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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

CURSO DE BIOMEDICINA

THAIS TEIXEIRA OLIVEIRA

ALTERAÇÃO DA EXPRESSÃO DE GENES RELACIONADOS A DOENÇAS

NEURODEGENERATIVAS EM MODELOS INFLAMATÓRIOS TRATADOS

COM INIBIDORES DE APE1

Natal

Novembro de 2017

2

ALTERAÇÃO DA EXPRESSÃO DE GENES RELACIONADOS A DOENÇAS

NEURODEGENERATIVAS EM MODELOS INFLAMATÓRIOS TRATADOS

COM INIBIDORES DE APE1

Por

Thais Teixeira Oliveira

Orientador: Profa. Dra. Lucymara Fassarella Agnez Lima

Natal

Novembro de 2017

Monografia Apresentada à

Coordenação do Curso de

Biomedicina da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte, como

Requisito Parcial à Obtenção do

Título de Bacharel em Biomedicina.

4

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

CURSO DE BIOMEDICINA

A Monografia alteração da expressão de genes relacionados a doenças

neurodegenerativas em modelos inflamatórios tratados com inibidores de APE1

Elaborada por Thais Teixeira Oliveira

E aprovada por todos os membros da Banca examinadora foi aceita pelo Curso

de Biomedicina e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial

à obtenção do título de

BACHAREL EM BIOMEDICINA

Natal, 01 de dezembro de 2017

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________

Dra. Lucymara Fassarella Agnez Lima (Departamento de Biologia molecular e

Genética)

_________________________________________

Dra. Tirzah Braz Petta Lajus (Departamento de biologia celular e genética)

________________________________________

Nome do Professor Examinador 2 (Departamento)

5

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico,

CNPq, instituição financiadora do projeto.

Agradeço a minha orientadora, prof. Dra. Lucymara Fassarella Agnez

Lima, pela oportunidade de aprender a fazer ciência.

Agradeço a todo o grupo de pesquisa que faço parte, especialmente a

Frabrícia, Daniele e Ana Helena, por toda a paciência que tiveram comigo

desde o início.

A meu noivo, minha família e meus amigos, por todo o apoio que me

deram em todas as questões da minha vida.

Aos meus professores e coordenadores do curso de biomedicina, pela

dedicação ao ensino e a esse curso.

Por fim, agradeço a Deus pela oportunidade viver tudo isso!

6

RESUMO

A inflamação no sistema nervoso pode levar a perturbação funcional e

morte de neurônios quando se desenvolve de maneira crônica ou exacerbada,

doenças de base infecciosa como Meningite, frequentemente causam

complicações, associadas a espécies reativas de oxigênio (ERO) geradas

durante a inflamação. Devido aos danos causados ao DNA por ERO e sua

relação com a morte neuronal, o papel das vias de reparo de DNA e suas

consequências durante processos inflamatórios vem sendo estudado. Nosso

grupo observou que a ocorrência de polimorfismos em genes da via de reparo

por excisão de bases, foi mais frequente em pacientes com meningite bacteriana,

foram observados aumento na ocorrência de danos no DNA, redução dos níveis

de citocinas e desbalanço na produção de anticorpos nesses pacientes. Visando

investigar melhor o papel da enzima APE1 durante o processo inflamatório,

nosso grupo estabeleceu um modelo de inflamação in vitro, utilizando linhagem

de monócitos (U937) tratadas com lipopolissacarídeo (LPS) e posterior adição

de inibidores específicos para funções da enzima APE1, E3330 e metoxiamina,

e do antioxidante resveratrol. A partir desse modelo, foram obtidos os

transcriptomas dos diferentes tratamentos. Dentre os genes diferencialmente

expressos foram identificados vários genes envolvidos em vias de

neurodegeneração. Foi observado que o tratamento com E3330 e resveratrol

leva a redução de expressão de muitos genes mitocondriais envolvidos com a

patogênese de doenças como Parkinson e Alzheimer.

Palavras-chave: Inflamação. APE1. Neurodegeneração. Estresse oxidativo.

Mitochondria.

7

ABSTRACT

Inflammation is one of the main defense mechanisms against pathogens

and antigens, but in the nervous system inflammation can lead to functional

disturbance and death of neurons when it develops in a chronic or exacerbated

way. Infectious diseases, such as meningitidis, which develop in the CNS often

cause complications and neuronal death, many studies have already associated

these complications with reactive oxygen species generated during inflammation.

Due to the damage caused to DNA and its relation to neuronal death, our

research group investigated the relationship of DNA repair enzymes with the

occurrence of bacterial meningitis, in this study we observed that the occurrence

of polymorphisms in genes of the bases excision repair was more frequent in

patients with bacterial meningitis, in addition the amount of DNA damage was

also higher in patients with APE1 and OGG1 polymorphism. To investigate the

anti-inflammatory role of APE1, we performed a sequencing of the monocyte

lineage RNA pool (U937) by observing gene expression alterations after the use

of E3330 inhibitors Methoxyamine and resveratrol, one of the results was the

appearance of many Genes belonging to neurodegeneration pathways with

altered expression after the treatments. This work aimed to investigate these

genes better; we observed that the treatment with E3330 and Resveratrol down

regulates many mitochondrial genes involved in the pathogenesis of diseases

such as Parkinson and Alzheimer.

Keywords: Inflammation. APE1. Neurodegeneration. Oxidative stress. Mitochondria.

8

Sumário LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................................10

LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................11

LISTA DE TABELAS ..............................................................................................................13

INTRODUÇÃO.........................................................................................................................14

O estresse oxidativo e seu papel no processo inflamatório ..................................14

O reparo dos danos causados por EROs no DNA ....................................................16

APE1/Ref-1: uma proteína multifuncional ...................................................................18

A associação entre danos no DNA, inflamação e doenças neurodegenerativas

...............................................................................................................................................22

Doença de Alzheimer (DA) ..............................................................................................22

Doença de Parkinson (DP) ..............................................................................................23

Esclerose Lateral amiotrófica (ELA) .............................................................................23

Doença infecciosa no SNC: Meningite .........................................................................24

OBJETIVOS .............................................................................................................................25

OBJETIVO GERAL ................................................................................................................25

OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................26

METODOLOGIA .....................................................................................................................26

ANÁLISE DA VIAS ENRIQUECIDAS NAS LISTAS DE TRANSCRITOS .................26

ANÁLISE DE REDES DE INTERAÇÃO PROTEÍNA-PROTEÍNA ...............................26

INDUÇÃO DA INFLAMAÇÃO E TRATAMENTO COM INIBIDOR. ............................27

EXTRAÇÃO DE RNA .........................................................................................................28

q-PCR ...................................................................................................................................28

RESULTADOS ........................................................................................................................29

Genes envolvidos na neurodegeneração tem sua expressão afetada por

inibidores de APE1 durante o processo inflamatório. .............................................29

E3330 ................................................................................................................................32

Metoxiamina....................................................................................................................34

Resveratrol ......................................................................................................................36

Principais reguladores dos genes com expressão modificada por E3330,

Metoxiamina e Resveratrol. ............................................................................................39

E3330 ................................................................................................................................39

Resveratrol ......................................................................................................................40

Metoxiamina....................................................................................................................41

9

Principais clusters contendo genes das vias neurodegenerativas e suas

funções dentro da célula. ................................................................................................42

E3330 ................................................................................................................................42

Metoxiamina....................................................................................................................47

Resveratrol ......................................................................................................................52

EXPRESSÃO DE ALGUNS GENES DA LISTA POR Q-PCR .....................................57

A expressão de ATM não está reduzida somente após o tratamento com

resveratrol, mas também com E3330 e Mettoxiamina..............................................58

E3330 causa Up regulação da Histona deacetilase 1 (HDAC1) ..............................59

A Expressão de NDUFV2 está diminuída no tratamento com E3330 e

metoxiamina .......................................................................................................................60

A expressão de NRF1 não foi alterada em nenhum dos inibidores ......................61

DISCUSSÃO ............................................................................................................................62

CONCLUSÕES .......................................................................................................................69

REFERÊNCIAS .......................................................................................................................70

10

LISTA DE ABREVIATURAS

EROs - Espécies reativas de oxigênio

ERNs – Espécies reativas de Nitrogênio

BER - base excision repair

APE1 - Apurinic-Apyrimidinic Endonuclease 1

AP - Apurínico/Apirimidinico

UDG - Uracil DNA Glycosylase

MPG - N-Methylpurine DNA Glycosylase

OGG1 - 8-Oxoguanine DNA Glycosylase

NF-kB - Fator Nuclear kappa B

PARP-1 - Poly(ADP-Ribose) Polymerase 1

AP-1 - Activator Protein 1

TNF-α - Tumor Necrosis Factor alfa

LPS – Lipopolissacarídeo

SNPs - single nucleotide polymorphisms

MB – Meningite Bacteriana

HIF-1 - Hypoxia Inducible Factor 1

Egr-1 - Early Growth Response 1

E3330 - (E) - 3 - (5, 6 - dimetoxi - 3 - metil - 1, 4 - dioxociclohexa - 2, 5 - dienil) -

2 - ácido nonilpropenóico

MTX – Metoxiamina

DP – Doença de Parkinson

DA – Doenças de Alzheimer

DH - Doença de Huntington

NRF1 – Nuclear Respiratory Factor 1

DDR – DNA damage response

ATM - Ataxia Telangiectasia Mutated

HDAC1 - Histone Deacetylase 1

NDUFV2 - NADH:Ubiquinone Oxidoreductase Core Subunit V2

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Redução do O2 a H2O.

Figura 2. Via de reparo por excisão de bases.

Figura 3. Intersecção entre os genes da neurodegeneração down regulados por

cada tratamento.

Figura 4. Intersecção entre os genes da neurodegeneração up regulados por

cada tratamento.

Figura 5. Cluster 1 de genes down regulados por E3330.

Figura 6. Cluster 2 de genes down regulados por E3330.

Figura 7. Cluster 2 de genes up regulados por E3330.

Figura 8. Cluster 2 de genes up regulados por E3330.

Figura 9. Rede formada pelos genes da neurodegeneração com expressão

alterada por E3330.

Figura 10. Cluster 1 dos genes Up regulados por metoxiamina



Figura 13. Cluster 4 dos genes Up regulados por metoxiamina.

Figura 14. Genes da neurodegeneração com expressão alterada por MTX.

Figura 15. Cluster 1 dos genes down regulados por resveratrol.




Figura 19. Genes da neurodegeneração com expressão alterada por resveratrol.

Figura 20. Alteração da expressão de ATM em células U937

Figura 21. Alteração da expressão de ATM em células U251MG

12

Figura 22. Alteração da expressão de HDAC1 em células U937

Figura 23. Alteração da expressão de HDAC1 em células U251MG

Figura 24. Alteração da expressão de NDFV2 em células U937

Figura 25. Alteração da expressão de NDFV2 em células U251MG

Figura 26. Alteração da expressão de NRF1 em células U937

Figura 27. Alteração da expressão de NRF1 em células U251MG

13

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Sequências dos primers utilizados para qPCR.

Tabela 2. Descrição de genes de vias de neurodegeneração Down regulados

após tratamento com E3330 segundo o DAVID e KEGG.

Tabela 3. Genes Up regulados após tratamento com E3330 envolvidos em vias

de doenças neurodegenerativas segundo DAVID e UNIPROT.

Tabela 4. Genes Up regulados após tratamento com Metoxiamina envolvidos em

vias de doenças neurodegenerativas segundo DAVID e UNIPROT.

Tabela 5. Genes Down regulados após tratamento com Metoxiamina envolvidos

em vias de doenças neurodegenerativas segundo DAVID e UNIPROT.

Tabela 6. Descrição de genes Down regulados após tratamento com Resveratrol

e vias de neurodegeneração em que estão envolvidos segundo o DAVID e

KEGG.

Tabela 7. Descrição de genes Up regulados após tratamento com Resveratrol e

vias de neurodegeneração em que estão envolvidos segundo o DAVID e KEGG.

Tabela 8. Principais fatores de transcrição da rede down regulada por E3330.

Tabela 9. Principais fatores de transcrição da rede down regulada por

Resveratrol.


