UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ - UNIVALI CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS DA TERRA E DO MAR – CTTMar

Letícia Zanatta Baratieri

Influência da temperatura e concentração de Tween20 sobre o crescimento de Halomonas sulfidaeris LAMA838 e Marinobacter excellens LAMA842

Itajaí 2013

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Letícia Zanatta Baratieri

Influência da temperatura e concentração de Tween20 sobre o crescimento de Halomonas sulfidaeris LAMA838 e Marinobacter excellens LAMA842

Tabalho de Conclusão de Curso Área de conhecimento: Oceanografia Sub- área de conhecimento: Biológica Modalidade: Pesquisa Orientador: Marcus Adonai Castro da Silva

Itajaí 2013

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AGRADECIMENTOS

Agradeço ao professor Marcus Adonai, pela orientação, paciência, dedicação e

apoio.

Ao pessoal do LAMA Tiago e César e também ao Tiago do LBB por me

ajudarem sempre que precisei.

A minha família que mesmo de longe sempre me incentivou muito.

Ao meu namorado pelo companheirismo, apoio e paciência.

Aos amigos mais antigos, que mesmo de longe estiverem sempre ao meu lado.

Aos amigos que fiz durante a faculdade, que ajudaram a tornar esse período

mais prazeroso.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Crescimento dos micro-organismos H. sulfidaeris LAMA 838 e M. excellens

LAMA 842, em função da temperatura. O crescimento foi avaliado em caldo marinho

suplementado com Tween20 a 1%. Os valores plotados representam as médias

aritiméticas de triplicatas para cada temperatura testada, e as barras representam o

desvio padrão................................................................................................................16

Figura 2. Crescimento dos micro-organismos H. sulfidaeris LAMA 838 e M. excellens

LAMA 842, em função da concentração de Tween20. Os micro-organismos foram

cultivados por um dia em caldo marinho, a 30ºC (H. sulfidaeris LAMA 838) e entre 20 e

25ºC (M. excellens LAMA 842). Os valores plotados representam as médias

aritiméticas de triplicatas para cada concentração testada, e as barras representam o

desvio padrão................................................................................................................16

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LISTA DE APÊNDICES Apêndice1. Níveis de significância da ANOVA para taxa de crescimento em função da temperatura...................................................................................................................24

Apêndice 2. Resultados para a ANOVA, para os experimentos de crescimento em função da temperatura..................................................................................................24

Apêndice 3. Níveis de significância da ANOVA para taxa de crescimento em função da temperatura...................................................................................................................24

Apêndice 4. Resultados para a ANOVA, para os experimentos de crescimento em função da concentração de Tween20...........................................................................25 Apêndice 5. Curvas de calibração elaboradas no presente trabalho............................26

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SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO ..........................................................................................................7

2.OBJETIVO GERAL ................................... ................................................................9

2.1.Objetivos específicos.......................... ..............................................................9

3.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA............................ ................................................... 10

3.1.Enzimas marinhas............................... ............................................................ 10

3.2.Micro-organismos marinhos lipolíticos .......... ............................................... 10

3.3.Influência da temperatura sobre o crescimento m icrobiano ....................... 11

3.4.Influência da concentração do substrato sobre o crescimento microbiano................................................................................................................................ 11

4.MATERIAIS E MÉTODOS.............................. ......................................................... 13

4.1.Micro-organismos estudados..................... .................................................... 13

4.2.Experimentos de cultivo ........................ ......................................................... 13

4.3.Determinação do crescimento microbiano ......... .......................................... 14

4.4.Análise de dados............................... .............................................................. 14

5.RESULTADOS ....................................... ................................................................. 15

6.DISCUSSÃO ........................................................................................................... 18

7.CONCLUSÃO........................................ .................................................................. 21

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................... .................................................. 22

APÊNDICES............................................................................................................... 25

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RESUMO

Os ecossistemas marinhos profundos apresentam uma grande diversidade

microbiológica. Muitos desses micro-organismos têm a capacidade de produzir

enzimas lipolíticas, e estas por sua vez, podem apresentar diversas aplicações

biotecnológicas: em tratamento de esgoto ou caixas de gordura, produção comercial

de biodiesel e produção de alguns alimentos e algumas drogas. Neste contexto, o

presente trabalho tem como objetivo determinar as melhores condições para o

crescimento das linhagens Halomonas sulfidaeris LAMA 838 e Marinobacter excellens

LAMA 842, previamente isoladas de amostras de sedimentos da região da cordilheira

