universidade estadual de...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS APLICADAS
MARCELLA RAMOS SANT’ANA
AVALIAÇÃO DOS MECANISMOS MOLECULARES DOS ÁCIDOS GRAXOS
ÔMEGA-3 NO CONTROLE DA INFLAMAÇÃO HIPOCAMPAL ASSOCIADA À
OBESIDADE: PAPEL DO RECEPTOR GPR120
OMEGA 3 FATTY ACIDS MOLECULAR PATHWAYS RELATED TO THE
CONTROL OF OBESITY-ASSOCIATED HIPPOCAMPAL INFLAMMATION:
ROLE OF GPR120 RECEPTOR
LIMEIRA
2019
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MARCELLA RAMOS SANT’ANA
AVALIAÇÃO DOS MECANISMOS MOLECULARES DOS ÁCIDOS GRAXOS
ÔMEGA-3 NO CONTROLE DA INFLAMAÇÃO HIPOCAMPAL ASSOCIADA À
OBESIDADE: PAPEL DO RECEPTOR GPR120
OMEGA 3 FATTY ACIDS MOLECULAR PATHWAYS RELATED TO THE
CONTROL OF OBESITY-ASSOCIATED HIPPOCAMPAL INFLAMMATION:
ROLE OF GPR120 RECEPTOR
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Aplicadas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora
em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo, na
área de Nutrição.
Orientador: Prof. Dr. Dennys Esper Cintra
ESSE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELA ALUNA MARCELLA RAMOS SANT’ANA E ORIENTADO PELO
PROF. DR. DENNYS ESPER CINTRA.
LIMEIRA
2019
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Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Ciências Aplicadas
Renata Eleuterio da Silva - CRB 8/9281
Sant'Ana, Marcella Ramos, 1989-
Sa59a Avaliação dos mecanismos moleculares dos ácidos graxos ômega-3 no
controle da inflamação hipocampal associada à obesidade : papel do receptor
GPR120 / Marcella Ramos Sant'Ana. – Limeira, SP : [s.n.], 2019.
Orientador: Dennys Esper Cintra.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de
Ciências Aplicadas.
1. Obesidade. 2. Neuroinflamação. 3. Ácidos graxos Ômega-3. 4. GPR120.
5. Alzheimer, Doença de. I. Cintra, Dennys Esper, 1976-. II. Universidade
Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Aplicadas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Omega 3 fatty acids molecular pathways related to the control of
obesity-associated hippocampal inflammation : role of GPR120 receptor
Palavras-chave em inglês:
Obesity
Neuroinflammation
Omega-3 fatty acids
GPR120
Alzheimer's disease
Área de concentração: Nutrição
Titulação: Doutora em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo
Banca examinadora:
Dennys Esper Cintra [Orientador]
Fernando Moreira Simabuco
Lício Augusto Velloso
Fernanda Guarino de Felice
André Gustavo Vasconcelos Costa
Data de defesa: 21-03-2019
Programa de Pós-Graduação: Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0003-3420-7686
- Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/2399495875810598
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FOLHA DE APROVAÇÃO
Autor: Marcella Ramos Sant’Ana
Título: Avaliação dos mecanismos moleculares dos ácidos graxos ômega-3 no controle da
inflamação hipocampal associada à obesidade: papel do receptor GPR120
Natureza: Tese de doutorado.
Instituição: Faculdade de Ciências Aplicadas – Unicamp.
Data da Defesa: 21 de março de 2019.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Dennys Esper Cintra (Orientador) ________________________________________
Prof. Dr. Lício Augusto Velloso (Membro interno) __________________________________
Dr. Fernando Moreira Simabuco (Membro interno) __________________________________
Dr. André Gustavo Vasconcelos Costa (Membro externo) ____________________________
Dra. Fernanda Guarino de Felice (Membro externo) _________________________________
Ata da Defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no processo
de vida acadêmica do aluno
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DEDICATÓRIA
Ao meu avô Toti (in memoriam) que mesmo não
entendendo a minha escolha em sair de casa, sempre me
apoiou e sonhou os meus sonhos.
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AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
Agradeço à CAPES, à Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e ao Programa
de Pós-graduação em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo (CNEM), por todo o
apoio financeiro e incentivo à pesquisa que possibilitou a realização deste trabalho.
Meu agradecimento e respeito a todos os animais experimentais utilizados para
realização desta pesquisa.
Ao meu orientador, professor Dennys Cintra. O seu amor pela pesquisa e respeito aos
alunos me inspira a cada dia. Obrigada pela confiança e por ter me recebido tão bem em seu
laboratório. Obrigada pela ótima convivência durante todos esses anos. Obrigada por ser tão
acessível e sempre se preocupar com o bem-estar dos alunos. Obrigada por todos os cafés e
conselhos e por sempre compartilhar seus conhecimentos científicos e de vida conosco.
Aos professores Eduardo Ropelle, Leandro Pereira, Rodrigo Pauli e Adelino Sanchez
pelo envolvimento direto com esta pesquisa e por todos os ensinamentos compartilhados
durante os quatro anos de doutorado.
Ao professor Lício Velloso, aos seus alunos (Alexandre, Pedro, Dani e Daiane) e ao
Centro de Pesquisa em Obesidade e Comorbidades (OCRC) por todo o apoio financeiro e
teórico para execução desta pesquisa.
Aos professores André Vasconcelos e Fernanda De Felice, por todas as sugestões para
elaboração deste trabalho.
A todas as pessoas que colaboraram na execução desta pesquisa: Marcella Dátilo e
Camila Ramos pela ajuda diária com os animais experimentais; professor Alexandre Leite,
Mateus e Monize que foram fundamentais para as análises de microscopia eletrônica de
transmissão; Fernando Simabuco e a Isadora Pavan pelo auxílio nos experimentos com as
culturas celulares; Barbara Crisol pela ajuda com as análises de bioinformática. Em especial,
gostaria de deixar o meu eterno agradecimento aos meus queridos colaboradores, Kellen e
Rodrigo Pereira, que não pouparam esforços em me ajudar no planejamento e execução de
todas as etapas desta pesquisa.
A todos os alunos que frequentaram os laboratórios LABGEN e LABMEX entre 2015
e 2019. Obrigada pelos ótimos anos de convivência, parceria e amizade. Todos, sem exceção,
deixaram um grande ensinamento e foram fundamentais para o meu crescimento pessoal e
profissional.
7
À professora Hosana e ao professor Augusto, assim como todos os alunos do
LABNUTRE e BIOTEC, pela ótima convivência e ensinamentos durante todos esses anos.
Ao Vítor, por todas as noites em claro, por toda a ajuda nas traduções e por ouvir as
mesmas apresentações mil vezes. Muito obrigada por todo auxílio e paciência durante esses
anos de doutorado.
A Deus que sempre nas horas difíceis mostrou sua providência em minha vida, sendo
minha rocha e meu refúgio.
A minha amada família, meus pais, Célia e Marcos; meus irmãos, Clerinsom e Gedson;
meu sobrinho, Arthur; minhas cunhadas Cristiane e Dayane; meus avós, Emília, Geraldo.
Obrigada por sempre me apoiarem e entenderem a minha ausência. Sem o apoio de vocês nada
disso seria possível.
Por fim, gostaria de deixar os meus sinceros agradecimentos a todos que direta ou
indiretamente colaboraram para a concretização desta pesquisa. A todos que despenderam
minutos, horas ou até mesmo dias para compartilhar o seu conhecimento e me ensinar técnicas
experimentais ou conceitos teóricos que foram fundamentais para a execução deste trabalho.
Muito obrigada pela generosidade e paciência!
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“Conheça todas as teorias, domine todas as técnicas, mas ao
tocar uma alma humana, seja apenas outra alma humana”.
Carl Jung
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RESUMO
Introdução: A obesidade é um dos principais fatores indutores da inflamação e da resistência
à insulina. A perpetuação destas alterações moleculares tem sido associada à déficits cognitivos
e surgimento de doenças neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer (DA). Objetivo:
Avaliar se o consumo de fontes alimentares de ômega 3 seria capaz de controlar o processo
inflamatório no hipocampo de camundongos obesos e resistentes à insulina por meio da ação
do receptor GPR120 e assim melhorar a cognição e reduzir os marcadores que precedem a DA.
Materiais e métodos: Camundongos Swiss foram induzidos à obesidade e posteriormente
tratados com dieta hiperlipídica com substituição de ⅓ da gordura suína por óleo de linhaça.
Durante o experimento os animais foram submetidos aos testes de tolerância à glicose e
sensibilidade à insulina, assim como teste cognitivo de Morris Water Maze. Ao final do
experimento, o hipocampo foi extraído para análises histológicas de microscopia de
fluorescência e eletrônica; cromatografia gasosa espectrométrica; immunobloting e RT-qPCR.
Em cultura de células do tipo N2a foi testado o mecanismo que envolve o receptor GPR120
como agente catalisador dos efeitos do ômega-3. Resultados: O grupo obeso apresentou maior
ganho de peso, intolerância à glicose e resistência à insulina, assim como prejuízo cognitivo em
comparação ao grupo controle. O processo obesogênico foi capaz de induzir a resistência à
insulina em concomitância a marcadores inflamatórios, de estresse de retículo endoplasmático
e apoptose, além da redução do processo autofágico no hipocampo dos animais. Também
evidenciou-se elevação na concentração de amiloide (βA) e hiperfosforilação da proteína tau,
junto à neurodegeneração no hipocampo dos animais, demonstrando o envolvimento da
obesidade como agente predisponente à DA. Contudo, os animais que receberam a dieta fonte
de ômega-3 apresentaram maior incorporação desses ácidos graxos no hipocampo, redução da
neuroinflamação e restabelecimento da sensibilidade sistêmica à insulina e atenuação do
processo neurodegenerativo devido à redução dos marcadores predisponentes à DA. Assim, foi
notado melhora cognitiva dos animais tratados quando comparados ao grupo obeso. O grupo
tratado também apresentou aumento no conteúdo proteico do GPR120 e redução da p-TAK1,
o que implica na atividade deste receptor na desarticulação da neuroinflamação. Esta hipótese
foi parcialmente comprovada ao desafiar as células N2a com palmitato e posteriormente tratá-
las com ômega-3 purificado. Ao silenciar o GPR120, ocorreu redução na potência da resposta
anti-inflamatória. Conclusão: A simples substituição de parte da gordura animal por alimentos
fontes de ácidos graxos ômega-3 foi capaz de atenuar as alterações moleculares desencadeadas
pela obesidade que aceleram o declínio cognitivo e predispõe o surgimento da DA. A atividade
do GPR120 se mostrou importante para a mediação dos fenômenos coordenados pelo ômega-
3.
Palavras-chave: Obesidade; Neuroinflamação; Ômega-3; GPR120; Doença de Alzheimer
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ABSTRACT
Introduction: Obesity is one of the main factors that induces inflammation and insulin
resistance. The perpetuation of these molecular alterations has been associated to cognitive
impairments and the onset of neurodegenerative diseases, such as the Alzheimer’s Disease
(AD). Objective: Evaluate if the consumption of omega-3 rich sources would be able to regulate
the inflammatory process in the hippocampus of obese and insulin resistance mice through the
GPR120 receptor, which could improve cognition and reduce the risk of developing AD.
Materials and Methods: Swiss mice were induced to obesity and received a high fat diet with
one third of the lard content replaced by flaxseed oil. During the experiments, animals were
submitted to glucose and insulin tolerance tests, as well as the Morris Water Maze. At the end
of the experiments, hippocampus was extracted to histological analysis by fluorescence and
electronic microscopy, gas chromatography mass spectrometry; immunoblotting and RT-
qPCR. Cell culture lines of N2a were used to investigate the mechanism of action of the
GPR120 receptor as a catalyst of the omega-3 effects. Results: Obese group demonstrated
higher weight gain, reduced glucose tolerance and insulin sensitivity, as wells as a cognitive
impairment when compared to the control group. Obesogenic process was able to induce insulin
resistance in association with inflammation, endoplasmic reticulum stress and apoptosis
markers, while simultaneously reduced the autophagic process on the hippocampus of these
animals. Also, it was found elevated levels of βA and hyperphosphorylation of tau-protein,
associated with a neurodegeneration in the hippocampus, demonstrating the obesity role in the
onset of AD. However, animals that were fed with the flax seed oil omega-3 rich diet were able
to incorporate these fatty acids into their hippocampus, reduced neuroinflammation,
reestablishment of systemic insulin sensitivity, along with a reduced neurodegenerative process
as shown by decreased biomarkers of AD. Thus, these alterations reflected in the improvement
of the cognitive behavior of these animals when compared with the obesity only group. Flax
seed oil-treated group also shown increased GPR120 protein content and a reduction in p-TAK1
content, which indicates the activity of this receptor and its involvement in the discontinuity of
the neuroinflammation. This hypothesis was partially proved when N2a cells lines were defied
with palmitate, following treatment with purified omega-3. When GPR120 was silenced, there
was a decrease in the magnitude of the anti-inflammatory response. Conclusion: The simple
replacement of some animal fat content with rich sources of omega-3, such as the flaxseed oil,
were able to attenuate molecular alterations induced by obesity, which are responsible for a
decline in cognition and the onset of AD. GPR120 activity shown to be an important mediator
of the omega-3 effects.
Keywords: Obesity; Neuroinflammation; Omega 3; GPR120; Alzheimer's disease
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LISTA DE FIGURAS
Fig 1 Vias moleculares afetadas pela obesidade ....................................................................... 17
Fig 2 Vias possivelmente relacionadas com o aumento do risco da Doença de Alzheimer ..... 20
Fig 3 Ação anti-inflamatória do receptor GPR120 ................................................................... 22
Fig 4 Delineamento experimental ............................................................................................. 25
Fig 5 Desenho experimental da cultura de células N2a. ........................................................... 33
Fig 6 Análise de bioinformática do GRP120 no hipocampo de camundongos BXD. ............. 34
Fig 7 Perfil dos ácidos graxos das dietas experimentais .......................................................... 36
Fig 8 Dados fisiológicos dos animais durante o período de indução da obesidade .................. 37
Fig 9 Dados fisiológicos dos animais durante todo o experimento .......................................... 38
Fig 10 Metabolismo glicídico dos animais experimentais ....................................................... 39
Fig 11 Perfil lipídico dos animais experimentais ..................................................................... 40
Fig 12 Perfil de ácidos graxos do soro dos animais experimentais .......................................... 42
Fig 13 Perfil de ácidos graxos do hipocampo dos animais experimentais ............................... 44
Fig 14 Teste cognitivo Morris Water Maze .............................................................................. 45
Fig 15 Análise ultraestrutural do hipocampo dos animais experimentais ................................ 46
Fig 16 Proteínas relacionadas à via inflamatória ...................................................................... 47
Fig 17 Proteínas relacionadas à ativação do complexo inflamassomo ..................................... 48
Fig 18 Proteínas relacionadas ao estresse de retículo endoplasmático e apoptose ................... 48
Fig 19 Proteínas relacionadas à autofagia ................................................................................ 49
Fig 20 Proteínas relacionadas à sinalização da insulina ........................................................... 50
Fig 21. Proteínas relacionadas ao surgimento da Doença de Alzheimer .................................. 51
Fig 22 Proteínas relacionadas à via do GPR120 ....................................................................... 52
Fig 23 Distribuição do GPR120 e sua co-localização com neurônios do hipocampo .............. 54
Fig 24 Distribuição do GPR120 e sua co-localização com astrócitos do hipocampo .............. 55
Fig 25 Distribuição hipocampal da β-amiloide (βA) e sua co-localização com o GPR120 ..... 56
Fig 26 Ensaio de ligação entre GPR120 e β-arrestina 2 em células N2a ................................. 57
Fig 27 Silenciamento do receptor GPR120 em células N2a tratadas com ALA ...................... 59
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição das dietas experimentais ..................................................................... 26
Tabela 2. Perfil dos ácidos graxos do óleo de linhaça e das dietas experimentais .................. 35
Tabela 3. Perfil de ácidos graxos do soro dos animais experimentais .................................... 41
Tabela 4. Perfil de ácidos graxos do hipocampo dos animais experimentais .......................... 43
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LISTA DE ABREVIAÇÕES
AGMS: ácidos graxos monoinsaturados
AGPI: ácidos graxos poli-insaturados
AGS: ácidos graxos saturados
ALA: ácido graxo alfa-linolênico
APP: proteína precursora amiloide
AUC: área sob a curva
βA: proteína β-amiloide
BACE1: enzima clivadora do sítio beta da APP 1
BF3: trifluoreto de boro
CDK5: quinase dependente de ciclina 5
CT: grupo controle
DA: Doença de Alzheimer
DM2: Diabetes Mellitus tipo 2
FS: dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça
GPCR: receptor acoplado a proteína G
GSK3β: glicogênio sintase quinase beta
HF: dieta hiperlipídica
i.c.v: intracerebroventricular
IDE: enzima degradadora de insulina
i.p: intraperitoneal
IKK: inibidora da quinase kappa
IL: interleucina
IR: receptor de insulina
IRS1/2: substrato do receptor de insulina 1/2
JNK: quinase c-Jun n-terminal
Kitt: constante de decaimento da glicose sérica
LPS: lipopolissacarídeo
MWM: teste cognitivo Morris Water Maze
NFκB: fator nuclear kappa B
NLRP3: receptor do tipo NOD 3
PP2A: proteína fosfatase 2A
SNC: sistema nervoso central
TAB1/2: proteína 1 ligadora da TAK1
TAK1: quinase 1 ativada por fator de crescimento transformador β
TLR4: receptor do tipo Toll 4
TNF-α: fator de necrose tumoral α
TTG: teste de tolerância à glicose
TTI: teste de tolerância à insulina
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 15
1.1 Obesidade e Metainflamação ........................................................................................... 15
1.2 Neuroinflamação, Resistência à Insulina e Doença de Alzheimer................................... 17
1.3 Ação Anti-inflamatória do Ômega 3 ................................................................................ 20
1.4 Ômega 3 e Doença de Alzheimer ..................................................................................... 23
2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 24
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................................. 24
2.2 Objetivos Específicos: ...................................................................................................... 24
3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 25
3.1 Bioinformática .................................................................................................................. 25
3.2 Delineamento Experimental ............................................................................................. 25
3.3 Teste de Tolerância Intraperitoneal à Insulina (TTI) ....................................................... 26
3.4 Teste de Tolerância Intraperitoneal à Glicose (TTG) ...................................................... 27
3.5 Teste Cognitivo Morris Water Maze ................................................................................ 27
3.6 Coleta do Material Biológico ........................................................................................... 27
3.7 Análise Bioquímica .......................................................................................................... 28
3.8 Análise do Perfil Lipídico ................................................................................................ 28
3.8.1 Preparo das Amostras ................................................................................................. 28
3.8.2 Condições Cromatográficas ........................................................................................ 29
3.9 Immunobloting ................................................................................................................. 29
3.10 RT-qPCR ........................................................................................................................ 30
3.11 Imunofluorescência ........................................................................................................ 30
3.12 Microscopia Eletrônica de Transmissão ........................................................................ 31
3.13 Cultura de Célula Neuro2A ............................................................................................ 31
3.13.1 Ensaio de Ligação do GPR120 com a β-arrestina 2 ................................................. 31
3.13.2 Silenciamento do Receptor GPR120 ........................................................................ 32
3.14 Análise Estatística .......................................................................................................... 33
4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 34
4.1 Análise de Bioinformática ................................................................................................ 34
4.2 Dietas Experimentais ....................................................................................................... 35
4.3 Caracterização do Modelo Experimental ......................................................................... 36
4.4 Tratamento da Obesidade com Óleo de Semente de Linhaça .......................................... 37
4.4.1 Peso e Parâmetros Metabólicos .................................................................................. 37
4.4.2 Perfil de Ácidos Graxos no Soro e Hipocampo dos Animais ..................................... 40
4.4.3 Teste Cognitivo ........................................................................................................... 44
4.4.4 Análise Ultraestrutural do Hipocampo dos Animais Experimentais .......................... 45
4.4.5 Proteínas relacionadas com inflamação, estresse de retículo, autofagia e apoptose ... 47
4.4.6 Proteínas da Via de Sinalização da Insulina ............................................................... 49
4.4.7 Marcadores da Doença de Alzheimer ......................................................................... 50
4.4.8 Presença do GPR120 no Hipocampo .......................................................................... 51
4.5 Silenciamento do Receptor GPR120 ................................................................................ 57
5. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 60
6 CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 66
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 68
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1 INTRODUÇÃO
1.1 Obesidade e Metainflamação
A obesidade é considerada um problema de saúde pública mundial e sua prevalência
atinge níveis pandêmicos (Swinburn et al., 2011). Segundo a Organização Mundial da saúde,
nos últimos 40 anos a prevalência mundial da obesidade triplicou. Em 2016, cerca de 1,9 bilhões
de adultos estavam com sobrepeso, e deste total, aproximadamente 650 milhões estavam com
obesidade. De forma preocupante, o número de crianças acima do peso tem crescido na mesma
proporção, sendo que no mesmo ano foram estimadas que 381 milhões de crianças, entre 0 e
19 anos, estavam acima do peso ou obesas (WHO, 2018). Entre as doenças crônicas não
transmissíveis, a obesidade tem ganhado destaque por ser um importante fator de risco para o
surgimento precoce de doenças, como o Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2), doenças
cardiovasculares, osteoartrite, doenças pulmonares e doenças neurodegenerativas (WHO, 2018;
Nyberg et al., 2018; Guh et al., 2009; Mazon et al., 2017).