Metoxiamina.

Tabela 11. Principais fatores de transcrição da rede Up regulada por

Metoxiamina.

14

INTRODUÇÃO

O estresse oxidativo e seu papel no processo inflamatório

Em organismos vivos aeróbicos mais de 90% do oxigênio consumido é

reduzido a água pelo citocromo C oxidase, também chamado de complexo IV da

cadeia transportadora de elétrons. Os 10% restantes são reduzidos por meio de

adição de um elétron ao radical ânion superóxido (O2-) e adição de mais um

elétron formando o peróxido de hidrogênio (H2O2), a adição de mais um elétron

ao H2O2 produz o radical Hidroxil (OH-) (Figura. 1). Esses compostos são

quimicamente mais ativos que o oxigênio molecular e por isso são denominados

de espécies reativas de oxigênio (EROs). Os peróxidos lipídicos, peróxidos de

proteínas e de ácidos nucleicos são outros exemplos de EROs. Apesar de 90%

das EROs endógenas serem produzidas pela mitocôndria, o retículo

endoplasmático, membranas nucleares bem como enzimas chamadas de

oxidases também são fontes das espécies reativas.

Apesar de serem sempre associadas aos danos que causam a lipídeos,

proteínas e DNA, as espécies reativas possuem um papel como moléculas de

sinalização para regulação de processos fisiológicos. Um desses processos de

sinalização envolve a oxidação mediada por H2O2 em resíduos de cisteína nas

proteínas, em pH fisiológico os resíduos de cisteína existem como ânions tiolato

Figura 1. Redução do O2 a H2O. O oxigênio pode receber quatro elétrons e

quatro prótons resultando na formação de duas moléculas de H2O ou pode

ser reduzido por adição de um elétron de cada vez, gerando intermediários

reativos, como os radicais superóxido (O2-.), radical Hidroxil (OH-) e o

peróxido de hidrogênio (H2O2).

15

(Cys-S-), quando oxidados por H2O2 formam a Cys-SOH, que altera a

conformação da proteína alterando assim sua função biológica. A forma

sulfenica pode ser reduzida novamente por tiorredoxina (Trx) e glutarredoxina

(Grx) retornando a sua função original (Winterbourn et al. 2008; Finkel et

al.2012), além disso EROs também são produzidas durante a inflamação onde

desenvolvem um papel fundamental no combate a microrganismos invasores.

Em células imunes, enzimas como NADPH oxidase (NOX) e a mieloperoxidase

produzem EROs que atuam no combate aos patógenos (revisado por Fontes et

al. 2014).

Para manutenção da homeostase, a célula possui um mecanismo de

eliminação de EROs através dos antioxidantes, que podem ser classificados em:

antioxidantes não enzimáticos, como: vitamina C (ácido ascórbico), vitamina E

(Tocoferol), carotenoides, polifenois e ácido úrico são exemplos deles; e

antioxidantes enzimáticos, por exemplo, superóxido dismutase (SOD), catalase

(CAT), glutationa peroxidase (GTPx), além das já mencionadas Trx e Grx (Birben

et al 2012). O desequilíbrio entre a produção de espécies reativas e sua

eliminação pelos antioxidantes é chamado de estresse oxidativo, as condições

de estresse podem ocorrer tanto pela diminuição dos mecanismos antioxidantes

como pelo aumento de EROs ou espécies reativas de nitrogênio (ERNs).

É durante o estresse oxidativo que as EROs podem causar danos

significativos a lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos. Em lipídeos a oxidação de

um elétron em ácidos graxos poli-insaturados pode desenvolver uma reação de

peroxidação lipídica em cadeia alterando a permeabilidade da membrana celular

(Valko et al, 2007). Já nas proteínas o resíduo de cisteína, já mencionado, é o

mais sensível a oxidação, em condições de estresse a oxidação de proteínas

pode acelerar sua degradação ou alterar sua função, em particular, proteínas

mitocondriais oxidadas podem causar morte celular por necrose ou apoptose

devido a deficiência bioenergética (Brown, 2007). No DNA a oxidação causa

danos principalmente a guanina, resultando na 8-oxoguanina (revisado em

Agnez-Lima et al., 2012) ou gerar quebras de fita do DNA.

Como já mencionado as EROs possuem um papel importante no combate

aos patógenos, muitos estudos já descreveram sua importância na fisiopatologia

da inflamação (revisado por Rosenblatt-velin et al. 2014). O processo

inflamatório nada mais é que o acúmulo de leucócitos e proteínas plasmáticas

16

em um sítio de infecção ou lesão tecidual (Abbas et al. 2012). O reconhecimento

dos patógenos pela célula ocorre por meio dos receptores Toll-like (TLRs). Essa

família de receptores transmitem o sinal através do adaptador MyD88 resultando

na ativação de fatores de transcrição como NF-kB e AP-1. Além de promover a

transcrição de citocinas inflamatórias, a sinalização dependente dos TLRs

resulta na formação de EROs principalmente pela ativação de isoformas da

NADPH oxidase (Ogier-Denis et al. 2008). Como uma espécie de feedback

positivo, a exposição de macrófagos a EROs aumenta os níveis de TLR4

(receptor responsável pelo reconhecimento de LPS) na superfície da membrana

(Powers et al. 2006), esse processo de amplificação da resposta tem sido

chamado de ‘TLR-radical cycle’ e pode representar um importante mecanismo

de manutenção da inflamação crônica em doenças humanas como diabetes,

doenças cardiovasculares e neurodegenerativas (revisado por Lucas e Maes,

2013).

O reparo dos danos causados por EROs no DNA

A maioria das lesões de DNA induzidas por ERO são corrigidas pela via

de reparo por excisão de bases (BER, base excision repair) (revisado em Agnez-

Lima et al., 2012), essa via é a responsável por reparar a maioria das lesões de

base única, causadas por agentes ambientais (fumaça de cigarro e radiação

ionizante) ou endógenos, como as EROs, além de reparar também quebras de

fita simples no DNA. A via requer a atividade coordenada de algumas enzimas

tais como: a) DNA glicosilases capazes de excisar as bases modificadas; b) AP

endonucleases como a APE1, que cliva a ligação 5’fosfodiéster, gerando os

terminais 3’OH e 5’dRP; c) exonucleases (polimerase β, FEN, APE1); d) DNA

polimerases (polimerase β ou polimerase δ/ε com PCNA); e finalmente e)

enzimas de ligação (DNA ligase I e III com XRCC1) (Tell et al., 2009).

Detalhadamente, quando o dano no DNA é reconhecido, dois tipos de

glicosilases podem agir, as monofuncionais, como UDG e MPG, que são

capazes apenas de remover a base danificada resultando em um sítio

apurínico/apirimidinico (AP) clivado por APE1 que por sua vez produz um

terminal 3’ OH e 5’dRP, este último é processado pela DNA Polimerase β

produzindo um terminal 5’P. Já as glicosilases bifuncionais podem clivar a base

17

inicialmente modificada e estas são capazes também de agir como

endonuclease, gerando pontas 3’dRP e 5’P (OGG1 e NTH1) ou ainda 3’P e 5’P

(NEILs), esses terminais 3’ precisam ser modificados por APE1 e PNK,

respectivamente, para gerar os terminais 3’OH e 5’P necessários para

continuação da via. (Hegde et al. 2012). A partir do sítio AP clivado a via ainda

pode seguir por dois caminhos diferentes, a polimerase β pode inserir o

nucleotídeo danificado seguida pela ligação da fita pela DNA ligase 3 (Lig3) e

XRCC1 (SP-BER, do inglês Short Pacth) ou as polimerases δ e ε removem

alguns nucleotídeos e promovem o reparo em conjunção com FEN-1, proteína

responsável pelo processamento do terminal 5’, PCNA, uma proteína auxiliar

para a polimerase δ e Lig1, que liga as pontas da fita finalizando assim o reparo

(Figura 2).

Além de reparar o DNA nuclear a via BER é importante para o reparo do

DNA mitocondrial, que devido a sua proximidade com a maior fonte de produção

de EROs na célula possui um mecanismo de reparo eficiente, evitando a

disfunção da organela. A maioria das proteínas que atuam na via BER nuclear

(nBER) também estão presentes na via BER mitocondrial (mtBER), com algumas

Figura 2. Via de reparo por excisão de bases, a base modificada é

removida por uma glicosilase e o sítio abásico é clivado por uma

endonuclease e a via pode seguir por umas das duas subvias A) via curta

onde apenas um nucleotídeo é retirado B) via Longa onde vários nucleotídeos

são removidos (Sykora et al. 2013).

18

exceções como TFAM (Fisher and Clayton 1988), Polγ (Bertazzoni et al. 1977)

estão apenas na mitocôndria e XRCC1 e Polβ presentes apenas no núcleo

(Hansen et al. 2006; Lakshmipathy and Campbell 2000). Apesar disso, mesmo

as proteínas que atuam somente na mitocôndria são codificadas pelo genoma

nuclear (Revisado por Sykora et al. 2013).

A via BER repara também a maioria das lesões causadas ao DNA em

neurônios e isso pode ser atribuído principalmente a: 1) o dano oxidado ao DNA

é um evento recorrente em neurônios devido ao alto consumo de oxigênio e

baixa taxa de produção de antioxidantes; 2) BER repara também o DNA

mitocondrial, que é fundamental para o funcionamento neuronal; 3) BER repara

os danos causados pela atividade fisiológica dos neurônios, como por exemplo

danos induzidos por glutamato (revisado por, Akbari et al. 2015).

APE1/Ref-1: uma proteína multifuncional

A endonuclease apurínica/apirimidínica 1 (APE1) é uma das proteínas

mais importantes da via BER, exercendo assim um papel central na manutenção

da estabilidade genômica. O gene humano da APE1 (APEX1) é composto por

cinco exons, está localizado no cromossomo 14q11.2 e codifica uma proteína de

318 aminoácidos (revisado por Thakur et al. 2014), a região N-Terminal está

relacionada a interação proteína-proteína e localização nuclear. A partir do

aminoácido 35 até o 127 encontra-se a porção redox, e do 127 ao 318 no domínio

C-terminal estão os aminoácidos envolvidos no reparo de DNA. (Revisado por

Tell et al. 2010). APE1 está localizada principalmente no núcleo, e o sinal de

localização nuclear está nos 20 primeiros aminoácidos da porção N-terminal,

porém a proteína também sofre translocação para o citoplasma e para

mitocôndria. Sua expressão é estimulada pela presença de EROs aumentando

assim sua síntese proteica (Hsieh et al. 2001). A APE1 é vital em células de

mamíferos de modo que o knockout do gene é letal nos estágios iniciais do

desenvolvimento de camundongos.

Pós-traducionalmente APE1 pode sofrer modificações como acetilação,

fosforilação e ubiquitinação, que modulam sua atividade, estabilidade, interação

e distribuição intracelular (Bhakat et al.2003). p300 é uma histona

acetiltransferase que é ativada pelo cálcio intracelular, ao acetilar APE1, p300

19

aumenta sua ligação aos elementos negativos responsivos a cálcio (nCARE, do

inglês negative calcium response elements) (Bhakat et al. 2003). Além disso,

APE1 também é acetilada quando se liga ao sítio AP no DNA, a acetilação induz

mudanças conformacionais que aumentam sua atividade como endonuclease

(Roychoudhury et al. 2016), já a fosforilação de APE1 por caseína quinase

serina/treonina (CKII) e proteína quinase C (PKC) diminui sua atividade de

reparo (Yacoub et al. 1997) e aumenta a atividade de AP-1 dependente da

redução de APE1 (Hsieh et al. 2001), por fim, a endonuclease pode ser também

ubiquitinada por E3 ubiquitina ligase e degradada por MDM2 (Meisenberg et al.

2012).

Além de agir processando os sítios abásicos através da hidrolise da

ligação 5’fosfodiester como foi detalhado acima, APE1 é também chamada de

Ref1 pois atua reduzindo vários fatores de transcrição como AP-1 (Fos e Jun),

NF-kB, Egr-1, P53 e HIF-1 e aumentando a atividade de ligação destes com o

DNA (Kelley et al., 2012; Tell et al., 2010). Ao reduzir essas proteínas APE1 é

oxidada e por sua vez é reduzida por tiorredoxina. Apesar de não estar

exatamente claro o mecanismo pelo qual APE1 reduz os fatores de transcrição

sabemos que três dos seus resíduos de cisteína são importantes nessa função

(Cys65, Cys93 e Cys99) (Luo et al. 2012).