Walvis, Atlântico Sul. Para tanto, os parâmetros avaliados foram temperatura e

concentração de substrato. Para a determinação da temperatura ótima de

crescimento, as bactérias foram inoculadas a partir de uma pré-cultura em meio Caldo

Marinho suplementado com Tween20 a 1% (CMT20), e incubadas durante um período

de 48 horas, nas temperaturas testadas (5ºC, 10ºC, 15ºC, 20ºC, 25ºC e 30ºC). E por

fim, na verificação da melhor concentração de substrato, os micro-organismos foram

mantidos em frascos Erlenmeyer, suplementado com Tween20 a quatro

concentrações distintas (0,001, 0,01, 0,1 e 1%), na temperatura ótima de crescimento,

determinada previamente. Para H. sulfidaeris entre as temperaturas testadas, aquela

em que a espécie apresentou um crescimento ótimo foi a 30°C e na concentração de

substrato, Tween 20 a 1%. Enquanto para M. excellens a temperatura ótima se

encontra entre 20 a 25°C e subtrato em concentração de 0,001 a 0,01%. A partir dos

resultados, é possível verificar que os organismos aqui estudados são mesófilos, e

que M. excellens é uma bactéria mais adaptada a ambientes pobres em nutrientes do

que H. sulfidaeris.

Palavras-chave : bactérias lipolíticas, crescimento, temperatura, substrato

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1.INTRODUÇÃO

Os ecossistemas marinhos, especialmente os mares profundos, abrigam uma

grande diversidade filogenética de micro-organismos. Estes podem ter grande

importância ecológica e também diversas possibilidades de aplicações

biotecnológicas. No entanto, as dificuldades de acesso a esses locais e a manutenção

desses organismos em laboratório, tornaram seu entendimento bastante complexo.

Sua capacidade de sobreviver e manter suas atividades mesmo sob condições

de baixa temperatura e alta pressão despertaram o interesse da comunidade cientifica.

Desde a última década tem havido um esforço contínuo para se conhecer mais sobre

as enzimas de organismos marinhos. Entre as mais citadas com potencial

biotecnológico tem-se: proteases (GIONGO, 2006), carboidrases (BERTUCCI; COURI,

2004), peroxidases (DEBASHISH et al., 2005), lipase e celulases (ODISI et al., 2012).

Outro grupo de proteínas de grande interesse são as lipases, enzimas lipolíticas

produzidas por micro-organismos que apresentam variadas aplicações: em tratamento

de esgoto ou caixas de gordura, produção comercial de biodiesel e produção de

alimento e algumas drogas. No tratamento de esgoto ou em caixas de gordura, as

lípases atuam diminuindo custos de manutenção e reduzindo impactos negativos ao

meio ambiente (AEHLE, 2007). Na produção comercial de biodiesel, são ótimas

diminuindo a quantidade de resíduos e facilitando a recuperação do produto final.

Comparando-se combustíveis fósseis com biocombustíveis, o segundo apresenta a

vantagem de ser uma fonte de energia renovável (SALIS; MONDUZZI; SOLINAS,

2007). Na indústria alimentícia, seu uso está associado à produção de queijos, sucos

de frutas e vegetais, clarificação de sucos e vinhos, panificação e cervejaria

(BERTUCCI; COURI, 2004). E, em algumas drogas, possuem a capacidade de reduzir

os efeitos colaterais causados pelas mesmas (AEHLE, 2007; KIM et al., 2007).

Anterior ao processo de aplicação em microbiologia industrial, é necessário o

desenvolvimento de métodos para o controle ou otimização das atividades

microbianas, que por sua vez, depende muito do entendimento das influências

ambientais a que estes micro-organismos estão submetidos. Basicamente, os fatores

que mais controlam seu crescimento são: temperatura, pH, disponibilidade de água e

oxigênio (MADIGAN et al., 2004) e concentração do substrato (HORIKOSHI, 2011).

Cada organismo apresenta uma temperatura e/ou um pH mínimo abaixo do qual

não consegue crescer, um ótimo em que o crescimento ocorre rapidamente e um

máximo, acima do qual o organismo não consegue crescer. O oxigênio estabelece o

crescimento de organismos anaeróbios, aqueles que não são capazes de respirar

8

oxigênio, e aeróbios, capazes de crescer em ambientes com grandes concentrações

de oxigênio (MADIGAN et al., 2004). A concentração do substrato também está

relacionada ao crescimento microbiano. Acima de uma determinada concentração de

carbono (substrato), por exemplo, a taxa de crescimento será constante e, abaixo

dessa concentração, a taxa poderá diminuir consideravelmente (HORIKOSHI, 2011).

