produção de ectoína por bactérias halofílicas do gênero...
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Produção de Ectoína por Bactérias Halofílicas
do Gênero Halomonas
Carina Heigl
Orientador
Prof. Nei Pereira Jr.
Setembro de 2016
ii
Produção de Ectoína por Bactérias Halofílicas do
Gênero Halomonas
Carina Heigl
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de
Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química, Universidade Federal do Rio de
Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em
Ciências (MSc.).
Rio de Janeiro, 08 de Setembro de 2016
_________________________________________________________
Nei Pereira Jr., PhD (DEB/EQ-UFRJ) - Orientador/Presidente
_________________________________________________________
Alane Beatriz Vermelho, DSc. – Instituto de Microbiologia/UFRJ
_________________________________________________________
Flávia Duta Pimenta, DSc – SENAI-CETIQT
_________________________________________________________
Ivaldo Itabaiana Junior, DSc - Escola de Química /UFRJ
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
iv
“Alles is overall: maar het milieu selecteert”
“Everything is everywhere: but the environment selects”
Lourens Baas Becking
v
AGRADECIMENTOS
Aqueles que estão ao meu lado durante todo esse percurso, me provendo com
apoio, compreensão e carinho. A minha família (pai, mãe e irmãos) e meu namorado.
Especialmente meu pai, que sempre se mostrou interessado no meu trabalho, me
ajudando sempre que precisei e que é meu exemplo de dedicação e realização. E ao meu
namorado, que me ajudou na distância de casa, nos compromissos que tive e tenho, e a
manter a cabeça sã e os pés no chão. Na distância, ao meu avô, que está na Alemanha,
mas sempre me deixou orgulhosa pelo meu trabalho, por ter realizado algo similar
quando novo;
Ao professor Nei Pereira Jr, que confiou em mim, me recebeu de braços abertos
e sempre me ouviu. Que me permitiu e ajudou a trilhar esse caminho novo, com todos
os cálculos e a necessidade de sair do modo “microbiológico” da pesquisa;
Aos colegas de laboratório, que sempre me mostraram prestativos e
companheiros, tomando conta da autoclave quando necessário, e tornando o dia-a-dia
do laboratório algo prazeroso. Alguns nomes merecem evidência, mas nenhum de vocês
estão ausentes do agradecimento. Aos estagiários, principalmente Diogo Marques, que
sempre foi prestativo em me ajudar, e principalmente, em lavar as vidrarias. Ao Douglas
de França, que sempre me ouviu e parou para me ajudar. Ao Luiz Felipe (vulgo,
Modestov) e Fabio Andrade, por alegrarem meus dias com as palhaçadas e brincadeiras,
mas sendo sérios quando há necessidade. Ao meu ex-companheiro de projeto, Rodrigo
Pimentel, que abandonei para pesquisar algo que me fascina, mas nunca deixei de lado.
A Ana Pantoja, colega de profissão, que me ajudou a contornar as dificuldades das
biólogas no mundo da engenharia. A Johanna Méndez, com seu carinho e truculência
suficiente para assistir mas nos fazer aprender. A Carol Barcelos, que faz uma falta.... E
principalmente, a Isis Mendes, por sua dedicação e força de vontade em quantificar
minha amostras, solucionando problemas e nunca medindo esforços, e o carinho pelas
coisas pessoais;
Aos amigos que fiz durante o mestrado, durante as disciplinas e até depois disso.
Alanna, Vanessa, André, Gabi e Dani. Obrigada;
A Universidade Federal do Rio de Janeiro, minha casa desde 2009, e um local
que foi responsável por boa parte do meu crescimento, pessoal e profissional. Um lugar
lindo, com uma história linda, e que espero que possa trazer essa satisfação para muitos
outros;
Aos meus amigos de outrora, que estão comigo há tempos e alguns que ficam
zonzos quando paro para contar sobre meu projeto. Paulo Alves, Maria Luiza, Elissa,
Larissa, Poliana, Nina. As minhas roomies do mestrado, Babi, Carol, e Dani! Obrigada.
vi
RESUMO
Heigl, Carina. Produção de Ectoína por Bactérias do Gênero Halomonas.
Dissertação de Mestrado. Escola de Química - Universidade Federal do Rio de
Janeiro, 2016.
Orientador: Nei Pereira Jr.
Ectoína é um soluto compatível que protege até mesmo células inteiras contra os
efeitos deletérios do dessecamento, congelamento e aquecimento, tendo assim
aplicações em diversos segmentos da indústria, como a de cosméticos, farmacêutica e
de biotecnologia. O gênero Halomonas tem apresentado resultados promissores pelos
altos valores de produtividade e a facilidade da técnica de obtenção do produto. A
produção industrial química não é viável, pois apresenta diversos empecilhos como
custo de precursores, a baixa qualidade do produto e a grande formação de co-produtos.
No processo biotecnológico é empregado microrganismo de fácil manuseio e robustez, e
reagentes de custo e toxicidade menores que os utilizados na síntese química. Porém
ainda é necessário sobrepor certos limitantes, como as altas concentrações de sal, que
causam problemas em equipamentos e limitam o crescimento celular, tornando assim as
concentrações de produto mais baixas. Desta forma, o objetivo geral desta dissertação
de mestrado foi desenvolver um bioprocesso capaz de produzir ectoína com valores de
rendimento e produtividade volumétrica e específica que sejam atrativos sob o ponto de
vista industrial. Inicialmente, os estudos realizados focalizaram na escolha da cepa mais
apropriada ao processo, levando em consideração parâmetros como simplicidade do
meio, tempo de cultivo e concentração de sal necessária mais baixa para que ocorra o
choque hiperosmótico. A metodologia do planejamento experimental de delineamento
composto central rotacional foi empregada, avaliando as concentrações de glutamato
monossódico, cloreto de sódio e de fosfatos, tendo sido todas estas substâncias
relevantes para a síntese de ectoína. Após a otimização das concentrações desses
componentes do meio de fermentação, outras condições também foram analisadas,
sendo demonstrado que a aeração é um fator limitante para a produção do soluto
compatível, que foi estudada mais detalhadamente, devido à necessidade de obtenção de
altas concentrações celulares e às características estritamente aeróbicas da espécie.
Assim, investigou-se a produção de ectoina em biorreator instrumentado, empregando-
se altas velocidades de agitação e vazões de ar a fim de se identificar o melhor
suprimento de oxigênio. A produtividade de ectoína apresentou um aumento de
aproximadamente 20 vezes, passando de 0,011g/L.h para 0,238g/L.h, quando a taxa de
areação foi controlada a 2,5 vvm, resultando em concentrações finais de ectoína ao
redor de 4,7 g/L. Com fatores de rendimento de produto por célula superiores a 0,8 g/g,
é possível observar um grande avanço se comparado aos resultados reportados na
literatura, que apresentam fatores de rendimento de cerca de 0,25 g/g. Estudos
avançados com o intuito de suprimir a conversão de ectoína em hidroxiectoína e
aumentar a taxa de secreção da molécula, bem como avaliar outras formas de condução
do bioprocesso foram apontados como sugestões para continuidade do desenvolvimento
da tecnologia para a produção de ectoína.
Palavras-chave: Ectoína, soluto compatível, Halomonas, bioprocessos, bactérias
halofílicas.
vii
ABSTRACT
Heigl, Carina. Ectoine Production by Halophilic Bacterias from genus Halomonas.
Dissertação de Mestrado. Escola de Química - Universidade Federal do Rio de
Janeiro, 2016.
Orientador: Nei Pereira Jr.
Ectoine is a compatible solute that provides cell protection against the
deleterious effects of desiccation, freezing and heating, with applications in several
industry segments, such as cosmetics, pharmaceuticals and biotechnology. The genus
Halomonas has been regarded as promising with respect to ectoine production due to
the high values of productivity reported in previous works, as well as to the easy
technique described for obtaining the product. Chemical industrial production is not
viable since it presents several drawbacks, represented mainly by the cost of the
precursors, the low product quality and the large formation of by-products. With regards
to the biotechnological process, however, some advantages can be pointed out: the
microorganism used is robust and easy to handle and the reagent cost and the toxicity
are lower when compared to the chemical synthesis. Nevertheless, some obstacles still
ought to be surmounted, such as those concerning the high salt concentrations required,
which may cause problems in the equipments and is responsible for limiting cell
growth, lowering the product concentration. The general objective of this master's thesis
was to develop a bioprocess capable of producing ectoine with values of yield,
volumetric and specific productivity that are attractive from the industrial point of view.
Initially, studies focused on the choice of the most appropriate microorganism strain,
taking on account relevant parameters such as medium composition, cultivation time
and salt concentration that leads to the hyperosmotic stress necessary for ectoine
production. A Central Composite Rotatable Design was used for modeling and
optimizing the process through the evaluation of monosodium glutamate, sodium
chloride and phosphate concentrations, all of these substances which play an important
role in ectoine synthesis. Once these parameters were optimized, other conditions were
also analyzed and it was demonstrated that aeration is a limiting factor for the
production of ectoine. Thus, ectoine production was investigated in instrumented
bioreactors, using high levels of both stirring speed and air flow in order to identify the
best supply of oxygen. Ectoine productivity increased by about 20 times, from 0.011g /
L.h to 0.238g / L.h at 2.5 vvm air flow rate, reaching final ectoine concentrations
around 4.7 g / L, along with a product yield per cell factor (YP/X) higher than 0.8 g / g.
These results represent a great improvement over those previously reported in the
literature, which reached yield factors around 0.25 g / g. Advanced studies aiming at
suppressing ectoine conversion into hidroxiectoine, besides increasing secretion rate of
the molecule were identified as suggestions for further development of this
biotechnology.
Key-words: Ectoine, compatible solute, Halomonas, bioprocess, halophilic bacteria.
viii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................................... 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................................... 3
2.1 BACTÉRIAS E SUA MEMBRANA CELULAR ............................................................................................... 3 2.2 BACTÉRIAS EXTREMÓFILAS ................................................................................................................. 6 2.3 BACTÉRIAS HALOFÍLICAS E SEUS MÉTODOS DE SOBREVIVÊNCIA ............................................................. 8
2.3.1 Método “Salt-in” .......................................................................................................................11 2.3.2 Método “Salt-out” .....................................................................................................................11
2.4 SOLUTOS COMPATÍVEIS ......................................................................................................................13 2.4.1 Ação .........................................................................................................................................14
2.5 ECTOÍNA E HIDROXIECTOÍNA ..............................................................................................................16 2.5.1 Via Metabólica ..........................................................................................................................17 2.5.2 Vias de Transporte.....................................................................................................................23 2.5.3 Tecnologia de Produção de Ectoína............................................................................................25 2.5.4 Aplicações Diretas e Indiretas ....................................................................................................30
2.5.4.1 Efeitos na estrutura proteína e na estabilidade enzimática ....................................................................................... 31 2.5.4.2 Efeitos na estrutura de DNA .................................................................................................................................. 32 2.5.4.3 Potenciais aplicações biomédicas de Ectoínas ......................................................................................................... 32 2.5.4.4 Efeitos de proteção celular ..................................................................................................................................... 35
2.6 OUTROS PRODUTOS DECORRENTES DA ATIVIDADE DE HALOMONAS: PHB ..............................................36 2.7 CONSIDERAÇÕES FINAIS .....................................................................................................................39
3 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS .......................................................................................................41
3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................................................42 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................................................42
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................................44
4.1 MICRORGANISMO E INÓCULO ..............................................................................................................44 4.2 CURVAS DE ATIVAÇÃO .......................................................................................................................47
4.2.1 Halomonas salina ......................................................................................................................48 3.2.2 Halomonas elongata ..................................................................................................................48 4.2.3 Halomonas boliviensis ...............................................................................................................49
4.3 ANÁLISE DAS AMOSTRAS ....................................................................................................................49 4.3.1 Amostragem dos experimentos ..................................................................................................49 4.3.2 Quantificação de biomassa.........................................................................................................50 4.3.3 Quantificação do substrato de produtos do bioprocesso – Métodos Analíticos .............................52
4.4 FERMENTAÇÃO EM FRASCO AGITADOS................................................................................................52 4.5 FERMENTAÇÃO EM REATOR INSTRUMENTADO .....................................................................................53
4.5.1 Biorreator de 2 L .......................................................................................................................53 4.5.2 Biorreator de 4 L .......................................................................................................................53
4.6 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL .........................................................................................................54 4.6.1 Validação da otimização experimental .......................................................................................56
4.7 “ORDENHA BACTERIANA” ..................................................................................................................56 4.8 VARIÁVEIS DE RESPOSTA ....................................................................................................................56
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...........................................................................................................58
5.1 CURVAS DE ATIVAÇÃO ................................................................................................................58 5.2 ESCOLHA DA CEPA ..............................................................................................................................60 5.3 AVALIÇÃO DA NECESSIDADE DE PREPARO DE PRÉ-INÓCULO DA CEPA SELECIONADA ..............................61
ix
5.4 “ORDENHA BACTERIANA” ..................................................................................................................63 5.4.1 Frascos cônicos agitados ............................................................................................................63 5.4.2 Frascos cônicos agitados com chicanas ......................................................................................64
5.5 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL .........................................................................................................65 5.6 FERMENTAÇÃO EM FRASCOS AGITADOS SEM E COM CHICANAS ............................................................69 5.7 AVALIAÇÃO DO GRAU DE AERAÇÃO EM BIORREATOR AGITADO MECANICAMENTE PARA
PRODUÇÃO DE ECTOÍNA ...................................................................................................................................71 5.8 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................................77
6 CONCLUSÕES E SUGESTÕES ..........................................................................................................79
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................................................................81
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DAS ESTRUTURAS DA SUPERFÍCIE CELULAR DE
BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS. ............................................................................... 4
FIGURA 2: RESPOSTA CELULAR EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SAL. (A)
CRESCIMENTO BALANCEADO ................................................................................... 5
FIGURA 3: MECANISMO DE ESTABILIZAÇÃO DE SOLUTOS COMPATÍVEIS. MODELO DE
EXCLUSÃO PREFERENCIAL ..................................................................................... 15
FIGURA 4: ESTRUTURA QUÍMICA DAS MOLÉCULAS QUÍMICAS DE ECTOÍNA E
HIDROXIECTOÍNA. ................................................................................................. 17
FIGURA 5: VIA PARA A SÍNTESE DE ECTOÍNAS EM H. ELONGATA. .................................... 18
FIGURA 6: VIA SECUNDÁRIA PARA A SÍNTESE DE HIDROXIECTOÍNA. ............................... 19
FIGURA 7: INFLUÊNCIA DA FONTE DE CARBONO NA CONCENTRAÇÃO CELULAR E
CONCENTRAÇÃO DE ECTOÍNA INTRACELULAR EM B. EPIDERMIS. ............................. 20
FIGURA 8: ACÚMULO DE ECTOÍNAS POR C. SALEXIGENS E OS MECANISMOS DE CONTROLE
TRANSCRICIONAIS. ................................................................................................ 21
FIGURA 9: VIA CATALÍTICA DE ECTOÍNA EM H. ELONGATA. ............................................ 23
FIGURA 10: ESTRUTURA DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO COM ALTA AFINIDADE POR ECTOÍNA
(TEAA)................................................................................................................. 24
FIGURA 11: SEQUÊNCIA DE REAÇÕES PARA A SÍNTESE QUÍMICA DE ECTOÍNA. ................. 26
FIGURA 12: DIAGRAMA DO PROCESSO DE ORDENHA BACTERIANA, PARA A PRODUÇÃO DE
ECTOÍNA PELA BACTÉRIA H. ELONGATA. ................................................................ 28
FIGURA 13: ECTOÍNA E SEUS DERIVADOS QUÍMICOS. ..................................................... 30
FIGURA 14: ESTRUTURA GENÉRICA DE POLI-HIDROXI-ALCANOATOS.. ............................ 37
FIGURA 15: VIA PARA A SÍNTESE DE PHB. .................................................................... 38
FIGURA 16: DIFERENTES REPRESENTAÇÕES DE GRÂNULOS DE PHB. .............................. 39
FIGURA 17: MICROSCOPIA DE HALOMONAS SALINA APÓS A ATIVAÇÃO E DURANTE O
CRESCIMENTO EM FRASCO (COM AUMENTO DE 100 X). ........................................... 48
FIGURA 18: MICROSCOPIA DE HALOMONAS ELONGATA APÓS A ATIVAÇÃO E DURANTE O
CRESCIMENTO EM FRASCO (COM AUMENTO DE 100 X). ........................................... 49
FIGURA 19: MICROSCOPIA DE HALOMONAS BOLIVIENSIS APÓS A ATIVAÇÃO E DURANTE O
CRESCIMENTO EM FRASCO (COM AUMENTO DE 100 X). ........................................... 49
FIGURA 20: CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA HALOMONAS SALINA, COM R2= 0,9987. ......... 50
FIGURA 21: CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA HALOMONAS ELONGATA, COM R2= 0,9993. .... 51
FIGURA 22: CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA HALOMONAS BOLIVIENSIS, COM R2= 0,9995. .. 51
FIGURA 23: CROMATOGRAMAS PADRÃO PARA A DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE
(A) ECTOÍNA E (B) GLUTAMATO MONOSSÓDICO. ..................................................... 52
FIGURA 24: BIORREATOR INSTRUMENTADO, BIOFLO 310 (NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC).
