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TÂNIA KAWASAKI DE ARAUJO
UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE OPENARRAY PARA
INVESTIGAÇÃO DE GENES ASSOCIADOS A FENDAS
LABIOPALATAIS EM AMOSTRA DA POPULAÇÃO
BRASILEIRA
CAMPINAS
2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
TÂNIA KAWASAKI DE ARAUJO
UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE OPENARRAY PARA
INVESTIGAÇÃO DE GENES ASSOCIADOS A FENDAS
LABIOPALATAIS EM AMOSTRA DA POPULAÇÃO
BRASILEIRA
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em
Ciências Médicas na área de concentração em Ciências
Biomédicas.
ORIENTADOR: Profa. Dra. Vera Lúcia Gil da Silva Lopes
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Rodrigo Secolin
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA
PELA ALUNA TÂNIA KAWASAKI DE ARAUJO, E ORIENTADA PELA
PROFA. DRA. VERA LÚCIA GIL DA SILVA LOPES.
CAMPINAS
2015
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Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Araujo, Tânia Kawasaki de, 1985-
Ar15u Utilização da técnica de Open Array para investigação de genes associados a
fendas labiopalatais em amostra da população brasileira / Tânia Kawasaki de
Araujo. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
Orientador: Vera Lúcia Gil da Silva Lopes.
Coorientador: Rodrigo Secolin.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de
Ciências Médicas.
1. Fenda labial. 2. Fissura palatina. 3. Estudos de casos e controles. 4. Gene
KIF7. 5. Gene TCEB3. I. Lopes, Vera Lúcia Gil da Silva,1967-. II. Secolin, Rodrigo.
III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV.
Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Association study between genes and cleft lip and palate in
Brazilian population using the openarray technique
Palavras-chave em inglês:
Cleft lip
Cleft palate
Case-control studies
Genes, KIF7
Genes, TCEB3
Área de concentração: Ciências Biomédicas
Titulação: Doutora em Ciências Médicas
Banca examinadora:
Vera Lúcia Gil da Silva Lopes [Orientador]
Lucimara Teixeira das Neves
Lucilene Arilho Ribeiro Bicudo
Monica Barbosa de Melo
Claudia Vianna Maurer Morelli
Data de defesa: 27-02-2015
Programa de Pós-Graduação: Ciências Médicas
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vi
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RESUMO
A fenda labiopalatal (FLP) isolada é o defeito craniofacial mais comum em humanos. O
objetivo deste estudo foi avaliar associações entre 39 genes e a etiologia de FLP isolada em
uma amostra da população brasileira. Este estudo de associação do tipo caso-controle foi
desenhado com um poder estatístico de 81,29% por meio de regressão logística. O grupo de
casos foi composto por 182 pacientes com FLP isolada registrados na Base Brasileira de
Dados Clínicos e Familiais de Fendas Orofaciais Típicas. O grupo controle foi formado por
355 indivíduos saudáveis, sem história de fendas orais em três gerações. Toda a amostra foi
genotipada por meio do sistema OpenArray®TaqManTM para 253 polimorfismos de
nucleotídeo único (SNPs) em 39 genes, incluindo dois genes que, recentemente, haviam sido
descritos por este grupo de pesquisa. A seleção de SNPs foi feita com o programa
SNPbrowser 4.0 (Applied Biosystems) para verificar o número e a localização dos SNPs
apropriados para explorar a associação de cada gene com FLP isolada. A análise de
associação foi realizada por meio de regressão logística e regressão stepwise. Os resultados
foram corrigidos para múltiplos testes (correção de Bonferroni). Vinte e quatro SNPs em 16
genes foram significativamente associados com a etiologia da FLP isolada, incluindo MSX1,
SPRY1, MSX2, PRSS35, TFAP2A, SHH, VAX1, TBX10, WNT11, PAX9, BMP4, JAG2,
AXIN2, DVL2, KIF7 e TCBE3. A análise de regressão stepwise revelou que 11 genes
contribuiram em 15,5% do fenótipo de FLP isolada nessa amostra. Este é o primeiro estudo
a associar os genes KIF7 e TCEB3 à FLP isolada.
Palavras-chave: Fenda labiopalatal isolada. Estudo de associação do tipo caso-controle.
KIF7. TCEB3.
viii
ix
ABSTRACT
Nonsyndromic cleft lip and palate (NSCLP) is the most common craniofacial birth defect.
The aim of this study was to evaluate associations between 39 genes and the etiology of
NSCLP in a Brazilian population. This case-control association study was designed with
81.29% statistical power according to logistic regression. The case group was composed of
182 patients with NSCLP enrolled in the Brazilian Database on Orofacial Clefts. The controls
included 355 healthy individuals with no history of oral clefting in the past three generations.
All samples were genotyped by TaqMan®OpenArrayTM system for 253 single nucleotide
polymorphisms (SNPs) in 39 genes, including two that had recently been associated with this
process. The SNPs selection was made by SNPbrowser 4.0 (Applied Biosystems) in order to
establish the best SNPs to explor the association between each gene and NSCLP. The
association analysis was performed using logistic regression and stepwise regression. The
results were corrected for multiple testing (Bonferroni correction). Twenty-four SNPs in 16
genes were significantly associated with the etiology of NSCLP, including MSX1, SPRY1,
MSX2, PRSS35, TFAP2A, SHH, VAX1, TBX10, WNT11, PAX9, BMP4, JAG2, AXIN2, DVL2,
KIF7 and TCBE3. Stepwise regression analysis revealed that 11 genes contributed to 15.5%
of the phenotype of NSCLP in the sample. This is the first study to associate KIF7 and TCEB3
with NSCLP.
Key words: Nonsyndromic cleft lip and cleft palate, case-control association study. KIF7.
TCEB3
x
xi
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA ............................................................................................................. xvii
AGRADECIMENTOS ................................................................................................... xix
LISTA DE ILUSTRAÇÕES .......................................................................................... xxi
LISTA DE TABELAS ................................................................................................... xxv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................... xxvii
APRESENTAÇÃO ......................................................................................................... xxxv
INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1
1.Classificações e epidemiologia .................................................................................... 1
2.Desenvolvimento craniofacial ..................................................................................... 5
2.1. Desenvolvimento do lábio e do palato .................................................................... 6
2.2.Base embriológica da fenda labial e palatal ............................................................. 9
3. Etiologia ................................................................................................................... 11
3.1.Fatores predominantemente ambientais ................................................................... 11
3.2.Fatores predominantemente genéticos...................................................................... 14
3.2.1. Genes candidatos e vias envolvidas na etiologia de FLP ................................... 15
3.2.1.1. Fatores de sinalização extracelular ................................................................... 15
3.2.1.1.1. Superfamília TGF-β ...................................................................................... 16
3.2.1.1.2. Fatores de crescimento de fibroblastos .......................................................... 18
xii
3.2.1.1.3. SHH .............................................................................................................. 20
3.2.1.1.4. WNT ............................................................................................................. 21
3.2.1.1.5. Fatores de transcrição. .................................................................................. 22
3.2.1.1.5.1.IRF6 .............................................................................................................. 23
3.2.1.1.5.2. FOXE1 ......................................................................................................... 25
3.2.1.1.5.3. Fatores de transcrição T-box ....................................................................... 25
3.2.1.1.5.4. MSX1 ........................................................................................................... 26
3.2.1.1.5.5. VAX1 ............................................................................................................ 27
3.2.1.1.5.6. JAG2 ............................................................................................................ 27
3.2.1.1.5.7. PAX9 ............................................................................................................ 28
3.2.1.2. Modificação de proteínas.............................................................................. 29
3.2.1.2.1. SUMO ............................................................................................................. 29
3.2.1.3. Outros genes e loci candidatos ......................................................................... 29
3.2.1.3.1. Região 19q13.1 ............................................................................................... 29
3.2.1.3.2. RARA .............................................................................................................. 31
3.2.1.3.3. ERBB2 ............................................................................................................ 31
3.2.1.3.4. AXIN2 ............................................................................................................. 32
4. Metodologias para o estudo de FLP isolada ............................................................ 33
4.1. Plataforma TaqMan®OpenArray™ Genotyping ...................................................... 38
OBJETIVO. .................................................................................................................... 45
1. Objetivo Geral ............................................................................................................ 45
2. Objetivo Específico .................................................................................................... 45
CASUÍSTICA e MÉTODOS ......................................................................................... 47
xiii
1. Desenho do estudo ..................................................................................................... 47
2. Estimativa da estratificação da amostra ..................................................................... 48
3. Genotipagem .............................................................................................................. 49
3.1.Etapas ................................................................................................................... 49
3.1.1.Seleção dos polimorfismos e genes ................................................................. 50
3.1.2.Desenho e síntese das lâminas ......................................................................... 52
3.1.3.Coleta e extração das amostras ........................................................................ 53
3.1.4.Verificação da concentração e pureza das amostras.........................................53
3.1.5.Diluição das amostras ...................................................................................... 54
3.1.6.Realização dos experimentos utilizando a plataforma TaqMan®OpenArray™
Genotyping ............................................................................................................... 54
3.1.6.1.Preparo de amostras ...................................................................................... 55
3.1.6.2.Distribuição das amostras nas lâminas de OpenArray® ............................... 56
3.1.6.3.Inserção da lâmina de OpenArray® na case ................................................. 57
3.1.6.4.Selagem das cases ........................................................................................ 57
3.1.6.5.Termociclagem ............................................................................................. 58
3.1.6.6.Leitura das lâminas de OpenArray® ............................................................. 59
3.1.7.Análise dos dados ............................................................................................ 60
4. Análise estatística ............................................................................................... 61
5. Análise de predição de mutações in silico .......................................................... 62
RESULTADOS .............................................................................................................. 63
1. Genotipagem ....................................................................................................... 63
2. Estimativa da estratificação da amostra.............................................................. 64
xiv
3. Resultados de associação genética ..................................................................... 66
4. Análise de predição de mutações in silico .......................................................... 69
DISCUSSÃO .................................................................................................................. 71
CONCLUSÃO ................................................................................................................ 83
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. .85
APÊNDICES .................................................................................................................. 121
APÊNDICE I. Genes e SNPs selecionados para serem genotipados na amostra ........... 121
APÊNDICE II. Estimativa dos valores de desequilíbrio de ligação entre os SNPs em
termos de r2 para os genes (I-BCL3, II-FGF22, III-HOXA2, IV-MSX1, V-APOC2, VI-
BMP4, VII-SPRY1, VIII-VAX1, IX-MSX2, X-WNT8A, XI-KIF7, XII-SPRY2, XIII-
TCEB3, XIV-JAG2, XV-SUMO1, XVI-TBX10, XVII-SOX7, XVIII-TFAP2A, XIX-
TGFB1, XX-TBX1, XXI-ERBB2, XXII-IRF6, XXIII-LHX8, XXIV-PTCH1, XXV-
WNT5A, XXVI-RARA, XXVII-WNT9B, XXVIII-PRSS35, XXIX-AXIN2, XXX-
CLPTM1, XXXI- GREM1, XXXII-PAX9, XXXIII-TGFB3, XXXIV-WNT3A,
XXXIV-WNT3A, XXXVI-DVL2, XXXVII-TBX22 ....................................................... 127
ANEXOS ........................................................................................................................ 141
ANEXO I. Nomenclatura e as definições clínicas adotadas pela International
Clearinghouse for Birth Defects and Surveillance and Research para a descrição e
classificação das fendas orofaciais (ICBDSR 2007) ...................................................... 141
ANEXO II. Parecer do Comitê de Ética ......................................................................... 143
ANEXO III. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido .......................................... 146
ANEXO IV. Protocolo de extração de DNA por Kit (Quiagen) .................................... 151
ANEXO V. Protocolo de extração de DNA pelo método Fenol-Clorofórmio ............... 153
xv
ANEXO VI. Protocolo de purificação do kit MilliUni ................................................... 155
ANEXO VII. Protocolo para realização do ensaio de Open Array .................................. 156
xvi
xvii
Dedico este trabalho aos meus pais Lázaro e Hisako,
as minhas irmãs Taciana e Priscila por todo o amor
e apoio em todos os momentos da minha vida.
xviii
xix
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Lázaro e Hisako e as minhas irmãs Taciana e Priscila, por estarem sempre
ao meu lado.