Uma vez que já tenha sido constatado o potencial biotecnológico das bactérias

produtoras de enzimas lipolíticas, a idéia que se segue é gerar um produto de

interesse comercial. Em microbiologia industrial, uma produção economicamente

viável só é possível se realizada em largas escalas (MADIGAN et al., 2004), para

tanto, se faz necessário a otimização do crescimento destes micro-organismos. Estes,

por razões econômicas, devem ser produzidos em grandes quantidades no menor

intervalo de tempo, o que reflete a necessidade de se determinar as condições mais

adequadas para o crescimento destas bactérias.

Foi realizado, em 2011, um trabalho visando avaliar a atividade lipolítica de

bactérias produtoras de lipases em diferentes substratos (ROSA, 2011). O trabalho

teve como objetivo isolar e caracterizar bactérias lipolíticas de amostras de sedimentos

oriundas de várias regiões do Oceano Atlântico. Baseado nesta pesquisa, o presente

trabalho dará continuidade ao anterior, procurando agora, as melhores condições para

o crescimento das bactérias que apresentaram resultados positivos quanto a produção

de enzimas, em função da temperatura e concentração de substrato.

9

2.OBJETIVO GERAL

Determinar as melhores condições de crescimento de duas bactérias marinhas

lipolíticas, Halomonas sulfidaeris LAMA 838 e Marinobacter excellens LAMA 842, em

função da temperatura e da concentração do substrato (Tween20).

2.1.Objetivos específicos

• Avaliar o crescimento das duas bactérias marinhas lipolíticas aqui estudadas,

em função de diferentes temperaturas.

• Avaliar o crescimento das duas bactérias marinhas lipolíticas estudadas, em

função de diferentes concentrações de Tween20.

10

3.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1.Enzimas marinhas Os oceanos são vistos atualmente como um ambiente extremamente

promissor, no entanto sua matéria-prima ainda é pouco explorada. Trata-se de um

ecossistema com uma diversidade infinita de novos micro-organismos e estes por sua

vez, podem significar uma importante fonte de compostos bioativos fundamentais para

o avaço biotecnológico e desenvolvimento sustentável (RIVERA, 2012). Vinculado ao

grande potencial biotecnológico, estão as enzimas destes micro-organismos.

Debashish et al., (2005) cita Vibrio spp e V. alginolyticus como sendo organismos

capazes de produzir, respectivamente, enzimas protease e colagenase, que então,

podem ser utilizadas pelas indústrias de limpeza e farmacêutica.

Além destas, outra enzima que tem recebido bastante atenção é a lipase,

produzida por micro-organismos como Pseudoalteromonas sp J937 (MO etl al., 2007),

Pseudomonas sp MSI057 (KIRAN et al., 2008), Yarrowia lipolytica CL180 (KIM et al.,

2007), Bacillus pumilus B106 (ZHANG et al., 2009), Bacillus aerophilus LAMA 582 e

Bacillus stratosphericus LAMA 585 (ODISI et al., 2012)

3.2.Micro-organismos marinhos lipolíticos

Micro-organismos lipolíticos são aqueles capazes de produzir enzimas que

hidrolisam lipídeos. Pertencem a vários grupos filogenéticos, dos domínios de

procariotos, Bacteria e Archaea. Dentro destes domínios, são observados micro-

organismos marinhos em vários filos distintos. Um trabalho realizado por Seo et al.

(2005), encontrou uma nova espécie bacteriana produtora de lipase, Photobacterium

frigidiphilum, isolada a partir de sedimentos marinhos coletados a uma profundidade

de 1450 m. Sua atividade lipolítica foi observada em Ágar Marinho contendo o

substrato tributirina. Park et al, (2007) também determinou uma nova enzima lipolítica,

estudando a linhagem Vibrio GMD509, isolada a partir de ovos de lebre do mar,

Aplysia kurodai.

No decorrer das pesquisas a respeito de micro-organismos marinhos e o

ambiente que os circunda, muitas novas espécies acabam sendo descobertas. Outras

bactérias produtoras de lípases são as do gênero Halomonas e Marinobacter. Kaye et

al. (2004) procuraram avaliar a diversidade fisiológica e filogenética de bactérias de

fontes hidrotermais do oceano profundo. Como resultado, quatro isolados foram

11

totalmente caracterizados e, através de sequenciamento genético, classificados e

nomeados como Halomonas neptunia, H. sulfidaeris, H. axialensis e H. hydrothermalis.