A obesidade é caracterizada pelo aumento da adiposidade corporal e consequentemente
pelo o aumento da liberação de adipocinas na corrente sanguínea. A dispersão sistêmica dessas
proteínas, em concentração suprafisiológica, lhes confere caráter pró-inflamatório, afetando o
funcionamento de diversos tecidos envolvidos no controle metabólico. Esta inflamação crônica,
de baixo grau, induzida pela obesidade é denominada “metainflamação” e atualmente é
considerado o principal fator de risco para o surgimento das comorbidades associadas à
obesidade (Hotamisligil, 2017).
Entretanto, acredita-se que a perda na homeostase do imunometabolismo pode ocorrer
antes mesmo da instalação da obesidade. Pesquisas recentes demonstram que tanto a exposição
aguda (Nakandakari et al., 2019; Thaler et al., 2012) quanto crônica à dieta hiperlipídica
(Sobesky et al., 2014; Sobesky et al., 2016; Spencer et al., 2017) são capazes de desencadear o
processo inflamatório de baixo grau no sistema nervoso central de animais experimentais.
Estudos relatam que o consumo de dietas ricas em gordura saturada seja capaz de ativar
receptores da resposta imune inata, como TLR4 (receptores do tipo Toll 4), e desencadear a
resposta inflamatória tanto periférica quanto no SNC (Hua et al., 2007; Milanski et al., 2009;
Okun et al., 2012). O consumo destas dietas também é capaz de ativar outras estruturas
relacionadas ao sistema imune inato, como o complexo do inflamassomo NLRP3 (receptores
do tipo NOD 3) (Sobesky et al., 2016). A junção das proteínas NLPR3, ASC e caspase 1,
formam este complexo que, quando ativado, cliva e ativa IL-1β e IL-18, contribuindo para
16
intensificação e propagação do processo inflamatório (Legrand-Poels et al., 2014; Wen et al.,
2014).
Tanto a ativação do TLR4, quanto dos receptores de IL-1β e TNF-α levam à ativação
de TAB1/2 (proteína 1 ligadora da TAK1) e subsequentemente indução da ubiquitinação e
fosforilação da proteína TAK1 (quinase 1 ativada por fator de crescimento transformador β). A
jusante a esta via está a fosforilação e ativação das proteínas IKK (inibidora da quinase kappa)
e JNK (quinase c-Jun n-terminal). Essas proteínas atuam como serinas quinases, induzindo a
fosforilação do substrato 1 do receptor de insulina (IRS-1) em seu resíduo de serina, na posição
307. Isso, por sua vez, impede a correta propagação intracelular do sinal da insulina (Hirosumi
et al., 2002). A ativação de IKK também pode levar à desestruturação do complexo IκBα/NFκB,
liberando o NFκB para controlar a transcrição nuclear de genes responsáveis por diversas
proteínas de caráter inflamatório como TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS, COX2, MCP1 e a
contrarreguladora IL-10. Estas citocinas, em quantidades elevadas, adquirem caráter pró-
inflamatório, e podem agir de forma autócrina e parácrina, perpetuando o processo inflamatório
que instala e intensifica a resistência à insulina (Shoelson, Lee, Yuan, 2003).
A obesidade e o consumo excessivo de gordura saturada também podem afetar as vias
de autofagia (Yang et al., 2010). Tais prejuízos nos mecanismos celulares de degradação de
organelas e proteínas danificadas podem favorecer a formação de agregados proteicos e
interferir na função do retículo endoplasmático, estrutura fundamental para a síntese e
enovelamento proteico. A redução crônica do processo autofágico em conjunto com o aumento
do estresse de retículo endoplasmático gera o acúmulo de proteínas mal formadas e
disfuncionais, que ativam o mecanismo de UPR (do inglês Unfolded Protein Response) (Yang
et al., 2017; Cybulsky, 2017). Diversos estudos sugerem que estas alterações moleculares
favorecem a resistência à insulina em diversos tecidos e, com isso, contribuem para alteração
no metabolismo de macronutrientes hepáticos, prejuízo na captação de glicose em órgãos
periféricos, prejuízo no controle hipotalâmico da fome e prejuízos cognitivos (Hummasti,
Hotamisligil, 2010; Cai et al., 2016; Yang et al., 2017; Cybulsky, 2017) (Figura 1).
17
Figura 1. Vias moleculares afetadas pela obesidade. Com a obesidade e padrões inadequados de alimentação há
ativação dos receptores de citocinas inflamatórias e dos receptores do sistema imune inato, como TLR4 e
inflamassomo. Estes receptores exacerbam a resposta inflamatória e levam a ativação de proteínas quinases como
JNK e IKK que bloqueiam a propagação do sinal intracelular da insulina e fosforilam a proteína IkBa,
respectivamente. Uma vez fosforilada, IkBa é degradada e permite que a proteína NFkB migre ao núcleo e favoreça
a ativação de mais proteínas com atividade pró-inflamatória. A obesidade e o consumo excessivo de gordura
saturada também prejudicam os mecanismos moleculares de autofagia e com isso aumentam o estresse de retículo
endoplasmático. Tais alterações moleculares intensificam a resistência à insulina e promovem a apoptose em
diferentes tipos celulares que compõem diversos tecidos periféricos e o SNC, e assim, favorecem o surgimento
das comorbidades associadas à obesidade.
1.2 Neuroinflamação, Resistência à Insulina e Doença de Alzheimer
Estudos epidemiológicos evidenciam que a obesidade se correlaciona positivamente
com o declínio cognitivo, atrofia cerebral, redução da substância branca, prejuízo na integridade
da barreira hematoencefálica e risco elevado no desenvolvimento de doenças
neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer (DA) (Profenno et al., 2010; Loef, Walach,
2013; Gottesman et al., 2017). Possivelmente a exposição crônica a dietas de baixa qualidade
nutricional, sedentarismo e todas as alterações metabólicas desencadeadas pela obesidade
possam estar relacionadas com a fisiopatologia da DA devido à neuroinflamação e resistência
à insulina, fenômenos comuns a estas doenças (Pugazhenthi et al., 2017; Alford et al., 2018).
18
A doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa de maior prevalência na
população mundial, sendo responsável por mais de 80% dos casos de demência diagnosticados
(Kumar, Singh, Ekavali, 2015). Aproximadamente 46,8 milhões de pessoas no mundo são
acometidas por algum tipo de demência e estima-se que a prevalência deva aumentar para 74,7
milhões de casos em 2030 e 131,5 milhões em 2050 (Prince et al., 2018).
Para ser possível controlar a progressão da DA, é necessário compreender os fenômenos
moleculares e os fatores que favorecem seu surgimento. Análises histológicas no cérebro de
pacientes com a DA mostram maior atrofia do córtex e hipocampo, redução no número de
neurônios, presença extracelular de placas amiloides e acúmulo intraneural de emaranhados
neurofibrilares, decorrentes da aglomeração de proteína β-amiloide (βA) e da proteína tau
hiperfosforilada, respectivamente (Querfurth, LaFerla, 2010). Acredita-se que estes dois
últimos fatores sejam primordiais para a gênese da doença (Cerpa, Dinamarca, Inestrosa, 2008;
Querfurth, LaFerla, 2010).
Os peptídeos de βA são naturalmente produzidos no organismo por meio clivagem da
proteína precursora de amiloide (APP) sob a ação da enzima BACE1 (do inglês beta-site APP-
cleaving enzyme 1) e posteriormente pela γ–secretase (Querfurth, LaFerla, 2010). Em condições
adversas, pode ocorrer o desequilíbrio entre a síntese e degradação de βA, levando ao seu
acúmulo. Os monômeros de βA podem se agrupar e formar oligômeros solúveis de βA que são
capazes de se ligar aos receptores de neurotransmissores e impedir a propagação do impulso
nervoso (Strooper, Karran, 2016). Evidências sugerem que os oligômeros também sejam
capazes de desencadear resistência à insulina e ativar vias inflamatórias e de estresse de retículo
endoplasmático, conduzindo à hiperfosforilação da proteína tau e ativação de vias apoptóticas,
que culminam em neurodegeneração (Querfurth, LaFerla, 2010; Yu, Tan, Hardy, 2014).
A proteína tau se encontra ancorada aos microtúbulos e é responsável por dar
estabilidade a esta estrutura celular. A atividade da tau pode ser regulada por proteínas quinases,
como a glicogênio sintase quinase beta (GSK3β) e quinase dependente de ciclina 5 (CDK5),
como também pode sofrer ação de proteínas fosfatases, como a proteína fosfatase 2A (PP2A)
(Mazanetz, Fischer, 2007; Querfurth, LaFerla, 2010; Huang, Mucke, 2012; Liu et al. 2016). A
hiperativação da GSK3β e da CDK5 no sistema nervoso central pode favorecer a
hiperfosforilação da proteína tau. Uma vez hiperfosforilada, a proteína tau se desassocia do
microtúbulo e se acumula no citosol, formando os emaranhados neurofibrilares. Devido à
dissociação com a proteína tau, o microtúbulo perde sua estabilidade, o que resulta no prejuízo
do transporte intracelular e perda na estrutura do neurônio (Querfurth, LaFerla, 2010).
19
A fisiopatologia da DA ainda não é totalmente compreendida, porém diversos
pesquisadores sustentam a hipótese sobre a ativação do sistema imune inato em seu
desenvolvimento (Heneka, Golenbock, Latz, 2015; Rangasamy et al., 2018; Shi, Holtzman,
2018). Sabe-se que a constante ativação da imunidade inata no sistema nervoso central (SNC)
resulta na neuroinflamação e, consequentemente, na resistência local à insulina (Steen et al.,
2005; de la Monte, Wands, 2008; de la Monte, 2009; Lourenco et al., 2013; Dineley, Jahrling,
Denner, 2014; De Felice, Ferreira, 2014; Mullins et al. 2017; Pugazhenthi, Qin, Reddy, 2017;
Arnold et al., 2018). O bloqueio na via da insulina no hipocampo está relacionado a prejuízos
no metabolismo energético celular, disfunções mitocondriais e prejuízo na transdução sináptica
(Neth, Craft, 2017). A resistência à insulina também está correlacionada ao aumento do
conteúdo de marcadores da DA, como βA e p-tau, possivelmente pelo aumento da atividade de
GSK3 (Biessels, Reagan, 2015; Neth, Craft, 2017) (Figura 2).
Embora diversos estudos tenham sugerido que a resistência à insulina seja responsável
por aumentar os marcadores da DA, recentemente descobriu-se que a simples presença de βA
seria capaz de ativar a micróglia e astrócitos, intensificando o processo inflamatório e afetando
a via sinalização da insulina (Forny-Germano et al., 2014; Zhao et al., 2017).
Diante o exposto, é notório o fato de que a dieta rica em gordura saturada pode ser o
ponto inicial para o desencadeamento do processo inflamatório, o qual pode culminar na
resistência à insulina e, posteriormente, instalação da obesidade, DM2 e demais comorbidades,
como a DA (Kothari et al., 2017; Spencer et al., 2017; Nakandakari et al., 2019). Dessa forma,
estratégia importante para a contenção do avanço da DA seria a reversão do processo
inflamatório ocasionado por padrões alimentares incorretos e pela própria obesidade. Associado
a isto, o consumo de alimentos com potencial anti-inflamatório poderia interferir na transdução
da sinalização inflamatória, reduzindo sistemicamente o tônus inflamatório e, assim,
restabelecer a via da insulina e retardar o surgimento da DA.
20
Figura 2. Vias possivelmente relacionadas com o aumento do risco da Doença de Alzheimer. O aumento da
ativação de receptores do sistema imune inato, como TLR4 e NLRP3, assim como os de citocinas inflamatórias
estão associados ao aumento da inflamação hipocampal, do estresse de retículo endoplasmático, da resistência à
insulina, assim como redução da autofagia. Estas condições favorecem a formação dos agregados proteicos - tanto
os emaranhados neurofibrilares, como as placas amiloides – pelo aumento na produção de βA e a hiperfosforilação
da proteína tau, assim como prejuízo nos mecanismos celulares de depuração destas proteínas. Tais aglomerados
proteicos são associados ao aumento do estresse oxidativo, aumento do processo inflamatório, prejuízo nas funções
celulares e à morte celular.
1.3 Ação Anti-inflamatória do Ômega 3
Os ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 (ω3) e ômega-6 (ω6), são ácidos graxos
essenciais, uma vez que são indispensáveis para a manutenção das funções fisiológicas e não
são sintetizados pelo organismo humano devido a limitação endógena das enzimas
dessaturases, que convertem o ácido oleico (ω9, 18:1) em linoleico (ω6, 18:2) e, posteriormente,
em alfa-linolênico (ω3, 18:3) (Curi et al., 2002; Saini; Keum, 2018).
Os ácidos graxos essenciais são importantes constituintes da membrana das células, da
bainha de mielina, da estrutura retiniana e favorecem a propagação do impulso nervoso, além
de controlar o sistema imunológico e a agregação plaquetária. Os principais ácidos graxos da
família ω6 são o ácido linoleico (LA, 18:2) e o seu derivado alongado, ácido araquidônico
21
(ARA, 20:4). Já os principais ácidos graxos da família ω3 são o ácido α-linolênico (ALA, 18:3),
de origem vegetal, e seus derivados alongados, o ácido eicosapentaenóico (EPA, 20:5) e
docosahexaenóico (DHA, 22:6), geralmente encontrados em fontes animais marinhas (Curi et
al., 2002; Sain; Keum, 2018).
Devido a incapacidade do organismo humano sintetizar os ácidos graxos essenciais,
estes necessitam ser adquiridos pela alimentação (Sain; Keum, 2018). Contudo, é necessário o
consumo equilibrado entre as fontes de ω6 e de ω3 para manutenção do equilíbrio inflamatório.
Estima-se que a maior parte da população ocidental tenha o consumo de ω6 muito superior ao
de ω3, perfazendo razão de 20:1 (ω6: ω3), resultando na maior produção de eicosanoides com
potencialidade inflamatória. Esta razão elevada se associa ao surgimento de doenças
cardiovasculares, câncer e doenças inflamatórias e autoimunes. Visando a prevenção destas
doenças, estudos tem demonstrado que a redução desta razão para 5:1 já é satisfatória na
redução do processo inflamatório, como também para manutenção da homeostase cerebral
(Simopoulos, 2008; Simopoulos, 2011; Simopoulos, 2016).
O ácido LA pode ser encontrado em óleo de milho, girassol, gergelim, prímula e
amendoim, enquanto o ARA pode ser encontrado em produtos de origem animal, como carnes
e ovos. O ALA pode ser encontrado em fontes vegetais como chia, linhaça, nozes, canola e
soja, enquanto os seus derivados, EPA e DHA, podem ser encontrados em grandes quantidades
em vísceras e óleos extraídos de peixes (Fleming, Kris-Etherton, 2014).
Dentre as várias alegações benéficas que os ácidos graxos ω3 recebem, figuram entre as
principais a capacidade na redução do processo inflamatório em geral. Apesar de muitos estudos
utilizarem os ácidos graxos de fontes marinhas (EPA e DHA) como as principais moléculas
representativas desse efeitos anti-inflamatórios, o ALA, de origem vegetal, desempenhar com
efetividade esta mesma função (Ren, Chung, 2007; Oliveira et al. 2015; Dátilo et al 2018).
Antigamente, acreditava-se que o efeito anti-inflamatório do ALA ocorria apenas após
sua conversão em EPA e DHA. Contudo, nas últimas décadas, comprovou-se a ação anti-
inflamatória desses ácidos graxos ocorrem antes mesmo deles serem internalizados pela célula,
uma vez que todas as isoformas dos ácidos graxos ω3 se utilizam do mesmo receptor para a
propagação do seu efeito anti-inflamatório (Oh, Walenta, 2014). O GPR120 é um receptor da
família dos GPCRs (receptores acoplados à proteína G), com especificidade de reconhecimento
de ácidos graxos ω3. Ao ser ativado, este receptor se associa fisicamente à proteína β-arrestina
2. A partir desta configuração, ocorre a atração das proteínas TAB1/2 (Oh et al., 2010) e do
NLRP3 (Yan et al., 2013), formando então um grande complexo proteico. Uma vez associadas
a este complexo, as proteínas TAB1/2 não são capazes de fosforilar a proteína TAK1, com
22
consequente ativação da via inflamatória coordenada, a partir daí, pelo NFκB (Oh et al., 2010).
Além disso, ao se associar ao NLRP3, a β-arrestina 2 impede a que o complexo do
inflamassomo seja estruturado para a clivagem e ativação das citocinas IL-1β e IL-18 (Yan et
al., 2013) (Figura 3). Estudos já demonstraram a participação do GPR120 na inibição parcial
do processo inflamatório, no fígado, músculo esquelético, tecido adiposo (Oliveira et al., 2015),
aorta (Moura-Assis et al., 2018), retina (Dátilo et al., 2018) e hipotálamo (Cintra et al., 2012),
restabelecendo parcialmente a função nesses tecidos.
Além de apresentar mecanismos moleculares semelhantes ao EPA e ao DHA, o ALA
apresenta características específicas que aumentam o interesse na utilização dessa molécula.
Um fator relevante é que fontes alimentares de ALA são mais acessíveis e confiáveis de ácidos
graxos ômega 3 para a população (Cunnane et al., 1993). Não há evidências na literatura
científica de fraudes na composição desses produtos, entretanto, cápsulas de óleo de peixe são
produtos comumente flagrados em testes de validação de qualidade, no Brasil (Galuch et al.,
2018) e no exterior (Ritter, Budge, Jovica, 2012).
Figura 3. Ação anti-inflamatória do receptor GPR120. Quando os ácidos graxos da família ω3 (ALA, EPA ou
DHA) se ligam ao receptor GPR120 há o recrutamento da proteína β-arrestina e, consequentemente, a atração das
proteínas TAB1 e NLRP3, o que impede a propagação do sinal inflamatório.
23
1.4 Ômega 3 e Doença de Alzheimer
Os ácidos graxos ω3 são os compostos nutricionais mais estudados como alternativa não
farmacológica na prevenção e tratamento da DA. Alguns ensaios clínicos randomizados já
associaram o consumo crônico de fontes de ω3 à melhora cognitiva em pacientes no início da
DA, quando há apenas comprometimento cognitivo leve (Huang & Mucke, 2012; Hjorth et al.,
2013; Teng et al., 2015; Canhada et al., 2018). Entretanto, não há evidência científicas quanto
a sua efetividade no tratamento a curto e médio prazo na fase moderada e avançada da DA
(Araya-Quintanilla; Canhada et al., 2018).
Aparentemente, os maiores benefícios são encontrados no consumo crônico desde
ácidos graxo como forma preventiva ao surgimento da DA. Dados epidemiológicos têm
demonstrado correlação negativa entre o consumo de fontes de ω3 e o aumento do risco de
doenças demenciais, como a DA (Cole et al., 2014; Wu et al., 2015). Fonteh et al (2014) ao
analisarem o líquido cefalorraquidiano de pacientes saudáveis, com declínio cognitivo leve e
com DA, observaram redução significativa de ácidos graxos ω3 em pacientes com DA.
Entre os ácidos graxos da família ω3, o EPA e o DHA são os mais estudados no controle
da DA. Além de proteger contra vários fatores de risco associados à DA, como
neuroinflamação, resistência à insulina e dislipidemia, eles parecem desempenhar importante
papel neuroprotetor por reduzir a razão cerebral de ω6:ω3, o conteúdo da proteína β-amiloide
e a morte neuronal, assim como, melhorar a função cognitiva (Labrousse et al., 2012;
Hooijmans et al., 2012, Cole et al., 2014).
Embora muitos estudos clínicos tenham observado melhora cognitiva em indivíduos
suplementados cronicamente com DHA, poucos estudos exploraram a ação central do ALA,
ou mesmo do EPA e DHA, sobre os reais mecanismos moleculares pelos quais estes ácidos
graxos agiriam no hipocampo e postergariam a gênese da DA. Dessa forma, este trabalho
pretendeu investigar a ação do ALA e as vias moleculares pelas quais ele agiria para prevenir
e proteger o hipocampo de animais obesos e resistentes à insulina da instalação e avanço dos
desarranjos neuronais precursores da DA.
24
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar se o consumo de fontes de ômega 3 seria capaz de controlar o processo
inflamatório no hipocampo de camundongos obesos por meio da ação do receptor GPR120 e
assim melhorar a cognição e reduzir o risco do surgimento da DA.
2.2 Objetivos Específicos:
• Avaliar as alterações metabólicas sistêmicas nos animais experimentais induzidos à
obesidade por dieta hiperlipídica.
• Avaliar o perfil de ácidos graxos do soro e do hipocampo dos animais experimentais.
• Avaliar a formação e retenção da memória em camundongos obesos e resistentes à
insulina, bem como o possível papel protetor do ômega 3.
• Determinar o perfil de proteínas controladoras da inflamação, estresse de retículo,
autofagia, resistência à insulina e apoptose no hipocampo dos camundongos obesos, e avaliar
se o consumo de fontes de ômega 3 é capaz de reverter estes parâmetros.
• Identificar os principais marcadores que precedem ou participam da gênese da Doença
de Alzheimer no hipocampo de camundongos obesos e resistentes à insulina, e a ação do ômega
3 na reversão destes fatores.