Ao meu cunhado, Fernando, por estar ao meu lado desde a graduação me apoiando.
À minha orientadora, Profa. Dra. Vera Lúcia Gil da Silva Lopes, por todo aprendizado e
dedicação durante estes seis anos e pela confiança que teve em mim para a realização deste
trabalho.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Rodrigo Secolin, por todo aprendizado e dedicação durante
estes quatro anos.
Aos professores do Dept. de Genética Médica, por todo o conhecimento compartilhado.
Aos funcionários do Laboratório de Citogenética Humana e do Laboratório de Genética
Molecular, Nilma, Marilza, Luciana e Madá, por todos os momentos que me auxiliaram
durante estes anos.
A todos os meus amigos por estarem presentes no meu caminho, me apoiando em todos os
momentos.
Em especial, nessa fase da minha vida, agradeço a: Renata, Miriam, Ilária, Ana Paula,
Luciana, Stephanie, Alexandre, Társis, Fernando, Matheus, Isabella, Roby, Simone, Fábio,
Taty, Karina, Marcella, Daniel, Ana Laura, Elaine, Joana, Bruna, Roberta, Fernanda e
Alexandra. Obrigada por me ajudarem na realização deste trabalho e, principalmente, pelo
apoio e pelos momentos que compartilhamos.
xx
Enfim, a todos aqueles que me ajudaram sem os quais não conseguiria obter este resultado.
À Banca Examinadora, pela contribuição na elaboração da minha tese.
Às famílias e voluntários participantes da pesquisa, pela compreensão e incentivo.
xxi
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Diagramas esquemáticos do desenvolvimento do lábio e palato em humanos. (A)
Desenvolvimento da proeminência frontonasal, do par de processos maxilares, do par de
processos mandibulares que rodeiam a cavidade oral na quarta semana do desenvolvimento
embrionário. (B) Na quinta semana, os orifícios nasais se formaram, o que leva à formação
do par de processos nasais laterais e medial. (C) Os processos nasais mediais se fundiram
com os processos maxilares para formar o lábio superior e palato primário até o final da sexta
semana. Os processos nasais laterais formam a asa do nariz. Da mesma forma, os processos
mandibulares se fundem para formar o maxilar inferior. (D) Durante a sexta semana de
embriogênese, o palato secundário se desenvolve como consequência bilateral dos processos
maxilares, que crescem verticalmente para baixo do lado da língua. (E) Posteriormente, os
processos palatais elevam a uma posição horizontal acima da língua, entram em contato um
com o outro e começam a se fundir. (F) Fusão dos processos palatais, em última análise
divide o espaço oronasal em duas cavidades, oral e nasal (7).................................................8
Figura 2. Ilustração da lâmina de OpenArray™, contendo os 48 subarrays e, em destaque,
a esquematização de um subarray com 64 poços, cada um apresentando o volume de 33nL
(Modificado de Applied BioSystems, 213)............................................................................39
Figura 3. Ilustração de uma sonda TaqMan MGB. F - Fluorofóro e Q - Quencher não
fluorescente (supressor).........................................................................................................40
Figura 4. Representação esquemática de resultados de hibridização e não hibridização entre
as sequências de sonda e a sequência alvo em ensaios de OpenArray® (Adaptado de
AppliedBioSystems,213)........................................................................................................41
xxii
Figura 5. Plataforma TaqMan® OpenArray™ (Applied BioSystems)………………….....42
Figura 6. Ilustração da placa 384 poços de amostras e esquema de sua distribuição na lâmina
de OpenArray®......................................................................................................................55
Figura 7. Foto do interior do equipamento OpenArray®AccuFill™System............................56
Figura 8. Foto das cases preparadas (a) e depois com as lâminas já inseridas na case (b)..57
Figura 9. Foto da selagem das cases na estação de selagem................................................58
Figura 10. (a) Foto do termociclador Dual Flat Block GeneAmp®PCR System 9700 (Applied
BioSystems); (b) Interior do termociclador com as lâminas...................................................59
Figura 11. a) Foto do equipemento OpenArray™NT Cycler acoplado a um computador; b)
Foto do interior do OpenArray™NT Cycler com as lâminas já posicionadas......................60
Figura 12. Visão geral do programa TaqMan®Genotyper..................................................61
Figura 13. A) Resultados da análise da frequência do menor alelo (MAF). B) Resultados da
análise de equilíbrio de Hardy-Weinberg.....................................……………………..…....63
Figura 14. Gráficos mostrando a ancestralidade de cada indivíduo no grupo de casos com
FLP (a) e no grupo controle (b).............................................................................................65
Figura 15. Resultados da análise de regressão logística, onde cada ponto representa um SNP.
Os SNPs acima da linha cheia (-ln(p-value) > 3,00), indicam os SNPs com associação
genética estatisticamente significativa para o fenótipo. Gráfico A - baseado na análise por
Bonferroni, e gráfico B - baseado na análise por FDR............................................................66
Figura 16. Resultado da análise de regressão stepwise..........................................................68
Figura 17. Esquema de articulação entre vários genes envolvidos na etiologia de FLP........78
xxiii
xxiv
xxv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Formatos oferecidos para a elaboração das lâminas de genotipagem.....................43
Tabela 2. Lista de genes selecionados e o número de SNPs genotipados por gene................51
Tabela 3. Resultados da análise de regressão logística e característica dos SNPs associados
com FLP isolada nesse estudo................................................................................................67
Tabela 4. Resultados dos algoritmos PolyPhen-2 e SIFT para três SNPs associados à FLP
isolada na presente amostra...................................................................................................69
xxvi
xxvii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACM: Anomalias congênitas múltiplas
ACVR1: activin A receptor
ACVR2A: activin A receptor, type IIA
ACVR2B - activin A receptor, type IIB
ADH1C: alcohol dehydrogenase 1C (class I) gamma polypeptide
AXIN: axis inhibition protein
AXIN2: axis inhibition protein 2
BBDCF: Base Brasileira de Dados Clínicos e Familiais de Fendas Orofaciais Típicas
BCL3: B-cell CLL/lymphoma 3
BMP: Bone morphogenetic protein
BMP2: bone morphogenetic protein 2
BMP3: bone morphogenetic protein 3
BMP4: bone morphogenetic protein 4
BMP5: bone morphogenetic protein 5
BMP6: bone morphogenetic protein 6
BMP7: bone morphogenetic protein 7
BMP8: bone morphogenetic protein 8
BMPR1A: bone morphogenetic protein receptor, type IA
BMPR1B: bone morphogenetic protein receptor, type IB
BMPR2: bone morphogenetic protein receptor, type II,
CEP: Comitê de Ética em Pesquisa
xxviii
C1: Concentração inicial
C2: Concentração final
CCD: Charge-coupled Device
CLPTM1: cleft lip and palate associated transmembrane protein 1
CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CNV: copy number variation
COGENE: Craniofacial and Oral Gene Expression Network Database
DLX: Drosophila distal-less homeobox
Dvl1: dishevelled, dsh homolog 1 (Drosophila)
DVL2: dishevelled segment polarity protein 2
Dvl2: dishevelled 2, dsh homolog (Drosophila)
Dvl3: dishevelled 3, dsh homolog (Drosophila)
DNA: ácido desoxirribonucleico
DVL: Disheveled
DZ: dizigóticos
ERBB2: receptor tyrosine-protein kinase erbB-2, precursor
EDTA: etilenediaminotetracetato dissódico 2H2O
EYA1: EYA transcriptional coactivator and phosphatase 1
FDR: False Discovery Rate
FGF: fibroblast growth fator
FGF8: fibroblast growth factor 8
FGF22: fibroblast growth factor 22
FGF10: fibroblast growth factor 10
xxix
FGFR1: fibroblast growth factor receptor 1
FGFR2: fibroblast growth factor receptor 2
FGFR3: fibroblast growth factor receptor 3
FL: Fendas labiais
FLP: Fenda labiopalatal
FOA: Fendas orofaciais atípicas
FOT: Fendas orofaciais típicas
FOXE1: forkhead box E1
FP: Fendas palatais
Fst: Fixation index
GDF5: growth differentiation factor 5
GDF6: growth differentiation factor 6
GDF7: growth differentiation factor 7
GDF10: growth differentiation factor 10
GLI2: GLI family zinc finger 2
GLI3: GLI family zinc finger 3
GREM1 gremlin 1, DAN family BMP antagonist
GSK3β: glycogen synthase kinase 3 beta
GSTT1: glutathione S-transferase theta 1
GWAS: Genome Wide Association Studies
HOXA-1: homeobox A1
HOXA-2: homeobox A2
HOXB-1: homeobox B1
xxx
HOXB-3: homeobox B3
HOXb-4: homeobox B4
IPDTOC: International Perinatal Database of Typical Oral Clefts
INDELS: Small insertions and deletions
IRF: interferon regulatory fator
IRF1: interferon regulatory fator 1
IRF2: interferon regulatory fator 2
IRF3: interferon regulatory fator 3
IRF4: interferon regulatory fator 4
IRF5: interferon regulatory fator 5
IRF6: interferon regulatory fator 6
IRF7: interferon regulatory fator 7
IRF8: interferon regulatory fator 8
IRF9 interferon regulatory
JAG2: jagged 2
KAL2: Kallmann Syndrome 2
KIF7: kinesin family member 7
Lefty: left-right determination factor
LHX: LIM homeobox
LHX8: LIM homeobox 8
LRP6: low density lipoprotein receptor-related protein 6
MAF: minor allele frequency
MGB: minor groove binder
xxxi
MSX: muscle segment homeobox
MSX1: msh homeobox 1
MSX2: msh homeobox 2
MTHFR: methylenetetrahydrofolate reductase (NAD(P)H)
MZ: monozigóticos
NCBI: National Center for Biotechnology Information
Nodal: nodal growth differentiation fator
NSCLP: Nonsyndromic cleft lip and palate
OR: odss ratio
OTX: homeobox orthodentical
PAX: Paired box
PAX9: paired box gene 9
PMx: processos maxilares
PNL: Processos nasais laterais
PNM: Processos nasais mediais
PP: processos palatais
PPS: síndrome pterígio poplíteo
PCFB: Projeto Crânio-face Brasil
PCR: reação em cadeia da polimerase
Pdf: portable document format
PTCH1: patched 1
PTCH2: patched 2
PVRL1: poliovirus receptor-related 1
xxxii
PVRL2: poliovirus receptor-related 2
QNQ: um quencher não fluorescente
RARA: retinoic acid receptor, alpha
ROI: regiões óticas de interesse
SATB2: SATB homeobox 2
SHH: sonic hedgehog
SMO: smoothened, frizzled class receptor
SNP: Single-Nucleotide Polymorphism
SOX7: SRY (sex determining region Y)-box 7
SUMO-1: small ubiquitin-like modifier 1
Spf: SNP Plate File
Tm: temperatura de fusão
TBX1: T-box 1
TBX10: T-box 10
TBX22: T-box 22
TCEB3: transcription elongation factor B3
TCLE: termo de consentimento livre e esclarecido
TFAP2A: transcription factor AP-2 alpha (activating enhancer binding protein 2 alpha)
TGFβ: transforming growth fator beta
TGF-β3: transforming growth factor, beta 3
TGFBR1 - transforming growth factor, beta receptor 1
TGFβR2 - transforming growth factor, beta receptor II
TP63: tumor protein p63
xxxiii
TRPS1: trichorhinophalangeal syndrome I
txt: text file
UTR: untranslated region
V1: volume inicial
V2: volume final
VWS: síndrome de Van der Woude
WHS: síndrome de Wolf-Hirschhorn
WNT: wingless-type MMTV integration site Family
WNT3: wingless-type MMTV integration site family, member 3
WNT3A: wingless-type MMTV integration site family, member 3A
WNT5A: wingless-type MMTV integration site family, member 5A
WNT7A: wingless-type MMTV integration site family, member 7A
WNT9A: wingless-type MMTV integration site family, member 9A
WNT11: wingless-type MMTV integration site family, member 11
UV: ultravioleta
xxxiv
xxxv
APRESENTAÇÃO
As fendas orofaciais típicas compõem um grupo de defeitos congênitos comuns e
multifatoriais. Entretanto, como sua etiologia envolve diversos fatores os mecanismos gene-
gene, gene-ambiente permanecem desconhecidos. Por isso, a Organização Mundial da Saúde
(OMS) lançou o projeto Global Strategies to Reduce the Health-Care Burden of Craniofacial
Anomalies, que tinha como objetivos determinar prioridades, consensos globais e protocolos
comuns de pesquisa.
