and Drug Administration recommends that the total concentration used for sanitizing fruit not exceed 200 ppm of sodium hypochlorite and 80 ppm of peracetic acid in wash water (20). However, for non-acidified chlorine and peracetic acid, this study showed that the maximum permitted concentrations only reduce the initial population by 1 to 2 log spores/g for five of the six varieties studies. Results of this study show that a decrease in the pH of the sodium hypochlorite solutions used to sanitize apples can significantly reduce the population of P. expansum naturally occurring on the surface of these fruits. In addition, this research also shows that a simple wash with water in the apple wash process will have less than a 1 log spores/g reduction of P. expansum, which does very little to reduce this patulin producing mold on apple surfaces.

ACKNOWLEDMENTS We gratefully acknowledge the Capes Foundation (Brazil) for the financial support of Beatriz de Cássia Martins Salomão for her Ph.D. studies. The authors also thank David C. Manns for his help with the statistical analyses and the assistance with the manuscript preparation.

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136

137

4.4 Modeling Penicillium expansum resistance to thermal and

chlorine treatments Apresentação: A diminuição da contaminação por P. expansum no processo produtivo deve acontecer principalmente pela redução de sua carga nas maçãs (através das estapas de lavagem e seleção das frutas) e também pela sua destruição durante o processo térmico de pasteurização, o qual é considerado um ponto crítico de controle. Levando-se em conta que a pasteurização do suco de maçã a ser mantido refrigerado utiliza temperaturas mais amenas (71ºC/6 s), esse trabalho teve o objetvo de estudar a resistência térmica destes esporos. Além disso, estudou-se a habilidade de modelos matemáticos em descrever as curvas de inativação de P. expansum obtidas por aquecimento e também por sanitização.

Research Note Modeling Penicillium expansum resistance to thermal and chlorine

treatments BEATRIZ C. M. SALOMÃO2, JOHN J. CHUREY1, GLÁUCIA M. F.

ARAGÃO2, and RANDY W. WOROBO1*

1 Department of Food Science and Technology, New York State Agricultural Experiment Station, Cornell University, Geneva, NY

14456-0462, USA. 2 Department of Chemical Engineering and Food Engineering,

Federal University of Santa Catarina, UFSC, Florianópolis, SC 88040-900, Brazil.

*Author for correspondence. Phone: 315-787-2279, Fax: 315-787-2284. E-mail: rww8@cornell.edu

Keywords: Penicillium expansum, patulin, apple juice, apple sanitizing, Bigelow Model, Weibull Model, and Biphasic Model. Abstract Apples and apple products are excellent substrates for Penicillium expansum to produce patulin. In an attempt to avoid excessive levels of patulin, limiting or reducing P. expansum

138

contamination levels on apples designated for storage in packing houses and/or during apple juice processing is critical. The aim of this work was (i) to determine the thermal resistance of P. expansum spores in apple juice; comparing the ability of Bigelow and Weibull models to describe the survival curves and (ii) to determine the inactivation of P. expansum spores in aqueous chlorine solutions at varying concentrations of chlorine solutions; comparing the ability of Biphasic and Weibull models to fit the survival curves. The results showed that Bigelow and Weibull models were similar for describing the heat inactivation data because the survival curves were almost linear. In this case, the concept of D and z values could be used and the D-values obtained were 10.68, 6.64, 3.32, 1.14 and 0.61 min at 50°C, 52°C, 54°C, 56°C and 60°C, respectively; while the z-value was determined to be 7.57°C. For the chlorine treatments, although Biphasic model presented a slightly superior performance, Weibull model has been choose considering parsimony principal, since it has less parameters than Biphasic model. In conclusion, the typical pasteurization regime used for refrigerated apple juice (71ºC/6 s) is capable of achieving a 6-log of P. expansum spores. Introduction Apples and apple products, like juice and cider, are excellent substrates for Penicillium expansum to grow and produce patulin. This fungus is the most important causative agent of blue mold rot in this fruit (12, 18, 26) and apple juice contaminated with patulin is indicative of rotted fruit used for juicing (27, 29). The presence of patulin in apple products such as juice represents an important concern since this mycotoxin is considered to be carcinogenic, mutagenic and teratogenic for animals and it is suspected to be a health risk in humans (8, 9, 14, 22, 33). Apple storage at low temperature fails to impede fungal growth and patulin production (25), then alternative treatments need to be identified to avoid this problem in fruit destined for juicing over the off-season months. In this way, sanitizer treatments are important measures to reduce mold spore contamination levels with these fruit. Sodium hypochlorite based sanitizers are efficient for disinfection (24) and widely used. However, organic chlorine compound (sodium dichloroisocyanurate) also shown to be effective in reducing P. expansum spores on apple surfaces (unpublished data).

139

Another effective treatment for reducing P. expansum spores is through the thermal treatment of the apple juice. In this step, mold spores can be destroyed by heating (28) but since patulin is relatively stable to thermal degradation in the pH range of 3.5 to 5.5, very little patulin destruction occurs (7, 16). P. expansum spores can be introduced at the juice processing facility by contaminated fruits. During harvest season, although fruit with no visible rot are generally used for juicing, they may be contaminated with internal fungal growth (11, 27). During the off-harvest season, visible blue mold infected apples are commonly found and wash treatments using high-pressure water spray can remove damaged areas (1, 31). However, spores will be suspended in the flume or wash water and this inoculum will increase the risk of mold growth during bulk storage (4). Thermal processing has been suggested as a critical control point for juice to avoid the growth of P. expansum and subsequent patulin production in the finished juice. However, it is more important to control P. expansum development in the fruits by reducing mold contamination levels prior to apple storage.

Determination of the thermal processing regime (for juice pasteurization) and the efficacy of chlorine sanitizer conditions (to reduce spores during handling of apples in water at packing houses or in the wash water in the juice industries) is essential for controlling P. expansum since this information is very limited in the literature.

The inactivation kinetics of microorganisms, primarily the heat resistance of microorganisms, has been determined by the classic Bigelow’s model (D and z concepts). Numerous microorganisms, including fungi, show non-linear, semi-logarithmic survival curves (2, 5, 10, 23). Peleg (19) and Van Boekel (32) considered that the linear behavior for the survival curves is the exception rather than the rule. The Weibull model has been proposed to estimate thermal and non-thermal inactivation of microorganisms (3, 20, 21, 32). This model assumes that cells and spores in a population have different resistances and a survival curve is the cumulative form of a distribution of lethal agents (19).

In order to model the inactivation behavior that displays tailing, Cerf (2) proposed a two-fraction Biphasic model capable of describing log-linear, linear with tailing and biphasic survival curves (6).

The aim of this work was to determinate the heat resistance of P. expansum in apple juice and also to estimate its response to sanitizer treatments, choosing the appropriate models to describe the survival curves obtained in both cases.

140

Material and methods Preparation of mold spore suspension: P. expansum CCT 4680 strain was obtained from André Tosello Foundation, Campinas, S.P., Brazil. The mold was grown on Malt Extract Agar (23) plates at 25°C for 10 days. After incubation, 10 ml of deionized sterile water was added to the surface of the plates and the mold growth was scraped using a sterile scraper. The suspension was filtered through four layers of sterile cheesecloth to remove hyphae and then centrifuged at 2000 x g for 15 minutes at 4°C twice. The final spore suspension concentration was adjusted with deionized sterile water to achieve roughly > than 109 spores/ml. Heat Resistance: The heat resistance was determined in 1.5 x 1.8 x 90 mm capillary tubes. The heating menstrum used was prepared by the dilution of 1 ml of spore suspension in 9 ml of apple juice pasteurized at 121ºC/5 min (pH 3.25; 12.2°Brix; 0.45% total acidity). A 1 ml syringe equipped with a Hamilton repeating dispenser was used to inject 0.04 ml of the inoculated juice into each capillary tube (5, 30). After flame sealing, 5 tubes for each temperature were submerged in a circulating water bath (Haake® C1, Karlsruhe, Germany) at 50, 52, 54, 56, and

60°C. The tubes were removed at the various time intervals, immediately cooled in an ice water bath, and then placed in 95% ethanol to reduce the level of surface contamination on the capillary tubes. The residual ethanol was then blot dried on sterile filter paper, and the five capillary tubes from each sample time were transferred to a dilution bottle containing 20 ml of sterile water. The capillary tubes inside the bottle were then crushed using a sterile glass rod. This resulted in an initial dilution of 102 CFU/ml. Appropriate decimal dilutions were performed in 0.1% peptone water and plated on Potato Dextrose Agar (Criterion®, Santa Maria, CA, U.S.A.), pH 3.5, containing 50 mg/ml Rose Bengal to inhibit spreading. The colonies were enumerated after an incubation period of 4-5 days at 25°C. Each test was individually analyzed in duplicate trials. Sanitizer in aqueous solutions: The chlorine solutions were prepared using sodium dichloroisocyanurate-based sanitizer (Sumaveg®, Johnson Diversey, São Paulo, Brazil) at 0, 25, 50 and 75 ppm of free chlorine. The level of free chlorine was measured using free chlorine test strips (Test Systems®, Rock Hill, SC, U.S.A.). The tests were carried out by the contact of 0.1 ml of P. expansum suspension spores and 5 ml of the

141

above described chlorine solutions for the duration of 1, 2, 3, 4, 5 and 6 min, for each chlorine concentration. In order to inactivate the chlorine at the end of each time point, 1.6 ml of 0.6% sodium thiosulfate solution was added and held for 2 min. Each sample (triplicate) was diluted and plated on Potato Dextrose Agar (Biolife®, Milan, Italy), pH 3.5, containing 50 mg/ml Rose Bengal to inhibit spreading. The colonies were counted after an incubation period of 4-5 days at 25°C. P. expansum inactivation modeling: GInaFiT® software, version 1.4.2 (6) was used to estimate the inactivation parameters. For modeling P. expansum CCT 4680 heat inactivation in apple juice, the ability of the classic Bigelow model (Equation 1) and Weibull model (Equation 3) (13) was compared. The biphasic model (Equation 2) described by Cerf (2) and the Weibull model were fit to survival curves and its ability to describe the inactivation after sanitizer treatments was compared. The inactivation models were: Bigelow model:

Dt

NoNLog −=

(Equation 1)

Cerf (biphasic) model:

( )tkftkfLogNoNLog ×−×−+×−×=

2maxexp()1()1maxexp( (Equation 2)

Weibull model:

ptNoNLog )(

δ−=

(Equation 3)

In these equations, N represents the number of surviving spores after the duration (t) of treatments, while No is the initial level of P. expansum spores at the beginning of treatment (t = 0 min). In equation 1 (Bigelow model), D is the time (min) needed to reduce the population by one logarithmic cycle. The Biphasic model (equation 2) assumes the existence of two sub-populations which are characterized by the difference in their levels of sensitivities to the treatment where f is the fraction of treatment-sensitive and (1-f) is the treatment-resistant fraction. The specific

142

inactivation rates of the two populations are kmax1 (min-1) and kmax2 (min-1), respectively. In the Weibull model (equation 3), p is a shape parameter (for p > 1, convex curves are obtained while for p < 1, concave curves are described) and δ is a scale parameter. In an effort to best explain the observed data, for each experimental set, a secondary model was established using the information attained when fitted to the primary model selected. Model comparison: The following three criteria were used to compare different models. MSE (Mean square error) The smaller mean square error (MSE) values, the better the model to fit data.

npredictobserved

nRSSMSE ∑ −

==2)(

(Equation 4)

Where RSS is the residual sum of squares, n is the number of degrees of freedom. bias factor If there is structural derivation and the bias factor = 1, the model is exact.