• Delinear a distribuição do receptor GPR120 nas diferentes regiões do hipocampo e nos
diferentes tipos celulares hipocampais.
• Inibir o GPR120 para determinação de sua função como mediador dos possíveis
benefícios dos ácidos graxos ômega-3 em neurônios hipocampais.
25
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Bioinformática
Inicialmente foi realizado análise de bioinformática utilizando o conjunto de dados do
hipocampo de camundongos com a diversidade genética BXD (UTHSC Hippocampus Illumina
v6.1 NON (Nov12) RankInv). Esse conjunto de dados é acessível no site Genetwork
(http://www.genenetwork.org). O gráfico de calor (heat map) foi elaborado no software Gene-
E®.
3.2 Delineamento Experimental
Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da
Universidade Estadual de Campinas com o número de protocolo 4973-1/2018 (Anexo 1). Para
o ensaio biológico foram utilizados camundongos Swiss, com cinco semanas de vida,
provenientes do Biotério Central da Universidade de Campinas (CEMIB). Os animais foram
separados em três grupos experimentais (n=30 animais/grupo): grupo controle (CT), grupo
obeso alimentado com dieta hiperlipídica (HF) e grupo obeso tratado com dieta hiperlipídica
com óleo de semente de linhaça (FS) (Figura 4).
Figura 4. Delineamento experimental. CT: grupo controle; HF: grupo obeso alimentado com dieta hiperlipídica;
FS: grupo obeso tratado com dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça; TTI: teste de tolerância à insulina;
TTG: teste de tolerância à glicose. MET: microscopia eletrônica de transmissão. GC-MS: cromatografia a gás
acoplada ao espectrômetro de massas. N= 30 animais por grupo.
Com o objetivo de induzir o ganho de peso e resistência à insulina, característicos do
processo obesogênico, durante as oito primeiras semanas experimentais, os animais foram
alimentados com dieta hiperlipídica (do inglês high fat diet – HF). Esta dieta foi baseada no
modelo AIN-93G, do American Institute of Nutrition (Reeves et al., 1993). Entretanto, teve seu
26
conteúdo lipídico modificado de 4% para 35%, sendo 4% de óleo de soja e 31% de gordura
suína, como fonte de ácidos graxos saturados. Após a instalação da obesidade e confirmação da
resistência à insulina, os animais foram redistribuídos em dois outros grupos, onde um grupo
continuou a receber dieta hiperlipídica (grupo HF) e outro que recebeu HF com substituição de
1/3 da gordura suína por óleo de semente de linhaça (grupo FS – do inglês Flax seed) por mais
8 semanas. O grupo controle (CT) foi mantido em ração comercial (Nuvilab®) durante todo o
período experimental (Tabela 1). Durante as 16 semanas experimentais, os animais
permaneceram em gaiolas individuais de polietileno, em estantes ventiladas, com condições
controladas de temperatura (23 °C ± 2) e ciclo claro-escuro (12/12h), com água e dieta ad
libitum. O peso e a ingestão alimentar dos animais experimentais foram monitorados
semanalmente.
Tabela 1. Composição das dietas experimentais
Ingredientes HF (g/Kg) FS (g/kg)
Amido Q.S.P 115,5 115,5
Caseína 200 200
Amido dextrinizado 132 132
Sacarose 100 100
Celulose microfina 50 50
Óleo de soja 40 40
Gordura Suína 312 208
Óleo de linhaça - 104
Mix de minerais 35 35
Mix de vitaminas 10 10
L-cistina 3 3
Bitartarato de colina 2,5 2,5
kcal/g 5,4 5,4
3.3 Teste de Tolerância Intraperitoneal à Insulina (TTI)
A sensibilidade à insulina dos animais foi avaliada por meio do TTI na 8ª e 15ª semana
experimental. Para esta análise, os animais permaneceram em jejum por 8 horas, sendo
realizado punção caudal para coleta do sangue e dosagem da glicemia (tempo zero).
Posteriormente, aplicou-se insulina intraperitoneal (i.p) na dosagem de 1,5 U/Kg de peso e o
sangue foi coletado nos tempos 5, 10, 15, 20, 25 e 30 min. A constante de decaimento da glicose
sérica (Kitt) foi calculada segundo Bonora et al. (1989). Os níveis de glicose sérica foram
medidos por meio do glicosímetro da marca Accu-Chek (Roche®).
27
3.4 Teste de Tolerância Intraperitoneal à Glicose (TTG)
A tolerância à glicose dos animais foi avaliada por meio do TTG na 15ª semana
experimental. Após jejum de 8 horas, coletou-se sangue por punção caudal para a dosagem da
glicemia de jejum (tempo zero). Em sequência, injetou-se solução glicosada a 25% (1 g/Kg de
peso corporal) por via i.p., com posteriores coletas de amostras sanguíneas nos tempos 30, 60,
90 e 120 minutos. Os resultados foram avaliados a partir da determinação da área sob a curva
(AUC) da glicose sérica durante todo teste, utilizando o programa Microsoft Excel 2013. Os
níveis de glicose sérica foram aferidos por meio do glicosímetro da marca Accu-Chek®
(Roche®).
3.5 Teste Cognitivo Morris Water Maze
O teste do labirinto aquático Morris Water Maze (MWM) foi realizado na 15ª semana
experimental para avaliar as funções cognitivas de aprendizado e memória (Sase et al., 2013).
Antes da realização do teste os animais foram adaptados ao meio aquático durante cinco dias
para minimizar o estresse durante o teste. O labirinto aquático foi realizado em piscina circular
(2 m de diâmetro e 70 cm de profundidade) com temperatura da água controlada (25 ºC ± 1). A
piscina foi dividida em quadrantes (norte, sul, leste e oeste) onde no quadrante norte estava
localizado a plataforma de escape circular (15 cm de diâmetro). O teste de aprendizado durou
cinco dias e em todos os dias os camundongos realizavam quatro tentativas para localizar a
plataforma de escape. Cada tentativa era iniciada em um quadrante diferente do labirinto, com
60 segundos de tolerância para que os animais encontrassem a plataforma. No primeiro dia do
teste, a água do labirinto estava limpa e a plataforma se encontrava a 1 cm da superfície da
água. Nos demais dias, a água foi tingida com corante escuro e a plataforma escondida a 1 cm
da superfície da água. O tempo em que o camundongo demorou a encontrar a plataforma foi
denominado latência de escape.
O teste de retenção de memória foi realizado no sexto dia. Para isso, a plataforma de
escape foi removida da piscina e o animal permaneceu 60 segundos no labirinto. Foi
contabilizado apenas o tempo em que o camundongo permaneceu no quadrante norte (local
onde a plataforma de escape estava localizada durante o período de aprendizagem).
3.6 Coleta do Material Biológico
Ao final do período experimental, os animais foram mantidos em jejum por 8 horas,
sendo posteriormente anestesiados com ketamina e xilazina (100 mg/kg e 10 mg/kg,
28
respectivamente). Após a perda dos reflexos pedais, caudais e corneais, 5 animais/grupo foram
perfundidos com solução fixadora Karnovsky e o encéfalo destinado à microscopia eletrônica
de transmissão (MET) e 5 animais/grupo foram perfundidos com paraformaldeído a 4% e o
encéfalo destinado à técnica histológica de imunofluorescência. Posteriormente, mais 5
animais/grupo foram submetidos à cirurgia estereotáxica para a infusão de insulina (2 µL, 200
mU) no ventrículo lateral direito (AP: -0,34 mm; LT: -1,0 mm; DV: -2,2 mm). Após 15 minutos
da infusão, os animais foram decapitados e o hipocampo coletado para avaliação posterior de
proteínas da via da insulina. O restante dos animais (n=15 animais/grupo) foi decapitado para
coleta do sangue e do hipocampo para posterior análise de cromatografia, immunobloting e RT-
qPCR.
3.7 Análise Bioquímica
No último dia do experimento, antes da eutanásia dos animais, foi coletada uma gota de
sangue proveniente da cauda dos animais para análise em tiras reagentes de colesterol total e
triglicerídeos, por meio do equipamento Accutrend Plus (Roche®).
Para analisar a concentração plasmática de insulina, o sangue coletado após a eutanásia
foi centrifugado a 3500 RPM, a 4 ºC, por 15 minutos. No soro dosou-se a concentração de
insulina utilizando-se o kit ELISA #EZRMI-13K (Millipore).
3.8 Análise do Perfil Lipídico
3.8.1 Preparo das Amostras
As frações lipídicas das dietas experimentais e do hipocampo dos animais foram
extraídas a frio por meio da técnica adaptada de Folch (1957), em que 1 mg da dieta foi
adicionada à 1 mL de clorofórmio:metanol (2:1 v/v) e um hemisfério do hipocampo foi
adicionado à 200 µL da mesma solução de clorofórmio:metanol. As amostras foram
homogeneizadas no TissueLyser (QIAGEN®), centrifugadas a 13.000 x g por 2 minutos e
posteriormente o sobrenadante foi coletado.
As frações lipídicas da dieta e do hipocampo, assim como o soro dos animais foram
esterificadas segundo o método proposto por Shirai, Suzuki e Wada (2005), utilizando 50 µL
das frações lipídicas das dietas experimentais e 150 µL do soro e das frações lipídicas do
hipocampo dos animais. As amostras foram transferidas para tubos de vidros com tampa de
rosca e foram adicionados a 1 mL NaOH metanólico a 0,5 M. As amostras foram agitadas e
aquecidas em banho-maria por 15 minutos a 100ºC. Em seguida, as amostras foram resfriadas,
29
adicionados a elas 2 mL de BF3 (trifluoreto de boro, Sigma-Aldrich) e foram novamente
agitadas e aquecidas em banho-maria por 20 segundos a 100ºC. As amostras foram resfriadas
novamente e adicionadas a elas 1 mL de isoctano e, após a agitação do tubo, mais 5 mL de
solução saturada de NaCl. O sobrenadante foi coletado, evaporado com auxílio de nitrogênio
gasoso e ressuspenso em 200 µL de hexano para a realização da análise cromatográfica.
3.8.2 Condições Cromatográficas
A análise cromatográfica foi realizada em cromatógrafo a gás acoplado ao
espectrômetro de massas (GCMS-QP2010 Ultra; Shimadzu®), utilizando coluna de sílica
fundida Stabilwax (30 m de comprimento; 0,25 mm de diâmetro interno; 0,25 µm de espessura;
Restek®). O gás hélio ultrapuro foi utilizado como gás de arraste a um fluxo de 1,3 mL/min.
Através de um injetor automático (AOC-20i), injetou-se 1 µL de amostra, na razão de divisão
de 1:30. A temperatura do injetor foi mantida em 250 ºC, enquanto a programação de
aquecimento do forno iniciou-se a 80 ºC, com velocidade de aquecimento programado em
rampa de 5 ºC/min até 175 ºC, seguido por uma taxa de aquecimento de 3 ºC/min até 230 ºC,
onde a temperatura foi mantida por 20 minutos. O espectrômetro de massa seguiu as seguintes
condições: voltagem de ionização de 70 eV, temperatura da fonte de ionização de 200 ºC, modo
de escaneamento completo com amplitude de 35-500 m/z e velocidade de 0,2 seg. por
escaneamento.
3.9 Immunobloting
O hipocampo foi homogeneizado em tampão de extração que continha 1% de Triton X
100, 100 mM de Tris (pH 7,4), 100 mM de pirofosfato de sódio, 100 mM de fluoreto de sódio,
10 mM de EDTA, 10 mM de ortovanadato de sódio, 2 mM de PMSF e 0,1 mg/mL de aprotinina,
a 4 ºC no homogeneizador TissueLyser (QIAGEN®). O tecido lisado foi centrifugado a 11.000
RPM, a 4 ºC, por 40 min e o sobrenadante coletado. Posteriormente foi analisada a concentração
proteica do sobrenadante pelo método de Bradford (1976) e as amostras foram concentradas
entre 30-50 µg de proteína para realização da técnica de imunnobloting. As amostras foram
incubadas com tampão Leammli a 95 ºC por 5 minutos e posteriormente aplicadas em de gel
de poliacrilamina (10 a 15%) para separação por eletroforese (SDS-PAGE). As proteínas
presentes no gel foram transferidas para membranas de nitrocelulose e a eficiência da
transferência foi confirmada por meio do corante vermelho Ponceau. Sequencialmente, as
membranas foram incubadas em solução de leite em pó a 5%, por 1 hora. A seguir, as
30
membranas foram incubadas overnight com os anticorpos primários de interesse e,
posteriormente, com os respectivos anticorpos secundários. As bandas foram obtidas por meio
de quimiluminescência e visualizadas com o auxílio de fotodocumentador (G:BOX Chemi
XRQ – Syngene – EUA). As bandas foram quantificadas utilizando o software UN-SCAN-IT
gel 6.1. As imagens obtidas apresentadas neste trabalho são originais, não foram cortadas,
giradas, invertidas ou emendadas. Os anticorpos utilizados foram: IL-1β (AB_2124616), TNF-
α (AB_315422), p-JNK (sc 6254), p-IKK (# 2697S), IκBα (sc-847), p-eIF2α (#9721), eIF2α
(#9722), CHOP (sc-793), Bcl2 (sc-7382), BAX (sc-526), p-IRS1Tyr612 (sc-17195), p-IRS1Ser307
(sc-33956), p-IRTyr972 (07-838), p-AKT (sc 33437), AKT (sc-8312), β-amiloide (sc-374527), p-
tau (sc-71794), IDE (sc-393887), p-GSK3β (sc-373800), GSK3β (sc-9166), p-CDK5 (sc
12918), CDK5 (sc-6247), GPR120 (sc-48203), p-TAK1 (#9339), TAK1 (sc 7967), ASC (sc
22514), NLRP3 (#15101), IL-18 (sc-7954), caspase-1(sc-56036), LC3 A/B (#4108s), p62
(#5114), Beclin (#3738) e β-actina (sc-47778).
3.10 RT-qPCR
Para obtenção do RNA, o hipocampo dos animais foi homogeneizado com o reagente
PureZOL®, de acordo com as recomendações do fabricante. O total de RNA foi quantificado
com auxílio do Nanodrop 8000 (Thermo Scientific) e 2 µg de amostra foram utilizados para
síntese de cDNA, utilizando o kit de transcrição reversa High Capacity (Applied Biosystems).
As reações da PCR foram preparadas utilizando o sistema TaqMan® e 40 ng de cDNA. Para
cada reação foi utilizado 3 µL de Master Mix; 0,25 µL de primer; 0,75 µL de água DEPC e 5
µL de amostra. Em seguida, a análise da expressão gênica foi realizada no sistema de análise
em tempo real StepOneTM (AppliedBiosystems). O conteúdo relativo de mRNAs foi
determinado após a normalização com GAPDH usando o método 2^-ΔΔCT (Livak, Schmittgen,
2001). Os primers utilizados foram: GPR120 (Mm00725193_m1), GAPDH
(Mm99999915_g1).
3.11 Imunofluorescência
Os animais destinados à análise histológica por imunofluorescência foram previamente
anestesiados e fixados com solução de paraformaldeído a 4%, como descritos previamente no
item 3.6. Após fixação, o encéfalo dos animais foi coletado e imerso na mesma solução fixadora
por 24 h, a 4 ºC. Os encéfalos foram criopreservados em solução de sacarose a 30% e realizados
cortes coronais (15 μm) com auxílio do criostato (Leica CM1850). Os cortes foram incubados
31
em solução bloqueadora (1 × TBST com 3% de BSA) e posteriormente incubados overnight
com anticorpos primários de interesse na diluição de 1:100 (Moura-Assis et al., 2018): GPR120
(sc-48203), β-amiloide (sc-374527), GFAP (ab7260), NeuN (ABN78c3), β-arrestina2 (sc-
13140). Em seguida, os cortes foram incubados com anticorpos secundários IgG conjugados
com fluoróforo verde FITC (1:100; Santa Cruz, CA, EUA) ou fluoróforo vermelho rodamina
(1:200; Santa Cruz, CA, EUA). Por fim, os cortes foram montados com Vectashield Mounting
Medium com DAPI (# H-1200 Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA), corando o núcleo
de azul. As imagens foram capturadas usando o software Leica Application Suite®.
3.12 Microscopia Eletrônica de Transmissão
Os animais destinados à técnica de microscopia eletrônica de transmissão foram
anestesiados e fixados em solução de glutaraldeído (2.5%) e paraformaldeído (1%), conforme
descrito anteriormente no item 3.5. O hipocampo foi coletado e posteriormente imerso na
mesma solução fixadora por sete dias a 4° C. Após a fixação completa do tecido, o hipocampo
foi fragmentado em hemisfério direito e esquerdo e pós-fixados em solução de tetróxido de
ósmio a 1% em tampão fosfato de sódio a 0.2 M, pH 7,38. Em sequência, os fragmentos foram
desidratados em série crescente de álcool e acetona, sendo incluídos em resina araldite
(Durcupan, Fluka®). Os blocos foram desbastados e as secções semi-finas obtidas (0,5 µm)
foram coradas com azul de toluidina 0,25% para a observação ao microscópio óptico. Foram
realizados os cortes ultrafinos com espessura de 70 ƞm (Ultramicrótomo Ultracut UCT, LEICA)
os quais foram coletados em telas de cobre recobertas com formvar. Após contraste em acetato
de uranila a 2% e citrato de chumbo, os cortes foram observados no microscópio eletrônico
Tecnai G2 Spirit Bio-twin (FEI, Holanda) operando a 80 KV.
Para análise ultraestrutural, foram analisados dois neurônios piramidais da região do
cornu ammonis 1 (CA1)/animal/grupo. Os neurônios foram analisados qualitativamente,
levando em consideração as alterações no microambiente e nas estruturas celulares associados
à perda de função ou degeneração neuronal.
3.13 Cultura de Célula Neuro2A
3.13.1 Ensaio de Ligação do GPR120 com a β-arrestina 2
Para avaliar o possível mecanismo de ação do GPR120 em linhagens de células N2a e
determinar do tempo de ligação entre o GPR120 e a β-arrestina 2, as células Neuro2A (N2A)
foram cultivadas em DMEM/HamF12, suplementado com penicilina-estreptomicina a 1% (Life
32
Technologies) e 10 % de FBS (Fetal Bovine Serum) e posteriormente tratadas com 50 µM de
palmitato (PA) ou 50 µM de ALA. Após 5 e 30 minutos, o meio foi coletado e as células fixadas
com formol a 4%. As células fixadas foram destinadas à análise de imunofluorescência (item
3.11)
3.13.2 Silenciamento do Receptor GPR120
Inicialmente as células Neuro2A (N2A) foram cultivadas em DMEM/HamF12,
suplementado com penicilina-estreptomicina a 1% (Life Technologies) e 10 % de FBS (Fetal
Bovine Serum). As células foram cultivadas em placas de 6 poços e incubadas a 37 ºC, sob
atmosfera de 5 % de CO2.
Antes do início do experimento as células foram diferenciadas em meio
DMEM/HamF12 suplementado apenas com penicilina-estreptomicina a 1% por 24 horas. Após
a diferenciação, as células foram transfectadas por 48 horas com siRNA para o GPR120 (sc-
60738) ou com o controle negativo do siRNA (Ambion #4390843), utilizando o reagente de
transfecção Lipofectamina® RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific), seguindo condições
previamente estabelecidas pelo fabricante. Após o silenciamento do GPR120, iniciou-se o
tratamento. As células do grupo controle (CT) foram tratadas com meio DMEM/HamF12,
suplementado com 10 % de FBS por 3 horas. As células do grupo palmitato (PA) foram
inicialmente tratadas com meio suplementado com 10% de FBS e 100 µM de palmitato por 90
minutos e posteriormente o meio foi coletado e um novo meio, nas mesmas condições que o
anterior, foi adicionado à placa.
As células do grupo alfa-linolênico (PA+ALA) foram inicialmente tratadas com meio
suplementado com 10% de FBS e 100 µM de palmitato por 90 minutos e posteriormente o meio
foi coletado e as células foram tratadas com meio suplementado com 10% de FBS e 50 µM de
palmitato (P9767, Sigma-Aldrich) mais 50 µM de ácido alfa-linolênico (L2376, Sigma-
Aldrich) por mais 90 minutos. As células do grupo alfa-linolênico com siRNA para o GPR120
(si-PA+ALA) receberam o mesmo tratado das células do grupo PA+ALA, contudo, este foi o
único grupo em que o GPR120 foi silenciado (Figura 5). Todos os ácidos graxos utilizados
neste estudo foram previamente conjugados com BSA livre de ácidos graxos (Sigma-Aldrich),
seguindo a metodologia proposta por Kim et al., 2017.
Para extração das proteínas as células foram ressuspensas em tampão de extração, como
citado no item 3.8. Os lisados celulares foram incubados em gelo por 15 minutos e
centrifugados a 11.000 x g por 10 minutos a 4 ºC. Os sobrenadantes foram coletados e as
proteínas quantificadas para realização da técnica de immunobloting (item 3.8).
33
Figura 5. Desenho experimental da cultura de células N2a. CT: controle; PA: palmitato; ALA: ácido α-linolênico;
si: siRNA GPR120.