O Projeto Crânio-face Brasil (PCFB) foi iniciado em 2003 no Departamento de
Genética Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas
(Unicamp). Trata-se de uma proposta multicêntrica e multiprofissional, cujo objetivo
principal é trazer subsídios científicos para a melhoria na atenção à saúde de pessoas com
anomalias craniofaciais.
Minha participação neste projeto começou em 2009, com meu trabalho de mestrado,
intitulado “Investigação dos genes BMP4 e TFAP2A em pacientes com fendas orafaciais
típicas”. Fui a primeira aluna a trabalhar com fendas labiopalatais isoladas utilizando casos
coletados da Base Brasileira de Fendas Orais do PCFB, que foi implantada em 2008. Isto foi
muito desafiador não só pelo aprendizado das técnicas envolvidas, mas porque, nesta época,
ainda estava em desenvolvimento toda a logística de registro de casos e envio de amostras
para investigação nos Laboratórios de Citogenética e Genética Molecular da Faculdade de
Ciências Médicas da Unicamp.
Defendi minha dissertação em 2011 e, ao discutir as possibilidades para realização
de meu projeto de Doutorado, sabia que gostaria de continuar na área de genética craniofacial.
xxxvi
Nesta época, a técnica de Openarray estava no início e pude implantá-la para este grupo de
pesquisa. Além das dificuldades iniciais de uma nova técnica, a definição prévia do tamanho
amostral se revelou um aspecto mais complexo ainda: definimos pela adoção de diretrizes
para classificação de defeitos congênitos isolados que exigiam investigação com exames
complementares (ultrassonografia, ecocardiografia e tomografia em algumas situações).
Com muitos bebês registrados e em seguimento pelo PCFB, não era possível a conclusão
imediata do diagnóstico, o que levou a muita ansiedade até completarmos a amostra.
Participei ativamente de todo o processo, desde o contato com os médicos, registro
laboratorial, formação do biorrepositório de amostras de pacientes e de controles, atividades
de bancada e discussões científicas.
Todo este período junto a este grupo de pesquisa foi realmente formador de meu
aprendizado científico e estou muito satisfeita por ter participado e contribuído para o
crescimento do PCFB.
1
INTRODUÇÃO
1. Classificações e epidemiologia
As fendas orofaciais compõem um grupo heterogêneo de defeitos congênitos e
podem ser divididas em dois grandes grupos: as fendas orofaciais típicas (FOT) e as fendas
orofaciais atípicas (FOA). As FOA são raras e compreendem as fendas faciais transversais,
as fendas faciais oblíquas e as fendas de lábio inferior, entre outras classificadas por Tessier
em 1976 (1,2).
Dentre as anomalias craniofaciais mais frequentes e estudadas atualmente estão
as FOT. As FOT, também chamadas de fendas orais, são comuns e, de modo geral, são
classificadas em três categorias: aquelas que afetam apenas o lábio (fendas labiais, FL),
aquelas que afetam o lábio e o palato (fendas labiopalatais, FLPs) e aquelas que afetam o
palato isoladamente (fendas palatais, FP) (3).
De forma geral, as FL e FLP têm sido consideradas variantes do mesmo defeito,
uma vez que compartilham alterações no palato primário, diferindo apenas na gravidade (3).
Entretanto, dados epidemiológicos e biológicos sugerem que as FL e FLP podem apresentar
etiologias genéticas distintas (4,5,6), mesmo que vias comuns sejam a base da etiologia de
cada grupo, já que ocasionalmente, tanto casos de FL quanto de FLP compartilham a mesma
ascendência. Dados recentes sugerem que estas duas categorias devem, sempre que possível,
ser analisadas separadamente (5).
A prevalência das FOT é variável segundo a composição étnica e a origem
geográfica da população afetando, mais comumente, indivíduos de descendência asiática ou
2
ameríndia (1/500 nascimentos) (7). As populações caucasianas possuem taxa de prevalência
intermediária, aproximadamente 1/1.000 nascimentos (8). Estas observações sugerem que a
contribuição relativa da susceptibilidade genética individual pode variar entre diferentes
populações. As possíveis explicações para as diferenças na prevalência entre diferentes etnias
e status socioeconômico incluem fatores ambientais como uso de vitaminas, nutrição, acesso
a cuidados médicos e estilo de vida.
A maioria das FOT ocorre como um defeito isolado, embora possa ser associada
a outras anomalias ou síndromes (9). A prevalência mundial de FLP isolada é de 6,64 por
10.000 nascidos vivos (10) e a brasileira é de cerca de 19,33 por 10.000 nascidos vivos
(Organização Mundial de Saúde (OMS) "Programas e projetos’
http://www.who.int/genomics/anomalies/americas / en / index.html.).
As FOT constituem um grupo de defeitos do desenvolvimento embrionário
decorrente de alterações da diferenciação celular e/ou da fusão dos processos faciais e/ou
palatinos (11). Estas malformações são caracterizadas por uma separação incompleta entre
as fossas nasais e orais, ou seja, são derivadas de uma embriopatia com a falha da: a) fusão
das proeminências nasais mediais e maxilares (FL; MIM 119530) ou b) fusão dos processos
palatais (FP; MIM 119540), ou c) ambas as falhas (FLP; MIM 119530) (11).
Esse grupo de defeitos pode ocorrer como uma anomalia isolada, como parte de
uma seqüência, ou dentro de um quadro de anomalias congênitas múltiplas (ACM). Nos
casos de ACM, a fenda oral pode ser encontrada em síndromes monogênicas, associações,
ou em quadros de ACM sem etiologia conhecida. Apesar dessa classificação feita por alguns
autores, a grande maioria das publicações científicas, inclusive de estudos genéticos, divide
as FOT apenas em sindrômicas e não-sindrômicas (9). Entretanto, mesmo nesses estudos não
3
há consenso sobre a investigação ou menção a exame físico dismorfológico, o que pode gerar
dificuldade na correta interpretação dos resultados.
A precisa caracterização do fenótipo é crucial para a compreensão tanto da
epidemiologia e da etiologia de qualquer malformação congênita, porque o poder para
detectar efeitos é enfraquecido quando grupos heterogêneos são tratados como uma única
entidade.
Embora várias síndromes mendelianas raras incluam fendas orais entre seus
sinais clínicos, a maioria dos casos de FOT são não sindrômicos e não mendelianos (12, 13).
Aproximadamente 70% de todos os casos de FLP e 50% dos casos de FP são considerados
não-sindrômicos ou isolados (7,12). Os demais casos são compostos por diversas síndromes
de malformações, incluindo mais de 600 síndromes mendelianas
(www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/) (7).
Nos últimos anos, muito esforço tem sido realizado para se delinear os distúrbios
mendelianos e identificar os genes envolvidos em tais transtornos. No entanto, apenas uma
pequena parcela de indivíduos com fenda oral tem uma etiologia conhecida. As FOT
sindrômicas apresentam, muitas vezes, padrões de herança mendeliana e, portanto,
favoráveis à identificação das causas genéticas (14).
A grande parte dos casos de FLP ocorre de forma esporádica, mas em algumas
famílias há recorrência e até observa-se um padrão de herança mendeliana (12). Dessa
maneira, as FLPs podem ser classificadas como esporádica ou familial.
Apesar da patogênese da FLP ser complexa e multifatorial (12,13,15), a
importância dos fatores genéticos tem sido cada vez mais reconhecida, o que pode ser
comprovado pelos resultados de alta agregação familiar, por taxas de riscos de recorrência e
4
pela elevação nas taxas de concordância de gêmeos monozigóticos (MZ) quando comparadas
aos dizigóticos (DZ) (16).
As fendas orais mostram forte agregação familiar e têm uma elevada taxa de
recorrência familiar em comparação com outros defeitos congênitos. O risco de recorrência
entre parentes de primeiro grau é aproximadamente 32 vezes maior do que o risco da
população geral para fenda de lábio com ou sem fenda de palato, e cerca de 56 vezes maior
para FP (17). Em estudos envolvendo gêmeos, a taxa de concordância é de 40% a 60% em
gêmeos MZ e é significativamente maior do que a observada em gêmeos DZ, que é apenas
de 3% a 5%. A alta taxa de concordância em gêmeos MZ fornece provas substanciais de um
forte componente genético (18,19).
A ocorrência de FLP e FP também se altera dependendo do sexo e lateralidade
da fenda. Os meninos são mais afetados por FLP do que as meninas na razão de 2:1. Por
outro lado, a proporção de FP é inversa, na razão de 1:2 meninos para meninas. Além disso,
as FL podem ser divididas em bilaterias ou unilaterais (20). Aproximadamente 75% das FL
são unilaterais. Entre as fendas unilaterais, aquelas que afetam o lado esquerdo são duas vezes
mais comuns que as fendas do lado direito (21).
Imediatamente após o nascimento, os indivíduos com FLP têm deformações
faciais, problemas na alimentação, e infecções recorrentes do ouvido médio. Desse modo, o
tratamento requer intervenções multidisciplinares: cirúrgicas, ortodônticas, fonoaudiólogicas
e psicológicas. Na idade de aquisição da fala, a terapia da fala é muitas vezes necessária para
corrigir problemas resultantes de defeitos musculares da fenda oral. À medida que o
indivíduo continua a crescer, defeitos no desenvolvimento dos dentes e má oclusão podem
exigir tratamento dentário especializado, por vezes, cirúrgico. A longa série de tratamentos,
5
desde o nascimento até a idade adulta é um grande ônus para o paciente, a família e a
sociedade (19). Foram feitos vários esforços para compreender a etiologia da FLP, de modo
a prever a sua ocorrência e para impedi-la. Nos últimos anos, avanços na genética e biologia
molecular começaram a revelar a base do desenvolvimento craniofacial, e vários genes
associados com FLP foram identificados.
Diante da complexidade clínica e etiológica das FLPs, a avaliação genético-
clínica dos pacientes é fundamental para obtenção de diagnósticos consistentes e acurados.
No plano individual, o diagnóstico é a base para o planejamento do tratamento, a estimativa
do prognóstico, a adoção de condutas antecipatórias e o aconselhamento genético. Em
perspectiva populacional, permite o reconhecimento e a descrição do perfil de morbidade e
de fatores de risco específicos de determinada população e que podem ser alvos de ações
preventivas (22).
2. Desenvolvimento craniofacial
Para entender o desenvolvimento patológico, é fundamental entender os
mecanismos do desenvolvimento normal. As fendas orofaciais surgem do fracasso dos
processos de desenvolvimento craniofacial normal. O adequado desenvolvimento da face
requer a coordenação de uma série complexa de eventos e inclui o crescimento celular,
migração, diferenciação e apoptose.
O desenvolvimento da face começa na quarta semana de desenvolvimento
embrionário, quando as células da crista neural migram para formar os primórdios faciais: o
processo frontonasal, o par de processos mandibulares e o par de processos maxilares (PMx).
6
Após a formação das proeminências faciais, os placoides nasais invaginam para formar a
processos nasais laterais (PNL) e mediais (PNM) (Figura 1) (23).
Vários eventos indutivos entre o prosencéfalo, mesencéfalo, rombencéfalo e
tecido da crista neural, que migram para o complexo craniofacial e arco faríngeo, ajudam a
formar as cinco proeminências faciais (24, 25). Os PMx são derivados a partir do primeiro
arco faríngeo e contribuem para os lados da face, lábios e do palato secundário (26). É a
diferenciação, o crescimento e a eventual fusão desses processos que resultam na formação
da face definitiva.
