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TATIANE MACEDO SILVA
Estudo do modo de transcrição e expressão dos
genes surf de Plasmodium falciparum
Dissertação apresentada ao programa de Pós-
Graduação em Biologia da Relação Patógeno-
Hospedeiro do Departamento de Parasitologia do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade
de São Paulo para obtenção do Título de Mestre
em Ciências.
São Paulo
2015
TATIANE MACEDO SILVA
Estudo do modo de transcrição e expressão dos
genes surf de Plasmodium falciparum
Dissertação apresentada ao programa de Pós-
Graduação em Biologia da Relação Patógeno-
Hospedeiro do Departamento de Parasitologia do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade
de São Paulo para obtenção do Título de Mestre
em Ciências.
Área de concentração:
Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro
Orientador:
Prof. Dr. Gerhard Wunderlich
Versão Original
São Paulo 2015
Dedico este trabalho
aos meus filhos Renan e Alice,
além de todo o meu amor!
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo milagre da vida, pela perfeição da natureza e por ter
me dado capacidade de estar aqui.
Agradeço ao meu esposo Sérgio pelo apoio, pelas caronas e por me financiar
em muitos momentos e aos meus filhos Renan e Alice por sempre me receberem
com um sorriso. Vocês são a razão da minha vida.
Agradeço aos meus pais Suzana e Paulino por ter me ensinado, mesmo na
simplicidade, a acreditar nos meus sonhos. Agradeço aos meus irmãos Thiago,
Thais, Thalita, Thomas, Thaiane e Thissiane, por ter me compartilhado a infância e
me ajudado sempre quando precisei, e aos meus cunhados por completar a família.
Um agradecimento especial para Luis e Michelle e minha avó Terezinha por
me ajudar com as crianças sempre quando precisei.
Agradeço a todos os meus amigos por sempre estarem ao meu lado mesmo
eu ausente e nas horas que chorei, sorri, que me lamentei e que demonstrei total
alegria. Karol você é muito especial!
Agradeço ao Gerd pela oportunidade, pela colaboração, compreensão, por me
ensinar tudo sobre biologia molecular, por sempre manter sua porta aberta em
qualquer momento do dia e estar aberto a novas idéias, críticas e sugestões.
Agradeço ao pessoal do laboratório Eli, Wolf, Gabi, Juliane em especial ao
Wesley pelas várias consultas intelectuais.
Agradeço também aos Laboratórios dos Professores Dr. Cláudio, Dr.
Alejandro, Dr. Carsten, Dra. Silvia Boscardin, e Dra. Sirlei pela disposição em ajudar
ao próximo e pela simpatia.
Agradeço todas as dificuldades e adversidades que enfrentei, pois me
ensinaram a tolerância, o autocontrole, a determinação e a perseverança.
A todos o meu muito obrigada!
Este trabalho contou com o apoio financeiro da
fundação de amparo à pesquisa do Estado de
São Paulo (FAPESP) e da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES).
"Da vida não quero muito. Quero apenas
saber que tentei tudo o que quis, tive tudo o
que pude, amei tudo o que valia e perdi apenas
o que, no fundo, nunca foi meu..." (Autor
desconhecido)
RESUMO
Silva TM. Estudo do modo de transcrição e expressão dos genes surf de
Plasmodium falciparum [dissertação (Parasitologia)]. São Paulo: Instituto de
Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2015.
Um dos fatores mais importantes para a alta virulência de Plasmodium
falciparum é exportar para superfície da hemácia infectada algumas proteínas como
os antígenos PfEMP1 codificados pelos genes var, cuja a transcrição ocorre de
forma especial denominada exclusão alélica. Outra família multigênica, polimórfica,
ainda pouco conhecida é a família SURFIN, codificada por dez genes denominados
surf (surface-associated interspersed genes). Para abordar o modo de transcrição
desses genes e observar se ocorre switching transcricional parecido com o que
acontece com genes var, monitoramos a quantidade de transcritos em cultivos
contínuos analisando amostras por RT-qPCR ao longo de 40 reinvasões, realizando
uma coleta inicial de RNA nas fases anel, trofozoita e esquizonte e outras após 20 e
40 gerações utilizando cepa 3D7 de P. falciparum. Observamos que houve
mudança na quantidade relativa de transcritos surf. Alguns genes parecem pouco ou
não transcritos, enquanto outros foram claramente detectáveis em nossos ensaios e
talvez possuam algum papel funcional na fase sanguínea. Especificamente o gene
surf 4 - de forma constitutiva - apresentou quantidade significativa de transcritos na
fase esquizonte. Para analisar a função de SURFIN 4, construímos linhagens
transgênicas que permitem não apenas localizar o antígeno (por fusão à GFP) mas
também estudar sua importância no ciclo sanguíneo por fusão de um domínio
desestabilizador (DD24) que permite de forma controlada, desestabilizar a proteína.
Enquanto não houve alteração na viabilidade dos parasitas com SURFIN 4
desestabilizado, detectamos que em parasitas com SURFIN 4 desestabilizado houve
um aumento significativo e reprodutível de transcritos surf 4 e outros e isso foi
revertido quando estabilizamos a proteína novamente. Estes achados apontam para
um novo mecanismo de regulação ao menos de gene surf 4 onde a proteína
SURFIN 4 parece ser capaz de modular a quantidade do seu respectivo transcrito.
Palavras-chave: Malária. Plasmodium falciparum. Genes surf. Antígenos SURFIN.
Transcrição de genes.
ABSTRACT
Silva TM. Studies on the mode of transcription and expression of surf genes from
Plasmodium falciparum. [Masters thesis (Parasitology)]. São Paulo: Instituto de
Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2015.
Blood stage forms of the protozoan parasite Plasmodium cause malaria and
express virulence factors at the surface of the infected red blood cell (IRBC) and
many of them are encoded by multigene families. In Plasmodium falciparum, the
most important disease-related, IRBC-exposed proteins are the PfEMP1 antigens
encoded by the var gene family. Var gene expression is controlled in a specific
manner termed allelic exclusion. Another smaller gene family which appears to be
not as variant as the var genes comprises the 10 surf (surface-associated
interspersed genes) genes with yet unknown function. Herein we monitored the
transcription mode of surf genes using continuous blood culture of tightly
synchronized P. falciparum parasites, followed by RT-qPCR analysis of surf
transcripts after 20 and 40 reinvasion cycles. While most surf genes showed differing
transcript quantities, transcription of PF3D7_07_0402200 (surf 4) was reproducibly
stable throughout the experiment. The remaining surf genes were transcriptionally
silent during all time points. In order to elucidate the biological role of the
corresponding SURFIN we genetically tagged the protein with GFP and a
destabilizing domain (DD24). Using a cloned parasite line expressing GFP and DD24
no differential growth rates were observed upon destabilization of SURFIN4-GFP-
DD24. However, when monitoring surf transcription in knocked down and stabilized
parasites lines expressing SURFIN4 GFP-DD24, we found that decreasing SURFIN4
levels led to an increase of its cognate transcript and also some other surf transcripts
and this effect was reversed when SURFIN4 was again stabilized. This points to a
novel feedback control mechanism where the SURFIN 4 protein level has an
influence on the quantities of its cognate transcript.
Keywords: Malaria. Plasmodium falciparum. surf genes. SURFIN antigen.
Transcription profiling.
LISTA DE FiGURAS
Figura 1 - Distribuição global da malária. .................................................................. 21
Figura 2 - Imagem do merozoito. .............................................................................. 23
Figura 3 - Ciclo de vida de Plasmodium em humanos. ............................................. 26
Figura 4 - Representação da invasão do eritrócito por um merozoito. ...................... 28
Figura 5 - Foto de merozoito em processo de invasão no eritrócito. ......................... 29
Figura 6 - Imagem de um esquizonte em eritrócito infectado. ................................... 30
Figura 7 - Antígenos variantes da hemácia infectada e sua suposta localização...... 32
Figura 8 - Características estruturais de SURFIN compartilhadas com proteínas exportadas de várias espécies de Plasmodium. ....................................................... 33
Figura 9 - Mapas dos vetores utilizados .................................................................... 44
Figura 10 - Esfregaços sanguíneos mostrando hemácias infectadas com parasitas sincronizados. ........................................................................................................... 53
Figura 11 - Desempenho dos oligos de surf e do controle endógeno K1 usando gDNA de P. falciparum. ............................................................................................. 55
Figura 12 - Cts obtidos por RT-qPCR da transcrição do gene PF07_0073 (K1) como controle endógeno de P. falciparum .......................................................................... 56
Figura 13 - Quantificação dos transcritos dos genes surf de P. falciparum clone 3D7 em coleta inicial e após 20 e 40 gerações ................................................................ 57
Figura 14 - Quantificação dos transcritos dos genes surf de P. falciparum isolado NF54 em coleta inicial e após 20 e 40 gerações. ...................................................... 58
Figura 15 - Quantificação dos transcritos dos genes surf de P. falciparum isolado de campo de Rondônia em coleta inicial e após 20 e 40 gerações. .............................. 59
Figura 16 - Mapa dos plasmídeo com sítios loxP. ..................................................... 61
Figura 17 - Análise de restrição para confirmação da modificação do vetor para obtenção do plasmideo pS4LOXTERM. .................................................................... 62
Figura 18 - integração por recombinação simples das construções. ......................... 63
Figura 19 - Análise da amplificação por PCR com oligonucleotídeos específicos para detectar modificação no lócus do gene surf 4 de P. falciparum. ............................... 64
Figura 20 - Foto de imunofluorescência, para análise da proteína SURFIN 4 fusionada ao tag GFP, obtido através do Zeiss Axio Imager M2.............................. 64
Figura 21 - Visualização das bandas obtidas após amplificação por PCR para confirmação da linhagem clonal com modificação no locus surf 4. ........................... 66
Figura 22 - Amplificação por PCR para confirmação da inserção do domínio desestabilizador (DD24) no locus surf 4 após seleção clonal. ................................. 67
Figura 23 - Scatter plots da aquisição de 40.000 eventos. Citometria de fluxo de hemácias infectadas com parasita expressando SURFIN 4 GFP. ............................ 68
Figura 24 - Western Blot do ensaio de retirada do ligante estabilizador Shield-1 para análise da performance do knockdown da proteína SURFIN 4 modificada com o domínio desestabilizador (DD24). ............................................................................. 69
Figura 25 - Curva de parasitemia para análise do efeito após SURFIN 4 diminuída mediante resposta ao DD24 por ausência do ligante estabilizador Shield-1. ............ 71
Figura 26 - Análise do efeito de Shield-1 na transcrição dos genes surf de P. falciparum em parasitas controle da cepa 3D7. ........................................................ 72
Figura 27 - Quantificação da transcrição do gene surf 4 após desestabilização condicional da proteína mediante a retirada de Shield-1 da cultura. ......................... 73
Figura 28 - Quantificação de transcritos surf de P. falciparum após desestabilização condicional de SURFIN 4 mediante retirada da droga Shield-1, da cultura. ............. 74
Figura 29 - Análise da emissão de fluorescência GFP fusionado a proteína SURFIN4 de P. falciparum por de microscopia de fluorescência. ............................................. 75
Figura 30 - Localização de SURFIN 4 na hemácia infectada, por microscopia de fluorescência. ............................................................................................................ 76
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Sequências de oligonucleotideos para amplificação dos genes surf.........42
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
AMA 1 APICAL MEMBRANE ANTIGEN AMP AMPICILINA ApiAp2 APICOMPLEXAN APETALA FAMILY 2 (FATOR DE TRANSCRIÇÃO) cDNA DNA COMPLEMENTAR CSA CHONDROITIN SULFATE A Ct THRESHOLD CYCLE DAPI 4',6-DIAMIDINO-2-PHENYLINDOLE DD24 DOMÍNIO DESESTABILIZADOR 24 DNA ACIDO DESOXIRRIBONUCLÉICO E. COLI ESCHERICHA COLI EBA ERYTHROCYTE BINDING ANTIGEN EDTA ÁCIDO ETILENODIAMINOTETRACÉTICO EPCR ENDOTHELIAL PROTEIN C RECEPTOR G ACELERAÇÃO DA GRAVIDADE (9,81 M/S2) gDNA DNA GENÔMICO GFP GREEN FLUORESCENT PROTEIN HA HEMAGLUTININA HS HORAS ICAM 1 INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE 1 MSP MEROZOITE SURFACE PROTEÍN Pb PARES DE BASES PBS PHOSPATE BUFFERED SALINE PCR REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA (POLYMERASE CHAIN REACTION) PEXEL PLASMODIUM ELEMENTO EXPORTAÇÃO
PfEMP1 PLASMODIUM FALCIPARUM ERYTHROCYTE MEMBRANE PROTEIN 1
PfRH P. FALCIPARUM RHOPTRY PTEX PLASMODIUM TRANSLOCON OF EXPORTED PROTEÍNS RIFIN REPETITIVE INTERSPERSED FAMILY RNA ÁCIDO RIBONUCLÉICO RON 2 ROPTRY NECK PROTEÍN 2 RPM ROTAÇÃO POR MINUTO RPMI ROSWELL PARK MEMORIAL INSTITUTE (MEIO DE CULTIVO) RT TRANSCRIÇÃO REVERSA
RT- qPCR TRANSCRIÇÃO REVERSA SEGUIDA DE QUANTIFICAÇÃO POR REAÇÃO DE POLIMERASE EM CADEIA
SDS-PAGE SODIUM DODECYL SULFATE POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS
STEVOR SUB-TELOMERIC VARIABLE OPEN READING FRAME SURFIN SURFACE- ASSOCIATED INTERSPERSED GENES TA TEMPERATURA AMBIENTE TAE TAMPÃO TRIS-ACETATO
TBE TAMPÃO TRIS-BORATO TERM TERMINADOR (DE GENE) TP TIME POINT VSA VARIANT SURFACE ANTIGENS
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 18
1.1 Malária - Um problema mundial ....................................................................... 19
1.2 Malária - Distribuição global e problemas na erradicação ............................ 20
1.3 Malária - O parasita ........................................................................................... 22
1.4 Malária - O mosquito vetor ............................................................................... 26
1.5 Malária - Capacidade de invadir células e evasão imunológica .................... 27
2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS ........................................................................... 35
3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 37
3.1 Isolados de P. falciparum ................................................................................. 38
3.2 Cultivo e armazenagem de P. falciparum ....................................................... 38
3.3 Sincronização das formas de P. falciparum ................................................... 39
3.4 Extração de RNA de cultura de P. falciparum sincronizada e transcrição reversa ..................................................................................................................... 39
3.5 Quantificação dos transcritos por PCR em tempo real ................................. 40
3.6 Extração de gDNA de P. falciparum ................................................................ 41
3.7 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ......................................................... 42
3.8 Purificação de produto de PCR ........................................................................ 43
3.9 Ligação de DNA e transformação .................................................................... 43
3.10 Extração do DNA plasmidial em pequena escala (Minipreps). .................... 45
3.11 Sequenciamento .............................................................................................. 45
3.12 Extração do DNA plasmidial em grande escala, MaxiPrep [65] .................. 46
3.13 Transfecção em P. falciparum ........................................................................ 47
3.14 Ciclagem dos parasitas .................................................................................. 47
3.15 Microscopia de fluorescência ........................................................................ 48
3.16 Citometria de Fluxo ......................................................................................... 48
3.17 Clonagem limitante dos parasitas transfectados ......................................... 49
3.18 Western blot ..................................................................................................... 49
3.19 Densitometria das bandas de western blot ................................................... 50
3.20 Cultivo de P. falciparum com a adição de Shield-1 ...................................... 50
3.21 Ensaio de retirada da droga Shield-1 ............................................................ 50
3.22 Contagem da parasitemia por microscopia .................................................. 51
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 52
4.1 Sincronização de P. falciparum ....................................................................... 53
4.2 Análise do perfil de transcrição de P. falciparum .......................................... 53
4.4 Confirmação da fusão genética após transfecção dos plasmídeos e recombinação simples em surf 4 ........................................................................... 62
4.5 Linhagem clonal de parasitas transgênicos ................................................... 65
4.6 Análise do fenótipo com knockdown de SURFIN 4 da linhagem de parasitas transgênicos com fusão GFP-HA-DD24 ................................................................ 68
4.7 Fitness de P. falciparum após knockdown de SURFIN 4 dos parasitas transgênicos com fusão GFP-HA-DD24 ................................................................ 70
4.8 Transcrição de surf 4 e de outros membros surf após knockdown de SURFIN 4 dos parasitas transgênicos com fusão GFP- HA- DD24 ..................... 71
4.9 Microscopia de fluorescência para localização de SURFIN 4 em P.
falciparum ................................................................................................................ 75
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 77
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 84
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 86
1 INTRODUÇÃO
19
1.1 Malária - Um problema mundial
A malária atualmente é uma doença de países subdesenvolvidos, cujos
grandes responsáveis são um protozoário e um mosquito.