Em um outro trabalho, por sequenciamento genético, foi descoberta uma nova espécie

para o gênero Marinobacter, a M. excellens. Esta foi encontrada a partir de 5 estirpes

de bactérias halofílicas, gram-negativas isoladas de amostras de sedimento coletadas

na Baía de Chazhma, mar do Japão (GORSHKOVA et al., 2003).

Além destes, autores como Xiang et al. (2004) estudaram micro-organismos

lipolíticos psicrófilos dos gêneros Psychrobacter, Pseudoalteromonas e Pseudomonas,

do filo Proteobacteria, sendo isolados de sedimentos profundos do Oceano Pacífico.

Este trabalho teve ênfase na produção de lípases em diferentes temperaturas. E então

foi verificado que as bactérias cresceram entre 4°C e 30°C, com um crescimento ótimo

entre 10 e 20°C, e produziram também enzimas hidrolíticas como proteases, amilases

e gelatinases.

3.3.Influência da temperatura sobre o crescimento m icrobiano

A temperatura mais adequada para o crescimento de um micro-organismo

varia muito de acordo com sua necessidade e/ou tolerância. Há organismos cuja

temperatura ótima de crescimento situa-se em baixas temperaturas, estes são

denominados psicrófilos entre 15°C e 0°C e psicotolerantes, capazes de crescer a

0°C, mas com ótimo entre 20°C e 40°C. Por outro lado, existem os organismos mais

adaptados a ambientes com altas temperaturas, como os termófilos, podendo

apresentar um crescimento ótimo a uma temperatura superior a 45°C, ou ainda, os

hipertermófilos cujo ótimo é superior a 80°C (MADIGAN et al., 2004).

Yu et al., (2009), investigaram a capacidade de 338 cepas de bactérias

isoladas do gelo do mar Ártico, na Bacia do Canadá (77°30’N–80°12’N), de produzir

protease, lipase, amilase, quitinase, celulase e/ou agarase. Destes isolados, verificou-

se que produtores de lipase foram filogeneticamente comuns entre as cepas isoladas,

que a temperatura ótima de atividade occorre entre 20 e 35ºC mas que, mesmo a

baixas temperaturas (0°C), os organismos apresentaram elevada produtividade

enzimática, não havendo diferença significativa entre as bactérias psicrófilas e

psicotolerantes.

3.4.Influência da concentração do substrato sobre o crescimento microbiano

12

Todas as bactérias heterotróficas marinhas têm que enfrentar o mesmo

problema em mar aberto, a extração de substratos suficientes para o seu crescimento

em um ambiente que, de modo geral, é empobrecido de nutrientes. Em resposta a

estas condições, alguns micro-organismos se adaptaram para ter um ótimo

crescimento sobre baixas concentrações de nutriente, como os oliogotróficos. E outros

no entanto, são dependentes de condições de meio enriquecido em nutrientes, os

copiotróficos (HORIKOSHI, 2011).

Eguchi et al., (1996) e Fegatella et al., (1998) demonstraram que culturas de

uma bactéria placntônica, Sphingopyxis alaskensis (ultramicrobacteria oligotrófica),

respondem imediatamente a “upshift” de nutrientes aumentando sua taxa de

crescimento, atingindo seu máximo quando expostas a elevados níveis de glicose. No

entanto, a taxa máxima de crescimento S. alaskensis é baixa, se comparada com os

organismos copiotróficos (FEGATELLA et al., 1998).

13

4.MATERIAIS E MÉTODOS

4.1.Micro-organismos estudados

Os micro-organismos utilizados neste trabalho pertencem às linhagens

Halomonas sulfidaeris LAMA 838 e Marinobacter excellens LAMA 842. Estas bactérias

foram previamente isoladas de amostras de sedimentos da região da cordilheira

Walvis, no Oceano Atlântico, de profundidades de 4650 e 5000 m (SILVA et al., 2013),

e foram selecionadas com base na sua atividade lipolítica sobre quatro substratos

distintos, Tween20, Tween40, Tween60 e Tween80 por Rosa, (2011). Durante o

trabalho os micro-organismos foram mantidos a 4ºC em placas de Ágar Marinho

suplementado com Tween20 a 1%, sendo repicados mensalmente.