As células da crista neural desempenham um papel integral na morfogênese
facial. Pouco antes da fusão das pregas neurais para formar o tubo neural, células
neuroectodermicas adjacentes à placa neural migram para a região do nervo facial, onde
formam o esqueleto e tecido conjuntivo da face: ossos, cartilagens e todos os tecidos, exceto
o esmalte dental (27, 28). Assim o mesênquima facial é de origem da crista neural. Os
endotélios vasculares e musculares, no entanto, são de origem mesodérmica.
2.1.Desenvolvimento do lábio e do palato
Parte do desenvolvimento do lábio superior e nariz iniciam-se no final da 4ª
semana de gestação humana (11). Na 5ª semana de gestação, os PNM e PNL de cada uma
das placas nasais, áreas cujo mesênquima é derivado do prosencéfalo e de células da crista
neural, crescem para se tornar proeminências projetando-se frontalmente, rodeando um par
de sulcos nasais, que irão se desenvolver em narinas. Ao mesmo tempo, a região dorsal do
primeiro arco branquial do crânio expande frontalmente abaixo da região de desenvolvimento
7
do olho para formar a PMx, enquanto a região ventral e mais caudal do primeiro arco torna-
se o maxilar inferior (11, 29, 30).
Durante a sexta e sétima semanas de gestação, as PNM e PNL sofrem um
crescimento direcional para convergirem e se fundirem com as PMx. Na superfície externa
as PNM e PMx parecem se encontrar, em primeiro lugar, na parte frontal dos sulcos nasais e
é seguida pela reunião das PNM e PNL na área interna do sulco nasal formando o lábio (30).
O palato é formado pela união de 2 elementos: o palato primário e o palato
secundário. O palato primário é definido como a parte do primórdio facial que, inicialmente,
separa a cavidade oral e nasal e inclui partes do PNM, do PNL, do processo frontonasal e do
PMx que contribuem para a separação das cavidades. O desenvolvimento normal do palato
primário envolve diversos eventos moleculares e celulares que estão intensamente
cronometrados. O palato primário inicialmente se forma em torno dos placóide olfativo em
desenvolvimento com a rápida proliferação do epitélio lateral e mesênquima subjacente. (31)
O palato secundário é definido como a parte do primórdio facial posterior ao
palato primário e inclui os dois processos palatais (PP) laterais que se projetam medialmente
para os PMx. Os primórdios do palato secundário formam o palato duro (osso), o palato mole
(o velum) e o osso alveolar e basal da maxila. Tal como acontece no desenvolvimento do
palato primário, o encerramento e a fusão do palato secundário exigem uma interação
complexa dos movimentos dos processos palatais, sendo a coordenação do crescimento entre
os processos e a apoptose ao longo da margem medial do epitélio dos processos palatais (31)
eventos criticamente cronometrados.
O palato secundário começa a se desenvolver na sétima semana de embriogênese
quando os PP surgem como conseqüências do PMx. Os PP desenvolvem verticalmente,
8
elevam a uma posição horizontal, fazem contato e se fundem (32). Uma vez que os PP são
elevados e aproximados, eles se aderem na superfície de contato, sendo a fusão na linha ao
longo das bordas mediais e a apoptose do epitélio mecanismos essenciais para o
desenvolvimento normal do palato secundário. Fusão bem sucedida do palato secundário
resulta em separação completa das cavidades nasal e oral (Figura 1).
Figura 1: Diagramas esquemáticos do desenvolvimento do lábio e palato em humanos. (A)
Desenvolvimento da proeminência frontonasal, do par de processos maxilares, do par de
processos mandibulares que rodeiam a cavidade oral na quarta semana do desenvolvimento
embrionário. (B) Na quinta semana, os orifícios nasais se formam, o que leva à formação do
9
par de processos nasal lateral e medial. (C) Os processos nasais mediais se fundiram com os
processos maxilares para formar o lábio superior e palato primário até o final da sexta
semana. Os processos nasais laterais formam a asa do nariz. Da mesma forma, os processos
mandibulares se fundem para formar o maxilar inferior. (D) Durante a sexta semana de
embriogênese, o palato secundário se desenvolve como consequência bilateral dos processos
maxilares, que crescem verticalmente para baixo do lado da língua. (E) Posteriormente, os
processos palatais elevam a uma posição horizontal acima da língua, entram em contato um
com o outro e começam a se fundir. (F) Fusão dos processos palatais, em última análise
divide o espaço oronasal em duas cavidades, oral e nasal (7).
2.2.Base embriológica da fenda labial e palatal
O momento exato do posicionamento das proeminências faciais durante o
desenvolvimento embrionário é crucial. Qualquer alteração poderá resultar na formação de
FLP. Fatores genéticos e ambientais que inibem o fluxo de células da crista neural ou
diminuem o seu número podem afetar as massas celulares, tornando inadequado ou
impossível o contato entre as proeminências faciais. O epitélio que cobre o mesênquima pode
não sofrer morte celular programada, impedindo a fusão dos placóides. Portanto, qualquer
mudança na posição do placóide nasal ou crescimento direcional anormal das proeminências
faciais pode resultar em fenda orofacial.
Assim, a FL resulta da falha da fusão da PNM e da PNL com a PMX, resultando
em uma lacuna, lateral a linha mediana, estendendo-se até o lábio superior e maxilar na narina
(20, 30, 31).
10
As FP podem surgir devido a defeitos primários na palatogênese ou podem ser
secundárias aos distúrbios em outras estruturas craniofaciais. Os defeitos primários incluem
o crescimento deficiente dos PP, falha da elevação dos PP, falha da migração e fusão dos PP
e ruptura de pós-fusão nos PP (33, 34).
Os defeitos secundários podem ser distúrbios de crescimento ou da morfologia
de estruturas craniofaciais, incluindo a base craniana, e (ou) obstrução mecânica da elevação
dos PP pelo tamanho ou posicionamento anormal da língua (34, 35). Em alguns casos a
micrognatia é um fator que pode inibir a elevação dos PP, como pode ocorrer, por exemplo,
na síndrome de Pierre Robin.
Além disso, a FP resulta em uma comunicação com a cavidade nasal e é um
defeito de linha média relevante. Algumas estruturas adicionais que podem ser afetadas por
FP são: a dentição, o osso alveolar e basal do palato primário e a musculatura labial. Os
indivíduos com fenda de palato primário podem apresentar deslocamento dental, agenesia
dentária ou hipoplasia do pré-maxilar (20, 29, 31).
O movimento e o destino dos tecidos da crista neural para o primórdio facial são
controlados em parte por várias famílias de genes, compreendendo genes regulatórios
homeobox (HOXA-1- homeobox A1, HOXA-2- homeobox A2, HOXB-1- homeobox B1,
HOXB-3- homeobox B3, e HOXB-4- homeobox B4), genes OTX (homeobox orthodentical),
genes DLX (Drosophila distal-less homeobox), genes MSX (muscle segment homeobox) e
genes LHX (LIM homeobox) (31).
A rápida elevação dos PP resulta de uma série de mecanismos que podem estar
relacionados com a expressão dos genes FGF8 (fibroblast growth factor 8) e SHH (sonic
hedgehog) ao longo da borda medial do PMx (31). É também observada expressão
11
aumentada de moléculas de adesão celular como TGF-β3 (transforming growth factor, beta
3) e caderina-N ao longo da margem medial dos PP, sendo que os mesmos podem causar
apoptose e diferenciação epitelial (31).
3. Etiologia
A etiologia das FLPs isoladas é multifatorial, sendo determinada por fatores
ambientais e genéticos (12, 36, 37, 38), porém os exatos fatores de risco associados com FLP
permanecem desconhecidos (7, 39).
As alterações em mais de um gene têm sido apontadas como necessárias para a
ocorrência de fendas orais, já que a formação dos lábios e do palato envolve vários processos
celulares (proliferação, diferenciação e adesão celular; e apoptose) com risco de falha.
Consequentemente, várias interações podem ocorrer entre genes que regulam esses processos
(12, 14, 38).
3.1.Fatores predominantemente ambientais
Dados epidemiológicos respaldam um papel para os fatores de risco ambientais
no desenvolvimento de fendas orais. A contribuição dos fatores ambientais na etiologia das
FOT é sugerida por diversos estudos. Alguns teratógenos humanos estão associados à FLP,
entre eles: álcool etílico e tabaco (12, 15, 34, 40).
O uso de álcool materno, além de causar a síndrome do alcoolismo fetal, também
aumenta o risco de FLP. Munger et al. (41) mostrou que o consumo materno aumentou o
12
risco de FLP de 1,5 a 4,7 vezes de uma forma dose-dependente. Os resultados foram apoiados
por Shaw e Lammer (42), que mostraram que as mães que consumiam mais de cinco doses
por dia tiveram 3,4 vezes mais risco de ter um bebê com FLP. O consumo de nível baixo de
álcool, no entanto, não parece aumentar o risco de fendas orais. (43).
Enquanto o álcool é um teratógeno estabelecido (44), o uso de álcool materno
relacionado a fendas orais tem sido inconsistente (45). Algumas evidências que fundamentam
a relação entre o consumo de álcool materno e fendas orais vêm de uma associação entre
fendas orais e variantes genéticas no gene álcool desidrogenase ADH1C (alcohol
dehydrogenase 1C (class I) gamma polypeptide) (46). Além disso, um estudo recente
demonstrou que a combinação de variantes ADH1C com reduzida atividade enzimática e uso
intenso de álcool materno aumentou o risco de fendas orais (47). A influência do álcool
também pode ser combinada com outros fatores de risco, tais como nutrição, tabagismo e
estresse.
O tabagismo materno tem sido consistentemente associado com um risco
aumentado de FOT, com um risco atribuível à população estimada de até 20% e um odds
ratio (OR) de 1.3 para FLP (48). Quando o tabagismo materno foi considerado junto com
uma história genética positiva, o efeito combinado foi mais significativo. Além disso, van
Rooij et al. (49) descobriram que o genótipo materno glutathione S-transferase theta 1
(GSTT1), quando combinado com o fumo, pode aumentar significativamente o risco de FLP
(OR = 4,9). Beaty et al. (50) relataram que o tabagismo materno e genótipos MSX1 (msh
homeobox 1) em fetos agiriam em conjunto para aumentar o risco de FLP em 7,16 vezes. O
genótipo materno MTHFR [methylenetetrahydrofolate reductase (NAD(P)H)] parece afetar
13
o risco de FOT, mas os estudos não são consistentes (51, 52, 53). Observa-se, portanto, a
existência de interação de fatores genéticos com ambientais na gênese de FLP, de modo geral.
O estado nutricional de mulheres grávidas também tem recebido bastante atenção
com respeito à incidência de fendas orais. Durante a gestação, a baixa ingestão de vitaminas
do complexo B concomitante com a exposição excessiva ou deficiente à vitamina A foram
associadas a um risco aumentado de fendas orais (15).
A nutrição durante a gravidez tem sido sugerida como um outro fator de
contribuição com base em estudos observacionais e de intervenção, utilizando suplementos
de ácido fólico como medida preventiva (54). O efeito benéfico da utilização do folato, no
entanto, permanece controverso e não tem sido consistentemente replicado (54, 55). Outros
nutrientes, incluindo o colesterol (56), o zinco (57) e o uso de multivitaminas em geral (58)
também têm sido estudados, mas é preciso ser expandido para populações maiores.
Finalmente, outras exposições a teratógenos e toxinas ambientais também têm
sido associadas ao aumento do risco de fendas orais (59), tal como ácido retinóico, ácido
valpróico, trimetadiona, talidomida e drogas anticonvulsivantes, como a fenitoína, (12, 15,
34, 39, 40, 60).
14
3.2.Fatores predominantemente genéticos
As causas genéticas das FLPs incluem rearranjos cromossômicos,
susceptibilidade genética a teratógenos e mutações patogênicas em múltiplos genes (61).