3.14 Análise Estatística
Os dados da bioinformática foram analisados por meio da correlação de Pearson. A
análise dos dados no período de indução da obesidade (CT vs HF) foi realizada por meio do
teste t não pareado. A análise dos dados após o tratamento dos animais foi realizada por meio
da ANOVA, seguidos do teste de Bonferroni, utilizando o grupo obeso como grupo de
referência. A análise estatística dos dados obtidos em cultura de célula foi realizada por meio
da ANOVA, seguidos do teste de Tukey. Para todas as análises foi adotado o nível de
significância de 5% (p<0,05). Todos os resultados foram expressos como média ± desvio
padrão (DP) e a normalidade dos dados foi comprovada por meio do teste de Kolmogorov-
Smirnov. As análises foram realizadas com auxílio da versão demonstrativa do software
GraphPad Prism®, v5.0.
34
4 RESULTADOS
4.1 Análise de Bioinformática
Ao realizar a análise de bioinformática do GPR120 no hipocampo de animais BXD
eutróficos foi possível observar alta correlação entre a expressão gênica deste receptor com a
expressão gênica de proteínas relacionadas ao processo inflamatório, como NLRP3 (r=0,81),
TLR4 (r=0,80), caspase 1 (r=0,57), IRAK4 (r=0,46) e IL-1β (r=0,48) (Figura 6A). Ao ranquear
as linhagens com menor expressão e as com maior expressão gênica do GRP120 (Figura 6B) e
compará-las com a expressão dos genes relacionados com o processo inflamatório, torna-se
notória a relação proporcional entre elas (Figura 6C).
Figura 6. Análise de bioinformática da expressão do GRP120 no hipocampo de camundongos BXD. (A)
Correlação de Pearson entre os valores de mRNA de GPR120 contra mRNA de genes relacionados a proteínas
inflamatórias. (B) Linhagens de BXD ranqueadas pelo conteúdo de mRNA de GPR120 no hipocampo. As
amostras marcadas em amarelo foram as escolhidas para construção do heat map. (C) Heat map dos valores
relativos de mRNA de GPR120 contra os valores de mRNA de genes relacionados a proteínas inflamatórias no
hipocampo de 9 linhagens de camundongos BXD.
35
4.2 Dietas Experimentais
Antes do início do experimento, o perfil dos ácidos graxos do óleo de semente de linhaça
e das dietas utilizadas durante o estudo foi analisado para determinação da sua qualidade. O
óleo de linhaça apresentou aproximadamente 60% de ácido alfa-linolênico (ALA),
demonstrando ser uma fonte abundante de ω3. Como esperado, a dieta HF continha
aproximadamente 47% de gordura saturada, valores superiores aos encontrados na dieta CT
(24%) e na dieta FS (26%). A dieta FS apresentou diferentes proporções de gordura saturada,
monoinsaturada e poli-insaturada, quando comparadas a dieta HF assim como melhor
proporção de ω6:ω3 (Tabela 2 e Figura 7).
Tabela 2. Perfil dos ácidos graxos do óleo de semente de linhaça e das dietas experimentais
Ácido graxo Óleo de linhaça CT HF FS
C14:0 0,06 ± 0,00 ND 1,43 ± 0,04 0,76 ± 0,00
C16:0 5,98 ± 0,02 18,60 ± 0,37 27,58 ± 0,05 16,36 ± 0,00
C16:1 ω7 0,08 ± 0,01 ND 1,27 ± 0,03 1,26 ± 0,02
C17:0 ND ND 0,41 ± 0,01 0,22 ± 0,00
C17:1 ω7 ND ND 0,14 ± 0,04 0,13 ± 0,02
C18:0 3,43 ± 0,04 4,28 ± 0,11 17,15 + 0,23 8,65 ± 0,3
C18:1 ω9 14,67 ± 0,04 23,22 ± 0,07 31,15 ± 0,28 30,77 ± 0,4
C18:1 ω7 0,74 ± 0,01 1,32 ± 0,03 1,83 ± 0,03 2,01 ± 0,01
C18:2 ω6 15,37 ± 0,09 47,36 ± 0,40 16,56 ± 0,17 20,49 ± 0,03
C18:3 ω3 59,52 ± 0,15 3,54 ± 0,07 0,84 ± 0,03 18,43 ± 0,04
C20:0 ND 0,55 ± 0,01 0,24 ± 0,02 0,21 ± 0,05
C20:1 ω9 0,08 ± 0,00 0,51 ± 0,11 0,67 0,01 0,47 ± 0,02
C20:2 ω6 ND ND 0,58 ± 0,02 ND
C20:4 ω6 ND ND 0,14 ± 0,07 0,13 ± 0,02
C22:0 0,07 ± 0,06 0,63 ± 0,12 ND 0,10 ± 0,04
∑ AGS 9,54 ± 0,01 24,05 ± 0,41 46,81 ± 0,48 26,23 ± 0,08
∑ AGMI 15,57 ± 0,07 25,05 ± 0,07 35,06 ± 0,23 34,64 ± 0,03
∑ AGPI 74,89 ± 0,06 50,89 ± 0,47 18,12 ± 0,24 39,06 ± 0,04
∑ ω6 15,37 ± 0,09 47,36 ± 0,40 17,29 ± 0,17 20,62 ± 0,21
∑ ω3 59,52 ± 0,15 3,54 ± 0,07 0,84 ± 0,03 18,43 ± 0,01
ω6:ω3 0,26 ± 0,00 13,39 ± 0,18 20,61 ± 0,33 1,12 ± 0,04
Os dados foram realizados em triplicata e expressos em média ± desvio padrão (DP). ND: ácidos graxos não
detectados. CT: ração comercial; HF: dieta hiperlipídica; FS: dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça.
AGS: ácido graxo saturado; AGMI: ácido graxo monoinsaturado; AGPI: ácido graxo poli-insaturado.
36
CT HF FS0
20
40
60
6D
Ácid
os g
raxo
s (
%)
Figura 7. Perfil dos ácidos graxos das dietas experimentais. (A) Porcentagem dos ácidos graxos saturados, (B)
Porcentagem dos ácidos graxos monoinsaturados, (C) Porcentagem dos ácidos graxos poli-insaturados, (D)
Porcentagem dos ácidos graxos ômega 6, (E) Porcentagem dos ácidos graxos ômega 3, (E) Razão entre os ácidos
graxos ômega 6: ômega 3. CT: grupo controle; HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica; FS: grupo obeso
que recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça. Dados expressos como média ± DP.
4.3 Caracterização do Modelo Experimental
O maior consumo calórico durante as oito primeiras semanas do experimento
proporcionou ganho de peso 2,7 vezes maior no grupo HF em comparação aos animais do grupo
CT (Figura 8A-C) (p<0,05). Além disso, foi observado aumento de 1,6 vezes na glicemia de
jejum dos animais do grupo HF quando comparados ao grupo CT, assim como prejuízo na
sensibilidade à insulina devido à redução de 1,8 vezes no valor do Kitt (p<0,05) (Figura 8D-F).
Dessa forma, caracterizaram-se os animais do grupo HF como obesos e diabéticos.
CT HF FS0
5
10
15
20
3E
Ácid
os g
raxo
s (
%)
CT HF FS0
5
10
15
20
25
F
Ra
zã
o
6:
3
CT HF FS0
10
20
30
40
50
AGSA
Ácid
os g
raxo
s (
%)
CT HF FS0
10
20
30
40
50
AGMIB
Ácid
os g
raxo
s (
%)
CT HF FS0
20
40
60
AGPIC
Ácid
os g
raxo
s (
%)
37
Figura 8. Dados fisiológicos dos animais durante o período de indução da obesidade. (A) Evolução ponderal (CT=
30 animais; HF=60 animais). (B) Delta do ganho de peso ao final do período de indução da obesidade (CT= 30
animais; HF=60 animais). (C) Ingestão alimentar (CT= 15 animais; HF=15 animais). (D) Glicemia de jejum (CT=
15 animais; HF=30 animais). (E) Curva de decaimento da glicose sanguínea após o teste de tolerância à insulina
(TTI). (F) Constante de decaimento da glicose sanguínea (KITT) durante o TTI (CT= 15 animais; HF=30 animais).
CT: grupo controle; HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica. *p<0,05 pelo teste t não pareado. Dados
expressos como média ± DP.
4.4 Tratamento da Obesidade com Óleo de Semente de Linhaça
4.4.1 Peso e Parâmetros Metabólicos
Ao final do experimento o grupo HF apresentou ganho de peso 2,3 vezes superior ao
grupo CT (p<0,05). Embora não tenha sido encontrada diferença na ingestão alimentar dos
animais do grupo HF para o grupo FS (p>0,05) (Figura 9C), a substituição de ⅓ da gordura
suína presente na dieta HF por óleo de semente de linhaça foi eficaz em retardar o ganho de
peso, uma vez que o ganho final do grupo FS foi 1,2 vezes menor que o encontrado no grupo
HF (p<0,05) (Figura 9A,B).
CT HF0
2
4
6*
F
KIT
T (
% m
in)
0 5 10 15 20 25 300
100
200
300
400CT
HF
**
**
**
*
E
Minutos
Gli
cem
ia (
mg
/dL
)
CT HF0
100
200
300
400
*
D
Gli
cem
ia d
e j
eju
m (
mg
/dL
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
20
40
60
80 CT
OB
**
******
A
Semanas
Gan
ho
de p
eso
(g
)
CT HF0
10
20
30
40
*
B
G
an
ho
de p
eso
1 2 3 4 5 6 7 8
10
15
20
25
30
CT
HF
*
**
**
** *
C
Semanas
Ing
estã
o a
lim
en
tar
(kcal/
dia
)
38
Figura 9. Dados fisiológicos dos animais durante todo o experimento. (A) Progressão do ganho de peso durante
todo o experimento. (B) Delta do ganho de peso ao final do experimento (n=15 animais/grupo). CT: grupo controle;
HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica. *p<0,05 vs HF pelo teste de Bonferroni. Dados expressos como
média ± DP.
Ao final do período experimental, o grupo HF apresentou aumento de 1,6 vezes na
glicemia de jejum (p<0,05), 5,5 vezes na insulinemia de jejum (p<0,05), 1,5 vezes na AUC
(p<0,05) e redução de 2,1 vezes no KITT (p<0,05), o que demonstra considerável intolerância à
glicose e resistência à insulina em comparação ao grupo CT (p<0,05). Por outro lado, apesar do
consumo de dieta FS não ter alterado de forma significante (p>0,05) a insulinemia de jejum
(Figura 10B), se mostrou eficiente em reduzir a glicemia de jejum em aproximadamente 1,6
vezes (p<0,05), melhorar a tolerância à glicose - com redução de 1,2 vezes na AUC (p<0,05) -
e também a sensibilidade à insulina com incremento de 1,6 vezes no KITT (p<0,05) quando
comparados ao grupo HF (Figuras 10A, C-F).
CT HF FS0
10
20
30
40
50
* *
B
G
an
ho
de p
eso
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
20
40
60
80
CT
HF
FS
Indução da obesidade Tratamento da obesidade
* * * * * * * * * * * *** *
A
*
*** * * * *
Semanas
Gan
ho
de p
eso
(g
)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
10
15
20
25
30
CT
HF
FS
Indução da obesidade Tratamento da obesidade
** * * * * ********
**
C
Semanas
Ing
estã
o a
lim
en
tar
(kcal/
dia
)
39
Figura 10. Metabolismo glicídico dos animais experimentais. (A) Glicemia de jejum (n=15 animais/grupo). (B)
Insulinemia de jejum (n=12 animais/grupo). (C) Curva de decaimento da glicose sanguínea após o teste de
tolerância à glicose (TTG). (D) Área sob a curva após o teste TTG (n=15 animais/grupo). (E) Curva de decaimento
da glicose sanguínea após o teste de tolerância à insulina (TTI). (F) Constante de decaimento da glicose sanguínea
durante o TTI (n= 15 animais/grupo). Nos gráficos A, B, D e F: *p<0.05 vs HF pelo teste de Bonferroni. Nos
gráficos C e E: *p<0,05 vs CT pelo teste de Bonferroni e #p<0.05 vs FS pelo teste de Bonferroni. CT: grupo
controle; HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica; FS: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica com
óleo de semente de linhaça. Dados expressos como média ± DP.
Ainda, a dieta FS reduziu a concentração sérica de colesterol total em 1,2 vezes em
comparação ao grupo HF (p<0,05), sem alterar os níveis de triglicerídeos (Figura 11).
CT HF FS0.0
0.5
1.0
1.5
2.0*
B
Insu
lin
a s
éri
ca (
ng
/mL
)
CT HF FS0
100
200
300
400
* *
A
Gli
cem
ia d
e j
eju
m (
mg
/dL
)
0 5 10 15 20 25 300
100
200
300
400CT
HF
FS* #* #
* #
* #
* #
* #
* #
E
Minutos
Gli
cem
ia (
mg
/dL
)
0 30 60 90 1200
200
400
600CT
HF
FS
* #
* #
* #
* #
* #
C
Minutos
Gli
cem
ia (
mg
/dL
)
CT HF FS0
10000
20000
30000
40000
50000 * *D
AU
C (
un
idad
e a
rbit
rári
a)
CT HF FS0
2
4
6
* *
F
KIT
T (
%/m
in)
40
Figura 11. Perfil lipídico dos animais experimentais. (A) Concentração do colesterol total no sangue capilar e (B)
triglicerídeos. *p<0.05 vs HF pelo teste de Bonferroni. CT: grupo controle; HF: grupo obeso que recebeu dieta
hiperlipídica; FS: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça (n=8
animais/grupo). Dados expressos como média ± DP.
4.4.2 Perfil de Ácidos Graxos no Soro e Hipocampo dos Animais
Os animas do grupo HF apresentaram alterações significativas no perfil de ácidos graxos
séricos quando comparados ao grupo CT, como aumento de 3,5% na concentração de ácidos
graxos saturados (AGS) e redução de 1,8% e 1,6% nos ácidos graxos monoinsaturados (AGMI)
e poli-insaturados (AGPI), respectivamente (p<0,05) (Tabela 3 e Figura 12). Embora os animais
do grupo HF tenham apresentado alterações nas concentrações de AGPI, a razão ω6:ω3
permaneceu semelhante ao grupo CT. Não foram encontradas alterações significativas no
conteúdo total de AGS, AGMI e AGPI no hipocampo dos animais do grupo HF em comparação
ao CT (Tabela 4 e Figura 13).
O consumo de dieta FS além de reduzir o conteúdo sérico AGS em aproximadamente
2,5% (p<0,05), melhorou a razão entre ω6:ω3, que passou de 11:1 no grupo HF para 5:1 no
grupo FS (p<0,05). A melhora na razão ω6:ω3 no grupo FS foi devido ao aumento na proporção
de ácidos graxos da família ω3 (C18:3, C20:5 e C22:6) e redução dos ácidos graxos da família
ω6 (C20:4 e C22:4) (p<0,05) (Tabela 3). De forma interessantemente, o consumo de dieta FS
também foi capaz de promover o aumento de 1,7% no conteúdo total dos ácidos graxos ω3 no
hipocampo dos animais do grupo FS em comparação com os animais do grupo HF (p<0,05)
(Tabela 4 e Figura 13).
CT HF FS0
50
100
150
200
250**
A
Co
leste
rol
tota
l (m
g/d
L)
CT HF FS0
50
100
150
200B
Tri
gli
cerí
deo
s (
mg
/dL
)
41
Tabela 3. Perfil de ácidos graxos do soro dos animais experimentais
Ácido Graxo CT HF FS
C12:0 0,07 ± 0,01* 0,03 ± 0,01 0,04 ± 0,02
C14:0 0,25 ± 0,05* 0,14 ± 0,00 0,17 ± 0,02
C15:0 0,14 ± 0,04 0,20 ± 0,19 0,28 ± 0,00
C16:0 20,93 ± 0,89 20,83 ± 0,54 19,00 ± 0,82*
C16:1 ω7 1,95 ± 0,23* 0,70 ± 0,06 0,77 ± 0,08
C17:0 0,24 ± 0,04 0,23 ± 0,03 0,19 ± 0,01
C18:0 8,87 ± 0,71* 12,47 ± 0,93 11,92 ± 0,24
C18:1 ω7 13,86 ± 0,35 14,90 ± 0,88 15,83 ± 1,28
C18:1 ω9 2,85 ± 0,42* 1,48 ± 0,07 1,45 ± 0,20
C18:2 ω6 27,41 ± 0,38* 19,58 ± 1,79 25,30 ± 1,37*
C18:3 ω6 0,19 ± 0,03 0,16 ± 0,02 0,09 ± 0,01*
C18:3 ω3 0,49 ± 0,06* 0,11 ± 0,02 1,40 ± 0,12*
C20:1 ω9 0,41 ± 0,09 0,36 ± 0,07 0,43 ± 0,03
C20:2 ω6 0,29 ± 0,12 0,22 ± 0,02 0,24 ± 0,01
C20:3 ω6 1,57 ± 0,10* 2,19 ± 0,27 2,05 ± 0,21
C20:4 ω6 16,05 ± 0,92* 22,52 ± 0,43 13,19 ± 2,53*
C20:5 ω3 0,16 ± 0,03* 0,11 ± 0,01 1,63 ± 0,02*
C22:4 ω6 0,14 ± 0,02 0,16 ± 0,01 0,07 ± 0,00*
C22:6 ω3 4,15 ± 0,25 3,83 ± 0,66 6,07 ± 0,67*
∑ AGS 30,51 ± 0,47* 33,91 ± 1,56 31,55 ± 0,86*
∑ AGMI 19,07 ± 0,68* 17,29 ± 0,89 18,46 ± 2,01
∑ AGPI 50,42 ± 0,57* 48,80 ± 0,28 49,99 ± 1,15
∑ ω6 45,62 ± 0,61 44,75 ± 1,86 40,97 ± 0,40*
∑ ω3 4,80 ± 0,21 4,05 ± 0,65 9,02 ± 0,75*
ω6:ω3 9,51 ± 0,34 11,32 ± 2,13 4,55 ± 0,33*
Dados expressos como média ± DP. CT: grupo controle; HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica; FS:
grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça. AGS: ácidos graxos saturados;
AGMI: ácidos graxos monoinsaturados; AGPI: ácidos graxos poli-insaturados. *p<0,05 vs HF, pelo teste
Bonferroni (n=5 animais/grupo).
42
Figura 12. Perfil de ácidos graxos do soro dos animais experimentais. (A) Porcentagem dos ácidos graxos
saturados, (B) Porcentagem dos ácidos graxos monoinsaturados, (C) Porcentagem dos ácidos graxos poli-
insaturados, (D) Porcentagem dos ácidos graxos ômega 6, (E) Porcentagem dos ácidos graxos ômega 3, (E) Razão
entre os ácidos graxos ômega 6: ômega 3. CT: grupo controle; HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica;
FS: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça. AGS: ácidos graxos saturados;
AGMI: ácidos graxos monoinsaturados; AGPI: ácidos graxos poli-insaturados. *p<0,05 vs HF, pelo teste
Bonferroni (n=5 animais/grupo). Dados expressos como média ± DP.
CT HF FS0
10
20
30
40
AGS
* *
A
Ácid
os g
raxo
s (
%)
CT HF FS0
5
10
15
20
25
AGMI
*
B
Ácid
os g
raxo
s (
%)
CT HF FS0
20
40
60
AGPIC
Ácid
os g
raxo
s (
%)
CT HF FS0
10
20
30
40
50
6D
*
Ácid
os g
raxo
s (
%)
CT HF FS0
3
6
9
12
3E
*
Ácid
os g
raxo
s (
%)
CT HF FS0
5
10
15
F
*
Ra
zã
o
6:
3
43
Tabela 4. Perfil de ácidos graxos do hipocampo dos animais experimentais
Ácido graxo CT HF FS
C12:0 0,11 ± 0,01* 0,18 ± 0,04 0,14 ± 0,02
C14:0 0,26 ± 0,06 0,34 ± 0,08 0,30 ± 0,06
C15:0 0,05 ±0,01 0,09 ± 0,03 0,07 ± 0,02
C16:0 24,09 ± 0,49 25,13 ± 0,56 24,11 ± 0,93
C16:1 ω7 0,72 ± 0,12 0,66 ± 0,11 0,69 ± 0,06
C17:0 0,17 ± 0,03 0,19 ± 0,01 0,19 ± 0,02
C18:0 23,06 ± 0,64 23,09 ± 0,90 22,67 ± 0,72
C18:1 ω9 19,04 ± 0,72* 17,45 ± 0,84 17,61 ± 0,75
C18:1 ω7 4,41 ±0,29 4,37 ± 0,32 4,19 ± 0,22
C18:2 ω6 1,51 ± 0,30 1,49 ± 0,22 1,44 ± 0,23
C18:3 ω3 0,09 ± 0,03 0,07 ± 0,04 0,15 ± 0,05*
C19:0 0,08 ± 0,01 0,09 ± 0,01 0,09 ± 0,02
C19:1 ω9 0,03 ± 0,03 0,05 ± 0,01 0,05 ± 0,02
C20:1 ω9 1,72 ± 0,25 1,68 ± 0,39 1,64 ± 0,42
C20:1 ω7 0,46 ± 0,09 0,47 ± 0,10 0,42 ± 0,10
C20:2 ω6 0,20 ± 0,06 0,24 ± 0,08 0,20 ± 0,03
C20:3 ω9 0,07 ± 0,01 0,10 ± 0,03 0,09 ± 0,02
C20:3 ω6 0,65 ± 0,12 0,58 ± 0,14 0,77 ± 0,15
C20:4 ω6 9,01 ± 0,32 8,97 ± 0,15 9,26 ± 0,49
C20:5 ω3 ND ND 0,06 ± 0,01
C22:0 0,28 ± 0,01 0,29 ± 0,08 0,28 ± 0,05
C22:1 ω9 0,70 ± 0,09* 0,87 ± 0,10 0,77 ± 0,08
C22:4 ω6 2,98 ± 0,28 3,21 ± 0,31 2,98 ± 0,26
C22:6 ω3 9,80 ± 0,81 9,85 ± 0,64 11,35 ± 0,58*
C23:0 0,15 ± 0,02 0,15 ± 0,05 0,16 ± 0,02
C24:0 0,27 ± 0,02 0,30 ± 0,12 0,29 ± 0,08
C24:1 ω9 0,10 ± 0,03 0,12 ± 0,04 0,10 ± 0,02
∑ AGS 48,52 ± 1,03 49,83 ± 0,89 48,25 ± 1,06
∑ AGMI 27,19 ± 1,02 25,67 ± 1,39 25,48 ± 1,36
∑ AGPI 24,30 ± 0,69 24,49 ± 0,73 26,27 ± 0,97*
∑ ω6 14,35 ± 0,44 14,50 ± 0,28 14,64 ± 0,46
∑ ω3 9,87 ± 0,76 9,90 ± 0,66 11,54 ± 0,61*
ω6:ω3 1,46 ± 0,14 1,47 ± 0,10 1,27 ± 0,05*
Dados expressos como média ± DP. ND: ácidos graxos não detectados. CT: grupo controle; HF: grupo obeso que
recebeu dieta hiperlipídica; FS: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça. AGS:
ácido graxo saturado; AGMI: ácido graxo monoinsaturado; AGPI: ácido graxo poli-insaturado. *p<0,05 vs HF,
pelo teste Bonferroni (n= 5 animais/grupo).