4.2.Experimentos de cultivo

Para determinação dos valores de temperatura ótimo, máximo e mínimo de

crescimento, as bactérias foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer (125 ml),

contendo 75ml de meio Caldo Marinho (Himedia) suplementado com Tween20 a 1%

(CMT20), nas temperaturas: 5ºC, 10ºC, 15ºC, 20ºC, 25ºC e 30ºC. O inóculo foi feito a

partir de uma pré-cultura em meio CMT20, incubada por até 48 horas, na temperatura

testada. Após a inoculação das bactérias, os frascos foram incubados em estufa na

temperatura testada, com força g de 0,36276864, por períodos de 1 dia para os testes

de 30 e 25°C, 2 dias para os testes de 20 e 15°C e 5 dias para os de 10 e 5°C. O valor

máximo de temperatura corresponde ao maior valor deste parâmetro no qual o

organismo apresenta crescimento. Da mesma forma, o valor mínimo de temperatura

corresponde ao menor valor no qual se observa crescimento. O valor ótimo de

temperatura para o crescimento de um determinado organismo foi determinado a partir

da taxa de crescimento deste organismo em cada um dos valores de temperatura. O

valor ótimo de temperatura correspondeu ao valor no qual a taxa de crescimento é

máxima. Para a obtenção dos valores de taxa de crescimento, a densidade óptica (600

nm) das culturas foi determinada ao longo do experimento, em intervalos de uma hora

(temperaturas mais altas) a quatro horas (temperaturas mais baixas), como medida de

crescimento. Estas determinações foram realizadas em periodicidade variável, de

acordo com a temperatura testada. A partir das medições de densidade óptica, a taxa

14

de crescimento foi calculada como descrito abaixo. Neste procedimento foram

utilizadas triplicatas (BREZNAK e COSTILOW, 1994).

Para avaliação do crescimento com diferentes concentrações do substrato

lipídico (Tween20), o experimento foi similar ao descrito acima para as diferentes

temperaturas. Neste caso o micro-organismo foi incubado em meio CMT20 com quatro

concentrações distintas de Tween20 (0,001, 0,01, 0,1 e 1%), na temperatura ótima de

crescimento, determinada previamente.

4.3.Determinação do crescimento microbiano

O crescimento microbiano foi avaliado através da densidade óptica (DO),

determinada em espectrofotômetro a 600nm (WHITE, 2000). As leituras foram

limitadas a valores de DO inferiores a 0,3, pois acima destes valores a relação entre

número de células e absorbância perde linearidade. Quando necessário, a cultura foi

diluída para a leitura no espectrofotômetro.

Para o cálculo da taxa de crescimento, os valores de DO foram convertidos em

número de células por mililitro. Para isto, a partir de uma cultura densa dos micro-

organismos estudados, foram preparados seis padrões com concentrações distintas

de células, e valores de DO, dentro da faixa linear (inferiores a 0,3). Em paralelo, foi

determinada a concentração de células nesta cultura, através de contagens em meio

sólido (Ágar Marinho), pela técnica de espalhamento em placas. Posteriormente, a

relação entre DO e número de células foi expressa por uma equação da reta,

calculada utilizando-se o software Microsoft Excel. Esta equação permitiu a conversão

dos valores de DO em células por mililitro. O cálculo da taxa de crescimento foi

efetuado através da regressão linear dos dados logaritimizados (Log10) de densidade

celular em relação com o tempo, utilizando o mesmo software mencionado acima. A

partir do coeficiente angular obtido, a taxa de crescimento foi calculada pela fórmula K

= a*2,303, sendo K a taxa de crescimento e “a” o coeficiente angular (WHITE, 2000).

4.4.Análise de dados

Os valores de K para cada experimento de crescimento foram comparados

entre si, para determinação da temperatura ótima e concentração de tween20

preferencial de crescimento, através de análise de variância. Esta análise foi realizada

utilizando-se o software Statistica® versão 6.0.

15

5.RESULTADOS

Neste trabalho foram avaliadas quais seriam as melhores condições de

crescimento para as bactérias H. sulfidaeris LAMA 838 e M. excellens LAMA 842,

sendo a temperatura o primeiro parâmetro avaliado. Primeiramente foi realizado o

teste a 5°C, e, posteriormente a 10°C. Tratando-se de temperaturas muito baixas,

esperava-se que ambas as bactérias crescessem mais lentamente, por isso foram

cultivadas por aproximadamente 5 dias, no entanto, nenhuma das linhagens foi capaz

de crescer sob essas condições.

