Técnica de Western Blotting

Objetivo da aula Estudar as frações: - gama-globulina precipitada - isotipo IgG purificado

Utilizando a técnica de Western Blotting

Técnica de Western Blotting (Immunoblotting)

Método utilizado para a imunodetecção de proteínas após sua separação por eletroforese em gel e transferência de um extrato

proteico para uma membrana adsorvente. Kurien & Scofield, 2006

Permite detectar, caracterizar e semi-quantificar múltiplas proteínas, principalmente aquelas que estão em baixas quantidades na amostra.

1973 – Edwin Southern Southern Blotting - DNA 1977 – James Alwine e colaboradores Northern Blotting - RNA 1979 – Towbin e colaboradores Western Blotting - Proteínas

Etapas da técnica

- Eletroforese – SDS-PAGE - Transferência para membrana - Bloqueio - Adição de anticorpos específicos - Detecção da reação

Alberts, Biologia Molecular da Célula 5ºedição

Eletroforese SDS-PAGE

Soro gama IgG

Transferência para membrana

Nitrocelulose (menor custo) PVDF (maior sensibilidade, ligação e retenção)

Bloqueio

Leite, soro albumina bovina (BSA) ou ovo albumina

- Membrana – alta afinidade por proteína

Adição de anticorpos específicos

Detecção de sinal (colorimétrico ou quimioluminescente)

Substrato da enzima Anticorpo secundário Conjugado com enzima

Anticorpo primário Proteína alvo

Membrana contendo proteína transferida

Indireto

Direta

Detecção da reação

Substrato DAB- Diaminobenzidina- cor marrom

https://www.youtube.com/watch?v=pRIn3p7x3V8

25KDa

50KDa

Aplicações no diagnóstico e pesquisa animal

Técnica recente que possui alta sensibilidade e especificidade com emprego crescente em diagnóstico de doenças animais.

Diagnóstico - Encefalopatias espongiformes transmissíveis

- Leishmaniose visceral americana

- Mieloencefalite equina por protozoário

- Salmonelose

- Mycoplasma hyopneumoniae (suínos)

- Mormo (Burkholderia mallei) em equinos

Pesquisa- Neoplasias

Doenças hereditárias

Descobertas de proteínas para produção de vacinas

Science, v 235