44
Figura 13. Perfil de ácidos graxos do hipocampo dos animais experimentais. (A) Porcentagem dos ácidos graxos
saturados, (B) Porcentagem dos ácidos graxos monoinsaturados, (C) Porcentagem dos ácidos graxos poli-
insaturados, (D) Porcentagem dos ácidos graxos ômega 6, (E) Porcentagem dos ácidos graxos ômega 3, (E) Razão
entre os ácidos graxos ômega 6: ômega 3. CT: grupo controle; HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica;
FS: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça. AGS: ácidos graxos saturados;
AGMI: ácidos graxos monoinsaturados; AGPI: ácidos graxos poli-insaturados. *p<0,05 vs HF, pelo teste
Bonferroni (n=5 animais/grupo). Dados expressos como média ± DP.
4.4.3 Teste Cognitivo
Na última semana experimental, os animais foram submetidos ao teste cognitivo em
labirinto aquático para avaliar a capacidade de formação e retenção de memória. Durante o
primeiro dia do teste, não houve diferença estatística entre os grupos (Figura 14A). Contudo, já
no segundo dia o grupo HF demorou, aproximadamente, 9 segundos a mais para localizar a
plataforma de escape em comparação ao grupo CT (p<0,05), o que demonstra prejuízo na
formação da memória. Este comportamento se manteve durante todos os dias do teste, sendo
que no último dia a diferença na latência de escape dos animais do grupo HF em relação ao CT
foi de 13 segundos (p<0,05). A partir do quarto dia o grupo FS apresentou melhoras
significativas na formação de memória, uma vez que os animais possuíam latência de escape
do labirinto de aproximadamente 7 segundos a menos que os animais do grupo HF (p<0,05).
Ao analisar a retenção de memória observou-se que os animais do grupo HF
apresentaram dificuldade em memorizar o local onde a plataforma de escape costumava estar
CT HF FS0
20
40
60
AGSA
Ácid
os g
raxo
s (
%)
CT HF FS0
10
20
30
AGMIB
Ácid
os g
raxo
s (
%)
CT HF FS0
10
20
30
AGPIC
*
Ácid
os g
raxo
s (
%)
CT HF FS0
5
10
15
20
6D
Ácid
os g
raxo
s (
%)
CT HF FS0
5
10
15
3E
*Á
cid
os g
raxo
s (
%)
CT HF FS0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
F
*
Ra
zã
o
6:
3
45
localizada, permanecendo apenas 20% do tempo no quadrante alvo, enquanto o grupo CT
permaneceu 33% (p<0,05). Em contrapartida, os animais do grupo FS apresentaram maior
capacidade de retenção de memória ao final do teste cognitivo ao permanecer 28% de tempo
no quadrante alvo, ou seja, 8% a mais que o grupo HF (p<0,05) (Figura 14B).
Figura 14. Teste cognitivo Morris Water Maze. (A) Teste de análise da capacidade de formação de memória
durante cinco dias consecutivos; *p<0.05 vs CT pelo teste de Bonferroni e #p<0.05 vs FS pelo teste de Bonferroni.
(B) Teste de retenção de memória no sexto dia do teste cognitivo. *p<0.05 vs HF pelo teste de Bonferroni. CT:
grupo controle; HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica; FS: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica
com óleo de semente de linhaça (n=10 animais/grupo).
4.4.4 Análise Ultraestrutural do Hipocampo dos Animais Experimentais
Por meio da microscopia eletrônica de transmissão foi possível observar considerável
neurodegeneração e alterações estruturais em neurônios dos animais do grupo HF em
comparação ao grupo CT. O grupo HF apresentou neurônios com núcleos menos volumosos e
periféricos; mitocôndrias atrofiadas e com perda de formato; degeneração da estrutura axonal;
redução dos autofagolisossomos; aumento na quantidade da micróglia; maior morte neuronal e
considerável perda da matriz extracelular. Por outro lado, o tratamento com óleo de linhaça foi
eficaz em reestabelecer as alterações encontradas no grupo HF. Os animais do grupo FS
apresentaram neurônios com núcleos mais volumosos e concêntricos; mitocôndrias maiores e
mais alongadas; maior integridade axonal; maior conteúdo de autofagolisossomo; redução na
quantidade de micróglia; assim como menor morte neuronal e maior volume de matriz
extracelular (Figura 15).
CT HF FS0
10
20
30
40
50
**
B
Tem
po
no
qu
ad
ran
te a
lvo
(%
)
1 2 3 4 5
20
40
60CT
HF
FS*
* #
* #*
A
Dias
Latê
ncia
de e
scap
e (
seg
)
46
Figura 15. Análise ultraestrutural do hipocampo dos animais experimentais. CT: grupo controle; HF: grupo obeso
que recebeu dieta hiperlipídica; FS: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça
(n=3 animais/grupo). As imagens foram fotografadas em aumentos de 440 a 11000x.
47
4.4.5 Proteínas Relacionadas com Inflamação, Estresse de Retículo, Autofagia e Apoptose
Ao analisar o hipocampo dos animais experimentais, observou-se que o grupo HF
apresentou aumento expressivo no conteúdo de proteínas relacionadas com a via inflamatória
quando comparados ao grupo CT, como IL-1β, TNF-α, p-JNK e com consequente redução de
IκBα (p<0,05). Em contrapartida, o grupo FS apresentou redução de nos níveis de IL-1β e p-
JNK, assim como aumento de IκBα quando comparados ao grupo HF (p<0,05) (Figura 16).
Ao analisar as proteínas relacionadas com a via do inflamassomo, não foi observada
diferença no conteúdo da proteína NLRP3 (p>0,05), porém, houve aumento de ASC e das
formas clivadas de caspase 1 e IL-18 no hipocampo dos animais do grupo HF em relação ao
grupo CT (p<0,05). De forma interessante, os animais do grupo FS apresentaram reversão desse
quadro, com redução no conteúdo proteico das proteínas relacionadas com a ativação do
complexo do inflamassomo (p<0,05) (Figura 17).
Figura 16. Proteínas relacionadas à via inflamatória. (A) Conteúdo proteico de IL-1β, TNF-α, p-JNK, p-IKK e
IκBα. (B) Valor expresso em porcentagem a partir da relativização pelo grupo CT. Β-actina foi utilizada como
controle endógeno. CT: grupo controle (n=4); HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica (n=5); FS: grupo
obeso que recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça (n=5). *p<0.05 vs HF pelo teste de
Bonferroni.
Além do aumento da inflamação, o grupo HF apresentou maior conteúdo de proteínas
relacionadas com a via de estresse de retículo endoplasmático, como p-eIF2 α e CHOP
(p<0,05). Não obstante, houve aumento de BAX (p<0,05), sugerindo ativação na via
controladora de morte celular (Figura 18). Este quadro também foi atenuado nos animais do
grupo FS, com considerável aumento da proteína anti-apoptótica Bcl2 (p<0,05).
0
100
200
300
400
500 CTHFFS
IL-1 TNF- p-JNK p-IKK IB
**
**
**
*
p= 0.06
B
% d
o C
T
48
Figura 17. Proteínas relacionadas à ativação do complexo inflamassomo. (A) Conteúdo proteico de NLRP3, ASC,
Caspase-1 clivada, IL-18 clivada. (B) Valor expresso em porcentagem a partir da relativização pelo grupo CT. Β-
actina foi utilizada como controle endógeno. CT: grupo controle (n=4); HF: grupo obeso que recebeu dieta
hiperlipídica (n=5); FS: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça (n=5).
*p<0,05 vs HF pelo teste de Bonferroni.
Figura 18. Proteínas relacionadas ao estresse de retículo endoplasmático e apoptose. (A) Conteúdo proteico de p-
eIF2α, CHOP, BAX e Bcl2. (B) Valor expresso em porcentagem a partir da relativização pelo grupo CT. Β-actina
foi utilizada como controle endógeno. CT: grupo controle (n=4); HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica
(n=5); FS: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça (n=5). *p<0.05 vs HF pelo
teste de Bonferroni.
O grupo HF também apresentou redução na autofagia devido à redução no conteúdo de
LC3 e aumento de p62 (p<0,05), porém sem alterações no conteúdo de Beclin (p>0,05).
Aparentemente, o processo autofágico foi reestabelecido nos animais do grupo FS em
comparação aos animais do grupo HF (Figura 19).
0
100
200
300
400
p-eIF2 CHOP BAX Bcl2
CTHF
FS
**
** ** *
B
% d
o C
T
0
200
400
600
NLRP3 ASC Caspase-1clivada
IL-18clivada
**
****
p= 0.06
BCTHFFS
% d
o C
T
49
Figura 19. Proteínas relacionadas à autofagia. (A) Conteúdo proteico de LC3 A/B, p62 e Beclin. (B) Valor
expresso em porcentagem a partir da relativização pelo grupo CT. Β-actina foi utilizada como controle endógeno.
CT: grupo controle (n=4); HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica (n=5); FS: grupo obeso que recebeu
dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça (n=5). *p<0,05 vs HF pelo teste de Bonferroni.
4.4.6 Proteínas da Via de Sinalização da Insulina
Após comprovada a eficiência do estímulo central à insulina (Figura 20A e B), todos os
animais que receberam o estímulo foram comparados para avaliar a sensibilidade a este
hormônio. Foi observado que o hipocampo dos animais do grupo HF apresentou prejuízos na
propagação do sinal intracelular da insulina devido aos reduzidos níveis de p-IRStyr972, p-
IRS1Tyr612 e p-Akt, como também aumento nos níveis de p-IRS1Ser307(p<0,05). O consumo da
dieta FS se mostrou eficiente em reestabelecer a propagação do sinal da insulina no hipocampo,
uma vez que foram encontrados níveis elevados de p-IRTyr972, p-IRS1Tyr612, p-Akt e reduzidos
níveis de p-IRS1Ser307 em comparação do grupo HF (p<0,05) (Figura 20C e D).
0
50
100
150
200
250
LC3 p62 Beclin
**
** CT
HF
FS
B
% d
o C
T
50
Figura 20. Proteínas relacionadas à sinalização da insulina. (A) Conteúdo proteico de p-IRS1Tyr612, IRS1, p-Akt
e Akt. (B) Valor expresso em porcentagem a partir da relativização pelo grupo CT. (C) Conteúdo proteico de p-
IRTyr972, IR, p-IRS1Tyr612, p-IRS1Ser307, IRS1, p-Akt e Akt. (D) Valor expresso em porcentagem a partir da
relativização pelo grupo CT. As proteínas totais das respectivas proteínas fosforiladas foram utilizadas como
controle endógeno. CT: grupo controle (n=4); HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica (n=5); FS: grupo
obeso que recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça (n=5). *p<0.05 vs HF pelo teste de
Bonferroni.
4.4.7 Marcadores da Doença de Alzheimer
Os animais do grupo HF apresentaram aumento no conteúdo de proteínas relacionadas
com o surgimento da DA, como a proteína β-amiloide e proteína tau hiperfosforilada (p-tau)
(p<0,05) em relação ao grupo CT. Não foi encontrado diferença nos níveis de IDE (p>0,05),
porém houve aumento na ativação de quinases responsáveis pela fosforilação da proteína tau,
como redução de p-GSK3β e aumento de CDK5 (p<0,05) no grupo HF em comparação ao
grupo CT. Em contrapartida, os animais do grupo FS apresentaram redução no conteúdo de β-
0
100
200
300
p-IRTyr972 p-IRS1Tyr612 p-IRS1Ser307 p-AKT
**
** ** **
CTHFFS
D
% d
o C
T
51
amiloide, p-tau, p-CDK5, assim como aumento de IDE e p-GSK3 (p<0,05) em comparação aos
animais do grupo HF (Figura 21).
Figura 21. Proteínas relacionadas ao surgimento da Doença de Alzheimer. (A) Conteúdo proteico de β-amiloide
(βA), p-tauSer726, IDE, p-GSK3 β, p-CDK5Tyr15. (B) Valor expresso em porcentagem a partir da relativização pelo
grupo CT. Β-actina ou as proteínas totais das respectivas proteínas fosforiladas foram utilizadas como controle
endógeno. CT: grupo controle (n=4); HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica (n=5); FS: grupo obeso que
recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça (n=5). *p<0.05 vs HF pelo teste de Bonferroni.
4.4.8 Presença do GPR120 no Hipocampo
Ao analisar o conteúdo do receptor GPR120 no hipocampo dos animais experimentais,
não foi encontrado diferença nos níveis de mRNA entre os grupos experimentais, no entanto,
foi observado aumento no conteúdo proteico deste receptor. O consumo de dieta rica em
gordura (HF) induziu aumento do conteúdo proteico de GPR120 em comparação ao grupo CT
(p<0,05), enquanto o grupo FS aumentou ainda mais o conteúdo deste receptor em comparação
ao próprio grupo HF (p<0,05). Quanto ao conteúdo proteico da p-TAK, foi observado aumento
no grupo HF e considerável redução no grupo FS (p<0,05) (Figura 22).
0
100
200
300
400
500
A p-tau IDE p-CDK5 p-GSK3
**
B
**
**
***
CTHF
FS
% d
o C
T
52
Figura 22. Proteínas relacionadas à via do GPR120. Conteúdo de mRNA transcritos de GPR120 (n= 5
animais/grupo) (A). Conteúdo proteico de GPR120 (B) e p-TAK1 (C). CT: grupo controle (n=4); HF: grupo obeso
que recebeu dieta hiperlipídica (n=5); FS: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de
linhaça (n=5). p<0.05 vs HF pelo teste de Bonferroni.
Observou-se por meio da análise de imunofluorescência que o GPR120 está presente
em diversas regiões do hipocampo, como CA1, CA2, CA3 e giro denteado, além de estar
presente no córtex (Figuras 23, 24 e 25). O consumo de dieta HF e FS foi capaz de aumentar o
conteúdo deste receptor no hipocampo, sendo que este aumento se deu de forma homogênea
entre as regiões. Foi demonstrado também que este receptor está expresso tanto em neurônios
quanto em astrócitos (Figura 23 e 24).
Por meio das imagens de imunofluorescência também foi possível identificar maior
conteúdo de βA no grupo HF em comparação ao grupo CT. De forma intrigante, o grupo FS
apresentou maior concentração de βA na região de CA1 enquanto o grupo HF apresentou maior
degeneração na região de CA1 e giro. A presença de βA se co-localizou juntamente ao receptor
GPR120 (Figura 25).
53
Continuação da figura
54
Figura 23. Distribuição do receptor GPR120 e sua co-localização com neurônios do hipocampo. Cortes de 15 µm
foram preparados e corados com anticorpos contra GPR120 (Verde – FitC) e NeuN (vermelho – Cy3). CT: grupo
controle; HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica; FS: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica com
óleo de semente de linhaça. (a) Fotomicrografia ilustrativa das áreas hipocampais – aumento de 5x. (b) CA1. (c)
CA2/3. (d) Giro denteado. (e) Córtex. fotomicrografias adquiridas em aumentos de 20x. As imagens em destaque
foram obtidas em aumentos de 40x. Setas indicam a presença do receptor em células neuronais e em outros tipos
celulares.
55
Figura 24. Distribuição do receptor GPR120 e sua co-localização com astrócitos do hipocampo. Cortes de 15 µm
foram preparados e corados com anticorpos contra GPR120 (Verde – FitC) e GFAP (vermelho – Alexa Fluor). As
fotografias foram adquiridas em aumentos de 20x. As imagens em destaque foram obtidas em aumento de 40x.
CT: grupo controle; HF: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica; FS: grupo obeso que recebeu dieta
hiperlipídica com óleo de semente de linhaça. Setas indicam a co-localização do GPR120 com o GFAP.
56
Figura 25. Distribuição hipocampal da proteína β-amiloide (βA) e sua co-localização com o receptor GPR120.
Cortes de 25 µm foram preparados e corados com anticorpos contra GPR120 (Verde – FitC) e βA (vermelho –
rodamina). (a) Fotomicrografia ilustrativa do hemisfério hipocampal direito – aumento de 5x. (b) CA1. (c) Giro
denteado. As fotografias foram adquiridas em aumentos de 20x. CT: grupo controle; HF: grupo obeso que recebeu
dieta hiperlipídica; FS: grupo obeso que recebeu dieta hiperlipídica com óleo de semente de linhaça. Setase
linhanhas segmentadas indicam a co-localização do GPR120 com βA. Linha pontilhada indicam
neurodegeneração.
57
4.5 Silenciamento do Receptor GPR120
Antes do início do experimento com as células N2a, foi realizado ensaio de ligação para
estimar o tempo de associação entre o GPR120 e a β-arrestina 2. Por meio da técnica de
imunofluorescência, foi possível observar que após 30 minutos de tratamento com ALA houve
associação entre estas proteínas, o que sugere ativação do receptor. Tal associação não foi
observada ao tratar as células com as mesmas concentrações de palmitato (Figura 26).
Figura 26. Ensaio de ligação entre GPR120 e β-arrestina 2 em células N2a. As células foram tratadas com 50 µM
de palmitato (Palm) ou 50 µM de ácido alfa-linolênico (ALA). Após 5 ou 30 minutos as células foram fixadas em
formol 4% e destinadas à técnica de imunofluorescência. GPR120 (Verde – FitC) e β-arrestina 2 (vermelho –
rodamina). As fotografias foram adquiridas em aumentos de 40x.
58
Após ensaio de confirmação da associação entre as proteínas GPR120 e β-arrestina 2,
um novo conjunto de células foi desafiado com 100 µM de palmitato. Nas células tratadas com
palmitato (grupo PA), pode-se observar aumento de proteínas com caráter inflamatório, como
p-IKK e p-JNK (p<0,05) e também em proteínas relacionadas ao estresse de retículo
endoplasmático e com a DA, como p-eIF2α e βA, respectivamente (p<0,05) em comparação
aos demais grupos (Figura 25). Em contrapartida, a substituição de parte do palmitato por ALA
(grupo PA+ALA) foi capaz de desarmar as vias inflamatórias previamente instaladas, coma
redução de p-TAK, p-IKK, p-JNK e a proteína precursora de IL-1β (p<0,05). Também houve
redução na fosforilação da eIF2α e no conteúdo de βA no grupo PA+ALA, em comparação ao
grupo PA (p<0,05). Após silenciamento do receptor GPR120 nas células tratadas com ALA (si-
PA+ALA), houve redução de aproximadamente 60% em seu conteúdo em comparação ao
grupo PA+ALA que recebeu o controle negativo para o si-RNA (p<0,05). Contudo, embora
tratadas com a mesma concentração de ALA, a resposta molecular das células com menor
expressão do GPR120 foi distinta a encontrada no grupo PA+ALA. Por mais que seja possível
observar redução nos precursores da IL-1β quando comparados ao grupo PA, não foi possível
observar redução significativa nas demais proteínas inflamatórias. Porém, ao comparar os
efeitos entre o grupo PA+ALA com o si-PA+ALA pode-se notar expressiva perda na potência
do ALA em bloquear as vias inflamatórias, de estresse de retículo e relacionadas à DA (Figura
27).