Alguns dos fatores reduzidos por APE1, como NF-kB e AP-1, são

necessários durante o processo inflamatório para a expressão de citocinas e

quimiocinas pró-inflamatórias. Foi observado que a inibição da porção redox de

APE1 por E3330 inibe a secreção de TNF-α, IL-6, IL-12 e PGE2 em macrófagos

ativados tratados com LPS (Jedinak et al., 2011), outro trabalho observou que

APE1 é um regulador da resposta inflamatória TLR2-dependente e que age

modulando as atividades de NF-kB e HIF-1α, em queratinócitos (Lee et al.,

2009). Já Beak et al. (2016) mostrou que astrócitos ativos tratados com LPS

aumentam a translocação de APE1 para o citoplasma, e a presença de APE1 no

citoplasma interrompeu a acetilação de p65 (subunidade de NF-kB) por p300,

diminuindo assim a atividade de NF-kB.

Além de regular a transcrição por meio da redução de FTs, APE1 também

participa de complexos proteicos e interage e regula genes de maneira redox-

independente. Um exemplo é o complexo que se liga a região nCARE, já citada

anteriormente, que bloqueia a expressão dos genes do paratormônio e da renina.

20

Já foi observado que um aumento da transcrição e dos níveis proteicos de APE1

aumentam o recrutamento do complexo no promotor do gene do paratormônio

regulando-o negativamente (Okazaki et al. 1994), o mesmo acontece com o gene

da renina (Fuchs et al. 2003). APE1 interage também com EGR-1, que é um fator

de transcrição e supressor tumoral que regula a expressão de genes como p53

e PTEN. Já foi demonstrado que EGR-1 ativa a expressão de PTEN de uma

maneira dependente da acetilação de APE1. Neste mesmo trabalho foi

demonstrado, em células Hela, que o tratamento com HDACs diminui a

acetilação de APE1 e a indução da expressão de PTEN (Fantini et al. 2008).

APE1 também está presente no promotor do fator de crescimento endotelial

vascular (VEGF) juntamente com o complexo transcricional induzido por hipóxia

e interagindo com p300, HIF-1α e STAT3 (Gray et al. 2005), a endonuclease não

somente participa do complexo como também é fundamental para seu

recrutamento (Ziel et al. 2004). Por fim, p53 pode interagir com APE1 de maneira

redox-dependente ou de maneira redox-independente (Jayaraman et al. 1997).

O papel de APE1 como reguladora transcricional inclui também sua

função como endonuclease, estudos recentes têm demonstrado que OGG1 e a

função de endonuclease de APE1 são necessárias para a transcrição de genes

alvos de uma desmetilase conhecida como LSD1 ou KDM1A. Essa proteína é

responsável por desmetilar lisinas na histona 3, sendo capaz de ativar ou reprimir

a transcrição dependendo da lisina desmetilada. Desmetilação da lisina 4 (H3K4)

está associada a repressão transcricional enquanto a desmetilação da lisina 9

(H3K9) está associada a ativação. Ao promover a desmetilação LSD1 produz

H2O2, que causa danos ao DNA, sendo necessário portanto o recrutamento de

OGG1 e APE1 para ocorra o reparo e o remodelamento da cromatina levando a

transcrição (Amente et al. 2010).

APE1 também é capaz de agir como uma endoribonuclease, clivando

sítios AP no RNA e por causa dessa atividade tem sido proposto que a proteína

atua no controle de qualidade do RNA, ou ainda clivar RNAm em sequencias

específicas como acontece com o RNAm de c-myc, (clivado preferencialmente

entre os dinucleotídeos UA e CA). O knockout de APE1 aumenta a estabilidade

e o tempo de meia-vida do RNAm de c-myc, (Barnes et al. 2009).

Até o presente momento as duas funções de APE1, reparo e redox, são

descritas como independentes uma da outra e existem inibidores específicos

21

para cada uma das funções, E3330 ([(2E) -3 - [5 - (2,3 dimetoxi-6-metil-1 ,4-

benzoquinolyl)]-2-nonil-2-propenóico ácido]) é um composto derivado de

quinona com potencial clinico como inibidor da porção redox de APE1. E3330

inibe a expressão genica mediada por NF-kB e a translocação de NF-kB para o

núcleo sem afetar a degradação de IkB alfa (Fishel et al., 2015). Já a

metoxiamina é um derivado da alcoxiamina capaz de bloquear a clivagem do

sítio abásico por APE1, por ligar-se ao produto da DNA glicosilase formando um

sítio refratário para a clivagem de APE1. Dados anteriores indicaram que MTX

aumenta significantemente o efeito antitumoral de agentes quimioterápicos como

carmistine e temozolomida, suportando a ideia de que a inibição do reparo de

sítios AP seria vantajosa em alguns protocolos de terapia contra o câncer (Fishel

et al., 2007).

Resveratrol (3, 4, 5-tri-hidroxiestilbeno-trans) é uma fitoalexina polifenólica

presente no vinho tinto, nas uvas entre outras plantas e possui efeitos

antioxidantes e anticarcinogênico. Apesar de não estar claro, Yang et al. (2005)

demonstrou por meio de análise computacional da estrutura de APE1 que

resveratrol seria capaz de ligar-se a proteína, possivelmente inibindo a mesma,

no mesmo trabalho foi mostrado que resveratrol pode inibir a clivagem de sítios

abásicos de uma maneira concentração dependente de modo que na presença

de resveratrol acima de 20µM o antioxidante foi capaz de inibir o reparo de APE1

(Yang et al., 2005). Porém, nosso grupo observou por meio de Ensaio de excisão

de sítio abásico resveratrol não afeta a função de endonuclease de APE1 (dados

não publicados).

Em um trabalho utilizando os dois inibidores de APE1 e resveratrol após

o tratamento com LPS nosso grupo observou que, tanto a inibição da função

redox quanto a inibição do reparo de DNA afetaram a expressão de citocinas e

quimiocinas em monócitos tratados com LPS por 24h. Após o tratamento com

metoxiamina, resveratrol e E3330 separadamente por 4h observamos uma

diminuição na expressão de TNF-α, IL-8, IL-6, IL-10, MCP-1, MIP-1α e MIP-1β,

(Coutinho, 2013).

O dano ao DNA, o estresse oxidativo e o processo inflamatório são

envolvidos em várias doenças humanas, como câncer, doenças

cardiovasculares e doenças neurodegenerativas.

22

A associação entre danos no DNA, inflamação e doenças

neurodegenerativas

Doenças caracterizadas por uma disfunção progressiva do sistema

nervoso, resultante da perda seletiva de neurônios no cérebro ou medula

espinhal são chamadas de doenças neurodegenerativas. A medida que os

neurônios se degeneram os indivíduos apresentam sintomas tais como, perda

de coordenação ou de memória, quanto mais neurônios morrem os sintomas

ficam progressivamente pior (revisado por Coppedè et al. 2014). As doenças

mais conhecidas são: doença de Parkinson, doença de Alzheimer, doença de

Huntington e Esclerose lateral amiotrófica. A inflamação assim como o estresse

oxidativo e consequentemente os danos causados ao DNA, desenvolvem um

papel importante na fisiopatologia dessas doenças

Doença de Alzheimer (DA)

A DA é caracterizada por uma perda de neurônios principalmente do

neocórtex e hipocampo, causando perda de memória e declínio cognitivo, o

principal marcador histopatológico da doença é a presença de placas

extracelulares formadas por agregados de proteína beta amiloide (Aβ). Já foi

observado que os agregados Aβ recrutam células da microglia e astrócitos para

seu redor e são reconhecidos pelos receptores TLR2 da membrana dessas

células, a interação com os receptores pode ativar a fagocitose promovendo uma

diminuição do número de agregados de Aβ, por outro lado a ativação dos TLRs

ativam a expressão de citocinas, quimiocinas, EROs e ERNs que podem

contribuir com a progressão da doença (revisado por Fischer and Maier, 2015).

A quantidade de danos ao DNA causados por espécies reativas é maior

em pacientes com DA quando comparadas a pacientes controles (Mecocci et al.

1994; Gabbita et al. 1998), e este aumento é ainda mais acentuado no mtDNA

(Wang et al. 2006), muitos estudos sugerem que esse aumento de danos deve-

se a polimorfismos das enzimas de reparo nesses pacientes, outros estudos

indicam que as enzimas podem sofrer modificações pós-traducionais induzidas

por oxidação que causam inativação (Coppedè et al. 2010). APE1 por exemplo,

está mais expressa no cérebro de pacientes com DA, porém, foi demonstrado

23

que Cdk5 interage diretamente com APE1 fosforilando seu resíduo Thr232, o

que leva a redução da atividade de reparo. Esta diminuição está associada a

morte neuronal na DA (Huang et al., 2010; revisado em Thakur et al., 2014).

Doença de Parkinson (DP)

A DP é caracterizada pela perda de neurônios dopaminérgicos na

substância negra, que é responsável pelos sintomas motores característicos da

doença. Os neurônios afetados possuem agregados de proteína chamado de

corpos de lewy formados por α-sinucleína, além disso mutações nos genes da

α-sinucleína, Parquina, PINK-1, e DJ-1 levam a formas hereditárias da doença,

e todas elas levam a disfunção mitocondrial (revisado por Fischer e Maier, 2015).

Da mesma maneira que a Aβ é capaz de ativar células imunes na DA, na DP, a

α-sinucleína também ativa micróglia e astrócitos através do receptor TLR2,

desenvolvendo uma resposta inflamatória e consequentemente produção de

espécies reativas.

Os danos ao DNA causados por EROs em pacientes como DP são mais

numerosos na substância negra, no núcleo caudado, putâmen e córtex cerebral

(Sanchez-Ramos et al. 1994), Corroborando com isso Gencer et al. (2012)

observaram que variantes genéticas de APE1, XRCC1 e XRCC3 são fatores de

risco associados ao desenvolvimento de DP, isso porque o aumento de danos,

devido ao estresse oxidativo, pode levar a perda de neurônios dopaminérgicos.

Esclerose Lateral amiotrófica (ELA)

A esclerose lateral amiotrófica é uma desordem neurodegenerativa

caracterizada por perda de neurônios motores localizados no córtex motor,

tronco cerebral e medula espinhal, causando fraqueza progressiva e morte.

SOD1 foi o primeiro gene a ser identificado em associação com esta doença

estando presente em cerca de 20% dos pacientes com ELA hereditária. SOD1 é

uma superóxido dismutase essencial no combate a radicais livres produzidos

pela respiração mitocondrial. Esta descoberta levou a uma intensa investigação

24

sobre o papel do estresse oxidativo e do dano mitocondrial na ELA (revisado por

Coppedè et al. 2015).

Na ELA também foi observado um aumento de danos ao DNA de

neurônios do córtex motor e na medula espinhal de pacientes com ELA

esporádica e hereditária (Ferrante et al. 1997). Além disso, na ELA esporádica

foi observado uma redução na expressão e na atividade de reparo de APE1

(Kisby et al. 1997).

Doença infecciosa no SNC: Meningite

Leib et al. (1996) já havia observado um envolvimento do estresse

oxidativo na patogênese da injúria cerebral. Segundo este trabalho, moléculas

oxidativas geradas durante a inflamação contribuem para o dano cerebral e

morte neuronal, por necrose ou apoptose, em um modelo de meningite

bacteriana, em ratos. Devido ao crescente número de trabalhos associando

enzimas de reparo de DNA ao processo inflamatório e ao papel necessário,

porém perigoso do estresse oxidativo na inflamação, o nosso grupo resolveu

investigar polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs, single nucleotide

polymorphisms) não-sinônimos em pacientes com meningite. Foram analisados

polimorfismos antes associados com câncer, APE1Asn148Glu,

OGG1Ser326ICys e PARP-1Val762Ala, em pacientes com meningite bacteriana

comparando com um grupo de controle não infectado. Foi observado que o alelo

Glu de APE1 é mais frequente em pacientes com meningite bacteriana (MB) e

que indivíduos portadores deste alelo possuem aumento de danos no DNA,

desbalanço na razão IgG/IgA e diminuição de citocinas como IL-6, IL-1Ra, IL-

8/CXCL8 e MCP-1/CCL2. Os pacientes portadores do alelo Cys de OGG1

também foram mais frequentes no grupo com MB, apresentando também

aumento de danos no DNA e da imunoglobulina IgG, mas não houve redução

dos níveis de citocinas, já com o alelo Ala de PARP-1 o aumento da frequência

no grupo BM não foi significante assim como não houve alteração nos níveis de

citocinas nem imunoglobulinas. Os pacientes com meningite apresentaram

também maior frequência dos SNPs combinados (Silva et al. 2011).