A doença é causada por parasitas protozoários do gênero Plasmodium
transmitidos entre humanos pela fêmea do mosquito anofelino [1].
É caracterizada por episódios de febre alta, calafrios, sudorese, dores de
cabeça e muscular, taquicardia, aumento do baço, náuseas e fraqueza, anemia
grave e falência múltipla dos órgãos [2]. A malária grave pode ser causada pela
malária cerebral e é responsável por cerca de 80% dos casos fatais, que consiste na
soma dos sintomas com ligeira rigidez na nuca, perturbações sensoriais,
desorientação, sonolência ou excitação, assim como convulsões, podendo o
paciente chegar ao coma [2].
Fósseis antigos indicam a origem da malária na África Sub-Saariana. No Egito
há relatos de que Cleópatra teve malária. A doença pode ter sido causa da morte de
vários faraós, acometendo além de trabalhadores das plantações de arroz às
margens do Nilo, como também membros importantes da época. Cogita-se inclusive
que o grande imperador Alexandre Magno morreu de malária. Essa doença atingiu
profundamente o Império Romano comprometendo sua economia e contribuindo
para o seu declínio.
A origem do nome "Malária" iniciou no século XVIII baseada na expressão
italiana “mal aire”, sinônimo de “mau ar”, definição originada a partir da crença que a
doença estava associada com o ar insalubre originadas de matérias pútridas das
regiões pantanosas, cujos “germes” eram transferidos dessas águas para os
humanos através de transmissão mecânica.
Em 1880, uma descoberta foi realizada na Argélia pelo médico francês
Charles Alphonse Laveran. Analisando sangue de pacientes febris, ele descobriu
que no interior das hemácias havia parasitas protozoários. Essa foi à primeira
observação do parasita em hemácias humanas, o qual foi denominado como
Oscillaria malariae [3].
Apesar de não haver provas conclusivas de que esses parasitas causassem a
doença, essa descoberta abriu caminho para estudos sobre o ciclo de vida e a forma
de transmissão do parasita durante o século XIX.
20
Entre 1894 e 1898 Ronald Ross descobriu o crescimento do parasita da
malária no trato gastrointestinal do mosquito Anopheles. Após essa descoberta,
utilizando modelo aviário, ele descobriu a presença dos parasitas nas glândulas
salivares de mosquitos do gênero Culex e demonstrou que a transmissão do
parasita ocorria entre as aves e através dos mosquitos, definindo assim, o
hospedeiro intermediário [4].
Ao fim da mesma década, Eugène Richard, Camilo Golgi e Ettore
Marchiafava, demonstraram o ciclo de vida do parasita, relacionando com forma de
transmissão e os sintomas da doença.
A transmissão da malária entre humanos por mosquitos do gênero Anopheles
só foi demonstrada em 1899 pelos italianos Giovanni Baptista Grassi, Amico
Bignami e Giuseppe Bastinelli [5]. Apenas em 1948 Shortt e colegas [6] identificaram
a fase hepática da infecção.
Contudo, estudos sobre a biologia do parasita somente tiveram um avanço
decisivo, quando o parasita P. falciparum foi cultivado laboratorialmente in vitro [7].
1.2 Malária - Distribuição global e problemas na erradicação
No início do século XX a doença estava presente em continentes, e matou
cerca de metade das pessoas na segunda guerra mundial. Em 1956 foi criado um
programa de erradicação global da doença e países como os Estados Unidos e
vários países da Europa conseguiram sucesso utilizando programas que consistiam
no controle ao vetor, tratamento de pessoas infectadas com quinina, drenagem de
regiões alagadas e uso de inseticidas DDT (dichloro-diphenyl-trichloroethane) [8],
combinado com disponibilização de recursos e conscientização da população [9]
Já em países com problemas socioeconômicos isso não foi possível, pois a
doença compromete grande parte da renda com despesas geradas pelos
tratamentos e o uso de recursos para erradicação se torna escasso. Além disso, há
um agravamento da pobreza, pois o fato dos doentes não conseguirem ir para as
aulas e nem trabalhar, cria defasagem na educação e na produção impedindo o
crescimento da economia [10]
Esse é um problema que se torna cíclico, pois a doença aumenta os gastos
com a saúde e diminui a produção e recursos financeiros, a falta de recursos leva a
21
deficiência na prevenção e tratamento, aumentando do número de doentes,
elevando os gastos e comprometendo o desenvolvimento do país.
Por isso, a doença hoje continua a acometer países pobres, estima-se que
cerca de 90 países ainda continuam sendo atingidos pela malária em regiões
tropicais e subtropicais do planeta. Cerca de 40% da população mundial vive nessas
áreas endêmicas e em 2012 estima-se que 207 milhões de pessoas foram
infectadas, causando 627 000 óbitos. [11].
Figura 1 - Distribuição global da malária.
Fonte: Adaptado de Alonso e Tanner, 2013 [12]
Com o uso demasiado de quimioterapia para o combate à doença houve um
agravamento na resistência dos protozoários P. falciparum, P. vivax and P. malariae
aos medicamentos [13]. Em ordem cronológica, o uso indiscriminado e em
monoterapia das drogas quinina, cloroquina, mefloquina, halofantrina selecionou
22
parasitas resistentes tendo que ser substituídas ou complementadas. A terapia
preconizada atualmente é a combinação artemisinina e lumefantrina (coartem) [13].
Além disso, com o uso excessivo de inseticidas selecionamos mosquitos
resistentes o que dificulta ainda mais a eliminação da doença já que uma das
principais formas de combate à malária é o controle de vetores [14] o que evitaria a
transmissão.
Grandes avanços foram alcançados na pesquisa, e algumas vacinas
encontram-se em fase de testes. Mas, ainda assim, existem muitas questões abertas
relativas à evolução do parasita no hospedeiro vertebrado e a sua permanência no
hospedeiro invertebrado. Há a necessidade do descobrimento de novos alvos para
drogas e vacinas, uma capaz de favorecer imunidade eficiente e duradoura. Além
disso, precisamos do desenvolvimento de novos inseticidas e novas estratégias para
combater, eliminar e ou reduzir o contato do mosquito ao homem de forma a
bloquear a transmissão e favorecer a eliminação da doença.
1.3 Malária - O parasita
O protozoário intracelular do gênero Plasmodium causador da malária
pertence ao filo Apicomplexa.
O filo é também conhecido como esporozoários por apresentarem durante a
meiose e fissão múltipla, a produção de esporos, que no caso dos coccídeos como
Isospora ou Eimeria é uma forma de vida as vezes resistente às diversidades
ambientais. Apicomplexas são organismos predominantemente parasitários, que não
possuem flagelos (salvo os gametas masculinos) e são compostos por mais de cinco
mil espécies. Taxonomicamente são caracterizados principalmente pela presença de
um complexo apical na região anterior do corpo alongado que possui a função de
fixação e invasão das células nos hospedeiros. Além disso, muitos membros (mas
não todos) do filo ainda possuem o apicoplasto, que é uma organela derivada de
cloroplasto de alga e onde ocorre principalmente a biossintese de isoprenoides [15].
23
Figura 2 - Imagem do merozoito.
Fonte: Adaptado de Cowman et al., 2012 [16]
O ciclo de vida desses parasitas é complexo e apresenta uma típica forma
celular para cada um dos vários estágios nos hospedeiros [16].
No gênero Plasmodium, apesar de somente cinco espécies serem capaz de
causar a doença no homem, existem aproximadamente cem espécies, as quais a
maioria infectam aves, répteis e outros mamíferos como os roedores e macacos [1].
As espécies conhecidas que infectam o homem são: Plasmodium falciparum,
Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale e Plasmodium knowlesi
[1].
Plasmodium falciparum causa a forma mais grave da doença e índices mais
altos de mortalidade, pois pode causar a malária cerebral e impedir a função de
vários órgãos. Sua transmissão e prevalência ocorre principalmente na África
subsaariana embora possa ser encontrado distribuído pelo mundo. Tem como
principal vetor o mosquito Anopheles gambiae na África e Anopheles darlingi na
Amazônia. O genoma de P. falciparum foi completamente sequenciado em 2002 [17]
Este organismo possui 14 cromossomos lineares e aproximadamente 5400 genes,
sendo que ~50% dos genes ainda tem função desconhecida.
P. vivax, é conhecido como causador da malária não grave, na maioria dos
casos apesar de ser debilitante a infecção raramente mata. Ainda assim, é capaz de
24
causar a doença grave e morte em mulheres grávidas e crianças menores que cinco
anos [18] e atualmente está sendo discutido se a doença realmente pode ser de
"benigna" [19,20].
Esta espécie coloca em risco cerca de 2,5 bilhões de pessoas devido a sua
ampla distribuição que varia em toda a Ásia, Oriente Médio, Oceania e nas Américas
(e ressurge na Europa Oriental) menos na África [18]. É a espécie de maior
frequência no Brasil, predominantemente na Amazônia legal [21], que engloba os
Estados do Acre, Amapá, Amazonas, Maranhão, Mato Grosso, Pará, Rondônia,
Roraima e Tocantins.
Um grande problema em relação a este parasita é a dificuldade no controle,
pois uma pessoa infectada apresenta gametócitos antes mesmo do diagnóstico,
podendo transmitir a doença prematuramente. Outro ponto é que o doente após o
tratamento e aparente cura pode apresentar o parasita no estágio de dormência no
fígado, os conhecidos hipnozoitas [18,22], caso não tenha se tratado com
primaquina pelo tempo preconizado anteriormente. Isso permite apresentar recaídas
e novamente os sintomas da doença, além de transmitir novamente os gametócitos.
O abandono do tratamento com primaquina após aparente cura, assim como, a
possível crescente resistência do parasita à primaquina levam a uma perpetuação
preocupante da transmissão de P. vivax em muitas áreas [18].
Uma minoria dos casos de malária são causadas por Plasmodium ovale que
só ocorre na África [23]. Este parasita recebe esse nome pois causa um
alargamento ovalar dos eritrócitos. Em comum com P. vivax, apresenta o estágio de
hipnozoitas no fígado [22], além de não apresentar o fenômeno da citoaderência que
é um importantissimo fator de virulência de P. falciparum [24].
A infecção com Plasmodium malariae, leva a evoluções brandas e não causa
doença aguda fatal em imunocompetentes mas pode se tornar uma doença crônica
de muitos anos com esporádicos ataques, caso não haja tratamento [25]. Diferente
de P. vivax e P. ovale, P. malariae não apresenta a formação dos hipnozoitas [22].
P. malariae pode ser subnotificado em áreas extra-amazônicas como áreas da Mata
atlântica [26].
O ciclo de vida do parasita é complexo, alternando entre o hospedeiro
definitivo (mosquito vetor) onde ocorre a reprodução sexuada, e o hospedeiro
intermediário (vertebrado) onde ocorre a reprodução assexuada [27]. No hospedeiro
vertebrado, o inicio da infecção geralmente ocorre através da transmissão do
25
parasita pela picada de uma fêmea infectada do mosquito Anopheles, que libera
juntamente com a saliva esporozoítas os quais ganham a corrente sanguínea e
migram até ao fígado onde invadem os hepatócitos e se multiplicam
assexuadamente. Após de 6 a 14 dias, são liberados para o fluxo sanguíneo até
40000 merozoitas (Figura 2) os quais começam a invadir hemácias. Após a invasão,
ocorre uma nova multiplicação assexuada em 16 a 32 novos merozoítos. O ciclo
leva em torno de 36 a 48 horas período em qual o parasita passa pelos estágios
morfológicos de anel, trofozoíta, esquizonte e novamente merozoítas. O rompimento
das primeiras hemácias infectadas libera, além de toxinas, os merozoítas para nova
invasão, dando início, assim, às diversas manifestações clínicas do hospedeiro.
Uma mudança transcricional mediado por um fator de transcrição especifico
(ApiAP2-G) [28] leva ao comprometimento de merozoitas a se transformarem em
gametócitos diferenciados em microgametócitos (masculino) e macrogametócitos
(feminino), formas que são transmitidas a um novo mosquito, quando sugadas
durante o repasto sanguíneo.
No mosquito ocorre a fase sexuada, o mosquito adquire os gametócitos
femininos e masculinos (macrogametas e microgametas) durante o repasto
sanguíneo. No trato digestivo, os gametas se fundem gerando um zigoto que se
diferencia em oocineto. Essa forma móvel atravessa a parede do estômago e se
aloja na membrana basal transformando-se em oocisto o qual após o
desenvolvimento dará origem aos esporozoítos. Esses esporozoítos rompem o
oocisto e migram para as glândulas salivares do inseto estando aptos a invadirem
um novo hospedeiro vertebrado, dando continuidade ao ciclo [29].
26
Figura 3 - Ciclo de vida de Plasmodium em humanos.
O ciclo de vida do Plasmodium alterna entre o hospedeiro definitivo (mosquito vetor) onde ocorre a reprodução sexuada, e o hospedeiro intermediário (vertebrado). 1- A fêmea anofelina durante o período de reprodução inocula esporozoitas no hospedeiro humano através da picada. 2- Esporozoitas, após invadirem a corrente sanguínea, chegam ao fígado onde infectam as células hepáticas. 3- Após a invasão das células hepáticas se reproduzem assexuadamente produzindo os primeiros merozoitas. 4- A célula hepática é rompida liberando os merozoitas na corrente sanguínea. Em P. vivax e P. ovale o estágio dormente (hipnozoito) pode persistir no fígado e causar novas liberações de merozoitas na corrente sanguínea, semanas, meses ou mesmo anos depois da primeira infecção. 5- Merozoitos invadem os eritrocitos e iniciam uma nova divisão assexuada. 6 - Se desenvolve passando pelas formas de anel, 7- trofozoitos e 8- maturando-se em esquizontes. 9- Após a lise celular ocorre a liberação de novos merozoitos que iniciam nova invasão em eritrócitos. 10- Alguns parasitas diferenciam-se em gametócitos (formas sexuais). 8 – As fêmeas anofelinas adquirem os gametócitos durante o repasto sanguíneo. 9- No mosquito os macrogamentas (feminino) e microgamentas (masculinos) se fundem. 13- o zigoto diferencia-se em oocineto (forma móvel). 14- O oocineto atravessa a parede do estomago alojando-se na membrana basal. 15- Esse oocineto se desenvolve em oocisto que dará origem aos esporozoítos. 16- Os esporozoítos após a ruptura celular migram para a glândula salivar onde são liberados para o hospedeiro intermediário durante a picada iniciando novamente o ciclo. Fonte: Adaptado de Hull e Dlamini, 2014 [29]
1.4 Malária - O mosquito vetor A transmissão da malária aos hospedeiro vertebrados, ocorre pelas fêmeas
do mosquito do gênero Anopheles durante o repasto sanguíneo. As fêmeas
27
anofelinas são hematófagas após o acasalamento e durante a reprodução, pois
necessitam de ferro e proteínas do sangue e para o desenvolvimento das suas
centenas de ovos [14].