59
Figura 27. Silenciamento do receptor GPR120 em células N2a tratadas com ALA. (A) Conteúdo proteico de
GPR120, p-TAK1, TAK1, p-IKK, p-JNK, IL-1β, p-eIF2α e β-amiloide. (B) Valor expresso em porcentagem a
partir da relativização pelo grupo CT. Α-Tubulina foi utilizada como controle endógeno. CT: grupo controle; PA:
grupo desafiado com 100 µM palmitato e tratado com 100 µM de palmitato; PA+ALA: grupo desafiado com 100
µM palmitato e tratado com 50 µM de palmitato e 50 µM ácido alfa-linolênico; si-PA+ALA: grupo com
silenciamento do GPR120, desafiado com 100 µM palmitato e tratado com 50 µM de palmitato e 50 µM ácido
alfa-linolênico. O experimento foi realizado em triplicata. *Diferença estatística entre os grupos, p<0.05 pelo teste
de Bonferroni.
0
100
200
300
GPR120 p-IKKp-TAK p-JNK IL-1madura
IL-1precursor
p-eIF2 A
**
** *
* * *
* *
*
*
**
*
* * **
**
**
CTPAPA+ALAsi-PA+ALA
B
% d
o C
T
60
5. DISCUSSÃO
A obesidade é uma doença crônica não transmissível que gera alterações celulares e
metabólicas que estão intimamente relacionados com o aumento do risco do surgimento de
doenças neurodegenerativas, como a DA. Estudos apontam que a neuroinflamação, resistência
à insulina e hipercolesterolemia possam ser os principais fatores que correlacionam à obesidade
à DA (Profenno et al., 2010; Heppner, Ransohoff, Becher, 2015; Neth, Craft, 2017). Ainda não
há cura para a DA, apenas tratamentos farmacológicos que controlam a velocidade de
progressão da doença. Portanto, esforços têm sido feitos para encontrar alvos moleculares
capazes de prevenir ou postergar o surgimento de tal enfermidade. Diversas drogas com ação
anti-inflamatória (Daniels et al., 2016) ou anti-diabética (Batista et al., 2018; Freiherr et al.,
2013; Tai et al., 2018) tem sido testados com este fim. Contudo, ensaios clínicos ainda são
necessários para se avaliar a eficácia e os efeitos colaterais dessas drogas.
Nesse sentido, o presente estudo objetivou explorar profundamente a ação dos ácidos
graxos ω3, como estratégia não farmacológica, no controle das desordens moleculares causadas
pela obesidade e que poderia levar ao declínio cognitivo e contribuir para o surgimento da DA.
Embora diversos estudos já tenham relacionado o consumo de ω3 à melhoras no quadro clínico
de pacientes com comprometimento cognitivo leve (Huang, 2010; Gao et al., 2016; Canhada et
al., 2018), nenhum estudo explorou a fundo os mecanismos moleculares pelos quais estes ácidos
graxos atuariam, principalmente quanto à participação do GPR120 na remissão desses fatores.
Para comprovação da hipótese desta pesquisa, foi utilizado linhagem de camundongos
do tipo Swiss, por não apresentarem mutações associadas ao surgimento precoce da DA. Além
disso, trata-se de bom modelo experimental para o desenvolvimento da obesidade, apresentando
alterações metabólicas que se relacionam ao surgimento da DA (De Felice, Ferreira, 2014;
Pugazhenthi et al., 2017).
Inicialmente os animais foram induzidos à obesidade por meio da exposição à dieta HF
que continha 35% de gordura, sendo a gordura suína a principal fonte lipídica. Após
comprovado o ganho de peso e a resistência sistêmica à insulina, parte dos animais obesos foi
tratada com dieta FS (dieta HF que continha 35% de gordura, porém com substituição de 1/3
da gordura suína por óleo de linhaça). Dessa forma, as dietas HF e FS eram isolipídicas e
isocalóricas, com modificação apenas na qualidade da gordura ofertada. Ao final do período
experimental os animais do grupo HF apresentaram os clássicos fenótipos da obesidade (Rosini
et al., 2012), como resistência à insulina, intolerância à glicose, hiperinsulinemia,
hipercolesterolemia e déficit cognitivo em comparação ao grupo controles. O consumo de
61
fontes de ω3, por sua vez, foi capaz de reduzir o ganho de peso dos animais, controlar a
resistência à insulina, intolerância à glicose, hipercolesterolemia e melhorar a formação e
retenção de memória nos animais do grupo FS em comparação ao grupo HF. Estes achados
reforçam os efeitos benéficos do consumo crônico de ω3 sob o metabolismo periférico
(Lorente-Cebrián et al., 2013; Mello et al., 2018) e cognição em humanos e animais
experimentais (Canhada et al., 2018).
Neste estudo, como esperado, foi observado que o consumo crônico de dieta HF alterou
negativamente o perfil sérico de ácidos graxos nos animais experimentais, com aumento de
AGS e redução de AGMI e AGPI, porém sem modificação na razão ω6:ω3, em comparação
aos controles. Tais alterações sustentam a gênese do processo inflamatório sistêmico e
confluem para o surgimento de comorbidades que se associam à obesidade (Antonopoulos,
Tousoulis, 2017). Entretanto, no tecido hipocampal dos animais, não foram encontradas
alterações no conteúdo total de AGS, AGMI e AGPI no grupo HF em comparação ao grupo
CT. Em 2018, Lee e seus colaboradores realizaram a lipidômica no hipocampo de camundongos
expostos cronicamente a dieta HF e observaram diversas alterações nas estruturas lipídicas.
Entre as alterações, houve importante aumento no conteúdo de diacilgliceróis, molécula com
participação ativa na resistência central à insulina. Além disso, houve redução de
lisofosfatidilserina e aumento de fosfatidilserina, o que sugere intensificação do processo
inflamatório e estresse oxidativo induzido pela dieta HF (Lee et al., 2018). Entretanto, no
presente estudo, a substituição parcial de fontes de gordura saturada por gordura poli-insaturada
(ω3) se mostrou eficiente em melhorar o perfil de ácidos graxos séricos, assim como a razão
sérica e hipocampal de ω6:ω3 dos animais do grupo FS em comparação ao grupo HF. No grupo
FS também houve aumento significativo na incorporação do ALA e sua bioconversão em EPA
e DHA, tanto no soro quanto no hipocampo dos animais do grupo FS em relação ao grupo HF.
Ao observar a estrutura do tecido hipocampal dos animais experimentais, foi possível
verificar maior neurodegeneração e perda de matriz extracelular nos animais do grupo HF em
comparação aos animais do grupo CT. Também foram observados neste grupo maior presença
de micróglias e alterações nas estruturas e organelas neuronais. Tais alterações não foram
encontradas nos animais do grupo FS, demonstrando o efeito protetor do consumo crônico de
fontes de ω3.
As alterações teciduais encontradas nos animais do grupo HF podem ser reflexos da
ativação crônica das vias relacionadas à inflamação e apoptose (Cai et al.,2016). Ao analisar o
hipocampo dos animais do grupo HF, foi encontrado maior conteúdo de IL-1β, TNF-α e BAX,
como também aumento nas proteínas ASC e das formas clivadas de IL-18 e caspase 1 em
62
comparação ao grupo CT. Esse comportamento está estritamente relacionado à ativação do
complexo inflamassomal coordenado pela proteína NLRP3, juntamente à ativação das vias
inflamatórias clássicas (TLR/TNF), com consequente ativação da via apoptótica (Aachoui et
al., 2013; Heneka et al., 2013; Shi, Holtzman, 2018). Ainda, pesquisas sugerem que o aumento
da ativação do inflamassomo (Heneka et. al., 2013) ou o simples aumento das proteínas
relacionadas a este complexo (Shi, Holtzman, 2018), podem aumentar a produção βA e acelerar
a formação de placa amiloide. Venegas et al. (2017), ao realizarem experimentos in vivo e in
vitro, observaram que os aglomerados da proteína ASC liberados pela micróglia são capazes de
coalescer rapidamente os monômeros de βA, induzindo a formação de oligômeros e,
vagarosamente, agregados mais complexos. O trabalho sugere ainda que esta proteína poderia
ter função acopladora, sendo o nodo de formação da placa amiloide. Estes mesmos autores, ao
realizarem infusão intracerebroventricular (i.c.v) de βA e anticorpo específico para ASC,
encontraram redução na deposição amiloide em camundongos APP/PS1. Análises por imagem
reforçam esta hipótese ao demonstrarem a presença de aglomerados de ASC no núcleo das
placas amiloides presentes nos cérebros de camundongos e humanos acometidos pela DA (Gao
et al., 2015). Dessa forma, a cronificação e aumento do tônus inflamatório, pode favorecer a
produção de βA, acelerando o processo neurodegenerativo (Heppner, Ransohoff, Becher,
2015). De forma interessante, foi observada inibição do processo inflamatório no hipocampo
dos animais do grupo FS, com redução no conteúdo de IL-1β, ASC e as formas clivadas de
caspase-1 e IL-18. Também foi observado aumento no conteúdo de IκBα, o que sugere menor
atividade do fator de transcrição de citocinas inflamatórias NFκB.
No presente trabalho também pode-se observar que o consumo crônico de gordura
saturada favoreceu a instalação da resistência hipocampal à insulina no grupo HF em
comparação ao grupo CT. Por outro lado, a redução no tônus inflamatório no grupo FS foi
acompanhada da melhora na sensibilidade hipocampal à insulina. Os mecanismos intracelulares
envolvidos com a inflamação e a resistência à insulina, ativados pelo consumo excessivo de
gordura saturada, aparentemente se concatenam ao aumento dos marcadores da DA. Além do
aumento no conteúdo de βA e p-tau, também foi encontrado aumento na atividade de proteínas
quinases, como p-JNK, GSK3β e p-CDK5Tyr15 nos animais do grupo HF em comparação ao
CT. O aumento na atividade de JNK está estritamente relacionado ao aumento da resistência à
insulina (Hirosumi et al., 2002; Solinas, Becattini, 2017) e o aumento da resistência a este
hormônio está relacionada à redução da plasticidade neuronal e aumento na atividade GSK3
no hipocampo (Blázquez, Velázquez, Hurtado-carneiro, 2014; Zhou, 2012). Pesquisadores
sugerem que o aumento na atividade de GSK3 possa favorecer a fosforilação da proteína tau e
63
aumento da síntese de βA (Wagner et al., 1996; Hooper, Killick, Lovestone, 2008; Darocha-
Souto et al., 2012;). A CDK5, por sua vez, é uma importante proteína que controla o ciclo
celular. Entretanto em situações de estresse celular, a CDK5 é fosforilada e assume sua forma
ativa, aumentando a fosforilação da tau, síntese de βA e apoptose neuronal (Liu et al. 2016).
Dessa forma, a CDK5 tem ganhado destaque como possível alvo terapêutico na prevenção da
DA (Liu et al., 2016). A inibição farmacológica de CDK5 aparentemente é capaz de suprimir a
neurotoxicidade induzida pela βA, demonstrando efeito neuroprotetor e satisfatório no
tratamento da DA ( Lopes, Oliveira, 2010; Crews et al., 2011). No presente estudo, o consumo
de fontes de ω3 se mostrou uma eficiente estratégia não farmacológica no controle dos
marcadores da DA no hipocampo de camundongos obesos e resistentes à insulina, uma vez que
foi encontrada redução no conteúdo de βA e p-tau, inibição das quinases envolvidas com a sua
fisiopatologia (GSK3 e CDK5) e aumento no conteúdo de IDE.
Evidências sugerem que o consumo de fontes de ω3 está relacionado tanto com a
redução da produção de βA, quanto aumento na sua degradação (Lim et al., 2005; Ren et al.,
2016). Os macrófagos de pacientes com DA ou com comprometimento cognitivo leve são
defeituosos na fagocitose de βA e têm baixa resistência à apoptose. Recente estudo in vitro que
isolou macrófagos de pacientes com comprometimento cognitivo leve e posteriormente os
tratou com ω3, demonstrou aumento na fagocitose βA, redução do estresse de retículo
endoplasmático e redução da apoptose (Olivera-Perez et al., 2017). Outro importante
mecanismo de depuração de βA é desempenhado pela IDE (Kurochkin, Guarnera, Berezovsky,
2018). Estudos sugerem que a IDE desempenha um papel crítico nos mecanismos que
interligam a hiperinsulinemia e o DM2 com a DA (Qiu, Folstein, 2006; Pivovarova et al., 2016).
Tanto o envelhecimento quanto a exposição excessiva ao ácido palmítico parecem afetar
negativamente a expressão da IDE, o que poderia favorecer a hiperinsulinemia e o aumento de
βA (Runyan et al., 1979; Du et al., 2010). Pesquisas vêm sendo realizadas a fim de
desenvolverem modulares específicos que aumentem a expressão e atividade central da IDE
(Pivovarova et al., 2016). Estudos in vitro sugerem que o DHA seria um potente estimulador
da expressão de IDE em culturas de células neuronais (Du et al., 2010). Estes resultados vão de
encontro aos achados do presente estudo, uma vez que o consumo da dieta FS estimulou
aumento na produção desta enzima, contribuindo para a redução do conteúdo de βA em
comparação ao grupo HF, mas sem afetar as concentrações séricas de insulina.
Outro fenômeno associado à obesidade e ao DM2 que se relacionada de forma
intermediária com a fisiopatologia da DA é o estresse de retículo endoplasmático (Hotamisligil,
2008; Tripathi, Pandey, 2012; Ohno, 2014). No presente estudo, foi observado aumento nas
64
proteínas sensoras ao estresse de retículo, como a CHOP e a p-eIF2α. Acredita-se que o
aumento na fosforilação de eIF2α resulte em aumento na expressão de BACE1 e ATF4,
favorecendo ainda mais o aumento de βA e redução de p-CREB, um importante fator de
transcrição relacionado a manutenção da plasticidade neuronal e formação da memória de longo
prazo (Hur, Zhou, 2010; Sakamoto et al., 2011). Assim, a elevação crônica no conteúdo de p-
eIF2α poderia ser um dos fatores que contribuiu para o déficit cognitivo encontrado no grupo
HF. Por outro lado, o consumo de dieta FS foi eficaz em reduzir o conteúdo proteico de p-
eIF2α e CHOP, o que sugere amenização do estresse de retículo. Gao et al.(2016) ao
alimentarem cronicamente ratas Sprague-Dawley envelhecidas com dieta HF (14% de gordura
totais, sendo 10% proveniente da gordura suína) e dieta rica em ALA (14% de gorduras totais,
sendo 10% proveniente do óleo de linhaça), observaram melhoras cognitivas no teste do MWM
e redução nos depósitos de βA e p-tau no hipocampo dos animais que receberam elevadas doses
de ω3. Os pesquisadores afirmam que estes efeitos ocorreram em decorrência da redução da
ativação da via PERK/eIF2α e, consequentemente, redução de p-GSK3β, BACE1 e aumento de
p-CREB.
Outro processo intimamente relacionado com o surgimento da DA é a autofagia. Neste
trabalho, foi encontrado redução no processo autofágico nos animais que consumiram dieta HF,
devido à redução de LC3 e aumento de p62. A falha neste mecanismo pode ser prejudicial às
células do SNC, uma vez que a autofagia é um processo importante para a manutenção da
homeostase e a função celular (Hansen et al., 2018). Portanto, acredita-se que a depleção
crônica do processo autofágico é um dos principais fatores de risco associados à etiologia da
DA, devido ao aumento dos seus marcadores proteicos (βA e p-tau), à morte de neurônios e
degeneração axonal (Uddin et al., 2018). Estudos apontam o envelhecimento (Rubinsztein et
al. 2011) e o consumo excessivo de gordura saturada como uns dos principais fatores
responsáveis pela redução da autofagia em diversos tecidos, como fígado (Yang et al., 2010),
hipotálamo (Portovedo et al., 2015) e hipocampo (Zhuang et al., 2019). De forma interessante,
os animais do grupo FS apresentaram aumento da autofagia e de autofagolisossomos em
comparação aos animais do grupo HF. Inoue et al. (2017) ao desafiarem linhagens de células
microgliais (MG6) com LPS (lipopolissacarídeo) e posteriormente tratarem estas células com
EPA e DHA, também observaram aumento na proteína LC3 o que indica aumento do processo
de autofagia e possivelmente aumento na depuração das proteínas associadas ao surgimento da
DA.
Todas as alterações moleculares e estruturais encontradas no hipocampo dos animais
obesos que receberam dieta HF parecem justificar o défict cognitivo destes animais ao serem
65
expostos ao teste do labirinto aquático em relação aos animais do grupo CT. Stranahan et al
(2008) ao ofertarem dieta hiperlipídica e hiperglicídica por 8 meses para ratos adultos,
observaram a presença de sinais clínicos similares ao diabetes, caracterizados pelo aumento
sérico de glicose, colesterol e triglicerídeos. Estes animais ao realizarem o teste de MWM
apresentaram declínio na aprendizagem espacial. Stranahan et al (2008) sugeriram que o
prejuízo cognitivo possa ser devido à redução da densidade dos dendritos, redução das sinapses
CA1 e concomitantes redução de BNDF no hipocampo destes animais. Estudos em humanos
também tem demonstrado correlação negativa entre o IMC e o desempenho cognitivo global.
Observa-se que o excesso de peso está associado ao prejuízo na função executiva e na memória
de curto prazo (Lokken et al., 2009; Mond et al., 2007; Nguyen, Killcross, Jenkins, 2014).
Dessa forma, este estudo reforça a hipótese de que a obesidade leva a alterações
moleculares que, em longo prazo, aceleram o surgimento da DA. Acredita-se que décadas antes
das manifestações clínicas desta doença, alterações moleculares já ocorram no SNC dos
indivíduos (Stranahan et al., 2008). Nesse sentido, medidas preventivas se tornam relevantes
no combate a esta doença neurodegenerativa, uma vez que os danos causados pela DA são
irreversíveis.
Muitas são as vias moleculares moduladas pelo ω3, porém, acredita-se que a via
primária de ação desses ácidos graxos na redução do risco da DA seja por meio da inibição das
vias inflamatórias. Nesse sentido, estudos apontam que os efeitos anti-inflamatórios do ω3
ocorram antes mesmo dele ser internalizado pela célula alvo (Oh et al., 2010). Dentre as
proteínas envolvidas, o GPR120 se destaca pela sua ação inicial na transdução dos sinalis
induzidos pelo ω3, interferindo nas vias inflamatórias (Oh et al., 2010; Oh, Olefsky, 2012). A
ativação deste receptor desencadeia resposta intracelular que resulta no recrutamento da
proteína β-arrestina-2, que interage fisicamente com NLRP3 (Yan et al., 2013) e TAB1 (Oh et
al., 2010), e dessa forma, poderia desarticula as vias do inflamassomo e as controladas pelos
receptores TLR4, IL-1β e TNF-α.
Antes do início dos testes com o receptor GPR120, análises preditivas de bioinformática
foram realizadas. Foi encontrada correlação positiva entre diversas proteínas controladoras do
processo inflamatório com o receptor GPR120, reforçando a hipótese que este receptor possa
agir como ferramenta do sistema imune, com sua transcrição sendo favorecida em situações de
estresse, ou pelo aumento do consumo de gordura saturada, ou mesmo pelo aumento do
processo inflamatório. Neste estudo, observou-se aumento no conteúdo proteico de GPR120
nos animais do grupo HF em comparação ao grupo CT. Esses dados corroboram com os
achados de Ichimura et al. (2012), onde a expressão de GPR120 no tecido adiposo de humanos
66
foi significativamente maior em indivíduos obesos em comparação a eutróficos. Entretanto,
acredita-se que a ação anti-inflamatória do GPR120 só é possível frente ao estímulo de seu
agonista, a exemplo dos ácidos graxos da família ω3. Essa hipótese ganha força ao se confrontar
o conteúdo de GPR120 com o de p-TAK nos grupos HF e FS. O aumento do conteúdo proteico
de GPR120 no grupo HF não necessariamente refletiu maior ativação deste receptor, uma vez
que não houve redução na fosforilação de p-TAK1, com consequente desarme da via
inflamatória. Por outro lado, o aumento do conteúdo proteico de GPR120 no grupo FS foi
acompanhado por aumento em sua atividade, visto importante redução na fosforilação da p-
TAK1.
Yan et al.(2013) observaram que o tratamento de macrófagos derivados da medula
espinhal com EPA, DHA e com agonista sintético do GPR120 (GW9508), foi capaz de abolir
a ativação do inflamassomo, via a ativação do receptor GPR120. Tais evidências ajudam a
explicar os resultados encontrados no presente estudo, uma vez que o tratamento com fontes de
ω3 foi eficiente em aumentar o conteúdo de GPR120 e possivelmente aumentar a sua ativação,
devido a redução na ativação do inflamassomo e das proteínas envolvidas na cascata
inflamatória mediada por citocinas inflamatórias.
Embora as ações do GPR120 sejam conhecidas em diversos órgãos com ação
metabólica, este trabalho é pioneiro em demonstrar a presença e distribuição desta proteína no
hipocampo, assim como sua atividade como peça chave no desencadeamento das respostas
protetivas mediadas pelo ω3, em neurônios e astrócitos, contribuindo para a redução do risco
de surgimento da DA. Sua ação pode ser comprovada, parcialmente, pelo silenciamento do
GPR120 em cultura de células do tipo N2a. Ao tratar esta linhagem celular de forma aguda com
palmitato foi possível observar aumento das vias inflamatórias, com aumento de IL-1β, p-IKK,
p-JNK. De forma correlata, houve aumento de proteínas da via do estresse de retículo (p-eIF2
α) e da DA (β-amiloide). Em contrapartida, as células tratadas com ALA apresentaram inibição
nas vias citadas. De forma interessante, ao silenciar o GPR120 nas células N2a, os efeitos anti-
inflamatórios do ALA foram parcialmente abolidos.