Por causa da associação do polimorfismo de APE1 com MB, nosso grupo

resolveu investigar melhor o papel de APE1 na inflamação. Em um trabalho

25

utilizando os dois inibidores de APE1 e resveratrol após o tratamento com LPS,

nosso grupo observou que, tanto a inibição da função redox quanto a inibição do

reparo de DNA afetaram a expressão de citocinas e quimiocinas em monócitos

tratados com LPS e expostos aos inibidores metoxiamina, resveratrol ou E3330.

Foi observado uma diminuição na expressão de TNF-α, IL-8, IL-6, IL-10, MCP-

1, MIP-1α e MIP-1β, (Coutinho, 2013).

Afim de investigar melhor o efeito global dessas substâncias na célula

durante a inflamação, nosso grupo realizou um sequenciamento dos RNAs

transcritos em monócitos após 24hrs de tratamento com LPS mais 4hrs de

E3330 ou Metoxiamina ou Resveratrol, sendo geradas listas de genes Down

regulados ou Up regulados por cada inibidor. E3330 por exemplo possui 1250

diferencialmente expressos com fold change ≥3 ou ≤ -3, sendo 620 down

regulados e 630 up regulados (Fontes et al. 2016; dados não publicados). Todas

as listas foram submetidas análise de ontologia gênica e biologia de sistemas.

Após a analises de ontologia, utilizando a ferramenta DAVID, nós

observamos que os três inibidores afetaram a expressão de muitos genes

relacionados a neurodegeneração, e vias como as da Doença de Parkinson

(DP), Doença de Alzheimer (DA) e Doença de Huntington (DH) apareceram

enriquecidas nas nossas listas mesmo se tratando de monócitos. Devido a

importância de APE1 e suas funções na sobrevivência neuronal, este trabalho

visa observar quem são esses genes, quais suas funções e se alguns deles

possuem expressão alterada também em células de Glioma/Astrocitoma.

OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

Contribuir quanto ao conhecimento do envolvido de APE1 na regulação

transcricional durante o processo inflamatório e suas consequências sobre a

expressão de genes relacionados a fisiopatologia de doenças

neurodegenerativas.

26

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Identificar rotas metabólicas as quais os genes de doenças

neurodegenerativas participam;

Identificar mecanismos regulatórios comuns aos genes down e up

regulados por cada um dos tratamentos;

Predizer possíveis proteínas parceiras de APE1 que regulam os

genes da DN e os mecanismos regulatórios envolvidos;

Obter o perfil de expressão de alguns genes de interesse a fim de

validar a resposta do transcriptoma;

Determinar se as respostas observadas em monócitos se aplicam

a outras linhagens.

METODOLOGIA

ANÁLISE DA VIAS ENRIQUECIDAS NAS LISTAS DE TRANSCRITOS

Os transcriptomas gerais dos três tratamentos utilizados no estudo,

incluindo apenas os genes com fold change maior que 2,00, foram submetidos

a análise usando o software online e gratuito DAVID v 6.8, que é capaz de

identificar vias metabólicas enriquecidas nas listas de transcritos, disponibilizado

dados de vários bancos de dados. Os genes submetidos ao software são

agrupados seguindo os critérios: Disease, Functional_Categories;

Gene_Ontology; General Annotations; Literature; Main_Accessions; Pathways;

Protein_Domains; Protein_Interactions; Tissue_Expression. Nós utilizamos as

categorias Disease e Pathways, com dados dos Bancos KEGG e UNIPROT,

respectivamente, para observar se havia enriquecimento de via relacionadas a

neurodegeneração ou doenças neurodegenerativas.

ANÁLISE DE REDES DE INTERAÇÃO PROTEÍNA-PROTEÍNA

As listas de genes com expressão alterada e fold change maior que 2,00

foram submetidas ao String 10.5 para obter redes de interações entre as

proteínas. Foram utilizados todos os tipos de interação presentes na ferramenta

27

(textmining, Experiments, Databases, Co‑expression, Neighborhood, Gene

Fusion e Co‑occurrence) com intuito de analisar o maior número de genes da

lista quanto possível, cada rede montada foi submetida ao Cytoscape, versão

3.5.0, o programa oferece vários plug-ins como MCODE, Bingo e iRegulon.

Os genes envolvidos com neurodegeneração foram pesquisados dentro

das redes montadas pelo cytoscape, e para facilitar essa busca os genes foram

agrupados em clusters usando o plugin MCODE com os seguintes parâmetros:

inclusão de loops, degree cutoff 2, fluff e haircut ativados, node score cutoff de

0.2, K-core 2 e maximum depth de 100. Os clusters formados com Score acima

de 3 foram analisados para a presença dos genes de interesse. As funções

biológicos dos clusters selecionados foram preditas pelo BINGO, selecionando

o organismo Homo Sapiens para análise e considerando vias com significância

estatística (p<0,05).

As redes totais e os clusters foram analisados pelo plug-in iRegulon, O

programa reconhece regiões consensos e busca fatores transcricionais que se

ligam a essas regiões baseado em bancos de dados de chip-seq. A busca é feita

em uma região de 20kb em torno do sítio de início da transcrição, e cada fator

de transcrição resultante possui um escore de enriquecimento normalizado

mínimo (do inglês minimum normalized enrichment score -NES). NES acima de

3 é o valor padrão, acima de 4 tem uma boa significância e acima de 5 tem uma

alta significância (Verfaillie et al. 2015).

Em uma outra abordagem nós submetemos ao iRegulon apenas os genes

relacionados a neurodegeneração para observar os fatores de transcrição

enriquecidos entre eles.

INDUÇÃO DA INFLAMAÇÃO E TRATAMENTO COM INIBIDOR.

As células em suspensão U937, linhagem de monócitos, foram cultivadas

em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino e 100 u/mL de

penicilina, 100 u/mL estreptomicina e mantidas a 37ºC em atmosfera úmida com

5% de CO2. Para indução da resposta inflamatória celular, foi realizado

tratamento com LPS (1 µg/mL) por 24 horas e após isso a inibição da atividade

redox de APE1 com E3330 100 μM, Resveratrol 15 µM e Metoxiamina 6 mM por

mais 4 horas.

28

As células aderidas U251MG, linhagem de Glioma/astrocitoma, foram

cultivadas em meio DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 100

u/mL de penicilina, 100 u/mL estreptomicina e mantidas a 37ºC em atmosfera

úmida com 5% de CO2. O modelo de tratamento foi o mesmo desenvolvido nos

monócitos.

EXTRAÇÃO DE RNA

Com objetivo de confirmar a expressão de alguns genes envolvidos na

neurodegeneração por um método mais específico e validar o resultado do

transcriptoma, assim como observar se a resposta é célula especifica, foi feita a

extração de RNA das células U937 e U251MG.

A extração foi feita com o kit comercial Illustra triplePrep (GE Healthcare)

e a extração seguiu as instruções do fabricante, para recuperar o RNA a mistura

junto com acetona passa por uma mini coluna, onde o RNA fica retido, e é

recuperado através de tampão de eluição. O RNA extraído foi quantificado pelo

fluorímetro Quibit® 2.0 (Invitrogen).

Após a extração o RNA foi convertido em c-DNA utilizando o kit High

Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystem). O mix para

transcrição reversa contém: 10x RT Buffer, 25x dNTP Mix (100mM), 10x RT

Random Primers (200nM), 50U MultiscribeTM Reverse Transcriptase (50U/μL),

água livre de nucleases e o RNA. A solução foi incubada em termociclador

(Mastercycler® ep, EPPENDORF) a 25°C por 10 minutos, seguidos de 120

minutos a 37°C e 5 minutos a 85°C. As amostras foram armazenadas a -80°C.

q-PCR

O c-DNA, foi adicionado ao Mix de reação da PCR (dH2O, Tampão PCR

10X, 50 mM MgCl2, 20 mM dNTP, 10 μM Primers, ROX diluída, SYBR Green

1:50,000, 5 U/μl Taq). As reações foram então adicionadas ao equipamento Step

One (Applied Biosystems, Foster, CA). E submetidas a ciclos de alteração de

temperatura para que as diferentes etapas da reação ocorram primeiramente um

ciclo a 95ºC para ativação, seguido de 40 ciclos, em que se repetem,

29

desnaturação a 95ºC, Anelamento, a uma temperatura que depende do primer

desenhado, e extensão a 72ºC.

Foi analisada a expressão dos genes: NRF1, HDAC1, ATM e NDUFV2.

Utilizando os primers descritos na tabela 1.

Tabela 1: Sequências dos primers utilizados para qPCR.

GENE Primer Forward Primer Reverse

GAPDH GGCATGGACTGTGGTCATGAG TGCACCACCAACTGCTTAGC

ATM GCAGATGACCAAGAATGCAA GGCCTGCTGTATGAGCAAAT

HDAC1 GAGGAAGAGTTCTCCGATTC TCTCCTCTGGGTCTTTCT

NDUFV2 CGAAAGCCAGTTGGAAAG CTCCAGTATGCTGTCAGAG

NRF1 GAGGATGATCCTGGAAGACC AATTCCGTCGATGGTGAGAG

RESULTADOS

Genes envolvidos na neurodegeneração tem sua expressão afetada

por inibidores de APE1 durante o processo inflamatório.

Em trabalhos anteriores nosso grupo realizou RNAseq de células U937

tratadas com LPS para induzir inflamação e co-tratadas com inibidores de APE1

E3330 e Metoxiamina, e com o antioxidante resveratrol, separadamente. Este

experimento gerou duas listas para cada inibidor, sendo uma de genes down

regulados e outra de genes up regulados após o tratamento, estas listas foram

submetidas a analise funcional e de ontologia gênica pelo KEGG e UNIPROT

através do DAVID para descobrir as vias metabólicas enriquecidas nos genes

diferencialmente expressos. Como resultado observamos vias relacionadas a

doenças neurodegenerativas (Doenças de Parkinson, Doença de Huntington e

Doença de Alzheimer) enriquecidas em nossas listas Down reguladas, após o

tratamento com resveratrol e E3330, mas não após o tratamento com

Metoxiamina. Nas listas de genes Up regulados a análise funcional pelo

UNIPROT, indicou a presença de genes relacionados a neurodegeneração

pertencentes a doenças variadas, apenas após o tratamento com E3330 e

Metoxiamina.

30

Na lista de genes down regulados após tratamento com Metoxiamina, não

se observou genes suficientes para que a via de neurodegeneração estivesse

enriquecida no DAVID, porém alguns poucos genes presentes nos tratamentos

de E3330 e Resveratrol, também estão presentes no tratamento com

metoxiamina (figura 3), assim como ocorre com resveratrol e os genes up

regulados (figura 4).

Figura 3. Intersecção entre os genes da neurodegeneração down

regulados por cada tratamento. NDUFB7 foi o único comum a todos os

tratamentos. O tratamento com metoxiamina não down regulou genes

suficientes para que as vias fossem estatisticamente significativas. Alguns dos

genes presentes nos tratamentos de E3330 e Resveratrol estavam presentes

também em metoxiamina, por exemplo ATP5H, NDUFB4, CASP3, PPP3CB.

31

Figura 4. Intersecção entre os genes da neurodegeneração up regulados por cada tratamento. MARS2, AARS e ASCC1 foram up regulados por todos os tratamentos. O tratamento com resveratrol não Up regulou genes suficientes para que as vias fossem estaticamente significativas, porém TECPR2 e ATP13A2 foram up regulados por ele.