............................................................................................................................ 54
FIGURA 25: CURVA DE ATIVAÇÃO DE H. SALINA DSM 5928. S0= 30G/L ......................... 59
FIGURA 26: CURVA DE ATIVAÇÃO DE H. ELONGATA DSM 2581. S0= 30G/L .................... 59
FIGURA 27: CURVA DE ATIVAÇÃO DE H. BOLIVIENSIS DSM 15516. S0= 30G/L ................ 60
FIGURA 28: CURVA DE PROPAGAÇÃO DE H. SALINA DSM 5928 ...................................... 62
xi
FIGURA 29: CINÉTICA DA FERMENTAÇÃO PARA PRODUÇÃO DE ECTOÍNA COM DOIS
TAMANHOS DE PRÉ-INÓCULO, 10 E 20% (V/V) ........................................................ 63
FIGURA 30: ECTOÍNA SECRETADA NATURALMENTE E A OBTIDA POR “ORDENHA
BACTERIANA” COM CÉLULAS CULTIVADAS EM FRASCOS CÔNICOS AGITADOS .......... 64
FIGURA 31: CONCENTRAÇÃO DE ECTOÍNA NO SOBRENADANTE E NA ORDENHA
BACTERIANA, EM FRASCOS CÔNICOS AGITADOS DOTADOS DE CHICANAS ................. 65
FIGURA 32: VALORES PREDITOS E VALORES EXPERIMENTAIS OBTIDOS NO PLANEJAMENTO
EXPERIMENTAL ..................................................................................................... 67
FIGURA 33: GRÁFICO DE PARETO, INDICANDO QUAIS VARIÁVEIS SÃO SIGNIFICATIVAS EM P
< 0,05. VARIÁVEL: ECTOÍNA. TRÊS FATORES E CINCO NÍVEIS.................................. 67
FIGURA 34: SUPERFÍCIE DE RESPOSTA PARA A SÍNTESE DE ECTOÍNA COM VALOR DA
CONCENTRAÇÃO DE FOSFATO FIXADO EM 21,6 G/L ................................................. 68
FIGURA 35: CINÉTICA DE PRODUÇÃO DE ECTOÍNA EM CONDIÇÕES OTIMIZADAS EM
FRASCOS AGITADOS SEM CHICANAS. ...................................................................... 69
FIGURA 36: GRÁFICO COMPARATIVO ENTRE FERMENTAÇÃO EM FRASCOS AGITADOS COM E
SEM CHICANAS, NO MEIO OTIMIZADO PELO DCCR ................................................. 70
FIGURA 37: CULTIVOS EM FRASCOS SEM E COM CHICANAS PARA A PRODUÇÃO DE
ECTOÍNA. .............................................................................................................. 71
FIGURA 38: PRODUÇÃO DE ECTOÍNA EM BIORREATOR INSTRUMENTADO (BIORREATOR I)
COM O MEIO DE FERMENTAÇÃO OTIMIZADO POR DCCR PARA H. SALINA DSM 5928,
COM TAXA DE AERAÇÃO DE 1,7 VVM E VELOCIDADE DE AGITAÇÃO DE 350 RPM ...... 72
FIGURA 39: FERMENTAÇÃO EM BIORREATOR INSTRUMENTADO (BIORREATOR II) COM O
MEIO DE FERMENTAÇÃO OTIMIZADO POR DCCR PARA H. SALINA DSM 5928, COM
TAXA DE AERAÇÃO DE 1,7 VVM E VELOCIDADE DE AGITAÇÃO VARIANDO COM O
TEMPO .................................................................................................................. 74
FIGURA 40: VISUALIZAÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR EM BIORREATOR INSTRUMENTADO
COM O MEIO DE FERMENTAÇÃO OTIMIZADO POR DCCR PARA H. SALINA DSM 5928,
COM AGITAÇÃO DE 350 RPM E TAXA DE AERAÇÃO DE 1,7 VVM (BIORREATOR I) E COM
AGITAÇÃO VARIANDO CONFORME TEMPO E TAXA DE AERAÇÃO DE 2,5 VVM
(BIORREATOR III) ................................................................................................. 76
FIGURA 41: FERMENTAÇÃO EM BIORREATOR INSTRUMENTADO (BIORREATOR III) COM O
MEIO DE FERMENTAÇÃO OTIMIZADO POR DCCR PARA H. SALINA DSM 5928, COM
TAXA DE AERAÇÃO DE 2,5 VVM E AGITAÇÃO VARIANDO CONFORME O TEMPO ......... 76
FIGURA 42: EVOLUÇÃO DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ECTOÍNA EM TERMOS DE
CONCENTRAÇÃO DE PRODUTO ............................................................................... 78
FIGURA 43: EVOLUÇÃO DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ECTOÍNA EM TERMOS DE
PRODUTIVIDADE VOLUMÉTRICA ............................................................................ 78
xii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. BACTÉRIAS HALOFÍLICAS E SUAS APLICAÇÕES.............................................. 10
TABELA 2: POTENCIAIS APLICAÇÕES BIOMÉDICAS PARA ECTOÍNA. ................................. 35
TABELA 3: POTENCIAIS APLICAÇÕES NA PROTEÇÃO CELULAR. ....................................... 36
TABELA 4: MEIO DE MANUTENÇÃO – DSM 593............................................................ 45
TABELA 5: MEIO DE ATIVAÇÃO; DE LANG ET AL., 2011 ................................................ 45
TABELA 6: MEIO DE FERMENTAÇÃO; DE LANG ET AL., 2011 .......................................... 45
TABELA 7: MEIO DE MANUTENÇÃO E DE ATIVAÇÃO – DSM 276 ................................... 46
TABELA 8:- MEIO DE MANUTENÇÃO – MARINE BROTH (DIFCO) + 6% NACL ................. 46
TABELA 9: MEIO DE ATIVAÇÃO; DE VAN-THUOC ET AL., 2010A .................................... 47
TABELA 10: VARIÁVEIS INDEPENDENTES E SUAS CONCENTRAÇÕES NO DCCR .............. 55
TABELA 11: MATRIZ EXPERIMENTAL DO DCCR............................................................ 55
TABELA 12: PRINCIPAIS VARIÁVEIS DE RESPOSTA DOS CULTIVOS DE ATIVAÇÃO ............. 60
TABELA 13: PROPORÇÃO ENTRE ECTOÍNA NO SOBRENADANTE (ECTEXT) E NA ORDENHA
BACTERIANA (BM) E AS CONCENTRAÇÕES MÁXIMAS DE ECTOÍNA (ECTEXT +
ECTBM) ............................................................................................................... 65
TABELA 14: CONDIÇÕES DO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL E RESULTADOS OBTIDOS. . 66
TABELA 15: VARIÁVEIS DE RESPOSTA DE FERMENTAÇÕES EM FRASCOS AGITADOS SEM E
COM CHICANAS. .................................................................................................... 71
TABELA 16: VARIÁVEIS DE RESPOSTA DOS FRASCOS CÔNICOS E O BIORREATOR
INSTRUMENTADO COM O MEIO OTIMIZADO, NAS CONDIÇÕES DE 350 RPM E 1,7 VVM. 73
TABELA 17: VARIÁVEIS DE RESPOSTA DO BIORREATOR INSTRUMENTADO COM AGITAÇÃO
DE 350 RPM E O BIORREATOR INSTRUMENTADO COM MAIORES AGITAÇÕES E TAXA DE
AERAÇÃO DE 1,7 VVM. .......................................................................................... 75
TABELA 18: VARIÁVEIS DE RESPOSTA DO BIORREATOR INSTRUMENTADO COM MAIORES
AGITAÇÕES E VAZÕES DE AR DE 1,7 (REATOR II) E 2,5 VVM (REATOR III), EM
DIFERENTES TEMPOS. ............................................................................................ 77
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
(L): Linear;
(Q): Quadrático;
µ: taxa específica de crescimento (h-1)
Abs: absorbância;
AD: Alzheimer Disease;
ATP: adenosida trifosfato;
Bacterial Milking: ordenha bacteriana, processo de choque hipo-osmótico;
BCCT: transportador Betaína-carnitina-colina;
BM: ordenha bacteriana;
DA: ácido L-diaminobutírico;
DCCR: Planejamento Experimental do Composto Central;
xiii
DNA: ácido desoxirribonucleico;
DSMZ: Deustsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen;
EctBM: ectoína secretada na ordenha bacteriana;
EctExt: ectoína extracelular, do sobrenadante;
g/L.dia: gramas por litro por dia;
g/L: grama por litro;
GC: Guanina e citosina;
GMS: Glutamato monossódico;
HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana;
HPLC: Cromatografia Líquida de Alta Performance;
I/R: isquemia e lesão de reperfusão subsequente;
kDa: quilo Dalton;
LADEBIO: Laboratório de Desenvolvimento de Bioprocessos;
LDH: lactato desidrogenase;
mg/L.dia: miligramas por litro por dia;
mL/min: mililitro por minuto;
mL: mililitro;
mM: mili molar;
mM: milimolar
MSA: aspartato monossódico;
NADA: N-γ-acetildiaminobutírico;
nm: namometros;
ºC: graus Celsius;
OMP: proteína de membrana externa tipo barril;
p/v: peso por volume;
pb: pares de bases;
PCR: reação em cadeia polimerase;
PHB: poli(3-hidroxibutirato);
PO4: Fosfato;
QP: produtividade volumétrica em produto;
QX: produtividade volumetria em células;
R2: Coeficiente de Determinação;
RNA: ácido ribonucleico;
rpm: rotações por minuto;
RSM: Metodologia de Superfície de Resposta;
S0: concentração inicial de substrato (g/L)
UV: ultravioleta;
v/v: volume por volume;
Vvm: volume de ar por volume de meio;
X: concentração celular (g/L);
Xmáx: concentração celular máxima (g/L);
YP/S: Fator de Rendimento de Substrato em Produto;
YX/P: Fator de Rendimento de Produto em Células;
YX/S: Fator de Rendimento de Substrato em Células;
1
1 INTRODUÇÃO
A ectoína é um soluto compatível, presente nos reinos Bacteria, Archaea e
Eukarya. Além do efeito osmoprotetor, também confere proteção para macromoléculas
e até mesmo células inteiras, contra os diversos efeitos deletérios do dessecamento,
congelamento e aquecimento. O gênero Halomonas apresenta resultados promissores, e,
por serem bactérias gram-negativas, é possível utilizar o “bacterial milking”, um choque
hipoosmótico que faz com que as células secretem o soluto, tornando a obtenção do
produto menos complexa. No processo biotecnológico ainda é necessário sobrepor
certos limitantes, como as altas concentrações de sal, que causam problemas em
equipamentos, assim como as baixas taxas de produção.
Logo, o desenvolvimento da produção desse soluto compatível, assim como a
aquisição de conhecimento para superar obstáculos foram desenvolvidos no Laboratório
de Desenvolvimento de Bioprocessos (LADEBIO), sob a coordenação do Prof. Dr. Nei
Pereira Jr.
2
Organização da dissertação
Para uma melhor orientação, a Dissertação encontra-se dividida nos seguintes
tópicos:
INTRODUÇÃO, fornecendo informações básicas e apresentando a
estrutura do texto.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA, onde estudos prévios direcionam o
desenvolvimento do projeto, e lacunas que se mostram vazias podem
ser preenchidas.
JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS, em que são ressaltadas as
motivações para a pesquisa e suas metas.
MATERIAIS E MÉTODOS, o qual descreve a metodologia utilizada nos
experimentos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO, com a apresentação dos resultados
obtidos e comentários acerca dos mesmos.
CONCLUSÕES E SUGESTÕES, que ressalta as principais contribuições
e resultados da pesquisa e, em seguida, diante da experiência adquirida
com os ensaios e das dificuldades encontradas, propõe alternativas.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, com a menção devida aos
trabalhos consultados que serviram de base para a dissertação
desenvolvida.
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Bactérias e sua membrana celular
Bactérias podem ser divididas em dois grupos principais, baseado nas
características observadas após a coloração de Gram: Gram-positiva ou Gram-negativa.
As diferenças são devido às estruturas da parede celular. Bactérias Gram-positivas
possuem uma grossa camada de peptideoglicana envolvendo a membrana
citoplasmática, enquanto as bactérias gram-negativas possuem uma pequena camada de
peptideoglicana, associada a uma membrana externa. Logo, a camada de
peptideoglicana em bactérias Gram-negativas está presente em um espaço chamado
periplasma, ou espaço periplasmático, em um ambiente com características hidrofílicas
(NARITA, 2011).
A membrana externa de bactérias Gram-negativas tem proteínas e lipídeos
distintos, e serve como uma barreira seletiva, permitindo que nutrientes entrem, mas
mantendo compostos tóxicos fora. É composta por uma bicamada lipídica, com
fosfolipídeos na face interna e lipopolissacarídeos (LPS) na face externa (NIKAIDO,
2003). Dois tipos de proteínas estão presentes nessa membrana externa, proteínas da
4
membrana externa tipo barril (OMP) e lipoproteínas (Figura 1). Essas proteínas tem
várias funções, incluindo manutenção do formato da célula, biogênese da membrana,
transporte de uma variedade de moléculas, transdução de sinais, mobilidade celular,
entre outros (NARITA, 2011).
Figura 1: Representação esquemática das estruturas da superfície celular de
bactérias Gram-negativas. Adaptado de Narita, 2011.
O crescimento celular normalmente é definido pelo aumento balanceado de
massa da célula, até que a massa atinge um valor crítico e se divide, e para que haja o
crescimento de bactérias, um fluxo de água controlado é necessário (Figura 2 – a).
Como as membranas bacterianas apresentam uma permeabilidade alta para a água e não
há mecanismos para o bombeamento de água entre o citoplasma e o ambiente, todo esse
fluxo é feito de forma passiva e responde aos gradientes de solutos. Assim, para garantir
o crescimento celular, as células acumulam solutos além do necessário pelos seus
metabolismos, exibindo assim uma pressão de turgor alta (NARITA, 2011). A pressão
de turgor consiste na força realizada pela expansão das moléculas de água presentes no
interior da célula (CSONKA, 1989). Mesmo em baixa osmolaridade como em
condições de depleção nutricional, a concentração de potássio que é um desses solutos,
se mantem próxima de 100-200 mM (EPSTEIN; SCHULZT, 1965). Essa concentração
se mantem pela presença do íon em diversas macromoléculas (como DNA, RNA e
proteínas) e também como íons ativos, como o glutamato, que provem para
intermediários de diversas vias metabólicas, como a glicólise, a via da pentose fosfato e
o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) (ROE et al., 1998).
5
Quando a concentração externa de sal é mais alta que a concentração do
citoplasma, uma condição de choque hiperosmótico é imposta, e faz com que a água que
está presente no citoplasma saia das células, até que haja um balanço dessas
concentrações. Isso resulta na perda do turgor, e pode haver encolhimento do citoplasma
(Figura 2 - b) (DELAMARCHE et al., 1999). Para restaurar o turgor há o acumulo de
solutos (BOOTH et al., 1988; EPSTEIN, 1986; MORBACH; KRÄMER, 2002), mas
muitas vezes essa não é a condição mais apropriada para atividade enzimática e assim
pode causar um crescimento debilitado, levando ao estresse celular por alterações do
metabolismo (DODD et al., 1997). Na condição contrária, com concentração externa de
sal inferior a concentração intracelular, há uma entrada de água rápida na célula, e para
compensar, pode haver a liberação de solutos por canais mecanosensíveis (BOOTH;
BLOUNT, 2012; MORBACH; KRÄMER, 2002), desregulando assim o balanço de
solutos e água da célula, e sua estrutura (Figura 2 – c). Com a pressão de turgor
aumentando rapidamente, a parede de peptidoglicana, apesar de semi-elástica (YAO et
al., 1999), pode acabar sofrendo ruptura e assim causar a lise celular (LEVINA et al.,
1999). Tais respostas podem ser ilustradas na imagem abaixo:
Figura 2: Resposta celular em diferentes concentrações de sal. (a) crescimento
balanceado, (b) estresse hiperosmótico e (c) estresse hipoosmótico. As setas
indicam o fluxo de água ou solutos, o que causa do desbalanço celular. Note que há
alterações no volume celular nos sistemas (b) e (c) (BYRNE; BOOTH, 2002).
6
Logo, a osmorregulação consiste no controle de influxo e efluxo de solutos da
célula, fazendo com que haja a movimentação de água, que ocorre essencialmente de
forma passiva. O controle delicado mostra que há a necessidade de uma modulação dos
sistemas de transportadores e de enzimas, assim como a regulação da expressão gênica
(KEMPF; BREMER, 1998). Há um interesse muito grande na osmorregulação pela
indústria alimentícia, pois tem se mostrado um mecanismo para superar os métodos
preservativos utilizados há tempos, onde é aplicada baixíssima atividade de água
(BYRNE; BOOTH, 2002).
2.2 Bactérias Extremófilas
Microrganismos extremófilos são aqueles que habitam ambientes que, para a
maioria dos seres vivos, são extremos, pelo pH, temperatura, salinidade, pressão e a
combinação de tais fatores. Quando vivem em combinação de condições extremas,
esses microrganismos são chamados poliextremófilos, e nessa classificação podemos
identificar todos os três domínios da vida, Archaea, Bacteria e Eukarya (MESBAH;
WIEGEL, 2008). Desde seu descobrimento, as características fisiológicas e sua
capacidade de adaptação atraíram muito interesse pela sua potencialidade
biotecnológica. Um exemplo foi a aplicabilidade da Taq polimerase, enzima utilizada
no processo de reação em cadeia polimerase (polymerase chain reaction – PCR), pois
seus ciclos apresentam alterações de temperatura, chegando próximo de 100ºC, o que
causa a desnaturação de enzimas “comuns”. Essa enzima foi isolada do extremófilo
Thermus aquaticus, em 1969 por Thomas D. Brock e Hudson Freeze em fontes termais
no Parque Nacional Yellowstone (BROCK; FREEZE, 1969), sendo então resistente a
tais temperaturas. Assim, foi possível automatizar o PCR, o que resultou no
sequenciamento de inúmeros genomas.
Quando observamos a capacidade de adaptação a altas concentrações de sal,
vemos que tal característica é muito importante, pois muitos organismos estão
susceptíveis as alterações de atividade de água no ambiente onde vivem, por situações
de seca e dilúvios (AVERHOFF; MÜLLER, 2010). Tais bactérias (halofílicas) também
apresentam outros fenômenos interessantes. A resistência térmica é altamente
relacionada à resistência osmótica. Muitos estudos mostram que a redução da atividade
de água leva a um aumento resistência térmica, como é possível ver para Lysteria
monocytogenes, que tem sua viabilidade associada ao estresse térmico suave (entre 56-
60 ºC), perdendo essa viabilidade com menos rapidez se cloreto de sódio for adicionado
7
ao sistema (ANDERSON et al., 1991; JUNEJA et al., 2014). O mesmo efeito protetor é
observado com Salmonela enteritidis, Escherichia coli O157;H7 (BLACKBURN et al.,
1997) e Staphylococcus aureus (SHEBUSKI; VILHELMSSON; MILLER, 2000).
Apesar de não termos a base molecular totalmente elucidada, é de se esperar que a haja
relação com a concentração intracelular de água. As moléculas de água que apresentam
mais colisões por causa do calor têm a habilidade de interagir com as proteínas e
acelerar a desnaturação. Com menor atividade de água, esse efeito fica afetado,
aumentando assim a termoestabilidade (CASTRO, 2000; KNUBOVETS et al., 1999).
Umas das maneiras de aumentar a adaptação dos microrganismos aos ambientes
são as mutações genéticas, recombinação intramolecular e/ou a transferência genética,
permitindo a troca de DNA entre microrganismos de diferente espécies. A transferência
horizontal oferece a vantagem de ganhar quantidades substanciais de informação
genética, por exemplo traços metabólicos, genes de resistência e determinantes de
patogenicidade (GOPHNA; CHARLEBOIS; DOOLITTLE, 2004; OCHMAN;
LAWRENCE; GROISMAN, 2000). Para microrganismos extremófilos, isso é
evidenciado pelo fato que mais de 20% dos genes bacterianos e mais de 40% dos genes
de arquea foram transferidos horizontalmente (BOUCHER et al., 2003;
DEPPENMEIER et al., 2002; EISEN, 2000; GOGARTEN; DOOLITTLE;
LAWRENCE, 2002; LAWRENCE, 1999; OCHMAN; LAWRENCE; GROISMAN,
2000; THOMAS; NIELSEN; N, 2005). Há também evidencias substanciais de
elementos móveis em bactérias alcalifílicas (TAKAMI et al., 2000) e de transferências
horizontais de genes de resistência em ambientes ácidos, em bactérias termoacidofílicas
(ANGELOV; LIEBL, 2006). Entre termofílicos e hipertermofílicos, é possível observar
transferências de DNA entre os domínios, uma vez que as bactérias Thermogata
maritima e Aquifex aeolicus apresentam 24 e 16,2 % de genes que aparentam ter sido
transferido de arqueas hipertermofílicas, respectivamente (ARAVIND et al., 1998;
NELSON et al., 1999). Muitos desses genes são traços termofílicos essenciais para a
sobrevivência no ambiente por elas habitado. Um exemplo é a girase reversa, uma
proteína específica de hipertermófilos (FORTERRE et al., 2000).
A transferência horizontal de genes é facilitada principalmente por três
mecanismos: conjugação, transdução e transformação. Essa última, que consiste na
captação e incorporação de DNA, acontece naturalmente e é o maior contribuinte para a
troca horizontal de informação genética entre bactérias, sendo um mecanismo muito
8
importante para a plasticidade genômica na evolução (CHEN; CHRISTIE; DUBNAU,
2005; CHEN; DUBNAU, 2003, 2004; LORENZ; WACKERNAGEL, 1994). E não
sendo restrito aos procariotos, se mostra um mecanismo muito versátil de transferência
de DNA, gerando diversidade genética, evolução dos traços metabólicos, espalhando
alelos vantajosos e mediando variações antigénicas.
2.3 Bactérias halofílicas e seus métodos de sobrevivência
Bactérias halofílicas são um grupo especializado que precisam de cloreto de sódio
para o crescimento (VENTOSA; NIETO; OREN, 1998), crescendo com taxas bem
semelhantes em diferentes concentrações de sal (0,5 – 2,5 M). Isso evidencia a
necessidade de lidar com a salinidade. Como modelo de estudo, a bactéria aeróbica
formadora de esporo, Halobacillus halophilus mostrou a dependência estrita da
presença de cloreto para o crescimento celular (CLAUS et al., 1983; ROESSLE;
MÜLLER, 1998), pois não houve crescimento em concentrações baixas de cloreto (0,2
M). Porém, ao ser adicionado mais cloreto, mantendo a osmolaridade do meio, o
crescimento é restaurado. Assim, o crescimento e também as taxas celulares se
mostraram estritamente dependentes do cloreto (ROESSLE; MÜLLER, 1998). Alguns
processos celulares são dependentes de cloreto, tendo sido identificados a germinação
de endósporos, a produção de flagelos e a mobilidade (ROESSLE; WANNER;
MÜLLER, 2000). Análises proteômicas indicaram que a ausência de cloreto inibe a
produção do componente estrutural do flagelo, a flagelina, assim como outras proteínas,
como a LuxS, um componente do sistema quórum sensing (SEWALD et al., 2007), e
análises de transcrição mostram a necessidade do Cl- para a expressão de fliC, o gene
que codifica para a síntese de flagelo. Assim, é possível observar a dependência do Cl-
para a expressão gênica e a produção de proteínas. Além disso, um transporte cloreto-
dependente foi identificado na captação de solutos compatíveis - a glicina betaína - para
superar os efeitos deletérios das altas concentrações de sal. Porém, seus transportadores
ainda não foram identificados (AVERHOFF; MÜLLER, 2010; ROESSLE; MÜLLER,
2001a).