Existem aproximadamente 600 síndromes genéticas já descritas associadas à FLP, sendo que
mais da metade têm um padrão de herança monogênica (62, 63).
As alterações cromossômicas são mais frequentemente encontradas em pacientes
com fendas orais associadas a síndromes multissistêmicas complexas. Dentre estas,
destacam-se as trissomias do 13 (Síndrome de Patau) e do 18 (Síndrome de Edwards),
deleção 4p (Síndrome de Wolf-Hirschhorn, VWS), deleção 18q (Síndrome de deleção 18q)
e microdeleção 22q11 (Síndrome Velocardiofacial ou Síndrome de DiGeorge).
A variação genética em mais de um gene tem sido apontada como necessária para
a ocorrência de fendas orais, já que a formação dos lábios e do palato envolve vários
processos celulares e que a falha em qualquer um desses pode ocasionar a fenda oral.
Consequentemente, variações e interações podem ocorrer entre genes que regulam esses
processos (38).
A diversidade de eventos embriológicos que contribuem para a formação das
estruturas faciais se reflete no grande número de genes conhecido ou suspeito de estar
envolvido na etiologia das FOT (19).
A seguir, apresenta-se um breve resumo de alguns dos principais genes
candidatos para fendas orais e suas respectivas funções em vias genéticas conhecidas por
moldar o complexo craniofacial.
15
3.2.1. Genes candidatos e vias envolvidas na etiologia de FLP
3.2.1.1.Fatores de sinalização extracelular
O destino das células é regulado por moléculas de sinalização. Estas são
substâncias químicas (hormônios, neurotransmissores, entre outros) sintetizadas e segregadas
por células com a finalidade de comunicação extracelular. Após a ligação aos seus
respectivos receptores de superfície celular, estas moléculas sinalizadoras iniciam uma cadeia
de eventos moleculares e ativam fatores de transcrição específicos (proteínas que se ligam
diretamente ao DNA - ácido desoxirribonucleico). Esses fatores de transcrição ligam-se a
regiões reguladoras do genoma e ativam a expressão ou a repressão de conjuntos específicos
de genes que controlam o comportamento das células. O processo acima é um evento crucial
e repetido no desenvolvimento do embrião e a base para a formação correta de todas as
estruturas embrionárias, incluindo o crânio (64). Estudos sobre desenvolvimento orofacial
têm identificado várias moléculas de sinalização (principalmente fatores de crescimento) e
fatores de transcrição.
Os fatores de crescimento são moléculas de peptídeo ou hormônios esteroides
que estimulam o crescimento, a proliferação e a diferenciação celular. Os eventos
moleculares que estão na base da formação de estruturas orofaciais estão sob o estrito
controle de uma variedade de genes que pertencem principalmente a quatro famílias de
fatores de crecimento que são bem conservadas entre diferentes espécies: FGF (fibroblast
growth fator), SHH, WNT (wingless-type MMTV integration site family) e TGFβ
16
(transforming growth fator beta), que inclui as proteínas morfogenéticas ósseas (BMP - Bone
morphogenetic protein) e ativinas (65).
3.2.1.1.1. Superfamília TGFβ
A superfamília de fatores de crescimento TGFβ regulam muitos aspectos do
desenvolvimento do esqueleto, incluindo formação da cartilagem e óssea, modelação da
mesoderme, e desenvolvimento craniofacial e de membros (66). Este grupo de fatores de
crescimento e de diferenciação incluem TGF-β, proteínas morfogênicas ósseas (BMP), e
moléculas sinalizadoras ativinas (67).
A inativação do receptor do gene TGFβ3 (TGFβR2 - transforming growth factor,
beta receptor II) em células da crista neural de camundongo resultou em FP e anomalias na
formação do crânio (68, 69), implicando, assim, a via de sinalização TGFβ na cascata
molecular que determina o desenvolvimento craniofacial. A inativação de outro receptor do
gene TGFβ (TGFBR1 - transforming growth factor, beta receptor 1) em camundongos
provoca fendas unilaterais ou bilaterais no lábio superior (70), indicando que a via TGFβ
pode ser também importante na formação do lábio.
Embora os outros membros da família TGFβ sejam temporal e espacialmente
expressos no desenvolvimento do palato, apenas o knockout Tgfb3 inibe a fusão dos PP em
camundongos (71,72,73). Em humanos, foi observada uma ligação significativa entre a
região do gene TGFB3 e fenda de lábio com ou sem fenda de palato isolada (74), apesar de
uma falta de associação com este gene em estudos anteriores (75).
17
Como outros membros da superfamilia TGF-β, as BMP exercem os seus efeitos
ligando-se a dois tipos de receptor serina/treonina kinases (tipo I e II) ligadas à membrana
(76). Existem três receptores tipo I (ACVR1 - activin A receptor, BMPR1A - bone
morphogenetic protein receptor, type IA e BMPR1B - bone morphogenetic protein receptor,
type IB) e três receptores tipo II (BMPR2 - bone morphogenetic protein receptor, type II,
ACVR2A - activin A receptor, type IIA e ACVR2B - activin A receptor, type IIB) conhecidos
por mediar sinais de BMP (52). Após a ligação de uma proteína BMP ao ligando, o receptor
de tipo II fosforila o receptor de tipo I. Por sua vez, o receptor tipo I fosforila e ativa um
grupo de co-ativatores transcricionais denominados Smads, seguido por translocação do
complexo para dentro do núcleo e da ativação da transcrição de genes-alvo específicos
(76,77), incluindo genes Msx (50).
Mais de 20 membros foram identificados na família BMP (49). São classificados
em cinco subfamílias com base em estudos filogenéticos e semelhança de sequências: (1)
subfamília dpp é composta de BMP2 (bone morphogenetic protein 2) e BMP4 (bone
morphogenetic protein 4) devido à sua semelhança com o gene Drosophila dpp; (2)
subfamília 60ª que inclui BMP5 (bone morphogenetic protein 5), BMP6 (bone
morphogenetic protein 6), BMP7 (bone morphogenetic protein 7) e BMP8 (bone
morphogenetic protein 8); (3) BMP3 (bone morphogenetic protein 3) e GDF10 (growth
differentiation factor 10) em conjunto constituem uma subfamília única; (4) GDF5 (growth
differentiation factor 5), GDF6 (growth differentiation factor 6), GDF7 (growth
differentiation factor 7) constituem outro subgrupo nesta família, e (5) Nodal (nodal growth
differentiation factor) e Lefty (left-right determination factor ) são membros distantes da
subfamília BMP (78, 79).
18
Os genes BMP2 e BMP4 são expressos em determinados momentos e em regiões
específicas do epitélio nasal, do maxilar e dos processos mandibulares (80). Em experiências
em que Noggin, uma molécula que antagoniza a ação de moléculas de BMP, foi aplicado
sobre os processos faciais de embriões em desenvolvimento, a forma e o tamanho dos
processos faciais foram alterados de forma significativa (81). Além disso, a superexpressão
ou inibição da sinalização de BMP em embriões causa FL (82).
O gene Bmp4 parece ser particularmente importante na fusão do lábio e do palato.
Em modelo de camundongo condicional knockout Bmp4, todos os embriões apresentavam
fenda de lábio bilateral no 12º dia pós concepção, mas por volta de 14,5 dias pós concepção,
apenas 22% ainda exibiram fenda de lábio (83,84). Assim, várias fendas iniciais pareciam ter
sido curadas no utero, possivelmente através de complementação ou regulação de outros
genes Bmp (30).
3.2.1.1.2. Fatores de crescimento de fibroblastos
A via de sinalização do fator de crescimento de fibroblastos (FGF) é altamente
conservada evolutivamente e desempenha funções importantes em vários aspectos do
desenvolvimento craniofacial, incluindo indução da crista neural, esqueletogênese e
interações epitélio-mesenquimal (78). Múltiplos membros da família FGF são expressos em
domínios que se sobrepõem durante o desenvolvimento nasal e região média da face (85).
A via de sinalização FGF está ativa tanto no epitélio quanto no mesênquima facial
e está envolvida, principalmente, na estimulação da proliferação celular. As mutações nas
19
moléculas FGF ou em seus receptores podem resultar em craniossinostoses (86,87), o que
reflete o papel da sinalização do FGF nos processos de osteogênese e condrogênese.
Provas convincentes ligando fenda orofacial com os membros da família FGF e
seus receptores têm sido obtidas a partir de estudos em animais transgênicos. Os
camundongos que carregavam uma deleção no gene que codifica tanto fgf10 (fibroblast
growth factor 10) como fgfr2 (fibroblast growth factor receptor 2) possuiam um fenótipo de
FP (88). O gene Fgf8, por exemplo, é expresso no desenvolvimento do ectoderma e do
endoderma do arco faríngeo durante a migração de células da crista neural através dos arcos
da faringe (89).
Durante a formação do palato, as moléculas de FGF e seus receptors são
expressas nos PP em desenvolvimento (90). Nos seres humanos, as mutações nos genes
FGFR1 (fibroblast growth factor receptor 1), FGFR2, e FGFR3 (fibroblast growth factor
receptor 3) são associadas com craniossinostose e outras malformações face-esqueléticas
(91). Um bom exemplo é a síndrome de Apert, causada por mutações no gene FGFR2, na
qual em torno de 75% dos pacientes apresentam FP ou úvula bífida (92). Por outro lado,
mutações com perda de função do gene FGFR1 são encontradas em KAL2 (Kallmann
Syndrome 2), uma forma autossômica dominante da síndrome de Kallmann associada com
hipogonadismo, anosmia e fenda oral em cerca de 5% a 10% dos pacientes (93,94). Tal como
acontece com a síndrome de Van der Woude (VWS), alguns indivíduos com KAL2 podem
apresentar fendas como o único componente do fenótipo, o que reforça a necessidade de
avaliações fenotípicas criteriosas e de mapeamentos genéticos (95).
O seqüenciamento de 12 genes FGF em 184 indivíduos com FLP isolada
identificou sete potenciais mutações causadoras de doenças, incluindo uma mutação sem
20
sentido no gene FGFR1, mutação de novo de sentido trocado no gene FGF8, e outras
variantes de sentido trocado nos genes FGFR1, FGFR2 e FGFR3. Curiosamente, a mutação
sem sentido foi identificada em um paciente com síndrome de Kallmann e seu pai com apenas
FLP isolada, destacando questões de não penetrância na identificação de mutações em fenda
de lábio com ou sem fenda de palato isolada (96).
3.2.1.1.3. SHH
O gene Sonic Hedgehog (SHH) é o principal membro da família Hedgehog que
está associado com eventos fundamentais de desenvolvimento durante a embriogênese
orofacial (97). A sinalização Shh é essencial para a normal padronização e o crescimento da
face. A análise de interações entre os genes Shh e Fox indicam que os genes Fox pelo menos
medeiam parcialmente a ação de genes Shh no desenvolvimento facial (98). Nos seres
humanos, a perda de um alelo SHH é suficiente para causar holoprosencefalia
(desenvolvimento anormal do prosencéfalo e face) (99,100).
A sinalização celular é iniciada através da ligação de Shh ao seu receptor de
superfície celular patched homolog 1 (Ptch1) para ajudar na repressão basal de Smoothened
(Smo) (101). Smo então ativa a família GLI de fatores de transcrição zinc-finger para a
transdução do sinal Shh para o núcleo.
O PTCH é um gene supressor de tumores localizado em 9q22.3, na vizinhança
de uma região altamente provável de possuir um gene candidato forte para fendas orofaciais
(74). Mutações em vários membros da via SHH (por exemplo, PTCH1 - patched 1, PTCH2
- patched 2, GLI2 - GLI family zinc finger 2, GLI3 - GLI family zinc finger 3, SMO -
21
smoothened, frizzled class receptor) podem levar a diferentes defeitos congênitos, incluindo
holoprocencefalia, síndrome de Gorlin, síndrome de Pallister-Hall, síndrome Rubinstein-
Taybi e câncer (97). A Síndrome de Gorlin, por exemplo, é causada por mutações no gene
PTCH e está associada com FP em 5% dos casos (102). Devido a esta associação com fendas
orais, o gene PTCH foi examinado quanto a mutações em casos isolados de fenda de lábio
com ou sem fenda de palato. Sendo que sete novas variantes normais, distribuídas ao longo
de todo o gene, e três mutações missense foram encontrados entre os casos de fenda de lábio
e/ou palato. (103).