( )

∑

= np/o

10redictedbservedLog

factorbias (Equation 5) Af (Accuracy factor) The larger the value, the less accurate the average estimate.

∑

= n/Log(

10 observedpredicted

fA (Equation 6) Results and discussion

The model parameters and statistic comparison obtained for

thermal inactivation are presented in Table 1 where it is possible to observe that both models describe all thermal inactivation curves similarly well. Using the Weibull model, when p-value is close to 1 (p values ranged from 1.00 to 1.13) the survival curve is almost linear and

143

δ values can be compared to D values. Therefore, as can be seen in Figure 1, these results show that the survival curves are almost linear, and the classical Bigelow model can be used to describe the heat resistance of P. expansum in apple juice under the investigated conditions (50, 52, 54, 56 and 60°C) without the risk of an inaccurate thermal death time calculation.

A secondary model was established showing the behavior of log D with the temperature (T) variation (Figure 2). As the relation is almost linear in the investigated temperature range, the z value could be calculated using the D values obtained from the Bigelow model (z = 7.57°C; r2 = 0.97), and the equation obtained was:

Log D = -0.1321T + 7.6274 (Equation 7)

The ability of Biphasic and Weibull models to describe the chlorine inactivation of P. expansum CCT 4680 was compared. Both models were able to describe microbial inactivation, as can be concluded analyzing the statistical data on Table 2. Biphasic model presented a slightly superior performance, but this model has three parameters and Weibull model has two. Considering parsimony principal, Weibull model has been choose to describe the chlorine inactivation and its parameters (p and δ) are presented on Table 2. It can be observed that the higher the chlorine concentration, the lower were the p and δ values. The survival curves displayed a Weibull behavior when analyzing the chlorine treatments of P. expansum CCT 4680 and p values obtained were less than 1 describing concave curves (Figure 3). The Figure 4 and 5 present the fit of secondary model to chlorine treatments obtained by variation of δ (exponential) and p (linear) parameters with chlorine concentration from 25 to 75 ppm. The equations obtained for secondary models considering δ (r2 = 0.99) and p (r2 = 0.98) parameters were:

δ = 0.36e -0.072(chlorine)

(Equation 8) p = 0.005(chlorine) + 0.52 (Equation 9)

Marquenie et al. (15) studied the heat resistance of

Botrytis cinerea and Monilia fructigena in 10 mM phosphate buffer (pH 7.2). They showed that after 15 minutes of heating at 45°C, B. cinerea levels were reduced by approximately 5.5-log. In the case of M. fructigena, it required 15 minutes at 43°C to reach an approximately

144

4-log reduction. Contrary to the findings of this study, the data of log (N0/N) vs. time showed that the survival curves were not log linear. Therefore, the use of the D concept must be avoided. In addition, it is possible to observe that the heat resistance of P. expansum in the present work is higher than those molds studies by Marquenie et al. (15). For example, it required 15 min of heating at 50ºC to reach a 1.4-log reduction of the initial population of P. expansum CCT 4680 while an approximately 4.5-log reduction was achieved after 15 min of heating at 54ºC. Shearer et al. (28) studied the heat resistance of juice spoilage microorganisms and reported the maximum D60ºC of 0.016, 0.290 and 0.449 min for Penicillium citrinum, Penicillium roquefortii and Aspergillus niger, respectively. The present investigation found a higher D60ºC of 0.61 min for P. expansum CCT 4680 spores than the previous study. Using the 7th equation (Log D = -0.1321T + 7.6274), it is possible to show that the D-value at 71ºC is 0.017 min (D71ºC=1.020 s). Therefore, the typical pasteurization regimes used for refrigerated fruit juice (71ºC/6 s) is capable of achieving a 6 log reduction of P. expansum CCT 4680. The quality of the raw material should also be controlled at the beginning of process to minimize the patulin levels in the finished apple products. The use of organic chlorine treatments in reducing P. expansum spores was found to be efficient to reduce the incidence of mold growth in apples during storage. Furthermore, the results showed that the well known Bigelow model can be used for the thermal inactivation conditions for P. expansum used in this study while the Weibull model was best in describing the inactivation of P. expansum spores due to sanitizer treatments. Acknowledments We gratefully acknowledge the Capes Foundation (Brazil) for the financial support of Beatriz C. M. Salomão for her Ph.D. studies. This research was supported by the M-1033 Regional Hatch Funds and the New York State Agricultural Experiment Station. The authors would like to thank David C. Manns of Cornell University for his assistance with the manuscript preparation.

145

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Figures Figure 1 – Thermal survival curves of P. expansum CCT 4680 at 50 (♦), 52(▲), 54 (+) , 56 (●) and 60°C (▫).The line () corresponds to Bigelow Model fitted to survival curves. Figure 2 –Secondary model showing the dependence of log D with temperature (°C). Figure 3 –Sanitizer survival curves of P. expansum CCT 4680 when treated with chlorine sanitizer at 25 (+), 50 (●) and 75 ppm (▫). The line () corresponds to Weibull Model fitted to survival curves. Figure 4 –Secondary model obtained by variation of δ vs. chlorine concentration (ppm) Figure 5 –Secondary model obtained by variation of p vs. chlorine concentration (ppm) Table1. Statistic indices for Bigelow and Weibull models and thermal inactivation parameters of P. expansum CCT 4680 in apple juice

Bigelow model Weibull Model T(ºC) D

(min) MSE bias Af δ p MSE bias Af

50 10.68 0.01 1.00 1.01 11.77 1.08 0.01 1.00 1.01 52 6.64 0.01 1.00 1.02 7.56 1.10 0.01 1.00 1.02 54 3.32 0.02 0.99 1.01 3.33 1.10 0.03 0.99 1.01 56 1.14 0.08 1.00 1.00 1.36 1.13 0.08 1.00 1.00 60 0.61 0.01 1.01 1.01 0.65 1.06 0.06 0.96 1.04

149

Table 2. Statistic indices for Biphasic and Weibull models and Weibull model parameters for chlorine inactivation of P. expansum CCT 4680

Biphasic Model Weibull Model Chlorine

(ppm) MSE bias Af δ p MSE bias Af

25 0.02 0.98 1.02 0.06 0.39 0.07 1.02 1.16

50 0.06 0.90 1.11 0.01 0.29 0.04 0.98 1.16

75 0.02 0.99 1.01 1.55x10-5 0.14 0.16 1.08 1.08

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

00 5 10 15 20 25 30 35 40

Time (min)

Log

N/N

o

-0.30

-0.10

0.10

0.30

0.50

0.70

0.90

1.10

50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Temperature (oC)

Log

D

150

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

00 1 2 3 4 5 6 7

Time (min)

Log

N/No

25 50 750

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

Chlorine (ppm)

δ

151

25 50 75

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

Chlorine (ppm)

p

152

4.5 Influence of storage temperature and apple variety on patulin production by Penicillium expansum

Apresentação: Os resultados anteriores mostraram que as maçãs destinadas ao processamento podem estar contaminadas com esporos de P. expansum. O grau de contaminação por este fungo pode variar dependendo das suas condições previas de estocagem. O desenvolvimento deste fungo na matéria-prima pode levar ao apodrecimento das frutas com consequente produção de patulina no produto final. Assim, este estudo avaliou a produção de patulina por P. expansum em seis diferentes variedades de maçã durante armazenamento em duas condições de temperatura.

Research Paper Influence of storage temperature and apple variety on patulin

production by Penicillium expansum

BEATRIZ C. M. SALOMÃO2, GLÁUCIA M. F. ARAGÃO2, JOHN J. CHUREY1, OLGA I. PADILLA-ZAKOUR1, and RANDY W.

WOROBO1*

1Department of Food Science and Technology, New York State Agricultural Experiment Station, Cornell University, Geneva, NY

14456-0462, USA 2Department of Chemical Engineering and Food Engineering, Federal

University of Santa Catarina, UFSC, Florianópolis, SC 88040-900, Brazil

*Author for correspondence. Phone: 315-787-2279; Fax: 315-787-2284. E-mail: rww8@cornell.edu

Keywords: Penicillium expansum, apples, patulin, cider, juice, storage temperature

ABSTRACT

This study examined the potential for patulin production in six different varieties of apples (Red Delicious, Golden Supreme, Gala, Fuji, Empire and McIntosh) inoculated with Penicillium expansum spores and stored at two different temperatures (11°C and 20.5°C). Samples for patulin analysis were randomly taken from apples stored at different time periods ranging from 21 to 93 days. While patulin was

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produced at both storage temperatures, apples incubated at 20.5°C yielded significantly higher patulin concentrations than those incubated at 11°C. All apple varieties showed mold spoilage at both temperatures, except Red Delicious and Empire. A total of 44% of the samples analyzed showed patulin concentrations over the FDA regulatory limit (50 ppb). The highest patulin productions occurred in Golden Supreme (54,221 ppb) and McIntosh (52,131 ppb and 48,457 ppb) varieties. Our results showed that careful culling of apples is essential for high juice quality since high patulin levels in some apples varieties could result in a greater than 50 ppb level of this mycotoxin in the finished juice or cider even when only one contaminated apple occurs in one thousand apples.

INTRODUCTION

Patulin is a mycotoxin that is produced by certain species of molds including Penicillium expansum, the causative fungus for core rot in apples, which can be considered as the primary species responsible for the production of this mycotoxin in the pre-processing stages of the fruit (pre-harvest and post-harvest). Although patulin can occur in different food products, the most important source of patulin for humans are apples with blue mold rot and apple products made from P. expansum rotted apples (1, 9, 10, 14, 16, 23, 25, 33, 34, 36). The presence of patulin in apple products has been of particular interest because studies in animals have shown that patulin can cause acute effects to the intestinal tract which may include epithelial cell degeneration, inflammation, ulceration, and hemorrhages. Chronic symptoms such as genotoxic, neurotoxic, immunotoxic, immunosuppressive, teratogenic and carcinogenic effects have also been attributed to patulin exposure over time. On a cellular level, patulin has been shown to result in plasma membrane disruption, protein synthesis inhibition, disruption of transcription and inhibition of DNA synthesis (5, 16, 17, 18, 20, 26, 28, 29, 33, 39, 45). Therefore, apple products contaminated with patulin pose a serious health risk, particularly to children who consume high levels of apple products, placing them at increased risk for patulin toxicity (25, 42). Thermal processing, frequently used to treat apple juice and cider, does not inactivate patulin since this mycotoxin is relatively heat resistant, particularly in acidic environments (pH 3.5 to 5.5) (46). Patulin contained in apple juice or cider is stable after typical pasteurization processes (8, 13, 21, 24). Since the compound persists in

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heated juices, it has been suggested that the presence of patulin in processed apple products may be a good indicator of the quality of the fruit used in production (18). However, it has been reported that patulin can be destroyed during the course of yeast fermentation (35). Although the toxicity of patulin in humans has not been demonstrated conclusively, limiting its concentration in apple juice is desirable since infants are the predominant consumers of these products and the effects of long-term exposure to patulin are not known (18). Several government food safety organizations worldwide have set limits on patulin content in apple products. FDA and Codex Alimentarius established a maximum patulin concentration of 50 µg/l in single-strength and reconstituted apple juices (7, 41, 42). In Europe, a maximum level of 50 µg/kg has been established for apple juice and apple cider, while maximum levels for apple products and apple products intended for consumption by young children have been set at 25 µg/kg and 10 µg/kg, respectively (11). The FDA has recommended control measures for patulin that include purchasing only sound tree-picked apples, culling, and trimming apples prior to processing to eliminate moldy, damaged, or rotten apples (43). However, the trimming process is labor intensive and automated trimming of infected tissue is not possible. In addition, P. expansum infected apples may appear as sound on the exterior but core rot may be present and can be overlooked during culling operations (3). Therefore, careful selection of apples still remains the prerequisite for high quality juice (31). Since patulin has been detected frequently in apple juices and apple cider and is relatively stable to processing treatments for extended periods of time, it is essential that patulin control measures are taken prior to juice extraction and processing. Codex Alimentarius recommends that good agricultural practices (GAP) and good manufacturing practices (GMP) are used throughout the production chain in an attempt to limit the amount of patulin in the finished juice (6). The Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) and the FDA (12, 43), have recommended the adoption of the Hazard Analysis and Critical Control Points system (HACCP) to guarantee that patulin levels do not exceed the 50 µg/kg regulatory action level (33).

