tcc versao final - debora 1

UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E DA TECNOLOGIA

CURSO DE BACHARELADO EM QUMICA

TRABALHO DE CONCLUSO DE CURSO

DBORA MUNIZ DE SOUZA

ESTUDO FITOQUMICO DE

SALACIA IMPRESSIFOLIA (MIERS.) A. C. SMITH - CELASTRACEAE: ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

CAXIAS DO SUL

2014


ESTUDO FITOQUMICO DE SALACIA IMPRESSIFOLIA (MIERS.) A. C. SMITH - CELASTRACEAE:

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE.

Trabalho de Concluso de Curso apresentado

como parte dos requisitos para obteno da aprovao na disciplina de Trabalho de Concluso de Curso Bacharel em Qumica, sob a orientao acadmica do Prof. Dr.

Sidnei Moura e Silva e coordenao da Prof. Dr. Anna Celia Arruda.

CAXIAS DO SUL 2014


ESTUDO FITOQUMICO DE

SALACIA IMPRESSIFOLIA (MIERS.) A. C. SMITH - CELASTRACEAE: ATIVIDADE ANTIOXIDANTE.

Trabalho de Concluso de Curso apresentado como parte dos requisitos para obteno da aprovao na disciplina de Trabalho de Concluso de Curso Bacharelado em Qumica da Universidade de Caxias do Sul. Aprovada em __/__/__

Banca examinadora ________________________________________

Prof. Dr. Sidnei Moura e Silva Universidade de Caxias do Sul - UCS ________________________________________

Prof. Dr. Adriana del Carmen Escalona Gower Universidade de Caxias do Sul - UCS ________________________________________ Prof. MSc. Marilda Chiarello Universidade de Caxias do Sul - UCS

AGRADECIMENTOS

A Deus.

A todos aqueles que contriburam para que este trabalho fosse realizado.

A minha famlia, meu maior exemplo, minha inspirao constante, meu amor

maior. A meus queridos pais Ivaldo Ramos de Souza (in memorian) e Judite Muniz

de Souza pela vida, amor, carinho, oraes, pacincia e compreenso nas horas

difceis. Obrigada pelos ensinamentos e por acreditarem em mim, e terem me

incentivado na busca dos meus objetivos. Aos meu irmos, Jhonatts e Priscila, pelo

apoio, compreenso, incentivo e momentos de alegria proporcionados.

Ao Jean, pelo companheirismo, amor e apoio, em todos os momentos.

A minha famlia do corao, meus amigos. Vocs so meu suporte, meu

espelho, minha fortaleza nesses dias de batalha.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Sidnei Moura e Silva, pelos valiosos

ensinamentos, dedicao e pacincia.

Aos colegas LBIOP. Aos que me ajudaram durante todos esses meses,

independentemente de contato dirio ou no: Marilda Chiarello, Lauren Grnspan,

Denis Amilton, Paola Luchtenberg, Fabiana Agostini, Silviane Maggi. Palavras nunca

sero suficientes para expressar a importncia de vocs.

Em especial Manuela Merlin que iniciou os trabalhos com o cip mirarura e

me oportunizou a sua continuao em conjunto, ampliando as investigaes. A Dr.

Luciane Minetto pela pacincia, excelente trabalho, pelo comprometimento e

admirvel esforo, sem o qual esse trabalho no seria possvel.

UCS, ao Departamento de Qumica dos produtos naturais. A todos os

professores, Ana Clia, aos funcionrios da Central de Anlises e a todos que

fizeram parte dessa jornada.

Apega-te instruo e no a largues; guarda-a, porque ela a tua vida.

Provrbios 4:13

RESUMO

Dentre as fontes de produtos naturais ativos, destacam-se as plantas. A Salacia impressifolia, da famlia Celastracea, apresenta importantes atividades, sendo temas de pesquisas recentes. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi efetuar a investigao fitoqumica do caule desta espcie e avaliar a potencial atividade antioxidante do extrato bruto. Para obteno do extrato da planta, utilizou-se o caule seco em p, atravs de extrao com etanol e gua sob refluxo. O extrato foi concentrado e submetido avaliao de compostos fenlicos totais e da atividade antioxidante in vitro, utilizando os ensaios de poder redutor e captura do radical DPPH, apresentando 387, 165 g EAG/ kg de extrato bruto, e IC50% de 233 g/mL. A separao cromatogrfica do extrato bruto possibilitou a identificao de vrios compostos, entre eles os compostos fenlicos mangiferina e epicatequina, de maior interesse. Dessa forma, um trabalho de prospeco foi realizado, onde os resultados apontam para uma possvel atividade antioxidante para extratos de S. impressifolia.

Palavras-chave: Salacia impressifolia. Atividade antioxidante. Composio qumica.

ABSTRACT

Plants are highlighted in the middle of the sources of active molecules. The Salacia impressifolia, from Celastraceae family, presents important activities, being topics of current research. Thus, the aims of this study were a phytochemical investigation and evaluate the antioxidant potential of this specie crude extract. For the plant extract, was used dry stem powder in ethanol and water under reflux. The extract was concentrated and analyzed the total phenolic compounds and antioxidant activity in vitro. The results of reducing power and DPPH radical capture assays, presenting 387, 165 g GAE/kg and IC50% 233 mg/ml for the crude extract respectively. Liquid Chromatographic separation with High Resolution Mass Spectrometry (LC-MS) resulted in several compounds identification, being the most important the mangiferin and epicatechin. Thus, a prospecting work was carried out, where the results point to a possible antioxidant activity in of S. impressifolia extracts. Keywords: Salacia impressifolia. Antioxidant activity. Chemical composition

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estrutura qumica da penicilina e do AAS ................................................ 16

Figura 2 Estrutura qumica bsica de um fenol e do aldedo cinmico .................. 18

Figura 3 Esquema de formao do radical livre ..................................................... 20

Figura 4 Salacia impressifolia ................................................................................. 29

Figura 5 Perfil do EBH em ESI(+) e ESI(-) .............................................................. 32

Figura 6 Estrutura qumica dos compostos encontrados no EBH de S. impressifolia

................................................................................................................................... 34

Figura 7 Reao de reduo do radical DPPH ....................................................... 38

Figura 8 - % de varredura do padro (vitamina C) .................................................... 39

Figura 9 - % de varredura do EBH 1:1 de salacia impressifolia ................................ 40

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Compostos identificados no EBH de Salacia impressifolia ..................... 33

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Classificao dos compostos fenlicos de acordo com o esqueleto bsico ................................................................................................................................... 19 Quadro 2 Compostos encontrados em espcies do gnero Salacia ..................... 25

SUMRIO

1 INTRODUO ....................................................................................................... 12

1.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 14

1.1.1 Objetivos especficos........................................................................................ 14

2 REVISO BIBLIOGRFICA .................................................................................. 15

2.1 PRODUTOS NATURAIS ..................................................................................... 15

2.2 METABLITOS PRIMRIOS E SECUNDRIOS ............................................... 17

2.3 COMPOSTOS FENLICOS ............................................................................... 17

2.3.1 Radicais livres .................................................................................................. 20

2.3.2 Compostos fenlicos como antioxidantes ........................................................ 21

2.4 FAMLIA CELASTRACEAE GNERO SALACIA ............................................. 23

2.4.1 Salacia impressifolia ......................................................................................... 29

3 MATERIAIS E MTODOS ..................................................................................... 30

3.1 PREPARO DA AMOSTRA .................................................................................. 30

3.2 ANLISE CROMATOGRFICA .......................................................................... 30

3.3 ANLISE QUMICA DOS COMPOSTOS FENLICOS (MTODO DE FOLIN-

CIOCALTEAU) .......................................................................................................... 31

3.4 ENSAIO REDUO DE RADICAIS LIVRES ATRAVS DE ENSAIO QUMICO IN

VITRO POR METODOLOGIA DE REDUO DO COMPOSTO DPPH ................... 31

4 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................. 32

4.1 IDENTIFICAO DOS COMPOSTOS POR MEIO DE CROMATOGRAFIA

LQUIDA ACOPLADA COM ESPECTRO DE MASSAS ............................................ 32

4.2 DETERMINAO DE FENLICOS TOTAIS ...................................................... 36

4.3 ENSAIO DE REDUO DE RADICAIS LIVRES ATRAVS DE ENSAIO QUMICO

IN VITRO POR METODOLOGIA DE REDUO DO COMPOSTO DPPH .............. 37

5 CONCLUSO ........................................................................................................ 41

REFERNCIAS ......................................................................................................... 42

12

1 INTRODUO

A histria entre a utilizao de plantas para a sade e o bem estar humano se

conectam ao longo do tempo. As plantas medicinais tm sido utilizadas

tradicionalmente para o tratamento de vrias enfermidades. Suas aplicaes so

vastas e abrangem desde o combate ao cncer at aos microrganismos (SILVA;

CARVALHO, 2007).