Para a sobrevivência celular, é necessário que haja uma manutenção delicada no
turgor, e esses microrganismos desenvolveram duas estratégias principais para
contornar as consequências da perda de água. A primeira delas é chamada de estratégia
“salt-in-cytoplasm” (GALINSKI; TRÜPER, 1994; VENTOSA; NIETO; OREN, 1998),
e a segunda é chamada de “salt-out cytoplasm”, sendo largamente difundida e
9
evolucionariamente conservada nos três domínios filogenéticos (BOHNERT; NELSON;
JENSEN, 1995; KEMPF; BREMER, 1998; ROESSLE; MÜLLER, 2001b; SAUM;
MÜLLER, 2008). Alguns microrganismos apresentam as duas estratégias, podendo
citar Halobacillus halophilus (SAUM; MÜLLER, 2008). Isso pois assim é possível
avaliar a salinidade externa a fim de responder nos níveis transcricional, translacional e
de atividade enzimática para regular a quantidade de solutos compatíveis a serem
produzidos pela célula.
Apesar do fato de as bácterias crescerem em concentrações distintas de sal,
acumularem tipos distintos de solutos compatíveis e terem mecanismos moleculares
diferentes para o acúmulo dos mesmos, a resposta ao choque osmótico é basicamente a
mesma. Em baixa osmolaridade há o acúmulo de sais, principalmente o glutamato de
potássio. Com o aumento da osmolaridade, há uma sequência de respostas. A primeira
dela, a nível celular, é puramente física, onde a água sai do citoplasma, fazendo com
que a célula encolha. A primeira resposta fisiológica é o acúmulo de mais glutamato de
potássio no citoplasma. Porém, em altas concentrações desse sal, que se apresentam
inibitórias para funções enzimáticas, as células começam a próxima resposta, que
consiste no processo de acúmulo de solutos compatíveis (BYRNE; BOOTH, 2002). Tal
acúmulo permite que a célula diminua a concentração intracelular de sal, recuperando
assim a atividade enzimática e logo o seu metabolismo (POLLARD; WYN JONES,
1979; SUTHERLAND et al., 1986; WOOD, 2011).
As bactérias halofílicas sempre chamaram atenção da comunidade científica,
pela sua capacidade de crescimento em condições adversas, e também por estarem
presentes em vários alimentos, apesar das tentativas de conservação. Podemos listar o
uso de bactérias halofílicas e halotolerantes em diversos âmbitos (Tabela 1) (VAN-
THUOC, 2009):
10
Tabela 1: Bactérias halofílicas e halotolerantes e suas aplicações
Aplicações Cepas bacterianas Referências
Alimentos
Fermentados
Bacillus sp.
Lactobacillus lactis
Lactobacillys plantarum
Pediococcus halophilus
Tetragenococcus halophila
RÖLING; VERSEVELD,
1996;
VILLAR et al., 1985
Degradação de
Agentes Tóxicos
Bacillus cereus
Halomonas halodurans
Marinobacter
hydrocarbonoclasticus
Pseudomonas halodurans
Staphylococcus sp.
AZACHI et al., 1995;
HINTEREGGER;
STREICHSBIER, 1997;
MALTSEVA et al., 1996;
MCMEEKIN et al., 1993;
OREN et al., 1992;
ROSENBERG, 1983;
WARD; BROCK, 1978
Produção de Solutos
Compatíveis
Actinopolyspora halophila
Ectothiorhodospira
halochloris
Halomonas elongata
Marinococcus M52
Halomonas salina
Halomonas boliviensis
FRINGS; SAUER;
GALINSKI, 1995;
GALINSKI; PFEIFFER;
TRÜPER, 1985;
GUZMÁN et al., 2009;
MARGESIN; SCHINNER,
2001; SAUER;
GALINSKI, 1998;
VENTOSA; NIETO, 1995;
ZHANG; LANG;
NAGATA, 2009
Produção de
Exopolissacarídeos
Algumas bactérias do Gênero
Halomonas
Algumas cianobactérias
BÉJAR et al., 1998;
BOUCHOTROCH et al.,
2000; MARTÍNEZ-
CÁNOVAS et al., 2004;
MORENO et al., 1998;
SHAH; GARG;
MADAMWAR, 1999
Produção de poli-
hidróxido-alcanoato
Maioria do gênero Halomonas MATA et al., 2002;
QUILLAGUAMÁN;
DOAN-VAN, 2008;
QUILLAGUAMÁN et al.,
2005
Produção de
Biossurfactantes
Bacillus licheniformis JF-2
Bacillus licheniformis BAS50
(MARGESIN;
SCHINNER, 2001;
THOMAS et al., 1993;
YAKIMOV et al., 1995)
Produção de Enzimas Micrococcus halobius
Micrococcus varians
Vibrio costicola
Bacillus sp.
KAMEKURA, 1986;
ONISHI; MORI;
TAKEUCHI, 1983;
ONISHI; SONODA, 1979;
ONISHI, 1972
11
2.3.1 Método “Salt-in”
Essa estratégia consiste no acúmulo de íons inorgânicos, como K+ e Cl-, até que
a concentração interna se equipare à concentração externa (AVERHOFF; MÜLLER,
2010), e é típica de arqueas como Halobacteriaceae (LENTZEN; SCHWARZ, 2006),
bactérias halofílicas moderadas anaeróbicas da ordem Haloanaerobiales, e a bactéria
halofílica extrema Salinibacter ruber (OREN, 1999; OREN et al., 2002; ROBERTS,
2000). Esse método leva à pouca capacidade de adaptação, pois as enzimas e organelas
têm suas funções estritas aos ambientes com alta força iônica, pelos desdobramento e
atividade enzimáticas (PASTOR et al., 2010). Entre essas mudanças adaptativas
podemos citar as enzimas que apresentam resíduos ácidos, como ácido glutâmico e
ácido aspártico, sendo assim mais ácidas que as enzimas ortólogas dos organismos
mesofílicos (CHRISTIAN; WALTHO, 1962; COQUELLE et al., 2010; DENNIS;
SHIMMIN, 1997; LANYI, 1974; SAENGER, 1987). Esses resíduos são mais
hidratados e podem coordenar a organização da superfície da proteína (FROLOW et al.,
1996; MADERN; EBEL; ZACCAI, 2000). Sua substituição torna a proteína mais
hidrofílica e ajuda a prevenir colapso estrutural (EISENBERG; MEVARECH;
ZACCAI, 1992; LANYI, 1974; ZACCAI et al., 1989), e além disso, eles podem formar
pontes com resíduos básicos, como lisina e arginina, que estão posicionados
estrategicamente, provendo assim rigidez estrutural e mantendo a estrutura tri-
dimensional da proteína (DYM; MEVARECH; SUSSMAN, 1995; JAENICKE;
BÖHM, 1998). Em ambientes com força iônica mais baixa, essas proteínas costumam
desnaturar e mudar de conformação, fazendo assim com que não exerçam mais suas
funções (DENNIS; SHIMMIN, 1997).
2.3.2 Método “Salt-out”
Para superar o aumento da pressão osmótica, há o acúmulo de solutos
compatíveis, que são moléculas orgânicas pequenas, altamente solúveis, que podem ser
captadas ou sintetizadas e não interferem com o metabolismo central, mesmo se
acumuladas em altas concentrações (até 1-2 M) (BROWN, 1976). A quantidade de
moléculas distintas é bem limitada, pela necessidade de compatibilidade com as
macromoléculas e as funções celulares. Os solutos compatíveis das arqueas se
assemelham muito a estrutura dos solutos compatíveis das bactérias, sendo apenas
notável a presença de uma carga negativa neles (MARTIN; CIULLA; ROBERTS,
1999; ROESSLE; MÜLLER, 2001b). A captação e biossíntese são induzidas pela alta
12
salinidade ou alta osmolaridade, tanto no nível genético quanto proteico. As vias
biossintéticas de vários solutos compatíveis já foram descritas em bactérias e arqueas,
porém, pouco já foi elucidado sobre a sinalização pela salinidade e a transferência
desses sinais, nos níveis genético, enzimático ou de transportadores (AVERHOFF;
MÜLLER, 2010; WOOD et al., 2001). A importância desse conhecimento não é apenas
pelo acúmulo de tais moléculas, mas também pela reprogramação do metabolismo
celular e da estrutura, em geral. Poucos estudos foram realizados com microrganismos
halofílicos até agora, nos ilustrando a complexidade do processo (PASTOR et al., 2010;
PFLÜGER et al., 2007; STEIL et al., 2003; WEBER; JUNG, 2002). Um exemplo é a
arquea metanogênica não-halofílica Methanosarcina mazei, que consegue se adaptar até
800 mM NaCl, ao alterar diferentes funções celulares, incluindo vias protetoras
(transporte de soluto e biossíntese, importação de fosfato, exportação de íons de Na+) e
modificação das estruturas de DNA e superfície celular. Oitenta e quatro genes de
diferentes categorias funcionais, como o transporte de solutos e biossíntese, exporte de
Na+, resposta ao estresse, transporte de íons, fosfatos e proteínas, enzimas metabólicas,
proteínas regulatórias, sistemas de modificação genética e moduladores de superfície
celular se apresentaram fortemente expressos nas condições de alta salinidade. É
possível então observar que há uma resposta finamente controlada, com uma rede
altamente elaborada, que precisa conversar com outras diversas redes. Porém, é
necessário enfatizar que tais análises são ainda superficiais se levarmos em
consideração os conhecimentos que ainda não obtemos (AVERHOFF; MÜLLER, 2010;
ROESSLE; MÜLLER, 2002).
Essa estratégia tem como vantagem a característica de ser mais flexível e
adequada para diferentes concentrações de sal. A função primária é a adaptação as
alterações da osmolaridade extracelular, sendo então acumulados como consequência do
aumento da salinidade (SLEATOR; HILL, 2002). Normalmente, uma mistura de
diferentes osmólitos é produzida, tendo sua composição variada conforme o ambiente, a
duração do estresse osmótico, o nível de salinidade, a disponibilidade de substratos e a
fonte de carbono utilizada para o crescimento (AVERHOFF; MÜLLER, 2010;
PASTOR et al., 2010). Um exemplo é Halomonas elongata, que acumula
principalmente glutamato de potássio em salinidades intermediárias (0,5M NaCl), e
ectoína em maiores salinidades. Isso também se dá pelo tempo de resposta, permitindo
que haja uma proteção celular instantânea enquanto moléculas mais eficientes são
13
produzidas (KRAEGELOH; KUNTE, 2002), permitindo a sobrevivência em ambientes
com salinidade flutuante.
Para secretar os osmólitos, quando a pressão osmótica interna fica alta demais,
canais mecanossensíveis são ativados. O transporte não precisa de energia em forma de
ATP, ou gradiente eletroquímico. Estudos indicam que há três proteínas responsáveis
pela atividade de condução: MscL, canal mecanossensível de grande condutância;
MscS, canal de pequena condutância; e MscM, canal de condutância mínima
(BLOUNT; MOE, 1999; BLOUNT; SCHROEDER; KUNG, 1997; BOOTH; BLOUNT,
2012; SUKHAREV et al., 1997). Eles possuem grande capacidade de condutância,
diferente dos canais presentes em células eucariotas, e respondem a tensões na
membrana, reconhecendo propriedades biofísicas, como deformação da bicamada
lipídica (PEROZO et al., 2002).
2.4 Solutos Compatíveis
Como um modo de se adaptar a diferentes salinidades e outros estresses
ambientais, como temperatura, os microrganismos extremófilos produzem os chamados
solutos compatíveis. Tais moléculas são agrupadas em um número limitado de
componentes, que podem ser divididos em dois grandes grupos: 1) açúcares e polióis, e
2) α- e β-aminoácidos e seus derivados, incluindo metilalaminas (AVERHOFF;
MÜLLER, 2010). Elas são pequenas moléculas quimicamente diversas, podendo ser
zwitteriônica, sem carga ou aniônica. Alguns osmólitos, como a prolina, também são
componentes de vias metabólicas primárias (LENTZEN; SCHWARZ, 2006). Como
eles apresentam pouco efeito na força iônica citosólica, não há necessidade de
adaptações especiais dos sistemas intracelulares – enzimas e organelas – (BROWN,
1990; OREN, 1999).
Além da proteção celular, os solutos compatíveis também podem servir como
fonte de carbono, energia ou nitrogênio, como reserva intracelular ou presente no meio
pela liberação por outros microrganismos. Carboidratos como glicerol, glicosilglicerol,
trealose, sucrose, e aminoácidos, como prolina, glutamato e alanina, podem ser
utilizados (WELSH, 2000).
14
2.4.1 Ação
Há diferentes teorias sobre o mecanismo de ação dos solutos compatíveis em
ambientes com pouca água. A primeira é chamada de modelo de exclusão preferencial,
e foi proposto como um mecanismo global de estabilização proteica (ARAKAWA;
TIMASHEFF, 1985; TIMASHEFF, 2002) (Figura 3). Nesse modelo, a estrutura
terciária da proteína (representada em Figura 3 - a) em solução aquosa é estabilizada
pela presença de osmólitos (Figura 3 - b), formando um aglomerado de hidratação. Isso
faz com que haja uma compactação da estrutura terciária com área de superfície
diminuída (Figura 3 - c) (LENTZEN; SCHWARZ, 2006). Pela expulsão dos osmólitos
dos sítios de hidratação, o desnovelamento das proteínas precisa de energia adicional e é
termodinamicamente desfavorável (KURZ, 2008; LEE; TIMASHEFF, 1981). Assim, a
proteína é hidratada ao ocupar um volume menor, mantendo sua conformação nativa. Já
que a ação do soluto compatível não é relacionada com a superfície da proteína, a
atividade catalítica se mantem intacta (KOLP et al., 2006; LOUIS; GALINSKI, 1997).
O efeito “osmofóbico” desse modelo explica sua aplicação universal (BOLEN;
BASKAKOV, 2001), e é de grande relevância em soluções altamente concentradas e
em organismos que necessitam de altas concentrações intracelulares de osmólitos. Ao
contrário do efeito hidrofóbico, que faz com que aminoácidos apolares se agreguem no
interior da proteína, o efeito osmofóbico causa alterações na conformação da cadeira
principal, determinante para a estabilização proteica (BURG; FERRARIS, 2008).
Qualquer interação dos osmólitos com resíduos hidrofóbicos não supera o efeito
osmofóbico, ou interfere com o efeito hidrofóbico (ROBERTS, 2005). Foi observado
que metilaminas alteram a estrutura da água, causando uma maior organização e
ligações de hidrogênio mais fortes e, assim, causam a expulsão dos solutos (BENNION;
DAGGETT, 2004). Um estudo realizado mostrou que a ectoína não interage com a
proteína ou muda a estrutura, mas as propriedades do solvente (no caso, a água) são
alteradas, fazendo com que a difusão seja mais devagar (YU; NAGAOKA, 2004).
15
Figura 3: Mecanismo de estabilização de solutos compatíveis. Modelo de exclusão
preferencial, com a proteína em solução aquosa (a) e a formação do aglomerado de
hidratação (b) compactando a proteína (c); Figura de LENTZEN; SCHWARZ,
2006.
Já a teoria da substituição da água (CLEGG et al., 1982; CROWE et al., 1990)
foi desenvolvida na observação de que muitos organismos são capazes de perder até
50% da água presente na célula, e retomar atividade quando reidratados. Isso porque as
estruturas celulares são protegidas pelos solutos que são acumulados. Tal teoria é
contrária ao modelo apresentado anteriormente, uma vez que há a substituição da água
pelo soluto compatível, e parece se encaixar melhor em situações de atividade de água
extremamente baixa, enquanto o outro modelo é aplicável em faixas de concentração de
soluto mais variadas. Porém, a informação de maior relevância é que a afinidade dos
solutos para a água ou para a proteína depende da concentração, pesando para essa
teoria (KANIAS; ACKER, 2006). Por mais que tais teorias tenham conceitos contrários,
muitos estudos demonstram que não são excludentes, podendo haver as duas reações,
em situações distintas.
No estudo de Manzanera et al., 2004a, foi observado que a hidroxiectoína é
menos eficiente como protetor celular, se comparado com a trealose. Uma explicação
que acompanha a hipótese de substituição de água é o fato de a hidroxiectoína possuir
apenas uma hidroxila, enquanto trealose possui várias. E tais hidroxilas podem
substituir parcialmente as moléculas de água. Durante desidratações extensivas, há uma
16
ligação entre as hidroxilas da trealose com as proteínas, mantendo assim a conformação
e então, sua estabilidade. Além da ligação a proteínas, também há a ligação com
fosfatidilcolina, sugerindo um efeito estabilizante para camadas lipídicas (CROWE et
al., 1990).
2.5 Ectoína e Hidroxiectoína
Ectoína (ácido (4S)-2-metil-1,4,5,6-tetrahidropirimidina carboxílico)(ilustrada
na Figura 4) foi descoberta inicialmente por Galinski et al. (1985) em Halorhodospira
(anterior Ectothiorhodospira) halochloris, uma eubactéria fototrófica halofílica
extrema, isolada em Wadi Natrun, no Egito. Porém, após isso, tal substância foi
encontrada em várias bactérias halofílicas e halotolerantes, entre α- e γ-Proteobacteria e
Actinobacteridae, com algumas indicações também, porém mais limitadas, em β-, δ- e
ε-Proteobacteria, Firmicutes e Plantomycete (PASTOR et al., 2010). A capacidade de
acumular ectoína também é difundida entre microrganismos que não são capazes de
produzi-la, como Escherichia coli (JEBBAR et al., 1992), Bacillus subtilis (JEBBAR;
VON BLOHN; BREMER, 1997), Corynebacterium glutamicum (STEGER et al., 2004)
e Sinorhizobium melilotti (JEBBAR et al., 2005). É um aminoácido heterocíclico,
derivado parcialmente hidrogenado da pirimidina.
Seu derivado hidroxilado, a hidroxiectoína (ácido (4S,5S)-2-metil-5-hidroxi-
1,4,5,6-tetrahidropirimidina carboxílico) (também ilustrada na Figura 4) foi descoberto
em uma cepa de Streptomyces parculus produtora de actinomicina D (INBAR;
LAPIDO, 1988; LENTZEN; SCHWARZ, 2006) e está presente em várias cepas que
também produzem ectoína. É mais comum entre bactérias gram-positivas, incluindo
Nocardiopsis sp, Streptomyces griseolus, Brevibacterium linens e M. halophilus
(FRINGS; SAUER; GALINSKI, 1995; SEVERIN; WOHLFARTH; GALINSKI, 1992).
Sua proporção sempre aumenta quando há um aumento de temperatura, como
observado em Streptomyces, Halomonas elongata e Chromohalobacter salexigens. Isso
porque, apesar de ser quimicamente semelhante a ectoína, ela fornece características
protetoras adicionais, derivada da sua natureza hidroxilada. Uma ilustração nessa ação é
o fato de mutantes de C. salexigens que não possuem a enzima que faz a conversão da
ectoína em hidroxiectoína – a hidroxilase – serem termossensíveis (GARCÍA-ESTEPA
et al., 2006; MALIN; LAPIDOT, 1996; WOHLFARTH; SEVERIN; GALINSKI,
1990). Essa propriedade fez com que houvesse um aumento em processos específicos
17
focando na produção de hidroxiectoína (FRINGS; SAUER; GALINSKI, 1995;
SCHIRALDI et al., 2006).
Figura 4: Estrutura química das moléculas químicas de ectoína e hidroxiectoína.
Adaptado de MEFFERT, 2002.
Apesar da possibilidade de consumo de solutos compatíveis como fonte de
carbono, energia e nitrogênio, estudos mostram que o metabolismo de ectoína é menos
frequente. Sporosarcina pasteurii sintetiza e acumula ectoína mas não é capaz de
degradá-la (KUHLMANN; BREMER, 2002). O mesmo acontece com E. coli, que é
capaz de utilizar ectoína como um osmoprotetor, e hidroxiectoína como termo- e
osmoprotetor, mas não consegue catabolizá-las como fontes de carbono ou nitrogênio
(JEBBAR et al., 1992; MALIN; LAPIDOT, 1996).