Patulin production in fruit is believed to be affected by many factors. Apple variety is a very important factor since different varieties differ in their susceptibilities to P. expansum rot and patulin formation. Furthermore, apple storage temperature is a major environmental factor that affects apple shelf life and fungal deterioration rate (18).

155

Considering the concerns for patulin production by P. expansum in apples, it is important to understand and characterize its production in different apples varieties under different storage conditions. The purpose of this investigation was to determine patulin production rates in apples infected with P. expansum, evaluated at two different incubation temperatures (11°C and 20.5°C) for six different apples varieties commonly used for apple cider and juice (Red Delicious, Golden Supreme, Gala, Fuji, Empire and McIntosh) (44). In addition, a small portion of this study was conducted in order to confirm that yeast fermentations were capable of reducing patulin levels in apple juice and provide a plausible explanation for some of the patulin levels observed in extensively rotted apples but low levels of patulin were observed. This study provides a basis for target culling levels in juice manufacturing facilities to yield patulin levels in the final product that are below the limit allowed by regulatory agencies.

MATERIAL AND METHODS

Culture Preparation: Penicillium expansum CCT 4680 strain was obtained from the André Tosello Foundation, Campinas, S.P., Brazil. The mold was grown on Malt Extract Agar (MEA) (32) plates for 10 days at 25ºC. The inoculum was prepared by adding 10 ml of sterile deionized water to each plate followed by gentle swirling to facilitate spore release. The spore suspension was filtered through four layers of sterile cheesecloth to remove mycelial debris and then centrifuged twice at 2000 X g for 15 minutes at 4ºC. The final pellet was resuspended in sterile deionized water at a concentration of 108 spores/ml. From this, working suspensions with a concentration of 103 spores/ml were produced and maintained at 4ºC until apple inoculation. Apples: Red Delicious, Golden Supreme, Empire, McIntosh, Fuji and Gala apple varieties were harvested at commercial maturity according to standard horticultural practices from orchards at the New York State Agricultural Experiment Station – Cornell University, Geneva, NY, USA and were stored at 2ºC until needed. Apple Inoculation: Before each experiment, 15 selected apples of each variety were allowed to equilibrate to room temperature. Each apple was washed and brushed to remove surface debris and then rinsed with sterile deionized water and dried on sterile cheesecloth in a laminar flow hood. Apples were inoculated by a 10 minute dip in 4 liters of the P. expansum suspension containing 103 spores/ml. The suspension was maintained refrigerated at 4ºC to aid in the internalization of the spores through the calyx and stem. The temperature differential between apple

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and spores suspension is necessary to produce the pressure differential responsible for the internalization of the microorganism (2, 40). Excess liquid of the spore suspension was drained from apples and inoculated apples were then stored at two different temperatures (11ºC and 20.5ºC). Fifteen selected, non-inoculated apples of each variety were also maintained at the same temperatures, serving as uninoculated controls. Patulin production study: Samples of juice from incubated apples were periodically taken for patulin analysis. The apple juice was made by squeezing the juice of cut and mashed apple pieces from a single entire apple and the resulting juice was filtered through four layers of cheesecloth. All samples were frozen prior to analysis. Patulin analysis: Frozen samples of the juice from each single apple were sent to an external laboratory (Trilogy Analytical Laboratory, Inc. Washington, MO) for patulin analysis on the same day of extraction or the following day. The methodology used was the official method adopted by AOAC Intl. for apple juice (method 995.10) (4, 42). Results were expressed as µg/L or parts per billion (ppb). Apple juice Fermentation: Commercially purchased dry yeast of Saccharomyces cerevisiae (Lallemand, Australia) was used to ferment juice made from rotted McIntosh apple. Juice was prepared according to the methodology above, and an aliquot was sent to the external laboratory (Trilogy Analytical Laboratory, Inc. Washington, MO) for patulin analysis in order to determine the initial patulin concentration in the juice. This juice (16.2ºBrix, pH 4.1) was used to determine whether the fermentation process could reduce the patulin concentration. Sixty milliliters of this juice was divided in two samples of thirty milliliters and each sample was placed into a 50 ml Erlenmeyer flask fitted with fermentation trap. A 0.5 g inoculation of the yeast powder in both juice samples initiated the fermentation process. The samples were left at room temperature (23 to 25ºC) and were swirled twice daily to insure suspension of the yeast and to permit observation of gas evolution. Fermentation was considered complete (7 days after inoculation) when gas evolution ceased and the soluble solids ranged from 3.4 to 4.0°Brix.

RESULTS Patulin production in rotted apples: Table 1 and Table 2 show all patulin results found in apples incubated at 20.5°C and 11°C, respectively.

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Signs of apple rot were observed after 21 days of incubation at both temperatures (11°C and 20.5°C). After 21 days, only Red Delicious and Empire varieties showed no signs of mold rot at 20.5°C. No patulin was detected in McIntosh and Gala varieties at 20.5°C, after 21 days of incubation. Under the same conditions, Golden Supreme (Figure 1a and Figure 1b) and Fuji (Figure 1c) showed levels greater than 6,000 ppb. At 11°C, Gala showed no detectible patulin levels after 21 days of incubation. However, low levels of patulin were found in Golden Supreme apples under the same conditions. After 29 days at 20.5°C, a sample of Golden Supreme apple was completely rotted showing mold internalization in the central apple tissue and high levels of patulin were detected (Figure 1d). At 11°C, although McIntosh and Golden Supreme were completely rotted, no patulin was detected in either variety. The patulin concentrations found in Gala, McIntosh and Golden Supreme varieties after 35 days at 20.5°C showed differences with high and extremely high levels of patulin, respectively. In this case, McIntosh and Golden Supreme showed visible internal mold growth (Figure 1e and Figure 1f, respectively). After 44 days at 20.5°C, a Golden Supreme sample became partly rotted with patulin levels exceeding the regulatory upper limit.

The Golden Supreme apples, incubated for 59 days at 20.5°C, became completely rotted showing visible mold growth on the exterior and interior of the fruit. However, no patulin was detected in this sample. Similarly, McIntosh apple, incubated under the same conditions, showed both sound and decayed sections within the fruit and yielded very high levels of patulin (Figure 1g). After 59 days of incubation at 11°C, no patulin was detected in the Fuji variety and, under the same conditions; P. expansum produced low levels of patulin in Golden Supreme apples and high levels in McIntosh apples (Table 2).

A sample of Fuji apple analyzed after 80 days of incubation at 20.5°C showed visible mold growth on the exterior surface and very high levels of patulin (Figure 1h and Figure 1i). In a molded McIntosh sample that was incubated for 80 days at 20.5°C, no patulin was detected. After 80 days of incubation at 11°C, no patulin was detected in the McIntosh variety. Also at this temperature after 93 days of incubation, no patulin was detected in Golden Supreme apples. After 93 days of incubation at 20.5°C, no patulin was detected in the McIntosh and Fuji varieties. However, after the same incubation time,

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the concentration of patulin was six times the maximum allowed regulatory limit in Golden Supreme variety. Apple juice fermentation: The initial patulin concentration in the juice was 288 ppb. After fermentation, no patulin was detected in either sample.

DISCUSSION

Samples incubated at 20.5°C became more rotted due to mold compared to those incubated at 11°C. However, even at lower temperature (11°C), McIntosh, Golden Supreme, Gala, and Fuji varieties became rotted and the two first varieties cited produced patulin. P. expansum exhibited psychrotrophic characteristics, growing and producing patulin under refrigerated storage. Paster et al. (27) studied the ability of P. expansum strains to grow and produce patulin in apples stored at different temperatures (0, 3, 6, 17 and 25°C) and it was determined that the maximum production of patulin in apples occurred at 17°C. Patulin levels like those found in this study for whole apples, are considered extremely high and clearly show the potential of P. expansum to produce high levels of patulin in select varieties of apples. In accord agreement with other work (15), our results show that storage temperature is a major factor for patulin production in apples. Empire and Red Delicious varieties did not become rotted throughout the entire test period implying that these varieties could be considered more resistant against P. expansum growth and consequently, patulin production. However, another study (19) reported that cider pressed from ground-harvested Red Delicious apples had higher levels of patulin than cider prepared from other varieties (Golden Delicious, Granny Smith, Fuji, Gala, McIntosh and Red Rome). Our work is in accord with other authors (10, 18) who concluded that the mere presence of P. expansum did not necessarily imply that patulin was present since mycotoxin production is influenced by many factors including environmental conditions (i.e. temperature), variety and nutritional status of the fruit. A factor that may explain the differences in the various studies is the integrity of the fruit and the fruit storage conditions. The fruit used in this study was tree picked and the inoculation of the apples was performed within 1 day of harvest. It was clear in this study that patulin concentration is dependent on apple variety. Marín et al. (22) also showed that apple variety was the

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main factor affecting patulin content. In their study, they describe a markedly higher patulin concentration in Golden Delicious apples than in Fuji apples, attributed to the fact that Golden Delicious apples have a softer flesh and is more acidic than Fuji. A study from Brazil (30) comparing patulin production in two different varieties (Gala and Fuji) showed that 30 days after inoculation with P. expansum at 25°C, patulin levels reached a concentration of 2,400 µg/l in the Fuji variety and 325 µg/l in the Gala variety. Comparing the same varieties but with different incubation conditions, our results similarly showed higher patulin concentrations in the Fuji variety (6,144 µg/l, after 21 days of incubation at 20.5°C) than in the Gala variety (66 µg/l, after 21 days of incubation at 20.5°C). However, our results showed (in a shorter period of time and a lower temperature of incubation) that P. expansum produced 2.5 fold more patulin in the Fuji variety than in the former study. This may be explained by differences in the patulin production of the P. expansum strain used in both studies as well as variations in apple characteristics such as maturity and acid levels which may influence the propensity for patulin production by P. expansum.

The maximum limit allowed for patulin in the U.S. is 50 ppb (41). This study showed that 44% of the samples analyzed contain patulin levels exceeding 50 ppb and the concentration of this mycotoxin in some samples was approximately 1,000 fold higher than the allowed limit. Table 1 shows the high levels of patulin produced by P. expansum in McIntosh and Golden Supreme after 35 days of incubation, and also for McIntosh after 59 days of incubation.