A Organizao Mundial de Sade (OMS) reconhece que boa parte da

populao dos pases em desenvolvimento dependente da medicina tradicional,

tendo em vista que 80% desta populao se utilizam de prticas tradicionais nos seus

cuidados bsicos de sade (BRASIL, 2006). Aliado a isso, a populao tambm faz

uso de produtos naturais que apresentam uma ampla variedade e complexidade.

Assim o uso destes produtos estimula a investigao de princpios ativos com

potencial ao teraputica ou como fonte de inspirao para o desenvolvimento de

frmacos.

At meados do sculo XX, as plantas medicinais e seus derivados constituam

a base da teraputica medicamentosa. No entanto, com o avano e desenvolvimento

da sntese qumica no final do sculo XXI, iniciou-se uma nova fase de

desenvolvimento de medicamento. Atualmente, cerca de 50% dos medicamentos

utilizados so de origem sinttica e 25% so de origem vegetal, isolados ou

produzidos a partir de um processo de semi-sntese (CALIXTO, 2000).

Muitas espcies ainda so usadas empiricamente, sem respaldo cientifico

quanto eficcia e segurana. Em todo o mundo, apenas 17% das plantas foram

estudadas de alguma maneira quanto ao seu emprego medicinal e, na maioria dos

casos, sem grande aprofundamento nos aspectos fitoqumicos e farmacolgicos

(HAMBURGUER et al., 1991). Esses dados demonstram o enorme potencial das

plantas para a descoberta de novos fitoterpicos e fitomedicamentos (LOZOYA,

2001).

Apesar de o Brasil ser o pas com a maior diversidade gentica vegetal do

mundo, com mais de 55.000 espcies catalogadas de um total estimado entre 350.000

e 550.000, apenas 8% das espcies vegetais foram estudadas em busca de

compostos bioativos, e apenas 1.100 espcies vegetais foram avaliadas em suas

propriedades medicinais e txicas (SIMES et al., 2003).

13

Muitas reas esto envolvidas na pesquisa de novas substncias oriundas de

plantas, como a fitoqumica, que trabalha no isolamento, purificao e caracterizao

de princpios ativos; a etnobotnica e a etnofarmacologia, que buscam informaes a

partir do conhecimento de diferentes povos e etnias; e a farmacologia, que estuda os

efeitos farmacolgicos de extratos e dos constituintes qumicos isolados

(VENDRUSCOLO et al., 2005). Nos ltimos anos, no Brasil, vrias pesquisas foram

realizadas com contribuies relevantes sobre o assunto, no s quanto a aspectos

fitoqumicos, mas tambm quanto atividade biolgica de plantas que ocorrem de

diferentes ecossistemas (DESMARCHELIER et al., 1999; DUARTE et al., 2010;

HIRUMA-LIMA et al., 2006 JORGE et al., 2004; LIMA et al., 2006). H, nesse sentido,

vrios caminhos para o estudo de plantas medicinais, destacando-se a abordagem

etnodirigida.

A abordagem etnodirigida consiste na seleo de espcies de acordo com a

indicao de grupos populacionais especficos em determinados contextos de uso,

enfatizando a busca pelo conhecimento construdo localmente a respeito de seus

recursos naturais e a aplicao que fazem deles em seus sistemas de sade e

doena. Este um dos caminhos utilizados atualmente, por duas razes bsicas: o

tempo e o baixo custo envolvidos na coleta dessas informaes (MACIEL et al., 2002).

Duas disciplinas cientficas tm se destacado nesta tarefa: a etnobotnica e a

etnofarmacologia.

Por definio, a etnobotnica se ocupa da inter-relao direta entre pessoas

e plantas incluindo todas as formas de percepo e apropriao dos recursos

vegetais; e a etnofarmacologia se ocupa do estudo dos preparados tradicionais

utilizados em sistemas de sade e doena que incluem isoladamente ou em conjunto

plantas, animais, fungos ou minerais, (ALBUQUERQUE, 2005). Ampliando a anlise

desta definio, uma das vises para a etnofarmacologia defende que seu objetivo

avaliar a eficcia das tcnicas tradicionais fazendo uso de um grande nmero de

modelos farmacolgicos (WALLER, 1993). H vrias definies para

etnofarmacologia, mas, a ttulo de ilustrao, DI-STASI (2005) a entende como a

identificao e o registro dos diferentes usos medicinais de plantas por diferentes

grupos.

Para um uso seguro de extratos e/ou infuso de plantas existe a necessidade

de investigao das propriedades toxicolgicas.

14

Dentre as plantas estudadas no territrio brasileiro com propriedades

farmacolgicas conhecidas popularmente, est a Salacia impressifolia, tambm

conhecida na regio de Santarm Par (PA) como cip-mirarura, pertence

famlia Celastraceae que compreende cerca de 90 gneros. Entre estas, esto

aproximadamente 1.300 espcies vegetais, distribudas nas regies tropicais e

subtropicais dos dois hemisfrios, sendo pouco representadas nas zonas de clima

temperado. No Brasil, estas se concentram nas regies Norte, Nordeste e Sudeste.

Muitas das plantas desta famlia so usadas como medicinais, no tratamento de

diabetes e inflamaes, (JOLY, 1993).

Devido aos escassos estudos fitoqumicos e biolgicos desenvolvidos com a

S. impressifolia, a proposta deste estudo fornecer dados cientficos sobre essa

planta e verificar alguns dos usos a ela atribudos, principalmente quanto a atividade

antioxidante, contribuindo assim para o possvel desenvolvimentos de fitoterpicos a

partir da planta.

1.1 OBJETIVO GERAL

Realizar estudos fitoqumicos de Salacia impressifolia e investigar a atividade

antioxidante dos compostos fenlicos contidos no extrato bruto hidroalcolico (EBH).

1.1.1 Objetivos especficos

Identificar os principais compostos qumicos presentes no EBH, atravs de

cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas;

Determinar a quantidade de compostos fenlicos totais atravs de mtodo

espectrofotomtrico (Folin-Ciocalteu);

Avaliar a capacidade de reduo de radicais livres atravs de ensaio qumico

in vitro por metodologia de reduo do composto 1,1-difenil-2-picrilidrazil (DPPH).

15

2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 PRODUTOS NATURAIS

Os produtos naturais so utilizados desde os primrdios da humanidade. A

busca por alvio e cura de doenas atravs da ingesto de ervas por infuso, talvez

tenha sido uma das primeiras formas de utilizao dos produtos naturais (VIEGAS et

al., 2006).

O mais provvel que, pela experimentao direta, as populaes humanas

tenham aprendido a distinguir as plantas teis e de efeito benfico, daquelas sem

quaisquer efeitos teraputicos ou txicos, bem como qual o processamento e

combinaes poderiam ser usados para obteno de resultados positivo (YUNES et

al., 2001).