32

E3330

Para o inibidor da função redox de APE1 foram encontrados no DAVID

56 genes relacionados a neurodegeneração, sendo 21 Down regulados e 35 Up

regulados (Tabelas 2 e 3).

Tabela 2. Descrição de genes de vias de neurodegeneração Down regulados

após tratamento com E3330 segundo o DAVID e KEGG.

Gene Fold Change Vias de Neurodegeneração

COX8A -7,65442404

Doença de Parkinson, Alzheimer e Huntington

COX7A2 -5,46744574


UQCR10 -4,92153589


POLR2J -3,82804674

Doença de Huntington

ATP5H -3,28046745


UQCRH -3,28046745


NDUFB7 -3,28046745


NRF1 -3,28046745


DNAH1 -3,00751252


NDUFB4 -2,7345576


NDUFA11 -2,7345576


APH1A -2,5516138

Doença de Alzheimer

ATP2A3 -2,29649416


UQCR11 -2,1869783


COX5B -2,1869783


NDUFA12 -2,1869783


PPP3CB

-2,1869783


TNFRSF1A -2,12632165


33

NDUFB9 -2,02622017


CASP3 -2,00500835


PLCB3 -2,00500835

Doença de Alzheimer e Huntington

Tabela 3. Genes Up regulados após tratamento com E3330 envolvidos em vias

de doenças neurodegenerativas segundo DAVID e UNIPROT.


SLC25A46 12,78353659 neuropatia sensorial e autonômica hereditária tipo 5b

TTBK2 9,14503817 ataxia espinocerebelar

ASCC1 5,47865854 Atrofia muscular espinal

SPAST 5,1821883 paraplegia espástica

GNB4 4,99877875 Doença de Charcot-Marie-Tooth

HACE1 4,26551373 paraplegia espástica

ATXN3 4,11526718 Doença de Machado-Joseph

ATXN2 4,11526718 ataxia espinocerebelar, esclerose lateral amiotrófica e doença de parkinson

C12orf65 3,65801527 paraplegia espástica

KIF1B 3,35318066 Doença de Charcot-Marie-Tooth

EXOSC3 3,29120879 hipoplasia ponto cerebelar

ATXN7 3,13475796 ataxia espinocerebelar 7

PDK3 2,95420385 Doença de Charcot-Marie-Tooth

ENTPD1 2,92551893 paraplegia espástica

TFG 2,7970546 paraplegia espástica

SPG11 2,74351145 Doença de Charcot-Marie-Tooth, Paraplegia espástica e Esclerose lateral amiotrófica

MARS2 2,74351145 ataxia espástica

34

DYNC1H1 2,69361017 Doença de Charcot-Marie-Tooth e Atrofia Muscular espinal

CLN3 2,6122983 LIPOFUSCINOSE CERÓIDE NEURONAL

TRPM7 2,560499 esclerose lateral amiotrófica

WNK1 2,44948476 neuropatia sensorial e autonômica hereditária tipo 2

TECPR2 2,43743642 paraplegia espástica

CHMP2B 2,43743642 esclerose lateral amiotrófica

HEXB 2,40057252 Doença de Sandhoff

VPS37A 2,35106847 paraplegia espástica

SYNJ1 2,35106847 Doença de Parkinson

AARS 2,31650723 Doença de Charcot-Marie-Tooth

PNKP 2,28625954 Ataxia apraxia oculomotora tipo 4

SLC33A1 2,19413919 paraplegia espástica

CWF19L1 2,19413919 ataxia espinocerebelar

ELOVL5 2,15720661 ataxia espinocerebelar

AP4E1 2,05763359 paraplegia espástica

DDHD2 2,0119084 paraplegia espástica

PRPS1 2,00305321 Doença de Charcot-Marie-Tooth

HDAC1


Metoxiamina

A inibição do reparo de DNA por metoxiamina, mesmo tendo mostrado

genes relacionado a DN down regulados não foi suficiente para identificação pelo

DAVID como uma via enriquecida, porém a análise da rede UP regulada resultou

um enriquecimento de genes envolvidos em doenças neurodegenerativas

variadas (Tabela 4 e 5) assim como os genes Up de E3330.

35

Tabela 4. Genes Up regulados após tratamento com Metoxiamina envolvidos em

vias de doenças neurodegenerativas segundo DAVID e UNIPROT.


ATP13A2 2,2333188 Síndrome de kufor-rakeb

CLN3 2,9777584 Lipofuscinose ceróide neuronal

CWF19L1 2,77899878 Ataxia espinocerebelar

DNAJC5 2,83630359 Lipofuscinose ceróide neuronal

FBXO38 2,31653944 Neuropatia motora distal hereditária

TBP 3,90916031 Doença de Parkinson e ataxia espinocerebelar

AP4E1 2,38874046 Paraplegia espástica


ATXN2 2,17175573 Ataxia espinocerebelar, esclerose lateral amiotrófica e doença de Parkinson

CLN5 5,21221374 Lipofuscinose ceróide neuronal

CHMP2B 4,63072228 Esclerose lateral amiotrófica

DCTN1 2,04364224 Esclerose lateral amiotrófica e Neuropatia motora distal hereditária

ENTPD1 2,08424908 Paraplegia espástica

EXOSC3 3,47374847 Hipoplasia ponto cerebelar

KIF1B 2,60585242 Doença de Charcot-Marie-Tooth

LRSAM1 5,20426829 Doença de Charcot-Marie-Tooth

MARS2 2,8956743 Ataxia espástica

PLA2G6 3,4695122 Doença de Parkinson e distrofia neuroaxonal infantil

PSEN2 3,4695122 Doença de Alzheimer

RTN2 3,4695122 Paraplegia espástica

TECPR2 3,47304171 Paraplegia espástica

TRPM7 2,03498212 Esclerose lateral amiotrófica

36

TPP1 2,18760602 Lipofuscinose ceróide neuronal e Ataxia espinocerebelar

TDP1 2,17175573 Ataxia espinocerebelar

Tabela 5. Genes Down regulados após tratamento com Metoxiamina envolvidos

em vias de doenças neurodegenerativas segundo DAVID e UNIPROT.


ATP5H -3,45342707 Doença de Parkinson, Alzheimer e Huntington

NDUFB4 -2,87873462 Doença de Parkinson, Alzheimer e Huntington

CASP3 -6,33216169 Doença de Parkinson, Alzheimer e Huntington

NDUFB7 -3,45342707 Doença de Parkinson, Alzheimer e Huntington

PPP3CB -2,30228471 Doença de Alzheimer

APH1A -2,14916803 Doença de Alzheimer

DNAH1 -2,11072056 Doença de Huntington

NDUFA8 -2,87785589 Doença de Huntington, Parkinson e Alzheimer

COX7B -4,02987698 Doença de Huntington, Parkinson e Alzheimer

POLR2D -2,07205624 Doença de Huntington

POLR2J3 -2,87785589 Doença de Huntington

CDK5 -2,11072056 Doença de Alzheimer

Resveratrol

Resveratrol foi o composto que mais influenciou genes envolvidos nas

vias de doenças neurodegenerativas causando Down regulação de 47 genes

envolvidos na neurodegeneração (Tabela 6). Como aconteceu com

metoxiamina, os poucos genes Up regulados não foram significantes para a

identificação pelo DAVID, mas estão descritos na tabela 7

37

Tabela 6. Descrição de genes Down regulados após tratamento com Resveratrol

e vias de neurodegeneração em que estão envolvidos segundo o DAVID e

KEGG.

Gene Fold Change

Vias de Neurodegeneração

NDUFV2 -8,61842105 Doença de Huntington, Parkinson e Alzheimer

ATM -7,9002193

Ataxia-telangiectasia

COX7A2 -7,18201754 Doença de Huntington, Parkinson e Alzheimer

UQCR10 -6,46491228

Doença de Huntington, Parkinson e Alzheimer

HSD17B10 -5,02741228 Doença de Alzheimer

UQCRQ -4,30921053


ATP5G1 -4,30921053 Doença de Huntington, Parkinson e Alzheimer

NRF1 -4,30921053


NDUFB7 -4,30921053 Doença de Parkinson e Alzheimer

CDK5 -3,95065789


PPARG -3,59210526 Doença de Huntington

NDUFB2 -3,59210526


HTRA2 -3,59210526 Doença de Parkinson

NDUFA8 -3,59100877


SOD1 -3,50329128 Doença de Huntington

COX4I1 -3,32364235


NAE1 -3,23368075 Doença de Alzheimer

PARK7 -3,07897211

Doença de Parkinson

SLC25A6 -3,01799035 Doença de Huntington, Parkinson

SIN3A -2,99433169


NDUFS7 -2,87490856 Doença de Huntington, Parkinson e Alzheimer

38

SP1 -2,87438289 Doença de Huntington

APAF1 -2,87438289


DCTN2 -2,87438289


ATP5F1 -2,87421384


NDUFAB1 -2,8737073


NDUFC1 -2,87280702


BID -2,73058359


PPP3R1 -2,61268448


POLR2J -2,51425439


COX7B -2,51425439


POLR2B -2,48742616


POLR2J3 -2,39575713


CREB1 -2,39575713


CASP8 -2,33571037

Doença de Huntington e Alzheimer

NDUFB11 -2,33571037


PLCB2 -2,28619864

Doença de Huntington e Alzheimer

NCSTN -2,27531993


SDHA -2,25791288


POLR2F -2,15570175


CASP9 -2,15570175


POLR2D -2,15539305


PPP3CA -2,15539305


ATP5B -2,10343865


AP2M1 -2,09319851


39

CAPN1 -2,05264807 Doença de Alzheimer

Tabela 7. Descrição de genes Up regulados após tratamento com Resveratrol e

vias de neurodegeneração em que estão envolvidos segundo o DAVID e KEGG.


ASCC1 6,94817073 Atrofia muscular espinal

TECPR2 5,56358087 paraplegia espástica

ATP13A2 3,1805495 Síndrome de kufor-rakeb

MARS2 3,01526718 ataxia espástica


Principais reguladores dos genes com expressão modificada por

E3330, Metoxiamina e Resveratrol.

Para identificar as funções biológica e os possíveis reguladores, as listas

incluindo de genes com fold change acima de 2,00 foram submetidas a formação

de redes de interação proteica no STRING. As redes obtidas foram aplicadas no

cytoscape e submetidas a análise dos Plug-ins, MCODE, para formação de

clusters de interação dentro da via total, BINGO, que irá predizer a principais

funções celulares presentes naquele grupo de proteínas e iRegulon para

predizer os fatores de transcrição com mais sítios de ligação entre os genes

alterados. Primeiramente foi realizado o iRegulon das redes totais, afim de

observar os reguladores gerais das redes, e após isso o iRegulon dos genes

relacionados a neurodegeneração.

E3330

A lista de genes down regulados por E3330 durante a inflamação possui

915 genes com Fold Change maior que 2. Após ser submetida ao STRING 879

genes foram reconhecidos formando uma rede de interação que foi analisada no

Cytoscape, que reconheceu 863 desses genes. Estes foram então analisados

no iRegulon, permitindo a identificação de motifs de ligação a fatores de

40

transcrição, considerando sua ocorrência nos genes da rede. O iRegulon

retornou 8 fatores de transcrição que possuem NES acima de três sendo dois

deles com valor de NES acima de quatro são eles, em ordem decrescente de

valor de NES: ELK1, NRF1. NRF1 possui 336 alvos na rede down de E3330 e

além disso está down regulado em E3330 com fold = -3,28, ELK1 por sua vez,

com 584 alvos na Rede, não possui expressão alterada após tratamento com

E3330. (Tabela 8).

Tabela 8. Principais fatores de transcrição da rede down regulada por E3330.

Fatores de transcrição NES Nº de alvos

ELK1 5.802 457

NRF1 4.521 315

A lista de genes Up regulados após o tratamento com E3330 durante a

inflamação possui 2223 genes, como é uma lista grande para o String, que só

suporta dois mil proteínas por vez, ela foi dividida em duas partes e as duas

foram sobrepostas no cytoscape somando 1758 genes, diferente do resultado

da lista Down, o iRegulon desta rede não resultou em nenhum regulador com

NES significativo.