Considering the high concentrations of patulin that were found in many of the samples incubated at 20.5ºC, we can conclude that the presence of those contaminated apples among sound apples designated for juice or cider production could result in patulin levels exceeding the allowed limit established (50 ppb). In Table 1, from the 16 apples analyzed, 7 (44%) indicated patulin concentrations from 6,000 to 50,000 ppb. If only one of these apples was processed with 100 and 1,000 sound apples respectively, the resulting juices would contain patulin concentrations above the regulatory upper limit of 50 ppb. Effective and meticulous culling of apples is essential to control excessive levels of patulin in processed apple products. Previous studies have suggested that patulin may diffuse to healthy tissue and that cutting or trimming infected portions of the apple flesh may be insufficient to reduce patulin levels to an acceptable level in the fruit (22, 31, 38). Marín et al. (22) identified the importance of

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adequate handling aimed at avoiding damaging the apples prior to processing, since patulin concentrations in both portions (decayed and sound) of the apples was dependent on the diameter of the damaged areas. Moreover, bruises, skin breaks, and other physical damage within these apples provide a point of entry for P. expansum (25). That damage in the fruit is generally associated with insect injury, storm damage, and handling procedures (19). Hassan (15) showed that the spoilage of apples by fungi was accompanied with the production of mycotoxin and that patulin represented the main toxin in the lesion and other parts of brown rotten fruit. Thus, considering this information and the FAO recommendation (12), monitoring of fruit quality during reception is the first control measure for patulin reduction. Apples of inferior quality (dropped or damaged fruit but not rotted) should be processed immediately, as extended storage or inadequate refrigeration during storage will lead to mold growth and thus, the potential for patulin production. In a study by Jackson et al. (19), patulin was not detected in cider from culled, tree-picked apples stored 4 to 6 weeks at 0 to 2°C, but patulin was detected (1 to 64 µg/kg) in stored, tree-picked, unculled fruit.

Our investigation also indicated some rotted samples incubated at 20.5ºC for 59 days (Golden Supreme), 80 days (McIntosh) and 93 days (McIntosh and Fuji) contained no detectable amount of patulin. In these samples, it was noted that in addition to mold growth, yeast spoilage was also occurring, since there was a strong yeast odor associated with these apples. Our first impression was that in these samples the patulin produced might be inactivated by the yeast growth occurring in the rotted apples. In order to confirm this fact, a juice with a known patulin concentration, was inoculated with a strain of yeast and allowed to ferment. The patulin concentration in the unfermented juice was found to be 288 ppb but no patulin was detected in the sample that had undergone yeast fermentation. It is likely that the yeast contained in the rotted apples destroyed the patulin that was present in rotted apples. In accordance with our results, Stinson et al. (35) also observed that patulin levels were reduced by more than 99% from their original amounts during alcoholic fermentation. However, the disappearance of patulin during alcoholic fermentation does not necessarily eliminate the potential health hazard incurred by its initial presence since it can be converted to other degraded forms or compounds during alcohol fermentation which have also shown to possess varying levels of toxicity (35).

161

The results of this study indicate that storage temperature is an important variable for the production of patulin in infected apples when stored for extended time periods prior to processing. Similar findings were reported by Sydenham et al. (37) where after 7 days of storage at ambient temperature, the mean concentration of patulin was 90 µg/ml and after 15 days and 33 days of storage, the mean accumulation of patulin was 395 µg/ml and 2,445 µg/ml, respectively. Therefore, storage temperature of apples prior to processing should be controlled and lack of refrigerated storage will result in high levels of patulin in the finished juice. In summary, the culling process to remove damaged or rotted fruit prior to storage and juice extraction is a critical step to reduce the levels of patulin in finished processed apple products. Cool storage (11°C) did not prevent patulin accumulation but yielded lower levels of patulin than in juice made from apples stored at 20.5°C. Refrigerated storage of fruit is an effective control practice to reduce patulin levels in combination with effective culling practices prior to juice extraction. However, over extended refrigerated storage can increase patulin levels in apples. It was observed that apple varieties have differing susceptibilities to P. expansum. Of the six varieties tested, Red Delicious and Empire were less susceptible to P. expansum degradation and consequently resulted in lower levels of patulin in their respective juices, whereas, Golden Supreme and McIntosh were the most susceptible and yielded high patulin levels at both storage temperatures. Based on our findings, the presence of a single P. expansum rotted apple in 1,000 sound apples can result in juice that exceeds the regulatory action limit of 50 ppb. Therefore, the starting fruit quality, storage conditions and meticulous culling practices are essential for controlling patulin in finished apple products.

ACKNOWLEDMENTS We gratefully acknowledge the Capes Foundation (Brazil) for the financial support of Beatriz de Cássia Martins Salomão for her Ph.D. studies and the New York State Agricultural Experiment Station (Geneva, NY) for funds to carry out this research. The authors would also like to thank David Manns for the assistance with the manuscript preparation.

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4.6 Development of a sampling plan at apple receiving step for patulin control in concentrated apple juice Foi verificado que o fungo P. expansum pode produzir patulina mesmo à baixas temperaturas. Assim sendo, tornou-se importante conhecer a carga de patulina presente nas frutas que chegam para o processamento, tanto na época da safra (vindas direto do campo para a fábrica) quanto na entressafra (após o armazenamento refrigerado). Visando conhecer as condições reais de processamento, este trabalho pretendeu ir a campo e buscar informações que pudessem ser usadas como base para as indústrias processadores do suco. Desta forma, o trabalho englobou o estudo da seleção dos lotes de maçãs durante o recebimento, de forma a garantir que produto final estivesse dentro dos padrões internacionais para níveis de patulina. Além disso, o processo de desinfecção foi extensivamente estudado.

Research Paper Development of a sampling plan at apple receiving step for patulin

control in concentrated apple juice Beatriz C. M. Salomão1, Chalana Müller1, Hudson C. Amparo, Gláucia

M. F. Aragão1*

1 Department of Chemical Engineering and Food Engineering, Federal University of Santa Catarina, UFSC, Florianópolis, SC 88040-900,

Brazil *Phone: (55) 48 37219448, r. 245; Fax: (48) 48 3721 9687

Abstract Patulin (PAT) is a mycotoxin that can be found in apple juice produced from rotten apples contaminate by P. expansum. The aim of this study was to assess strategies to reduce PAT by monitoring lots of apples during reception and also determining the effect of wash treatments. PAT was not detected in all lots analyzed throughout the harvest season. However, 86% of lots from off-season yielded > 50 ppb of PAT. During the receiving step, samples (50 apples) from each lot were visually analyzed and the sampling plan indicated that lots should be rejected if more than 8 rotten apples were found, because the risk of > 50 ppb of PAT in the final product. Wash treatments reduced PAT levels by 64 to 100%, but the toxin was transferred to the water.

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However, the use of 25 ppm of sodium dichloroisocyanurate proved to be efficient at reducing 100% of PAT in aqueous solution. Keywords: apple juice concentrate, patulin, receiving step, wash step, sampling plan. 1 Introduction PAT is a mycotoxin produced primarily by Penicillium expansum, the mold most commonly found in apples. Normally, fungal growth results in a substantial fruit loss due to soft “blue mold rot” decay. High levels of PAT can be found in apple juice produced from P. expansum-rotten apples, increasing the risk for their consumers (Drusch & Ragab, 2003; Moake, Padilla-Zakour & Worobo, 2005; Sant’Ana, Rosenthal & Massaguer, 2008; Doores, 1983; Lai; Fuh & Shih, 2000). Human exposure to PAT via consumption of infected products may result in severe toxicosis. According to Liu et al. (2003), PAT has the ability to cause oxidative damage to the DNA in human cells, which plays a role in mutagenesis and cancer initiation. In animals, PAT has exhibited chronic effects including teratogenicity (Roll, Matthiaschk & Korte, 1990), neurotoxigenicity (Hopkins, 1993) immunotoxicity (Escoula, Thomsen, Bourdiol, Pipy, Peuriere & Roubinet, 1988; Sharma, 1993), as well as acute intoxications (Sant’Ana et al., 2008; Devaraj, Shanmugasundaram & Shanmugasundaram, 1986; McKinley, Carlton & Boon, 1982; Gashlan, 2008). Apples not approved by the rigid selection criteria for fresh fruit consumption (around 15-30% of the apples produced in Brazil) are used for juice processing and the majority (90%) of concentrated apple juice produced in Brazil is exported, mainly for U.S. (Nogueira, Teixeira, Demiate & Wosiacki, 2007). International regulatories agencies advisory maximum level for apple juice is 50 ppb of PAT (Codex, 2003; FDA, 2001a). Considering this toxin’s serious heath risk, particularly to children whom have been shown to consume increased levels of apple products (Moake et al., 2005), some U.S. juice importers may require lower PAT levels which are based on the maximal daily intake of 0.4 µg/kg body weigh for PAT (WHO, 1998; FDA, 2001b) and also on the Europe regulation (Europe Union, 2003) which has recommended a maximum level of 25 ppb (for solid apple products) and 10 ppb (juice or foods for infants). Therefore, this mycotoxin is the primary barrier for apple juice exportation (Barkai-Golan & Paster, 2008) forcing exporters

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to assess their techniques and strategies to successfully produce apple juice concentrate below the control limits set for this toxin. Surveys on the incidence of PAT in apple products have been conducted in many countries like as Italy (Beretta, Gaiaschi, Galli & Restani, 2000; Ritieni, 2003; Piemontese, Solfrizzo & Visconti, 2005), the United Kingdom (Montimer, Parker, Shepherd & Gilbert, 1985), Spain (Murillo-Arbizu, Amézqueta, González-Peñas & Cerain, 2009), Turkey (Gökmen & Acar, 1998; Yurdun, Omurtag & Ersoy, 2001), Brazil (Sylos & Rodriguez-Amaya, 1999), South Africa (Leggot & Shephard, 2001), Belgium (Tangni, Theys, Mignolet, Maudoux, Michelet & Laromdelle, 2003; Baert, De Meulenaer, Kamala, Kasase & Devlieghere, 2006), Iran (Cheraghali, et al. 2005), Japan (Watanabe & Shimizu, 2005), Argentina (Funes & Resnik, 2009), the USA (Trucksess & Tang, 1999) and Australia (Burda, 1992). In all countries were detected samples contaminated by PAT. In those studies, levels of this mycotoxin in apple products have been found up to 1150 µg/l. Several methods for reducing PAT levels in apple juice have been studied, but its presence in those products commercialized throughout the world indicates that, to a certain extent, this mycotoxin is stable during the manufacturing process including heat treatments (Huebner et al., 2000; Gökmen, Artık, Acar, Kahraman & Poyrazoglu, 2001; Lovett & Peeler, 1973); Worobo & Splittstoesser, 2005; Harrison, 1989). Levels of PAT in fruit products can be reduced by removing decayed fruit or by trimming moldy portions of apples prior to processing (Lovett, Thompson & Boutin, 1975; Sydenham, Vismer, Marasas, Brown, Schlecter & Rheeder, 1997; Taniwaki, Hoenderboom, De Almeida Vitali & Eiroa, 1992). Another recent study (Salomão, Aragão, Churey, Padilla-Zakour & Worobo, 2009) showed that culling of apples is essential for good juice quality, since high PAT amounts in some apples varieties could result in a level greater than 50 ppb in the finished product, even when only one contaminated apple occurs in 1,000 apples. The Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO, 2003) and the United States Food and Drug Administration (FDA, 2002) have recommended the adoption of the Hazard Analysis and Critical Control Points system (HACCP) to guarantee mycotoxin amounts under the regulatory action level. Sorting to remove visibly moldy apples during the process is a recommended critical control point (CCP) that will make a contribution towards achieving acceptable levels of toxin in the final product (FAO, 2003). However, this process is labor intensive, not automated and, sometimes, the corrective action can imply in a rejection of the entire juice load.