Esta prtica de medicina natural existiu de variadas formas nas culturas e

civilizaes, como no Egito, no Ocidente, na China e no Japo. Muitas vezes a

utilizao de extratos vegetais para o tratamento de doenas era feita de uma forma

acertada mesmo no conhecendo a verdadeira composio de determinada espcie.

Um bom exemplo a quinina, extrada de plantas do gnero Cinchona, que foi usada

para tratar os sintomas da malria muito antes da doena ser identificada, (GILANI et

al., 2005).

importante mencionar, que alm das plantas serem empregadas na

medicina popular como fontes teraputicas, elas tambm tem contribudo para a

descoberta de novos frmacos que so amplamente utilizados (CECHINEL FILHO;

YUNES, 1998).

Dentre os medicamentos utilizados no tratamento teraputico, uma ampla

gama de princpios ativos como aspirina, atropina, morfina, efedrina, quinidina,

reserpina, taxol, vincristina e vimblastina que foram descobertas atravs do estudo de

plantas usadas tradicionalmente, como tambm pelo conhecimento popular dos povos

indgenas, chineses e egpcios (GILANI et al., 2005; RATES, 2001;).

Um dos mais importantes exemplos da contribuio do acaso para a

descoberta de novos frmacos a penicilina, (Figura 1), identificado em meados de

1928 por Sir Alexander Fleming, que em seu laboratrio algumas placas de cultura

esquecidas sobre a bancada com reduzido crescimento de Staphylococcus que

haviam sido semeados no incio do vero. Posteriormente, Fleming constatou que

houve inibio do crescimento das cepas de Staphylococcus e verificou a presena

16

de metablitos do fungo Penicillumnotatum com propriedade antibacteriana,

conduzindo assim a identificao da penicilina. Este processo de descoberta ao acaso

foi substitudo por estratgias racionais baseadas em modificaes moleculares ou no

alvo teraputico (BARREIRO; FRAGA, 2001; MALERBA et al., 2001).

Outra descoberta importante desse perodo foi a do cido acetilsaliclico (AAS)

isolado a partir da casca do salgueiro (Salix alba) (Figura 1). Na busca pelo

planejamento racional na descoberta de novos frmacos, os primeiros estudos sobre

a relao entre estrutura qumica e sua atividade ganharam destaque durante a

Segunda Guerra, uma vez que a pesquisa militar foi responsvel por grandes avanos

na qumica sinttica, motivada pela necessidade de tratamento de infeces, da dor,

de processos alrgicos e da depresso (DEWICK, 2002; YUNES et al., 2001).

A associao de pesquisas no ramo da qumica sinttica e dos produtos

naturais contribuiu muito com a evoluo na rea farmacolgica dentre outras. As

descobertas na rea de produtos naturais colaboram com o conhecimento na rea da

qumica sinttica, j que ao se isolar uma nova substncia e atravs de testes

farmacolgicos for evidenciado atividade biolgica de tal substncia.Esta nova

estrutura pode ser sintetizada (desde que seja vivel economicamente e possvel de

ser feita) em quantidades maiores, j que nos produtos naturais a maioria das

substncias isoladas apresenta baixo rendimento (MORAIS; BRAZ-FILHO, 2007).

Figura 1 - Estrutura qumica da penicilina e do AAS

Fonte: Dewick (2002)

Notas: 1 penicilina

2 - AAS

17

2.2 METABLITOS PRIMRIOS E SECUNDRIOS

D-se o nome de metabolismo ao conjunto de reaes qumicas que ocorrem

de forma contnua nas clulas. A presena de algumas enzimas especficas garante

certa direo dessas reaes. Essas reaes visam, primariamente, o aproveitamento

de nutrientes para atender as necessidades fundamentais da clula: energia, que a

Adenosina Trifosfato (ATP), poder redutor e biossntese (SIMES et al, 2003).

Vegetais e microrganismos, e, em menor evidncia animais, apresentam um

arsenal metablico (enzimas, coenzimas e organelas), capaz de produzir, transformar

e acumular inmeras outras substncias, que nem sempre so fundamentais a

manuteno da vida do organismo produtor (WINK, 1990).

As plantas dependem de transformaes qumicas executadas pelo seu

metabolismo, para garantir assim sua sobrevivncia. Estes organismos possuem duas

formas de metabolismo: o primrio, responsvel pela produo de substncias como

aminocidos, lipdios, carboidratos entre outros; e o secundrio, responsvel pela

produo de substncias que muitas vezes so caractersticas de grupos

taxonmicos, tais como famlia e gnero. O metabolismo secundrio o que mais

interessa ao qumico de produtos naturais, pois em alguns casos so utilizados como

padro na sntese de frmacos, aromatizantes, herbicidas e inseticidas (CROTEAU et

al., 2000; HARVEY, 1999; VIEGAS et al., 2006).

As principais caractersticas dos metablitos secundrios so baixo peso

molecular, estrutura complexa, atividades biolgicas marcantes, e so normalmente

encontrados em concentrao relativamente baixa em determinados grupos de

plantas (SIMES et al., 2003).

2.3 COMPOSTOS FENLICOS

Dentre os metabolitos secundrios esto os compostos fenlicos. Estes

pertencem a uma classe de substancias que inclui uma grande diversidade de

estruturas simples e complexas as quais possuem ao menos um anel aromtico no

qual, pelo menos um hidrognio substitudo por um grupamento hidroxila (Figura 2).

As plantas e os microrganismos tm a capacidade de sintetizar o anel benznico, e a

partir dele, principalmente os compostos fenlicos (DEWIKC, 2002). Os compostos

fenlicos contribuem para o sabor, odor e colorao de diversos vegetais. Muitos

18

desses compostos constituem leos volteis e alguns so aromatizantes, como o

aldedo cinmico, princpio ativo da canela (Cinnamomoum zeyllanicum Nees)

(DEWICK, 2002).

Figura 2 - Estrutura bsica de um fenol e do aldedo cinmico

Fonte: Dewick (2002)

Notas: 1- estrutura bsica de um fenol

2- Aldedo cinmico

Dentre os compostos fenlicos esto molculas sinalizadoras, pigmentos e

sabores que podem atrair ou repelir, bem como os compostos que possam proteger a

planta contra insetos, fungos, bactrias e vrus. A maior parte dos compostos fenlicos

est presente como steres ou glicosdeos ao invs de compostos livres. Dentre

estes, so encontradas estruturas to variadas quanto a dos cidos fenlicos, dos

derivados de cumarina, dos pigmentos hidrossolveis das flores, dos frutos e das

folhas. Essa classe de compostos engloba tambm as ligninas e os taninos, que so

polmeros com funes importantes nos vegetais. Taninos so usados

comercialmente como corantes e adstringentes, e a lignina responsvel pela rigidez

estrutural das clulas e tecidos e , essencial para o desenvolvimento vascular

(DEWIKC, 2002; SIMES et al., 2003).

Os compostos fenlicos podem ser classificados segundo o tipo de esqueleto

principal, conforme descrito no Quadro 1.

19

Quadro 1 - Classificao dos compostos fenlicos de acordo com o esqueleto bsico

Esqueleto bsico Classe de compostos fenlicos

C6 Fenis simples, benzoquinonas

C6-C1 cidos fenlicos

C6-C2 Acetofenonas e cidos fenilacticos

C6-C3 Fenilpropanides, cidos cinmicos e

compostos anlogos, fenilpropenos,

cumarina, isocumarinas e cromonas

C6-C4 Naftoquinonas

C6-C1-C6

C6-C2-C6

Xantonas

Estilbenos, antraquinonas

C6-C3-C6 Flavonoides e isoflavonoides

(C6-C3)2 Lignanas

(C6-C3-C6)2 Diflavonoides

(C6)n Melaninas vegetais

(C6-C3)n Ligninas

(C6-C1)n Taninos hidrolisveis

(C6-C3-C6)n Taninos condensados

Fonte: Simes et al. (2001)

Notas: C6 corresponde ao anel benznico ;

CX cadeia substituinte com X tomos de carbono.