Entre as temperaturas testadas (5°C, 10°C, 15°C, 20°, 25°C e 30°C), H.

sulfidaeris LAMA 838 teve sua ótima taxa de crescimento a 30ºC, diferindo

estatisticamente dos outros valores experimentados, enquanto que M. excellens LAMA

842, teve seu crescimento ótimo na faixa de 20 a 25ºC, sem diferença estatística entre

estas duas temperaturas. Ambas as espécies cresceram somente a partir de 15°C,

portanto essa pode ser classificada como a temperatura mínima para o crescimento

das bactérias utilizadas neste estudo (Figura 1).

O segundo parâmetro testado foi o substrato Tween20, em quatro

concentrações diferentes, a fim de se identificar, entre estas, qual seria a mais

favorável ao crescimento de H. sulfidaeris LAMA 838 e M. excellens LAMA 842. De

acordo com os resultados obtidos, H. sulfidaeris LAMA 838 teve um incremento na sua

taxa de crescimento conforme o aumento das concentrações. Logo, a melhor

concentração de Tween20 para esta espécie é de 1%, e aquela em que o organismo

teve sua menor taxa de crescimento foi a 0,001%, ambas com significância estatística.

M. excellens LAMA 842, no entanto, apresentou um comportamento diferente se

comparada com H. sulfidaeris. Os valores obtidos para M. excellens não diferiram

estatisticamente entre si, ou seja, não houve grandes variações nas taxas de

crescimento entre os valores de concentração testados (Figura 2).

16

Figura 1. Crescimento dos micro-organismos H. sulfidaeris LAMA 838 e M. excellens LAMA 842, em

função da temperatura. O crescimento foi avaliado em caldo marinho suplementado com Tween20 a 1%.

Os valores plotados representam as médias aritiméticas de triplicatas para cada temperatura testada, e as

barras representam o desvio padrão.

Figura 2. Crescimento dos micro-organismos H. sulfidaeris LAMA 838 e M. excellens LAMA 842, em

função da concentração de Tween20. Os micro-organismos foram cultivados por um dia em caldo

marinho, a 30ºC (H. sulfidaeris LAMA 838) e entre 20 e 25ºC (M. excellens LAMA 842). Os valores

plotados representam as médias aritiméticas de triplicatas para cada concentração testada, e as barras

representam o desvio padrão.

17

Os resultados obtidos a partir do cálculo da taxa de crescimento foram

analisados com o auxílio do software Statistica® versão 6.0. Então foi observado que,

no parâmetro temperatura, o crescimento de H. sulfidaeris LAMA 838 apresentou

diferença significativa no experimento de 15 a 25°C e M. excellens LAMA 842 não teve

diferença significativa entre 20-25°C, sendo esta sua faixa ideal. Quanto a

concentração de substrato, por meio da análise estatística verificou-se que os valores

na taxa de crescimento para H. sulfidaeris apresentaram diferença significativa. E para

M. excellens estes valores não diferiram estatisticamente entre si.

18

6.DISCUSSÃO

A partir da taxa de crescimento encontrada em diferentes temperaturas de

cultivo, (Figura 1) para as duas bactérias estudadas neste trabalho, nota-se que elas

apresentaram um comportamento bastante diferente entre si. H. sulfidaeris LAMA 838

teve seu crescimento aumentado, conforme o aumento da temperatura, o que mostra

que o organismo tem uma preferência por ambientes mais quentes. Já M. excellens

LAMA 842 apresentou um crescimento constante até certo ponto, tendo sua taxa de

crescimento diminuída a partir de uma determinada temperatura (30°C ou abaixo de

15ºC), sendo assim, pode-se dizer que esta bactéria cresce melhor em ambientes um

pouco mais frios.

De um modo geral, a temperatura ótima de crescimento para as bactérias do

gênero Halomonas, fica em torno de 20 a 35°C, e para H. sulfidaeris LAMA 838 não foi

diferente. Neste caso, a melhor temperatura encontrada, entre as testadas, foi de

30°C, concordando com os resultados apresentados por Kaye et al., (2004) que

estudaram a mesma espécie, isolada de fontes hidrotermais submarinas, e apresentou

a mesma condição de crescimento encontrada no presente trabalho. É importante

ressaltar que as temperaturas testadas nesta pesquisa vão de 5 a 30°C e por isso, não

é possível afirmar se condicionada a temperaturas mais altas, esta bactéria cresceria

melhor, pois já foram relatadas algumas espécies do gênero Halomonas capazes de

crescer a 40 - 50°C (MATA et al., 2002).