6 CONCLUSÃO
O consumo crônico de dieta rica em ácidos graxos saturados foi capaz de induzir a
obesidade e gerar alterações metabólicas sistêmicas – como hipercolesterolemia, intolerância à
glicose e resistência à insulina – e também desencadear alterações moleculares no hipocampo
dos animais experimentais – como redução da autofagia, aumento de proteínas relacionadas à
67
inflamação, resistência à insulina, estresse de retículo endoplasmático, apoptose e proteínas
associadas ao surgimento da DA. Houve importante neurodegeneração e maior déficit cognitivo
nos animais induzidos à obesidade por dieta hiperlipídica.
A substituição parcial da gordura suína por fontes de ácidos graxos poli-insaturados ω3
foi capaz de reestabelecer os níveis séricos de colesterol, reduzir a intolerância à glicose e
resistência à insulina. Além dos benefícios periféricos, o tratamento com fontes de ω3 modulou
vias moleculares no hipocampo relacionadas à inflamação, estresse de retículo, autofagia,
resistência à insulina, apoptose e vias associadas ao surgimento da DA. Os resultados
moleculares encontrados justificam menor neurodegeneração, com consequente melhora
cognitiva nos animais experimentais.
A presença do receptor GPR120 foi demonstrada em todas as regiões do hipocampo dos
animais experimentais, sendo que o consumo de fonte de ω3 foi capaz de aumentar seu
conteúdo e sua atividade. O silenciamento do receptor comprometeu a ação anti-inflamatória
do ácido graxo ω3.
Assim, os achados do presente estudo demonstram que o consumo de fontes de ômega
3 seria interessante estratégia para redução do risco do surgimento da DA e que tais efeitos se
devem, parcialmente, ao receptor GPR120 que se mostrou importante condutor da sinalização
anti-inflamatória intracelular favorecendo a homeostase de diversas vias associadas a esta
doença neurodegenerativa.
68
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AACHOUI Y, SAGULENKO V, MIAO E. A, STACEY K. J. Inflammasome-mediated
pyroptotic and apoptotic cell death, and defense against infection. Current Opinion in
Microbiology, 16(3):319-26, 2013.
ALFORD S.; PATEL D.; PERAKAKIS N.; MANTZOROS C. S. Obesity as a risk factor for
Alzheimer’s disease: weighing the evidence. Obesity Review, v. 19, n. 2, p. 269-280,
2018.
ALZHEIMER’S DISEASE INTERNATIONAL. World Alzheimer Report 2018: The state of
the art of dementia research – New frontiers. Alzheimer’s Disease International: The
International Federation of Alzheimer’s Disease and Related Disorders Societies,
London, 48 p., 2018.
ANTONOPOULOS A. S.; TOUSOULIS D. The molecular mechanisms of obesity paradox.
Cardiovascular Research, v. 113, n. 9, p. 1074-1086, 2017.
ARNOLD S. E.; ARVANITAKIS Z.; MACAULEY-RAMBACH S. L.; KOENIG A. M.;
WANG H. Y.; AHIMA R. S.; CRAFT S.; GANDY S.; BUETTNER C.; STOECKEL L.
E.; HOLTZMAN D. M.; NATHAN D.M. Brain insulin resistance in type 2 diabetes and
Alzheimer disease: concepts and conundrums. Nature Review: Neurology, v. 14, n. 3,
p. 168-181, 2018.
BATISTA, A.F; FORNY-GERMANO, L; CLARKE, J.R; LYRA E SILVA, N.M; BRITO-
MOREIRA, J; BOEHNKE, S; WINTERBORN, A; COE, B; LABLANS, A; VITAL, J.F;
MARQUES, S.A; MARTINEZ, A.M; GRALLE, M; HOLSCHER, C; KLEIN, W.L;
HOUZEL, J.C; FERREIRA, S.T; MUNOZ, D.P; DE FELICE, F.G. The diabetes drug
liraglutide reverses cognitive impairment in mice and attenuates insulin receptor and
synaptic pathology in a non-human primate model of Alzheimer’s disease. The Journal
of Pathology, 245(1):85-100, 2018.
BIESSELS G. J., REAGEN L. P. Hippocampal insulin resistance and cognitive dysfunction.
Nature Review: Neuroscience, v. 16, n. 11, p. 660-671, 2015.
BLÁZQUEZ E.; VELÁZQUEZ E.; HURTADO-CARNEIRO V.; RUIZ-ALBUSAC J. M.
Insulin in the brain: its pathophysiological implications for States related with central
insulin resistance, type 2 diabetes and Alzheimer’s disease. Frontiers in Endocrinology,
v. 5, n. 161, 2014.
BONORA E.; MOGHETTI P.; ZANCANARO C.; CIGOLINI M.; QUERENA M.;
CACCIATORI V.; CORGNATI A.; MUGGEO M. Estimates of in vivo insulin action in
man: comparison of insulin tolerance tests with euglycemic and hyperglycemic glucose
clamp studies. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, v. 68, n. 2, p.
374-378, 1989.
BRADFORD M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
Biochemistry, v. 72, n. 1-2, p. 248-254, 1976.
69
CAI, M; WANG, H; LI, J.J; ZHANG, Y.L; XIN. L; LI, F; LOU, S.J. The signaling mechanisms
of hippocampal endoplasmic reticulum stress affecting neuronal plasticity-related protein
levels in high fat diet-induced obese rats and the regulation of aerobic exercise. Brain,
Behavior, and Immunity, 57:347-359, 2016.
CAI, Y; ARIKKATH, J; YANG, L; GUO, M.L; PERIYASAMY, P; BUCH, S. Interplay of
endoplasmic reticulum stress and autophagy in neurodegenerative disorders. Autophagy,
12(2):225-44 2016.
CANHADA S.; CASTRO K.; PERRY I. S.; LUFT V. C. Omega-3 fatty acids’ supplementation
in Alzheimer’s disease: A systematic review. Nutritional Neuroscience, v. 21, n. 8, p.
529-538, 2018.
CERPA W.; DINAMARCA M. C.; INESTROSA N. C.; Structure-function implications in
Alzheimer’s disease: effect of Aβ oligormers at central synapses. Current Alzheimer
Research, v. 5, n. 3, p. 233-243, 2008.
CINTRA D. E.; ROPELLE E. R.; MORAES J. C.; PAULI J. R.; MORARI J.; SOUZA C. T.;
GRIMALDI R.; STAHL M.; CARVALHEIRA J. B.; SAAD M.J.; VELLOSO L. A.
Unsaturated fatty acids revert diet-induced hypothalamic inflammation in obesity. PLoS
One, v. 7, n. 1, 2012.
CREWS, L; PATRICK, C; ADAME, A; ROCKENSTEIN, E; MASLIAH, E. Modulation of
aberrant CDK5 signaling rescues impaired neurogenesis in models of Alzheimer's
disease. Cell Death & Disease, 2(2):e120-13, 2011.
CUNNANE S. C.; GANGULI S.; MENARD C.; LIEDE A. C.; HAMADEH M. J.; CHEN Z.
Y.; WOLEVER T. M.; JENKINS D. J. High alpha-linolenic acid flezzseed (Linum
usitatissimum): some nutritional properties in humans. The British Journal of
Nutrition, v. 69, n. 2, p. 443-453, 1993.
CYBULSKY, A.V. Endoplasmic reticulum stress, the unfolded protein response and autophagy
in kidney diseases. Nature Reviews Nephrology, 13(11):681-696, 2017.
DANIELS, M.J; RIVERS-AUTY, J; SCHILLING, T; SPENCER, N.G; WATREMEZ, W;
FASOLINO, V; BOOTH, S.J; WHITE, C.S; BALDWIN, A.G; FREEMAN, S; WONG,
R; LATTA, C; YU, S; JACKSON, J; FISCHER, N; KOZIEL, V; PILLOT, T;
BAGNALL, J; ALLAN, S.M; PASZEK, P; GALEA, J; HARTE, M.K; EDER, C;
LAWRENCE, C.B; BROUGH, D. Fenamate NSAIDs inhibit the NLRP3 inflammasome
and protect against Alzheimer's disease in rodent models. Nature Communications,
7:12504, 2016.
DA ROCHA-SOUTO B, COMA M, PÉREZ-NIEVAS B.G, SCOTTON T.C, SIAO M,
SÁNCHEZ-FERRER P, HASHIMOTO T, FAN Z, HUDRY E, BARROETA I, SERENÓ
L, RODRÍGUEZ M, SÁNCHEZ M.B, HYMAN B.T, GÓMEZ-ISLA T. Activation of
glycogen synthase kinase-3 beta mediates β-amyloid induced neuritic damage in
Alzheimer's disease. Neurobiology of Disease, 45(1):425-37, 2012.
DÁTILO M. N.; SANT’ANA M.R.; FORMIGARI G. P.; RODRIGUES P. B.; MOURA L. P.;
DA SILVA A. S.; ROPELLE E. R.; PAULI J. R.; CINTRA D. E. Omega-3 from flaxseed
70
oil protecsts obese mice against diabetic retinopathy through GPR120 Receptor,
Scientific Reports, v. 8, n. 1, 13 p., 2018.
DE FELICE F. G.; FERREIRA S. T. Inflammation, defective insulin signaling, and
mitochondrial dysfunction as common molecular denominators connecting type 2
diabetes to Alzheimer disease. Diabetes, v. 63, n. 7, p. 2262-2272, 2014.
DE LA MONTE S. M.; WANDS J. R. Alzheimer’s disease is type 3 diabetes – Evidence
reviewed, Journal of Diabetes Science and Technology, v. 2, n. 6, p. 1101-1113, 2008.
DE LA MONTE, S. M. Insulin resistance and Alzheimer’s disease. BMB Reports, v. 42, n. 8,
p. 475-481, 2009.
DE STROOPER B.; KARRAN E. The cellular phase of Alzheimer’s disease. Cell, v. 164, n.
4, p. 603-615, 2016.
DINELEY K.T.; JAHRLING J. B.; DENNER L. Insulin resistance in Alzheimer’s disease.
Neurobiology Disease, v. 72, n. A, p. 92-103, 2014.
DU J, ZHANG L, LIU S, WANG Z. Palmitic acid and docosahexaenoic acid opposingly
regulate the expression of insulin-degrading enzyme in neurons. Pharmazie, 65(3):231-
2, 2010.
FLEMING J.A.; KRIS-ETHERTON P.M. The evidence for alfa-linolenic acid and
cardiovascular disease benefits: Comparisons with eicosapentaenoic acid and
docosahexaenoic acid. Advances in Nutrition, v. 5, n. 6, p. 863S- 876S, 2014.
FONTEH, A.N; CIPOLLA, M; CHIANG, J; ARAKAKI, X; HARRINGTON, M.G. Human
Cerebrospinal Fluid Fatty Acid Levels Differ between Supernatant Fluid and Brain-
Derived Nanoparticle Fractions, and Are Altered in Alzheimer's Disease. PLoS One,
9(6): e100519, 2014.
FORNY-GERMANO L.; LYRA E SILVA N. M.; BATISTA A. F.; BRITO-MOREIRA J.;
GRALLE M.; BOEHNKE S. E.; COE B. C.; LABLANS A.; MARQUES S. A.;
MARTINEZ A. M.; KLEIN W. L.; HOUZEL J. C.; FERREIRA S. T.; MUNOZ D.P.;
DE FELICE F. G. Alzheimer’s disease-like pathology induced by amyloid- β oligomers
in nonhuman primates. The Journal of Neuroscience, v. 34, n. 41, p. 13629-13643,
2014.
FREIHERR, J; HALLSCHMID, M; FREY, W.H 2ND; BRÜNNER, Y.F; CHAPMAN, C.D;
HÖLSCHER, C; CRAFT, S; DE FELICE, F.G; BENEDICT, C. Intranasal Insulin as a
Treatment for Alzheimer’s Disease : A Review of Basic Research and Clinical Evidence.
CNS Drugs, 27(7):505-14, 2013.
GALUCH M. B.; CARBONERA F.; MAGON T. F. S.; SILVEIRA R.; SANTOS P. D. S.;
PIZZO J.; SANTOS O. O.; VISENTAINER J. V. Quality assessment of Omega-3
supplements available in the Brazilian market. Journal of the Brazilian Chemical
Society, v. 29, n. 3 , p. 631-638, 2018.
GAO H.; YAN P.; ZHANG S.; NIE S.; HUANG F.; HAN H.; DENG Q.; HUANG Q.; YANG
W.; WU H.; YAO P.; YE K.; XU J.; LIU L. Chronic alpha-linolenic acid treatment
71
alleviates age-associated neuropathology: Role of PERK/eIF2 α signaling pathway.
Brain, Behavior, and Immunity, v. 57, p. 314-325, 2016.
GOTTESMAN R. F.; SCHENEIDER A. L.; ZHOU Y.; CORESH J.; GREEN E.; GUPTA N.;
KNOPMAN D. S.; MINTZ A.; RAHMIM A.; SHARETT A.R.; WAGENKNECHT L.E.;
WONG D. F.; MOSLEY T. H. Association between midlife vascular risk factor and
estimated brain amyloid deposition. JAMA, v. 317, n. 14, p. 1443-1450, 2017.
GUH, D.P; ZHANG, W; BANSBACK, N; AMARSI, Z; BIRMINGHAM, C.L; ANIS, A.H.
The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review
and meta-analysis. BMC Public Health, 25;9:88, 2009.
HANSEN, M; RUBINSZTEIN, D.C; WALKER, D.W. Autophagy as a promoter of longevity:
insights from model organisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 19(9):579-
593, 2018.
HENEKA M. T.; KUMMER M. P.; STUTZ A.; DELEKATE A.; SCHWARTZ S.; VIEIRA-
SAECKER A.; GRIEP A.; AXT D.; REMUS A.; TZENG T. C.; GELPI E.; HALLE A.;
LATZ E.; GOLENBOCK D. T. NLRP3 is activated in Alzheimer’s disease and
contributes to pathology in APP/PS1 mice. Nature, v. 493, n. 7434, p. 674-678, 2013.
HENEKA M. T.; GOLENBOCK D. T.; LATZ E. Innate immunity in Alzheimer’s disease.
Nature Immunology, v. 16, n. 3, p. 229-236, 2015.
HEPPNER F. L.; RANSOHOFF R. M.; BECHER B. Immune attack: the role of inflammation
in Alzheimer disease. Nature Review: Neuroscience, v. 16, n. 6, p. 358-372, 2015.
HIROSUMI J.; TUNCMAN G.; CHANG L.; GÖRGÜN C. Z.; UYSAL K. T.; MAEDA K.;
KARIN M.; HOTAMISLIGIL G. S. A central role for JNK in obesity and insulin
resistance. Nature, v. 420, n. 6913, p. 333-336, 2002.
HJORTH E.; ZHU M.; TORO V. C.; VEDIN I.; PALMBLAD J.; CEDERHOLM T.;
FREUND-LEVI Y.; FAXEN-IRVING G.; WAHLUND L. O.; BASUN H.;
ERIKSDOTTER M.; SCHULTZBERG M. Omega-3 fatty acids enhance phagocytosis of
Alzheimer’s disease-like amyloidβ42 by human microglia and decrease inflammatory
markers. Journal of Alzheimer’s Disease, v. 35, n. 4, p. 697-713, 2013.
HOOPER C, KILLICK R, LOVESTONE S. The GSK3 hypothesis of Alzheimer's disease.
Journal of Neurochemistry, 104(6):1433-9, 2008.
HOTAMISLIGI, G. S. Inflammation, metainflammation and immunometabolic disorders.
Nature, v. 542, n. 7640, p. 177-185, 2017.
HOTAMISLIGIL G.S. Inflammation and endoplasmic reticulum stress in obesity and diabetes.
International Journal of Obesity, 32: S52–S54., 2008.
HUA F.; MA J.; HA T.; XIA Y.; KELLEY J.; WILLIAMS D. L.; KAO R. L.; BROWDER I.
W.; SCHWEITZER J. B.; KALBFLEISCH J. H.; LI C. Activation of toll-like receptor 4
signaling contributes to hippocampal neuronal death following global cerebral
ischemia/reperfusion. Journal of Neuroimmunology, v. 190, n. 1-2, p. 101-111, 2007.
72
HUANG T. L. Omega-3 fatty acids, cognitive decline, and Alzheimer’s disease: a critical
review and evaluation of the literature. Journal of Alzheimer’s Disease, v. 21, n. 3, p.
673-690, 2010.
HUANG Y.; MUCKE L. Alzheimer’s mechanisms and therapeutic strategies. Cell. v. 148, n.
6, p. 1204-1222, 2012.
HUMMASTI, S; HOTAMISLIGIL, G.S. Endoplasmic Reticulum Stress and Inflammation in
Obesity and Diabetes. Circulation Research,107(5):579-91, 2010.
HUR E. M.; ZHOU F. Q. GSK3 signalling in neural development. Nature Review
Neuroscience, v. 11, n. 8, p. 539-551, 2010.
ICHIMURA, A; HIRASAWA, A; POULAIN-GODEFROY, O; BONNEFOND, A; HARA, T;
YENGO, L; KIMURA, I; LELOIRE, A; LIU, N; IIDA, K; CHOQUET, H; BESNARD,
P; LECOEUR, C; VIVEQUIN, S; AYUKAWA, K; TAKEUCHI, M; OZAWA, K;
TAUBER, M; MAFFEIS, C; MORANDI, A; BUZZETTI, R; ELLIOTT, P; POUTA, A;
JARVELIN, M.R; KÖRNER, A; KIESS, W; PIGEYRE, M; CAIAZZO, R; VAN HUL,
W; VAN GAAL, L; HORBER, F; BALKAU, B; LÉVY-MARCHAL, C; ROUSKAS, K;
KOUVATSI, A; HEBEBRAND, J; HINNEY, A; SCHERAG, A; PATTOU, F; MEYRE,
D; KOSHIMIZU, T.A; WOLOWCZUK, I; TSUJIMOTO, G; FROGUEL, P. Dysfunction
of lipid sensor GPR120 leads to obesity in both mouse and human. Nature,
19;483(7389):350-4, 2012.
INOUE, T; TANAKA, M; MASUDA, S; OHUE-KITANO, R; YAMAKAGE, H;
MURANAKA, K; WADA, H; KUSAKABE, T; SHIMATSU, A; HASEGAWA, K;
SATOH-ASAHARA, N. Omega-3 polyunsaturated fatty acids suppress the inflammatory
responses of lipopolysaccharide-stimulated mouse microglia by activating SIRT1
pathways. Biochimica et Biophysica Acta, 1862:552–560, 2017.
KIM J. Y.; LEE H. J.; LEE S. J.; JUNG Y. H.; YOO D. Y.; HWANG I. K.; SEONG J. K.; RYU
J. M.; HAN H. J. Palmitic acid-BSA enhances Amyloid-β production through GPR40-
mediated dual pathways in neuronal cells: Involvement of the Akt/mTOR/HIF-1α and
Akt/NF-kB pathaways. Scientific Reports, v. 7, n. 1, 2017.
KOTHARI V.; LUO Y.; TORNABENE T.; O’NEILL A. M.; GREENE M. W.; GEETHA T.;
BABU J. R. High fat diet induces brain insulin resistance and cognitive impairment in
mice. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease, v. 1863, n. 2, p. 499-
508.
KUMAR, A.; SINGH, A.; EKAVALI. A review on Alzheimer’s disease pathophysiology and
its management: an update. Pharmacological Reports, v. 67, n. 2, p. 195-203, 2015.
KUROCHKIN, I.V; GUARNERA, E; BEREZOVSKY, I.N. Insulin-Degrading Enzyme in the
Fight against Alzheimer’s Disease Aβ. Trends in Pharmacological Sciences, 39(1):49–
58, 2018.
LABROUSSE, V.F; NADJAR, A; JOFFRE, C; COSTES, L; AUBERT, A; GRÉGOIRE, S;
BRETILLON, L; LAYÉ, S. Short-term long chain omega3 diet protects from
neuroinflammatory processes and memory impairment in aged mice. PLoS One,
73
7(5):e36861, 2012.
LEE J. C.; PARK S. M.; KIM I. Y.; SUNG H.; SEONG J. K.; MOON M. H. High-fat diet-
induced lipidome perturbations in the cortex, hippocampus, hypothalamus, and olfactory
bulb of mice. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids,
v. 1863, n. 9, p. 980-990, 2018.
LEGRAND-POELS S.; ESSER N.; L’HOMME L.; SCHEEN A.; PAQUOT N.; PIETTE J.
Free fatty acid as modulators of the NLRP3 inflammasome in obesity/type 2 diabetes.
Biochemical Pharmacology, v. 92, n. 1, p. 131-141, 2014.
LIM, G.P; CALON, F; MORIHARA, T; YANG, F; TETER, B; UBEDA, O; SALEM, N JR;
FRAUTSCHY, S.A; COLE, G.M. A diet enriched with the omega-3 fatty acid
docosahexaenoic acid reduces amyloid burden in an aged Alzheimer mouse model.
Journal of Neuroscience, 25(12):3032-40, 2005.
LIU S. L.; WANG C.; JIANG T.; TAN L.; XING A.; YU J. T. The role of Cdk5 in Alzheimer’s
disease. Molecular Neurobiology. v. 53, n. 7, p. 4328-4342, 2016.
LIVAK K. J.; SCHMITTGEN T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time
quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, v. 25, n. 4, p. 402-408,
2001.