A maior parte dos compostos fenlicos no encontrada no estado livre na

natureza, mas sob a forma de steres ou heterosdeos. So solveis em gua e em

solventes polares, pois so bastante reativos. Outra caracterstica importante a

propriedade de complexao dos fenis com metais, formando quelatos de utilidade

em diversos sistemas biolgicos. So facilmente oxidveis tanto por enzimas vegetais

quanto por influncia dos metais (ferro e mangans), da luz e do calor e em meio

alcalino (DEWIKC, 2002).

20

2.3.1 Radicais livres

Pesquisas tem tentado esclarecer o papel dos radicais livres em processos

fisiopatolgicos como envelhecimento, cncer, aterosclerose, inflamao, etc.

bastante comum se deparar com temas relacionados a radicais livres em vrios

peridicos que, por seu carter multidisciplinar, tm atrado ateno de

pesquisadores de vrias reas (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).

Radical livre, de maneira resumida, refere-se ao tomo ou molcula altamente

reativo que contm nmero mpar de eltrons em sua ltima camada eletrnica. O no

emparelhamento de eltrons da camada de valncia que confere alta reatividade a

esses tomos ou molculas (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1990).

Para entender a formao de um radical livre, como por exemplo para um

superxido (O2--), derivado do oxignio molecular (O2) (Figura 3), tem-se que o O2

composto por dois elementos oxignio (O), com nmero atmico 8. Para que ocorra a

formao do oxignio molecular (O2), os dois eltrons solitrios do subnivel p de um

elemento oxignio fazem intercmbio com dois eltrons de outro elemento oxignio,

para ento formar compostos estvel com doze eltrons na camada L.

Figura 3 - Esquema de formao do radical livre

Fonte: Ferreira; Matsubara (1997)

importante ressaltar que reaes de reduo implicam em ganho de

eltrons e as de oxidao em perda. Portanto, quando no metabolismo normal ocorrer

uma reduo do oxignio molecular, este ganhar um eltron, formando assim o

radical superxido, ficando instvel. Assim, pode-se concluir que os radicais livres so

21

formados a partir de reaes de oxido-reduo, e provocam ou resultam dessas

reaes (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).

Compostos oxidantes so produzidos pelo metabolismo normal do corpo e,

se no controlados, podem provocar danos extensivos. O stress oxidativo tem sido

associado ao desenvolvimento de muitas doenas crnicas e degenerativas incluindo

o cncer, doenas cardacas, doenas degenerativas como Alzheimer, bem como

est envolvido no processo de envelhecimento (AMES; GOLD; WILET, 1995;

CHRISTEN, 2000). O balano entre o stress oxidativo e as funes antioxidantes dos

organismos vivos parece ter um papel na carcinognese. Estudos clnicos e

epidemiolgicos tm mostrado evidncias de que antioxidantes fenlicos de cereais,

frutas e vegetais so os principais fatores que contribuem para a baixa e significativa

reduo da incidncia de doenas crnicas e degenerativas encontradas em

populaes cujas dietas so altas na ingesto desses alimentos, (SHAHIDI, 1996).

2.3.2 Compostos fenlicos como antioxidantes

A produo de radicais livres controlada nos seres vivos por diversos

compostos antioxidantes, os quais podem ter origem endgena (por ex., superxido

dismutase), ou serem provenientes da dieta alimentar e outras fontes. Destas ltimas

destacam-se tocoferis (vitamina E), cido ascrbico (vitamina C), polifenis, selnio

e carotenoides (VALKO et al., 2004). Quando h limitao na disponibilidade de

antioxidantes podem ocorrer leses oxidativas de carter cumulativo. Os antioxidantes

so capazes de estabilizar ou desativar os radicais livres antes que ataquem os alvos

biolgicos nas clulas (ATUOI et al., 2005).

Antioxidantes so substncias que retardam a velocidade da oxidao atravs

de um ou mais mecanismos, tais como inibio de radicais livres e complexao de

metais, (PIETTA, 2000). Eles podem ser sintticos ou naturais e, para serem utilizados

em alimentos, devem ser seguros para a sade. Alguns dos antioxidantes sintticos

mais importantes so hidroxianisol de butila (BHA) e o hidroxitolueno de butila (BHT)

e entre os naturais destacam-se cido ascrbico, vitamina E e -caroteno (RICE-

EVANS et al., 1996).

Entre os antioxidantes, destacam-se os compostos fenlicos, que podem agir

como redutores de oxignio singleto, atuando nas reaes de oxidao lipdica assim

22

como na quelao de metais. Compostos antioxidantes esto naturalmente presentes

em frutas, sendo que algumas apresentam altas concentraes de determinados

grupos (HARVEY et al., 2004).

A partir do incio dos anos 80, o interesse em encontrar antioxidantes naturais

para o emprego em produtos alimentcios ou para uso farmacutico tem aumentado

consideravelmente, com o intuito de substituir antioxidantes sintticos. Esses tm sido

restringidos devido ao seu potencial de carcinognese, bem como pela comprovao

de diversos outros males como aumento do peso do fgado e significativa proliferao

do retculo endoplasmtico (MELO; GUERRA, 2002; SIMO, 1985; YILDRIM et al.,

2002; ZHENG; WANG, 2001).

Dentre as diversas classes de substncias antioxidantes de ocorrncia

natural, os compostos fenlicos tm recebido muita ateno nos ltimos anos,

sobretudo por inibirem a peroxidao lipdica e alipooxigenase in vitro (HASLAN,

1996; SOARES, 2002).

A oxidao de fenis um dos aspectos mais importantes destes compostos

para a biologia, pois pode resultar no escurecimento dos tecidos. Exemplo bem

conhecido o escurecimento de frutas depois de terem sido cortadas. A oxidao

tambm pode resultar na formao de metablitos que so txicos para animais e

plantas, e que podem representar deteriorao de alimentos no processamento. Por

outro lado, os compostos txicos formados a partir da oxidao de fenis podem inibir

microrganismos patognicos. Determinados fenis so utilizados como retardadores

ou antioxidantes para impedir a oxidao de cidos graxos (DEWICK, 2002).

As matrias-primas in natura disponveis como frutas, vegetais em geral e

condimentos contm numerosos fitoqumicos, alm dos compostos fenlicos como,

por exemplo, compostos nitrogenados, carotenoides, cido ascrbico e tocoferis.

Muitos destes fitoqumicos apresentam significante capacidade antioxidante e so

associados baixa incidncia e baixa mortalidade de cncer em seres humanos

(BIRCH et al., 2001; SLUIS et al., 2001; TOMS-BARBERN et al., 2001; VINSON et

al., 2001).

Em pesquisas epidemiolgicas, alguns flavonoides apresentam-se

associados com a proteo contra doenas do envelhecimento. Isto pode ser

justificado devido sua ao antioxidante. A atividade antioxidante de compostos

fenlicos deve-se principalmente s suas propriedades redutoras e estrutura qumica.

Estas caractersticas desempenham um papel importante na neutralizao ou

23

sequestro de radicais livres e quelao de metais de transio, agindo tanto na etapa

de iniciao como na propagao do processo oxidativo. Os intermedirios formados

pela ao de antioxidantes fenlicos so relativamente estveis, devido ressonncia

do anel aromtico presente na estrutura destas substncias (DEWICK, 2002).