Existem aproximadamente quatrocentas espécies neste gênero, e
aproximadamente quarenta delas são transmissores do plasmódio na natureza e
das espécies de Anopheles que podem transmitir a doença ao homem as mais
comum mundialmente são Anopheles gambiae e Anopheles funestus que se
destacam na transmissão de P. falciparum principalmente na África [14]. No Brasil a
espécie Anopheles darlingi se destaca na transmissão de P. vivax e P. falciparum.
A ampla presença do mosquito em países tropicais e subtropicais se deve às
temperaturas ideais para o seu desenvolvimento, que ficam entre 20 e 30 ºC e altas
taxas de umidade. Nessas regiões, os ovos levam cerca de três dias para maturar
[30].
O ciclo de vida do mosquito inclui os estágios de ovos, larva, pupa e adulto
[14]. Os ovos são postos em águas paradas (criadouros) onde se desenvolvem. Os
criadouros podem ser grandes alagados, lagos ou lagoas, remanso de rios ou
córregos, represas, manguezais, pântanos etc.
Cerca de dez a quinze dias após a deposição dos ovos, depois de passarem
pelos estágios de larva e pupa os mosquitos adultos são ativos sexualmente [14].
1.5 Malária - Capacidade de invadir células e evasão imunológica
O complexo ciclo de vida do Plasmodium depende do sucesso na
sobrevivência intracelular e/ou extracelular do hospedeiro, isso inclui vários
mecanismos que permitem a evasão das respostas imunológicas e o sucesso na
invasão de vários tipos celulares. Na fase sanguinea que corresponde ao ciclo
assexuado no hospedeiro vertebrado, o parasita tem que ser capaz de reconhecer e
invadir os eritrócitos [31], e ao mesmo tempo evadir às respostas imunológicas do
hospedeiro.
O sucesso de P. falciparum é principalmente dependente da capacidade de
invadir e sobreviver nos eritrócitos. O parasita possui um sistema muito eficiente de
reconhecimento celular, pois consegue reconhecer a célula a ser invadida através
de um contato inicial exercido por MSPs (merozoite surface proteins) [31]. Após o
28
reconhecimento, o parasita dá inicio a um processo de reorientação celular
direcionando o complexo apical ao centro do eritrócito [31]. Após essa reorientação,
o merozoita começa a liberar ordenadamente fatores envolvidos na invasão através
das roptrias, micronemas e grânulos densos que fazem parte do complexo apical.
Assim, inicia-se o uma fraca interação aos eritrócitos, a qual é aumentada a medida
que o parasita realiza junções das proteínas de interação (erythrocyte binding
antigens EBA-175, EBA-140, EBA-181 e EBL1) e (reticulocyte-binding like
homologs PfRh2a, PfRh2b e PfRh4) a receptores específicos da hemácia.
Após a formação dessa junção inicial, o parasita necessita de uma interação
muito mais forte para de fato realizar a invasão ao eritrócito. Por isso, excreta pelas
róptrias a molécula RON2 (rhoptry neck protein) que possui um papel fundamental
durante a invasão. Após ser excretada, RON2 se adere à membrana do eritrócito e
funciona como receptor para o antígeno AMA1 (apical merozoite antigen 1). A
interação AMA1-RON2 forma um complexo que fornece uma estável ligação física
entre o citoesqueleto do parasita e do eritrócito e funciona como uma estrutura de
ancoragem resistente à tração durante o movimento exercido pelo parasita para a
penetração no eritrócito [31,32].
Figura 4 - Representação da invasão do eritrócito por um merozoito.
A figura evidencia o complexo que envolve diferentes proteínas atuando em diferentes etapas durante a invasão. MSPs inicia o contato, PfRHs e PfEBAs atuam durante a formação da junção entre a superficie do eritrócito e do merozoito. A interação AMA1-RON permite maior estabilidade na adesão merozoito-eritrócito, durante o movimento no processo de invasão. Fonte: Adaptado de Wright e Rayner, 2014 [31].
29
Figura 5 - Foto de merozoito em processo de invasão no eritrócito.
Na figura, A - respresenta superfície do merozoito, B e G - Local de junção entre o merozoito invasor e a hemácia, C - Róptria, D - Membrana de fusão, E – A nascente do vacúolo parasitóforo, F- Motor actomiosina ativado. Fonte: Cowman et al., 2012 [33]
Durante a invasão é formado um vacúolo onde o parasita fica alojado,
denominado de vacúolo parasitóforo (figura 5 e 6) [34]. Este é decorrente da
invaginação da membrana do eritrócito. É o espaço formado entre a membrana da
hemácia e a membrana do Plasmodium (figura 5). Após a formação desse vacúolo
algumas proteínas fazem a intersecção entre o parasita, o vacúolo e a hemácia
[34,35].
30
Figura 6 - Imagem de um esquizonte em eritrócito infectado.
Fonte:Adaptado de Cowman e Crabb, 2006 [34]
O eritrócito não dispõe de maquinaria para a síntese proteica ou lipídica assim
como o transporte. Por tanto, para sobreviver, o parasita deve remodelar a sua
célula hospedeira [36,37]. Antígenos começam a ser exportados para a superfície do
eritrócito. Isso é possível graça a um complexo de estruturas membranosas
denominadas Maurer’s cleft, que é um sistema que medeia o tráfego de proteínas do
parasita em direção à superfície da célula hospedeira [36,37]. Esta estrutura, apesar
do pouco conhecimento sobre sua função e origem, desempenha um papel crucial
na remodelação do eritrócito. Além disso há um sistema especial de exportação
através da membrana do vacuólo parasitóforo, que envolve uma eficiente
maquinaria responsável pelo transporte de diversas proteínas de virulência para a
superfície da hemácia infectada. O complexo de proteínas conhecido como PTEX
(Plasmodium translocon of exported proteins) [38] é um exemplo de transportador de
proteínas que faz o intercâmbio entre a membrana do vacúolo parasitóforo e a
hemácia hospedeira.
31
Além dessas estratégias para invasão e sobrevivência intracelular o parasita
tem que ser capaz de evadir ao sistema imune. Possui um sistema complexo de
antígenos altamente variantes expressos por uma variedade de famílias
multigênicas e exportados para a superfície das hemácias infectadas ou expresso no
merozoíto [39–42].
A expressão de neoantígenos na superfície do eritrócito infectado possibilita à
hemácia infectada modificar seu comportamento dentro do sistema vascular do
hospedeiro humano. Assim, hemácias infectadas por P. falciparum e numa menor
escala de P. vivax [43] podem aderir a outras hemácias não infectadas ("rosetting")
ou hemácias infectadas ("clotting") ou em receptores endoteliais tais como
condroitina sulfato A (CSA), CD36, ICAM1, E-selectina, e EPCR entre outros [44].
Esta citoaderência é mediada predominantemente por PfEMP1s (Plasmodium
falciparum Erythrocyte Membrane Protein 1) [45] que consistem de uma família de
50-60 alelos antigenicamente diferentes por parasita. A expressão de PfEMP1 é
regulado em nível transcricional de ativação ou silenciamento de genes var que
codificam PfEMP1 [46,47] mas também em nível pós-transcricional [37,38] com a
consequência que apenas um ou dois tipos de antígeno PfEMP1 aparecem na
superfície da hemácia infectada. A frequente troca do antígeno expresso por
switching transcrional leva ao constante escape da resposta imunológica mediada
por anticorpos é chamado variação antigênica e o mecanismo molecular da
regulação é chamado exclusão alélica. [47,50–52].
Além da família das PfEMP1 codificadas pelos genes var, existem outras
famílias multigênicas altamente polimórficas cujo papel está pouco claro, por
exemplo RIFINs (repetitive interspersed family), STEVOR (sub-telomeric variable
open reading frame) e SURFIN (surface-associated interspersed gene family) [39].
Membros da família RIFIN também são sujeitos de algum controle
transcricional, mas não do tipo exclusão alélica dos genes var, onde apenas um ou
dois genes var são expressos [53]. Esta família compreende aproximadamente 180
genes que podem ser divididos em duas subfamílias RIFIN A e RIFIN B [54].
Antígenos RIFIN do tipo A parecem estar localizadas na superfície da hemácia
infectada e RIFIN do tipo B parecem ser internos no parasita [55]. As proteínas
resultantes são de função desconhecida [54].
32
Figura 7 - Antígenos variantes da hemácia infectada e sua suposta localização.
Fonte: Chan et al., 2014 [39]
STEVOR também são antígenos variantes, expressos por cerca de 30 a 40
genes preditos. Foram localizados no complexo Maurer’ clefts e associados a
membrana do eritrócito em trofozoitas e gametócitos, e se associa ao complexo
apical do merozoita e foi proposto qiue eles exercem algum papel durante a invasão
[56].
Uma outra família multigênica, polimórfica entre alelos de um único genoma
mas com alelos aparentemente conservados entre isolados diferentes e ainda pouco
conhecida é a família de genes surf. Esta família consiste de dez genes localizados
na região subtelomérica dos cromossomos [52] (na cepa 3D7) e codifica antígenos
com alto peso molecular (~280–300 kDa) [39].
Quatro deles são anotados como pseudogenes [57]. No caso de um membro,
a proteína SURFIN 4 (gene PF3D7_0402200, plasmodb.org) aparentemente
encontra-se presente durante toda a fase eritrocítica do parasita e sobre o
merozoíta, porém surpreendentemente está anotado no plasmodb.org como uma
proteína truncada [57] e a fase de leitura predita contém códons de parada.
Parte das proteínas SURFIN mostra similaridade estrutural com domínios
externos ricos em cisteína como encontrados em proteínas PvSTP1 codificadas
pelos genes pvstp1 de P. vivax, e, de forma limitada, com proteínas codificadas
pelos genes PkSICAvar, PvVIR, Pf332, e PfEMP1 de varias espécies de
Plasmodium [57]. Verificou-se que o transporte de SURFINs dentro do eritrócito é
realizado juntamente com RIFIN e PfEMP1 através das organelas Maurer’s cleft’s
33
[58]. Estudos demonstram que ao menos SURFIN 4 também pode estar localizado
na membrana do vacúolo parasitóforo [57–59]. SURFIN 4 e 5 (antigo surf 4.1 e 4.2)
não possui o elemento que indica ser proteína destinada à exportação para o
eritrócito (PEXEL - Exportação elemento Plasmodium) [59] que consiste de uma
sequência N-terminal hidrofóbica e uma série de motivos de direcionamento [60].
SURFIN 4 contém no N-terminal sequência específica que pode ser responsável em
direcionar a proteína para o vacúolo parasitóforo, e esta não é conservada entre as
proteínas da família SURFIN [59].
Figura 8 - Características estruturais de SURFIN compartilhadas com proteínas
exportadas de várias espécies de Plasmodium.
A- Estruturas comum entre SURFIN e outras proteína de outras espécies de Plasmodium, B- Características estruturais gerais compartilhadas por proteínas de superfície relacionados em P. vivax e P. falciparum que incluem um domínio externo variável que contém resíduos de cisteína conservados e um domínio interno conservado. (TM, separa uma região variável do terminal NH2 da região semi conservada do terminal COOH) Fonte: Gerhard Winter et al., 2005
34
No eritrócito a expressão dos genes surf parece ser diferencialmente
transcrita nos vários estágios do parasita [39].
Além disso, os membros SURFIN PF3D7_0402200 (surf 4) e
PF3D7_0424400 (surf 5) parecem fazer parte de uma camada amorfa anexa ao
complexo apical de merozoítos liberados. Essa estrutura talvez possa estabelecer
uma ligação antigênica entre o merozoíto e a superfície do eritrócito, o que
possibilitaria o seu envolvimento no processo de invasão celular [57,58].
A função de SURFIN é nebulosa e até hoje apenas um gene foi deletado sem
aparente perda de viabilidade do parasita [35]. Além disso, também não há
informações sobre o modo de transcrição desta família, se ocorre por exclusão
alélica ou por transcrição cumulativa. Aparentemente, alguns membros SURFIN são
importantes para fases sexuadas do parasita já que consta mais transcrito de alguns
alelos em oocinetos ou oocistos (plasmoDB.org).
2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
36
Apesar do sequenciamento do genoma de Plasmodium falciparum em 2002
até o momento cerca de 50 % dos genes, incluindo os codificadores de antígenos
SURFIN, possuem função desconhecida. Sabe-se que um desses antígenos
PF3D7_0402200 (SURFIN4) já foi encontrado associado ao merozoita [57] e no
vacúolo parasitóforo [59], e outro PF3D7_0424400 (SURFIN 5) sendo transportado
pelas organelas Maurer's cleft [57,58].
Como algumas proteínas também exportadas para a membrana do eritrócito
são altamente variantes e são regulados por processos sofisticados de controle de
transcrição como exclusão alélica e switching [61] e ainda são considerados
importantes fatores de virulência, julgamos importante desvendar o modo de
transcrição da família SURFIN para analisar se há algum controle transcricional e
switching, além disso, pretendemos elucidar se SURFIN 4 é essencial para a
sobrevivência do parasita durante a fase assexuada sanguínea.
Este trabalho busca elucidar se a expressão dos genes surf ocorre de
maneira variante, com ocorrência de exclusão alélica e switching, além de mostrar
se o antígeno SURFIN 4 (PF3D7_0402200) é essencial para a sobrevivência do
parasita durante o ciclo eritrocítico. Os objetivos deste trabalho são:
• Verificar o perfil de transcrição dos genes surf em P. falciparum ao longo de
múltiplas reinvasões (switching).
• Verificar o papel funcional do gene surf 4 (PF3D7_0402200), através de
ferramenta genética para knockin, utilizando domínio desestabilizador da proteína
(DD24) que permite a expressão condicional da proteína.
• Mostrar a localização do antígeno SURFIN 4 por knockin de domínio GFP/HA.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
38
3.1 Isolados de P. falciparum
Para este trabalho foram utilizados o clone 3D7 de P. falciparum, sua
linhagem parental, o isolado NF54 (obtido no ano de 1979 de amostra sanguinea de
paciente infectado com P. falciparum em Amsterdam, Holanda), e o isolado CAND,
que é proveniente de um paciente sintómático infectado com P. falciparum que
morava no bairro da Candelária, cidade de Porto Velho-RO, Brasil, em 2002.
3.2 Cultivo e armazenagem de P. falciparum
O cultivo de P. falciparum foi realizado in vitro em cultura contendo 5% de
eritrócitos B+ (em garrafas para cultivo) adicionando meio RPMI-1640 (Embriolife,
Campinas) suplementado com 0,5% de AlbuMAX (Gibco) e 0,23% bicarbonato em
sistema de candle jar adaptado [7] e mantido em estufa 37 ºC com trocas diárias de
meio.