A rede de sinalização do Fgf-Shh pode também desempenhar um papel
importante na coordenação de interações epitélio-mesênquimal durante os estágios iniciais
de desenvolvimento do palato (88,104). O sistema de sinalização Fgfr2b/FGF10 foi
demonstrado ser crítico para o desenvolvimento normal do palato secundário (88). É
importante ressaltar que a eliminação do receptor ou do ligando resulta em perda de expressão
de Shh, indicando que a sinalização Fgf e Shh são componentes da mesma via de
palatogênese.
3.2.1.1.4. WNT
Em seres humanos, a família WNT de moléculas de sinalização é composta por
19 membros. As moléculas de WNT atuam através de receptores específicos (Frizzled 1-10)
para ativar os sinais intracelulares que ditam uma variedade de ações celulares (64).
A via de sinalização WNT consiste em uma grande família de moléculas
secretoras que desempenham funções importantes em uma variedade de processos do
22
desenvolvimento (105). A transdução de sinal é iniciada quando as proteínas WNT se ligam
a receptores de superfície celular Frizzled, resultando na ativação da proteína citoplasmática
Dishevelled (106).
Durante o desenvolvimento craniofacial inicial no embrião de camundongos, os
membros da família WNT são expressos em locais de iniciação dos dentes no epitélio oral,
no mesênquima da elevação dos PP, e em locais de futura formação óssea da maxila e da
mandíbula (107).
A perda da função de WNT em vertebrados provoca uma grande variedade de
defeitos de desenvolvimento. Em humanos, uma mutação no gene WNT3 (wingless-type
MMTV integration site family, member 3) tem sido associada a uma condição rara chamada
tetra-amelia (108). Indivíduos com tetra-amelia não têm os quatro membros e muitas vezes
têm fenda de lábio com ou sem fenda de palato. Algumas mutações no gene WNT7A
(wingless-type MMTV integration site family, member 7A) têm sido associadas com síndrome
de Fuhrmann que também envolve anomalias de membros e FLP (109).
Muitos dos componentes de sinalização Wnt são partilhados por outras vias de
sinalização. A expressão do WNT é frequentemente coincidente com a expressão de
moléculas das familías Hedgehog e TGF (107). A inativação da sinalização WNT em
camundongos provoca fenda de lábio com ou sem fenda de palato (110).
3.2.1.1.5. Fatores de transcrição
Os genes do tipo fator de transcrição têm grande atuação no desenvolvimento
embrionário precoce. Estes genes atuam no controle da transcrição de outros genes
codificadores de proteínas estruturais, reguladoras ou enzimáticas (111).
23
3.2.1.1.5.1. IRF6
O gene IRF6 (interferon regulatory factor 6) pertence a uma família de nove
fatores de transcrição (112) e é fortemente expresso no ectoderma da borda dos PP antes e
durante a formação do palato secundário (113,114,115). Os membros da família IRF
(interferon regulatory fator) são conhecidos por regular uma variedade de mecanismos de
defesa. Os camundongos deficientes de genes irf1 (interferon regulatory fator 1), irf2
(interferon regulatory fator 2), irf3 (interferon regulatory fator 3), irf4 (interferon regulatory
fator 4), irf5 (interferon regulatory fator 5), irf7 (interferon regulatory fator 7), irf8
(interferon regulatory fator 8) ou irf9 (interferon regulatory fator 9) têm uma resposta
imunitária comprometida (116). Estes camundongos, no entanto, não manifestam quaisquer
anormalidades embriológicas. Em contraste, camundongos irf6 nulos têm pele,
desenvolvimento craniofacial e membros anormais (112), consistente com a distribuição
fenotípica em pacientes com VWS e síndrome pterígio poplíteo (PPS).
Do grande número de genes candidatos que se acredita contribuir na etiologia de
fenda oral, o gene IRF6 está entre os poucos que tem mostrado um grau convincente de
consistência entre os estudos (5,117). As mutações neste gene são conhecidas por causar dois
distúrbios autossômicos dominantes: VWS e PPS (112,118). A VWS é um dos melhores
modelos para fenda de lábio com ou sem fenda de palato isolado, em que em torno de 15%
dos indivíduos afetados são clinicamente indistinguíveis de fendas orais isoladas. Estas
observações rapidamente levaram à hipótese de que variantes genéticas no gene IRF6
também podem estar envolvidas na etiologia das fendas orais isoladas, o que foi
posteriormente confirmada em um grande conjunto de dados de cerca de 2000 famílias
24
composta por 10 populações de ascendências diferentes (119) e replicada de forma
independente em vários estudos (117).
As mutações no domínio de ativação da transcrição do gene IRF6 foram
demonstradas como inibidoras da ativação da transcrição (120). Um avanço na compreensão
de como o gene IRF6 afeta o risco de fenda de lábio com ou sem fenda de palato isolada foi
a recente identificação de um SNP (rs642961) que interrompeu o sítio de ligação para o fator
de transcrição AP-2α dentro de um elemento enhancer IRF6 altamente conservado (5). A
ligação entre IRF6 e AP-2α é particularmente notável, dado o fato de que os dados anteriores
demonstraram um papel essencial para a AP-2α no desenvolvimento craniofacial (121). Além
disso, os camundongos que carregam tanto células tipo selvagem quanto AP-2α nulo tem
FLP e pronunciada dismorfologia mandibular e maxilar, consistente com desenvolvimento
anormal das proeminências faciais (122).
Algumas mutações no gene TFAP2A [transcription factor AP-2 alpha (activating
enhancer binding protein 2 alpha)], o gene que codifica AP-2α, causam síndrome brânquio-
óculo-facial, caracterizada por algumas das mesmas características observadas em VWS
(fendas orais) (123). Por último, o gene TFAP2A está localizado no cromossomo 6p24 onde
anomalias cromossômicas têm sido associadas à fenda orais (63). Assumidos em conjunto,
estes resultados colocam IRF6 e AP-2α em uma via de desenvolvimento comum em que suas
alterações podem contribuir para a patogênese de fenda de lábio com ou sem fenda de palato.
25
3.2.1.1.5.2. FOXE1
Nos seres humanos, uma mutação de perda de função no gene FOXE1 (forkhead
box E1, thyroid transcription factor 2) foi associada à síndrome Bamforth-Lazarus, que inclui
agenesia da tireóide, defeitos do folículo piloso, atresia de coanas, e FP entre as
características clínicas (124). Alguns estudos apoiam uma função para o gene FOXE1 em
FLP isolada. O sequenciamento direto de 184 pacientes com fenda de lábio com ou sem fenda
de palato isolado detectou mutações de sentido trocado no gene FOXE1 em dois pacientes
não relacionados e nenhuma das mutações detectadas foram encontradas em 186 controles
(125).
Além disso, uma meta-análise de 13 estudos tipo genome-wide observou um
grande sinal de ligação no cromossomo 9q21 (74), que está proximo dos genes FOXE1
(9q22) e PTCH (9q22.3). Outro estudo do tipo genome-wide em 820 famílias com fenda de
lábio com ou sem fenda de palato mostrou que a região FOXE1 foi mais significativamente
presente em famílias em que alguns ou todos os indivíduos afetados têm fenda de lábio com
ou sem fenda de palato (126).
3.2.1.1.5.3. Fatores de transcrição T-box
As mutações encontradas no gene TBX22 (T-box 22) foram a causa de fenda
palatal ligada ao X (FPX), geralmente associada à anquiloglossia (127). Subsequentemente,
mutações no gene TBX22 também foram encontradas em casos de FP isolada (128,129). Em
26
camundongos, a expressão do gene Tbx22 está localizada no desenvolvimento dos PP e na
base da língua, onde a anquiloglossia é observada (130,131).
Dois membros adicionais da família T-Box, TBX1 (T-box 1) e TBX10 (T-box 10),
têm sido implicados na patogênese de fenda de lábio com ou sem fenda de palato. Aspectos
genéticos da síndrome de deleção 22q11.2 são complexos, mas mutações no gene TBX1
foram identificadas em um pequeno número de pacientes com esta condição clínica
(132,133,134). Uma proporção significativa de pacientes com síndrome de deleção 22q11.2
têm anomalias palatais, incluindo FP em 9 a 11% dos casos (135).
Além disso, a expressão ectópica do gene tbx10 resulta em FLP em camundongos
transgênicos (137) e as mutações neste gene também foram encontras em casos de fenda de
lábio com ou sem fenda de palato (125).
3.2.1.1.5.4. MSX1
O gene MSX1, localizado no cromossomo 4p16, é fortemente expresso em células
da crista neural (138). As proteínas MSX são conhecidas por desempenharem uma função
chave nas interações dos tecidos epitélio-mesenquimal durante o desenvolvimento
craniofacial (139). Em humanos, mutações sem sentido no gene MSX1 foram responsáveis
por agenesia dentária e fendas orais (140). O gene MSX1 também é deletado em pacientes
com WHS, causada por deleções na região 4p16.3 (141). Entre uma série de características
clínicas, os pacientes com WHS apresentam defeitos de fechamento, tais como FLP,
coloboma do olho e defeitos de septo cardíaco.
27
Um estudo recente mostrou que variantes raras nos genes TGFA (transforming
growth factor, alpha) e MSX1 poderiam aumentar o risco de FP em até 9,7 vezes,
demonstrando a importância da interação gene-gene na etiologia de fenda oral (142).
Jezewski et al. (143) identificaram uma mutação no gene MSX1 em 3 de 242 filipinos com
fenda de lábio com ou sem fenda de palato. Suzuki et al. (144) e Vieira et al. (125)
identificaram uma mutação de sentido trocado no gene MSX1 em pacientes com fenda de
lábio com ou sem fenda de palato vietnamitas e filipinos. O sequenciamento completo do
gene MSX1 revelou que 2% dos pacientes com fenda de lábio com ou sem fenda de palato
isolada possui mutações nesse gene (143).
3.2.1.1.5.5.VAX1
O gene Vax1 (ventral homeobox anterior 1) é um regulador transcricional que
contém um domínio homeobox DNA binding. Os marcadores em/ou próximo ao gene VAX1
tiveram significância em estudos genome-wide realizados por Mangold et al. (145) e
GENEVA Cleft Consortium (146). Esta associação foi replicada em três populações asiáticas
independentes (147). O gene Vax1 é expresso em diversas estruturas craniofaciais e
camundongos deficientes de Vax1 desenvolvem FP (147).
3.2.1.1.5.6.JAG2
O gene JAG2 (jagged 2) codifica um ligando para a família de receptores
transmembranares Notch, que estão envolvidos em um mecanismo essencial de sinalização
28
necessário para o desenvolvimento normal do palato (149). Em estudos de associação de base
familiar, evidências do envolvimento do gene JAG2 em fenda de lábio com ou sem fenda de
palato foram obtidas a partir de análises de haplótipos utilizando ensaios globais e testes de
associação de haplótipos (125,150).
Interessantemente, os dados mais significativos em ambos os estudos ocorriam
quando haplótipos incluíam o polimorfismo não sinônimo, rs1057744. Recentemente, tem-
se demonstrado que os genes IRF6 e JAG2 têm vias moleculares convergentes durante a
diferenciação do epitélio oral, e esta sinalização integrada é essencial para o controle da
adesão e fusão palatal (151). Jagomägi et al. (152) encontraram associação do SNP (Single-
Nucleotide Polymorphism) rs1022431, onde o alelo A foi associado a um risco mais elevado
de fenda de lábio com ou sem fenda de palato. A associação mais significante com o fenótipo
de FP entre todos os genes candidatos rastreados neste estudo foi observada para o SNP
rs11624283 no gene JAG2. Estes resultados indicam que as variantes JAG2 podem estar
envolvidas na etiologia das fendas orais em diferentes populações.