A determinao dos nveis de compostos fenlicos totais em tecidos vegetais

a etapa inicial de qualquer investigao de funcionalidade fisiolgica para posterior

estmulo ao consumo, visando a preveno de doenas crnico-degenerativas. A

capacidade redutora desses compostos pode ser uma das propriedades utilizadas

para nortear a quantificao inicial, porm, em tecidos vegetais, a presena de

carboidratos e outros interferentes com as mesmas caracterstica requer metodologias

confiveis para tais avaliaes (ANTOLOVICH et al., 2000).

2.4 FAMLIA CELASTRACEAE GNERO SALACIA

A famlia Celastraceae est representada predominantemente nas zonas

tropical e subtropical dos dois hemisfrios, incluindo cerca de 50 gneros e 1.000

espcies (SOUZA et al., 2008). Pertencente a esta famlia, o gnero salacia

compreende cerca de 200 espcies, as quais em sua maioria constituem-se de

arbustos com flores pequenas e frutos comestveis com polpa mucilaginosa e so

comumente encontradas em campos e mata (PAARAKH et al., 2008). No Brasil, os

dois gneros da famlia Celastraceae mais comuns so Maytenus e Salacia so

encontrados na regio norte, nordeste, centro oeste, e alguns registros no sudeste

(BRAGA FILHO et al., 2001).

Diante das diversas descries de atividade biolgica das plantas

pertencentes ao gnero que despertou interesse de pesquisadores foram:

antirreumticas, antibacterianas, antitumorais (no tratamento de cncer de pele),

aes curativas de feridas de pele, aes antiulcerognicas, anti-inflamatrias,

cicatrizantes, inseticidas, imunossupressoras, antimicrobianas, antimalricas,

antioxidantes, tripanomicidas, no tratamento de diabticos e outras (FONSECA et al.,

2007; RODRIGUES et al., 2006; SILVA JNIOR, 2005).

Atravs de estudo fitoqumico deste gnero foram isoladas e identificadas

vrias substncias, entre elas os triterpenos, flavonoides, esteroides, alcaloides, e

outras substncias, alm dos triterpenos quinonametdeos, os mais representativos,

24

e so considerados marcadores quimiotaxnomicos (FONSECA et al., 2007;

RODRIGUES et al., 2006).

Duarte et al. (2010) relataram o isolamento do triterpeno friedelano 1,3-dioxo-

16-hidroxifriedelano pela primeira vez nos galhos de Salacia elliptica (Mart. ex Roem.

Schult.) G. Don. Tambm foi citado por Figueiredo e colaboradores (1998) o

isolamento de trs novos triterpenos quinonametdeos das razes de Salacia kraussii

(Harv.) Harv. que demonstraram atividade antimalrica in vitro. Atravs do estudo

fitoqumico das razes de Salacia amplifolia Merr. ex Chun & F.C. foram isolados 13

triterpenos incluindo quinonametdeos, friedelanos, oleananos e triterpenos ursanos,

trs fenlicos simples, um poliol e um cromanona (WANG et al., 2011).

O extrato das razes de S. oblonga apresentou atividade antiperoxidao

lipdica no tecido cardaco de ratos diabticos. A atividade de enzimas antioxidantes,

como a superxido dismutase, catlase, GSHPxase e GSSGRase foi aumentada no

tecido cardaco de animais diabticos tratados com este extrato, sugerindo a sua

atividade antioxidante (KRISHNAKUMAR et al., 1999). J o triterpeno celastrol,

encontrado nas razes de S. campestris, apresentou potente atividade antioxidante,

inibindo a peroxidao lipdica de membrana em mitocndrias isoladas do fgado de

ratos (SASSA et al., 1994).

A investigao fitoqumica da S. chinensis forneceu triterpenos

quinonametdeos (tingenona, tingenina B), friedelanos (kokoonol, cido

salasprmico), ursanos (desmetilregelina, cido triptergico A), glicosdeos

megastigmanos (foliasalaciosdeos), flavonoides (vitexina, isovitexina, rutina), entre

outros (DEOKATE et al., 2012; MORIKAWA et al., 2003; NAKAMURA et al., 2011;

ZHANG et al., 2008).

A espcie S. campestris caracteriza-se pela presena dos triterpenos

quinonametdeos (celastroloides), tingenona, pristimerina, tingenina B, 20-

hidroxitingenona, celastrol e netzahualcoieno nas suas razes (CORSINO et al., 2000).

Um panorama geral de alguns compostos isolados a partir de espcies do

gnero salacia apresentado no Quadro 2.

25

Quadro 2 - Compostos encontrados em espcies do gnero Salacia (continua)

Espcie Composto Referncia

S. amplifolia

pristimerina, netzahualcoieno, friedelan-3-ona, isoiguesterina, 2-hidroxifriedelan-3-ona, regeol A, 7-hidroxi-6- oxopristimerol, -amirina, -amirina, salacenonal, wilforlida A, wilforlida B, lupeol, lup-20(29)-en-3,21-diona, -sitosterol, -daucosterol

Pu et al., 2009; Wang et al., 2011

S. beddomei

pristimerina, friedelan-3-ona, lup-20(29)-en-3,21-diona, -sitosterol, 21-hidroxilup- 20(29)-en-3-ona, 6-hidroxilup- 20(29)-en-3,21-diona, 2,3-di- hidroxilup-20(29)-eno, betulina

Deepa et al., 2003; Deepa et al., 2004; Hisham et al., 1995; Hisham et al., 1996a; Hisham et al., 1996b.

1996b

S. campestris

tingenona, pristimerina, tingenina B, 20- hidroxitingenona, celastrol, netzahualcoieno, friedelan-3-ona, netzahualcoiona

Carvalho et al.,2005; Corsino et al., 2000; Liao et al., 1997

S. kraussi

pristimerina, celastrol, isoiguesterinol, 28-nor- isoiguesterina-17-carbaldedo, 17-(metoxicarbonil)-28-nor- isoiguesterina, 28-hidroxi iguesterina

Figueiredo et al., 1998a

26

Quadro 2 - Compostos encontrados em espcies do gnero Salacia (continuao)


S. chinensis

tingenona, tingenina B, kokoonol, cido salasprmico, desmetilregelina, cido triptergico A, foliasalaciosdeo E1, foliasalaciosdeo E2, foliasalaciosdeo E3, foliasalaciosdeo F, foliasalaciosdeo I, vitexina, isovitexina, rutina, mangiferina, (-)-epicatequina, (-)- epigalocatequina, - amirina, cido wilfrico C, salaquinona A, salaquinona B, cido ortosfnico, - amirenona, cido 3,22-di- hidroxiolean-12-en-29-oico, cido maitenflico, cido 22- hidroxi-3-oxo-olean-12-en-29-oico, regeol A, triptocalina A, 29-hidroxifriedelan-3-ona, canferol 3,7-di-O--D- glicopiranosdeo, canferol 3-O- rutinosdeo-7-O--D- glicopiranosdeo, canferol 3-O- (2,6--L-diramnopiranosil--D- glicopiranosdeo)-7-O--D- glicopiranosdeo, quercetina 3- O-rutinosdeo-7-O--D- glicopiranosdeo, miricetina-3- O--D-rutinosdeo, roseosdeo, (+)-lioniresinol, (+)- isolariciresino, (+)-8-metoxi- isolariciresinol

Deokate et al., 2012; Kishi et

al., 2003; Morikawa et al., 2003; Nakamura et al., 2008;

Zhang et al., 2008

S. elliptica

28-hidroxifriedelan-3-ona, 1,3- dioxo-16-hidroxifriedelano , 16-hidroxifriedelan-3-ona, 30- hidroxifriedelan-3-ona, 16,28- di-hidroxifriedelan-3-ona

Duarte et al 2010.

