Purificação e detecção de Purificação e detecção de AntígenosAntígenos

ImunocromatografiaImunocromatografia

Cromatografia de Cromatografia de afinidadeafinidade

Eletroforese SDS pageEletroforese SDS page

Western blottingWestern blotting

ImunohistoquímicaImunohistoquímica

CromatografiaCromatografia

Método físico-químico de separação, fundamentado na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária.

A cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar.

Cromatografia planar: cromatografia em papel, cromatografia por centrifugação e à cromatografia em camada delgada

Cromatografia em coluna, de acordo com fase móvel: líquida, gasosa.

ImunocromatografiaImunocromatografia

O método, conhecido como imunocromatografia, ou O método, conhecido como imunocromatografia, ou teste de migração lateral, vale-se de uma teste de migração lateral, vale-se de uma membrana de nitrocelulose no formato de fita. membrana de nitrocelulose no formato de fita. Impregnada em cada trecho com Impregnada em cada trecho com Antígenos ou Antígenos ou AnticorposAnticorpos específicos e marcados (ex: ouro específicos e marcados (ex: ouro coloidal), ela reage com a amostra, indicando ou coloidal), ela reage com a amostra, indicando ou não a existência dos Acs (ex: Ac anti HIV) ou dos não a existência dos Acs (ex: Ac anti HIV) ou dos Ags (ex: hormônio betaHCG) pesquisados. A Ags (ex: hormônio betaHCG) pesquisados. A leitura do resultado é feita a olho nu e independe leitura do resultado é feita a olho nu e independe de especialistas. de especialistas.

Cromatografia de AfinidadeCromatografia de AfinidadeCromatografia de afinidade (coluna e líquida)Separa proteínas por suas especificidades de

ligação

mistura de proteínasé adicionada à colunacontendo polímeros comligantes específicos paraproteína de interesse

proteína de interessedeixa coluna coma solução de ligantes

EletroforeseEletroforese

Método utilizado para separar e purificar macromoléculas (proteínas, RNA, DNA) de diferentes tamanhos, carga ou conformação.

Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico, migram para o pólo positivo ou negativo.

Proteínas (carga líquida negativa ou positiva) e DNA sempre negativa (fosfato)

Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel. O gel é submerso em um tampão que possui íons para a

corrente passar.

GEL para EletroforeseGEL para Eletroforese

Compostos de agarose ou poliacrilamida

Agarose: polissacarídeo extraído de alga marinha. Usada em concentrações de 0,5 a 2%. Fácil de preparar. Não-tóxico.

Géis de Agarose possuem ampla capacidade de separação mas baixa resolução. Muito utilizado para ácidos nucleicos.

GEL para eletroforeseGEL para eletroforesePoliacrilamida: polímero de ligação cruzada de

acrilamida. Comprimento das cadeias do polímero dependem da concentração usada (3,5 a 20%).

Mais difíceis de preparar. Como oxigênio inibe a polimerização precisam ser montados entre placas de vidro.

Acrilamida: potente neurotóxico e deve ser manipulado com cuidado!!! Luvas e máscaras devem ser usadas para pesar o pó.

A poliacrilamida é considerada não tóxica mas luvas devem ser usadas pela possível presença de acrilamida livre

Géis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de separação mas alta capacidade de resolução. Muito utilizado para separação de proteínas

Coloração GelColoração Gel

Coloração com Blue Coomassie que se liga inespecificamente a praticamente todas as proteínas.

Eletroforese – SDS pageEletroforese – SDS page

proteínas migram de acordo comtamanho e forma

• a proteina é denaturada, as subunidades se separam

cátodo

ânodo

SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Eletroforese de proteínasEletroforese de proteínas

Western blottingWestern blottingGel blotting: técnica de visualização/separação de Gel blotting: técnica de visualização/separação de

macromoléculas (DNA,RNA, Proteínas) em uma macromoléculas (DNA,RNA, Proteínas) em uma mistura complexa.mistura complexa.

protein blotting ou westernblotting ou protein blotting ou westernblotting ou imunoblottingimunoblotting

É um método analítico que envolve a imobilização É um método analítico que envolve a imobilização das proteínas em membranas para posterior das proteínas em membranas para posterior detecção/identificação utilizando anticorpos detecção/identificação utilizando anticorpos monoclonais ou policlonais  monoclonais ou policlonais  

A proteína previamente separada e denaturada na A proteína previamente separada e denaturada na Eletroforese (SDS page), técnica que fornece Eletroforese (SDS page), técnica que fornece informações sobre o peso molecular e a possível informações sobre o peso molecular e a possível existência de isoformas da proteína em estudo, é existência de isoformas da proteína em estudo, é então imobilizada em membranas como a de então imobilizada em membranas como a de nitrocelulose e reconhecida pelos anticorpos nitrocelulose e reconhecida pelos anticorpos marcadosmarcados