A parasitemia foi monitorada com a verificação microscópica de esfregaços
corados com kit Panótico Rápido (LabClin, São Paulo). Para congelamento de
alíquotas de parasitas para armazenagem, as hemácias infectadas foram lavadas
com meio RPMI (incompleto) e centrifugadas a 1500 RPM por 5 minutos. Logo após,
foi adicionado 1,666 X o volume do sedimentado de glycerolyte (45,3 V/V glicerol,
2,26% V/V lactato de sódio, KCl 5mM, pH 7,2 acertado com NaHCO3), transferido
para criotubo e congelado em -80 °C por uma noite e transferido no dia seguinte
para preservação em nitrogênio liquido.
Para descongelamento, foram preparadas soluções estéreis de NaCl 12% pH
6 (ajustado com HCl) e NaCl 1,6% pH 5,5. Alíquotas descongeladas foram
transferidas de criotubos para tubo tipo falcon de 15 ml e adicionado 1/5 do volume
total de hemácias de NaCl 12% gota a gota. Após repouso de 1 minuto foi
adicionado 10 volumes de NaCl 1,6% e submetido a centrifugação a 1400 RPM (800
g) por 5 minutos. Logo após o sobrenadante foi aspirado e as hemácias
sedimentadas foram transferidas para garrafas de cultivo mantidas em cultura como
descrito anteriormente.
39
3.3 Sincronização das formas de P. falciparum
As culturas foram regularmente sincronizadas através do método lise por sobitol
selecionando parasitas na fase anel [17] e sedimentação por Plasma
expander/Voluven 6% (Fresenius-Kabi, Campinas), seguindo protocolos
estabelecidos que seleciona parasitas na fase trofozoíta [16]. Para análise de
transcrição dos genes surf os parasitas foram obtidos através da sincronização
sucessiva plasmagel/sorbitol sendo admitidos somente culturas de parasitas com
sincronização acima de 80%, monitorados por análise em microscopia.
3.4 Extração de RNA de cultura de P. falciparum sincronizada e transcrição
reversa
Os parasitas foram coletados nas fases anel (4 a 6 hs), trofozoita (25 a 27 hs)
e esquizonte (33 a 35 hs) em 3 pontos no tempo. Esses pontos foram divididos em
uma coleta inicial e após 20 e 40 gerações.
As coletas de parasitas para análise do efeito da retirada do Shield-1, por RT-
qPCR foram realizadas com culturas sincronizadas de parasitas acima de 30 hs.
As hemácias parasitadas obtidas da cultura sincronizada, foram tratadas com
0,1% Saponina em 1xPBS por 10 min à temperatura ambiente. Após centrifugação a
3000g, os parasitas precipitados foram resuspendidos em 100 µl 1xPBS e lisados
com 1 ml Trizol Reagent (Invitrogen). O RNA foi extraído de acordo com método
sugerido pela empresa.
Após a obtenção do RNA, para deduzir a sua integridade, uma alíquota foi
submetido à eletroforese em gel TBE 1% agarose e visualização por luz ultravioleta
das bandas de RNA ribossomal marcado com brometo de etídio.
A transcrição reversa (RT) de RNA foi conduzida utilizando protocolos
estabelecidos no laboratório onde 10 µg de RNA total foram digeridos por três vezes
seguidas com a enzima DNAse I (Fermentas) modificado de Taylor et. al, (2000) [62]
e uma alíquota desta reação foi utilizada para ensaios de transcrição reversa,
incluindo uma reação controle para exluir a possibilidade de contaminação com
gDNA. A reação foi conduzida utilizando oligonucleotídeos randômicos hexaméricos.
Para testar a viabilidade do cDNA obtido, aplificamos por PCR o gene
considerado como controle interno, Seril-tRNA sintetase “K1”. Como controles
40
negativos, foram utilizadas as reações, de RT-qPCR com os mesmos
oligosnucleotídeos, sem adição de transcriptase reversa.
3.5 Quantificação dos transcritos por PCR em tempo real
Os oligonucleotídeos específicos para cada gene surf foram criados utilizando
sequências de mRNA dos genes surf anotados no PlasmoDB (versão 8.2,
plasmodb.org) e desenhados com o programa Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-
0.4.0/) para amplificar fragmentos entre 80 a 120 nucleotídeos e temperatura de
melting de 60°C ± 2°C. A eficiência dos pares de oligos foi testada em DNA
genômico de P. falciparum, cepa 3D7 e é mostrado na figura 10.
Para as reações de PCR em Tempo Real, utilizamos 50 ng RNA (por reação
individual, triplicatas) convertido para cDNA em SYBR green Master-Mix (Fermentas)
e os experimentos foram conduzidos no aparelho Realplex 2 (Eppendorf), seguindo
os protocolos sugeridos pelo fornecedor.
A eficiência dos oligos foi testada através de reação de PCR em tempo real
utilizando diferentes diluições de DNA genômico onde o Ct (threshold cycle o ciclo
da PCR onde a reação entra está em fase exponencial e o amplicon começa a ser
detectado acima do background) podia variar de +/- 1 unidades entre pares de
oligos diferentes.
Todas as amplificações por PCR em tempo real, para cada par de oligos dos
genes surf e para nosso cotrole interno utilizado, o gene Seril-tRNA sintetase
(PF07_0073, “K1”), foram feitas em triplicatas, mais um controle negativo.
Os dados foram analisados em Microsoft Excel utilizando a fórmula 2-∆CT em
relação ao controle endógeno, gene PF07_0073 ("K1"), segundo proposto por Livak
e Schmittgen [63].
41
Tabela 1 - Sequências de oligonucleotideos para amplificação dos genes surf.
Gene
surf
ID
plasmodb.org
Sequência dos oligonucleotídeos para RT-
qPCR dos genes surf de P.falciparum
surf 1 PF3D7_0113100 F 5' GAAGAATGGAAAATGACCAAGG
R 5' TCGAAATCGTCCTCTTCGTT
surf 2 PF3D7_0113600 F 5' CCCCTGTATCTGAACCGATG
R 5' CGTTTGAGCAAGATGGGAAT
surf 3 PF3D7_0115000 F 5' AAAATTCCGGAACAAGACCA
R 5' ATTCCAGATTCCGCATGAAC
surf 4 PF3D7_0402200 F 5' ACACTTGCACAAACAAAACAGG
R 5' CCATCAACTTGCGTTTTCAATA10
surf 5 PF3D7_0424400 F 5' TCACGAACGCTTGATAGTGC
R 5' TTGCTTTGACCTTCACTTCG
surf 6 PF3D7_0831100 F 5' TGCCATTTGATGAACCAGAA
R 5' GCATGTCGTTCAACCCATCT
surf 7 PF3D7_0830800 F 5' ACCTCGAGCGATGGAGATAA
R 5' CTCATTGGGTGATCCATCCT
surf 8 PF3D7_0800700 F 5' AAAATTCCGGAACAAGACCA
R 5' ATTCCAGATTCCGCATGAAC
surf 9 PF3D7_1301800 F 5' TCCCCTCATTCTTCAGTTCC
R 5' TTTGCAAAGGGTGGAGTAGC
surf 10 PF3D7_1477600 F 5' GAAGGGGGTGATAATGGTGA
R 5' TGAACAATGAGGGAAAACCAG
3.6 Extração de gDNA de P. falciparum
Em 100 µl de hemácias parasitadas com mínimo 5% de parasitemia foi
acrescentado 1,25 ml de PBS (1X) em tubo tipo eppendorf e misturado levemente
por inversão do tubo fechado. Logo após foi acrescendo 150 µl de saponina (1%) e
42
incubado por 5 minutos no gelo (até a solução ficar translúcida) e centrifugada por 5
minutos a 12000 RPM. Logo após foi retirado o sobrenadante e o sedimentado foi
lavado 1 vez em PBS (1X) e dissolvido em 250 µl de TE (Tris/HCl 10 mM pH 8 e
1mM EDTA pH 8) e adicionado 100 µl de tampão de lise 4X (40 mM Tris/HCl pH 8;
4mM EDTA pH 8; 0,8 M NaCl, 4% SDS) mais 20 µl de Proteinase K (Solução 10
mg/ml) por um período de 3 horas a 37 °C.
O material foi extraído com a utilização sequencial de fenol, fenol-clorofórmio
e clorofórmio (400 µl cada) incubado na gangorra por 10 minutos seguido de
centrifugação (8000 RPM) após cada solução. Finalizado este passo, o
sobrenadante foi então transferido para um novo tubo eppendorf e acrescentado 800
µl de Etanol 100% incubado por 15 minutos para precipitação do material genético.
Após centrifugação por 10 minutos a 8000 RPM a 4 °C o sobrenadante foi retirado e
o sedimentado foi lavado 1X com Etanol 70%. Após nova centrifugação e secagem
em temperatura ambiente o sedimentado foi resuspendido em 50 µl de TE e
armazenado em temperatura de 4 °C para utilização.
3.7 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Para a amplificação do fragmento surf 4 para clonagem em plasmídeo de
knockin, foram desenhados oligonucleotídeos 5´-
agatctGGAAAATGTAAAATGTTGGAAATTG-3´ e 3´
ctgcagcTTTTTTTCTTTTATTATTATGTTTATC 5´que amplificam cerca de 1000 pb
imediatamente anterior ao códon de parada com sítio de restrição para as enzimas
Bgl2 (5' do amplicon) e Pst1 (3' do amplicon) da mesma espécie segundo sequência
genômica depositada no plasmodb.org.
Numa reação PCR em volume final de 15 µl em H2O nuclease free utilizamos
100 ng de gDNA P. falciparum NF54, 5 pM de cada óligo sob ação da Taq
polimerase Elongase (Invitrogen) seguindo instruções do fabricante. As condições
para amplificação seguiu de uma etapa inicial de desnaturação por 5 minutos a
94°C, seguida de 30 ciclos de desnaturação por 40 segundos a 94°C, annealing por
40 segundos a 53°C e extensão a 72°C de um minuto para o gene. Ao término dos
30 ciclos foi realizada uma etapa adicional de extensão a 72 °C por 10 minutos. A
ciclagem foi realizada no termociclador Eppendorf Mastercycler.
43
O produto final PCR foi submetido à eletroforese em 40 ml de gel de 1%
agarose e o DNA visualizado com Crystal violet (2 mg/ml em metanol, 50 µl por 50
ml gel) e luz branca e foi cortado do gel, purificado e clonado no vetor pGEM® T-
easy (Promega, Belo Horizonte) seguido de transformação em bactérias e
sequenciamento de clones.
Os demais PCRs seguiram as mesmas condições, porém com a Taq
polimerase (Fermentas) convencional, o produto PCR analisado em gel de agarose
1% e o DNA marcado com brometo de etídio (0,5 µg/ml) visualizado em luz
ultravioleta.
3.8 Purificação de produto de PCR
O procedimento para purificação do produto de PCR de gel de agarose (TAE)
foi realizado utilizando sílica "Glassmilk" [64].
Às bandas excisadas do gel foram adicionadas 3 volumes de NaI (6 M)
incubados a 37°C até dissolver o agarose. Foi adicionado então, 5 µl de Glassmilk
(100 mg/ml em 3 M NaI). Após incubação por 5 min e centrifugação o sedimentado
branco foi lavado com 1 ml de NEW wash buffer (20mM Tris/HCl pH 7,5, 0,1 M de
NaCl, 2 mM de EDTA (pH 8,0) em 55% V/V de Etanol). O sedimentado levemente
seco foi resuspendido em 20 µl de TE para o DNA desagregar do Glassmilk. Após
incubação e nova centrifugação, o sobrenadante pronto para uso foi transferido para
um novo tubo e utilizado ou estocado a -20°C.
3.9 Ligação de DNA e transformação
Para a reação de ligação utilizamos 0,5 µL (~50 ng) do vetor (pGEM-T easy)
ou (pTEX 150 GFP HA, pTEX 150 DD24 e pLOXTERM) e 1,5 µl inserto (fragmento
do gene surf 4).
44
Figura 9 - Mapas dos vetores utilizados
Na figura, mapa dos plasmídeos mostrando em A - O plasmídeo base pTEX150-GFPHA que também poderia apresentar a sequencia desestabilizadora (DD24) e B- O plasmídeo pLoxTerm. Para a reação, o inserto juntamente com o vetor foram incubados com a
enzima T4 ligase (Thermo Scientific) e 1 µL desta reação de ligação foi transformada
em 20-25 µl bactérias competentes das cepas DH10B ou XL1 blue, preparados
como descrito por Sambrook et al. (1991) [65]. Para os três últimos plasmídeos,
como controle de ligação, o vetor digerido também foi submetido aos mesmos
A
B
45
procedimentos para controle. Logo foram inoculadas em placa ágar LB amp e
mantidos em estufa por 10 a 16 horas a 37°C.
3.10 Extração do DNA plasmidial em pequena escala (Minipreps).
O procedimento foi realizado segundo Sambrook et al., 1991 [65].
Foram escolhidos colônias, da placa Agar LB amp, para inóculo em 1,5 ml de LB
amp em tubo (tipo Falcon) de 15 ml e incubadas no agitador deitado com tampa
semi-aberta por 10-16 horas a 37°C.
A cultura foi transferida para tubo tipo Eppendorf e centrifugado a 12000 rpm,
por 1 minuto. O sedimentado foi dissolvido em 200 µl de tampão 1 (Tris/HCl 0,01M
pH 8, glicose 1% e 2 mM EDTA, pH 8) e acrescentado 400 µl de tampão 2 (NaOH
0,2M, SDS 1%) para lisar as bactérias. As proteínas e complexos com DNA
genômico de E. coli foram precipitadas com acetato de potássio (3 M) e ácido
acético (5 M) (tampão 3) seguida por centrifugação a 12000 RPM por 5 minutos a
4ºC. Em sequência, o sobrenadante foi transferido para um novo tudo e o DNA foi
precipitado com 600 µl de isopropanol incubado por 10 min. Após nova
centrifugação (5 min, 12000 rpm e 4º C) o sedimentado foi lavado com 1 ml de
etanol 70%. Após secagem em temperatura ambiente o DNA foi resuspendido em
50 µl de TE (10 mM Tris/HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8, diluido em H2O) suplementado
com RNAse A (10 µg/ml) (Invitrogen).
Para análise e confirmação da clonagem, alíquotas do DNA após minipreps
foram incubadas com as respectivas enzimas de restrição (Fermentas, tipo comum
ou fast digest) e os fragmentos observados em gel TAE agarose 1% DNA marcado
com brometo de etidio e visualizado em luz ultravioleta.
3.11 Sequenciamento
Após análise do produto de restrição, os vetores intermediários (pGEM-T)
foram enviados para sequenciamento de DNA no próprio departamento que utiliza
sequenciador ABI 3100 e 3550 e componentes BigDye3.1.
Após a confirmação de 100% de identidade do fragmento com a sequência
surf 4 consultada no plasmoDB, este foi excisado do pGEM-T e clonado nos vetores
para transfecção (vide acima).
46
3.12 Extração do DNA plasmidial em grande escala, MaxiPrep [65]
Após confirmação por restrição, 0,2 µl dos plasmídeos positivos foram
transformados em células competentes XL1 blue ou DH10B. Uma colônia foi
inoculada em 1 mL de LB-amp+1% glucose e o cultivo foi mantido em agitação a 37
°C durante o dia e transferida em 100-200 ml TB-Amp sob agitação a 150-200 rpm a
37°C durante a noite. Depois foi centrifugado em tubos Falcon 50 ml a 2800 rpm por
15 min numa centrifuga Sorvall Benchtop. Após centrifugação, o sobrenadante foi
descartado e o precipitado foi dissolvido em 5 ml tampão 1 (vide "miniprep"),
adicionado 10 ml de tampão 2, levemente mexido e depois 10 min foi acrescentado
7,5 ml tampão 3. Após 10 min incubação no gelo, foi centrifugado por 10 min a 4°C e
2800 rpm, na centrifuga Sorvall.