27

Quadro 2 - Compostos encontrados em espcies do gnero Salacia (continuao)


S.hainanensis

21,26-di-hidroxifriedelan-3-ona, friedelan-3-ona, 21- hidroxifriedelan-3-ona, mangiferina, (-)-epicatequina, -amirina, wilforlida A, lupeol, lup-20(29)-en-3,21- diona, -sitosterol, 29- hidroxifriedelan-3-ona, 30-hidroxifriedelan-3-ona, 7,21- di-hidroxifriedelan-3-ona, 3, 30-di-hidroxiolean-12-eno, cido oleanlico, 2,3-di-hidroxilup- 20(29)-eno, 2,3,22-trihidroxilup-20(29)-eno,3- hidroxilup-20(29)-en-2-ona, 3, 28-di-hidroxilup-20(29)-en-2-ona

Gao et al., 2010; Guo et al., 2013; Guo et al., 2009; Huang et al., 2012; Yuan et al., 2011.

S. longipes

mangiferina, -sitosterol, estigmasterol, salaterpeno A, salaterpeno B, salaterpeno C, salaterpeno D

Mbaning et al.,

2011; Mba'ning et al., 2013

S. madagascariensis

isoiguesterino, isoiguesterina, 6-oxo-isoiguesterina, 20- epi-isoiguesterinol

Thiem et al., 2005

S. prinoides

salacinol, kotalanol, lupeol, -sitosterol, -daucosterol, 30-hidroxilup-20(29)-en-3-ona, 3,30-di-hidroxilup-20(29)-eno, cido urslico, salaprinol, ponkoranol, canferol-4'- metil ter, quercetina, quercetina-3',4'-dimetil ter, isoramnetina, cido glico, galato de etila

Gao et al., 2008;

Yoshikawa et al., 2008

28

Quadro 2 - Compostos encontrados em espcies do gnero Salacia (concluso)


S. reticulata

tingenona, pristimerina, celastrol , netzahualcoieno, isoiguesterinol, 30-hidroxipristimerina, 22- hidroxitingenona, salaciquinona, 21,26-di-hidroxifriedelan-3- ona, 28idroxifri-3-ona, 3-oxo- 28idroxifri-28-al, 2l- 28idroxifriedelano-3-ona, salacinol, kotalanol, mangiferina, (-)-epicatequina, (-)-epigalocatequina, (-)-4-O- metilepigalocatequina, (-)- epiafzelequina-(4 8)-(-)-4-O- metilepigalocatequina, (-)- epicatequina-(4 8)-(-)-4-O- metilepigalocatequina, isoiguesterina, -amirina, salacenonal, -sitosterol, cido 3,22-di-hidroxiolean-12-en- 29-oico, cido maitenflico, 29-hidroxifriedelan-3-ona, 28- 28idroxifriedelano-3-ona, 30-hidroxifriedelan-3-ona, 28idroxifri-3, 21-diona cido 3- oxo- 28idroxifri-30-oico, 16- 28idroxi de kotalagenina, 26- 28idroxifriedelano-1,3-diona, 19- hidroxiferruginol, cido lambrtico

Dhanabalasingham et al., 1996; Kumar et al., 1990; Yoshikawa

et al., 1998; Yoshikawa et al.,

2002a; Yoshikawa et al., 2001;

Yoshikawa et al., 1997

S. verrucosa

2l-hidroxifriedelan-3-ona, 26- hidroxifriedelano-1,3-diona, hidroxifri-1,3-diona, 21- hidroxifriedelano-1,3-diona, 30- hidroxifriedelano-1,3-diona

Somwong et al., 2011

Fonte: o autor (2014)

29

2.4.1 Salacia impressifolia

A espcie Salacia Impressifolia (Miers) A. C. Smith est distribuda pela

Amrica Central e Amrica do Sul. No Brasil encontrada em apenas cinco estados,

sendo todos da regio Norte, com exceo do Mato Grosso (LOMBARDI, 2013).

uma liana com flores amarelas, botes com colorao esverdeada e fruto comestvel

com casca rugosa apresentada na figura 4. (The New York Botanical Garden;

Universidade de So Paulo).

Figura 4 - Salacia impressifolia

Fonte: Universidade de So Paulo (2014)

Conhecida na regio de Santarm PA, como cip mirarura, seu caule e

folhas so utilizados na medicina de sabedoria popular no combate a diabetes e

inflamaes (ALMEIDA, 1993). No h muitos estudos que relatam a composio

qumica desta espcie, porm alguns autores j reportaram o isolamento de algumas

substncias a partir do extrato do caule como dos esteris -sitosterol, estigmasterol

e campesterol, dos triterpenos tingenona, tingenina B, friedelano-3-ona, - amirina, -

amirina, lupeol, cido cinchlico, cido quinvico, o cido 3-O-[-D-quinovopiranosil]-

quinvico, cido 3-O-[-D-fucopiranosil]-quinvico e cido 3-oxoquinvico (COSTA et

al., 2007; RIPARDO FILHO et al., 2008; ROCHA et al., 2000).

30

3 MATERIAIS E MTODOS

3.1 PREPARO DA AMOSTRA

O material botnico (caule, folhas, galhos finos) foi coletado no municpio de

Parintins Amazonas (AM), no dia 14 de setembro de 2014. A identificao da planta

foi confirmada pelo Dr. Xxx, do departamento xxx do Instituto de xxxx, da Universidade

de Caxias do Sul, com depsito no herbrio do xxx da UCS com o nmero xxx.

No experimento apenas o caule da salacia impressifolia foi utilizado. Este foi

seco em estufa com circulao de ar a 45 C, por 48 horas, aps foi modo em moinho

de facas para ento proceder a extrao.

A extrao foi realizada a quente (80 C) por refluxo (Soxhlet). Este mtodo

baseado no refluxo de solvente (lcool P.A e gua destilada 1:1) em um processo

intermitente. A amostra no ficou em contato direto com o solvente muito quente.

Iniciou-se colocando 10 gramas da amostra num papel de filtro (forma cilndrica)

dentro do Soxhlet. O solvente (200 mL) foi aquecido em um balo de fundo redondo,

originando vapor. O vapor proveniente do solvente aquecido passou para o

condensador e foi refrigerado passando ao estado lquido e enchendo o extrator at

ao nvel do tubo lateral. Ao longo do tempo, o solvente foi arrastando compostos

solveis presentes na amostra e aps duas horas obteve-se e extrato final. Aps a

extrao, foi feita a concentrao do EBH em rotaevaporador.

3.2 ANLISE CROMATOGRFICA

O EBH de salcia impressifolia foi dissolvido em uma soluo 1:1 (v/v) de

acetonitrila: gua com 0,1% de cido frmico ou 0,1% de hidrxido de amnia (por

ESI (+) ou ESI (-) respectivamente). Para separao cromatogrfica foi utilizado um

cromatgrafo lquido com sistema UFLC Shimadzu, coma uma bomba LC-20ADXR,

um amostrador automtico SIL-30AC. Foi utilizada coluna analtica Shim-pack XR-

ODS (30 mm x 2,0 mm 2,2 um). O volume de injeo foi de 5 L e vazo da fase mvel

de 150 L/min. Para a deteco foi utilizado um espectrmetro de massas hbrido de

alta resoluo e preciso modelo Microtof-Q Bruker Scientific. Para a ionizao foi

usado a fonte de ionizao por eletrospray (ESI) modelo MicrOTOF-QII Bruker

31

Scientific em modo positivo e negativo. O intervalo de massa foi 50-1200 m / z com

duas leituras por segundo, proporcionando a resoluo de 50.000 (FWHM). Nitrognio

foi utilizado como gs de secagem num fluxo de 10 L min-1. A temperatura de secagem

foi de 200 C, a energia de ionizao de 3,0 eltron Volt (eV), e a voltagem do capilar

de 4500 eV (adaptado de: laboratrio de produtos naturais e sinttico LBIOP, 2014).