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Besides, this operation will increase costs forcing small-scale producers, who cannot afford these losses, to the point that many may cease operating (Moake et al., 2003). In addition, PAT can be detected in visibly sound fruit (Jackson et al., 2003) and may be present even after the rotten parts has been removed, since it can spread from damaged areas into sound areas (Beretta et al., 2000; Taniwaki et al., 1992; Rychlik & Schieberle, 2001; Barkai-Golan et al., 2008). Although sorting or trimming moldy apples during the process appears to be one of the most important methods for reducing PAT in juice (Jackson et al., 2003), it is clear that successful PAT control will most likely result, not from a single treatment, but from a combination of control measures throughout the production process (Moake et al., 2005). With this affirmation in mind, this work focuses in the investigation of another measure not yet studied. The apple receiving step should also be considered a very important point to minimize PAT contamination into juices since the quality of the fruit will be assessed before they enter the processing line and not after the production has started. Post-production inspection of the fruit can lead to great economic losses because, in this case, juice has been processed and may be discarded. According to FAO (2003), lots with a high percentage of damaged and rotten fruit should to be avoided, even with a sorting step, because it will be extremely difficult to sort manually, and a high level of PAT will likely be present in the finished product. However, even now, there are no studies appointing measures for monitoring the quality of lots at the receiving step. In addition, the real risk of PAT at this point of production has not yet been investigated. Therefore, this investigation was carried out to develop a sampling plan which provides a basis to be used in juice manufacturing industries to yield a final product containing a toxin level below the amount limited by regulatory agencies. This study also was interested in elucidating the effect of wash and sanitizer treatments on reducing PAT in fruits and water wash, since few findings were published on this issue (Jackson et al., 2003; Sydenham et al., 1997; Sydenham et al., 1995; Acar et al., 1998). Furthermore, little is known about differences in PAT levels between harvest season and off-season. The specific objectives of this study were (i) to determine PAT levels in non-stored apples (harvest season) and refrigerated stored apples (off-season); (ii) to determine a method for sorting apple lots in the receiving step, in order to produce juice within the PAT levels set by regulatory agencies (≤ 50 ppb) and (iii) to determine the effectiveness of apple wash or sanitizer treatments are effective in reducing PAT levels.

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2 Material and Methods 2.1. Apple sorting lots study (Receiving step) This study was carried out inside a concentrated apple juice manufacturing facility located in the Brazil. A total of 23 lots of apples were taken and analyzed for their PAT levels. Additionally, the relationship between the number of rotten and sound apples was verified to develop a sampling plan for sorting lots at the receiving step in order to guarantee the action level of 50 ppb of PAT (Codex, 2003; FDA, 2001a). Apples from Fuji and/or Gala varieties were supplied by orchards (during harvest season, from March to May) and by a packing house after a period of refrigerated storage (during off-season, from July to October). The apple lot size was based on the weight of fruit delivered in trucks (from 15,000 kg to 27,000 kg of apple). Considering 0.130 kg as the weight of a single apple, the lot size (in numbers of apples) were established to be approximately 110,000 to 200,000 apples. Each lot was analyzed under inspection by attributes and classified as acceptable or unacceptable on basis of the number of nonconforming apples. Nonconforming apples were defined as rotten apples with a lesion size ≥ 4 cm. Initially, the sampling plan was based in both Brazilian (NBR 5426) and American (MIL STD 105D) normative reference (Costa, Epprecht &Carpinetti, 2005) and an acceptable quality level (AQL) of 15% (based in the industry backgrounds) was chosen. Considering the number of apples delivered in trucks, a representative sample size should be 50 apples. From this sample, a lot acceptable for further processing should contain up to 11 rotten apples. From each sample the juice produced as explained in section 2.5. 2.2. Hypothetic lots study (Receiving step) Some fruits were assembled to compose a sample (of 50 apples) in order to determine the PAT levels in different combinations of sound and rotten apples. These combinations are explained bellow. (i) Considering a lesion size ≥ 4 cm, PAT levels were tested in samples

of 50 apples with the following combinations: 5 (rotten) + 45 (sound); 8 (rotten) + 42 (sound) (duplicate trial); 11 (rotten) + 39 (sound) (duplicate trial); 13 (rotten) + 37 (sound) and 16 (rotten) + 34 (sound). Each combination of 50 apples was pressed for juice as

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explained in section 2.5. (ii) Considering a lesion size < 4 cm, PAT levels were tested in samples

of 50 apples with the following combinations: 8 (rotten) + 42 (sound) (duplicate trial); 11 (rotten) + 39 (sound) (duplicate trial) and 16 (rotten) + 34 (sound). Each combination of 50 apples was produced as explained in section 2.5.

(iii) Fruits were assembled to compose a sample with rotten apples highly contaminated with a heavy load of visible P. expansum growth: 11 (rotten) + 39 (sound) (duplicate trial); 18 (rotten) + 32 (sound) and 32 (rotten) + 0 (sound) apples. From each sample (50 or 32 apples) the juice was produced as explained in section 2.5.

(iv) Three samples of sound apples without any visible mold damage were assembled (50 apples by sample) and the juice was prepared as explained in section 2.5.

2.3. Wash and sanitizer treatment study (Wash step) (i) The first study was developed during juice processing at the wash

treatment step in order to evaluate the effectiveness of a high-pressure water in removing the toxin. From each lot received, a sample of 50 apples was taken before and after the wash step. The 50 apples sampled after and before treatment, were singly pressed and the juice was extracted as explain in section 2.5.

(ii) Four samples (250 ml) of water used during wash treatment were collected from the reservoir (which stores recycled water) for PAT analysis. Samples were frozen at -18ºC until analysis.

Other two wash investigations were undertaken to analyze the efficacy PAT reduction due to sanitizer treatments. One study was conducted in aqueous solution and another one on the apple surface.

The sanitizer solutions were prepared from sodium dichloroisocyanurate (Sumaveg®, Jonshon Diversey, São Paulo, Brazil) and peracetic acid-based sanitizer (Tsunami 100®, ECOLAB, São Paulo, Brazil). Concentrations of the sanitizing solutions were confirmed using test strips for free chlorine (Test Systems Inc., Rock Hill, SC, USA) and peracetic acid (Weber Scientific, Chestertown, Md, USA).

(iii) This investigation evaluated the efficacy of the sanitizer in reducing PAT in aqueous solution. In a 100 mL volumetric flask 1 ml of PAT solution (called stock solution B – section 2.7) was added and the remaining volume was supplemented with solutions of chlorine (0,

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25, 50, 100 and 200 ppm) and peracetic acid (0, 80 and 100 ppm). Immediately, each sample (duplicate trial for each sanitizing concentration) was frozen at -18ºC and sent to an external laboratory for PAT analyzes.

(iv) This investigation evaluated the efficacy of the sanitizer in reducing PAT on apple surface. Fuji apples purchased from a local market were submitted to the following procedures: first, fruits were washed in tap water and subsequently in sterile distillated water then dried using cheesecloth. Each apple was placed inside a laminar flow hood with the stem up and 100 µl of synthetic PAT stock solution (called stock solution A – section 2.7) was deposited on the skin surface area around the stem. Inoculated apples were left to dry for 1 h to allow for PAT fixation. The trials were performed in duplicate. Each apple was placed in a sterile bag and 100 ml of chlorine solution (0, 50, 100 and 200 ppm) were added. Each apple in the bag was massaged for 30 s or 2 min by hand and then, the solution was immediately transferred to a second recipient containing 5 ml of 0.6% sodium thiosulfate in order to stop the sanitizer action. The resulting solution was immediately frozen at -18ºC and sent to an external laboratory for PAT analysis.

2.4 Pressed apple juice analyses (Pressing step) A parallel study was conducted in order to investigate PAT levels in the pressed juice. According to the flow of the production process, after wash treatment, the apples are ground and then, are conduced to the stage of pressing. Therefore, during the pressing step, four samples of the resulted juice were taken. After this stage the juice were conduced to the subsequent steps, but no more samples were taken. Each sample was treated as described in section 2.5. 2.5 Preparation of samples for patulin analysis Each sample of apples were pressed though a centrifuge, and the resulting juice was treated enzymatically (Pectinex®, YieldMASH, Novozymes) for juice extraction and heated up to 80ºC to decontaminate and avoid further fermentation and consequently PAT degradation. Subsequently, each sample was filtered though a homemade filter and the resultant product was immediately frozen at -18ºC and send for PAT

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analysis through an external laboratory (The National Food Laboratory, Dublin, CA, US). Samples from wash or sanitizer treatments were also frozen at -18ºC and sent for PAT analysis to the same external laboratory cited previously or to Laboratório de Análises – LABCAL, Federal University of Santa Catarina, Florianópolis, Brazil). 2.6 Patulin analysis The methodology used was the official method adopted by AOAC for apple juice (method 995.10) (FDA, 2001a, Brause, Trucksess, Thomas & Page. 1996). Results were expressed as µg/l or parts per billion (ppb). The limit of detection was 10 ppb. 2.7. Patulin standard solution PAT was purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo, USA). A stock standard solution was prepared by dissolving 3 mg of pure crystalline PAT in 10 ml of distillated water (stock solution A). Another stock solution B was prepared by diluting (10 times) the stock solution A. The standard solutions were kept frozen at -18 C until used. 3. Results and Discussion Table 1 shows PAT levels found in samples of apples taken from 23 different lots during harvest season (March to May) and off-harvest season (July to October). No PAT was found in any of the nine lots (lots from 1 to 9) tested throughout the harvest season (Table 1). Therefore, there is no evidence that juice produced during the harvest season may be contaminated with this toxin. However, from the 14 lots of apples sampled in off-season (lots 10 to 23), 12 lots (86%) yielded PAT levels greater than 50 ppb (Table 1). Additionally, only during the off-season, blue moldy apples showed up and one of those colonies was identified (in another study) as P. expansum. Therefore, this mold showed its ability to grow during the storage time under refrigeration (0ºC) and, subsequently, to produce the toxin. As observed in other studies (Salomão et al., 2009; Jackson et al., 2003), storage at low temperatures was not enough to avoid both blue mold growth and PAT production. As observed throughout the test, apples with visible P. expansum development produced substantial levels of PAT. For example, during the sampling of the lot 23, severely damaged apples showed evidence of mold development resulting in

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550 ppb of toxin. The extended time of storage during off-season further contributes in both P. expansum and mycotoxin production, since the longer the storage of the apples, the greater the risk of increased PAT content. Juice producers in the U.K. also observed dramatic rises of PAT in the months just prior to the new harvest season where apples have been stored for almost a year (Moake et al., 2005). During the off-season, the packing house supplied the manufacturing industry with stored fruits rejected by the fresh fruit market. In several cases, it was observed that apples used for juicing were not processed as soon as received in the factory and sometimes, fruits waited to be processed (on the trucks or on the receiving platforms) more than 5 days at room temperatures. In addition, usually apples removed from cold storage in packing houses can wait around 3 to 4 days before transportation to a juicing facility (personal information). This procedure probably leads to high PAT production. Studies made in apples that were taken out from cold storage (Morales, Marín, Centelles, Ramos & Sanchis, 2007) showed that PAT amounts significantly increased on the 2nd day at 20ºC. Besides, the same investigation confirmed that lesion size can increase fast during deck storage, since they observed a significant expansion from 2 cm rot damage to 5 cm by the 5th day. Therefore, is important to estimate the capacity for juice processing and also the quality of apples entering in the manufacturing plant in order to program or avoid deck storage and minimize PAT accumulation, since rapid mold development occurs when fruits are transferred to a warm environment (Morales, Marín, Rovira, Ramos & Sanchis, 2006). Ideally, apples should be maintained under refrigeration (<10ºC) throughout storage at the manufacturing industry until processed. When refrigerated storage is not possible, then time must be minimized for a maximum of 48 hours of storage at ambient temperature (FAO, 2003). The test to evaluate PAT amounts in the three samples of 50 sound apples (without any visible mold damage) showed the following results: 36 ppb, 15 ppb and nondeductible level. PAT production is common in molded fruit. However, findings of this investigation showed, as described by Jackson et al. (2003), that PAT can also be detected in visually sound fruit. Table 2 shows PAT levels in samples (50 apples) assembled with different combinations of sound and rotten apples with lesions < 4 cm, ≥ 4 cm (i.e. Fig. 1a; 1b) or combinations of sound apples and moldy apples with a visibly high load of P. expansum development (i.e. Fig. 1c; 1d).