O sobrenadante então, foi passado por um filtro de papel para um novo tubo e
adicionado 0,6 volumes de isopropanol. Incubou-se por 15 min a temperatura
ambiente e foi centrifugado novamente por 10 min a 4°C na centrifuga Sorvall a 2800
rpm. Após centrifugação o sedimentado seco foi resuspendido em 3 ml de TE e
acrescentado 3 ml de LiCl 5 M (gelado). Após nova centrifugação por 15 min a 4°C
na centrifuga Sorvall, o sobrenadante foi transferido para um tubo novo e misturado
ao mesmo volume de isopropanol. Após nova centrifugação (10 min, 2800 rpm, 4°C)
o sedimentado foi dissolvido em 0,5 ml de TE-RNAse (10 µg/ml) e incubado a 37°C
por 30 min e transferido para um tubo Eppendorf. Então, 0,5 ml de 13 % PEG 6000,
1,6 M NaCl foi adicionado. Após nova centrifugação por 5 min a 12000 rpm
(centrifuga Eppendorf) o sedimento foi ressuspendido em 0.5 ml de TE e extraído 3
vezes com fenol/clorofórmio e adicionado 100 µl 10 M NH4Ac. Os plasmídeos foram
precipitados com 1 ml de etanol 100%, após centrifugação por 5 minutos na
centrifuga Eppendorf foram lavados com 70% etanol, e o sedimentado depois foi
seco a temperatura ambiente. Finalmente, os sedimentados de DNA foram
dissolvidos em 200 µl de TE e quantificados no aparelho Nanodrop 2000 (Life
technologies).
47
3.13 Transfecção em P. falciparum
Um total de 40 µg plasmideo por transfecção foram administrados nos
parasitas através da metodologia descrita por Hasenkamp, Russell, & Horrocks
(2012) [66]. As condições de eletroporação foram 0,31 kV e 960 µF em cubetas de 2
mm (estabelecido por Fidock & Wellems, (1997)) [67]. Hemácias frescas foram
previamente lavadas em cytomix (120 mM KCl; 0,15 mM CaCl2; 10 mM
K2HPO4/KH2PO4 pH 7,6; 25 mM HEPES pH 7,6; 2 mM EGTA; 3 mM MgCl2),
adicionados aos plasmídeos (ressuspensos em cytomix) onde foram eletroporadas e
adicionados a 108 parasitas da linhagem NF54 em fase trofozoito/esquizonte
purificados pelo método plasmagel. Os parasitas foram mantidos em 5 ml cultura sob
mistura de gases (5% CO2/5% O2 e 90% N2). Após dois dias em cultivo, o meio de
cultivo foi suplementado com 2.5 nM WR99210.
3.14 Ciclagem dos parasitas
Para transfectantes com o domínio desestabilizador (DD24) foi adicionado
diariamente 0,5 µM final de Shield-1(Clontech) na cultura.
Para a seleção de eventos de integração por recombinação simples,
retiramos de forma intermitente a droga WR99210 por 14 a 20 dias e depois
retornamos a mesma ao cultivo. Desta forma, parasitas com plasmídeos de forma
episomal perdem estes e espera-se que parasitas com o plasmídeo integrado no
genoma sobreviverem a recolocação da droga WR99210.
Assim, a cultura de parasitas transfectados inicialmente e estabelecidos
(comumente 20-25 dias após transfecção), foi exposta a três ciclos de retirada da
droga WR99210 (por 14 dias) e adição até o reaparecimento estável de parasitas (1-
2 semanas).
A integração no lócus desejado foi detectada por PCR seguido por
microscopia de fluorescência e citometria de fluxo quando se tratava de parasitas
com etiqueta GFP.
A confirmação de parasitas com lócus modificado foi realizado por PCR
utilizando os óligos 5´ GACAATGTGGATAGAGATACACATG 3´ contida no gene em
posição 5' do fragmento presente no plasmídeo de transfecção e
48
3´AGCGGCATAATCTGGAACATCGTAC 5´ presente no tag 3xHA. Para controle
adicionamos 2 pares de óligos e gDNA de P. falciparum do isolado NF54, totalizando
3 pares de óligos para 2 gDNAs além do controle negativo. O produto PCR foi
analisado por eletroforese em gel de TAE agarose 1% e o DNA marcado com
brometo de etídio foi visualizado em luz ultravioleta.
3.15 Microscopia de fluorescência
Aliquotas de P. falciparum foram incubadas com 40 µg/ml de DAPI para
marcação de DNA do núcleo e com o anticorpo comercial anti-HA com fluoróforo
(alexa 594) (1:200) por 30 minutos a 37°C. Após esse período as amostras foram
lavadas 3x com 1xPBS e visualizadas em microscopia de fluorescência (Zeiss Axio
Imager M2) com aumento de 1000X.
Para análise da localização da proteína marcada com GFP, utilizamos 40
µg/ml de DAPI para marcação de DNA do núcleo, antí-glicoforina feito em
camundongo para marcação da membrana dos eritrócitos (1:200) por 30 minutos a
37°C e utilizamos um anticorpo secundário antí-mouse com fluoróforo (alexa 594)
(1:200) por 30 minutos a 37°C.
3.16 Citometria de Fluxo
Para verificar presença de GFP nos parasitas ou para quantificação de
parasitas (parasitemia) os parasitas foram incubados com brometo de etídeo a 100
µg/ml em meio RMPI completo por 20 minutos e posteriormente passaram por 3
lavagens com 1xPBS e foram resuspendidos em 1 ml de 1xPBS. Estas preparações
foram analisadas em citometria de fluxo Guava EasyCyte Mini (GE). Utilizamos o
sinal vermelho F3 para o brometo de etídeo e o verde F1 para a emissão de
fluorescência GFP. Para cada amostra foram analisados 40.000 eventos.
A porcentagem de células marcadas e a média de intensidade de
fluorescência puderam ser estimadas em análise no programa Guava EasySoft.
Para o transfectante NF54::pS4GFPHA 1µl de hemácias infectadas foi diluído
em 1 ml de RPMI e submetido analise utilizando o sinal o verde F1 para a emissão
49
de fluorescência GFP produzida pelo parasita mediante tag GFP inserido no gene
surf 4.
3.17 Clonagem limitante dos parasitas transfectados
Para obtenção de 100% dos parasitas com a modificação do lócus desejada,
foi realizado diluição limitante. Após a medição da parasitemia em citometria de
fluxo, a cultura foi diluída em até 0,3 parasitas por poço numa placa de 96 poços
fundo chato, que foi mantida em 5% de hematócrito até o 7° ciclo de reinvasão onde
eram esperados cerca de 107 parasitas. A detecção dos poços positivos foi realizada
por esfregaço sanguíneo corado com kit panótico rápido. Pocinhos com parasitas
foram expandidos até alcançarem a quantidade de 8x107 parasitas, seguido por
extração de gDNA com kit (Promega) e amplificação por PCR.
3.18 Western blot
Amostras de parasitas purificados e coletados no estágio esquizonte foram
lisados em buffer 4x SDS PAGE (0,25 M TrisCl pH 6,8, 6% SDS, 20% glicerol) e
desnaturados por 5 minutos quando aquecida em banho seco à 94 °C incubado com
inibidor de protease (Thermo Scientific). Em seguida a amostra foi submetida a
separação de proteínas por gel de SDS-PAGE 10% descontínuo [68] (SDS
polyacrylamid gel electrophoresis) em tampão de corrida 1X Running Buffer (0,192M
glicina, 0,025M Tris, 0,1% SDS). Os géis correram a 120 V.
Após a corrida os géis foram preparados para transferência em membrana de
nitrocelulose (Hybond C), em (0,192M glicina, 0,025M Tris + 10% metanol)
transferidas na voltagem de 1 V por cm2 do gel durante o período de 1 hora. Após a
transferência as membranas foram previamente lavadas em Ponceau, (0,1 g em 1%
ácido acético em H2O). As membranas foram lavadas em H2O deionizada e
bloqueadas em leite desnatado 5% em PBS 0,1% Tween20 por 1 hora. Após 3
lavagens com PBS/TBS-Tween (0,1%), o anticorpo primário anti-HA ou (anti-
PTEX150) 1:2000, feito em camundongo, foi incubado por 12 horas diluído em 2%
de leite desnatado em PBS 0,1% Tween20. Após esse período e novas 3 lavagens
com PBS-T (em 10 minutos de agitação cada lavagem), foi incubado o anticorpo
50
secundário (anti-mouse-peroxidase, KPL) diluido em 1% leite PBS-T por 2 horas.
Após novas 3 lavagens com PBS-T a quimioluminescência foi monitorada no
aparelho foto documentador utilizando o kit de substrato Western pico (KPL) que usa
uma mistura de luminol e água oxigenada para detectar emissão de luz onde há
presença de peroxidase.
3.19 Densitometria das bandas de western blot
Os sinais luminescentes emitidos no do western blot foram analisados por
densitometria medindo a intensidade da banda SURFIN 4 GFPHA em relação a
intensidade da banda de antígeno controle pTEX-150, utilizando o programa Image J
(National Institutes of Health, Maryland, EUA). Para comparação dos resultados
foram construídos gráficos de barras utilizando o programa Windows Excel.
3.20 Cultivo de P. falciparum com a adição de Shield-1
Shield-1 [23] (comercializado pela Clontech Inc.) foi armazenado a -20 °C em
concentração de 1 mM diluido em etanol. Durante o uso a droga foi diluída em RPMI
para concentração final de 0,5 a 1 µM. Parasitas que foram transfectados com
plasmídeo com o tag receberem tratamento com Shield-1 desde o primeiro dia após
a transfecção. Esse método com domínio desestabilizador (DD) tem sua base em
formas mutadas de FKBP (FK506/rapamycin-binding-protein) humano, que foi
estabelecida e usada para um grande efeito em diversos tipos de células para
explorar a função de proteínas [23]. Shield-1 (domínio ligante único) é um derivado
de rapamicina, e é um ligante altamente eficiente e não apresenta toxicidade [23,69].
3.21 Ensaio de retirada da droga Shield-1
Para o experimento, cultura sincrônica de parasitas foi lavada 1x com RPMI e
centrifugada a 1200 RPM por 5 min e logo após foi colocada e mantida em cultivo
conforme metodologia anteriormente descrita.
51
3.22 Contagem da parasitemia por microscopia
A quantidade de parasitas foi analisada por esfregaço sanguíneo corado com
o kit panótico rápido de experimento realizado em triplicata. Foram contadas as
hemácias vazias e parasitadas de um total de 10 campos e calculado a média. As
médias e desvio padrão foram estabelecidos e os resultados plotados em gráficos,
utilizando o programa Prism5.
4 RESULTADOS
53
4.1 Sincronização de P. falciparum
O parasita foi altamente síncronizado pelo método plasmagel/sorbitol
(metodologia descrita). Culturas mistas de parasitas com predomínio em
trofozoita/esquizonte foram submetidas ao método plasmagel e após 23 horas
quando já em anel foram submetidas ao método sorbitol, que seleciona formas anel
de 4 a 6 horas após reinvasão. Com a utilização das duas metodologias seguidas,
foi possível a obtenção de parasitas com sincronização maior que 80% monitorados
por microscopia (figura 9). Somente foram admitidas coletas de parasitas com
sincronização mínima de 80%. As amostras consistiam em parasitas nas formas
anel (de 4 a 6 h), trofozoitas (25 a 27 h) e esquizontes (33 a 35 h).
Figura 10 - Esfregaços sanguíneos mostrando hemácias infectadas com parasitas
sincronizados.
A figura mostra, hemácias infectadas em esfregaços corados com o kit (Panótipo Rápido) e visualizadas por microscopia com amplificação de 1000x com objetiva de imersão. As imagens estão indicando em A - as fases sanguíneas anel, B - trofozoita e C - esquizonte de P. falciparum.
4.2 Análise do perfil de transcrição de P. falciparum
Em primeiro lugar, realizamos ensaios para verificar o desempenho dos óligos
por RT-qPCR amplificando gDNA de P. falciparum da cepas 3D7 isogênico ao
isolado NF54 e de um isolado de campo (CAND) provindo de um paciente
sintomático oriundo da Candelária, um bairro de Porto Velho - RO infectado com P.
falciparum em 2002 o qual foi cultivado in vitro conforme metodologia. Os resultados
mostraram que os oligos para amplificação dos transcritos da cepa 3D7, isogênico
ao isolado NF54, possuem um desempenho comparável entre si (figura 10 A),
permitindo a quantificação relativa entre os amplicons pelo metodo 2-∆Ct [63] usando
5µm
54
como controle endógeno o transcrito do gene PF07_0073 (denominado "K1") (figura
10), já para amplificação do gDNA de CAND, os oligos para amplificação dos genes
surf 2, 3, 4 e 8 não funcionaram, indicando um polimorfismo no sítio de hibridação
dos oligos ou ausência do gene no genoma do isolado (figura 10 B).
Após a aceitação do desempenho dos óligos, procuramos calibrar
quantidades de RNA/cDNA numa maneira para os Cts do controle endógeno de
diferentes amostras não estarem muito diferentes. Para isso testamos todos os
cDNAs produzidos comparando o Ct obtido na amplificação do gene controle
endógeno K1 (Figura 11).
O resultado mostrou que o Ct do controle endógeno não variou muito ficando
entre 20 a 25 Ct. Julgamos, assim, que os cDNAs foram apropriados para permitir
comparações quantificação de transcritos das diferentes amostras e entre os
diferentes genes.
Em sequência, partimos para a análise do perfil de transcrição dos genes surf,
utilizando todos os cDNAs produzidos em RT-qPCR com oligonucleotídeos
específicos para cada gene surf (tabela 1) em três pontos 0, 20 e 40 gerações (TP1,
TP2 e TP3). A quantidade de transcritos relativa foi calculada pelo método do Delta
Ct através da fórmula 2-∆Ct utilizando a média das triplicatas obtidas com erro menor
que 0.5 e os valores obtidos foram plotados em gráficos utilizando Microsoft Excel
(figuras 12, 13 e 14).
Figura 11 - Desempenho dos oligosgDNA de P. falciparum
Em A, Desempenho dos oligos falciparum da cepa 3D7 Em B, utilizando gDNA de barras correspondem aos Cts do inglês exponencial, obtidos na amplificação de cada gene.
Desempenho dos oligos de surf e do controle endógeno K1P. falciparum.
Em A, Desempenho dos oligos surf e do controle endógeno por RT-qPCR utilizando gDNA de 3D7 Em B, utilizando gDNA de P. falciparum do isolado de campo (CAND). As
barras correspondem aos Cts do inglês cycle threshold, o ciclo da PCR onde a reação entra em fase exponencial, obtidos na amplificação de cada gene.
55
K1 usando
qPCR utilizando gDNA de P.
do isolado de campo (CAND). As , o ciclo da PCR onde a reação entra em fase
56
Figura 12 - Cts obtidos por RT-qPCR da transcrição do gene PF07_0073 (K1) como
controle endógeno de P. falciparum
Os gráficos representa os Cts, obtidos na amplificação do transcrito do controle endógeno gene PF07_0073 (seril-t-RNA sintetase) denominado K1, em cDNAs pot RT-qPCR em três pontos 0, 20 e 40 gerações (TP1, TP2 e TP3). Em A, quantificação da transcrição do gene PF07_0073 (K1) como controle endógeno cepa 3D7 de P. falciparum; em B, isolado NF54 de P. falciparum; em C, de isolado de campo de P. falciparum (CAND). As reações foram conduzidas em triplicatas e um controle negativo, utilizando o equivalente a 50 ng de RNA total convertidos em cDNA. Os valores indicam os Cts obtidos em cada ponto.