3.3 ANLISE QUMICA DOS COMPOSTOS FENLICOS (MTODO DE FOLIN-CIOCALTEAU)

Para quantificar os compostos fenlicos do EBH foi utilizado o reagente de

Folin-Ciocalteau, no qual 0,5 mL da amostra foi diluda em etanol 70% (1 g/L), e

adicionado 2,5 mL de Folin-Ciocalteau a 10% e 2,0 mL de Na2CO3 a 7,5%. O tubo foi

agitado em Vrtex e incubado por 5 min em Banho-Maria a 50C. Aps 15 min de

repouso o complexo azul formado foi quantificado em espectrofotmetro marca

Beckman, modelo DU-530, com comprimento de onda de 760 nm (ROESLER et al.,

2007). A concentrao de fenlicos foi estimada correlacionando-se a absorbncia

das amostras a uma curva padro realizada a partir de 6 pontos com concentrao de

10 a 100 g/mL de cido glico, onde o resultado expresso em mg equivalentes de

cido glico/g de material vegetal (mg EAG/g MV) (BAYDAR et al., 2004;

WATERHOUSE et al., 2000).

3.4 ENSAIO REDUO DE RADICAIS LIVRES ATRAVS DE ENSAIO QUMICO IN VITRO POR METODOLOGIA DE REDUO DO COMPOSTO DPPH

Uma alquota da soluo antioxidante foi misturada com um tampo de Tris-

HCl com pH 7,4 e, em seguida, adicionados 1 mL de 500 M DPPH em etanol, agitada

vigorosamente e deixada repousar durante 20 minutos temperatura ambiente em

cmara escura. A leitura foi feita em absorbncia em 517 nm em espectrofotmetro

marca Beckman, modelo DU-530 (YAMAGUCHI et al., 1998).

32

4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 IDENTIFICAO DOS COMPOSTOS POR MEIO DE CROMATOGRAFIA LQUIDA ACOPLADA COM ESPECTRO DE MASSAS

Com base na composio complexa dos extratos de plantas, os HRMS tm

sido utilizados como uma ferramenta poderosa para a identificao de alcaloides e

flavonoides, por exemplo (NICOLA et al., 2013; RUFFATO et al., 2013).

Espcies de Salacia so conhecidas por possurem quinonametdeos, classe

de compostos que so considerados marcadores taxionmicos da famlia celastracea,

friedelanos, lupanos e oleananos triterpenos, sesquiterpenos e cidos fenlicos

(GUNATILAKA, 1996; MATSUDA et al., 2005). O EBH foi analisado em modo positivo

(ESI (+)) e negativo (ESI (-)), e os perfis do EBH so mostrados na Figura 5, em ESI

(+) e ESI (-).

Figura 5 - Perfil do EBH em ESI(+) e ESI (-)

1)

2)


Notas:1) ESI(+)

2) ESI(-)

O objetivo foi identificar principalmente os fenlicos presentes no EBH, uma

vez que h registro na literatura que estes possuem capacidade inibitria de radicais

livres. Um conjunto de informaes como massa exata, razo isotpica e rota de

fragmentao so usadas na identificao qumica. Para a confirmao de

composies elementares foi estabelecido um limite de exatido de 5 ppm (parte por

33

milho) (LACOSTE et al., 2006). Os principais compostos qumicos identificados esto

listados na Tabela 1 e suas estruturas qumicas esto ilustradas na Figura 6.

Tabela 1 - Compostos identificados no EBH de Salacia impressifolia

Nmero composto

on precursor (m/z)

EBH ESI(+) ou ESI(-)

Nome do composto Frmula molecular

Erro (ppm)

Referncias

1 179.0714 EBH(-) Coniferaldedo C10H10O3 2.84 Wang et al., 2011

2 193.0444 EBH(-) Gynuraone C10H10O4 2.62 Wang et al, 2011;

3 197.0450 EBH(-) cido lambrtico C9H10O5 2.70 Matsuda et al., 2005

4 255.2320 EBH(-) cido palmtico C16H32O6 3.90 Duarte et al., 2010

5 279.1577 EBH(+) Dibutilftalato C16H22O4 4.20 Wang et al., 2011

6 291.0877 EBH(+) Leucopelargonidin C15H14O6 2.63 Rastogi Mehrotra, 1960

7 289.0725 EBH(-) Epicatequina/ catequina

C15H14O6 1.00 Koga et al., 2013

8 335.0468 EBH(+) Salacinol C9H18O9S2 0.97 Yoshikawa et al., 1998

9 341.1230 EBH(-) Coniferina C16H22O8 3.60 Nakamura et al., 2011

10 347.1527 EBH(+) Ciliarin C19H22O6 1.84 Nakamura et al., 2011

11 383.1920 EBH(+) Foliachinenoside I C16H30O10 0.53 Nakamura et al., 2011

12 423.0925 EBH(+) Mangiferina C19H18O11 0.74 Karunanayake, 1985;

13 425.0781 EBH(+) Kotalanol C12H24O12S2 1.69 Yoshikawa et al, 1998;

14 441.3026 EBH(+) Regeol A C28H40O4 4.63 Wang et al, 2011;

15 465.1540 EBH(-) Lehmbachol D C26H26O8 1.86 Kawazoe et al, 1997;


34

Figura 6 - Estrutura qumica dos compostos identificados em EBH de S. impressifolia (continua)

35

Figura 6 - Estrutura qumica dos compostos identificados em EBH de S. impressifolia (concluso)

Fonte: Matsuda et al. (2005)

Foi encontrado no EBH compostos fenlicos e entre eles, a mangiferina,

constituinte polifenol e taninos como a epicatequina. Em estudo sobre constituintes

polifenis, a mangiferina revelou uma boa capacidade de reduzir a formao de

36

espcies de oxignio reativo, ativar o sistema antioxidante enzimtico e restaurar o

potencial da membrana mitocondrial. Foram analisadas clulas oriundas do lbulo

frontal de ratos, expostas ao glutamato 50 M e glicina 10M. Para avaliao dos

efeitos do polifenol em excitotoxicidade, a mangiferina foi adicionada 30 min antes e

tambm durante a exposio das clulas. A avaliao final foi feita 3 h mais tarde, para

ento concluir que a mangiferina possua excelente propriedades antioxidantes e anti-

apoptticos, podendo ser utilizada em patologias que envolvem excitotoxicidade e

morte de neurnios (KARUNANAYAKE; SIRIMANNE, 1985; CAMPOS-ESPARZA et

al., 2008).

A investigao da atividade nefroprotetor e antioxidante do extrato etanlico

oblonga S. foi estudada com duas doses (250 e 500 mg / kg) em ratos com toxicidade

induzida por acetaminofeno (paracetamol). Os resultados mostraram que o

paracetamol aumenta significativamente os nveis de nveis de ureia, creatinina e a

diminuio de soro de cido rico. A reduo foi por aumento de respostas dos

antioxidantes, tal como avaliado por parmetros bioqumicos e histopatolgicos. Os

resultados tambm sugerem uma atividade nefroprotetor e antioxidante do extrato

contra a toxicidade induzida por acetaminofeno em ratos (PALANI et al.,2011).

4.2 DETERMINAO DE FENLICOS TOTAIS

A determinao do contedo de compostos fenlicos totais utiliza o reagente

de Folin-Ciocalteu que consiste em uma mistura de cidos fosfomolibdico e

fosfotngstico, no qual o molibdnio e o tungstnio encontram-se no estado de

oxidao 6+ (ANAGNOSTOPOULOU et al., 2006). Na presena de certos agentes

redutores como os compostos fenlicos, forma-se molibdnio azul e tungstnio azul,

cujo estado de oxidao se encontra entre 5+ e 6+. Essa colorao azul permite a

determinao da concentrao das substncias redutoras. Os fenis contidos nas

amostras so energeticamente oxidados em meio bsico, resultando na formao do

O2, o qual reage com os cidos formando compostos com uma intensa absoro perto

de 750 nm (CHAVES et al., 2010; WATERMAN et al., 1994). Porm, essa metodologia

no seletiva para subtipos de compostos fenlicos vegetais e podem ser detectados

no teste alm de flavonoides, catequinas, compostos fenlicos simples e seus

polmeros como os taninos hidrolisveis, dentre outras substncia (MAGINA, 2008).