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This study showed that fruits with lesions < 4 cm yielded less than 50 ppb of PAT even when 11 or 16 rotten apples were pressed with more 39 or 34 sound fruits, respectively (Table 2). These findings indicated that fruits with less than a 4 cm lesion should not be considered rotten, unless they show visible development of “blue mold rot” (i.e. Fig. 1e). Similar findings has been reported showing that no PAT was produced during a short cold storage (6 weeks) in decayed apples with lesions smaller than 3.5 cm (Morales et al., 2007) and that PAT is primarily produced when apples were further kept at room temperature. The same investigation observed that apples with initial lesion size of 4 cm accumulated significantly greater amounts of PAT (368 ppb) than the rest with lower lesion size. Amounts of PAT in apples were correlated with the extent of rotten areas, since very high levels of this toxin (greater than 1,700 ppb) were detected when rotten apples with a visibly high load of P. expansum were processed together with sound apples (Table 2). It suggests that the mold itself has both a wide ability to develop very well in this substrate (apple) and produce secondary metabolites as described by Barkai-Golan et al. (2008). Rotten apples with lesions bigger than 4 cm yield less than 50 ppb of PAT when 5 or 8 rotten apples were processed along with 45 or 42 sound apples, respectively (Table 2). However, when 13 or 16 rotten apples were pressed together with 37 or 34 sound apples, respectively, the PAT content was higher than the allowed concentration (222 and 110 ppb, respectively). Table 2 shows that a combination of 11 rotten + 39 sound apples yield 269 ppb in the first trial but the toxin was undetected in the second one. Therefore, if 11 rotten apples were found in a total of 50 apples, probably the lot evaluated will result in a risk of unacceptable levels of toxin in the final juice. Considering apples with lesions greater than 4 cm, results showed that 8 rotten + 42 sound apples may results in a safe lot producing juice most likely under the action toxin level (Table 2). Therefore, lots should be accepted if 8 or less rotten apples are found in a representative sample of 50 apples. However, if 9 or more rotten apples are found in 50 apples, the lot should be rejected. In order to improve the confidence of this sampling plan, a duplicate trial is suggested. Then, if results found in the first and second trials lead to the same conclusion, it will be the final decision. However, if the first and second trials show different conclusions, it will be necessary to reanalyze (triplicate trial) the lot to determine the final conclusion. In case of a triplicate sample, the decision should be made on the similar duplicate result. This sampling

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plan is just necessary in the off-season since there is no evidence of PAT in the harvest season. Here, the risk of toxin contamination can be minimized by culling apples during the wash step and also by monitoring the accuracy of pasteurization treatment step in order to destroy P. expansum spores. Table 3 shows the effect of wash treatments (using high-pressure water) in decreasing PAT levels from fruits The wash treatment step could efficiently decrease PAT content from 64% up to 100% from its initial concentration (Table 3) since the soft damaged area was removed by spraying high-pressure water against apples. Sydenham et al. (1995) found that PAT levels in cider decreased from 920 to 190 ppb after a wash treatment step (reduction of approximately 80%). Washing with high-pressure water has been shown to reduce PAT levels within the apple juice by 21% to 54% (Acar et al., 1998). Another study observed that while non-processed fruit reached 90, 395 and 2245 ppb of PAT after 5, 15 and 33 days of deck-storage (room temperature), values decreased to 75, 100 and 695 ppb, respectively, after the washing stage (Sydenham et al., 1997). All PAT levels present in the fruit could not be removed in most of the experiments probably because in apples this toxin can diffuse from rotten core areas into sound areas up to 1 to 2 cm, so that PAT can be present in some degree even after the rotten area has been removed (Beretta et al., 2000; Taniwaki et al., 1992; Rychlik & Schieberle, 2001). Figure 1f clearly shows the difference between fruits after and before wash step. On the other hand, wash treatment may also serve as a source of water contamination. Results showed patulin contamination in wash water was from 24 ppb to very high levels of 353 and 444 ppb (Table 4). During wash treatment, PAT present in the rotten parts was leached by pressure spray and was transferred to the water phase. Therefore, the cyclic system of water can provide a source of PAT and also fungal inoculum in poorly sanitized water. FAO (2003) stated that PAT levels will be reduced at this step, but spores will be suspended in the water and will increase the risk of mould growth during bulk storage. A parallel study was conducted in order to investigate PAT levels in the extracted juice during the pressing step. Although after this stage, the extracted juice is conduced to the subsequent steps, only were analyzed samples on the pressing stage. The results showed levels of 30 ppb (8:30 am), 29 ppb (9:30 am), 51 ppb (10:15 am) and 22 ppb (11:30 am) of PAT, respectively. The presence of this toxin in the pressed juice indicated that low quality raw material was used.

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Besides, the results stated that the juice at the beginning of process was contaminated reaching 51 ppb in one sample. Then, subsequent stages should contribute to PAT reduction in order to the final product not exceed the maximum allowed level established for apple products intended for children (10 ppb). Table 5 shows the first report of an experiment to evaluate the efficacy of direct contact between aqueous sanitizer solutions and PAT. Findings showed that, unlike the peracetic acid, all sodium dichloroisocyanurate solution tested (25, 50, 100 and 200 ppm) were efficient to completely destroy the toxin present. Therefore, the use of an organic chlorine solution at 25 ppm can be an alternative for drastically reducing PAT from the water used for handling and washing apples. Furthermore, chlorination of water may be a good option not only to destroy PAT, but also to control Penicillium expansum growth. An investigation showed that acidified sodium hypochlorite at 50 ppm/30s resulted in 2.5 decimal reductions of the P. expansum spores on Fuji apple surfaces (Salomão, Aragão, Churey & Worobo, 2008). Another study (not yet published) also proved that sodium dichloroisocyanurate at 25 ppm/6 min reduced more than 6 cycles of its spores in aqueous solution. The test to verify the efficacy of sanitizer solutions in reducing PAT adhered on the apple surface showed that sodium dichloroisocyanurate was able to reduce PAT by 47.5% to 74.8% (Table 6). In this test, the time of contact between sanitizers and PAT was short (30 s and 2 min), most likely causing less reduction than the test in aqueous solution. Another study (Jackson et al., 2003) tested the efficacy of apple wash treatments using 100 and 200 ppm of chlorine. The authors observed a reduction of PAT levels in the cider from 10% to 100%, depending on the initial PAT levels and the type of wash solution used. 4. Conclusions In harvest season P. expansum was not visually found in apples, since the mold did not have enough time either to grow or produce PAT. However, stored apples from the off-season showed visible blue mold contamination which may bring a risk of PAT presence above internationally established safe limits. This results in a sanitary barrier for apple juice exportation.

181

Results showed that only apples with lesions greater than 4 cm or those with visible P. expansum development should be considered rotten. In the off-season, the receiving step should be monitored to avoid accepting lots meant for juice processing that contain a high proportion of rotten fruit. A sampling plan, developed in this investigation, suggest that a risk of PAT levels rising above 50 ppb will exist if more than 8 rotten apples (lesions ≥ 4 cm) are found in a sample of 50 apples. A sampling plan of lots in the receiving step will also help processors to assess the quality of fruits and to adjust deck storage accordingly, with the aim to minimize PAT accumulation. During wash treatments, the high pressurized water removed the soft damaged areas and reduced their PAT amount by 64 to 100%. However, this process transferred PAT to the water, which probably implies a risk of cross-contamination. Subsequently, this study suggests the use of 25 ppm chlorine in the water destined for apple handling as an alternative to reduce both PAT and P. expansum spores (Salomão et al., 2008). However, the use of organic chlorine compounds, like as sodium dichloroisocyanurate, is recommended since they are less susceptible to inactivation by organic matter (Russel, Hugo & Aylife, 1992). As a conclusion, control measures in the first step of production (receiving step) may provide one of the most important sources for effective PAT reduction in the final product because, once rotten apples are present after processing has been started, it will be extremely difficult to sort them manually, and will likely be arduous to attain the acceptable level of PAT in the finished product. Acknowledgements The authors gratefully acknowledge the Capes Foundation (Brazil) and CNPQ (National Counsel of Technological and Scientific Development, Brazil) for Beatriz C. M. Salomão and Chalana Müller scholarships, respectively. Besides, we would like to thank David C. Manns for assistance with the manuscript preparation. References Acar, J., Gökmen, V., & Taydas, E. E. (1998). The effects of processing technology on the patulin content of juice during commercial apple juice concentrate production. Zeitschrift fur Lebensmittel–Untersuchung

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a b c

d e f

a b c

d e f Figure 1. Pictures from apples obtained during the study and their different kinds of lesions. (a) apple with a lesion < 4 cm (not considered rotten apple); (b) lesion > 4 cm (considered rotten apple); (c ; d) lesion showing a heavy load of visible P. expansum damage (leading to a high risk of PAT contamination); (e) small lesion but with mold development (considered rotten fruit); (f) apple before wash treatment showing rot damage (left) and apple after wash treatment with high-pressure water spray showing removal of rot damage area (right).

c

f

188

Table 1 - PAT concentration (ppb) in apples sampled from lots taken during the harvest season (March to May) and off-season (July to October) and the relationship between rotten and sound apples in each lot

PAT concentration (ppb) March April May July August September October Lot 1 Nd

(11 rotten)*

Gala***

Lot 4 Nd

(20 rotten)*

Fuji

Lot 7 Nd (11

rotten)*

Fuji

Lot 10 34

(16 rotten)*

Fuji

Lot 12 67

(26 rotten+74

sound)**

Fuji

Lot 16 51

(16 rotten)*

Fuji

Lot 19 226

(16 rotten)*

Fuji

Lot 2 Nd

(9 rotten)*

Gala

Lot 5 Nd (26

rotten+74

sound)**

Fuji

Lot 8 Nd (11

rotten)*

Fuji

Lot 11 387

(18 rotten)*

Gala

Lot 13 78

(23 rotten)*

Fuji

Lot 17 71

(16 rotten)*

Fuji

Lot 20 25

(17 rotten)*

Fuji

Lot 3 Nd

(10 rotten)*

Gala

Lot 6 Nd

(29 rotten)*

Fuji

Lot 9 Nd

(8 rotten)*

Fuji

- Lot 14 101

(17 rotten+83

sound)**

Fuji/Gala

Lot 18 73

(18 rotten)*

Fuji

Lot 21 233

(16 rotten)*

Fuji

- - - - Lot 15 104

(11 rotten)*

Fuji

- Lot 22 120

(16 rotten)*

Fuji - - - -

-

- Lot 23 550

(16 rotten)*

Gala Nd: Non detectable level of PAT (detection limit = 10 ppb). *Relationship between rotten and sound apples in a representative sample of 50 apples. **From 12 to 15 rotten apples, the lot should be recounted (total sample = 100 apples) and more than 16 rotten apples leaded to a lot rejection (according to the regulation which this plan was based). ***Apple variety analyzed.