2.5.1 Via Metabólica
As vias sintéticas para a produção das ectoínas (ectoína e seu derivado
hidroxilado, hidroxiectoína) foram estudadas em H. halochloris, Halomonas elongata
DSM 2581 (PETERS; GALINSKI; TRÜPER, 1990) e Halomonas elongata DSM 3043
(CÁNOVAS et al., 1997), essa última depois sendo reclassificada como
Chromohalobacter salexigens DSM 3043 (ARAHAL et al., 2001). A via biossintética
da ectoína está ilustrada abaixo (Figura 5). Ela começa pela fosforilação do L-aspartato
e compartilha as duas primeiras etapas enzimáticas com a biossíntese de aminoácidos da
família do aspartato: a conversão de L-aspartato em L-aspartato-fosfato pela aspartato
quinase (Ask), e a síntese de L-aspastato-β-semialdeído a partir de L-aspartato-fosfato,
catalisada pela L-aspartato-β-semialdeído dehidrogenase (Asd). Nesse intermediário
geral começa a rota específica da síntese de ectoína, com três etapas. Primeiro, L-
aspartato-β-semialdeído é convertido em ácido L-diaminobutírico (DA) (pela enzima
ácido L-diaminobutírico transaminase, EctB ou ThpB – proteína com 421 resíduos e
peso molecular de 46,1 kDa; que tem como co-fator K+) e então é acetilado em ácido N-
γ-acetildiaminobutírico (NADA) pela enzima ácido L-diaminobutírico acetil transferase
(EctA ou ThpA – proteína com 192 resíduos e peso molecular de 21,2 kDa). Por fim, a
18
condensação cíclica do NADA leva a formação da ectoína pela atividade da enzima
ectoína sintase (EctC ou ThpC – proteína com 137 resíduos e peso molecular de 15,5
kDa). Para a então síntese de hidroxiectoína, há a hidroxilação da ectoína pela ectoína
hidroxilase (EctD ou ThpD) (GARCÍA-ESTEPA et al., 2006; GRAMMEL, 2000;
KUNTE; LENTZEN; GALINSKI, 2014).
Figura 5: Via para a síntese de ectoínas em H. elongata. LysC/Ask: L-aspartato-
fosfato pela aspartato quinase; Asd: L-aspartato-β-semialdeído dehidrogenase;
EctB: ácido L-diaminobutírico transaminase; EctA: ácido L-diaminobutírico acetil
transferase; EctC: ectoína sintase, EctD: ectoína hidroxilase. Adaptado de
MEFFERT, 2002.
Porém, há uma via secundária para a síntese de hidroxiectoína, que não envolve
ectoína, utilizando o precursor NADA, sugerida para C. salexigens (Figura 6). Sua
primeira enzima mostra pouca afinidade pelo substrato NADA, como visto no trabalho
realizado por Cánovas et at., em 1999, no qual o mutante deficiente na EctC acumula tal
19
precursor. Isso indica que há pouca especificidade, ou que a condição aplicada no
estudo não era a mais ideal.
Figura 6: Via secundária para a síntese de hidroxiectoína. As enzimas envolvidas
são redutases, mas ainda não foram totalmente descritas. Adaptado de Pastor et
al., 2010.
Estudos genéticos identificaram os genes para a síntese de ectoína em diversas
bactérias. Nesses microrganismos, os genes ectABC se apresentam arranjados em um
operon, com algumas exceções (PASTOR et al., 2010). Porém, o gene ectD apresenta
posição bem variada entre os microrganismos estudados, podendo ser encontrado
distante ou incluso no operon. Há indícios que tais organizações exercem um papel
regulatório (LO et al., 2009). Mapeando os sítios de iniciação de transcrição do operon
de ectoína por RACE-PCR, foi possível identificar dois promotores upstream ao ectA: o
dependente de σ70 e o dependente do fator de transcrição osmoticamente induzido (σ38);
e um upstream do ectC: σ54, também encontrado em genes regulados por nitrogênio
(KUNTE; LENTZEN; GALINSKI, 2014; SCHWIBBERT et al., 2011).
Com intermediários como o aspartato-β-semialdeído e acetil-CoA, o cálculo de
rendimento teórico e o gasto energético pôde ser realizado. As condições utilizadas para
o cálculo foram as seguintes: glicose sendo assimilada pelas vias Embden-Meyerhof e
Entner Doudoroff, e o oxaloacetato a partir da fixação de CO2 ou pela glicólise
(KUHLMANN, 2002). O gasto energético é baixo, e a conversão do carbono da glicose
20
para a ectoína é de quase 100%, mostrando que a síntese de ectoína ocorre de forma
muito eficiente (MASKOW; BABEL, 2001).
Carboxilação do piruvato
EMP: C6H12O6 + 2 NH3 → C6N10O2N2
ED: C6H12O6 + 2 NH3 + 1 ATP → C6N10O2N2
Glicólise
EMP: 3C6H12O6 + 2 NH3 → 2C6N10O2N2 + 2CO2 + 4 ATP + 10NAD(P)H + 2 FADH2
ED: C6H12O6 + 2 NH3 + 1 ATP → 2C6N10O2N2 + 2CO2 + ATP + 10NAD(P)H + 2
FADH2
Porém, resultados indicam que glicose não é a fonte de carbono mais indicada
para a síntese de ectoína, pois favorece o crescimento celular sobre a síntese de ectoína.
No experimento realizado com a bactéria Brevibacterium epidermis, é possível observar
que, entre os três substratos utilizados – glutamato monossódico, Aspartato
monossódico e glicose - o glutamato monossódico foi o que apresentou uma maior
produção de ectoína (Figura 7)(ONRAEDT et al., 2005).
Figura 7: Influência da fonte de carbono na concentração celular e concentração
de ectoína intracelular em B. epidermis. Legenda: GMS – glutamato monossódico,
MSA – aspartato monossódico, Ect – ectoína. Adaptado de ONRAEDT et al., 2005.
Combinando as reações bioquímicas para a síntese de ectoína a partir de
aspartato, e de aspartato a partir de glutamato, foi possível chegar a reação total para a
síntese de ectoína a partir de glutamato monossódico, estando demonstrada abaixo:
4C5H9NO4 → C6N10O2N2 + 2C5H6O5 + 4CO2 + 2NH3
21
Assim, é possível chegar a taxa de produção teórica máxima, sendo essa de 0,21
mol ectoína/ mol glutamato monossódico (ONRAEDT et al., 2005; PETERS;
GALINSKI; TRÜPER, 1990).
Um modo de aumentar a produtividade de ectoína é a geração de cepas
engenheiradas, e para isso é muito importante termos conhecimento sobre a regulação
de tais genes. Estudos com o microrganismo modelo para gram-negativas, C.
salexigens, nos permitem afirmar que os níveis de ectoína e hidroxiectoína chegam ao
máximo na fase estacionária, sendo o acúmulo de ectoína regulado pela salinidade e o
acúmulo de hidroxiectoína regulado pela salinidade e temperatura (GARCÍA-ESTEPA
et al., 2006). A regulação é feita em parte em nível transcripcional, e vários estudos
sugerem que a transcrição dos genes da síntese de ectoína envolve vários promotores,
permitindo que o sistema seja regulado por vários fatores ambientais, como salinidade,
temperatura, osmólitos externos, entre outros (Figura 8) (CALDERÓN et al., 2004).
Diferentes estímulos ativam diferentes fatores de transcrição, indicando a célula o
estresse que está sendo sofrido, fazendo com que haja a resposta apropriada.
Figura 8: Acúmulo de ectoínas por C. salexigens e os mecanismos de controle
transcricionais. Adaptado de PASTOR et al., 2010.
22
Em condições de altas temperaturas, há indícios da produção de ectoína, porém,
a mesma não exerce um papel direito na termorresistência. Na verdade, não há o
acúmulo de ectoína na célula pois ela é convertida rapidamente em hidroxiectoína
(CALDERÓN et al., 2004; GARCÍA-ESTEPA et al., 2006). Em um estudo com C.
salexigens ΔectD, é possível observar que a bactéria perde sua termorresistência,
indicando também que essa enzima (ectoína hidroxilase) é a principal responsável pela
conversão de ectoína em hidroxiectoína (GARCÍA-ESTEPA et al., 2006). Se
comparada a captação, a produção de solutos compatíveis é energeticamente
desfavorável (OREN, 1999), sendo possível assumir que a captação de solutos
compatíveis é priorizada, e isso é confirmado no estudo de Calderón et al., de 2004
(CALDERON, 2004). No cultivo da C. salexigens com betaína não foi observada a
produção de ectoína quando houve o aumento da salinidade, mostrando também que a
presença de outros solutos compatíveis age como um supressor da transcrição
(PASTOR et al., 2010).
Em certas condições, ectoínas também servem como fonte de carbono e
nitrogênio, sendo metabolizadas e não acumuladas. Sinorhizobium meliloti consome
ectoína para produzir seus próprios solutos compatíveis, e H. halochloris, a bactéria
sulfúrica fototrófica onde ectoína foi inicialmente descrita, também consegue
catabolizá-la em condições de ausência de nitrogênio e substituindo-a por trealose como
soluto compatível, liberando assim nitrogênio para o crescimento celular (GALINSKI;
HERZOG, 1990). C. salexigens consome ectoína e hidroxiectoína quando em condições
osmóticas ótimas de crescimento (VARGAS et al., 2006).
Os genes para a degradação de ectoína (doeABX e doeCD – degradation of
ectoine) foram identificados, elucidando assim a via de degradação. Os genes doeA e
doeB estão juntos em um operon com um terceiro gene, chamado doeX, e com um
promotor σ70-dependente (SCHWIBBERT et al., 2011).O doeCD está adjacente ao
doeABX, mas não faz parte do mesmo. O gene doeX codifica uma proteína ligadora ao
DNA da família Asn/Lrp, mas ainda não tem sua função descrita no processo de
degradação de ectoína (KUNTE; LENTZEN; GALINSKI, 2014). Ectoína é clivada por
DoeA (ectoína hidrolase) formando ácido Nα-acetil-2,4-diaminobutírico (α-NADA) e
ácido Nγ-acetil-2,4-diaminobutírico (γ-NADA), porém, apenas α-NADA é deacetilado
por DoeB (Nα-acetil-2,4-diaminobutírico deacetilase) a ácido 2,4-diaminobutírico. O
ácido 2,4-diaminobutírico será então deaminado por DoeD (ácido 2,4-diaminobutírico
23
transaminase), formando aspartato semialdeído, que então é oxidado por DoeC
(aspartato semialdeído desidrogenase), produzindo aspartato. Tal via metabólica está
ilustrada na figura abaixo (Figura 9). Deleções do genes doeA, doeB ou doeC impedem
o crescimento celular utilizando ectoína como fonte de carbono (SCHWIBBERT et al.,
2011).
Figura 9: Via catalítica de ectoína em H. elongata. DoeA: ectoína hidrolase; DoeB:
Nα-acetil-2,4-diaminobutírico deacetilase; DoeD: ácido 2,4-diaminobutírico
transaminase; DoeC: aspartato semialdeído desidrogenase.
2.5.2 Vias de Transporte
A captação de ectoína parece ser realizada exclusivamente pelo sistema de
transporte periplasmático independente de ATP tripartido (TRAP) chamado TeaABC
(transporter for ectoine accumulation) (GRAMMANN; VOLKE; KUNTE, 2002), que
consiste em três proteínas: a proteína periplasmática ligadora de substrato (TeaA)
(Figura 10), a proteína transmembranar pequena (TeaB) e a proteína transmembranar
grande (TeaC). Os genes estão organizados em um operon (teaABCD), e teaD é
transcrito junto com teaABC. A sequência proteica mostra que teaD é homologo a
proteína de estresse universal, UspA, sendo então uma proteína ligadora de ATP que
funciona como um sensor de energia (SCHWIBBERT et al., 2011). Ela regula a
concentração interna de ectoína em situações de estresse osmótico (SCHWEIKHARD et
al., 2010).
24
O genoma de C. salexigens apresenta genes ortólogos, mas com diferente
arranjo, porém com evidências de mesmo papel e importância (PASTOR et al., 2010).
Tais transportadores costumam ser unidirecionais, considerando a alta especificidade e a
função dependente de Na+. TeaA é uma proteína de alta afinidade por ectoína,
reconhecendo hidroxiectoína também, porém com menos afinidade (KUHLMANN;
BREMER, 2002; KUHLMANN et al., 2008), e é a única parte bem caracterizada do
sistema (Figura 10). Porém, suposições já foram feitas, que acreditam que a proteína
transmembranar grande forma um canal de translocação (MULLIGAN; FISCHER;
THOMAS, 2011). Já para M. halophilus, uma bactéria gram-positiva, o transportador de
ectoína, EctM, é uma proteína hidrofóbica muito semelhante ao transportadores betaína-
carnitina-colina (BCCTs) (VERMEULEN; KUNTE, 2004). Ela consiste em uma
proteína com resíduos de aminoácidos altamente conservados, incluindo a sequência
assinatura da família BCCTs; e acredita-se que tais resíduos estejam envolvidos com a
ligação do substrato e com a translocação pela membrana (KAPPES; KEMPF;
BREMER, 1996).
Figura 10: Estrutura da proteína de ligação com alta afinidade por ectoína (TeaA).
O círculo vermelho mostra o sítio de ligação da ectoína. Adaptada de
PITTELKOW, 2011.
Após um choque hipoosmótico, as células ajustam o potencial químico
citoplasmático rapidamente. O sistema de efluxo foi descrito no Tópico 2.3.2 – Método
“Salt-out”.
25
2.5.3 Tecnologia de Produção de Ectoína
Na década de 90, houve um desenvolvimento na produção de ectoína, uma vez
que os métodos utilizados não eram eficientes e começaram a ser insuficientes para a
demanda comercial. Tais métodos consistiam na extração de produtores naturais com
taxas baixíssimas (SAUER; GALINSKI, 1998) ou – sendo esse o método mais utilizado
– quimicamente produzido (LENTZEN; NEUHAUS, 2013; PASTOR et al., 2010). A
fim de chegar a valores de alta-escala, os métodos foram otimizados, fazendo uso de
bateladas alimentadas e choques hipoosmóticos. Em geral, processos biotecnológicos
são mais amenos para o meio ambiente pela ausência de solventes orgânicos e
componentes químicos tóxicos (PASTOR et al., 2010), porém, a principal vantagem do
método biossintético é a estereoseletividade do processo, no qual apenas L-ectoína é
produzida. O processo químico consiste em várias etapas, causando uma diminuição na
taxa de produção e também aumentando os passos necessários para a separação do
produto. Há também uma grande formação de co-produtos, que são semelhantes ao
produto pela baixa estereoseletividade da síntese química, e isso faz com que o processo
de purificação seja mais complexo.
A síntese química (Figura 11), descrita por Lentzen (US 8598346 B2) começa
pela conversão de lactona (II) a 2,4-dibromina (III) por brominação, que é realizada na
presença de bromina e PBr3. A 2,4-dibromina é esterificada, sendo obtido então éster
(IV) derivado de 2,4-dibromine butirato. Tal reação é muito importante e precisa ser
realizada imediatamente, para evitar a formação de sub-produtos, como o α-bromina-γ-
butirolactona; sendo realizada com metanol ou etanol em condição ácida (ex: sob a
passagem de HCl gasoso). A variação dos radicais R2, R3, R4, R5 e R6 na butirolactona
permite produzir derivados de ectoína. O éster é então aminado para a formação do
composto diamino (V). A substituição da bromina por grupos amino é realizada pela
reação direta com amônia ou por substituição nucleofílica com azida (NaN3), seguida de
uma hidrogenação. A reação direta com amônia é realizada com uma solução aquosa
concentrada, e temperaturas elevadas, por aproximadamente 20-30 horas. Finalmente, o
produto diamino (V) obtido é ciclizado, possivelmente após uma hidrólise da função
éster.
26
Figura 11: Sequência de reações para a síntese química de ectoína. Adaptado de
Lentzen e Neuhaus (2013).
Para o desenvolvimento de um processo industrial, a primeira coisa a ser levada
em consideração é o sistema de produção, no caso, um microrganismo produtor de
ectoínas. Características básicas do sistema precisam ser cumpridas, como temperatura e
pH amenos, facilitando o escalonamento do processo. O microrganismo pode ser um
produtor natural de ectoína, ou uma cepa engenheirada não-halofílica. Metabolismos
aeróbicos são preferidos, pela maior taxa de crescimento celular, e a concentração de sal
é algo a ser reduzida, pelos danos aos equipamentos e também aos limites que são
impostos ao metabolismo celular.
Para cumprir todos os fatores descritos acima, um biorreator adequado tem que
ser selecionado. E para a produção de ectoína, cultivos de alta concentração celular
(HCDC) são os mais indicados. Esse método tem sido utilizado há muito tempo para a
produção de antibióticos, proteínas recombinantes, metabólitos, polímeros, entre outros,
principalmente com leveduras e mesófilos (BERNAL et al., 2007; CÁNOVAS et al.,
2003; OBÓN et al., 1997; RIESENBERG; GUTHKE, 1999; SHILOACH; FASS,
2005), e, recentemente, com bactérias extremófilas (SCHIRALDI; DE ROSA, 2002).
Em sistemas com bactérias halofílicas, concentrações celulares variam entre 40 e 60 g/L
(FALLET; ROHE; FRANCO-LARA, 2010; FRINGS; SAUER; GALINSKI, 1995;
GUZMÁN et al., 2009; ONRAEDT et al., 2005; SAUER; GALINSKI, 1998;
SCHIRALDI et al., 2006; VAN-THUOC et al., 2010a). Sistemas de batelada
alimentada permitem concentrações celulares mais altas do que batelada simples. Isso
porque um dos limites superados é a exaustão de nutrientes essenciais presentes no meio
27
de cultivo, que serão injetados com frequência no sistema. E permite também que a
concentração inicial das fontes de carbono e nitrogênio não sejam tão altas, pois as
mesmas podem inibir o crescimento celular ou até mesmo precipitar. Porém, no final do
processo, com grandes concentrações celulares, é mais difícil manter a aeração do
sistema (RIESENBERG; GUTHKE, 1999), e isso pode afetar diretamente a taxa de
síntese, como acontece com a bactéria Marinococcus M52. Em dada concentração de
oxigênio dissolvido, a síntese dos solutos compatíveis se mantem constante na fase
exponencial. Com o aumento dessa concentração, houve maior produção (SCHIRALDI
et al., 2006).
Como o produto em questão é um soluto compatível, um estresse é necessário
para obter maiores produtividades. Porém, tais estresses não permitem um crescimento
celular favorável. Em alguns casos, dois ou mais reatores são acoplados para,
separadamente, otimizar o crescimento celular e o processo de bioprodução. Tal sistema
foi aplicado para a produção de ectoína (VAN-THUOC, 2009; VAN-THUOC et al.,
2010b) e para a obtenção simultânea de ectoína e poli(3-hidroxibutirato) (GUZMÁN et
al., 2009). Como sua função é intracelular, há a necessidade de um processo de extração
apropriado. A ordenha bacteriana é o processo de escolha, já que não faz uso de
compostos tóxicos e permite o reaproveitamento da cultura. Tal processo consiste em
um choque hipoosmótico, que faz com que as células secretem o composto, a fim de
reequilibrar as pressões osmóticas intra- e extracelular. Porém, esse processo só ocorre
com bactérias gram-negativas, que são mais susceptíveis à alterações na salinidade do
meio. Bactérias gram-positivas suportam variações com mais facilidade, não excretando
os solutos compatíveis acumulados. Isso faz com que, no caso de uma bactéria gram-
positiva, seja necessária uma etapa de lise celular, aumentando os custos do processo. A
purificação das ectoínas é feita a partir de um processo simples com duas etapas
distintas. Há a cromatografia de troca catiônica, e então é seguida da
cristalização/evaporação (SAUER; GALINSKI, 1998).