Com relao ao gnero Salacia foram reportados estudos relatando efetiva

atividade antioxidante para a frao solvel em ter de petrleo do extrato de S.

37

oblonga, extrato metanlico de S. chinensis e para compostos isolados a partir de S.

reticulata, S. campestris e S. chinensis (CARVALHO et al., 2005; KISHI et al., 2003;

KRISHNAKUMAR et al., 1999; PAARAKH et al., 2008; YOSHIKAWA et al., 2003).

No EBH de Salacia impressifolia foi encontrado um teor de fenlicos totais de

387,165 g equivalentes de cido glico (EAG)/kg de EBH da planta. Ao comparar o

teor de fenlicos totais de S. impressifolia com algumas plantas do gnero, observa-

se que ela possui uma concentrao maior de fenlicos. Por exemplo, em extrato de

S. oblonga (SO) o teor de fenis totais de 65,8 g EAG/kg de extrato da planta. A

atividade antioxidante in vitro do extrato metanlico aquoso SO foi analisada atravs

da reduo dos superxidos, gua oxigenada e xido ntrico. A anlise estatstica

revelou que o teor de fenlicos totais e tanino de SO reduziu significativamente a ao

desses xidos, enquanto o teor de flavonoides totais contribuiu significativamente para

o H2O2 e atividade captadora de O2-. Os compostos fenlicos de SO provocam a

eliminao significativa de radical NO-. Desta forma, o autor provou que o extrato de

SO comporta-se como um bom limpador dos radicais superxidos, e que pode ser

considerado como uma fonte natural de antioxidantes para usos medicinais e

comercial (BASU et al., 2013).

A capacidade antioxidante dos extratos brutos de plantas diretamente

influenciada pela presena de compostos fenlicos, pois esses possuem grupos

hidroxilos ligados a sistemas aromticos, os quais so capazes de receber e assimilar

eltrons livres. Sua ao antioxidante se d atravs da supresso de radicais livres

atuando dessa forma na regulao e proteo do sistema de defesa (DAI; MUMPER,

2010). Presume-se que a ingesto diria de cerca de 1g de compostos fenlicos em

uma dieta rica em frutas e legumes pode contribuir com um bom potencial antioxidante

para o corpo (SAUMYA; MAHABOOB, 2011).

4.3 ENSAIO DE REDUO DE RADICAIS LIVRES ATRAVS DE ENSAIO QUMICO IN VITRO POR METODOLOGIA DE REDUO DO COMPOSTO DPPH

Este mtodo baseado na transferncia de eltrons de um composto

antioxidante para um radical livre, o DPPH, e a sua reduo por um antioxidante

ilustrado na Figura 7. Isso ocorre devido ao desemparelhamento de eltrons, e a

absoro mxima do DPPH se d e 517 nm que incialmente possui colorao prpura.

medida que ocorre o emparelhamento dos eltrons, ocorre a eliminao dos

radicais, a fora de absoro diminuda, e a descolorao da soluo

38

estequiomtrica em relao ao nmero de eltrons capturados (YAMAGUCHI et al.,

1998).

Figura 7 Reao de reduo do radical DPPH

Fonte: Yamaguchi et al. (2008)

Para avaliar a capacidade antioxidante dos compostos presentes no EBH da

S. impressifolia foi feita anlise com DPPH. Os resultados foram expressos em

percentagem de inibio de oxidao, ou seja, a porcentagem de atividade

antioxidante corresponde quantidade de DPPH consumida pelo antioxidante (IC50%).

O IC50% expressa qual a concentrao necessria da amostra para reduzir em 50% o

radical livre DPPH, assim, quanto menor o valor do IC50% maior a atividade

antioxidante.

A porcentagem de inibio calculada a partir da absorbncia da amostra e

padro, atravs da equao 1:

(%) =

100 (1)

Onde:

AA(%): atividade antioxidante (%);

Apadro: absorbncia do DPPH;

Aamostra: absorbncia da amostra diluda em soluo de DPPH.

Com a porcentagem de inibio versus concentrao da amostra obtm-se a

equao da reta, y= 0,50207x 35,6217, para ento calcular o IC 50, onde y=50, e a

39

partir de ento, encontrar a concentrao da amostra necessria para inibir 50% do

radical DPPH. O resultado obtido para IC50% foi de foi de 164,4267 g/mL para a

vitamina C, e de 233,014 g/mL para o EBH.

Nas Figuras 8 e 9, esto representadas respectivamente as curvas de

calibrao construdas com a porcentagem da atividade antioxidante versus a

concentrao do padro referncia (vitamina C), e do EBH

Figura 8 curva de calibrao do padro (vitamina C)


y = 0,5207x - 35,617R = 0,9872

30,00

35,00

40,00

45,00

50,00

55,00

60,00

65,00

70,00

75,00

140 150 160 170 180 190 200 210

%A

tivi

dad

e a

nti

oxi

dan

te %

concentrao g/mL

% varredura do padro (vit C)

40

Figura 9 Curva de calibrao do EBH 1:1 de salcia impressifolia.


Rachana et al. (2013) obtiveram resultados de IC50% para extrato de SO para

inibio dos radicais H2O2 e O2- de 380 g/ mL e 186 g/ mL, respectivamente.

Tambm h registro da atividade antioxidante de S. campestris, porm o teste foi

realizado para compostos isolados a partir de extratos da raiz da espcie. Foram

analisados 5 quinonametdeos triterpenos salacin, pristimerina, maitenina, 20-

hidroximaitenina, netzahualcoyene e a atividade antioxidante para esses compostos

foi de 20, 39, 28, 55 e 10% respectivamente para concentrao de 50 M (CARVALHO

et al., 2005).

y = 0,2538x - 9,1389R = 0,9957

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Ati

vid

ade

an

tio

xid

ante

%

concentrao g/mL

% de varredura do EBH de salcia impressifolia.

41

CONCLUSO

Neste trabalho foi proposto um estudo fitoqumico do caule de Salacia

impressifolia em extrato hidroalcolico bruto. Este foi analisado por cromatografia

lquida acoplada com espectrometria de massas de alta resoluo. E foram

identificados 15 compostos, alguns inditos para espcie.

Dos compostos identificados, alguns pertencem ao grupo dos fenlicos, os

quais apresentaram influncia direta nos resultados dos ensaios simples de bancada

para determinao do teor de fenlicos totais e atividade antioxidante no extrato bruto.

Os ensaios in vitro indicam EBH de S. impressifolia como uma valiosa fonte

de antioxidantes naturais, os quais podem ser utilizados na preveno do stress

oxidativo em sistemas biolgicos.

Os resultados obtidos neste trabalho confirmaram a importncia da

continuidade do estudo de extratos oriundos do caule da espcie Salacia impressifolia,

pois foi identificado um bom potencial antioxidante, uma vez que para vitamina C,

composto j isolado, o IC 50% foi de 164 g/mL e para o EBH de S. impressifolia foi de

233 g/mL, enfatizando assim uma prioridade para isolamento dos constituintes de S.

impressifolia, para ento determinar e quantificar os metablitos responsveis pelas

atividades apresentadas. Alm disso, a avaliao do potencial antioxidante da planta

atravs de ensaios in vitro e estudos in vivo, facilita a descoberta sobre seu

mecanismo de ao. Isso pode ajudar na anlise de S. impressifolia como uma planta

de escolha para os alimentos funcionais, bem como, produtos farmacuticos base

de plantas.

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