189

Table 2 - PAT concentrations (ppb) from hypothetic combinations of sound and rotten apples with lesion sizes < 4 cm, ≥ 4 cm or lesions with a high load of visible P. expansum damage

Number of rotten aples

in 50 apples

PAT (ppb)

Number of rotten aples in 50 apples

PAT (ppb)

Number of rotten

aples in 50 apples

PAT (ppb)

Size lesion < 4 cm Size lesion ≥ 4 cm Lesion with a high load mold development*

8a Nd 5a 27 11 1741 8b Nd 8a 20 11 1866

11a Nd 8b Nd 18 2673 11b Nd 11a 269 32 2121 16a 17 11b Nd

13a 222 16a 110

Nd: Non detectable level of PAT (detection limit = 10 ppb). a: Samples of Fuji variety taken from Lot 19. b: Sample of Fuji variety taken from Lot 22. *Samples of Gala variety collected directly from a packing house (4 months of storage) in June (off-harvest season).

Table 3 - Effects of wash treatments (high-pressure water) on PAT levels. Samples have been taken after and before wash step

PAT (ppb) Month May July September October Variety Fuji Gala Fuji Fuji Fuji Fuji Fuji Gala Before wash

15 48 3772* 71 73 233 120 550

After wash Nd 17 361 14 22 12 Nd 31 PAT Reduction

100.0 %

64.6 %

90.4 %

80.3 %

69.8 %

94.8 %

100.0 %

94.4 %

Nd: Non detectable level of PAT (detection limit = 10 ppb). *Test made only with rotten apples

190

Table 4 - PAT levels of water used during wash treatment

Water Sample* Time (h)*** PAT (ppb) Transportation water** 8:20 am 444 Transportation water 9: 30 am 28 Transportation water 10:30 am 353

Wash water*** 9:00 am 36 Wash water 10:30 am 24

*Samples were collected from the reservoir which stores recycled water. **Water used to move apple to the next wash step and also to remove gross filth. ***Water pressured against apple during wash treatment (collected from the reservoir which stores recycled water). Ps. This production occurred from 8:00 to 11:30 am, during the off-season (October). Table 5 - Effect of sanitizing aqueous solutions on PAT reduction. Chlorine solution (sodium dicloroisocyanurate) and peracetic acid (PA) solution

Chlorine (ppm)

PAT reduction after Chlorine treatment (%) PA (ppm) PAT reduction after

PA treatment (%) 25 100.0 (1) 80 PA (1) 61.1 25 100.0 (2) 80 PA (2) 56.6 50 100.0 (1) 100 PA (1) 14.0 50 100.0 (2) 100 PA (2) 41.9 100 100.0 (1) 100 100.0 (2) 200 100.0 (1) 200 100.0 (2)

(1)first trial of the same test. (2)second trial of same test.

191

Table 6 - Effect of chlorine solutions on PAT reduction from the apple surface after 30 s or 2 min of contact. Chlorine solution (sodium dicloroisocyanurate)

Chlorine (ppm) Time of contact PAT reduction after chlorine treatment (%)

50 30 s (1) 62.6 50 30 s (2) 66.4 50 2 min (1) 73.3 50 2 min (2) 73.4 100 2 min (1) 47.5 100 2 min (2) 51.6 200 30 s (1) 74.8 200 30 s (2) 71.8 200 2 min (1) 73.3 200 2 min (2) 57.3

(1)first trial of the same test. (2)second trial of same test. PS.A duplicate trial test verified that sodium thiosulfate 0.6% (used to neutralize sanitizers) had any influence in the PAT reductions observed.

CAPÍTULO 5 CONCLUSÕES Através deste estudo, que teve como objetivo geral detectar patulina em maçãs e avaliar do processo de lavagem/desinfecção das frutas destinadas à produção de suco foi possível tirar as seguintes conclusões:

Três micro-organismos foram considerados os mais relevantes no processo produtivo de suco concentrado de maçã: P. expansum, devido à sua alta incidência e capacidade de produzir patulina em maçãs. B. fulva que demonstou alta termorresistência por sobreviver aos tratamentos térmicos aplicados e por ser relacionado à produção de patulina no suco de maçã. A. acidoterrestris por possuir esporos extremamente termorresistentes e pela alta capacidade deteriorante em produzir off-flavors no produto final durante a estocagem;

Os testes com sanitizantes mostraram que os esporos de A. acidoterrestris e B. fulva não serão eficazmente eliminados pela desinfecção usando dicloroisocianurato de sódio (dicloro) e ácido peracético, dentro das concentrações máximas permitidas. Além disso, nem mesmo o aumento da temperatura de 25ºC para 37ºC melhorou a eficácia dos sanitizantes na redução destes micro-organismos.

O sanitizante dicloro, mesmo quando utilizado em baixas concentrações de 25 ppm, mostrou ser eficaz em causar mais de 6 reduções decimais nos esporos de P. expansum após 6 minutos de contato. Entretanto, o sanitizante à base de ácido peracético Tsunami 100 não deve ser considerado substituto para compostos clorados, pois este não foi capaz de eliminar sequer os esporos de P. expansum, dentro das concentrações recomendadas (tanto na superfície das maçãs quanto em solução aquosa);

O sanitizante à base de ácido peracético Vortexx possui na sua formulação o ácido octanóico (agente anti-fúngico) e mostrou-se mais eficaz em reduzir esporos de P. expansum que Tsunami 100. Entretanto, Vortexx é menos eficaz que o hipoclorito de sódio acificado (pH 6,5) na redução destes esporos.

Nos testes utilizando hipoclorito de sódio, foi verificado que a diminuição do pH para 6,5 melhorou a eficácia da sanitização em relação às soluções não acidificadas;

193

A inativação de P. expansum causada por dicloro entre 25 e 75 ppm apresentou um comportamento que foi bem descrito pelo modelo de Weibull;

O processo de pasteurização branda de 71ºC/6 s muitas vezes aplicado ao suco de maçã é suficiente para causar 6 reduções decimais na população de esporos de P. expansum, sendo que o clássico modelo de Bigelow pode ser utilizado para descrever a inativação térmica destes esporos entre 50ºC e 60ºC;

P. expansum pode produzir patulina tanto em maçãs mantidas à temperatura de 20,5ºC quanto nas mantidas a 11ºC.

Na análise de produção de patulina após crescimento de P. expansum em diferentes variedades de maçãs, Red Delicious e Empire mostraram que não são susceptíveis ao desenvolvimento do fungo ou produção de patulina. Golden Supreme e McIntosh mostraram ser as variedades mais susceptíveis ao desenvolvimento de podridão por P. expansum e produção de patulina;

A produção de patulina é concentrada no período da entressafra. Durante a safra, não foi verificada presença de patulina;

Os lotes de maçã devem ser amostrados na etapa do recebimento. O plano de amostragem proposto sugeriu a retirada de 50 frutas/lote, sendo que deve-se rejeitar o lote que apresente mais que 8 maçãs podres, pois existe o risco de produção de patulina acima de 50 ppb no produto final. Devem ser consideradas podres somente as frutas com lesões maiores que 4 cm ou com visível desenvolvimento de “mofo azul” (P. expansum);

Na etapa de lavagem das frutas, a água pressurizada mostrou ser eficiente para remover total ou parcialmente os níveis de patulina das frutas. Entretanto, o processo transferiu patulina para a fase aquosa;

Dicloroisocianurato de sódio pode ser utilizado para reduzir níveis de patulina na fase aquosa. Nas concentrações entre 25-200 ppm, dicloro foi capaz de destruir 100% da patulina presente na água. Na fruta, a redução de patulina foi de 47,8-74,8%. O sanitizante à base de ácido peracético (Tsunami 100®) não apresentou boa eficácia na redução de patulina da água.

Este trabalho traz importantes contribuições para a indústria processadora de suco de maçã, fornecendo dados que servirão de base para que seja produzido suco dentro das normas internacionais de concentração de patulina, que além de ser uma toxina nociva à saúde do consumir, representa uma barreira sanitária na comercialização deste produto.

CAPÍTULO 6 REFERÊNCIAS

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ANEXOS

224

ANEXO I

1. Imagens de Penicillium expansum CCT 7549 nos meios de identificação

c

a b

Imagem 1. Colônias de Penicillium expansum CCT 7549 cultivadas durante 7 dias a 25ºC: (a) Cultivo em CYA; (b) Cultivo em MEA e (c) Culivo em G25N.

2. Imagens da deterioração das maçãs causada pelo “fungo azul” (P. expansum)

Imagem 2. Maçãs apodrecidas apresentando visível crescimento fúngico

(fungo azul).

225

3. Imagem de esporos de A. acidoterrestris CCT 7548

Imagem 3. A. acidoterrestris CCT 7548 (coloração Gram).

Aumento de 1000X.

226

4. Laudo de identificação das cepas de P. expansum e A. acidoterrestris isolados do processo produtivo de suco de maçã

concentrado

227

Relatório Técnico final Serviço: Identificação de

microrganismos Relatório: 080139rf

Interessado: Universidade Federal de Santa Catarina – Laboratório Engebio

Data da chegada da amostra: 23/01/2009

Serviço No. Descrição da Amostra/Serviço

080139-1 Tubo com a identificação 1 TEAly (Taxonomia Molecular)

080139-2 Tubo com a identificação 1 AUFAly (Taxonomia Molecular)

080139-3 Tubo com a identificação 2M – suspeita de Penicillium (Taxonomia Convencional)

1. Objetivos: Identificação de microrganismos por Taxonomia Clássica e Molecular. 2. Metodologia utilizada: - Taxonomia clássica convencional.

A identificação é baseada na análise comparativa de características diferenciais de morfologia, fisiologia e metabolismo bioquímico da

linhagem teste com dados citados na literatura de referência. - Taxonomia Molecular Identificação de bactéria, utilizando sequenciamento e análise filogenética de fragmentos de gene RNAr 16S: 1. Amplificação do RNAr 16S pela metodologia de PCR, utilizando como molde o DNA genômico extraído diretamente da amostra. Os primers (oligonucleotídeos sintéticos) utilizados para a reação de PCR foram p27f e p1401r. 2. Sequenciamento em seqüenciador automático MegaBACE 1000 (GE Healthcare). Os primers utilizados foram p10f, 765f, 782r, p1100r. 3. Análise filogenética: as seqüências parciais de RNAr 16S obtidas com os diferentes primers foram montadas em um contig (seqüência única combinando os diferentes fragmentos obtidos) e comparadas com as seqüências de organismos representados nas bases de dados do Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e do RDP (http://rdp.cme.msu.edu/). Foram selecionadas seqüências de

228

organismos relacionados ao organismo desconhecido para a realização das análises filogenéticas. O programa utilizado para alinhamento foi CLUSTAL X (Thompson et al. 1997) e para análise filogenética MEGA 4.0 (Tamura et al.,2007). A matriz distância evolutiva foi calculada com o modelo de Kimura (1980) e a construção da árvore filogenética foi feita pelo método de Neighbor-Joining (Saitou&Nei, 1987), com valores de bootstrap calculados a partir de 1000 re-amostragens, utilizando o software incluído no programa MEGA 4.0. 3. Resultados da identificação

Serviço No.

Amostra Resultado

080139-1 Tubo com a identificação 1 TEAly

Alicyclobacillus acidoterrestris (Deinhard et al. 1988) Wisotzkey et al. 1992 sinônimo Bacillus acidoterrestris

080139-2 Tubo com a identificação 1 AUFAly

Alicyclobacillus acidoterrestris (Deinhard et al. 1988) Wisotzkey et al. 1992 sinônimo Bacillus acidoterrestris

080139-3 Tubo com a identificação 2M – suspeita de Penicillium

Penicillium expansum Link ex Gray 1821

4. Comentários Análise Molecular:

As seqüências parciais do gene RNA ribossomal 16S das amostras OS080139-1 e 2 apresentaram entre 98 e 99% de similaridade com as seqüências do gene RNA ribossomal 16S da linhagem tipo Alicyclobacillus acidoterrestris e outras linhagens desta espécie. Porcentagens de similaridades mais baixas, entre 95 e 97% foram observadas com as especies Alicyclobacillus fastidiosus, A. hesperidium e A. sacchari contidas nas bases de dados. A análise filogenética agrupou as amostras com a linhagem tipo Alicyclobacillus acidoterrestris, formando um agrupamento coeso, com o alto valor de bootstrap (99%) confirmando a identificação das amostras .