Para a produção industrial de ectoína, H. elongata foi o microrganismo
escolhido. Tal bactéria foi isolada de salinas em Bonaire, nas Antilhas Holandesas
(VREELAND et al., 1980). Ela é um halofílico moderado não-patogênico, com um
genoma consistindo em apenas um cromossomo (4061296 pb) e carrega genes que
codificam para 3473 proteínas (SCHWIBBERT et al., 2011). A capacidade de obter
altas concentrações celulares (acima de 40 g/L, o que equivale a aproximados 10 g/L de
28
ectoína), sua robustez e a segurança no seu manuseio tornam o processo aplicável
também para industrias como a alimentícia (HINRICHSEN; MONTEL; TALON,
1994). Outras características são especiais, como a tolerância ao sal em grandes faixas e,
principalmente, a realização da ordenha bacteriana, onde a cultura libera rapidamente a
ectoína intracelular, e volta a sintetizar mais em seguida a esse processo. Após um
cultivo em batelada alimentada, com concentrações de sal acima de 15%, é realizada a
ordenha bacteriana (Figura 12). Há a possibilidade de aproveitamento da cultura em até
9 ciclos, aumentando a produtividade. A primeira patente para o processo de produção
de ectoína com Halomonas elongata foi depositava pela empresa alemã Bitop AG
(MOTITSCHKE; DRILLER; GALINSKI, 1994). Estudos comprovam que é possível
fazer esse processo aproveitando resíduos como da agro-indústria com Halomonas
elongata, mostrando a capacidade da cepa em consumir os açúcares presentes no
hidrolisado (TANIMURA et al., 2013), sendo mais um atrativo para a síntese de ectoína
por bioprocesso.
Figura 12: Diagrama do processo de ordenha bacteriana, para a produção de
ectoína pela bactéria H. elongata. (SAUER; GALINSKI, 1998).
29
Porém, outros microrganismos também são estudados para a síntese de ectoína,
entre eles Escherichia coli (TSAPIS; KEPES, 1977), Synechocystis sp. (REED et al.,
1986) e algumas espécies de Halorhodospira (FISCHEL; OREN, 1993).
Microrganismos do gênero Brevibacterium também foram estudados. Tais
microrganismos realizam a ordenha bacteriana, porém os resultados obtidos para
ordenhas periódicas de Brevibacterium JCM 6894 (NAGATA et al., 2008) (com o
aproveitamento da cultura para novos ciclos) não superaram os resultados obtidos no
processo com Brevibacterium epidermis, que não realizou ordenhas, apenas uma
extração final com etanol (ONRAEDT et al., 2005), e apresentava concentrações baixas
de sal. O lado positivo do uso de concentrações baixas de sal é evitar a corrosão dos
equipamentos, e também a redução da taxa de crescimento e a densidade máxima, o que
resultaria em menor concentração de ectoína (PASTOR et al., 2010). E nessa condição
também podemos listar os microrganismos geneticamente manipulados, como E. coli ou
leveduras, mais comumente utilizadas no processo, e que não exigem, nem resistem a
concentrações de sal muito altas. Para isso, é necessário realizar inserção de genes,
conhecer as vias metabólicas e seus genes para a construção do organismo
recombinante.
A hidroxiectoína chama atenção da indústria pelas suas características distintas
de outros solutos compatíveis, como a aplicação para aumentar a termorresistência de
proteínas e células. Os mesmos empecilhos para a produção de ectoína se aplicam para
a produção de hidroxiectoína, porém essa última apresenta mais um agravante: a adição
da hidroxila. O microrganismo mais estudado para a produção de hidroxiectoína é
Marinococcus M52, convertendo a ectoína em hidroxiectoína durante a fase
estacionária (FRINGS; SAUER; GALINSKI, 1995). Otimizações foram realizadas,
focalizando na hidroxiectoína, e entre elas podemos citar o processo de “ordenha”
bacteriana. Este foi associado a uma permeabilização térmica, aumentando assim a
eficiência na extração da molécula, e então, sua produtividade. Porém, tal processo
impossibilita a reutilização da cultura, sendo assim um limitante (PASTOR et al., 2010;
SCHIRALDI et al., 2006). No gênero Halomonas, Van-Thuoc (VAN-THUOC et al.,
2010b) otimizou a produção de hidroxiectoína por Halomonas boliviensis, conseguindo
obter produtividades 2 a 5 vezes maiores do que as obtidas com Marinococcus M52.
30
2.5.4 Aplicações Diretas e Indiretas
Como soluto compatível, além da proteção osmótica, é sabido que tais moléculas
são capazes de mitigar os efeitos deletérios do calor, do congelamento, do
ressecamento, da alta salinidade, dos radicais de oxigênio, da radiação, da ureia e outros
agentes desnaturantes, protegendo proteínas, ácidos nucléicos, biomembranas e até
mesmo as células inteiras (DA COSTA; SANTOS; GALINSKI, 1998; LENTZEN;
SCHWARZ, 2006), sendo aplicada então em diferentes segmentos industriais. Dentre
os solutos compatíveis já estudados, ectoínas são as que mostraram as características
estabilizantes mais poderosas (LIPPERT; GALINSKI, 1992). Porém, ectoína também
tem outras aplicações, como blocos de construção quiral (VAN-THUOC et al., 2010a;
VOSS, 2002), pelos derivados ilustrados abaixo (Figura 13). Tais derivados ainda não
tiverem seus efeitos e aplicações elucidados, mas há a promessa de outras ações mais
especificas.
Figura 13: Ectoína e seus derivados químicos. Em parênteses, os nomes triviais.
Adaptado de VOSS, 2002.
31
2.5.4.1 Efeitos na estrutura proteína e na estabilidade enzimática
Ectoína se mostra capaz de estabilizar diferentes processos enzimáticos, muitas
vezes pela sua capacidade de estabilizar enzimas. Podemos então listar alguns: RNases
foram estabilizadas por hidroxiectoína, sendo a suplementação com a molécula um
atrativo para processos biotecnológicos onde enzimas são aplicadas na presença de
desnaturantes ou temperaturas altas (KNAPP; LADENSTEIN; GALINSKI, 1999). A
hidroxiectoína também é capaz de proteger lactato desidrogenase (LDH) de oxidação
catalisada por metal ou por peróxido de hidrogênio (ANDERSSON, 2000), mostrando
que a proteção é independente da fonte do dano (PASTOR et al., 2010).
LDH e fosfofrutoquinase são sensíveis aos processos de congelamento e
descongelamento, aquecimento, e congelamento e ressecamento. Porém, ectoínas
mantiveram a atividade de tais enzimas (LIPPERT; GALINSKI, 1992). Ao observar as
mudanças estruturais, o proposto é que as ectoínas levaram a uma conformação mais
compacta ao modular propriedades dos solventes (GOLLER; GALINSKI, 1999),
corroborando a hipótese de “exclusão preferencial dos solutos da superfície proteica”
(ARAKAWA; TIMASHEFF, 1985).
O polímero cianoficina faz parte de um bioprocesso de interesse industrial
(JOENTGEN et al., 2001) e ectoína foi capaz de estabilizar a cianoficina sintase para a
produção in vitro, possibilitando sua produção em escala industrial (HAI;
OPPERMANN-SANIO; STEINBÜCHEL, 2002). A hidrólise de fitato para a liberação
de fosfatos inorgânicos durante a peletização de alimento (KESHAVARZ, 2000;
STAHL et al., 2000) é realizada pela fitase, uma fosfomonoesterase que tem sua
atividade perdida pelo aumento da temperatura do processo (ULLAH, 1988). A ectoína
foi capaz de estabilizar a capacidade catalítica da fitase em alta temperatura, mostrando
um aumento de sete vezes, se comparado ao sistema sem ectoína (ZHANG et al., 2006).
Estudos recentes mostram que a suplementação com ectoína aumentou a
produção de biodiesel por conversão enzimática de triglicerídeos, utilizando lipases
imobilizadas, permitindo a reutilização das enzimas (WANG; ZHANG, 2010).
No trabalho de Deguchi e Koumoto, de 2011, foi observado que metabólitos
zwitteriônicos, como a ectoína, são capazes de aumentar a taxa de reação, a
termoestabilidade, a tolerância ao sal e a especificidade de substrato de α-glucosidases,
ao diminuir a perturbação conformacional da enzima (DEGUCHI; KOUMOTO, 2011).
Proteínas que são deficientes, seja pelo enovelamento errado, ou super-
expressas, assim como proteínas insolúveis, podem ser desnaturadas e reenoveladas na
32
presença de osmólitos, recuperando assim o seu papel. Um exemplo específico é o uso
de hidroxiectoína para a purificação de proteínas citotóxicas, redirecionando-as para o
periplasma de E. coli (BARTH et al., 2000). E ectoína mostrou proteger proteínas da
proteólise por tripsina e tripsinogênio, preservando a atividade durante a incubação.
Tais resultados mostram que ectoínas podem servir como aditivos quando há a
necessidade de evitar inibidores de proteases (KOLP et al., 2006).
2.5.4.2 Efeitos na estrutura de DNA
Da mesma forma que ectoínas são capazes de estabilizar proteínas e enzimas, as
moléculas de DNA também são estabilizadas. Malin e grupo (MALIN;
IAKOBASHVILI; LAPIDOT, 1999) mostraram que ectoínas são capazes de causar
mudanças na estrutura do DNA ao ponto de não permitir a ligação de endonucleases de
restrição. Além disso, a adição de solutos compatíveis durante o processo de PCR pode
causar alterações na conformação do DNA, alterando o anelamento do primer e a
ligação da polimerase (PASTOR et al., 2010). Ectoína é capaz de aumentar a
estabilidade térmica da DNA polimerase em altas temperaturas, e diminuir a
temperatura de desanelamento em fitas duplas de DNA, muitas vezes sendo
imprescindível para que ocorra a amplificação de trechos ricos em GC (MALIN;
IAKOBASHVILI; LAPIDOT, 1999; SCHNOOR et al., 2004).
Microarranjo é uma técnica de biologia molecular, onde se utiliza de um chip
para se medir os níveis de expressão de genes. Sua otimização, incluindo a etapa de
hibridização, é o principal alvo para o desenvolvimento de protocolos mais eficientes
(PASTOR et al., 2010). O uso de hidroxiectoína nesse processo diminuiu a presença de
artefatos e aumentou a eficiência de hibridização (MASCELLANI et al., 2007).
2.5.4.3 Potenciais aplicações biomédicas de Ectoínas
Recentemente, várias doenças foram associadas ao enovelamento incorreto de
proteínas (DOBSON, 2003). Podemos listar várias delas, como a doença de Alzheimer
(AD) e a encefalopatia espongiforme, onde há a formação de agregados regulares
chamados amilóides (HARPER; LANSBURY, 1997; MURPHY, 2002). A ectoína foi
capaz de inibir eficientemente a formação desses amilóides nas fases de iniciação e
avanço, em um estudo com a formação de amilóides de insulina in vitro (ARORA; HA;
PARK, 2004; YANG et al., 1999). Para o tratamento da doença de Alzheimer, ectoína
se apresenta um forte candidato, pois inibe a formação dos amilóides Aβ42 in vitro e
reduz a toxicidade de células de neuroblastoma humano (KANAPATHIPILLAI et al.,
33
2005). Príons são partículas infecciosas que causam a encefalopatia espongiforme
transmissível (AGUZZI; POLUMENIDOU, 2004). Eles se agregam em fibrilas
amilóides resistentes a proteases, induzindo a morte celular neural por apoptose e
causando a proliferação e hipertrofia de células de glia em cultura (FORLONI et al.,
1993; PAN et al., 1993). Células de neuroblastoma incubadas com ectoína e príons
mostraram uma taxa de sobrevivência maior se comparado ao sistema sem ectoína,
inibindo então a formação de amilóides e reduzindo a toxicidade
(KANAPATHIPILLAI et al., 2008).
A patogênese de doenças como a Machado-Joseph são causadas por
enovelamentos incorretos de proteínas. Quando esse erro ocorre em fragmentos
contendo extensões de poliglutamina, há a produção de agregados e então morte celular
(KAKIZUKA, 1998; PAULSON, 1999; PERUTZ, 1996). Estudos mostram que ectoína
é capaz de reduzir o número de agregados e mudar sua distribuição intracelular,
diminuindo assim a citoxicidade (CELINSKI; SCHOLTZ, 2002; FURUSHO;
YOSHIZAWA; SHOJI, 2005).
A inalação de nanopartículas foi identificada como maior perigo no ar nas
sociedades atuais, induzindo a inflamação dos pulmões, o que pode causar inúmeras
doenças sistemáticas (DONALDSON et al., 2005). O pulmão acaba sofrendo lesões
pelo recrutamento e ativação das células inflamatórias. Doenças como enfisema, doença
pulmonar obstrutiva crônica, fibrose e câncer (BRINGARDNER et al., 2008;
MACNEE, 2005), e no nível sistêmico, como doenças cardiovasculares e do sistema
imunológico (PETERS et al., 2004) ocorrem com frequência. Ectoína se mostrou capaz
de bloquear a sinalização induzida por nanopartículas, bloqueando assim os respostas
pro-inflamatórias nas células epiteliais do pulmão (SYDLIK et al., 2009, 2013).
No transplante de intestino delgado, a estocagem do órgão acaba causando
isquemia e lesão de reperfusão subsequente (I/R) (GRANT et al., 1990) e mesmo sendo
capaz de se regenerar com rapidez, as lesões causadas em 24 horas de estoque
refrigerado demoram mais de 1 mês para serem recuperadas. Essas lesões aumentam as
possibilidades de rejeição e as complicações pós-operatórias, como infecções
bacterianas, absorção de toxinas e desnutrição (ZOU et al., 2005). Trabalhos
demonstram que ectoína protege a mucosa e a musculatura, diminuindo a ceramida do
local, que serve como um mediador de apoptose e de estresse oxidativo, e reduz
34
sinalizações com citocinas inflamatórias, melhorando assim a qualidade do tecido
(PECH et al., 2013; WEI et al., 2009).
Outro exemplo do papel da ectoína em proteger as células em certas doenças é
no caso de infecção por HIV, pois tal molécula é capaz de inibir a interação de duas
proteínas regulatórias virais, Tat e Ver, diminuindo assim a transcrição de proteínas
virais; e também potencializa o efeito antiviral de certas drogas (LAPIDOT; BEN-
ASHER; EISENSTEIN, 1995). E a hidroxiectoína aumentou a estabilidade de vetores
retrovirais estocados, ferramentas importantes para terapia gênica. Tal achado é de
grande valia, pois um dos principais obstáculos para o uso de tal terapia é a perda de
infecciosidade no estoque e transporte (CRUZ et al., 2006).
Uma das aplicações mais difundidas de ectoína é contra o envelhecimento da
pele, causados pelo acúmulo de efeitos de fatores externos, como radiação, umidade do
vento e temperaturas extremas (HEINRICH; GARBE; TRONNIER, 2007;
MOTITSCHKE; DRILLER; GALINSKI, 2000; RABE et al., 2006). Tal molécula é
capaz de proteger e estabilizar as membranas de células pré-tratadas contra os efeitos de
surfactantes, e também células de pele humana contra os fatores de estresse que
normalmente iriam causar desidratação (BOTTA et al., 2008; GRAF et al., 2008).
Assim, sua capacidade de hidratação é mais eficiente que o glicerol e apresenta outros
efeitos a longo prazo (GRAF et al., 2008). A exposição à radiação UVA pode causar
quadros de câncer (SANDER et al., 2004), imunossupressão (Wang 2001),
fotodermatoses e envelhecimento (FOURTANIER et al., 2006; KRUTMANN, 2000).
Ectoína é capaz de proteger a pele desses danos de diferentes maneiras, entre elas ao
bloquear a sinalização pro-inflamatória por ceramida (BUENGER; DRILLER, 2004;
GRETHER-BECK et al., 2005).
No quadro de fibroblastoma, há mutações no DNA mitocondrial em grandes
quantidades, chamadas “deleções comuns”, sendo dependentes da radiação UV-A
(BERNEBURG et al., 1997; BUENGER; DRILLER, 2004). Tais mutações causam
alterações celulares (FLIGIEL et al., 2003), e para contorná-las existem alguns
mecanismos de proteção celular, incluindo as proteínas de choque-térmico (Hsp)
(GIANNESSI et al., 2003). Quando as células são tratadas com ectoína e passam pelo
choque térmico, há um aumento marcante na forma constitutiva de proteínas de choque-
térmico. Ao induzir tais proteínas e inibir os sinais pro-inflamatórios, a molécula exerce
35
um papel citoprotetor (BUOMMINO et al., 2005). Além disso, também há evidencias
de proteção de células de Langerhans, elementos-chave do sistema imunológico da pele
(GAO; GARCIA-PICHEL, 2011; PFLÜCKER et al., 2005; TAVARIA et al., 1996), e
do aumento da radiação UV necessária para que as células entrem em apoptose
(PFLÜCKER et al., 2005).
A alta compatibilidade, a falta de toxicidade e as propriedades estabilizantes de
macromoléculas fazem os solutos compatíveis candidatos para excipientes
farmacêuticos, fazendo com que moléculas como as imunotoxinas e imunomoduladores
tenham seus efeitos colaterais diminuídos, sem afetar o efeito médico (BARTH et al.,
2000; LENTZEN; SCHWARZ, 2006). Mais estudos sobre potenciais biomédicos para
ectoína estão listados na tabela abaixo (Tabela 2):
Tabela 2: Potenciais aplicações biomédicas para ectoína.
Aplicações Referência
Tratamento da síndrome do vazamento
vascular (VLS)
LENTZEN; NEUHAUS, 2013
Estabilizante de Vacinas LENTZEN; NEUHAUS, 2013
Tratamento de Sinusite Aguda EICHEL et al., 2013
Tratamento de Colites (ex: doença de Chron) ABDEL-AZIZ et al., 2013
2.5.4.4 Efeitos de proteção celular
Não estabilizando apenas proteínas e outras macromoléculas, esses solutos
compatíveis são capazes de proteger células inteiras. Vários estudos foram realizados
para demonstrar isso. Um deles, realizado por Malin e Lapidot em 1996 mostrou que a
adição de ectoína no meio de cultivo contornou a inibição do crescimento de E. coli
causada pelos estresses osmótico e térmico, sendo um dos mecanismos a recuperação da
captação de glicose (NAGATA et al., 2002). Louis et al., em 1994 (LOUIS; TRÜPER;
GALINSKI, 1994) demonstraram que ectoína e hidroxiectoína estabilizaram células de
E. coli durante o processo de secagem, fosse por ar ou congelamento. Outros exemplos
de estabilização celular durante processos estão listados na tabela abaixo (Tabela 3):
36
Tabela 3: Potenciais aplicações na proteção celular.
Efeito Componente Referência
Proteção contra dessecação em
Pseudomonas putida
Hidroxiectoína MANZANERA et al., 2002
Proteção contra dessecação em
E. coli
Hidroxiectoína MANZANERA; VILCHEZ;
TUNNACLIFFE, 2004a
Proteção contra encapsulação
em E. coli e P. putida
Hidroxiectoína MANZANERA; VILCHEZ;
TUNNACLIFFE, 2004b
Promoção do efeito
fermentativo com Z. mobilis
Ectoína ZHANG et al., 2008
Detoxificação de Fenol em
Halomonas
Ectoína MASKOW; KLEINSTEUBER,
2004
Osmoproteção de bactérias
produtoras de ácido lático
Ectoína BALIARDA et al., 2003
Tolerância ao sal em plantas de
tabaco
Ectoína MOGHAIEB et al., 2006
Tolerância ao sal em células de
plantas de tabaco
Ectoína NAKAYAMA et al., 2000
Como é possível observar, as aplicações de ectoína são diversas, e muitos
estudos ainda estão em andamento, tornando possível o desenvolvimento de novas
aplicações.
2.6 Outros produtos decorrentes da atividade de Halomonas: PHB
As respostas osmoprotetoras envolvem a formação de mais do que apenas um
soluto compatível, incluindo aminoácidos como glutamato, prolina e alanina, entre
outros. Assim, é possível que haja a produção de mais de um soluto compatível pelo
microrganismo. No caso da Halomonas boliviensis, além da produção de ectoína,
também há a produção do biopoliéster poli(3-hidroxibutirato) (PHB – Figura 14), um
substituto biodegradável para o plástico derivado do petróleo, que são recalcitrantes
para a degradação microbiana (BRANDL et al., 1990). No início dos anos 2000, a
estimativa era da produção de 100 milhões de toneladas de plástico por ano (KALIA;
RAIZADA; SONAKYA, 2000), que são descartados principalmente em aterros
sanitários, no mar ou então são incinerados. Esse último processo libera compostos
químicos prejudiciais à saúde, como cloreto de hidrogênio e cianeto de hidrogênio.
Logo, um substituto ecológico poderá ajudar a contornar diversos problemas de
poluição (REDDY; GHAI; KALIA, 2003).
37
Figura 14: Estrutura genérica de poli-hidroxi-alcanoatos. R = H ou grupos
alquil C1-C13, x = 1.4 e n = 100 – 30000. Adaptado de VAN-THUOC, 2009.