Resveratrol

A rede down regulada por resveratrol também possui 2099 genes com fold

change menor que -2,00, neste caso foram reconhecidos no cytoscape 1770.

Quando analisada no iRegulon, esta rede retornou como principais fatores de

transcrição com NES maior que 4: NRF2 possuindo 1207 possíveis alvos na

rede, apesar de não conter um NES tão significativo NRF1 possui 769 alvos

nessa rede seguido por ELK1, possuindo 540 alvos, estes foram os fatores com

maior número de alvos dentro da rede. (Tabela 9).

41


Resveratrol.


NRF2 5.844 1207

NRF1 3.853 769

ELK1 3.691 540

Metoxiamina

A lista de genes down regulados por metoxiamina possui 1287 genes com

Fold change menor que -2,00, 1041 deles possuem algum tipo de interação entre

si formando uma rede no cytoscape que, assim como em E3330 e resveratrol,

foi analisada pelo plug-in iRegulon, encontrando seis reguladores com NES

maior que 4, são eles: ETV3, NRF2, ELK4, NRF1, YY1 e ETV6 (Tabela 10).

NRF2 e NRF1 são descritos na literatura como parceiros de APE1 e regulam 629

genes e 396 genes respectivamente.


Metoxiamina.


ETV3 6.451 602

NRF2 5.893 629

ELK4 5.299 493

NRF1 5.021 396

YY1 4.357 126

ETV6 4.109 407

Já a lista de genes Up regulados por metoxiamina possui 1386 genes

estando 1066 na rede analisada pelo iRegulon que encontrou três fatores de

transcrição com NES significativo, CRX, FLI1 e BDP1.

42

Tabela 11. Principais fatores de transcrição da rede Up regulada por

Metoxiamina.


CRX 5.125 386

FLI1 4.616 688

BDP1 4.033 259

Principais clusters contendo genes das vias neurodegenerativas e

suas funções dentro da célula.

Para facilitar a pesquisa dos genes relacionados a neurodegeneração

dentro da rede formada pelos genes com expressão alterada, a rede foi

submetida ao MCODE que gerou clusters, que foram selecionados pela

presença de nossos genes alvos.

E3330

Como vimos nas tabelas anteriores as vias das Doenças de Parkinson,

Huntington e Alzheimer estão enriquecidas após a inibição da função redox

possuindo 21 genes com expressão alterada, mas o mesmo não acontece após

a inibição do reparo, então foi verificado a posição desses genes dentro da rede

formada pela lista de genes down regulados por E3330.

Foram encontrados alguns clusters com a presença de vários genes

envolvidos na neurodegeneração. O Cluster 1 possui 12 genes das vias de

neurodegeneração (Figura 5A) juntamente com mais 26 genes sendo a maioria

deles envolvidos com a fosforilação oxidativa e cadeia transportadora de

elétrons, segundo o BINGO (Fig. 5B). Além deste outro cluster parece importante

na rede down regulada, o Cluster 2 (Figura 6A) que contém apenas três genes

das vias neurodegenerativas PPP3CB, POLR2J e NRF1, como mostrado

anteriormente NRF1 não somente está presente na rede down regulada como é

um dos principais reguladores de toda a rede.

43

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Geração de energia e metabólitos precursores

Fosforilação Oxidativa

Cadeia Transportadora de elétrons

Síntese de ATP mitocondrial acoplado a cadeiatransportadora

Respiração celular

A

Figura 5. Cluster 1 de genes down regulados por E3330. A) Cada nó representa

uma proteína, e as conectores ligam proteínas que interagem entre si. As proteínas

em verde são aquelas com envolvimento em doenças neurodegenerativas, em

rosa estão genes que interagem com elas e são regulados pelos mesmos

reguladores (nós em vermelho) B) Distribuição dos principais processos biológicos

do Cluster 1 regulado negativamente por E3330 com um p valor com significância

estatística (p-valor<10-6) após análise com o BINGO.

B

44

A lista de genes UP regulados por E3330 contem 35 genes relacionados

a neurodegeneração, mas dentre os genes UP regulados encontram-se genes

envolvidos em doenças mais raras como, ataxia espinocerebelar, paraplegia

espástica, Doença de Charcot-Marie-Tooth, dentro da rede de interação 12

desses genes fazem parte do cluster 1 (Figura 7A), que possui proteínas

pertencentes as vias de metabolismo de macromoléculas, metabolismo de

compostos nitrogenados, resposta celular ao estresse, entre outros. (Figura 7B),

essas proteínas são reguladas por ETV5, YY1 e NFYA.

O segundo cluster dessa rede possui 11 genes relacionados a

neurodegeneração e YY1, FOXP2, RBBP9 e EGR1 como seus principais

reguladores (Figura 8A), suas proteínas participam de vias de modificação pós-

traducional, organização cromossômica, modificação da cromatina, entre outras

(Figura 8B).

Figura 6. Cluster 2 de genes down regulados por E3330. A) cada nó representa




reguladores (nós em vermelho). Este cluster não apresentou função biológica

estatisticamente significativa.

45

Gráfico 3. Cluster 4 Principais funções encontradas no cluster pelo número

de proteínas relacionadas a tais funções encontradas pelo BINGO (p-valor<

10-6).

B

A

B

0 50 100 150 200 250

Metabolismo celular

Metabolismo de macromoléculas

Metabolismo de compostos nitrogenados

Metabolismo de ácidos nucléicos

Biossíntese de macromoléculas

Metabolismo do DNA

Resposta celular ao estresse

Resposta ao Dano de DNA

Reparo de DNA

Figura 7. Cluster 1 de genes up regulados por E3330. A) cada nó representa


em verde são aquelas com envolvimento em doenças neurodegenerativas, em rosa

estão genes que interagem com elas e são regulados pelos mesmos reguladores

(nós em vermelho). B) Distribuição dos principais processos biológicos do Cluster 3

regulado positivamente por E3330 com um p valor com significância estatística (p-

valor<10-6) após análise com o BINGO.

46

A

B

0 50 100 150 200 250 300 350

Regulação de processos biológicos

Metabolismo celular


Metabolismo de proteínas

Vias de sinalização

Protein modification process

Vias de sinalização intracelular

Organização cromossômica

Organização da cromatina

Figura 8. Cluster 2 de genes up regulados por E3330. A) cada nó representa




reguladores (nós em vermelho). B) Distribuição dos principais processos biológicos

do Cluster 2 regulado positivamente por E3330 com um p valor com significância


47

No primeiro cluster os reguladores com maior número de alvos foram

ELF4, KLF4 e NRF2 todos com NES maior que 4, já o segundo cluster possui 4

fatores de transcrição importantes com maior número de alvos dentro do cluster

que são, E2F4, ELK1, JUN e E2F1.

A rede formada apenas pelos genes da neurodegeneração com

expressão alterada por E3330, também foi submetida ao iRegulon (Figura 9),

NRF1 e NRF2 continuaram sendo os principais fatores de transcrição que

regulam estes genes.

Metoxiamina

Tanto o tratamento com E3330 como o tratamento com Metoxiamina

superexpressaram genes relacionados a neurodegeneração. A lista de genes Up

regulados após o tratamento com MTX possui 1362 genes com fold change

maior que 2 e desses apenas 1066 foram reconhecidos pelo cytoscape. A rede

formada possui 21 genes relacionados a neurodegeneração 11 desses genes

Figura 9. Rede formada pelos Genes da neurodegeneração com expressão

alterada por E3330. Sendo em verde os genes Up regulados e em rosa os down

regulados, os nós retangulares representam os reguladores, NRF1 e NRF2 são os

principais fatores de transcrição.

48

apareceram distribuídos nos quatro principais clusters formados pelo MCODE,

que foram chamados de Cluster 1, 2, 3 e 4.

O cluster 1 (Score = 10,79), possui 123 genes incluindo 4 envolvidos em

neurodegeneração (DCTN1, TPP1, KIF1B e LRSAM1) (Figura 10A) a análise

funcional pelo bingo mostrou que o cluster possui proteínas envolvidas com as

funções celulares mostradas na figura 10B, a maioria relacionada ao processo

metabólico de proteínas, este grupo proteico possui sítio de ligação para apenas

um regulador, ZNF35 com 73 alvos dentro do cluster, esse regulador está

classicamente envolvido com diferenciação celular e/ou proliferação.

Figura 10. Cluster 1 dos genes Up regulados por metoxiamina A) cada nó

representa uma proteína, e as conectores ligam proteínas que interagem entre si. As

proteínas em verde são aquelas com envolvimento em doenças neurodegenerativas,

em rosa estão genes que interagem com elas e são regulados pelos mesmos


do Cluster 1 regulado positivamente por Metoxiamina com um p valor com

significância estatística (p-valor<10-6) após análise com o BINGO.

0 10 20 30 40 50 60


Modificação de macromoléculas

Modificação de proteínas

Modificações pós-traducionais

Modificação de proteína por conjugação depequenas proteínas

Ubiquitinação de proteínas

A

B

49

Já o cluster número 2 possui 104 genes, envolvidos no metabolismo de

ácidos nucléicos, de RNAm e expressão genica, cinco desses genes tem

envolvimento com neurodegeneração, CWF19L1, ENTPD1, ATXN2, DCTN1 e

TBP (Figura 11), 72 genes desse cluster possuem sítio de ligação para ELF4 e

58 possuem sítio de ligação para ETV6.

A

B

0 10 20 30 40 50 60 70 80



Metabolismo de ácidos nucleicos

Expressão gênica

Metabolismo de RNA

Processamento de RNA

Splicing

Metabolismo de RNAm








50

O cluster 3 possui 114 genes o que inclui AARS, MARS2 e EXOSC3

(Figura 12A), e reuniu proteínas que interagem entre si envolvidas no processo

de tradução e metabolismo de RNAnc (figura 12B), os reguladores FLI1,

GAPBA/NRF2, ETV1 e MYC obtiveram maior número de alvos na rede.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Metabolismo celular


Expressão Gênica



Metabolismo de RNA

Tradução

Metabolismo de RNAnc

Processamento de RNAnc

Metabolismo de RNAt

A

B








51

No cluster 4 encontram-se 68 genes incluindo AARS, DCTN1 e KIF1B

(Figura 13), e possui apenas uma função significante indicada pelo bingo, boa

parte de suas proteínas estão envolvidas em processos relacionados com

microtúbulos e possuem sítio de ligação para RFX7, ARID3A e ETV6.

Figura 13. Cluster 4 dos genes Up regulados por metoxiamina. Cada nó




reguladores (nós em vermelho).

52

A rede com todos os genes relacionados a neurodegeneração de

metoxiamina, apontou reguladores variados, indicando a presença, nesse caso,

de uma resposta secundaria (Figura 14).

Resveratrol

A rede de genes Down regulados por resveratrol após indução

inflamatória contém 2098 genes com Fold Change menor que -2,00 destes

apenas 1770 possuem interação entre si e foram reconhecidos pelo cytoscape,

como mostrado na tabela 4 essa rede possui 46 genes envolvidos com o

processo de neurodegeneração e/ou relacionados com doenças

neurodegenerativas. Com uma rede relativamente grande o MCODE formou

muitos clusters com score acima de 3,00 os considerados mais importantes e

que contem genes relacionados a neurodegeneração estão ilustrados abaixo.

O cluster 1 (Figura 15) possui 13 genes da neurodegeneração incluindo

ATM, e suas funções principais são além de expressão gênica, metabolismo de

ácidos nucléicos, metabolismo de RNA e biogênese do complexo

ribonucleoproteína, assim como aconteceu com os outros cluster essas

proteínas foram analisadas quanto aos reguladores para os quais elas possuem

sítio de ligação pelo iRegulon, que resultou em dois reguladores principais NRF2

Figura 14. Genes da neurodegeneração com expressão alterada por MTX.

Sendo em verde os genes Up regulados e em rosa os down regulados, os nós

retangulares representam os reguladores.

53

e ELK1 com 233 e 147 alvos respectivamente, mesmos reguladores que foram

importantes na via completa.