Para o gênero Marinobacter, a faixa ótima de temperatura encontrada em

alguns trabalhos também pode variar bastante. Em espécies como M. segnicrescens,

o crescimento ótimo ocorre entre 30 e 37°C (GUO et al., 2007) e para M.

goseongensis entre 25 e 30°C (ROH, et al., 2008), por exemplo. No caso de M.

excellens LAMA 842, a bactéria apresentou um resultado similar ao descrito na

literatura, tendo seu crescimento ótimo entre 20 e 25°C. Trabalhos como o de

Gorshkova et al. (2003), encontraram o mesmo resultado para M. excellens isolada a

partir de sedimentos presentes no mar do Japão. Apesar dos trabalhos aqui citados

indicarem as temperaturas ótimas encontradas para H. suldaeris e M. excellens, os

mesmos fazem uma avaliação qualitativa dos organismos, tendo como principais

objetivos a identificação e caracterização genética de novas espécies dos gêneros,

diferentemente desde trabalho, cujo objetivo é encontrar as melhores condições de

crescimento para as duas espécies a partir de testes com diferentes valores de

temperatura.

Nenhum dos micro-organismos estudados se multiplicou nas temperaturas

inferiores a 15ºC, ou seja 5 e 10ºC. Isso foi inesperado, uma vez que Kaye et al.

19

(2004) relata que H. sulfidaeris cresce entre -1 e 35ºC, enquanto Gorshkova et al.

(2003) relata que M. excellens cresce entre as temperaturas de 10 e 41ºC. Além de H.

sulfidaeris, no trabalho citado anteriormente, foram estudadas diversas outras

espécies do gênero Halomonas, cada qual apresentando uma faixa diferente de

temperatura para seu crescimento. Como por exemplo H. hydrothermalis, isolada a

partir de fluidos hidrotermais de baixa temperatura no Sul do Oceano Pacífico, cresce

entre 2 e 40°C , ou ainda H. venusta isolada da superfície da água do mar tropical,

crescendo entre 4 e 40°C (Kaye et al.,2004). Para o gênero Marinobacter, já foram

encontradas espécies capazes de crescer entre 10 e 50°C, como a M. alkaliphilus

isolada da área adjacente ao vulcão, South Chamorro Seamount (TAKAI et al., 2005)

como também M. psychrophilus isolada do gelo encontrado no mar, na Bacia do

Canadá, capaz de crescer entre 0 e 22°C (ZHANG et al., 2008).

As diferenças nos padrões de crescimento podem estar relacionadas com o

tempo e com o meio de cultura utilizado no cultivo. Neste trabalho, os experimentos de

5 e 10°C duraram cerca de 5 dias, o que pode ter sido tempo insuficiente para que as

bactérias pudessem crescer. Outro fator importante que pode explicar essa diferença é

a composição do meio de cultura utilizado, pois podem variar muito de um estudo para

outro. Tratando-se de um experimento com baixas temperaturas, é muito importante a

escolha do meio de cultura utilizado, pois o meio pode fornecer componentes

crioprotetores, que a bactéria usa para se adaptar ao frio e, assim, manter suas

atividades. Wang et al., (2006) por exemplo, utilizaram em seu cultivo água do mar

artificial suplementada com triptona, L-tirosina, glucose e glicina, e a composição do

meio de cultura usado neste trabalho consiste basicamente em caldo marinho

suplementado com Tween20, o que pode ter tornando o meio pouco protetor contra as

baixas temperaturas.

Além disso, vários autores relatam variações fisiológicas e genéticas em

linhagens de bactérias marinhas provenientes de diferentes habitats, reconhecendo a

existência de diferentes ecotipos para um mesmo organismo. Um bom exemplo é o

estudo realizado por Rebollar et al. (2012), que a partir da caracterização genética de

três populações distintas de Exiguobacterium, coletadas na bacia Cuatro Cienegas

(México), concluíram que a divergência genética e fisiológica entre os isolados é

moldada pelos fatores ecológicos associados a diferentes nichos, especificamente

água e sedimento. Concluí-se portanto, que os micro-organismos podem se adaptar

ao meio em que vivem e por isso, as diferenças observadas podem estar relacionadas

com o seu habitat de origem.

Na Figura 2, os resultados mostram a resposta dos micro-organismos quanto a

concentração de substrato (Tween20) oferecida. Apesar de H. sulfidaeris crescer

20

relativamente bem em baixas concentrações, ela apresentou sua maior taxa de

crescimento a partir de concentrações maiores de substrato (1%). Kaye et al. (2004),

já destacaram a capacidade de 4 espécies de Halomonas, incluindo H. sulfidaeris, de

crescer sobre os baixos níveis de carbono no ecossistema marinho e ainda oxidar uma

extensa variedade de compostos orgânicos, permitindo-lhes aproveitar de muitas

formas os nutrientes transitoriamente disponíveis.