57
Figura 13 - Quantificação dos transcritos dos genes surf de P. falciparum clone 3D7
em coleta inicial e após 20 e 40 gerações
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
K1 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
3D7 TP1 ANEL
3D7 TP2 ANEL
3D7 TP3 ANEL
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
K1 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
3D7 TP1 Trofozoita
3D7 TP2 trofozoita
3D7 TP3 trofozoita
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
K1 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
3D7 TP1 Esquizonte
3D7 TP2 Esquizonte
3D7 TP3 Esquizonte
Quantificação do transcrito de 3D7 de P. falciparum nas fases anel, trofozoita e esquizonte em RT-qPCR em três pontos 0, 20 e 40 gerações (TP1, TP2 e TP3 respectivamente). Para as reações foram utilizados pares de oligonucleotídeos (surf), conduzidos em triplicatas e um controle negativo, utilizando o equivalente a 50 ng de RNA total convertidos em cDNA por reação individual. A quantidade de transcritos relativa foi calculada pelo método do Delta Ct através da fórmula 2-∆Ct utilizando a média das triplicatas obtidas com erro menor que 0.5. O parâmetro de referência utilizada foi o gene PF07_0073/K1 para controle interno.
58
Figura 14 - Quantificação dos transcritos dos genes surf de P. falciparum isolado
NF54 em coleta inicial e após 20 e 40 gerações.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
K1 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
NF54 TP1 ANEL
NF54 TP2 ANEL
NF54 TP3 ANEL
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
K1 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
NF54 TP1 TROFOZOITA
NF54 TP2 TROFOZOITA
NF54 TP3 TROFOZOITA
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
K1 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
NF54 TP1 ESQUIZONTE
NF54 TP2 ESQUIZONTE
NF54 TP3 ESQUIZONTE
Os gráficos mostram a quantificação dos transcritos de NF54 de P. falciparum nas fases anel, trofozoita e esquizonte em RT-qPCR em três pontos 0, 20 e 40 gerações (TP1, TP2 e TP3 respectivamente). Para as reações foram utilizados pares de oligonucleotídeos (surf), conduzidos em triplicatas e um controle negativo, utilizando o equivalente a 50 ng de RNA total convertidos em cDNA por reação individual. A quantidade de transcritos relativa foi calculada pelo método do Delta Ct através da fórmula 2-∆Ct utilizando a média das triplicatas obtidas com erro menor que 0.5. O parâmetro de referência utilizada foi o gene PF07_0073 definido como K1 para controle interno.
59
Figura 15 - Quantificação dos transcritos dos genes surf de P. falciparum isolado de
campo de Rondônia em coleta inicial e após 20 e 40 gerações.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
ANEL TP1
ANEL TP2
ANEL TP3
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
K1 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
TROFOZOITA TP1
TROFOZOITA TP2
TROFOZOITA TP3
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
ESQUIZONTE TP1
ESQUIZONTE TP2
ESQUIZONTE TP3
Nos gráficos, quantificação dos transcritos do isolado de campo (CAND) de P. falciparum nas fases anel, trofozoita e esquizonte em RT-qPCR em três pontos 0, 20 e 40 gerações (TP1, TP2 e TP3 respectivamente). Para as reações foram utilizados pares de oligonucleotídeos (surf), conduzidos em triplicatas e um controle negativo, utilizando o equivalente a 50 ng de RNA total convertidos em cDNA por reação individual. A quantidade de transcritos relativa foi calculada pelo método do Delta Ct através da fórmula 2-∆Ct utilizando a média das triplicatas obtidas com erro menor que 0.5. O parâmetro de referência utilizada foi o gene PF07_0073/K1 para controle interno.
Como pode ser analisado nos gráficos (figura 12, 13 e 14), houve variação na
quantidade relativa de transcritos surf ao longo de 40 reinvasões e em diferentes
linhagens.
Para o gene surf 4 apesar da variação na quantidade de transcritos, a
atividade de transcrição foi mantida nos estágios esquizonte do parasita na cepa
3D7 e isolado NF54. Já para o isolado de campo (CAND) não houve amplificação
dos transcritos para esse gene surf 4, devido ao insucesso na amplificação com os
oligos surf 4. Por outro lado, houve quantidades significativas (as vezes bem acima
60
do K1) de produtos amplificados com os oligos surf 1, surf 7, surf 9 e surf 10.
Adicionalmente e na contramão dos transcritos de 3D7 ou NF54, houve quantidades
maiores desses transcritos em formas anel e esquizonte e não apenas esquizontes,
indicando uma plasticidade na transcrição de genes surf entre linhagens diferentes.
Na cepa 3D7 houve transcrição para os genes surf 8 na fase anel, assim
como surf 9 que também foi transcrito nos estágios trofozoita e esquizonte (figura
12). NF54 apresentou transcritos dos genes surf 1, surf 9 e surf 10 no último ponto
em amostra de esquizonte (figura 13).
Julgamos que para 3D7 e NF54 (figura 12 e 13), os genes surf 1, 2, 3, 5, 6 e 7
estão transcricionalmente pouco ou não ativos em nossos cultivos. Por outro lado
alguns genes e suas correspondentes proteínas eventualmente possuam algum
papel na fase sanguínea por ter quantidades claramente detectáveis de transcritos
em nossos ensaios, destacando o gene surf 4, além do 8, 9 e 10.
Já o perfil de transcrição dos genes surf do isolado de campo CAND (figura
14), apresentou características muito distintas, exibindo a quantidade de transcritos
muito maior quando comparado com as cepas 3D7 e NF54. Nesse parasita, a
transcrição foi muito mais característica nas amostras de anel, seguida pelas
amostras de esquizonte dos genes surf 1, 6, 7, 9 e 10. Na fase trofozoita os genes
surf, assim como nas outras cepas, continuou com baixas quantidades de
transcritos, quando comparados com o controle endógeno o gene PF07_0073 (K1).
Possivelmente, existem outros alelos surf no isolado CAND que não são acessíveis
com os oligos aqui utilizados.
4.3 Elucidando o papel do gene constitutivamente transcrito, surf 4
(PF3D7_0402200)
Para acessar o papel do gene surf 4 e da proteína SURFIN 4, clonamos
vetores de expressão que tem como objetivo tornar o gene surf 4 a proteina SURFIN
4 regulável sem alterar seu timing de expressão. Utilizamos para isso plasmídeos
que permitem acrescentar etiquetas GFP-HA, GFP-HA-DD24 e HA com terminador
flanqueado por sítios loxP.
Os plasmídeos para a transfecção pTEX150-GFP/HA, pTEX150-GFP-HA-
DD24, que contém o epítopo da proteína hemaglutinina (HA), e/ou GFP e o domínio
desestabilizador DD24 [69], foram gentilmente cedidos por Dr. Mauro F. de Azevedo.
61
Os vetores para transfecção foram digeridos com as enzimas de restrição
Bgl2 e Pst1 (tipo FastDigest, Fermentas). Os fragmentos correspondentes aos
vetores posteriormente receberam o fragmento surf 4.
O plasmídeo pTEX-LoxTerm foi construído para a realização deste projeto
seguindo instruções, sobre a construção, do Doutor Mauro Azevedo.
Para essa construção, foram desenhados oligonucleotídeos que amplificam
por PCR o terminador com sequências LoxP flanqueados por sítios NcoI/EcoRV,
utilizando como substrato para o PCR o plasmídeo pTEX150HA.
Para obter o novo plasmídeo, denoninado pTEXLoxTerm, o terminador de
outra alíquota do pTEXHA150 foi excisado do vetor com enzimas de restrição Nco1
e EcoRV e o novo fragmento LoxP-terminador–LoxP extraído do pGEM-T foi
inserido (figura 15). A confirmação seguiu por análise de restrição onde pudemos
confirmar a exclusão do sítio Xho1 do vetor pTEXHA150 original o qual foi deletado
na inserção do fragmento utilizando os sítios Bgl2 e Pst1 contidos no fragmento e no
vetor (figura 16).
Figura 16 - Mapa dos plasmídeo com sítios loxP.
Mapa dos plasmídeos mostrando em A o plasmídeo base PTEX150-HA com sítio de restrição Xho1 e em B o plasmídeo pronto para transfecção pS4LOXTERM sem o sítio de restrição Xho1 o qual foi deletado na inserção do novo terminador flanqueado por sítios LoxP.
Figura 17 - Análise de restrição para confirmação da modificação do vetor para
obtenção do plasmideo pS4LOXTERM.
Na figura, visualização por luz ultravioleta de eletroforese em gel de DNA marcado com brometo de etídio. Nas colunas fragmentos de DNA do plasmídeo
4.4 Confirmação da fusão genética após transfecção dos plasmídeos e
recombinação simples
Finalizada as construções, os plasmídeos foram transfectados
metodologia descrita.
Na recombinação com o vetor pS4GFPHA, a proteína SURFIN 4 forma uma
fusão com GFP e uma etiqueta HA (epítopo principal de hemaglutinina), no vetor
pS4GFPHADD24 a proteína além de ter domínios GFP e HA apresenta um domínio
desestabilizador DD24 [69]
terminador flanqueado por sequências loxP expressando a prot
etiqueta HA.
Após três ciclos de retirada e re
dos integrantes por recombinação simples e deleção dos transfectantes com
plasmídeo episomal, testamos a integração no lócus por PCR e microscopia de
fluorescência (figuras 18 e 19
expressão do transgene com GFP
possuem promotor para a
não permite a expressão do gene quando ainda está no plasmideo de forma
episomal.
Análise de restrição para confirmação da modificação do vetor para
obtenção do plasmideo pS4LOXTERM.
Na figura, visualização por luz ultravioleta de eletroforese em gel de DNA marcado com brometo de etídio. Nas colunas fragmentos de DNA do plasmídeo indicado cortado com as enzimas Bgl2 e Xho1.
.4 Confirmação da fusão genética após transfecção dos plasmídeos e
simples em surf 4
Finalizada as construções, os plasmídeos foram transfectados
Na recombinação com o vetor pS4GFPHA, a proteína SURFIN 4 forma uma
fusão com GFP e uma etiqueta HA (epítopo principal de hemaglutinina), no vetor
pS4GFPHADD24 a proteína além de ter domínios GFP e HA apresenta um domínio
[69]. Já no vetor pS4LoxTerm, o gene adquire um novo
terminador flanqueado por sequências loxP expressando a proteína em fusão com
três ciclos de retirada e re-introdução da droga WR99210, para seleção
dos integrantes por recombinação simples e deleção dos transfectantes com
o episomal, testamos a integração no lócus por PCR e microscopia de
18 e 19), lembrando que apenas o plasmídeo integrado leva a
expressão do transgene com GFP-HA e GFP-HA-DD24 já que os plasm
possuem promotor para a fusão 3’ de surf 4 com GFP-HA e GFP-HA
a expressão do gene quando ainda está no plasmideo de forma
62
Análise de restrição para confirmação da modificação do vetor para
Na figura, visualização por luz ultravioleta de eletroforese em gel de DNA marcado com brometo de indicado cortado com as enzimas Bgl2 e Xho1.
.4 Confirmação da fusão genética após transfecção dos plasmídeos e
Finalizada as construções, os plasmídeos foram transfectados conforme
Na recombinação com o vetor pS4GFPHA, a proteína SURFIN 4 forma uma
fusão com GFP e uma etiqueta HA (epítopo principal de hemaglutinina), no vetor
pS4GFPHADD24 a proteína além de ter domínios GFP e HA apresenta um domínio
. Já no vetor pS4LoxTerm, o gene adquire um novo
eína em fusão com
introdução da droga WR99210, para seleção
dos integrantes por recombinação simples e deleção dos transfectantes com
o episomal, testamos a integração no lócus por PCR e microscopia de
lembrando que apenas o plasmídeo integrado leva a
DD24 já que os plasmídeos não
HA-DD24 o que
a expressão do gene quando ainda está no plasmideo de forma
63
Para confirmar a integração dos domínios no lócus surf 4, as linhagens
denominadas NF54::pS4GFPHA, NF54::pS4LoxTerm e NF54::pS4DD24 tiveram o
gDNA extraído e submetido a amplificação por PCR utilizando óligos como
esquematizado na figura 17.
Conforme o resultado mostrado na figura 18, quando há amplificação do
fragmento na canaleta denominada B, há a existência de gene fusionado porque o
oligonucleotideo reverso em 3xHA (indicado pela seta 2 na figura 17) não
amplificaria com o oligonucleotideo 5 se o sitio de hibridação não localiza-se na
mesma fita de DNA. Inversamente, ainda encontramos a presença de episomos
quando o par de oligos RM13 e 2 amplificaram. A figura 18 indica que todos os
transfectantes apresentaram um genótipo ainda misto episomal e integrado, isto é,
apesar da presença do genótipo com o lócus modificado os parasitas também
apresentaram formas com plasmídeo episomal.
A linhagem NF54::pS4GFPHA pôde ser observada por microscopia de
fluorescência (figura 18) utilizando o equipamento Zeiss Axio Imager M2.
Figura 18 - Integração por recombinação simples das construções.
3’ UTR
DD24GFP 3XHA term Resistência WR
DD24GFP 3XHASURF 4
SURF 4
term Resistência WR 3’ UTR
1 2
3 42
5
Locus original
Plasmídeo
Locus modificado
As setas indicam: 1 – sequência primer RM13 presente no plasmídeo; 2 – sequência primer 3’HA também presente no plasmídeo que amplifica a região 3’ do tag HA; 3 – sequência primer 5’ que amplifica o fragmento de Surf 4 utilizado para knockin; 4- primer 3’ do fragmento de surf 4 utilizado para knockin e 5 – primer desenhado para amplificar sequências 5’ de DNA de parasitas com lócus modificado utilizando como 3’ o indicado pela seta 2. Os pinos em preto indicam a localização dos sítios loxP apenas presentes em pS4LoxTerm.
64
Figura 19 - Análise da amplificação por PCR com oligonucleotídeos específicos para
detectar modificação no lócus do gene surf 4 de P. falciparum.
Na imagem, visualização por luz ultravioleta de eletroforese em gel de agarose com brometo de etídio. Em 1, amplificação por PCR de DNA genômico das cepas indicadas. Nas colunas, A indica controle positivo para o par de óligo 3 e 4 (figura 17) de DNA genômico da cepa NF54 de P. falciparum e das linnhagens transfectantes indicadas. B mostra fragmentos amplificados de DNA utilizando pares de oligos nucleotídeo 5 e 2 (figura 17) que quando positivos indicam a presença da integração no lócus e C utiliza pares de oligonucleotídeos 1 e 2 (figura 17), que quando positivos indicam a presença de plasmideo epissomal. Em 2, amplificação por PCR dos vetores com os oligos acima descritos (figura 17), nas canaletas A, os vetores indicados expostos a amplificação com oligos 3 e 4 da figura 9, em B, oligos 5 e 2 e C oligos 1 e 2 que pareia com DNA do plasmídeo.