A

B

Figura 15. Cluster 1 dos genes down regulados por resveratrol. A) cada nó representa

uma proteína, e as conectores ligam proteínas que interagem entre si. As proteínas em

verde são aquelas com envolvimento em doenças neurodegenerativas, em rosa estão

genes que interagem com elas e são regulados pelos mesmos reguladores (nós em

vermelho). B) Distribuição dos principais processos biológicos do Cluster 1 regulado

negativamente por resveratrol com um p valor com significância estatística (p-valor<10-6)

após análise com o BINGO.

0 20 40 60 80 100 120 140 160



Expressão gênica

Metabolismo de RNA

Processamento de RNA

Biossíntese de macromoléculas

Metabolismo de RNAm

Processamento de RNAm

Motagem de complexo macromolecular

Biogênese do complexo ribonucleoproteína

Transcrição

54

O cluster 2 (Figura 16A) reúne proteínas relacionadas ou metabolismo de

proteínas, além de outras funções apontadas pelo BINGO (Figura 16B), contém

16 genes da lista de neurodegeneração também regulados por GABPA além de

SP1 e IRF8.

A

B

Figura 16. Cluster 2 dos genes down regulados por resveratrol A) cada nó





do Cluster 2 regulado negativamente por resveratrol com um p valor com significância


0 20 40 60 80 100 120 140 160



Regulação positiva de processos biológicos

Modificações pós-traducionais

Ciclo celular

Proteólise

Regulação do ciclo celular

Ubiquitinação de proteínas

Regulação da atividade de ligase

55

Os cluster 3 e 4 possuem uma menor quantidade de genes sendo, 11

genes relacionados a doenças neurodegenerativas no cluster 3, bastante

envolvido com transdução de sinal e comunicação celular (Figura 17B) e tendo

como reguladores mais comuns entre seus genes EHF (172 alvos) e CRX (100

alvos) (Figura 17A), e apenas 6 no cluster 4, envolvido em metabolismo de

ácidos nucléicos e organização da cromatina entre outras funções este último

assim como o cluster 1 possui como principais reguladores GABPA e ELK1

(Figura 18).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Transdução de sinal

Metabolismo de pequenas moléculas

Regulação da comunicação celular

Regulação de vias de sinalização

Transdução de sinal intracelular

Transdução de sinal mediada por GTPase

A

Figura 17. Cluster 3 dos genes down regulados por resveratrol. A) cada nó







B

56

A

Figura 18. Cluster 4 dos genes down regulados por resveratrol. A) cada nó







B

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Metabolismo celular



Metabolismo de pequenas moléculas

Organização cromossômica

Organização da cromatina

57

A rede com apenas os genes da neurodegeneração down regulados por

resveratrol, também mostrou NRF1 como regulador principal entre eles,

juntamente com GATA5, CDX2, ZBTB33 e SMAD3.

EXPRESSÃO DE ALGUNS GENES DA LISTA POR Q-PCR

Apesar de tanto o RNAseq quanto a RT-PCR fornecerem resultados sobre

a expressão gênica, a RT-PCR é necessária para validar os resultados

observados no transcriptoma pois é uma técnica mais sensível e mais

sequencia-específica (Costa et al. 2013), portanto alguns genes foram

escolhidos para quantificação relativa de sua expressão afim de confirmar a

alteração de expressão em todos os inibidores.

Além disso o modelo de inflamação com posterior tratamento dos

inibidores de APE1 também foi repetido na linhagem de

glioblastoma/astrocitoma U251MG, que são células mais próximas dos

neurônios.

Figura 19. Genes da neurodegeneração com expressão alterada por

resveratrol. Todos os genes em rosa down regulados, os nós retangulares

representam os reguladores.

58

A expressão de ATM não está reduzida somente após o tratamento

com resveratrol, mas também com E3330 e Mettoxiamina.

Um dos genes escolhidos foi ATM causadora da ataxia telangiectasia. No

Gráfico 1 podemos observar que apesar de ser importante na inflamação o

tratamento com LPS não afetou a expressão de ATM em monócitos, porém o

bloqueio do reparo de DNA durante a inflamação assim como o bloqueio da

função redox de APE1 diminuiu significativamente a expressão de ATM, que foi

down regulado também por Resveratrol. Na linhagem de glioma a expressão de

ATM foi diminuída significativamente após o tratamento com resveratrol e com

metoxiamina, em relação ao controle (Figura 20 e 21).

Figura 20. Alteração da expressão de ATM em células U937. Células

tratadas com LPS e posteriormente com E3330, resveratrol e metoxiamina

*P < 0,05

59

E3330 causa Up regulação da Histona deacetilase 1 (HDAC1)

Após a indução da inflamação com LPS não houve modificação

significativa da expressão de HDAC1 em relação ao controle, porém o

tratamento dos monócitos com E3330 aumentou a expressão de HDAC1

confirmando assim o resultado do RNAseq, no qual HDAC1 encontra-se up

regulada. Já na linhagem de glioma nenhum dos tratamentos alterou

significantemente a expressão de HDAC1.

Figura 21. Alteração da expressão de ATM em células U251MG


**P < 0,05 significante em relação ao controle

Figura 22. Alteração da expressão de HDAC1 em células U937 tratadas

com LPS e posteriormente com E3330, resveratrol e Metoxiamina. * P =

0.0065

60

A Expressão de NDUFV2 está diminuída no tratamento com E3330 e

metoxiamina

No transcriptoma a expressão de NDUFV2 foi alterada após a inibição de

porções de APE1, resultado que se repetiu na q-PCR (Figura 24). Foi possível

observar que a inibição da porção redox de APE1 assim como a inibição da

clivagem do sítio AP por metoxiamina, diminuiu a expressão de NDUFV2 quando

comparada ao controle e ao tratado com LPS. Apesar de estar com expressão

um pouco diminuída em resveratrol essa diminuição não foi significativa

contrariando o que diz o RNAseq, no qual NDUFV2 está down regulada apenas

em resveratrol.

Em células U251MG o resultado foi diferente, nem o tratamento apenas

com LPS nem os inibidores afetaram a expressão de NDUFV2 (Figura 25).

Figura 23. Alteração da expressão de HDAC1 em células U251MG

tratadas com LPS e posteriormente com E3330, resveratrol Metoxiamina

61

A expressão de NRF1 não foi alterada em nenhum dos inibidores

NRF1 além de estar down regulado, segundo o RNAseq em células

tratadas com E3330, é um dos principais reguladores das redes down reguladas

de todo os inibidores. Porém na q-PCR não foi possível observar alteração de

expressão estatisticamente significativa em nenhum dos tratamentos, nem em

monócitos nem em astrócitos (Figura 26 e 27, respectivamente).

Figura 24. Alteração da expressão de NDFV2 em células U937

tratadas com LPS e posteriormente com E3330, resveratrol e

metoxiamina *P < 0,05

Figura 25. Alteração da expressão de NDFV2 em células U251MG


62

DISCUSSÃO

Conforme descrito anteriormente, APE1 é importante durante a

inflamação, tanto para expressão de genes pró-inflamatórios quanto para

proteção do DNA contra os danos gerados durante o estresse oxidativo. Muitos

autores já investigaram a influência dos danos no DNA na morte de neurônios

durante doenças neurodegenerativas relatando assim APE1 como uma proteína

importante na fisiopatologia dessas doenças (revisado por Fischer and Maier,

Figura 26. Alteração da expressão de NRF1 em células U937 tratadas

com LPS e posteriormente com E3330, resveratrol e metoxiamina

Figura 27. Alteração da expressão de NRF1 em células U251MG


63

2015). Porém atualmente sabemos que APE1 possui uma função importante na

regulação transcricional de muitos genes e foi objetivo deste trabalho identificar

possíveis alvos de APE1.

Ao investigar melhor o papel de APE1 na transcrição durante a resposta

inflamatória em monócitos, foi observado que os genes regulados negativamente

pelos tratamentos com E3330, resveratrol e metoxiamina possuem sitio de

ligação para três fatores de transcrição principais NRF1, NRF2 e ELK1, e isso é

evidente não apenas nas redes totais como também nas redes formadas apenas

pelos genes envolvidos com doenças neurodegenerativas.

NRF1 possui 315 alvos na rede de genes down regulados por E3330 e

396 alvos na rede down regulada por metoxiamina, o que pode indicar que tanto

função redox quanto o reparo de DNA podem regular a expressão de alvos de

NRF1, a literatura relaciona NRF1 tanto com APE1 quanto com alguns de seus

parceiros como, LSD1, c-Fos, c-Jun, NF-kB e CREB.

Sabe-se que NRF1 regula expressão de genes mitocondriais em resposta

ao estresse oxidativo, e que esse gene tem sua expressão aumentada após o

estresse, assim como seus genes alvos, Li et al. (2012) em um experimento com

células Hela notaram que APE1, mais precisamente sua função redox, também

possui um papel na função mitocondrial após estresse oxidativo e apesar da

expressão de NRF1 não ser afetada pela diminuição de APE1 ou presença de

APE1 mutada em sua função redox, a expressão dos alvos de NRF1 foi

fortemente afetada. No mesmo estudo a autor provou que NRF1 é

imunoprecipitada com APE1, que essa interação aumenta com estresse

oxidativo e que é dependente de sua função redox, assim como a ligação de

NRF1 ao promotor de seus genes alvos (Li et al. 2012). Além da interação direta

com APE1, NRF1 possui alguns parceiros que se ligam também a seus genes

alvos entre eles c-Jun e c-Fos (Venugopal et al. 1996; Novotny et al. 1998) que

são fatores de transcrição reduzidos por APE1 (Xanthoudakis et al. 1992; Ando

et al. 2015), apesar do transcriptoma indicar down regulação de NRF1 nos

tratamento com resveratrol e E3330, essa alteração na expressão do gene não

foi confirmada nem em nos monócitos nem na linhagem de glioma.

LSD1, é uma lisina desmetilase que foi detectada por chip-seq em 99%

dos sítios de NRF1 em células MCF7, e em mais quatro células: HMEC, LNCaP,

U2OS, SH-SY5Y. (Benner et al. 2013), sabe-se também que LSD1 gera ROS

64

durante a desmetilação e que causa danos ao DNA, por isso a proteína recruta

APE1 e OGG1 e a transcrição dos genes que são alvos de LSD1 pode ser

dependente do recrutamento das enzimas de reparo de DNA (Amente et al.

2010).

Tendo isso em mente a down regulação de alvos de NRF1 após

tratamento com E3330 pode ser atribuída a um dos dois fatores: (1) E3330 pode

estar bloqueando a interação direta de APE1 com NRF1 e diminuindo assim sua

ligação ao DNA para exercer sua função de fator de transcrição (2) E3330

também pode estar diminuindo a ligação de c-Fos e c-Jun ao DNA, já que ambas

são proteínas reduzidas por APE1 e como estas proteínas são parceiras de

NRF1 em alguns genes a falta delas pode estar afetando a transcrição desses

genes. Já metoxiamina pode estar afetando a expressão de alvos de NRF1

devido sua pareceria com LSD1, que requer a função de reparo de DNA para

ativar a transcrição de alguns genes.

GABPA, também conhecido como NRF2, é um dos mais importantes

fatores de transcrição redox-sensíveis. Durante o estresse oxidativo, NRF2 se

desloca para o núcleo e liga-se a elementos de resposta antioxidante (ARE, do

inglês antoxidant response elements) presentes nos promotores de genes

(Nguyen et al. 2003), além de regular 629 genes da lista geral de metoxiamina,

NRF2 também aparece como regulador de vários clusters e genes relacionados

a neurodegeneração após o tratamento com E3330 (apesar de não aparecer na

rede total) e resveratrol. No transcriptoma de E3330, NRF2 está Up regulado

com Fold change de 2,13 o que pode indicar que o fato deste fator transcricional

aparecer como regulador de tantos genes down regulados por E3330 estar mais

relacionado com alterações pós-traducionais ou interações com APE1.