LOEF M.; WALACH H. Midlife obesity and dementia: meta-analysis and adjusted forecast of
dementia prevalence in the United States and China. Obesity, v. 21, n. 1, p. 51-55, 2013.
LOKKEN K.L, BOEKA A.G, AUSTIN H.M, GUNSTAD J, HARMON C.M. Evidence of
executive dysfunction in extremely obese adolescents: a pilot study. Surgery for Obesity
and Related Diseases, 5(5):547-52, 2009.
LOPES, J.P; OLIVEIRA, C.R; AGOSTINHO, P. Neurodegeneration in an Abeta-induced
model of Alzheimer's disease: the role of Cdk5. Aging Cell, 9(1):64-77, 2010.
LORENTE-CEBRIÁN, S; COSTA, A.G; NAVAS-CARRETERO, S; ZABALA, M;
MARTÍNEZ, J.A; MORENO-ALIAGA, M.J. Role of omega-3 fatty acids in obesity,
metabolic syndrome, and cardiovascular diseases: a review of the evidence. Journal of
Physiology and Biochemistry, v.69(3):633-51, 2013.
LOURENÇO M. V.; CLARKE J. R.; FROZZA R. L.; BOMFIM T. R.; FORNY-GERMANO
L.; BATISTA A.F.; SATHLER L. B.; BRITO-MOREIRA J.; AMARAL O. B.; SILVA
C. A.; FREITAS-CORRREA L.; ESPÍRITO-SANTO S.; CAMPELLO-COSTA P.;
HOUZEL J. C.; KLEIN W. L.; HOLSCHER C.; CARVALHEIRA J.B.; SILVA A. M.;
VELLOSO L.A.; MUNOZ D. P.; FERREIRA S. T.; DE FELICE F. G. TNF-α mediates
PKR-dependent memory impariment and brain IRS-1 inhibition induced by Alzheimr’s
β-amyloid oligomers in mice and monkeys. Cell Metabolism, v. 18, n. 6, p. 831-843,
2013.
MAZANETZ M. P.; FISCHER P. M.; Untangling tau hyperphosphorylation in drug design for
neurodegenerative diseases. Nature Reviews: Drug Discovery, v. 6, n. 6, p. 464- 479,
2007.
74
MAZON, J.N; DE MELLO, A.H; FERREIRA, G.K; REZIN, G.T. The impact of obesity on
neurodegenerative diseases. Life Sciences, 1;182:22-28, 2017.
MILANSKI, M.; DEGASPERI G., COOPE A.; MORARI J.; DENIS R.; CINTRA D. E.;
TSUKUMO D. M.; ANHE G.; AMARAL M. E.; TAKAHASHI H. K.; CURI R.;
OLIVEIRA H. C.; CARVALHEIRA J. B.; BORDIN S.; SAAD M. J.; VELLOSO L. A.
Saturated fatty acids produce an inflammatory response predominantly through the
activation of TLR4 signaling in hypothalamus: implications for the pathogenesis of
obesity. Journal of Neuroscience, v. 29, n. 2, p. 359-370, 2009.
MOND J.M, RODGERS B, HAY P.J, DARBY A, OWEN C, BAUNE B.T, KENNEDY R.L.
Obesity and impairment in psychosocial functioning in women: the mediating role of
eating disorder features. Obesity, 15(11):2769-79, 2007.
MOURA-ASSIS A.; AFONSO M. S.; DE OLIVEIRA V.; MORARI J.; DOS SANTOS G. A.;
KOIKE M.; LOTTENBERG A. M.; RAMOS CATHARINO R.; VELLOSO L. A.; DA
SILVA A. S. R.; DE MOURA L. P.; ROPELLE E. R.; PAULI J. R.; CINTRA D. E. C.
Flaxseed oil rich in ômega-3 protects aorta against inflammation and endoplasmic
reticulum stress partially mediated by GPR120 receptor in obese, diabetic and
dyslipidemic mice models. Journal of Nutritional Biochemistry, v. 53, p. 9-19, 2018.
MULLINS R. J.; DIEHL T. C.; CHIA C. W.; KAPOGIANNIS D. Insulin resistance as a link
between Amyloid-beta and tau pathologies in Alzheimer’s disease. Frontier in Aging
Neuroscience, v. 9, n. 118, 16 p., 2017.
NAKANDAKARI, S.C.B.R; MUÑOZ, V.R; KUGA, G.K; GASPAR, R.C; SANT'ANA, M.R;
PAVAN, I.C.B; DA SILVA, L.G.S; SIMABUCO, F.M; DA SILVA, A.S.R; DE
MOURA, L.P; ROPELLE, E.R; CINTRA, D.E; PAULI, J.R. Short-term high-fat diet
modulates several inflammatory, ER stress, and apoptosis markers in the hippocampus of
young mice. Brain, Behavior, and Immunity, S0889-1591(19)30181-3, 2019.
NETH, B.J.; CRAFT S. Insulin resistance and Alzheimer’s disease: Bioenergetic linkages.
Frontier of Aging Neuroscience, v. 9, n. 345, 2017.
NGUYEN, J.C.D, KILLCROSS A.S, JENKINS T.A. Obesity and cognitive decline: role of
inflammation and vascular changes. Frontiers in Neuroscience, 8: 375, 2014.
NYBERG, S.T; BATTY, G.D; PENTTI, J; VIRTANEN, M; ALFREDSSON, L; FRANSSON,
E.I; GOLDBERG, M; HEIKKILÄ, K; JOKELA, M; KNUTSSON, A; KOSKENVUO,
M; LALLUKKA, T; LEINEWEBER, C; LINDBOHM, J.V; MADSEN, I.E.H;
MAGNUSSON-HANSON, L.L; NORDIN, M; OKSANEN, T; PIETILÄINEN, O;
RAHKONEN, O; RUGULIES, R; SHIPLEY, M.J; STENHOLM, S; SUOMINEN, S;
THEORELL, T; VAHTERA, J; WESTERHOLM, P.J.M; WESTERLUND, H; ZINS, M;
HAMER, M; SINGH-MANOUX, A; BELL, J.A; FERRIE, J.E; KIVIMÄKI, M. Obesity
and loss of disease-free years owing to major non-communicable diseases: a multicohort
study. Lancet Public Health, (10):e490-e497, 2018.
OH, D.Y.; TALUKDAR, S.; BAE, E.J.; IMAMURA, T.; MORINAGA, H.; FAN, W.; LI, P.;
LU, W. J.; WATKINS, S.M.; OLEFSKY, J.M. GPR120 is an omega-3 fatty acid receptor
75
mediating potent anti-inflammatory and insulin-sensitizing effects. Cell, v. 142, n. 5, p.
687-698, 2010.
OH, D.Y.; WALENTA, E. Omega-3 Fatty Acids and FFAR4. Frontiers in Endocrinology,
v.5, p.1-5, 2014.
OHNO, M. Roles of eIF2α kinases in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Frontiers in
Molecular Neuroscience, 7: 1–8, 2014.
OKUN, E.; BARAK B.; SAADA-MADAR R.; ROTHMAN S. M.; GRIFFIOEN K. J.;
ROBERTS N.; CASTRO K.; MUGHAL M. R.; PITA M. A.; STRANAHAN A. M.;
ARUMUGAM T. V.; MATTSON M. P. Evidence for a developmental role for TLR4 in
learning and memory. PLoS One, v. 7, n. 10, 2012.
OLIVEIRA V.; MARINHO R.; VITORINO D.; SANTOS G. A.; MORAES J. C.; DRAGANO
N.; SARTORI-CINTRA A.; PEREIRA L.; CATHARINO R. R.; DA SILVA A. S.;
ROPELLE E. R.; PAULI J. R.; DE SOUZA C. T.; VELLOSO L. A.; CINTRA D. E.
Diets containing alfa-linolenic or oleic fatty acids rescues obese mice from insulin
resistance. Endocrinology, v. 156, n. 11, p. 4033-4046, 2015
OLIVERA-PEREZ, H.M; LAM, L; DANG, J; JIANG, W; RODRIGUEZ, F; RIGALI, E;
WEITZMAN, S; PORTER V; RUBBI, L; MORSELLI, M; PELLEGRINI, M; FIALA,
M. Omega-3 fatty acids increase the unfolded protein response and improve amyloid-β
phagocytosis by macrophages of patients with mild cognitive impairment. The FASEB
Journal, 31(10):4359-4369, 2017.
PIVOVAROVA, O; HÖHN, A; GRUNE, T; PFEIFFER, A.F; RUDOVICH, N. Insulin-
degrading enzyme: new therapeutic target for diabetes and Alzheimer's disease? Annals
of Medicine, 48(8):614-624, 2016.
PORTOVEDO, M; IGNACIO-SOUZA, L.M; BOMBASSARO, B; COOPE, A; REGINATO,
A; RAZOLLI, D.S; TORSONI, M.A; TORSONI, A.S; LEAL, R.F; VELLOSO, L.A;
MILANSKI, M. Saturated fatty acids modulate autophagy's proteins in the hypothalamus.
PLoS One, 10(3):e0119850, 2015.
PRICE, J.L; MCKEEL, D.W. JR; BUCKLES, V.D; ROE, C.M; XIONG, C; GRUNDMAN,
M; HANSEN, L.A; PETERSEN, R.C; PARISI, J.E; DICKSON, D.W; SMITH, C.D;
DAVIS, D.G; SCHMITT, F.A; MARKESBERY, W.R; KAYE, J; KURLAN, R;
HULETTE, C; KURLAND, B.F; HIGDO, R; KUKULL, W; MORRIS, J.C.
Neuropathology of nondemented aging: Presumptive evidence for preclinical Alzheimer
disease. Neurobiology of Aging, 30(7):1026-36, 2009.
PROFENNO L.A.; PORSTEINSSON A. P.; FARAONE S. V. Meta-analysis of Alzheimer’s
disease risk with obesity, diabetes, and related disorders. Biological Psychiatry, v. 67, n.
6, p. 505- 512, 2010.
PUGAZHENTHI S.; QIN L.; REDDY P. H. Common neurodegenerative pathways in obesity,
diabetes, and Alzheimer’s disease. Biochimica et Biophysica Acat. Molecular Basis of
Disease, v. 1863, n. 5, p. 1037-1045, 2017.
QIU W.Q, FOLSTEIN M.F. Insulin, insulin-degrading enzyme and amyloid-beta peptide in
76
Alzheimer's disease: review and hypothesis. Neurobiology of Aging, 27(2):190-8, 2006.
QUERFURTH, H. W.; LAFERLA F. M. Alzheimer’s Disease. The New England Journal of
Medicine, v. 362, n. 4, p. 329-344, 2010.
RANGASAMY S. B.; JANA M.; ROY A.; CORBETT G. T.; KUNDU M.; CHANDRA S.;
MONDAI S.; DASARATHI S.; MUFSON E. J.; MISHRA R. K.; LUAN C. H.;
BENNETT D. A.; PAHAN K. Selective disruption of TLR2-MyD88 interaction inhibits
inflammation and attenuates Alzheimer’s pathology. The Journal of Clinical
Investigation, v. 128, n. 10, p. 4297-4312, 2018.
REEVES P. G.; NIELSEN F.H.; FAHEY G. C. JR. AIN-93 purified diets for laboratory
rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on
the reformulation of the AIN-76A rodent diet. The Journal of Nutrition, v. 123, n. 11,
p. 1939-1951, 1993.
REN, J; CHUNG, S.H. Anti-inflammatory effect of alpha-linolenic acid and its mode of action
through the inhibition of nitric oxide production and inducible nitric oxide synthase gene
expression via NF-kappaB and mitogen-activated protein kinase pathways. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v.55, p.5073-80, 2007.
REN, H; LUO, C; FENG, Y; YAO, X; SHI, Z; LIANG, F; KANG, J; WAN, J.B; PEI, Z; SU,
H. Omega-3 polyunsaturated fatty acids promote amyloid-β clearance from the brain
through mediating the function of the glymphatic system. The FASEB Journal,
31(1):282-293 2016.
RITTER J. C.; BUDGE S. M.; JOVICA F. Quality analysis of commercial fish oil preparations.
Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 93, n. 8, p. 1935-1939, 2013.
ROSINI, T.C; SILVA, A.S.R da; MORAES, C de. Obesidade induzida por consumo de dieta:
modelo em roedores para o estudo dos distúrbios relacionados com a obesidade. Revista
da Associação Médica Brasileira, v.58, n.3, p.383-387, 2012.
RUBINSZTEIN, D.C; MARIÑO, G; KROEMER, G. Autophagy and aging. Cell,146(5):682-
95, 2011.
RUNYAN, K; DUCKWORTH, W.C; KITABCHI; A.E; HUFF, G. The effect of age on insulin-
degrading activity in rat tissue. Diabetes, 28(4):324-5, 1979.
SAINI, R.K; KEUM, Y.S. Omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids: Dietary sources,
metabolism, and significance - A review. Life Science, 15;203:255-267, 2018.
SASE A.; DAHANAYAKA S. HÖGER H.; WU G.; LUBEC G. Changes of hippocampal beta-
alanine and citrulline levels are paralleling early and late phase of retrieval in the Morris
Water Maze. Behavioral Brain Research, v. 249, p. 104-108., 2013.
SIMOPOULOS, A.P. The importance of the omega-6/omega-3 fatty acid ratio in
cardiovascular disease and other chronic diseases. Experimental Biology and Medicine,
233(6):674-88, 2008.
SIMOPOULOS A.P. Evolutionary aspects of diet: the omega-6/omega-3 ratio and the brain.
Molecular Neurobiology, 44(2):203-15, 2011.
77
SIMOPOULOS, A.P. An Increase in the Omega-6/Omega-3 Fatty Acid Ratio Increases the
Risk for Obesity. Nutrients, 8(3): 128, 2016.
SHI Y.; HOLTZMAN D. M.; Interplay between innate immunity and Alzheimer disease:
APOE and TREM2 in the spotlight. Nature Reviews: Immunology. v. 18, p. 759-772,
2018.
SHIRAI N.; SUZUKI H.; WADA S. Direct methylation from mouse plasma and from liver and
brain homogenates. Analytical Biochemistry, v. 343, n. 1, p. 48-53, 2005.
SHOELSON S.E.; LEE J.; YUAN M. Inflammation and the IKK beta/I kappa B/NF-kappa B
axis in obesity- and diet-induced insulin resistance. International Journal of Obesity
and Related Metabolic Disorders, v. 27, n. Suppl 3, p. S49-52, 2003.
SOBESKY J. L.; BARRIENTOS R. M.; DE MAY H. S.; THOMPSON B. M.; WEBER M. D.;
WATKINS L. R.; MAIER S. F. High-fat diet consumption disrupts memory and primes
elevations in hippocampal IL-1β, an effect that can be prevented with dietary reversal or
IL-1 receptor antagonism. Brain, Behavior and Immunity, v. 42, p. 22-32, 2014.
SOBERSKY J. L.; D’ANGELO H. M.; WEBER M. D.; ANDERSON N. D.; FRANK M.G.;
WATKINS L.R.; MAIER S.F.; BARRIENTOS R. M. Glucocorticoids mediate short-
term high-fat diet induction of neuroinflammatory priming, the NLRP3 inflammasome,
and the danger signal HMGB1. eNeuro, v. 3, n. 4, p. 113-116, 2016.
SOLINAS G.; BECATTINI B. JNK at the crossroad of obesity, insulin resistance, and cell
stress response. Molecular Metabolism, v. 6, n. 2, p. 174-184, 2016
SPENCER S. J.; D’ANGELO H.; SOCH A.; WATKINS L.R.; MAIER S.F.; BARRIENTOS
R. M. High-fat diet and aging interact to produce neuroinflammation and impair
hippocampal- and amygdalar-dependent memory. Neurobiology of Aging, v. 58, p. 88-
101, 2017.
STEEN E.; TERRY B. M.; RIVERA E. J.; CANNON J. L.; NEELY T. R.; TAVARES R.; XU
X. J.; DE LA MONTE S. M. Impaired insulin and insulin-like growth factor expression
and signaling mechanisms in Alzheimer’s disease – is this type 3 diabetes? Journal of
Alzheimers Disease, v. 7, n. 1, p. 63-80, 2005.
STRANAHAN A.M, NORMAN E.D, LEE K, CUTLER R.G, TELLJOHANN R.S, EGAN
J.M, MATTSON M.P. Diet-induced insulin resistance impairs hippocampal synaptic
plasticity and cognition in middle-aged rats. Hippocampus, 18(11):1085-8, 2008.
SWINBURN, B.A; SACKS, G; HALL, K.D; MCPHERSON, K; FINEGOOD, DT; MOODIE,
M.L, GORTMAKER, S.L. The global obesity pandemic: shaped by global drivers and
local environments. Lancet, 378(9793):804-14, 2011.
TAI, J; LIU, W; LI, Y; LI, L; HÖLSCHER, C. Neuroprotective effects of a triple GLP-1
/GIP/glucagon receptor agonist in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer’ s
disease. Brain Research, 1678:64-74, 2018.
TENG E.; TAYLOR K.; BILOUSOVA T.; WEILAND D.; PHAM T.; ZUO X.; YANG F.;
CHEN P. P.; GLABE C. G.; TAKACS A.; HOFFMAN D. R.; FRAUTSHCY S. A.;
78
COLE G. M. Dietary DHA supplementation in an APP/PS1 transgenic rat model of AD
reduces behavioral and Aβ pathology and modulates Aβ oligomerization. Neurobiology
of Disease, v. 82, p. 552-560, 2015.
THALER, J.P; YI, C.X; SCHUR, E.A; GUYENET, S.J; HWANG, B.H; DIETRICH, M.O;
ZHAO, X; SARRUF D.A; IZGUR, V; MARAVILLA, K.R; NGUYEN, H.T; FISCHER,
J.D; MATSEN, M.E; WISSE, B.E; MORTON, G.J; HORVATH, T.L; BASKIN, D.G;
TSCHÖP, M.H; SCHWARTZ, M.W. Obesity is associated with hypothalamic injury in
rodents and humans. Journal of Clinical Investigation, 122(1):153-62, 2012.
TRIPATHI Y.B, PANDEY V. Obesity and endoplasmic reticulum (ER) stresses. Frontiers in
Immunology, 3: 240, 2012.
UDDIN M.S, STACHOWIAK A, MAMUN A.A, TZVETKOV N.T, TAKEDA S,
ATANASOV A.G, BERGANTIN L.B, ABDEL-DAIM M.M, STANKIEWICZ A.M.
Autophagy and Alzheimer's Disease: From Molecular Mechanisms to Therapeutic
Implications. Frontiers in Aging Neuroscience, 10: 04, 2018.
VENEGAS C.; KUMAR S.; FRANKLIN B. S.; DIERKES T.; BRINKSCHULTE R.; TEJERA
D.; VIEIRA-SAECKER A.; SCHWARTZ S.; SANTARELLI F.; KUMMER M. P.;
GRIEP A.; GELPI E.; BEILHARZ M.; RIEDEL D.; GOLENBOCK D. T.; GEYER M.;
WALTER J.; LATZ E.; HENEKA M. T. Microglia-derived ASC specks cross-seed
amyloid-β in Alzheimer’s disease. Nature, v. 552, p. 355-361, 2017.
WAGNER U.; UTTON M.; GALLO J. M.; MILLER C. C. Cellular phosphorylation of tau by
GSK-3 beta influences tau binding to microtubules and microtubule organization.
Journal of Cell Science, v. 106, n. pt. 6, p. 1537-1543, 1996.
WEN H.; GRIS D.; LEI Y.; JHA S.; ZHANG L.; HUANG M. T.; BRICKEY W. J.; TING J. P.
Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin
signaling. Nature Immunology, v. 12, n. 5, p. 408-415, 2011.
World Health Organization (WHO). Obesity and overweight. Publicado em 16 de fevereiro
de 2018. Acesso em: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-
overweight. Último acesso em: 15 de janeiro de 2019.
YAN Y.; JIANG W.; SPINETTI T.; TARDIVEL A.; CASTILLO R.; BOURQUIN C.;
GUARDA G.; TIAN Z.; TSCHOPP J.; ZHOU R. Omega-3 fatty acids prevent
inflammation and metabolic disorder through inhibition of NLRP3 Inflammasome
activation. Immunity, v. 38, n. 6, p. 1154-1163, 2013.
YANG L, LI P, FU S, CALAY, E.S, HOTAMISLIGIL G.S. Defective hepatic autophagy in
obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism, 11(6):467-
78, 2010.
YU J. T.; TAN L.; HARDY J. Apolipoprotein E in Alzheimer’s disease: an update. Annual
Review of Neuroscience, v. 37, p. 79-100, 2014.
ZHAO W. Q.; DE FELICE, F. G.; FERNANDEZ S.; CHEN H.; LAMBERT M. P.; QUON M.
J.; KRAFFT G. A.; KLEIN W. L. Amyloid beta oligomers induce impairment of neuronal
insulin receptors. FASEB Journal, v. 22, n. 1, p. 246-260, 2008.
79
ZHUANG J, LU J, WANG X, WANG X, HU W, HONG F, ZHAO X.X, ZHENG Y.L. Purple
sweet potato color protects against high-fat diet-induced cognitive deficits through
AMPK-mediated autophagy in mouse hippocampus. The Journal of Nutritional
Biochemistry, 65:35-45, 2018.
80
ANEXO 1