A bactéria é capaz de acumular PHB de diferentes fontes de carbono, chegando
a um conteúdo de 50-90 % da massa celular seca e utilizando-o como reserva de
carbono e energia (VAN-THUOC, 2009). Há a possibilidade de obtenção dos produtos
em sequência, porém, há uma perda na taxa de produção. Isso é de se esperar, uma vez
que o substrato não estará sendo utilizado unicamente para um produto (PASTOR et al.,
2010). Como é possível observar na via de síntese de PHB descrita abaixo (Figura 15),
há intermediários em comum com a via de síntese de ectoína, evidenciando que haverá
uma perda nas taxas.
38
Figura 15: Via para a síntese de PHB. Adaptado de PHILIP; KESHAVARZ;
ROY, 2007.
39
Pelas características anfipáticas do PHB, há a formação de grânulos com
supostamente o mesmo mecanismo que a formação de micélios. Essas inclusões
apolares possuem no seu interior o PHB (Figura 16 – B), e sua membrana é
fosfolipídica (MAYER; HOPPERT, 1997) com proteínas associadas, como a PHA
sintase (GERNGROSS et al., 1993; LIEBERGESELL et al., 1994), a PHA
depolimerase (GAO et al., 2001; YORK et al., 2003), proteínas regulatórias
(MAEHARA et al., 2002; PRIETO et al., 1999), entre outras (KLINKE et al., 2000).
Tais grânulos são visíveis em microscopias (Figura 16 – A).
Figura 16: Diferentes representações de grânulos de PHB. (A) Microscopia
eletrônica de transmissão de H. boliviensis (QUILLAGUAMÁN et al., 2006); (B)
representação esquemática de um grânulo de PHB e as proteínas associadas
(REHM, 2003).
Porém, por ser um produto intracelular, há vários fatores complicadores para a
produção de PHB como polímero, sendo o principal deles um custo adicional pela
necessidade de extração. Além disso, a manutenção da aeração da cultura aeróbica, o
custo do substrato utilizado como fonte de carbono e as baixas taxas de produtividade
também prejudicam a aplicabilidade do bioprocesso (CEYHAN; OZDEMIR, 2011;
CHOI; LEE, 1999).
2.7 Considerações Finais
Os trabalhos da literatura focalizam principalmente na bactéria H. elongata,
descrita anteriormente às outras do mesmo gênero, e apresentando resultados
significativos. Tanto que tal microrganismo é utilizado na principal planta de produção
40
bioquímica de ectoína, em BITOP, na Alemanha (KUNTE; LENTZEN; GALINSKI,
2014). Porém, os resultados de produtividade mais promissores têm sido obtido mais
recentemente por H. boliviensis e H. salina.
Outros microrganismos são utilizados, consistindo principalmente em bactérias
gram-positivas – fazendo necessária a etapa de lise celular - ou microrganismos
geneticamente engenheirados. Esses últimos são os que apresentam os melhores
resultados, chegando a concentrações de ectoína não comparáveis aos sistemas
selvagens. Um exemplo é E. coli, que consumindo aspartato e glicerol em uma cultura
de alta concentração celular, sendo capaz de produzir 25 g/L.dia, valor quase 20 vezes
maior que o obtido por H. elongata – 1,3 g/L.dia, em um processo que leva 110 horas
(HE et al., 2015; SAUER; GALINSKI, 1998). Porém, com esses microrganismos
também houve avanço, pois os estudos começaram com tempos finais de 160 horas, o
que fazia com que a produtividade volumétrica resultassem em 0,8 g/L.dia
(SCHUBERT et al., 2007). Com B. epidermis, uma bactéria gram-positiva, os valores
de produtividade são em torno de 2 g/L.dia, porém com extrato de levedura como fonte
de nitrogênio e a necessidade de lise celular, foi relatado aumento nos custos do
processo (ONRAEDT et al., 2005).
Para H. boliviensis, as pesquisas têm evoluído, tendo havido um ganho
significativo no processo. Isto é, trabalhos mais recentes relataram valores de
produtividade volumétrica de 6,3 g/L.dia, em um processo com duração total de 35
horas (VAN-THUOC et al., 2010a), enquanto trabalhos anteriores relataram valores de
produtividade volumétrica de 2,8 g/L.dia, com um tempo total de processo de 40 horas.
Para essa produção, é necessária a realização de duas etapas, pela diferença na
concentração de cloreto de sódio necessária no crescimento celular e na fermentação,
adicionando ao cálculo o tempo de processamento da cultura. Entretanto, para H. salina
não há a necessidade de condições distintas para crescimento celular e fermentação,
fazendo com que o processo seja mais rápido e menos oneroso. Os resultados com H.
salina indicam valores de produtividades de 7 g/L.dia, com concentrações de sal mais
reduzidas, sendo então menos agressivo para os equipamentos e tempos finais de 22
horas (LANG et al., 2011; ZHANG; LANG; NAGATA, 2009).
41
3 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
A produção de moléculas utilizadas pela indústria farmacêutica por via
biotecnológica é um desafio constante, mas que precisa ser ultrapassado. Os processos
químicos produzem intermediários e subprodutoss muitas vezes tóxicos, de alto custo,
que necessitam descarte apropriado, e condições mais agressivas de processo, tornando
por vezes a produção até inviável. Porém, vias biotecnológicas, que fazem uso de
microrganismos e enzimas, costumam ter condições mais brandas, utilizam de
intermediários menos tóxicos, tendo então vários atrativos a mais do que as vias
químicas.
Um exemplo de produção por via biotecnológica é da molécula ectoína, um
soluto compatível presente em todos os reinos, tornando as opções de processos muito
variadas, podendo ser utilizados diferentes substratos, em diferentes condições, e
diferentes organismos. Essa molécula tem diferentes aplicações, e muitas delas ainda
precisam ser desenvolvidas. Utilizada principalmente na indústria de cosméticos, ela é
capaz de aumentar a capacidade de hidratação de cremes contra sinais de idade, assim
como diminuir os efeitos deletérios da exposição ao sol. Já no segmento médico, sua
42
característica compatível e versátil faz com que seja possível a aplicação no tratamento
de diversas doenças, mantendo a estabilidade de moléculas e até mesmo células inteiras.
Essa característica também permite a aplicação da ectoína como estabilizante de
alimentos, coquetéis enzimáticos e terapias virais. A produção química, utilizada
anteriormente, faz uso de intermediários de alto custo e a reação química apresenta
baixa especificidade, aumentando assim as moléculas produzidas, o que torna o
processo de purificação mais caro.
No presente trabalho, cepas de Halomonas foram selecionadas. A capacidade
desse gênero de secretar ectoína quando estimulado faz com que haja uma diminuição
na complexidade e no custo do processo, além de possibilitar a reutilização da cultura.
Tais bactérias apresentam grande diversidade, sendo possível utilizar diferentes
concentrações de sal e de fonte de carbono, tornando o processo mais atrativo. A
produção de ectoína ainda tem muitas incógnitas que precisam ser desvendadas, sendo
necessário estudar todo o mecanismo de produção, secreção e recuperação.
Nesse sentido, pretende-se atingir maiores valores das principais variáveis de
resposta do bioprocessos em tela, afim de contribuir para o seu desenvolvimento,
visando sua produção comercial.
3.1 Objetivo geral
Esta dissertação tem como objetivo geral a otimização da produção de ectoína a
partir de meio sintético, utilizando bactérias do gênero Halomonas.
3.2 Objetivos específicos
Selecionar entre 3 espécies: Halomonas elongata, Halomonas boliviensis e
Halomonas salina, aquela mais apropriada;
Avaliar o tamanho do pré-inóculo e do inóculo da cepa selecionada;
Entender aspectos fisiológicos da expressão de ectoína, incluindo as formas de
secreção do produto;
Avaliar a concentração de NaCl ótima que resulte em máximos valores de
concentração celular e de ectoína;
43
Ensaiar a técnica da ordenha bacteriana;
Otimizar a composição do meio de cultivo para a produção de ectoína com a
espécie selecionada, empregando técnicas do planejamento experimental;
Realizar experimentos em biorreator instrumentado avaliando o grau de aeração
ótimo.
44
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Microrganismo e inóculo
As cepas utilizadas para os processos de fermentação visando a produção de
ectoína foram Halomonas salina (DSM 5928), Halomonas elongata (DSM 2581) e
Halomonas boliviensis (DSM 15516) e foram obtidas no banco de células da Alemanha,
o Leibniz-Institut DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSMZ), liofilizadas. Foram preparados os meios indicados para cada cepa com
a composição descrita nas tabelas abaixo, e o estoque foi feito por congelamento a -
80ºC, em meio de manutenção + 30% glicerol (v/v). A ativação da cultura do criotubo
para prosseguir com a fermentação foi feita no meio de ativação, com a composição
também descrita abaixo:
45
Para H. salina:
Tabela 4: Meio de Manutenção – DSM 593
Componente Concentração (g/L)
Cloreto de Sódio 81
Extrato de Levedura 10
Peptona 5
Cloreto de Magnésio 7
Sulfato de Magnésio 9,6
Cloreto de Cálcio 0,36
Cloreto de Potássio 2
Bicarbonato de Sódio** 0,06
Brometo de Sódio 0,026
Glicose 1
Ágar-ágar* 15
*Se necessário.
** Esterilizado separadamente.
Tabela 5: Meio de Ativação; de Lang et al., 2011
Componente Concentração (g/L)
Glutamato Monossódico 30
Cloreto de Sódio 30
Fosfato de Potássio Monobásico 3
Sulfato de Magnésio Heptahidratado 0,4
Fosfato de Potássio Dibásico 9
Sulfato de Manganês Heptahidratado 0,01
Extrato de Levedura 1
O pH foi ajustado para 7,1, e as soluções, esterilizadas a 121ºC por 20 minutos.
Tabela 6: Meio de Fermentação; de Lang et al., 2011
Componente Concentração (g/L)
Glutamato Monossódico 60
Cloreto de Sódio 30
Fosfato de Potássio Monobásico 3
Sulfato de Magnésio Heptahidratado 0,4
Fosfato de Potássio Dibásico 9
Sulfato de Manganês Heptahidratado 0,01
46
Para Halomonas elongata:
Tabela 7: Meio de Manutenção e de Ativação – DSM 276
Componente Concentração (g/L)
Cloreto de Sódio 80
Ácidos Casamino 7,5
Peptona 5
Extrato de Levedura 1
Citrato de Sódio 3
Sulfato de Magnêsio Heptahidratado 20
Fosfato de Potásso Dibásico 0,5
Sulfato de Amônio Férrico II Hexahidratado 0,05
Ágar-ágar* 15
*Se necessário.
Tabela 8: Meio de Fermentação; de Larsen et al., 1987
Componente Concentração (g/L)
Sulfato de Amônio 1,96
Cloreto de Sódio 150
Hidróxido de Potássio 4,6
Sulfato de Magnésio
Heptahidratado 0,12
Fosfato de Potássio Dibásico 13,6
Sulfato de Ferro Heptahidratado 0,005
Glicose 4
Para Halomonas boliviensis:
Tabela 9:- Meio de Manutenção – Marine Broth (Difco) + 6% NaCl
Componente Concentração (g/L)
Cloreto de Sódio 79,45
Extrato de Levedura 1
Peptona 5
Citrato de Ferro III 0,1
Cloreto de Magnésio 5,9
Sulfato de Sódio 3,24
Cloreto de Cálcio 1,8
Cloreto de Potássio 0,55
Bicarbonato de Sódio 0,16
Brometo de Potássio 0,08
Cloreto de Estrôncio 34 mg
Ácido Bórico 22mg
Silicato de Sódio 4mg
Fluoreto de Sódio 2,4mg
Nitrato de Amônio 1,6mg
Fosfato Dissódico 8mg
Ágar-ágar* 15
*Se necessário.
47
Tabela 10: Meio de Ativação; de Van-Thuoc et al., 2010a
Componente Concentração (g/L)
Glutamato Monossódico 3
Cloreto de Sódio 45
Cloreto de Amônio 2,3
Sulfato de Magnésio
Heptahidratado 2,5
Fosfato de Potássio Dibásico 0,55
Sulfato de Ferro Heptahidratado 0,005
Glicose 10
Tabela 11: Meio de Fermentação; de Van-Thuoc et al., 2010a
Componente Concentração (g/L)
Glutamato Monossódico 10,6
Cloreto de Sódio 157,3
Cloreto de Amônio 2
Sulfato de Magnésio
Heptahidratado 3,47
Fosfato de Potássio Dibásico 1,77
Sulfato de Ferro Heptahidratado 0,005
Glicose 20
As três cepas tiveram suas curvas de ativação obtidas. Para isso, criotubos foram
descongelados e centrifugados, o sobrenadante, descartado, e o sedimento,
ressuspendido em meio para ser adicionado ao frasco de cônicos com o meio de
ativação, o perfil cinético foi acompanhado. Após estudos baseados nas informações
obtidas sobre as cepas, houve a seleção de apenas uma delas, continuando assim com
seu cultivo.
4.2 Curvas de Ativação
As cepas utilizadas neste trabalho foram obtidas liofilizadas. Assim, foi
necessário realizar a ativação das cepas. Os meios indicados pela DSMZ (descritos
acima) foram preparados com antecedência e mantido por três dias em estufa a 30°C
para aferir esterilidade. Cada cepa foi ativada em separado, para garantir que não
houvesse contaminação cruzada. Assim, em fluxo laminar, a ampola foi quebrada e
meio estéril foi adicionado para reidratar o material celular. Após ressuspendê-lo,
alíquotas foram adicionadas em placas de Petri e em frascos cônicos, e inoculadas a
30°C e 200 rpm, a condição indicada. Após dois dias, as placas de Petri foram
guardadas em geladeira, e a cultura dos cônicos foi transferida para outros frascos
48
cônicos, visando aumentar o volume da cultura e torná-la mais recente. Depois de
inoculado novamente, esse material foi centrifugado e o sedimentado, ressuspendido no
meio de manutenção com 30% de glicerol, um crioprotetor necessário para manter a
integridade das células no processo de congelamento. Quando necessário, criotubos
dessa cultura são descongelados e ativados.
As curvas de ativação foram construídas em frascos cônicos de 500 mL com
volume final de 200 mL do respectivo meio de ativação (citados acima). Amostras
foram tiradas a cada duas horas, e o sobrenadante enviado para quantificação do
substrato.
4.2.1 Halomonas salina
O meio utilizado para a ativação da cultura de H. salina na ampola está descrito
na Tabela 4, e o meio utilizado para a ativação do criotubo, na Tabela 5. Abaixo, é
possível observar uma micrografia de coloração de gram de H. salina (Figura 17).
Figura 17: Microscopia de Halomonas salina após a ativação e durante o
crescimento em frasco (com aumento de 100 x).
3.2.2 Halomonas elongata
O meio utilizado para a ativação da cultura de H. elongata na ampola e para a
ativação do criotubo está descrito na Tabela 7. Abaixo, é possível observar uma
micrografia de coloração de gram de H. elongata (Figura 18).
49
Figura 18: Microscopia de Halomonas elongata após a ativação e durante o
crescimento em frasco (com aumento de 100 x).
4.2.3 Halomonas boliviensis
O meio utilizado para a ativação da cultura de H. boliviensis na ampola e para a
ativação do criotubo está descrito na Tabela 7. Abaixo, é possível observar uma
micrografia de coloração de gram de H. boliviensis (Figura 19).
Figura 19: Microscopia de Halomonas boliviensis após a ativação e durante o
crescimento em frasco (com aumento de 100 x).
4.3 Análise das amostras
4.3.1 Amostragem dos experimentos
Como padrão, alíquotas foram removidas dos sistemas testados, sempre
respeitando o volume máximo que pode ser removido. Essas alíquotas foram
centrifugadas a 10000 rpm por 10 minutos, separando assim o sobrenadante do material
celular. O sobrenadante foi processado para quantificação de substrato e produto, e o
50
sedimentado foi utilizado para quantificação da biomassa utilizando do método de
espectrofotometria. Caso feito diferente, será descrito no experimento.
4.3.2 Quantificação de biomassa
Para fazer uma relação entre a absorbância e a massa seca do microrganismo,
amostras de 2 mL foram coletas em tubos cônicos (aproximadamente 10), que tiveram
seu peso inicial (sem conter amostra) determinado. Após as amostras bacterianas terem
sido recolhidas, foram centrifugadas, sendo removido o sobrenadante, com cuidado,
para não remover material celular junto. Tais amostras foram adicionadas de água
destilada novamente, para lavagem (remoção de qualquer resto de meio no interstício), e
então centrifugada novamente para diminuição do volume do sobrenadante. Os tubos
foram mantidos então em estufa com temperatura acima de 60 °C, até que a massa fosse
constante. Pelo cálculo da diferença entre o valor final obtido após a secagem das
amostras na estufa e o valor do tubo vazio, é possível chegar a massa celular em 2 mL.
Com a mesma cultura de onde tais amostras foram removidas, foi feita uma
curva de calibração, que permitiu a geração de uma equação para determinação da
massa seca da biomassa. Abaixo estão apresentadas as curvas de calibração e suas
equações para: (1) Halomonas salina; (2) Halomonas elongata; (3) Halomonas
boliviensis (Figuras abaixo):
Figura 20: Curva de Calibração para Halomonas salina, com R2= 0,9987.
51
Figura 21: Curva de Calibração para Halomonas elongata, com R2= 0,9993.
Figura 22: Curva de Calibração para Halomonas boliviensis, com R2= 0,9995.
52
4.3.3 Quantificação do substrato de produtos do bioprocesso – Métodos Analíticos
As concentrações de ectoína e glutamato monossódico foram determinadas por
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC – Waters, Milford, MA, E.U.A.), como
descrita por Onraedt em 2005, em um sistema HPLC Waters com uma coluna Aminex
HPX-87C (Biorad) e um detector UV a 65 ºC. Cloreto de cálcio (5 mM) foi utilizado
como fase móvel, com uma taxa de fluxo de 0,3 mL/min. Os compostos foram
monitorados a 210nm.
As concentrações foram calculadas por comparação com padrões externos de
concentração conhecida, com áreas cromatográficas calculadas pelo próprio
equipamento. Os padrões utilizados foram da marca Sigma Aldrich, e na figura abaixo
(Figura 23) é possível observar o perfil cromotográfico de ectoína e de glutamato
monossódico.
Ecto
ína -
75,7
61
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Minutes
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 70,00 75,00 80,00 85,00 90,00 95,00 100,00
Glu
tam
ato
- 2
5,6
48
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00 36,00 38,00 40,00 42,00 44,00 46,00 48,00 50,00
Figura 23: Cromatogramas padrão para a determinação da concentração de (a)
ectoína e (b) glutamato monossódico.
4.4 Fermentação em Frasco Agitados
Dois experimentos distintos foram realizados em frascos agitados. No primeiro deles,
foram testadas concentrações iniciais de pré-inóculo, com 10 e 20% (v/v) a fim de se
observar possível ganho na produção de ectoína. H. salina foi ativada em frascos de Cônicos
de 500 mL com 200 mL de meio de ativação, em agitador rotatório (New Brunswick
Scientific Co, NJ, USA), a 30 ºC e 200 rpm por 24 horas. Após a ativação, 20 e 40 mL dessa
cultura foram adicionados nos respectivos frascos, e a cultura foi incubada a 30 ºC em
agitação de 200 rpm. Amostras foram removidas em intervalos constantes, para o
53
levantamento do perfil cinético.
No segundo deles, foram utilizados frascos de Cônicos tradicionais e também os
frascos de Cônicos que continham chicanas em sua parede interna. A cultura foi incubada a
30ºC em agitação de 200 rpm, e amostras foram removidas em intervalos constantes, para o
levantamento do perfil cinético. Após a centrifugação por 10 minutos a 10000 rpm, o
sobrenadante foi guardado para análise das concentrações de substrato e de produto,
enquanto o sedimentado foi analisado por espectrofotometria, para quantificação da
biomassa bacteriana.