Outro regulador importante foi ELK1 que além de aparecer também como

um dos principais reguladores das redes down reguladas de E3330 e

Resveratrol, também apareceu como regulador de alguns clusters

principalmente na rede de resveratrol. Não há trabalhos que liguem ELK1

diretamente a APE1, sua expressão não está alterada após o tratamento com

E3330, porém alguns trabalhos descrevem que ELK1 possui um papel durante

a inflamação e que é fosforilada pela via downstream a estimulação da célula

com IL-1, a ativação de ELK1 depende da ativação de ERK1/2, JNK e p38 sendo

a ativação de ERK1/2 controlada por NF-kB. (Kasza, 2013).

65

A inibição de APE1 durante a inflamação em monócitos também altera

expressão de vários genes envolvidos em processos neurodegenerativos, o

bloqueio da função redox de APE1 regulou negativamente muitos genes

mitocondriais associados com a neurodegeneração, a maioria pertencentes ao

complexo I mitocondrial (NDUFA11, NDUFB4, NDUFA12, NDUFB7, NDUFB9).

Em seu estudo Betarbet et al. (2000), percebeu que a inibição sistêmica parcial

do complexo I por rotenona reproduz as características comportamentais e

neuropatológicas da doença de Parkinson, em ratos sprague-dawley e ratos

Lewis. O complexo I também conhecido com NADH desidrogenase possui 47

subunidades e faz parte da cadeia respiratória tendo como função catalisar a

transferência de elétrons do NADH para a coenzima Q, este complexo

juntamente com o complexo III são bastante estudas com relação a produção de

ROS (revisado por Gào et al. 2017) e a disfunção desses complexos levam ao

estresse oxidativo na célula. O tratamento com Resveratrol durante a inflamação

também diminuiu a expressão desses genes (NDUFAB1, NDUFV2, NDUFA8,

NDUFS7, NDUFB2, NDUFC1, NDUFB11, NDUFB7).

Uma das subunidades formadoras do complexo I a NDUFV2 (do inglês,

NADH dehydrogenase ubiquinone flavoprotein 2) é alvo de alguns estudos que

indicam seu polimorfismo em associação com DP (Hattori et al. 1998; Nishioka

et al. 2010), assim como com desordem bipolar (Washizuka et al. 2003) e com

esquizofrenia (Washizuka et al. 2006). Por meio de q-PCR observamos uma

down-regulação de NDUFV2 em relação a LPS tanto em E3330 como em

Metoxiamina, mas a diminuição da expressão no tratamento com resveratrol não

foi estatisticamente significante, e a down-regulação após a inibição de APE1

não se manteve na linhagem astrocitária. Na literatura APE1 e NDUFV2 não

possuem nenhuma relação e a proteína mitocondrial não possui sítio de ligação

para NRF2 como as outras proteínas citadas, porém possui sítio de ligação para

Fos que, como citado, é um dos fatores reduzidos por APE1. Recentemente foi

observado que NDUFV2 é importante na migração radial de neurônios corticais,

além de regular a transição multipolar-bipolar dos neurônios e afetar o

citoesqueleto e a estabilização da tubulina (Chen et al. 2015) o que pode explicar

sua associação com várias doenças do SN.

Durante a inflamação o tratamento com resveratrol foi o que mais regulou

negativamente genes envolvidos com neurodegeneração, Yang et al. (2005)

66

sugeriram que resveratrol é capaz de se ligar a APE1 e que pode ser um

potencial inibidor da proteína, porém esta atividade não foi comprovada in vivo.

Nosso grupo já observou que a atividade de reparo de APE1 não é afetada por

resveratrol diretamente (dados não publicados). Apesar de não estar

comprovada como molécula inibidora de APE1, resveratrol possui outros alvos

já conhecidos dentro da célula, entre eles a sirtuina 1 (SIRT1), que uma proteína

deacetilase NAD-dependente, reguladora chave da respiração mitocondrial,

metabolismo de lipídeos e processo de envelhecimento (revisado por Kulkarni et

al. 2015). Resveratrol tem sido visto como um ativador de SIRT1 promovendo

consequentemente a deacetilação de diversos reguladores transcricionais como

PGC-1alfa (Lagouge et al. 2006). Nosso grupo também observou que resveratrol

diminui a acetilação de APE1 (dados não publicados) provavelmente devido a

ativação de SIRT1. Outro alvo de resveratrol é a cicloxigenase 1, enzima que

catalisa a transformação de ácido araquidônico em mediadores pro-inflamatórios

como as prostaglandinas e é inibida por resveratrol (Jang et al. 1997), assim

como NF-kB (Tsai et al. 1999).

Após 4 horas de tratamento com resveratrol em modelo inflamatório, 46

genes envolvidos com neurodegeneração estavam regulados negativamente.

Os principais cluster de interação que contem esses genes estavam

relacionados com metabolismo de RNA, Biogênese do complexo

ribonucleoproteico, reparo de DNA, resposta ao dano no DNA, comunicação

celular e organização da cromatina. Nestes cluster observamos a presença de

proteínas como NCTSN, que é uma glicoproteína transmembrana capaz de

clivar a proteína precursora da beta-amiloide, NAE1, proteína que liga-se ao

precursor da beta-amiloide, PARK7, e ATM, que encontrou-se regulada

negativamente não somente após o tratamento com resveratrol, mas também

após o tratamento com E3330 e metoxiamina em células U937, a diferença de

expressão também foi vista em U251MG. Porém nesta célula foi significativo

apenas após o tratamento com resveratrol e metoxiamina. Esses dados indicam

fortemente uma influência, direta ou indireta, de APE1 na regulação da

expressão de ATM, essa proteína é causadora da ataxia telangiectasia que é

uma doença autossômica recessiva que tem como características a ataxia,

telangiectasia, envelhecimento precoce, neurodegeneração, resistência a

insulina, entre outras (Kastan et al. 2001), ATM atua como uma quinase cujo a

67

principal função é como parte das vias de resposta ao dano no DNA (DDR, do

inglês DNA damage response) ATM-Chk2 e ATM-ATR-Chk1 são as duas

maiores vias DDR e coordenam o processo de reparo de DNA e a progressão

do ciclo celular (Yan et al. 2015) deficiências nas vias de reparo e nas vias DDR

podem levar a doenças como câncer e doenças neurodegenerativas. (Hegde et

al. 2012) além disso essa proteína possui um possível papel na neurogênese

(Guleria et al. 2016; Carlessi et al. 2009).

No que diz respeito a inflamação, Fang et al (2014) observou que após a

estimulação de células com TNF, ATM é transportada do núcleo para o

citoplasma através de uma via dependente de ROS e que além disso ATM

também possui um papel na regulação da via de NF-kB, seja por regular a taxa

de degradação da IkBα ou por afetar a fosforilação da Ser 276 ativando assim

RelA. O iRegulon indicou que ATM assim como a maioria das proteínas down

reguladas que interagem com ela possuem sítio de ligação para NRF2, que por

sua vez interage diretamente com APE1 e sua atividade depende de sua

interação direta com a porção redox de APE1, interação essa que aumenta sua

atividade de ligação as regiões ARE após indução do estresse oxidativo por

H2O2 (Shan et al. 2015). Além disso a inibição de NRF2 causa repressão

transcricional de ATM e ATR (Khalil et al. 2015), esses dados podem indicar que

no tratamento com E3330 em que há bloqueio da função redox de APE1 durante

a inflamação pode estar diminuindo a atividade de ligação de NRF2 e

consequentemente a transcrição de ATM, ainda é necessário estudar o efeito da

inibição do reparo por metoxiamina na interação entre as duas proteínas.

Os genes up regulados parecem ter pouca relação entre si, e pouca

relação, descrita na literatura, com APE1 e seus parceiros. Porém HDAC1

chamou atenção por interagir com APE1 em alguns complexos de repressão

(Kelly et al. 2013). HDAC1 é uma histona deacetilase bastante envolvida na

regulação da expressão genica, devido a sua habilidade de desacetilar resíduos

de lisinas das histonas resultando em compactação da cromatina (Haberland et

al. 2009) juntamente com HDAC2, a HDAC1 faz parte de alguns complexos

repressores, entre eles, o Sin3A, NuRD e CoREST. No sistema nervoso, HDAC1

e 2 possuem um papel importante no desenvolvimento das células, como

oligodendrócitos e células de Schuwan, (revisado por Kelly et al. 2013). Um

experimento realizado com camundongos R6/2, que expressam o fenótipo da

68

doença de Huntington observou aumento da expressão da proteína em questão

no núcleo estriado, que é bastante afetado pela doença além de observarem que

em cultura um aumento da expressão de HDAC1 reduz a viabilidade de

neurônios corticais em 40% (Bardai et al. 2012). Além de desacetilarem histonas,

catalisam também a desacetilação de muitas proteínas não histonas como, P53,

E2F1, GAT4 e NF-kB (Kelly et al. 2013).

Em um estudo recente Chen et al., (2015) analisou o efeito da exposição

a fumaça de cigarro no pulmão de camundongos, sabendo que esta causava

resposta inflamatória, assim como do extrato desta fumaça em cultura de

macrófagos A exposição a fumaça de cigarro causou danos pulmonares e

aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias, indicando que gerou

inflamação. A exposição diminuiu a atividade de HDACs devido a diminuição do

nível proteico, apesar de não haver diminuição nos níveis de RNAm, tanto nos

pulmões como em cultura de macrófagos, com a diminuição da atividade das

HDACs observou-se aumento de Histona 3 acetilada na lisina 9, inclusive nos

promotores de TNF, IL-8, MCP-1 e MMP9. Para confirmar o papel de HDAC1 na

repressão dos genes pro-inflamatórios, o knockout de HDAC1 aumentou os

níveis de MCP-1, TNF, IL-8 e MMP9 (Chen et al., 2015).

Na análise da rede de genes up regulados por E3330 HDAC1 encontra-

se no cluster 2 com outras 573 proteínas e interage com 98 delas, as funções

predominantes no cluster são de modificação pós-traducional de proteínas, via

de sinalização intracelular, organização da cromatina e organização

cromossômica entre outros, as proteínas desse cluster possuem sítios de ligação

para 4 reguladores com NES maior que 4, são eles, EGR1, YY1, RBBP9 e

FOXP2, porém HDAC1 possui motif apenas para YY1, fator de transcrição

envolvido em várias vias biológicas importantes capaz de ativar ou reprimir

genes dependendo do contexto (revisado por Gordon et al.2005). Esse fator está

Up regulado apenas na rede de E3330 assim como HDAC1. Dong et al. (2017)

mostraram que YY1 se liga ao promotor de HDAC1 em células de

hepatocarcinoma e promove sua transcrição, assim como no mesmo trabalho foi

demostrado que a superexpressão de HDAC1 também aumenta a expressão de

YY1 sugerindo assim uma regulação reciproca. Apesar disso já foi visto que

E3330 bloqueia a ativação de YY1 induzida por oxLDL (Li et al. 2014)

69

CONCLUSÕES

Neste trabalho foi observado que a inibição das atividades de APE1,

assim como o tratamento de monócitos com resveratrol modificam a expressão

de vários genes relacionados a doenças neurodegenerativas. E3330 e

resveratrol regularam negativamente genes mitocondriais indicando assim que

função redox de APE1 pode ser importante na manutenção da estabilidade da

mitocondrial durante a inflamação. Já a resposta observada após o tratamento

com Metoxiamina pareceu ser secundária, regulando positivamente genes de

diversas funções e vias biológicas.

Foi observado também que NRF1, NRF2 e ELK1 foram os fatores de

transcrição com maior número de alvos down regulados, em ambos os

inibidores, indicando uma interação desses fatores com APE1. A presença de

NRF1 como regulador tanto em E3330 como em metoxiamina, pode indicar que

a regulação desse fator de transcrição não está associada apenas a função

redox de APE1, mas também a sua função de reparo.

Foi confirmado que os inibidores de APE1 alteram a expressão de ATM e

NDUFV2 em monócitos. Porém essa resposta não se repete nas células de

astrocitoma, indicando uma resposta célula-específica.

Por fim, a influência de APE1 em doenças como DP, DH e DA, não parece

ser apenas devido a sua função no reparo de DNA, como já foi descrito antes,

mas também na regulação transcricional que a proteína exerce sobre alguns

genes e essa regulação transcricional não está ligada apenas à sua função redox

como também ao reparo de DNA.

70

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