Figura 20 - Foto de imunofluorescência, para análise da proteína SURFIN 4
fusionada ao tag GFP, obtido através do Zeiss Axio Imager M2
Na imagem, parasitas transfectados com o plasmídeo pS4GFPHA após 3 ciclos de retirada da droga. A- Microscopia em luz polarizada, B - filtro para visualizar núcleos através de coloração com DAPI, C- fluorescência emitida por anticorpo anti-HA marcado com Alexa594 após reconhecimento da proteína surf4 modificada com tag HA; D - fluorescência emitida pela proteína GFP fusionada a SURFIN 4 modificada com tag GFP e E, sobreposição. Em experimento paralelo, nenhuma fluorescência foi observada com parasitas não transfectados.
5µm
65
4.5 Linhagem clonal de parasitas transgênicos
Para analisar o papel funcional do gene surf 4 foi necessário obter uma
linhagem com 100% de parasitas com lócus modificado. Para tanto, realizamos a
clonagem dos parasitas NF54::pS4DD24 e NF54::pS4LoxTerm por diluição limitante,
conforme metodologia descrita.
A parasitemia da cultura foi averiguada e a cultura diluída até a quantidade de
0,3 parasitas por 100 µl para serem distribuídos em uma placa de 96 poços. Essa
placa foi mantida em cultura conforme indica metodologia, por 12 dias sem a droga
WR e reintroduzindo a mesma por 12 dias após esse período.
Metodologicamente, optamos por confirmar os poços positivos por esfregaço
sanguíneo corado com kit (Panótico Rápido). Foi padronizado a quantidade mínima
de parasitas para extração confiável de gDNA, além de escolher um melhor método
para sua extração, que anteriormente era realizado pelo método fenol/clorofórmio,
onde perdíamos o material genético durante o procedimento. Por isso, optamos pelo
kit da Promega (metodologia descrita), que se mostrou eficiente em obter material
genético de pequena quantidade de parasitas em hemácias infectadas.
Aplicando esta metodologia, verificamos que a clonagem do transfectante
NF54::pS4-GFP-HA-DD24 foi bem sucedida conforme mostra o teste onde
amplificamos gDNA do clone por PCR (figura 20) utilizando os mesmos
oligonucleotídeos como apresentado na figura 17. Na figura 20 também pudemos
observar que não houve a amplificação por PCR do gDNA de NF54::pS4DD24 para
os oligonucleotideos 1 e 2 (figura 17) sendo assim, não foram detectados parasitas
com plasmídeo episomal na cultura, como era desejado.
No resultado do PCR nas figuras 20 e 21, a linhagem transgênica com
modificação do gene surf 4, agora apresenta o tag GFP/HA além da fusão com
domínio desestabilizador.
O nosso segundo transfectante NF54::pS4LoxTerm, apesar de termos
conduzido o procedimento por três tentativas, ainda não conseguimos obter esta
linhagem de forma clonal.
66
Figura 21 - Visualização das bandas obtidas após amplificação por PCR para
confirmação da linhagem clonal com modificação no locus surf 4.
Visualização por luz ultravioleta de eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio. Amplificação por PCR de DNA genômico das cepas indicadas. Nas colunas, A indica o controle positivo para o par de óligo 3 e 4 (figura 17) de DNA genômico da cepa NF54 de P. falciparum e das linhagens transfectantes indicadas. B mostra fragmentos amplificados de DNA utilizando pares de oligos nucleotídeo 5 e 2 (figura 17) que quando positivos indicam a presença da integração no lócus e C utiliza pares de oligonucleotídeos 1 e 2 (figura 17), que quando positivos indicam a presença de plasmideo epissomal. D indica a ausência de contaminação dos ingredientes do PCR (reação sem substrato DNA).
Seguimos com a análise em citometria de fluxo tentando detectar a presença
da fusão GFP e saber em qual fase do parasita o antígeno é efetivamente mais
expressivo.
Os resultados demonstram que o gene de GFP parece estar inserido no lócus
em uma fase de leitura correta, devido à presença fluorescência correspondente a
GFP, confirmada por citometria de fluxo (figura 22).
Analisando os dados da citometria de fluxo (figura 22) é possível dizer que o
antígeno SURFIN 4 parece ser expresso principalmente nas fases trofozoita maduro
e esquizonte de P. falciparum, aparentando desempenhar sua função nestas fases.
Na figura 14, a notável captação do sinal de fluorescência começa a aparecer
no gráfico indicado pela letra C, o qual foi superado por D onde a fluorescência foi
ainda maior. No gráfico indicado pela letra A, podemos observar que esses parasitas
não transfectados (linhagem NF54) não emitem fluorescência, pois não apresentam
eventos na parte superior à direita em vermelho.
67
Figura 22 - Amplificação por PCR para confirmação da inserção do domínio
desestabilizador (DD24) no locus surf 4 após seleção clonal.
3’ UTR
DD24GFP 3XHA term Resistência WR
DD24GFP 3XHASURF 4
SURF 4
term Resistência WR 3’ UTR
12
3 42
567
A B C D
A- Oligos 5 e 4
B- Oligos 5 e 2
C- Oligos 5 e 6
D -Oligos 6 e 7
Na figura, visualização por luz ultravioleta de eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio. Em II amplificação por PCR de DNA genômico das cepas indicadas. Nas canaletas, A indica o controle positivo para o par de óligo 5 e 4 representados em I, onde amplifica DNA genômico da cepa NF54 de P. falciparum. B mostra fragmentos amplificados de DNA utilizando pares de oligos nucleotídeo 5 e 2 que quando positivos indicam a presença da integração no lócus, C utiliza pares de oligonucleotídeos 5 e 6 que quando positivos indicam a inserção do tag de domíneo desestabilizador. D representa amplificação do par de oligos 7 e 6 que indica a presença da sequencia desestabilizadora em total comprimento.
I
II
68
Figura 23 - Scatter plots da aquisição de 40.000 eventos. Citometria de fluxo de
hemácias infectadas com parasita expressando SURFIN 4 GFP.
Na figura, a letra A representa análise por citometria de hemácias infectadas por P. falciparum NF54 e as letras B, C e D representam respectivamente as fases anel, trofozoita jovem e trofozoita maduro/esquizonte do transfectante NF54::pS4GFPHA. A parte em verde, inferior à direita do gráfico, representa as hemácias vazias e parasitas que não emitiram fluorescência. A parte superior à direita em vermelho representa a captação de fluorescência emitido pelo parasita geneticamente modificado em diferentes fases do ciclo, como descrito acima.
4.6 Análise do fenótipo com knockdown de SURFIN 4 da linhagem de parasitas transgênicos com fusão GFP-HA-DD24
Para averiguar se a nossa construção com domínio desestabilizador era
eficaz, analisamos a diminuição da proteína por Western blot (figura 23) mediante a
sucessiva retirada do ligante estabilizador Shield-1 da cultura, utilizando como
controle positivo o nosso parasita modificado com a inserção de GFP em SURFIN 4.
69
Figura 24 - Western Blot do ensaio de retirada do ligante estabilizador Shield-1 para
análise da performance do knockdown da proteína SURFIN 4 modificada
com o domínio desestabilizador (DD24).
Em I, os números indicam proteinas de P. falciparum, separada por SDS-PAGE transferiadas para membrana de nitrocelulose onde, antecedente à exposição, foi submetida a incubação com anticorpo específico. Em A, anti-corpo anti-HA, em B, anticorpo contra PTEX 150 (utilizado como controle endógeno) de P. falciparum. Nas canaletas 1- Parasitas positivo para o tag GFPHA no antígeno SURFIN 4 na ausência de Shield. 2- SURFIN 4 GFPHA na presença do ligante. 3- Na presença do ligante estabilizador (Shield), antígeno SURFIN 4 modificado com dominio desestabilizador (DD24). 4- Antígeno SURFIN 4 DD sem o ligante estabilizador por 24 horas. 5 - Antígenos SURFIN 4 DD sem o ligante estabilizador por 48 horas, 6- Antígeno SURFIN 4 DD sem o ligante estabilizador por 72 horas e . 7-material de NF54 selvagem sem Shield-1. Em II, densitometria das bandas obtidas por western blot, utilizando programa imageJ, as barras representam a intensidade relativa do sinal de antiHA, calibrado usando o sinal para PTEX150. O tratamento das linhagens com e sem Shield-1 está indicado no eixo x.
Na análise, observamos que no parasita NF54::pS4-GFPHA-DD24 ocorria a
degradação sucessiva da proteína SURFIN em 24, 48 e 72 hs mediante a retirada
do ligante Shield-1 da cultura, em relação ao calibrador endógeno PTEX150 (figura
23). Isso mostra que o domínio DD24 foi capaz de levar a diminuição da proteína de
70
fusão SURFIN4-GFP-HA-DD24, possibilitando observar um possível efeito no fitness
da linhagem transfectante com expressão de SURFIN4 diminuída.
4.7 Fitness de P. falciparum após knockdown de SURFIN 4 dos parasitas transgênicos com fusão GFP-HA-DD24
Para essa análise, foi medido o progresso da parasitemia das culturas. O
experimento se iniciou em parasitemia de 0,2% e os parasitas foram mantidos em
cultura, em triplicatas, com e sem adição de Shield-1.
O progresso da parasitemia foi monitorado a cada ciclo. Em resultado, a
linhagem de parasitas transgênicos NF54::S4GFP-HA-DD24 exposto ou não ao
Shield-1 não apresentou diminuição da parasitemia assim como não demonstrou
anormalidades observáveis durante o estágio do parasita no eritrócito como mostra
o gráfico da figura 24, quando comparado com o controle NF54.
Assim, concluímos que o knockdown da proteína com a retirada e Shield-1
não modificou a sobrevivência do parasita que apresentou o mesmo desempenho
que o parasita NF54::S4GFP-HA-DD24 nunca foi submetido à retirada de Shield-1 e
do controle NF54 mantido em Shield-1.
O isolado NF54 sem adição de Shield-1 se comportou como esperado, pois a
adição de Shield-1 na cultura tem efeito sobre a parasitemia, mostrando uma leve
diminuição quando comparado ao controle [39].
71
Figura 25 - Curva de parasitemia para análise do efeito após SURFIN 4 diminuída
mediante resposta ao DD24 por ausência do ligante estabilizador Shield-
1.
Na figura, o grafico representa as curvas de parasitemia desenvolvida pelos parasitas clonados NF54:: S4GFPHADD24 e do controle NF54 em resposta a presença ou ausência de Shield-1 na cultura.
4.8 Transcrição de surf 4 e de outros membros surf após knockdown de SURFIN 4 dos parasitas transgênicos com fusão GFP- HA- DD24
Para averiguar se SURFIN 4 não estaria sendo substituída por algum outro
antígeno SURFIN, resolvemos monitorar a transcrição dos genes surf do parasita
NF54::S4GFP-HA-DD24 com a retirada de Shield-1 da cultura para explorar se
algum outro gene da mesma família começaria a ser transcrito.
O teste foi realizado com a retirada de Shield da cultura por 24, 48, 96 e 192
horas (figura 26 e 27), e a comparação realizada utilizando controle 3D7 com e sem
adição de Shield-1 (figura 25).
Observando a transcrição dos genes surf, após knockdown de SURFIN 4
mediante a retirada de Shield-1 da cultura, subitamente os genes surf 3, 8 e 9
aparentemente aumentaram a quantidade de transcrito quando comparado com o
72
controle endógeno K1 (27), além de intensificar a quantidade de transcrito de surf 4
como pode ser visualizado (figura 26).
Figura 26 - Análise do efeito de Shield-1 na transcrição dos genes surf de P.
falciparum em parasitas controle da cepa 3D7.
O gráfico mostra a quantificação da transcrição dos genes surf de 3D7 de P. falciparum na fase esquizonte por RT-qPCR com e sem a adição de Shield-1 na cultura. Para as reações foram utilizados pares de oligonucleotídeos (surf), conduzidos em triplicatas e um controle negativo, utilizando o equivalente a 50 ng de RNA total convertidos em cDNA por reação individual. A quantidade de transcritos relativa foi calculada pelo método do Delta Ct através da fórmula 2-∆Ct utilizando a média das triplicatas obtidas com erro menor que 0.5. O parâmetro de referência utilizada foi o gene PF07_0073 definido como K1 para controle interno.
73
Figura 27 - Quantificação da transcrição do gene surf 4 após desestabilização
condicional da proteína mediante a retirada de Shield-1 da cultura.
K1 024
48 96 19
2
+ SHLD 4
8 0.0
1.0
2.03456789
101618202224262830
Tempo em horas
Quantificação do transcrito surf 4 de P. falciparum nas fase esquizonte por RT-qPCR após diminuição da proteína SURFIN 4 fusionada ao domínio desestabilizador DD24 mediante a retirada do ligante estabilizador Shield-1 da cultura. Para as reações foram utilizados pares de oligonucleotídeos (surf), conduzidos em triplicatas e um controle negativo, utilizando o equivalente a 50 ng de RNA total convertidos em cDNA por reação individual. A quantidade de transcritos relativa foi calculada pelo método do Delta Ct através da fórmula 2-∆Ct utilizando a média das triplicatas obtidas com erro menor que 0.5. O parâmetro de referência utilizada foi o gene PF07_0073 definido como K1 para controle interno.
Para analisar se a adição de Shield-1 outra vez na cultura modularia a
transcrição dos genes surf, adicionamos novamente a droga e medimos a
transcrição dos genes. Em análise, as transcrições do gene surf 4 tendeu a se
normalizar quando comparado ao controle que consiste no parasita modificado que
sempre recebeu o ligante estabilizador Shld-1 (figura 26), assim como os genes que
tiveram a quantidade de transcritos aumentada surf 3, 8 e 9 também reduziram
novamente a transcrição na presença de Shield-1 que estabilizava SURFIN 4 (figura
27).
74
Figura 28 - Quantificação de transcritos surf de P. falciparum após desestabilização
condicional de SURFIN 4 mediante retirada da droga Shield-1, da
cultura. condicional de SURFIN 4
Quantificação do transcrito surf 4 de P. falciparum nas fases esquizonte por RT-qPCR após diminuição da proteína SURFIN 4 fusionada ao domínio desestabilizador DD24 mediante a retirada de Shield-1 da cultura. Para as reações foram utilizados pares de oligonucleotídeos (surf) (tabela 1), conduzidos em triplicatas e um controle negativo, utilizando o equivalente a 50 ng de RNA total convertidos em cDNA por reação individual. A quantidade de transcritos relativa foi calculada pelo método do Delta Ct através da fórmula 2-∆Ct utilizando a média das triplicatas obtidas com erro menor que 0.5. O parâmetro de referência utilizada foi o gene PF07_0073/K1 para controle interno.
75
Cabe ressaltar que os experimentos de retirada de Shield-1 e recolocação foram
repetidos três vezes onde foram observados tendências parecidas (aumento de
transcrito sem Shield-1 e diminuição ao recolocar) e o resultado representativo de
um experimento é mostrado.
4.9 Microscopia de fluorescência para localização de SURFIN 4 em P.
falciparum
Como surf 4 em nossos experimentos demonstrou ser transcrito em estágio
esquizonte, possivelmente esteja funcional em merozoitos, e para verificar se houve
uma localização diferencial daquela observada por Mphande e colegas [57] que
observou em merozoitos ou por Zhu e colegas [59] que observou a proteína no
complexo Maurer´s clefts, recorremos à microscopia de fluorescência, e
conseguimos detectar que o antígeno SURFIN 4 estava de fato associado ao
merozoito (figura 29), visualizado pela fluorescência GPF (fusionada à proteína)
como Mphande e colegas [57].