229

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230

laboratórios do Centro Pluridisciplinar Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas – Universidade Estadual de Campinas. As análises de identificação de fungo filamentoso, foram realizadas nos laboratórios da UNESP – Campus de Rio Claro, pela Dra. Derlene Attili de Angelis.Os resultados têm significação restrita e se aplicam somente à amostra recebida para análise. As culturas serão mantidas em nosso laboratório pelo período de um mês a partir desta data. Após este período elas serão descartadas.

Data 17/abr/2009

Emitido por Aline de Souza Lopes Identificações / Testes e ensaios

FICHA DE IDENTIFICAÇÃO - No. SERVIÇO: 080139-3 Resultado da identificação: Penicillium expansum Link ex Gray 1821

a b c.

Legenda: a. Ausência de crescimento em CYA, a 37°C, após 7 dias.

Microscopia óptica: b. e c. conidióforos e conídios em CYA e MEA a 25oC (x 400).

Descrição: A cultura observada em CYA a 37°C não cresceu (uma das características da espécie). A 25oC apresentou diâmetro médio de 25-30 mm; micélio branco, superfície aveludada a flocosa, formando corêmio, esporulação moderada e reverso com pigmentação caramelo. Em MEA a 25oC o diâmetro médio foi 35,0 mm. Conidióforos de parede lisa originando penicílios na maioria triverticilados, e biverticilados. Métulas de 14,5-19,0µm comprimento, e fiálides medindo entre 10,0–14,0 µm de comprimento. Conídios subglobosos a elipsoidais, parede lisa, 4,5-5,0 µm de diâmetro. Coloração empregada para microscopia: lactofenol azul de algodão.

231

232

ANEXO II

Curva de ativação dos esporos de Byssochlamys fulva CCT 0056

2

3

4

0 5 10 15

Tempo (min)

Log

espo

ros

B.fu

lva/

mL

Gráfico 1. Curva de ativação dos esporos de Byssochlamys fulva CCT 0056.

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ANEXO III 1. Meios de Cultura e reagentes utilizados 1) Água Peptonada 0,1% Peptona Bacteriológica………………………………………...........0,1g Água destilada……………………………………………………100 mL Modo de preparar: pesar a peptona, dissolve-la com água destilada e autoclavar a 121°C/15min. 2) Corante Lactofucsina 0,1% Ácido Fucsínico ……………………………………………........…0,1g Ácido Láctico 85% de pureza…………………………………....100mL Modo de preparar: dissolver o ácido fucsínico em ácido láctico com grau de pureza 85%. Este corante é utilizado para a verificação das estruturas fúngicas e não há necessidade de esterilização. 3) Concentrado Czapek NaNO3…………………………………………………………....…30g KCL…………………………………………………………………..5g MgSO4.7H2O…………………………………………………………5g FeSO4.7H2O………………………....……………………………...0,1g Água……………………………………………………………...100mL Modo de preparar: pesar todos os reagentes, homogeneizar bem e guardar em recipiente tampado dentro da geladeira durante tempo indefinido sem necessidade de esterilização. O precipitado de Fe (OH)3 que se forma com o tempo pode ser ressuspendido pela agitação antes do uso. 4) Czapek Ágar extrato de Levedura (CYA) K2HPO4……………………………………………...…………….1,0 g Czapek concentrado…………………………………..……..……10 mL Extrato de levedura ...........……………........…………………….….5 g Sacarose………………...………………………………….....…….30 g Ágar ………………………………………………………….........15 g Água destilada…………………………..……………….......……1 litro Modo de preparar: pesar todos os reagentes, acrescentar água e autoclavar a 121°C/15min. 5) Ágar extrato de Levedura com 20% de sacarose (CY20S) K2HPO4…………...……………………………………………….1,0 g

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Czapek concentrado……………………………………………....10 mL Extrato de levedura ...........……………………....……………….….5 g Sacarose…………………………………………...………...…….200 g Ágar ……………..……………………………………………....... 15 g Água destilada………………………………………...……………1 litro Modo de preparar: pesar todos os reagentes, acrescentar água e autoclavar a 121°C/15min. 6) Ágar Nitrato de Glicerol 25% (G25N) K2HPO4………………………………………….…………......…0,75 g Czapek concentrado………….......……………………………....7,5 mL Extrato de levedura em pó ………………………………………...3,7 g Glicerol (Grau analítico)………………………………………......250 g Ágar ……………...……………………………........……………...12 g Água destilada………....………………………….......…….......750 mL Modo de preparar: pesar todos os reagentes, acrescentar água e autoclavar a 121°C/15min. 7) Ágar Extrato de Malte (MEA) Agar....................................................................................................20 g Extrato de Malte.............………………………………...…….........20 g Peptona……………………………………………………....……..1,0 g Glicose………………………………………………………...........20 g Água destilada……………………………………………..……...1 litro Modo de preparar: pesar todos os reagentes, acrescentar água e autoclavar a 121°C/15min. 8) Ágar Batata Dextrose (PDA) (Biolife e Criterion) Ágar Batata Dextrose ……………………………...……………...3,9 g Água destilada……………………………………......………...100 mL Modo de preparar: pesar todos os reagentes, acrescentar água e autoclavar a 121°C/15min. 9) PDA com cloranfenicol e concentração dupla de Ágar Ágar Batata Dextrose ……………………………...………………3,9 g Ágar………………………………………………………………...1,5 g Cloranfenicol………………..…………………………………......0,4 g Água destilada…………………………………………………...100 mL Modo de preparar: pesar todos os reagentes, acrescentar água e autoclavar a 121°C/15min. Antes de utilizar adicionar ácido tartárico 10% para ajustar o pH a 3,5.

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10) Solução de Ácido Tartárico 10% Ácido Tartárico ……………………………………………………10 g Água destilada..………………………………………………….100 mL Modo de preparar: pesar o reagente, adicionar água destilada e autoclavar a 121°C/10min. 11) Solução de Rosa de Bengala 5% Rosa de bengala …………………………………………………...0,5 g Água destilada........………………………………………………....10 g Modo de preparar: pesar o reagente, adicionar água e autoclavar a 121°C/10min. Manter sob refrigeração coberto com papel alumínio para que o sal não seja oxidado na presença da luz. 12) Tiossulfato de sódio (0,6%) Tiossulfato de sódio.........…………………………………..............0,6 g Água destilada …………………………………………….....…..100 mL Modo de preparar: pesar o reagente, adicionar água destilada e autoclavar a 121°C/15mim. 13) Solução de leite desnatado 5% Leite Desnatado em pó……………………………………………....5 g Água destilada…………………………………………...….......100 mL Modo de preparar: pesar o leite em pó, adicionar água destilada e autoclavar a 121°C/10mim. 14) Lactofenol azul de algodão (Cotton Blue) Fenol (cristais)...................................................................................20 g Ácido Láctico..................................................................................20 mL Glicerol............................................................................................40 mL Água................................................................................................20 mL Metil blue.........................................................................................0,05% 15) Meio Alicycloterrestris acidocaldarius (AAM) suplementado (Meio de esporulação) Componentes da solução (1): Extrato de levedura...............................................................................1 g (NH4)2SO4.........................................................................................0,2 g CaCl2 .............................................................................................0,189 g MgSO4.7H2O……………………………………………...………..0,5 g Glicose……………………………………………………...........…...1 g KH2PO4………………………………………...…………………...0,6 g

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MnCl2.4H2O…………………………….......………………………0,5g Água destilada...............................................................................500 mL Modo de preparar: pesar os reagentes, adicionar água destilada e fazer ajuste para pH 4,0 com H2SO4 1N e autoclavar separadamente da solução 2 a 121°C/15min. Componentes da solução (2): Ágar.....................................................................................................15 g Água destilada................................................................................500 mL Modo de preparar: pesar o reagente e esterilizar separadamente da solução 1 a 121°C/15min. Misturar assepticamente a solução 1 com a solução 2 na proporção somente no momento de uso. 16) Caldo Alicycloterrestris acidocaldarius (AAM) (caldo de esporulação) Extrato de levedura...............................................................................1 g (NH4)2SO4.........................................................................................0,2 g CaCl2 .............................................................................................0,189 g MgSO4.7H2O……………….....................…………………………0,5 g Glicose…….....................…………………………………………..1,0 g KH2PO4………………….………………………………………….0,6 g Água destilada..............................................................................1000 mL Modo de preparar: pesar os reagentes, adicionar água destilada, fazer ajuste para pH 4,0 com H2SO4 1N e autoclavar a 121°C/15min. 17) BAT Ágar (Ágar Bacillus acidoterrestris) Componentes da solução (1): Extrato de levedura................................................................................2 g (NH4)2SO4..........................................................................................0,2 g CaCl2 ..............................................................................................0,189 g MgSO4.7H2O……………………………………………………......0,5 g Glicose……………….............................................................………..5 g KH2PO4……………………………………………………….....…..3,0 g Solução de Elementos traços…………………………............……..1,0 g Água destilada................................................................................500 mL Modo de preparar: pesar os reagentes, adicionar água destilada, fazer ajuste para pH 4,0 com H2SO4 1N e autoclavar separadamente da solução 2 a 121°C/15min.

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Componentes da solução (2): Ágar.....................................................................................................20 g Água destilada................................................................................500 mL Modo de preparar: pesar o reagente e esterilizar separadamente da solução 1 a 121°C/15min. Misturar assepticamente a solução 1 com a solução 2 na proporção somente no momento de uso. 18) Caldo BAT (Caldo Bacillus acidoterrestris) Componentes da solução (1): Extrato de levedura...............................................................................2 g (NH4)2SO4..........................................................................................0,2 g CaCl2 .............................................................................................0,189 g MgSO4.7H2O……………………………………….................…….0,5 g Glicose…………………………………………………………...........5 g KH2PO4……………………………………………………………...3,0 g Solução de Elementos traços………………………...........………...1,0 g Água destilada..............................................................................1000 mL Modo de preparar: pesar os reagentes, adicionar água destilada, fazer ajuste para pH 4,0 com H2SO4 1N e autoclavar separadamente da solução 2 a 121°C/15min. Componentes da solução (2): Ágar.....................................................................................................20 g Água destilada...............................................................................500 mL Modo de preparar: pesar o reagentes e esterilizar separadamente da solução 1 a 121°C/15min. Misturar assepticamente a solução 1 com a solução 2 na proporção somente no momento de uso. 19) Solução de Elementos Traços CaCl2.2H2O......................................................................................0,66 g ZnSO4.7H2O....................................................................................0,18 g CuSO4.5H2O....................................................................................0,16 g MnSO4.4H2O...................................................................................0,15 g CoCl2.5H2O....................................................................................0,18 g H3BO3.............................................................................................0,10 g Na2MoO4.2H2O..............................................................................0,30 g Água destilada................................................................................1 litro Modo de preparar: pesar todos os reagentes e autoclavar a 121°C/15min. 20) Ágar Nutriente (Biolife) Caldo Nutriente.................................................................................2,4 g

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Ágar...................................................................................................4,5 g Água...............................................................................................300 mL Modo de preparar: pesar os reagentes, adicionar água destilada e autoclavar a 121°C/15min.