3.2.1.1.5.7. PAX9
O gene PAX9 (paired box gene 9), localizado em 14q12-q13, codifica um fator
de transcrição. Em camundongos, o gene Pax9 é expresso no mesênquima dos PP e nos
dentes. Além disso, apresentaram fenda de palato secundário, agenesia dentária e outras
anormalidades (153). As mutações no gene PAX9 em humanos são relatadas como
causadoras de hipodontia de molares que são frequentemente acompanhados por fenda de
lábio com ou sem fenda de palato (154).
29
3.2.1.2. Modificação de proteínas
3.2.1.2.1. SUMO
O gene SUMO (Small ubiquitin-like modifier 1) modifica várias proteínas
celulares e participa de vários processos celulares, tais como transporte nuclear, regulação da
transcrição, apoptose e estabilidade da proteína (155). Além disso, as deleções envolvendo o
gene SUMO1 foram recentemente identificadas em uma pesquisa de microdeleções entre um
grande número de genes candidatos para fendas orais (156).
Recentemente, foi proposto que podem existir interações sinérgicas entre a via
de sinalização do FGF e SUMO, e fatores de risco ambiental causando fenda de lábio com
ou sem fenda de palato (91). É importante observar que vários genes previamente associados
com fendas orais também são alvos de modificação SUMO (por exemplo TBX22, MSX1,
SATB2 - SATB homeobox 2, TP63 - tumor protein p63, PAX9, TRPS1 -
trichorhinophalangeal syndrome I e EYA1 - EYA transcriptional coactivator and
phosphatase 1) (91).
3.2.1.3. Outros genes e loci candidatos
3.2.1.3.1. Região 19q13.1
A evidência de um locus de suscetibilidade para fenda oral na região 19q13.1 foi
encontrada a partir de estudos de ligação e associação (35,157,158). Yoshiura et al (159)
30
relataram uma família com FLP em três gerações, sendo que todos os membros afetados
tiveram uma translocação equilibrada no cromossomo 19q13. Uma variedade de genes foi
estudada, incluindo BCl3, PVRL2, CLPTM1.
O gene BCL3 (B-cell CLL/lymphoma 3) é um proto-oncogene que está envolvido
na proliferação celular, diferenciação e apoptose. O PVRL2 (poliovirus receptor-related 2) é
uma glicoproteína transmembranar que pertence à família dos receptores do poliovírus. As
mutações em uma proteína relacionada, PVRL1 (poliovirus receptor-related 1), são
conhecidos por causar a síndrome autossômica recessiva chamada síndrome Margarita
Island (160), e heterozigotos para a mutação PVRL1 W185X tem risco aumentado para FLP
isolada (161).
Por meio de clonagem e de pontos de quebra foi revelado um novo gene
denominado CLPTM1 (cleft lip and palate associated transmembrane protein 1). O gene
CLPTM1 codifica uma proteína transmembranar que é expressa em tecidos embrionários.
Oito variantes raras de CLPTM1 foram encontrados em 74 pacientes com FLP isolada, mas
nenhuma foi significativamente associada à FLP. Os autores concluíram que o gene CLPTM1
não era um dos principais contribuintes para FLP. Por outro lado, a mesma região do
cromossomo 19q13 tem sido implicada na etiologia de FLP por meio de estudos de ligação
e de desequilíbrio de transmissão (162,163) Assim, o gene CLPTM1 ou outros genes nesta
região ainda podem ser associados à FLP.
31
3.2.1.3.2. RARA
Chenevix-Trench et al. (164) descreveram uma significativa diferença na
freqüência de alelos do gene RARA (retinoic acid receptor, alpha) entre casos de fenda de
lábio com ou sem fenda de palato e controles. Shaw et al. (165), mostraram que os genes da
região do gene RARA, ou variações genéticas nesse locus estão envolvidos na formação de
defeitos de fenda de lábio com ou sem fenda de palato utilizando análise de ligação. Eles
também encontraram uma diferença significativa na freqüência alélica de D17S579 (um
marcador microssatélite perto de RARA) entre FLP e FL. Ao contrário, Vintiner et al. (166),
e Stein et al. (162) não encontraram ligação entre RARA e fenda oral, assim, excluindo-se
qualquer relação entre o gene RARA e fenda oral.
Caricini et al. (2007) com um estudo baseado em família, apoia o papel do gene
RARA em fendas orais. Resultados semelhantes também foram obtidos por Maestri et al.
(168). Kanno et al. (169) não encontraram qualquer associação entre o gene RARA e fenda
de lábio com ou sem fenda de palato na população japonêsa. Peanchitlertkajorn et al. (170)
investigaram vários loci no cromossoma 17, incluindo RARA, em famílias chinesas e
descobriram que a variação genética dentro do locus de RARA ou próximo dele, parece estar
envolvida na patogênese das fendas orais não sindromicas nesta população.
3.2.1.3.3. ERBB2
O gene ERBB2 (receptor tyrosine-protein kinase erbB-2, precursor) é 642088
pares de bases upstream do gene RARA. Uma vez que eles são relativamente próximos um
32
do outro, a associação referida anteriormente entre o gene RARA e fendas orais realmente
pode ser decorrente de variações no gene ERBB2. O gene ERBB2 é essencial no complexo
receptor-neuregulina mas não é ativado pelo EGF (fator de crescimento ectodérmica) ou
TGFA (fator de crescimento transformante alfa) (171).
3.2.1.3.4. AXIN2
Os membros da família de genes Wnt têm sido associados com fendas orais em
seres humanos e camundongos (172,173,174). O gene AXIN2 (axis inhibition protein 2) é
um regulador negativo da via de WNT devido ao seu papel na degradação de β-catenina.
Algumas mutações no gene AXIN2 têm sido associadas com o aumento da susceptibilidade
ao câncer (175,176,177), e em alguns casos foram detectados segregando juntamente com
agenesia dentária familiar (175). Além disso, foi descrita associação de uma mutação de
sentido trocado no gene AXIN2 (rs2240308, P50S) com a etiologia de fenda de lábio com ou
sem fenda de palato (174).
Diante desse pequeno resumo de alguns genes candidatos em fendas orais
percebemos que, de fato, o conhecimento da base molecular das fendas orais é crítico para
melhorar a acurácia do aconselhamento genético e a proposição de ações preventivas
populacionais. Embora muito já se tenha avançado, ainda persistem lacunas importantes tanto
em relação ao número e a contribuição de genes específicos em casos isolados e associados
a outros defeitos congênitos, quanto às interações gene-gene e gene-ambiente e às correlações
genótipo-fenótipo. A complexidade etiológica intrínseca das fendas orais, a heterogeneidade
33
de métodos de estudo empregados e o pequeno tamanho das casuísticas, são importantes
obstáculos na caracterização destes aspectos.
Sendo assim, a identificação de genes envolvidos na etiologia das FLP tem sido
objetivo de várias pesquisas com diferentes estratégias metodológicas, entre elas a seleção
de genes candidatos baseados na análise do padrão de expressão gênica em modelos animais,
estudos do tipo análise de ligação e estudos de associação alélica.
4. Metodologias para o estudo de FLP isolada
Atualmente, existem vários genes e loci genéticos que possuem participação na
etiologia de FLP determinados a partir de várias linhas de evidências. Assim, uma variedade
de abordagens genéticas tem sido utilizada para identificar vários genes e vias genéticas
críticas envolvidas no desenvolvimento craniofacial.
Os genes candidatos para FLP têm sido propostos em abordagens comuns como
estudos de associação alélica e análise de ligação (74,75,178). Outra estratégia comum
seleciona genes candidatos de modelos animais baseados no padrão de expressão desses
genes no desenvolvimento da face (179,180,181,182,183,184).
Portanto, a seleção de genes candidatos baseia-se, tipicamente, em
conhecimentos prévios sobre os processos biológicos envolvidos e pode utilizar uma
variedade de fontes, a partir de modelos animais a síndromes mendelianas com presença de
fenda oral no seu fenótipo. Os modelos animais têm provado ser muito úteis na identificação
de mutações genéticas responsáveis por malformações em humanos (95). Os camundongos
com dismorfismos craniofaciais são particularmente apropriados como modelos para a
34
malformação do palato humano, uma vez que o desenvolvimento facial precoce e a
morfologia dos camundongos são semelhantes à dos seres humanos (185,186).
Além disso, os genes candidatos também podem ser selecionados com base em
seus papéis em síndromes que incluem fenda como parte do fenótipo (65). A análise de
expressão é outra ferramenta poderosa na identificação de genes candidatos. O Craniofacial
and Oral Gene Expression Network Database (COGENE, www.FaceBase.org) cataloga
padrões de expressão gênica a partir de embriões humanos em estágios iniciais, enquanto o
banco de dados extenso EMAGE cataloga informações abrangentes de expressão de genes
para o desenvolvimento do embrião de camundogo (187).
As anomalias cromossômicas também podem fornecer pistas importantes sobre
genes envolvidos na etiologia de fendas orais. Uma ampla pesquisa de deleções
cromossômicas (188) e duplicações (189) foi realizada para identificar fenótipos
significativamente associados com aneuploidia parcial.
O diagnóstico molecular de alterações cromossômicas ou alterações no número
de cópias do DNA (copy number variation, CNV) em pacientes com FLP, principalmente
sindrômicos, é revolucionado pela tecnologia de microarray, já que esta permite a análise de
milhares de regiões do genoma simultaneamente para a detecção e localização de ganhos e
perdas de material genético (190,191,192,193,194,195,196). Entretanto, esta metodologia
não detecta alterações genômicas, eventos tecido-específico e aberrações pequenas (197).
Os rearranjos genômicos são causados por recombinação imprópria de
cromossomos e incluem deleções, duplicações, translocações, inversões e podem ocorrer
dentro ou entre cromossomos. A análise de pontos de quebra em rearranjos equilibrados
identificou os genes CLPTM1 (159), SATB2 (198), SUMO1 (199), e FGFR1 (94) como genes
35
candidatos para fenda de lábio com ou sem fenda de palato, e implicou as regiões 9q e 17q
como potenciais loci de risco (200).
Em contraste, as CNVs e microdeleções são ganhos ou perdas de segmentos de
DNA que variam de kilobases para megabases submicroscópicas. Embora a maioria das
CNVs sejam encontradas em formas sindrômicas de fendas, como a síndrome de DiGeorge e
VWS, estudos recentes têm pesquisado sobre o papel das CNVs e microdeleções em formas
não sindrômicas de fendas orais (174,190). Os genes implicados em fenda de lábio com ou
sem fenda de palato a partir destas abordagens incluem FGFR2 (190), TFAP2A (201),
SUMO1 (156), GLI2, MSX1, FGF8, TCEB3 e KIF7 (202).
Os estudos de análise de ligação baseiam-se na co-segregação de loci gênico com
a doença e podem ser realizados em grandes famílias, ou em pares de parentes afetados. A
triagem de todo o genoma tem sido realizada em casos de fenda de lábio com ou sem fenda
de palato. Embora cada estudo tenha identificado vários sinais positivos, nenhum teve LOD
escores atingindo significância. (74). Um grande estudo de ligação envolvendo 388 famílias
de sete populações identificou os primeiros resultados de ligação significativa do genoma em
1q32, 2p13, 3q27-28, 9q21, 14q21-24 e 16q24 (74). O subseqüente mapeamento da região
9q21 identificou o gene FOXE1 como o gene causador de fenda oral neste locus
(126,203,204).
Os estudos de associação também têm sido usados extensivamente para examinar
genes candidatos em FLP. Estes estudos possuem a vantagem sobre os de análise de ligação
ao usar uma amostra grande de casos que ocorrem isolados sem parentes afetados (205).
Além disso, os estudos de associação exploram uma riqueza da literatura em biologia do
36
desenvolvimento que identifica genes específicos expressos durante fases críticas da
formação do lábio ou do palato (206).