4.5 Fermentação em Reator Instrumentado
4.5.1 Biorreator de 2 L
H. salina foi ativada em frascos de Cônicos de 500 mL com 200 mL de meio de
ativação, em agitador rotatório (New Brunswick Scientific Co, NJ, USA), a 30ºC e 200
rpm por 24 horas. Subsequentemente, 100 mL (10% v/v) da suspensão bacteriana foram
inoculados em 1 L de meio de fermentação otimizado em um biorreator instrumentado
de 2 L (BioFlo – New Brunswick Scientific Co, NJ, EUA – Figura 25). A fermentação
foi realizada em 30 ºC, pH 7,1 com agitação de 400 rpm e aeração variou conforme
indicado. A taxa de aeração utilizada foi de 1,7 vvm. Amostras foram removidas em
intervalos constantes, para o levantamento do perfil cinético. Após a centrifugação por
10 minutos a 10000 rpm, o sobrenadante foi guardado para análise das concentrações de
substrato e de produto, enquanto o sedimentado foi analisado por espectrofotometria,
para quantificação da biomassa bacteriana. Para amostragem do sistema, pipetas de
vidro de 5 mL foram utilizadas.
4.5.2 Biorreator de 4 L
H. salina foi ativada em frascos de Cônicos de 500 mL com 200 mL de meio de
ativação, em agitador rotatório (New Brunswick Scientific Co, NJ, USA), a 30 ºC e 200
rpm por 24 horas. Subsequentemente, 200 mL (10% v/v) da suspensão bacteriana foram
inoculados em 2 L de meio de fermentação otimizado em um biorreator instrumentado
de 4 L transferidos para o reator mecanicamente agitado, com volume final de 2 L do
meio de fermentação otimizado (BioFlo – New Brunswick Scientific Co, NJ, EUA). A
fermentação foi realizada em 30 ºC, pH 7,1 com agitação de 350 rpm. As taxas de
aeração utilizadsa foram de 1,7 vvm e 2,5 vvm. A aeração começou em 500 rpm, sendo
54
aumentada para 600 rpm com 10 horas de processo, e 700 rpm com 16 horas. Amostras
foram removidas em intervalos constantes, para o levantamento do perfil cinético. Após
a centrifugação por 10 minutos a 10000 rpm, o sobrenadante foi guardado para análise
das concentrações de substrato e de produto, enquanto o sedimentado foi analisado por
espectrofotometria, para quantificação da biomassa bacteriana. Para amostragem do
sistema, pipetas de vidro de 5 mL foram utilizadas.
Figura 24: Biorreator instrumentado, BioFlo 310 (New Brunswick Scientific).
4.6 Planejamento Experimental
Empregou-se um delineamento composto central rotacional com base na
metodologia de superfície de resposta. As variáveis independentes e os seus respectivos
níveis de concentrações estão listados abaixo (Tabela 12). Para o glutamato
monossódico e o cloreto de sódio, as concentrações utilizadas na literatura (LANG et
al., 2011) foram mantidas no valor codificado de 0 (zero), enquanto a concentração de
fosfatos foi mantido no valor codificado de -1,68, sendo essa a menor concentração
utilizada, já que esperava-se observar o papel de tampão. A variável resposta escolhida
foi a produção de ectoína. A solução de fosfato utilizada seguia a proporção de 1 : 3
(K2HPO4 : KH2PO4) (LANG et al., 2011), como indicado na literatura , tendo a sua
55
concentração final alterada no meio. Um total de 17 experiementos com diferentes
combinações de concentrações de nutrientes foram realizados, com 3 pontos centrais .
As análises de regressão e análi
se de variância (ANOVA) foram realizadas utilizando softwares Design Expert 10 e
Statistica 7.0. O teste de Student’s t foi utilizado para determinar a significância dos
coeficientes de regressão das variáveis para um intervalo de confiança de 95 %.
Tabela 12: Variáveis Independentes e suas Concentrações no DCCR
Parâmetro Valores codificados e sua concentração (g/L)
+1,68 +1 0 -1 -1,68
Glutamato Monossódico (A) 60,0 53,93 45,0 36,07 30,0
Cloreto de Sódio (B) 60,0 51,9 40,0 28,1 20,0
Fosfato (C)* 24,0 21,57 18,0 14,43 12,0
A matriz utilizada para a realização dos experimentos, com valores codificados está
ilustrada abaixo (Tabela 13):
Tabela 13: Matriz experimental do DCCR
Glutamato
Monossódico
Cloreto de Sódio Fosfatos
1 0 0 -1,68
2 0 0 +1,68
3 1,68 0 0
4 0 0 0
5 -1 1 1
6 0 -1,68 0
7 -1 -1 -1
8 1 1 1
9 -1,68 0 0
10 0 0 0
11 -1 -1 1
12 1 -1 1
13 -1 1 -1
14 1 -1 -1
15 0 0 0
16 1 1 -1
17 0 1,68 0
56
4.6.1 Validação da otimização experimental
Para validar e confirmar a condição ótima predita pelo programa Design Expert 9.0, foi
utilizada a função desejabilidade (“desirability”), onde há uma busca pela combinação
de fatores que maximiza as variáveis de resposta. Tal função obtem um número que
varia entre 1 e 0, onde 1 corresponde a total satisfação dos objetivos, e 0,
impossibilidade de satisfação dos objetivos (MONTGOMERY, 2001). Os fatores
otimizados foram glutamato monossódico, cloreto de sódio e fosfato. O experimento foi
realizado em triplicatas em frascos agitados, no mesmo sistema e condições utilizados
para a realização do planejamento experimental.
4.7 “Ordenha Bacteriana”
Para realizar a cinética da “ordenha bacteriana”, uma fermentação em frascos agitados
foi realizada com o meio de fermentação original. Após 24 horas de processo, amostras de 1
mL da cultura foi centrifugada por 10 minutos a 10000 rpm e o sobrenadante foi descartado.
O sedimentado foi ressuspendido em água destilada no mesmo volume do sobrenadante. A
amostra foi inoculada no agitador rotatório (New Brunswick Scientific Co, NJ, USA), a
30ºC e 200 rpm. Após intervalos de 30 minutos e de duas horas, a amostra foi novamente
centrifugada e o sobrenadante foi enviado para análise. Nos experimentos seguintes, a
ordenha bacteriana teve o tempo estabelecido em 30 minutos, seguindo o mesmo protocolo
acima.
4.8 Variáveis de resposta
Para uma avaliação quantitativa dos fenômenos mais relevantes ao processo,
convém explicitar as principais variáveis envolvidas, conforme a seguir:
Fator de rendimento em ectoína ( ) formado por glutamato monossódico
( ) consumido (g/g)
57
Fator de rendimento em biomassa ( ) formada por glutamato
monossódico consumido (g/g)
Fator de rendimento em ectoína produzida por massa celular formada
(g/g)
Produtividade volumétrica em ectoína ( ) e massa celular ( ) (g/L.h)
Taxa específica de crescimento celular ( ) (h-1)
Redução percentual de substrato (%)
Tempo de duplicação (h)
58
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Curvas de Ativação
Com a finalidade de se iniciar o processo de produção de ectoina, especial atenção
foi dada as etapas de ativação e propagação das três espécies de Halomonas em estudo,
Halomonas salina DSM 5928, Halomonas elongata DSM 2581 e Halomonas
boliviensis DSM 15516. Estas etapas são compulsórias no desenvolvimento de qualquer
bioprocesso, pois não só permitem a aclimatação das células às condições de cultivo,
mas também o aumento das concentrações celulares a fim de se inocular o sistema
reacional com uma suspensão suficientemente concentrada de células. Isto se faz
necessário para que sejam atingidos valores das variáveis de resposta do bioprocesso
compatíveis com os requisitos para a sua comercialização. Os resultados de ativação
estão apresentados nas figuras que se seguem:
59
Figura 25: Curva de ativação de H. salina DSM 5928. S0= 30g/L
É possível observar que a cepa praticamente entra em fase de crescimento não
exibindo fase de adaptação perceptível. As células de H. salina continuaram crescendo
até aproximadamente 27 horas, entrando então na fase estacionária. A concentração
celular atingiu o valor de 4 g/L, e o consumo de glutamato foi de aproximadamente 7
g/L.
Figura 26: Curva de ativação de H. elongata DSM 2581. S0= 30g/L
Com uma fase de adaptação mais acentuada, a cultura de H. elongata demorou
aproximadas 24 horas para chegar à fase estacionária, com concentração celular de
aproximadamente 4,4 g/L.
60
Figura 27: Curva de ativação de H. boliviensis DSM 15516. S0= 30g/L
Com uma fase de adaptação também mais acentuada, a cultura de H. boliviensis
foi a que demorou mais, chegando na fase estacionária depois de aproximadamente 40
horas, porém apresentou também maior crescimento, com uma concentração celular
final de aproximadamente de 8 g/L.
Na tabela a seguir (Tabela 14) são reportados os valores de concentração celular
máxima atingidos nos diferentes cultivos de ativação, bem como a taxa específica de
crescimento das cepas de Halomonas.
Tabela 14: Principais variáveis de resposta dos cultivos de ativação
Cepa Xmáx (g/L) µ (h-1)
H. salina DSM 5928 4,11 0,24
H. elongata DSM 2581 4,40 0,32
H. boliviensis DSM 15516 8,01 0,36
5.2 Escolha da cepa
Em que pese os valores das principais variáveis de reposta obtidos para a cepa
H. boliviensis terem sido mais elevados quando comparados com as outras duas cepas,
as composições dos meios de cultivo tanto para H. boliviensis quanto para H. elongata
são mais complexas, contendo componentes que seguramente onerarão os custos
operacionais do bioprocesso. A literatura reporta que tanto cepas de H. elongata quanto
de H. boliviensis requerem diferentes condições para o crescimento celular e para a
produção de ectoína, diferentemente de H. salina, que parece ter a síntese de ectoína
associada ao crescimento (LANG et al., 2011; SAUER; GALINSKI, 1998; VAN-
61
THUOC et al., 2010b). Adicionalmente, o cultivo de H. boliviensis é mais longo do que
das outras duas cepas, mesmo em um meio de composição mais complexa.
Desta forma, Halomonas salina DSM 5928 foi escolhida para dar
prosseguimento aos estudos de produção de ectoína. Ressalta-se, ainda, que os
principais fatores que pesaram nesta decisão foram a simplicidade do meio de cultivo,
as concentrações mais baixas de cloreto de sódio necessárias para a obtenção do
produto-alvo, o cultivo mais rápido e também indicações da literatura que esta cepa
secreta ectoína durante o processo de crescimento, indicando um potencial de aplicação,
em uma cultura contínua para a síntese do produto (PASTOR et al., 2010; ZHANG;
LANG; NAGATA, 2009). Outro aspecto que merece registro refere-se a mesma
concentração de sal necessária tanto para o crescimento da bactéria halofílica quanto
para a secreção do produto de interesse, possibilitando uma concepção de processo em
que o crescimento e a produção possam ocorrer no mesmo biorreator (LANG et al.,
2011). Todo este conjunto de observações e constatações conduziu a seleção da cepa de
H. salina.
5.3 Avalição da necessidade de preparo de pré-inóculo da cepa selecionada
Com a intenção de se obter maiores concentrações celulares para tornar as
fermentações mais rápidas e eficientes, avaliou-se a necessidade de mais uma etapa no
desenvolvimento do bioprocesso, ou seja se uma única etapa de ativação supriria o
sistema de fermentação com concentrações de células suficientes para se levar a cabo o
processo produtivo a produção de ectoína. O que norteou esta investigação foi a
observância de ausência de fase de adaptação na etapa de ativação, denotando que a
cultura já está bem adaptada. Porém, uma curva de propagação foi realizada com a
intenção de confirmar esses dados, utilizando o meio de ativação (Figura 28).
É possível observar que a o crescimento não foi mais eficiente do que o
crescimento observado na ativação, de toda forma foi similar, mostrando a não
necessidade dessa etapa, passando assim direto da etapa de ativação para a fermentação.
Essa é mais uma característica positiva da cepa escolhida, pois assim o tempo total
necessário para a produção de ectoína será menor, aumentando a produtividade global
do processo, o que tem como consequência a redução dos custos do processo, tornado
dispensável um novo cultivo bacteriano, assim como redução de custos energéticos
associados à esterilização de um novo meio, dentre outros fatores.
62
Figura 28: Curva de propagação de H. salina DSM 5928
A literatura reporta que o tamanho do inóculo é capaz de afetar a taxa do
processo biológico, tornando a fase de adaptação menor, ou mesmo extinguindo-a.
Como padrão, 10% (v/v) do volume do pré-inóculo são utilizados como inóculo do
processo fermentativo. Porém, em algumas situações, há a necessidade de aumentar a
quantidade de células no inóculo (STANBURY; WHITAKER; HALL, 1995). Neste
contexto, avaliou-se a influência do tamanho do inóculo, empregando-se duas
concentrações iniciais de células (10% e 20% v/v).
Embora tenha sido observada uma pequena melhoria no crescimento celular, não se
verificam ganhos no consumo de substrato, tampouco na produção de ectoína, quando o
inóculo teve a sua concentração aumentada (Figura 29). A concentração de ectoína
indicada no gráfico da Figura 29 representa o somatório de suas quantidades mássicas
(extracelular e aquela secretada na ordenha bacteriana). Estas observações de certa
forma nos surpreenderam, na medida em que se esperavam melhores respostas no
sistema inoculado com a maior concentração celular. Visando dirimir esta questão,
investigou-se se a aeração desempenhava um papel importante nas respostas celulares.
Os perfis cinéticos similares indicaram que o cultivo inoculado com a maior
concentração celular (20% v/v) podia estar limitado no que se refere ao suprimento de
oxigênio. Esta observação conduziu ao estudo desta variável de processo (grau de
aeração) com maiores detalhes, cujos resultados serão apresentados na sequência.
63
Figura 29: Cinética da fermentação para produção de ectoína com dois tamanhos
de pré-inóculo, 10 e 20% (v/v)
5.4 “Ordenha Bacteriana”
5.4.1 Frascos cônicos agitados
Apesar de a literatura indicar que H. salina secreta ectoína de forma majoritária
(LANG et al., 2011), não havendo indicação da necessidade de se provocar um choque
osmótico para se aumentar a produção deste soluto compatível, ao se realizar um
experimento confirmatório, foi observado que a cepa faz sim acúmulo intracelular de
ectoína, secretando-a quando estimulada (Figura 30). A concentração de ectoína no
sobrenadante representa o que foi secretado naturalmente pelas células. Com o objetivo
de se verificar se a taxa de secreção do produto intracelular, dois intervalos de tempo
foram investigados: 30 minutos e 2 horas. É possível observar que 30 minutos são
suficientes para que H. salina secrete a ectoína intracelular, reequilibrando a pressão
osmótica exercida durante o cultivo bacteriano. Observam-se aumentos de
aproximadamente 400% quando a técnica de “ordenha bacteriana” foi empregada. Estes
resultados colidem com o que é preconizado na literatura.
64
Figura 30: Ectoína secretada naturalmente e a obtida por “ordenha bacteriana”
com células cultivadas em frascos cônicos agitados
5.4.2 Frascos cônicos agitados com chicanas
Com o propósito de se aumentar a turbulência nos frascos e, por conseguinte,
aumentar a disponibilidade de oxigênio no sistema, foram empregados frascos com
reentrâncias, denominadas de chicanas. O emprego deste sistema resultou em uma
maior secreção de ectoína (Figura 31), o que seguramente foi decorrente de um maior
crescimento celular e do papel importante que o oxigênio desempenha neste
bioprocesso. No gráfico da Figura 31, é possível observar que a condição de
fermentação em frascos agitados com chicanas aumenta muito a concentração de
ectoína no sobrenadante (chamada de ectoína extracelular) se aproximando à
concentração de ectoína obtida com a “ordenha bacteriana” (“bacterial milking”) e,
desta forma, diminuindo a proporção entre as duas (Tabela 15). Em sistemas de baixa
aeração, a concentração de ectoína no sobrenadante não é significativa, ficando próxima
a zero, como mostrado no gráfico da Figura 30.
65
Figura 31: Concentração de ectoína no sobrenadante e na ordenha bacteriana, em
frascos cônicos agitados dotados de chicanas
Tabela 15: Proporção entre ectoína no sobrenadante (EctExt) e na ordenha
bacteriana (BM) e as concentrações máximas de ectoína (EctExt + EctBM)
0 h 32 h 58 h
EctExt:EctBM 0,061 0,535 0,722
[Ect]total (g/L) 0,296 1,314 1,595
5.5 Planejamento Experimental
Como descrito em Materiais e Métodos, três parâmetros definidos tiveram suas
concentrações estudadas a fim de se buscar uma condição ótima para a síntese de
ectoína, no intervalo dos fatores selecionados. Assim, usando a técnica do DCCR para
três fatores e 5 níveis codificados, as faixas de concentração de cada componente foram
determinadas como mostrada na Tabela 12. Um total de 17 experimentos com diferentes
combinações de concentrações e 3 pontos centrais foram ensaiados, obtendo os
seguintes valores de concentração de ectoína (Tabela 16).
A análise de variância (ANOVA) foi realizada para um intervalo de confiança de
95%. A falta de ajuste foi não significativa, apresentando p < 0,05, sendo possível então
atestar a validade do modelo. Isto porque a quantidade de variação não explicada é
significativamente menor que a variação devido ao modelo (BARCELOS, 2012). O
modelo de estudo apresenta um valor para o coeficiente de determinação, R2, de 0,6975,
mostrando que 69,7% das variações são explicadas pelo modelo ajustado, sendo
significativo e podendo ser utilizado para fins preditivos, se considerado que consiste
em um modelo biológico. Ao observarmos o gráfico que compara valores preditos com
66
valores experimentais, é possível analisar que a qualidade do ajuste do modelo estudado
é alta, corroborando para a validação do modelo (Figura 32). É possível observar que os
pontos dos valores experimentais ficam distribuídos normalmente, ou seja, desvios
positivos e negativos em uma proporção similar.
Tabela 16: Condições do planejamento experimental e resultados obtidos
Experimento Concentrações (g/L) Variável de Resposta
(Ectoína, g/L) GMS NaCl PO4
1 40 40 12 0,306
2 40 40 24 0,448
3 60 40 18 0,346
4 45 40 18 0,414
5 36 51,9 21,6 0,380
6 45 20 18 0,148
7 36 28,1 14,5 0,254
8 54 51,9 21,6 0,362
9 30 40 18 0,310
10 45 40 18 0,464
11 36 28,1 21,6 0,214
12 54 28,1 21,6 0,366
13 36 51,9 14,5 0,324
14 54 28,1 14,5 0,190
15 45 40 18 0,280
16 54 51,9 14,5 0,434
17 45 60 18 0,400
A equação apresentada é:
Y[ectoína] = +0,38 + 0,018.A + 0,066.B + 0,026.C + 5E-4.AB - 0,021.A² - 0,040.B²
De acordo com a equação, é possível observar que o cloreto de sódio (parâmetro
B) possui maior coeficiente linear (+0,066), seguido do fosfato (parâmetro C) (+0,026)
e do glutamato monossódico (parâmetro A) (+0,018), porém tais valores se
apresentaram muito baixos. Do mesmo modo, as interações entre os fatores também
apresentam valores baixos. Isso pode ser explicado pelo fato de o microrganismo ser
extremófilo, sendo resistente a grandes alterações de concentração de sal, o que faz com
que essas diferenças não sejam capazes de causar grandes efeitos sobre o crescimento
celular e a síntese de ectoína.
De acordo com o gráfico de Pareto (Figura 33), constata-se que apenas o cloreto
de sódio apresenta significância no processo, tendo um efeito positivo na produção de
ectoína. Porém, tal parâmetro apresenta efeito quadrático negativo. Uma explicação é o
fato que altas concentrações desse componente tornam a pressão osmótica do meio
67
muito alta, tornando-se inibitória para o crescimento celular e a produção de ectoína. Os
outros componentes, apesar de serem indicados como não significativos, não podem ser
excluídos do meio de cultivo já que são essenciais para o crescimento, como o
glutamato monossódico, que é a fonte de carbono e de nitrogênio do meio de cultivo.
Figura 32: Valores preditos e valores experimentais obtidos no planejamento
experimental
Figura 33: Gráfico de Pareto, indicando quais variáveis são significativas em p <
0,05. Variável: Ectoína. Três fatores e cinco níveis
68
Para encontrar valores operacionais ótimos que satisfaçam simultaneamente
todos os requisitos operacionais, calculou-se a desejabilidade (desirability) do sistema.