Figura 29 - Análise da emissão de fluorescência GFP fusionado a proteína
SURFIN4 de P. falciparum por de microscopia de fluorescência.
Na imagem, fotografias obtidas através microscópio Zeiss Axio Imager M2. Em A, parasitas da linhagem NF54 sem a integração no lócus para GFP. Em B parasita transfectante NF54::pS4GFPHA com o lócus modificado para presença de GFP. Em ambos os ensaios, o número 1 representa microscopia em luz polarizada, 2 fluorescência emitida pela proteína GFP fusionada a SURFIN 4, 3 fluorescência azul para visualizar núcleos através de coloração com DAPI e 4 sobreposição das imagens 1, 2 e 3.
5µm
5µm
76
Figura 30 - Localização de SURFIN 4 na hemácia infectada, por microscopia de
fluorescência.
A B
C D
E Foto de microscopia de fluorescência obtida através do Zeiss Axio Imager M2 de NF54::pS4GFPHADD24. A - Microscopia em luz polarizada, B - marcador de núcleos DAPI, C- fluorescência emitida pela fusão GFP, D marcação de membrana antiGlicoforina E - sobreposição. Em experimento paralelo, nenhuma fluorescência foi observada com parasitas não transfectados (não mostrado).
5µm
5 DISCUSSÃO
78
Neste trabalho monitoramos a transcrição de genes surf, de função ainda
desconhecida, ao longo do ciclo assexuado durante múltiplas reinvasões.
Mostramos que a transcrição do gene surf 4 (PF3D7_0402200) se apresentou
predominantemente em esquizontes e do surf 9 (PF3D7_0115000) em anel,
enquanto os demais genes surf ou estavam transcricionalmente inativos ou em
algum momento foram detectados em pequenas quantidades.
A partir dos dados de vários transcriptomas acessíveis em plasmoDB.org,
parece que há transcrição diferenciada de surf para alguns estágios do parasita.
Alguns dos transcritos são mais abundantes em formas sexuadas, como por
exemplo, os genes surf (1, 2, 3 e 7) que possui altas quantidades de transcritos em
oocineto ou oocisto (vide plasmodb.org).
Em observação da transcrição do gene surf 4, ao longo das reinvasões em
diferentes linhagens 3D7 ou NF54 o transcrito está claramente presente nas fases
esquizonte. Isto é um indicativo de que a proteína pode desempenhar sua função de
forma estágio-específico e como comprovada por citometria de fluxo e por Western
Blot, além da transcrição, a proteína é mais abundante nessa mesma fase,
esquizonte. Estima-se que ao longo do ciclo eritrocítico mais de 75% dos genes são
expressos em estágio-específico, ocorrendo pouco antes da necessidade de
utilização das proteínas por eles codificados [70,71]. Sendo assim, se uma proteína
tem papel na invasão, o transcrito deve se manifestar no estágio esquizonte. Não se
sabe ainda se SURFIN 4 está de fato envolvida no processo de invasão como
proposto por estudos anteriores [57,58], mas esse fato pode ser explorado
futuramente já que o antígeno mostrou ser específico para merozoitas.
Quando testamos a linhagem de campo CAND, observamos que a dinâmica
da transcrição surf foi completamente diferente, mostrando altos níveis de transcritos
de vários loci simultaneamente. Não dispomos de dados do genoma de CAND,
entretanto, a partir de alinhamentos publicados fica claro que os genes surf são
muito mais conservados entre diferentes linhagens do que entre alelos diferentes,
isto é, surf4 de NF54 assemelha-se muito mais com o gene sinténico na linhagem IT
(plasmoDB.org) do que, por exemplo, com o alelo surf7 do próprio genoma. Se de
fato os oligos aqui empregados amplificam diferentes loci surf de CAND, os dados
levantados de NF54/3D7 são específicos e validos para estas linhagens, mas
provavelmente não de forma geral já que estes genes são polimórficos [72,73].
Como monitoramos apenas a transcrição dos genes surf, não sabemos se os
79
resultados observados para a quantificação dos transcritos refletem-se na expressão
das proteínas (exceto para SURFIN4 que foi detectado utilizando anti-HA), isso seria
possível saber mediante western blot, utilizando anticorpos específicos contra os
antígenos SURFIN, dos quais ainda não disponibilizamos em nosso laboratório.
Os nossos dados sobre a localização de SURFIN 4 coincidem com o dados
de outros trabalhos onde em experimentos de imunofluorescência SURFIN 4
Mphande e colegas [57,58] propuseram que a proteína fizesse parte do complexo
proteico como parte de uma camada anexa ao merozoita que poderia estar
associado ao processo de invasão ou estar envolvida no processo de
reconhecimento celular. Não pudemos detectar a proteína na superfície da hemácia
infectada como proposto por Zhu e colegas [59]. Nesta contradição, uma explicação
seria, que SURFIN 4 talvez localizado na superfície da hemácia infectada seja de
curta duração e nossas amostras quando visualizadas não continham as formas na
idade correta pós-infecção.
Curiosamente, surf 4 (também conhecido como surf4.1) nunca teve sua
deleção documentada na literatura. Para saber se SURFIN 4 é essencial, criamos
uma linhagem que expressa a proteína com GFP-HA e o domínio desestabilizador
(DD24) [69]. Interessantemente, 48h após retirada de Shield-1, que estabiliza o
domínio DD24 e a proteína SURFIN 4 associada, houve grande diminuição da
proteína. Entretanto, apesar da desestabilização da proteína, nenhum efeito na taxa
de crescimento foi perceptível, indicando que SURFIN 4 talvez possua um papel
dispensável em parasitas cultivados in vitro. Talvez em situação de infecção natural
no hospedeiro vertebrado a falta de SURFIN 4 leve a outros resultados.
Semelhantemente, proteínas PfEMP1 e knobs não possuem um papel decisivo in
vitro e assim podem ser deletadas ou mesmo ter a expressão diminuída como
mostrado em trabalhos anteriores [48]. Entretanto, in vivo possivelmente com a
diminuição de PfEMP1 o parasita poderia perder sua virulência já que sem a
citoaderência o parasita possivelmente seria eliminado no baço.
Outro ponto é que o desempenho do knockdown de SURFIN 4 na ausência
de Shield-1 se mostrou consistente com dados anteriores do nosso laboratório onde
experimentos mostraram uma diminuição geral da quantidade de luciferase e GFP
pelo tagging com o domínio DD24 e um decréscimo da quantidade da proteína
controlada pelo fator 5 [69]. A partir da quantificação do knockdown, podemos
constar que o desempenho de DD24 é ainda superior ao fator 1:5 alcançado por
80
Azevedo e colegas usando um construto Luciferase-GFP-DD24. O grupo de
Goldberg mostrou que o knockdown utilizando esse domínio desestabilizador
(ddFKBP) com a retirada de Shield-1, tinha o mesma eficiência que o knockout da
proteína por eles estudada [74]. O nosso coeficiente de knockdown depois 48 horas
fica comparável com o que foi conseguido em outros sistemas eucariotos usando o
dominio DD [23].
Esse método com domínio desestabilizador (DD) tem sua base em formas
mutadas de FKBP (FK506/rapamycin-binding-protein) humano, que foi estabelecida
e usada para um grande efeito em diversos tipos de células para explorar a função
de proteínas [23].
Além disso, o sistema depende de um conjunto de proteases contido no
proteassoma que é responsável pela degradação de proteínas instáveis e é
encontrado em todos os eucariotos e alguns procariotos. Em células eucarióticas foi
provado que proteínas fusionadas ao DD são instáveis e sujeitas à degradação pelo
proteassoma. No entanto, na presença de um derivado de rapamicina (Shield-1), a
proteína fusionada ao DD não é degradada pelo proteassoma [23].
Essa metodologia de regulação induzida de proteínas foi testada em P.
falciparum com o DD fusionado a proteína fluorescente (GFP), e somente mostrou-
se funcional quanto em substituição de rapamicina pelo seu derivado Shield-1
(domínio ligante único), que é um ligante altamente eficiente que não apresenta
toxicidade aos parasitas e apesar do retardamento celular, não prejudica o seu
desenvolvimento [23,69]. Esse ligante de DD permite o correto dobramento da
proteína, tornando-a estável impedindo-a da degradação pelo proteassoma [23].
Entretanto o nível da regulação de uma proteína fusionada a ser obtido com a
retirada de Shield-1 é imprevisível e depende provavelmente da estabilidade
intrínseca de cada proteína individual.
Em nosso experimento, o repentino aumento na quantidade de transcritos surf
após knockdown de SURFIN 4 se mostrou interessante, pois é um fato ainda não
documentado na literatura para Plasmodium e é diferente por exemplo da enzima
diidrofolato redutase humana (hDHFR) expressa em P. falciparum que quando
submetida a altíssimas concentrações de WR99210, um inibidor competitivo da
proteína, foi constatado um aumento pelo fator 3 na quantidade do transcrito do
gene [75].
81
Para abordar esse acontecimento podemos articular a hipótese de que o
parasita pode ser capaz de controlar a transcrição dos genes a fim de suprir a
necessidade na expressão do antígeno SURFIN 4. Em nosso modelo, como o
antígeno sempre se mostrou instável (por apresentar o domínio DD24), parece ter
havido a tentativa de reposição do antígeno, aumentando abundância de transcrito
desse gene. Entretanto, é difícil de compreender de como isso seria possível
mecanisticamente. Uma possível hipótese é que o transcrito de uma proteína que
está em rápido decaimento é estabilizado e tem sua meia vida aumentada pela
ocupação ribossomal e constante reiniciação de tradução. Se isso de fato ocorre,
pode ser testado pela simples medição de meia vida do transcrito em cultivos
tratados com actinomicina D sob efeito de Shield-1 (degradação normal) ou sem
Shield 1 (degradação atenuada). Adicionalmente, isso não explica satisfatoriamente
como ocorreria o aumento na quantidade de transcrito de outros genes surf também
observado. Como eles também decrescem após recolocação de Shield-1, o efeito
pode ser em nível transcricional, isso pode significar que de fato loci surf são
ativados e silenciados em NF54 em função da presença ou ausência de proteínas
SURFIN. Este seria um fenômeno ainda não descrito desta forma em Plasmodium.
O exemplo mais relacionado talvez seja o efeito observado para hDHFR que em
Plasmodium sofre um feedback traducional no momento quando há ausência de
enzima hDHFR funcional [75].
Contudo, essas questões necessitam de melhores estudos. Uma sugestão
seria realizar knockout de SURFIN 4 para avaliar se a repentina transcrição dos
outros genes surf continuaria a se manifestar. Além do mais, seria interessante
analisar a localização de todos os antígenos SURFIN para predizer se os antígenos
que talvez apresentassem a mesma localização também desempenhariam função
redundante e se poderiam ser substituídos caso algum antígeno se torne não
funcional.
Entender se a transcrição dos genes surf pode ou não ser reguladas através
da modificação das histonas utilizando da marca de silenciamento H3k9me3 ou
ativadoras H3K4me3, H3K4me3, H3K9ac [50,76] seria outro ponto a abordar, assim
como, através da ativação e ou silenciamento dos promotores por algum fator
regulatório da transcrição como, por exemplo, ApiAP2, Sir2 e Orc1 [77–81]. A
verdade é que ao analisar esses parâmetros, a questão sobre como funcionaria o
82
feedback para regulação da expressão dos genes surf, conforme a necessidade do
parasita, ainda não seria solucionada.
Trabalhos anteriores [82] encontraram sequência de RNA antisense
correspondente ao gene surf 5 (PF3D7_0424400). Muitos trabalhos tentam elucidar
o papel dos RNA antisense na regulação da transcrição genética. De acordo com a
literatura [83,84], existem algumas possibilidades para os RNA antisense estarem
envolvidos na regulação epigenética onde uma cadeia antisense pode ser capaz de
manipular a localização, estabilidade e a sequência primária da cadeia sense.
Em um trabalho recente [85] RNA antisense (noncoding), transcrito a partir da
região intrônica de genes var foi encontrado associado a cromatina de genes var
ativos, e quando silenciaram esse mesmo RNA antisense e ativaram outro,
verificaram que o gene associado, também era silenciado e o gene correspondente
ao outro RNA antisense ativado iniciava a transcrição.
Outros mecanismos relacionados ao RNA antisense podem estar envolvidos.
Segundo Malecová et. al, (2010), e Keller et. al, (2013) [83,84] a hibridização dos
transcritos com RNA antisense pode modificar a conformação secundária (loop) do
RNA. Essa hibridização é capaz de afetar o direcionando e ou reconhecimento
impedindo a tradução, assim como, pode ser capaz de guiá-lo para outros
compartimentos no núcleo.
Além disso, o gene surf 4 que aparentemente apresenta transcrição de forma
constitutiva em formas assexuadas em 3D7 e NF54, está anotado no banco de
dados plasmodb.org como pseudogene, pois possui na sua fase de leitura códons
de parada. Outros autores demonstram que o códon de parada no gene surf 4 é
diferencialmente especifico para diversos isolados de P. falciparum e que em todas
os subclones de 3D7 testados a proteína foi analisada por WB e apesar na variação
do peso molecular da proteína, a mesma se encontrava presente em formas
truncadas [59]. O próprio gene foi reanotado algumas vezes no plasmoDB desde a
versão 5 do banco de dados. Após sequenciamento de parte de um fragmento do
gene, posição 5', utilizado para fazer o 3'-tagging, não encontramos nenhuma fase
de leitura sem códon de parada, indicando que possivelmente há um splicing do
gene não predito no plasmoDB..
Mesmo, mediante as contradições referente a sequencia do gene, os nossos
experimentos mostraram que obtivemos sucesso na modificação da proteína
SURFIN 4 inserindo o tag GFP, HA e DD24. Além disso, por WB conseguimos
83
analisar que a proteína está sendo traduzida de tal modo que apresenta o peso
molecular correspondente a uma proteína com o tamanho total esperado, como se
não houvesse interrupção por algum códon de parada. Se realmente houver esse
códon de parada na sequencia genética, algo está proporcionado a forma de leitura
correta para a expressão da proteína. Porém, não se sabe se este gene dispõe de
artifícios para editar a sequência do transcrito de tal modo a conduzir a expressão
correta da proteína [86].
Assim, levando em consideração trabalhos anteriores [59] e analisando os
nossos dados podemos admitir que ainda que existam paradoxos envolvendo
códons de parada, a proteína SURFIN 4 tem se mostrado preferencialmente
transcrita para o parasita, que a codifica mesmo de forma truncada [59], apesar do
antígeno SURFIN 4 não se revelar essencial em nosso parasita knockdown.
Todavia, pressupomos que este antígeno possivelmente pode ter sido substituído
por outro da mesma família quando constatamos o aumento na quantidade de
transcritos dos surf 3, 8 e 9. Diante deste fato podemos considerar que a família
SURFIN, em sua totalidade, pode ser essencial e desempenhar alguma função
importante no parasita.
6 CONCLUSÃO
85
� SURFIN 4 (PF3D7_0402200, plasmodb.org) parece desempenhar sua função
em estágio específico provavelmente no merozoito, já que o gene
correspondente inicia sua transcrição em esquizonte e a proteína fusionada à
GFP foi observada por microscopia de fluorescência em merozoito.
� Da mesma forma a transcrição para SURFIN 9 (PF3D7_1301800,
plasmodb.org) parece estar associada ao estágio anel.
� A diminuição de SURFIN 4 parece ativar a transcrição de outros alelos surf
silenciados.
� A falta de um antígeno talvez leve ao parasita a necessidade de reposição ou
substituição por outro antígeno, talvez para desempenhar função redundante.
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