Western blotting

Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida

Separação e caracterização de proteínas Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para desnaturação Transferência para membrana por força elétrica Proteína alvo é identificada por Ac mono ou policlonal Revelação do sistema com anticorpo secundário

fluorescente ou radioativo Informa o tamanho e a quantidade das proteínas

Western blottingWestern blotting

ImunohistoquímicaImunohistoquímicaO príncípio básico: reconhecimento do Ag (presente no tecido analisado) por O príncípio básico: reconhecimento do Ag (presente no tecido analisado) por

um anticorpo específico, associado a diversos tipos de processos um anticorpo específico, associado a diversos tipos de processos de visualização/revelação.de visualização/revelação.

  Cada Ac reconhece apenas um único Ag, que pode ser, uma proteína Cada Ac reconhece apenas um único Ag, que pode ser, uma proteína de uma célula normal ou neoplásica ou de um microrganismo. de uma célula normal ou neoplásica ou de um microrganismo.

A técnica usual utiliza um Ac secundário, que se liga ao Ac primário e A técnica usual utiliza um Ac secundário, que se liga ao Ac primário e é associado a um complexo de visualização (complexo avidina-é associado a um complexo de visualização (complexo avidina-biotina-enzima-cromógeno ou polímero com amplificação). biotina-enzima-cromógeno ou polímero com amplificação).

Atualmente há disponibilidade de grande número de Ac primários Atualmente há disponibilidade de grande número de Ac primários para uso em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos para uso em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos parafina, permitindo o exame imuno-histoquímico de biópsias, parafina, permitindo o exame imuno-histoquímico de biópsias, peças cirúrgicas e de necropsias arquivados. peças cirúrgicas e de necropsias arquivados.

Preparados citopatológicos também podem ser utilizados nos exames Preparados citopatológicos também podem ser utilizados nos exames imuno-citoquímicos.imuno-citoquímicos.   

ImunohistoquímicaImunohistoquímica

ImunofluorescenciaImunofluorescenciaTrata-se de uma reação imunológica revelada com um marcador Trata-se de uma reação imunológica revelada com um marcador

fluorescentefluorescente

A primeira técnica utilizada foi a A primeira técnica utilizada foi a imunofluorescênciaimunofluorescência direta, onde se direta, onde se pesquisou um Ag em uma reação com Ac preparado com o pesquisou um Ag em uma reação com Ac preparado com o fluorocromo. fluorocromo.

Para este tipo de reação são utilizados Para este tipo de reação são utilizados Ac purificados específicos para Ac purificados específicos para um determinado Ag conjugados um determinado Ag conjugados com um fluorocromo. com um fluorocromo. Esta técnica também é Esta técnica também é chamada de técnica dechamada de técnica de camada simples.camada simples.

ImunofluorescenciaImunofluorescenciaA reação da A reação da imunofluorescênciaimunofluorescência indireta, ou técnica de dupla indireta, ou técnica de dupla

camada, é realizada por Ag fixados em uma lâmina, onde se camada, é realizada por Ag fixados em uma lâmina, onde se aplica primeiro um Ac específico não fluorescente. E por último aplica primeiro um Ac específico não fluorescente. E por último coloca-se um Ac fluorescente, contra determinantes antigenicos coloca-se um Ac fluorescente, contra determinantes antigenicos do primeiro Ac.do primeiro Ac.

Esta técnica apresenta como vantagem à possibilidade de se ter Esta técnica apresenta como vantagem à possibilidade de se ter uma fluorescência mais evidente, pelo fato do anticorpo uma fluorescência mais evidente, pelo fato do anticorpo fluorescente se ligar apenas aos anticorpos primários. fluorescente se ligar apenas aos anticorpos primários.

A técnica de imunofluorescência por sanduíche recebe este nome A técnica de imunofluorescência por sanduíche recebe este nome porque o antígeno fica entre dois anticorpos. Esta técnica é porque o antígeno fica entre dois anticorpos. Esta técnica é aplicada para estudar tecidos linfóides e descobrir que tipo de aplicada para estudar tecidos linfóides e descobrir que tipo de anticorpos está sendo produzido. anticorpos está sendo produzido.

(A)              (B)                           (C)(A)              (B)                           (C)Imunofluorescência indireta. O Anticorpo primário marcado com um fluorocromo (A) é excitado a Imunofluorescência indireta. O Anticorpo primário marcado com um fluorocromo (A) é excitado a

emitir cor (B), que é visualizado na foto de  um lâmina (C).emitir cor (B), que é visualizado na foto de  um lâmina (C).