Para M. excellens, ainda que os resultados obtidos mostrem uma leve

preferência por concentrações menores (0,001 e 0,01%), não ocorreram grandes

variações na taxa de crescimento, sugerido portanto que a bactéria já estava saturada

mesmo nas concentrações de substrato mais baixas (WHITE, 2000). A espécie

Sphingopyxis alaskensis apresentou um comportamento similar, sendo que sua taxa

de crescimento não muda entre o intervalo 0,8 a 800 mg/l de concentração de carbono

(CAVICCHIOLI et al., 2003). Sendo assim, pode-se dizer que M. excellens é um

organismo mais adaptado a ambientes pobres em nutrientes, logo, mais oligotrófico,

que H. sulfidaeris.

21

7.CONCLUSÃO

• As duas espécies de bactéria não conseguem crescer em temperaturas muito

baixas, podendo ser caracterizadas como micro-organismos mesófilos,

apresentando uma temperatura mínima de crescimento de aproximadamente

15°C e temperatura ótima para H. sulfidaeris em torno de 30°C e para M.

excellens de 20 a 25°C.

• Para H. sulfidaeris houve diferença significativa entre os valores de

concentração de substrato testados. A bactéria cresceu melhor na

concentração de 1%.

• M. excellens, não apresentou diferença significativa entre as concentrações de

substrato testadas, crescendo bem tanto em concentrações baixas como altas.

Trata-se, portanto, de um organismo mais oligotrófico que H. sulfidaeris.

22

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25

APÊNDICES

Apêndice1. Níveis de significância da ANOVA para taxa de crescimento em função da

temperatura.

LAM

A 8

38, 1

5°C

LAM

A 8

38, 2

0°C

LAM

A 8

38, 2

5°C

LAM

A 8

38, 3

0°C

LAM

A 8

42, 1

5°C

LAM

A 8

42, 2

0°C

LAM

A 8

42, 2

5°C

LAMA 838, 20°C 0,000179 LAMA 838, 25°C 0,000175 0,011058 LAMA 838, 30°C 0,000175 0,000177 0,012405 LAMA 842, 15°C 0,250562 0,001006 0,000175 0,000175 LAMA 842, 20°C 0,000431 0,552775 0,000421 0,000175 0,036563 LAMA 842, 25°C 0,000235 0,927762 0,001247 0,000175 0,008596 0,993510 LAMA 842, 30°C 0,095252 0,002790 0,000175 0,000175 0,998716 0,106269 0,026335

Apêndice 2. Resultados para a ANOVA, para os experimentos de crescimento em

função da temperatura.

SS Graus de liberdade MS F p Intercepto 1,801816 1 1,801816 992,1004 0,000000 Temperatura 0,745832 7 0,106547 58,6662 0,000000 Erro 0,029059 16 0,001816

Apêndice 3. Níveis de significância da ANOVA para taxa de crescimento em função da

temperatura.

LAM

A 8

38; 0

,001

LAM

A 8

38; 0

,01

LAM

A 8

38; 0

,1

LAM

A 8

38; 1

LAM

A 8

42; 0

,001

LAM

A 8

42; 0

,01

LAM

A 8

42; 0

,1

LAMA 838; 0,01 0,021358 LAMA 838; 0,1 0,000186 0,002586 LAMA 838; 1 0,000185 0,000185 0,000196 LAMA 842; 0,001 0,000185 0,000185 0,000185 0,000185 LAMA 842; 0,01 0,000185 0,000185 0,000185 0,000185 1,000000 LAMA 842; 0,1 0,000185 0,000185 0,000185 0,000185 0,821232 0,815600 LAMA 842; 1 0,000185 0,000185 0,000185 0,000185 0,946660 0,943796 0,999952

26

Apêndice 4. Resultados para a ANOVA, para os experimentos de crescimento em

função da concentração de Tween20.

SS Graus de liberdade MS F p Intercepto 0,986128 1 0,986128 3896,166 0,000000 Tween20 0,579367 7 0,082767 327,009 0,000000 Erro 0,003543 14 0,000253

Apêndice 5. Curvas de calibração elaboradas no presente trabalho

Curva Coeficiente Angular Intercepto R2

Concentração de células, LAMA 838 3*10-11 0,0327 0,9776

Concentração de células, LAMA 842 5*10-11 -0,0439 0,9999