No caso do sistema aplicado, o valor da função desejabilidade foi de 0,971, que
significa que a otimização por esta função atende em 97,1% o máximo obtenível. Para a
condição otimizada, o programa retornou com as seguintes concentrações (g/L):
glutamato monossódico, 48,9; cloreto de sódio, 49,8; fosfato mono e dibásico de
potássio, 21,57; MgSO4, 0,1; MnSO4, 0,01 (Figura 34). Assim, um ensaio foi realizado
para validação do planejamento experimental (Figura 35), obtendo uma concentração
média de ectoína de 420 mg/L, ficando no intervalo de confiança dado pelo programa,
entre 370 e 510 mg/L. O intervalo de tempo final para experimentação foi de 50 horas,
pois a cultura já se apresentava na fase de morte e a concentração de ectoína, constante.
Tendo em vista tais valores, é possível chegar um valor de produtividade volumétrica
de, aproximadamente, 12 mg/Lh. A concentração residual de glutamato de sódio foi de,
aproximadamente, 36 g/L, tendo havido um consumo deste nutriente de 13 g/L; logo,
fornecendo um valor de rendimento em ectoína de YP/S= 48 mg produto/g substrato
consumido e rendimento em células de YX/S= 0,342 g célula/ g substrato consumido.
Figura 34: Superfície de resposta para a síntese de ectoína com valor da
concentração de fosfato fixado em 21,6 g/L
69
Figura 35: Cinética de produção de ectoína em condições otimizadas em frascos
agitados sem chicanas. Legenda: ectoína total (círculo azul), concentração de
glutamato monossódico (círculo verde) e concentração celular (círculo vermelho)
Com a intenção de se confirmar o resultado obtido com o planejamento
experimental, uma fermentação em frascos agitados com o meio otimizado foi
realizada, e então o sistema foi validado, porém, foi possível observar que o consumo
do substrato, e, por conseguinte a produção de ectoína, não foram eficientes, indicando
que havia um limitante ao processo. Como os frascos agitados têm como modo de
aeração apenas a agitação (aeração superficial) é muito provável que tal limitante seja a
aeração. A fim de se confirmar resultados preliminares, experimentos foram realizados
com frascos agitados com chicanas, como descrito no próximo tópico.
5.6 Fermentação em Frascos Agitados sem e com chicanas
Uma vez que a aeração mostrou-se ser um fator limitante na produção de ectoína,
foi feita uma comparação entre a fermentação em frascos agitados com e sem a presença
de chicanas. Como mencionado, as chicanas fazem com que a transferência de oxigênio
seja mais eficiente, aumentando assim o oxigênio dissolvido presente no meio. O
acompanhamento cinético do processo de produção de ectoína nos sistemas com e sem
chicanas está apresentado na figura 36.
Claramente, observa-se a imprescindibilidade da disponibilidade de oxigênio para a
produção da molécula em estudo. O maior suprimento de oxigênio aumentou em 165%
a concentração celular, e em 560% a concentração de ectoína (Tabela 17). Além do
70
aumento significativo da concentração de ectoína, o valor de YP/X também aumentou,
denotando o aumento da capacidade produtiva da célula. Lang et al. (2011) realizaram
fermentações com H. salina em biorreatores instrumentados, chegando a concentrações
celulares máximas de 35 g/L, e de ectoína de 8,2 g/L. Porém, a concentração inicial de
glutamato era de 80 g/L, fornecendo valores de YP/X = 0,234 g/g. Nossos resultados
alcançaram valores de YP/X = 0,336 g/g, o que consideramos positivo face à produção de
ectoína ter sido até o presente momento realizada em frascos agitados, diferentemente
de biorreatores instrumentados nos quais o suprimento de oxigênio se dá de maneira
muito mais eficiente.
Figura 36: Gráfico comparativo entre fermentação em frascos agitados com e sem
chicanas, no meio otimizado pelo DCCR
A figura a seguir ilustra os cultivos conduzidos em frascos sem e com chicanas, nos
quais se observa nítida diferença na turbidez dos meios, evidenciando um maior
crescimento celular nos frascos com chicanas.
Além do fator YP/X ter sido mais alto, a produtividade volumétrica também
aumentou significativamente, com um ganho de 4,7 vezes. O consumo de glutamato
monossódico foi muito maior, indicando um maior aproveitamento na utilização do
substrato. Novamente, é válido ressaltar que os frascos cônicos com chicanas propiciam
uma maior disponibilidade de oxigênio do que os frascos sem as chicanas, porém,
continua sendo limitado.
71
Figura 37: Cultivos em frascos sem e com chicanas para a produção de ectoína. O
meio utilizado foi o meio de fermentação otimizado, e as condições foram: 30º C,
200 rpm e pH 7,1
Os valores finais de concentração de ectoína e os cálculos de variáveis foram
realizados levando em consideração o somatório da ectoína presente no sobrenadante e
a ectoína obtida na “ordenha bacteriana”. As demais variáveis estão descritas abaixo
(Tabela 17):
Tabela 17: Variáveis de resposta de fermentações em frascos agitados sem e com
chicanas
Variável Frasco sem
Chicanas
Frasco com
Chicanas
tempo (h) 30 42
µ (h-1) 0,111 0,149
td (h-1) 6,243 4,651
YP/S (g/g) 0,048 0,073
YP/X(g/g) 0,140 0,336
YX/S (g/g) 0,342 0,219
RPS (%) 16,0 69,54
X máx (g/L) 2,542 6,692
Ect máx (g/L) 0,331 2,188
QP (g/L.h) 0,011 0,052
QX (g/L.h) 0,085 0,159
5.7 Avaliação do Grau de Aeração em Biorreator Agitado Mecanicamente
para Produção de Ectoína
Após a otimização do meio de fermentação para a produção de ectoína em
frascos e a sinalização da essencialidade da aeração, passou-se, então à avaliação da
produção deste soluto compatível em biorreatores instrumentados. Nestes equipamentos
é possível empregar maior controle das condições de fermentação, como pH, importante
72
no processo, pois o metabolismo de glutamato monossódico libera amônia, tornando o
meio de cultivo mais básico, e logo, menos propício para a atividade da bactéria em
estudo (ONRAEDT et al., 2005). No entanto, o que se pretendeu foi empregar
condições de aeração e agitação mais eficientes, a fim de se aumentar a disponibilidade
de oxigênio às células bacterianas. Uma fermentação inicial foi conduzida em batelada
simples empregando as seguintes condições de aeração: taxa de aeração de 1,7 vvv e
velocidade de agitação de 350 rpm (experimento denominado de Reator I). Os
resultados obtidos durante o acompanhamento cinético estão ilustrados no gráfico a
seguir (Figura 38):
Figura 38: Produção de ectoína em biorreator instrumentado (Biorreator I) com o
meio de fermentação otimizado por DCCR para H. salina DSM 5928, com taxa de
aeração de 1,7 vvm e velocidade de agitação de 350 rpm
Novamente, os resultados obtidos tornam clara a necessidade de maior aeração
do sistema, pois com a manutenção de maiores concentrações de oxigênio dissolvido no
sistema houve um aumento significativo na produção de ectoína e no crescimento
celular. Como apresentado na tabela 18, observa-se um ganho expressivo na
concentração de ectoína de 380% quando comparado aos resultados provenientes do
sistema de frascos cônicos agitados sem chicanas, o que foi seguramente decorrente de
um maior consumo de substrato (aproximadamente 70%), resultando em concentrações
de células (8,5 g/L) e, consequentemente, de ectoína (1,6 g/L) mais elevadas. Porém,
devido às altas concentrações celulares e ao metabolismo ativo das células bacterianas,
as condições de aeração ainda se mostraram limitadas, o que nos motivou a investigar
73
outras condições de aeração e agitação, aumentando a disponibilidade de oxigênio, ou
seja, mantendo a taxa de aeração em 1,7 vvm, mas variando com o tempo a velocidades
de agitação.
Tabela 18: Variáveis de resposta obtidas nos cultivos em frascos cônicos e em
biorreator instrumentado com o meio otimizado (1,7 vvm e 350 rpm)
Variável Frascos Cônicos
sem chicanas
Frascos Cônicos
com chicanas Biorreator I
tempo (h) 30 42 52
µ (h-1) 0,111 0,149 0,109
td (h-1) 6,243 4,651 6,358
YP/S (g/g) 0,048 0,073 0,048
YP/X(g/g) 0,140 0,336 0,187
YX/S (g/g) 0,342 0,219 0,259
RPS (%) 16,0 69,54 70,19
X máx (g/L) 2,542 6,692 8,518
Ect máx (g/L) 0,331 2,188 1,595
QP (g/L.h) 0,011 0,052 0,031
QX (g/L.h) 0,085 0,159 0,164
Como reportado na literatura para outras cepas, as fermentações para a produção
de ectoína em biorreatores agitados mecanicamente costumam ser realizadas com
velocidades de agitações mais elevadas, muitas vezes chegando a valores de 1.100 rpm
(VAN-THUOC et al., 2010a), já que a demanda de oxigênio da cultura é bastante
elevada. Assim, com um aumento progressivo na agitação, espera-se que a
disponibilidade de oxigênio aumente com o curso do cultivo. Iniciou-se o experimento
com a taxa de aeração de 1,7 vvm e 500 rpm, alterando a velocidade de agitação para
600 rpm, após 10 horas de processo e para 700 rpm, após 16 horas, com o objetivo de
manter os valores de oxigênio dissolvido acima de 20% da saturação (experimento
denominado de Reator II). A velocidade de agitação era alterada sempre que havia uma
diminuição significativa no oxigênio dissolvido no meio de fermentação, que não devia
ser inferior ao valor inferido. O perfil cinético deste ensaio está apresentado na figura
39.
Ganhos expressivos foram obtidos com essa alteração operacional. A
concentração máxima de ectoína aumentou em duas vezes, passando de 1,6 g/L no
biorreator com agitação mecânica de 350 rpm, para 3,2 g/L, nas condições adotadas
neste ensaio que visavam a manutenção da concentração de oxigênio dissolvido acima
de 20% da saturação. Constata-se, ainda, uma diminuição no tempo de fermentação, que
foi de 16 horas para atingimento da concentração máxima de ectoína, bem mais
74
reduzido quando comparado com o tempo obtido no ensaio anterior (52 horas). Esta
redução no tempo de fermentação reflete, obviamente, na produtividade volumétrica,
que teve o seu valor aumentado em, aproximadamente, 6 vezes (0,031 g/L.h para o
ensaio em biorreator agitado com 350 rpm e 0,184 g/L.h para aquele realizado com
maior disponibilidade de oxigênio).
Figura 39: Fermentação em biorreator instrumentado (Biorreator II) com o meio
de fermentação otimizado por DCCR para H. salina DSM 5928, com taxa de
aeração de 1,7 vvm e velocidade de agitação variando com o tempo
Os valores de YP/X também aumentaram (0,187 g/g para o Biorreator I, e 0,538
g/g para o Biorreator II), denotando que a capacidade produtiva da célula também
aumentou. Por outro lado o valor do fator YX/S foi reduzido (0,147 g/g) quando se
compara com o obtido (0,259 g/g) no ensaio anterior (Reator I). Este resultado indica
que a maior disponibilidade de oxigênio parece favorecer a síntese de ectoína em
detrimento do crescimento celular, o que é corroborado pelo maior valor do fator de
rendimento YP/S (0,08 g/g) obtido neste ensaio e pela maior redução percentual do
substrato (88,65%). Os resultados indicam ainda que com maior suprimento de oxigênio
há um maior direcionamento do consumo de substrato para a síntese de ectoína. Artigos
publicados com H. salina reportam valores de YP/X bem menores, entre 0,234 g/g
(LANG et al., 2011) e 0,357 g/g (ZHANG; LANG; NAGATA, 2009) do que o obtido
neste ensaio (0,538 g/g).
75
As variáveis de resposta obtidas neste ensaio estão apresentadas na tabela abaixo
(Tabela 19):
Tabela 19: Variáveis de resposta dos ensaios codificados como
Biorreator I (agitação constante) e Biorreator II (agitação variável)
Variável Biorreator I
(N=350 rpm)
Biorreator II
(N variável)
tempo (h) 52 16
µ (h-1) 0,109 0,207
td (h-1) 6,358 3,348
YP/S (g/g) 0,048 0,080
YP/X(g/g) 0,187 0,538
YX/S (g/g) 0,259 0,147
RPS (%) 70,19 88,65
X máx (g/L) 8,518 5,727
Ect máx (g/L) 1,595 3,176
QP (g/L.h) 0,031 0,184
QX (g/L.h) 0,164 0,358
No decorrer do trabalho, os experimentos mostraram a essencialidade do
oxigênio para a síntese de ectoína, fato este que pode ser explicado pela característica
aeróbica da cultura e a necessidade de cultivos com altas densidades celulares a fim de
se alcançarem elevadas concentrações de ectoína. Com o intuito de se avaliar se um
maior grau de aeração levaria a maior expressão de ectoína, aumentou-se a taxa de
aeração para 2,5 vvm e a velocidade de agitação foi alterada em diferentes momentos à
semelhança do biorreator anterior (Biorreator II). Na figura abaixo é possível visualizar
o aspecto de ambos sistemas reacionais. O Biorreator III ao final de 16 horas se
apresentava com o meio em fermentação bastante denso quando comparado com
Biorreator I e observou-se grande formação de espuma. O perfil cinético deste
experimento está apresentado na figura 41, na qual se observam ganhos na produção de
ectoína. Constata-se que não só a concentração final deste soluto compatível foi maior
quando comparada ao Biorreator II, mas também se obtiveram ganhos significativos no
fator de rendimento de produto por substrato consumido, YP/S, no fator de rendimento
de produto por célula, YP/X e na produtividade volumétrica, QP, conforme apresentado
na tabela 20. Ressalta-se que em termos de concentração celular final e de consumo
percentual de substrato, ambos os sistemas resultaram em valores muito próximos.
76
Figura 40: Visualização do crescimento celular em biorreator instrumentado com
o meio de fermentação otimizado por DCCR para H. salina DSM 5928, com
agitação de 350 rpm e taxa de aeração de 1,7 vvm (Biorreator I) e com agitação
variando conforme tempo e taxa de aeração de 2,5 vvm (Biorreator III)
Figura 41: Fermentação em biorreator instrumentado (Biorreator III) com o meio
de fermentação otimizado por DCCR para H. salina DSM 5928, com taxa de
aeração de 2,5 vvm e agitação variando conforme o tempo
A característica secretora da cepa a torna muito atrativa para a síntese de ectoína,
tendo resultado em um fator de rendimento YP/X de 0,883 g/g, sendo o maior valor
obtido no presente estudo. Por outro lado, cepas que não secretam ectoína durante o
77
processo, como H. boliviensis e H. elongata, atingem valores máximos para esta
variável de resposta de 0,25 g/g (VAN-THUOC et al., 2010a).
Tabela 20: Variáveis de resposta do Biorreator instrumentado com maiores
agitações e vazões de ar de 1,7 (Biorreator II) e 2,5 vvm (Biorreator III), em
diferentes tempos
Variável Biorreator II Biorreator III
tempo (h) 20 20
µ (h-1) 0,207 0,261
td (h-1) 3,348 2,655
YP/S (g/g) 0,085 0,140
YP/X(g/g) 0,635 0,883
YX/S (g/g) 0,134 0,159
RPS (%) 87,27 87,0
X máx (g/L) 5,146 5,603
Ect máx (g/L) 3,114 4,764
QP (g/L.h) 0,155 0,238
QX (g/L.h) 0,257 0,280
Com base na estequiometria da reação, a produção máxima teórica é de 0,21 mol
de ectoína/mol de glutamato monossódico (0,17 g ectoína/g glutamato monossódico).
Esta relação permite calcular a eficiência do processo fermentativo, que resulta para o
Biorreator III de 82%, considerado por nós como um valor muito bom. Esse resultado é
muito superior aos reportados na literatura para sistemas similares (batelada simples),
como o relatado com B. epidermis, que forneceu um valor para o fator YP/S de apenas
25% do máximo obtenível pela estequiometria (ONRAEDT et al., 2005).
5.8 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ao término do presente estudo foram alcançados ganhos expressivos na
produção de ectoína, como apresentado no gráfico a seguir, que exibe a evolução do
desenvolvimento do processo para a produção deste importante soluto compatível.
Ficou claro que a elevada pressão osmótica imposta ao sistema de fermentação estimula
a síntese da molécula-alvo deste estudo, que é excluída preferencialmente como forma
de proteger as células das adversidades do meio de cultivo.
Constata-se ainda que a produção de ectoína é associada ao crescimento celular,
sendo parte secretada para o meio externo e outra parte intracelular que pode ser
extraída por intermédio da técnica da “ordenha bacteriana”.
78
Nos gráficos das figuras abaixo, é possível verificar que no início do trabalho,
ainda em sistemas com frascos agitados, que denominamos aqui como controle, obteve-
se uma concentração final de ectoína de 0,3 g/L. Com o desenvolvimento do
bioprocesso, empregando técnicas de planejamento experimental, “ordenha bacteriana”
e investigando o papel importante da aeração, quer por aeração superficial (aquela
conseguida apenas por agitação mecânica) quer por borbulhamento de ar em
biorreatores agitados mecanicamente atingiu-se ao final do processo uma concentração
de ectoína de aproximadamente 5 g/L. Foi, indubitavelmente, um ganho expressivo que
se refletiu sobre a produtividade volumétrica do processo que aumentou em
aproximadamente 20 vezes, com um valor final de 5,5 g/L.dia.
Figura 42: Evolução do processo de produção de ectoína em termos de
concentração de produto
Figura 43: Evolução do processo de produção de ectoína em termos de
produtividade volumétrica
79
6 CONCLUSÕES E SUGESTÕES
A partir de todos os resultados obtidos, apresentados e comentados ao longo
desta dissertação, pode-se concluir que:
Estudos foram realizados a fim de se escolher a cepa mais apropriada para o
trabalho. Parâmetros como tempo de cultivo, composição do meio, concentração
de sal necessária para o estresse osmótico foram considerados, em particular a
simplicidade do meio de cultivo. Desta forma, Halomonas salina DSM 5928 foi a
cepa escolhida para continuidade do trabalho de desenvolvimento de processo
para a produção de ectoína;
A boa adaptabilidade de Halomonas salina DSM 5928, crescendo na fase da
ativação sem exibir fase lag e resultando em altas concentrações celulares nos
levou a suprimir a etapa posterior de propagação, ou seja a etapa de ativação e
propagação foram integradas;
O planejamento experimental indicou apenas o cloreto de sódio como variável
significativa para a produção de ectoína, porém, no sistema biológico, outros
80
nutrientes também são necessários, fazendo com que não seja possível excluí-los
do meio. A composição do meio otimizado é a seguinte (g/L): glutamato
monossódico, 48,9; cloreto de sódio, 49,8; fosfato mono e dibásico de potássio,
21,57; MgSO4, 0,1; MnSO4, 0,01;
O principal fator limitante para a produção de ectoína pareceu ser a aeração, o que
decorre da necessidade de se obterem altas concentrações celulares e das
características do gênero que inclui espécies estritamente aeróbicas. Em
biorreatores instrumentados, sistemas nos quais a aeração é muito mais eficiente
do que em frascos cônicos, há um sinergismo entre agitação mecânica e
suprimento de oxigênio. Elevadas taxas de aeração com variação na velocidade de
agitação foi a estratégia adotada para se lograrem elevadas concentrações de
células e de ectoína. No entanto, problemas ligados a formação de espuma são
mais intenso quanto maior o grau de aeração. A condição que nos parece a melhor
foi: taxa de aeração de 2,5 vvm e agitação mecânica variando de 500 rpm a 700
rpm;
A síntese biotecnológica de ectoína se mostra viável tecnicamente, pois faz uso de
microrganismo de fácil manuseio e com reagentes de custo e toxicidade menores
que os utilizados na síntese química. Além disso, os processos de purificação são
mais simples pela maior especificidade da reação. Vários estudos estão sendo
realizados sobre as aplicações dessa molécula, que parece ter efeitos em várias
doenças e processos tecnológicos, tornando-a de grande importância.
Como sugestões para continuidade do processo, podemos listar:
Avaliar outras formas de condução do bioprocesso, como por exemplo, o
processo contínuo, tendo em vista que a síntese da molécula-alvo ser associada
ao crescimento. Com isto ter-se-ia ganhos em produtividade volumétrica.
Vincular a produção de ectoína ao conceito de biorrefinaria, já que a linhagem
selecionada se mostrou capaz de consumir açúcares presentes no hidrolisado
hemicelulósico (C5 e C6) de resíduos da agroindústria (dados não mostrados);
Construir uma linhagem recombinante com vistas ao aumento do nível de
expressão de ectoína e o bloqueio da conversão em hidroxiectoína.
81
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