Ardinger et al. (207) foram os primeiros a usarem um desenho de estudo do tipo
caso-controle para testar genes candidatos. Eles encontraram uma associação
estatisticamente significativa entre a doença e dois dos 12 marcadores em cinco genes, com
um marcador Taq1 intrônico no gene TGFA mostrando a associação mais forte.
Os estudos de associação do tipo genome-wide (Genome Wide Association
Studies, GWAS) tornaram-se amplamente utilizados por sua abordagem imparcial para
identificar genes candidatos ou locus associados com características complexas, como fenda
de lábio com ou sem fenda de palato. Birnbaum et al. (178) encontraram uma associação
extremamente forte entre marcadores em 8q24 e fenda de lábio com ou sem fenda de palato
em uma população alemã, a qual foi, posteriormente, replicada na população americana
(208). No terceiro estudo de GWAS, Mangold et al. (145) identificaram sinais significativos
perto do gene VAX1 no cromossomo 10q25 e NOG no cromossoma 17q22. O quarto GWAS
de fenda de lábio com ou sem fenda de palato foi realizado pelo GENEVA Cleft Consortium
study (146). Na análise combinada de todas as populações, este estudo confirmou as
associações anteriores com 1q32 e 8q24 e identificou novos loci em 1p22 e 20q12. Quando
estratificada a partir da população, marcadores perto 1q32, 1p22 e 20q12 alcançaram
significância de todo o genoma em asiáticos, enquanto que apenas o sinal 8q24 foi
formalmente significativo nos europeus.
Na sua maioria, os estudos na população brasileira em FLP são do tipo caso-
controle. De Aquino et al. (209) realizaram um estudo de associação para determinar o papel
de 16 marcadores polimórficos dentro de 4 genes (FGF12, VCL, CX43 e VAX1) em 300
37
pacientes com fenda de lábio com ou sem fenda de palato e 385 controles não afetados e não
encontraram nenhuma associação. Por outro lado, Menezes et al. (210) investigaram a
associação de 13 SNPs nos genes WNT3A, WNT5A, WNT8A, WNT11, WNT3 e WNT9B com
fenda de lábio com ou sem fenda de palato em 500 casos e 500 controles e encontraram
associação com o gene WNT3.
O estudo aqui apresentado foi realizado no contexto do grupo de pesquisa
nomeado “Historia Natural das Anomalias Craniofaciais”, certificado pelo Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), e que tem como uma de
suas propostas o Projeto Crânio-face Brasil (PCFB). O PCFB é multicêntrico e
multiprofissional e conta com diferentes áreas de atuação, incluindo a Base Brasileira de
Dados Clínicos e Familiais de Fendas Orofaciais Típicas (BBDCF) (211), que à época do
início deste estudo contava com cerca de 800 registros completos de indivíduos examinados
por médico geneticista. Utilizando método padronizado de coleta de dados clínicos e
incluindo resultados de investigações citogenéticas e moleculares, esta base de dados, agora
em sua versão eletrônica (CranFlow - Base Brasileira de Fendas Orais), permite o registro
do seguimento clínico do paciente, garantindo a acurácia diagnóstica.
A classificação proposta pela International Clearinghouse for Birth Defects
Surveillance and Research é a adotada pela CranFlow. De acordo com esta classificação estão
excluídos outros defeitos major, tais como cardiopatia, defeitos de sistema nervoso central e
anomalias de trato urinário, frequentemente descritos em indivíduos com FLP não
sindrômica (212, Anexo I).
Apesar do conhecimento da função de vários genes, ainda persistem lacunas
importantes tanto em relação ao número e a contribuição de genes específicos em casos
38
isolados e associados, quanto às interações gene-gene e às correlações genótipo-fenótipo.
Com os avanços das técnicas de genotipagem, atualmente é possível se testar múltiplos
marcadores genômicos simultaneamente em genes candidatos. Nesse sentido, a técnica de
OpenArray permite a genotipagem de até 256 SNPs customizados de vários genes
candidatos.
4.1.Plataforma TaqMan®OpenArray™ Genotyping
A plataforma OpenArray® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) é uma
tecnologia de alto rendimento (high-throughput) que utiliza reação em cadeia da polimerase
(PCR) baseada em reagentes fluorescentes para fornecer detecção qualitativa de sequências
alvos empregando análise pós-PCR (endpoint).
Um experimento de genotipagem é um experimento endpoint utilizado para
determinar os genótipos de amostras desconhecidas. Com esse tipo de experimento
consegue-se diferenciar dois alelos de um SNP. Assim, este tipo de ensaio determina se as
amostras desconhecidas são: 1) Alelo 1 homozigotas (amostras com apenas o alelo 1), 2)
Alelo 2 homozigotas (amostras com apenas o alelo 2) ou 3) Heterozigotas (amostras com
ambos alelos 1 e 2).
Nos experimentos de genotipagem TaqMan, a PCR inclui uma sonda
fluorescente específica marcada para cada alelo do SNP alvo. Essas sondas fluorescentes
contêm diferentes corantes repórteres para diferenciar cada alelo. Os ensaios são pré-
carregados nas lâminas de genotipagem e nelas existem 3072 poços de reação que podem
39
acomodar um volume de reação de 33 nL. Dessa forma, é possível detectar até 3072 SNPs,
mutações de ponto ou pequenas deleções e inserções em uma única lâmina de genotipagem.
Como se mostra na figura abaixo, a lâmina de genotipagem é dividida em 48
subarrays; cada um consistindo em 64 poços. A superfície desses poços apresenta
propriedades hidrofóbicas, enquanto o interior dos poços (local onde já estão as sondas e os
primers necessários para as reações) apresenta características hidrofílicas. (Figura 2).
Figura 2. Ilustração da lâmina de OpenArray™, contendo os 48 subarrays e, em destaque,
a esquematização de um subarray com 64 poços, cada um apresentando o volume de 33nL
(Modificado de Applied BioSystems, 213).
Cada ensaio contém 2 primer’s (forward e reverse.), 2 sondas (uma para cada
alelo do SNP), um corante repórter na extremidade 5'UTR (untranslated region) de cada
sonda (corante VIC® ligado à extremidade 5'UTR da sonda do alelo 1 e corante FAM™ ligado
40
à extremidade 5'UTR da sonda do alelo 2), um quencher não fluorescente (QNQ) na
extremidade 3'UTR da sonda (como o supressor não fluoresce, os sistemas de PCR em tempo
real podem medir contribuições do corante repórter com precisão) (Figura 3) e fluoróforo
ROX que serve para confirmar que o ensaio foi depositado na lâmina de OpenArray®.
Além disso, as sondas possuem minor groove binder (MGB), que é uma
modificação que aumenta a temperaturade de fusão (Tm) das sondas sem o aumento do
comprimento destas (214,215), assim, permitindo a concepção de sondas mais curtas.
Consequentemente, as sondas TaqMan MGB apresentam maiores diferenças de valores de
Tm entre sondas ligadas e não ligadas; e maiores diferenças nos valores de Tm fornecem uma
genotipagem precisa.
Figura 3. Ilustração de uma sonda TaqMan MGB. F - Fluorofóro e Q - Quencher não
fluorescente (supressor).
Durante a PCR, cada sonda hibridiza especificamente com a sua sequência
complementar entre os primers forward e reverse. A enzima DNA polimerase pode clivar
apenas sondas que se hibridizam ao alelo do SNP específico. A clivagem separa o corante
repórter do quencher aumentando substancialmente a fluorescência do corante repórter.
Assim, os sinais de fluorescência gerados durante a amplificação por PCR indicam que os
alelos estão presentes na amostra.
41
Uma incompatibilidade entre uma sonda e um alelo de um SNP reduz
significativamente a eficiência de hibridação da sonda. Como a enzima DNA polimerase não
desloca a sonda não correspondente ao fragmento, por conseguinte ela não liberta o corante
repórter. Em outras palavras, a não hibridização não gera sinal de fluorescência. A figura 4
ilustra os resultados de hibridização e não hibridização entre a sequência alvo e as sondas em
ensaios de genotipagem TaqMan (216).
Figura 4. Representação esquemática de resultados de hibridização e não hibridização entre
as sequências de sondas e a sequência alvo em ensaios de OpenArray® (Adaptado de Applied
BioSystems, 213).
Essa plataforma é constituída pelos seguintes componentes: 1)
OpenArray™AccuFill®System (Applied Biosystems), que é um robô pipetador que carrega as
amostras na lâmina de genotipagem TaqMan®OpenArray® (Applied Biosystems), interligado
a um computador para controlar as atividades através do programa OpenArray™AccuFill®
(Applied Biosystems); 2) OpenArray®Case Sealing Station (Applied Biosystems), onde ocorre
a selagem das cases de TaqMan®OpenArray®Genotipagem (Applied Biosystems); 3)
42
OpenArray™NTCycler® (Applied Biosystems), que executa as imagens das lâminas de
genotipagem, conectado a um computador. Este possui um programa,
OpenArray™Genotyper (Applied Biosystems), que analisa os dados da execução e em seguida
denomina os genótipos (Figura 5).
Figura 5. Plataforma TaqMan®OpenArray™ (Applied BioSystems).
Os ensaios de genotipagem requerem dois passos: ciclagem térmica
(amplificação por PCR), seguida por detecção de sinais de fluorescência de pontos
resultantes. Enquanto o OpenArray™NTCycler® (Applied Biosystems) realiza a detecção de
endpoint, é preciso um termociclador independente para realizar a amplificação por PCR.
Um termociclador qualificado para utilização com o sitema TaqMan®OpenArray® (Applied
Biosystems) é o Duo Block GeneAmp®PCR System 9700 (Applied Biosystems).
O equipamento OpenArray™NTCycler® coleta dados de fluorescência após a
realização do ciclo térmico (PCR). Um ponto de coleta de dados (datapoint) no
OpenArray™NT Cycler® é composto por três fases: 1. Excitação: o equipamento ilumina
todos os poços de passagem da lâmina de genotipagem, excitando os fluoróforos em cada
43
reação. 2. Emissão: o sistema ótico do aparelho coleta a fluorescência residual emitida a partir
dos orifícios de passagem da lâmina. A imagem resultante consiste apenas de luz que
corresponde à gama de comprimentos de onda de emissão. 3. Coleção: o instrumento monta
uma representação digital da fluorescência residual recolhida durante um intervalo de tempo
fixo, em seguida, armazena a fluorescência em imagem bruta para análise.
Depois de uma corrida, o programa OpenArray™Genotyper (Applied Biosystems)
usa regiões óticas de interesse (ROI), corantes e dados de calibração para determinar a
localização e a intensidade dos sinais da fluorescência em cada leitura, o corante associado
com cada sinal de fluorescência, e o significado do sinal.
Cada poço da lâmina de genotipagem pode conter um único ensaio. O número de
ensaios na lâmina de genotipagem e o número de amostras nela contidas dependem do
formato da lâmina. O número máximo de SNPs possível de se analisar nessa lâmina é 256
(Tabela 1).
Tabela 1. Formatos oferecidos para a elaboração das lâminas de genotipagem.
Ensaios Amostras Ensaios por subarray
16 144 3
32 96 2
64 48 1
128 24 0,5
192 16 0,3
256 12 0,25
A possibilidade de utilizar a técnica de OpenArray surgiu como uma alternativa
interessante de se verificar a contribuição de genes descritos como relacionados à gênese de
FOT em diferentes tipos de estudo. Nesta proposta, utilizou-se esta estratégia em uma
44
amostra fenotipicamente homogênea da população brasileira em estudo do tipo caso-
controle.
45
OBJETIVO
1. Objetivo Geral
Contribuir para a identificação de genes envolvidos na determinação das fendas
labiopalatais.
2. Objetivo Específico
Investigar a associação entre 253 SNPs em 39 genes candidatos e FLP isolada
em uma amostra da população brasileira.
46
47
CASUÍSTICA e MÉTODOS
1. Desenho do estudo
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP 059/2008) (n°
714/2008) (Anexo II). Todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e
esclarecido (TCLE) (Anexo III).
Este estudo do tipo caso-controle foi composto por 537 indivíduos. O tamanho
amostral foi calculado por meio de regressão logística utilizando o programa estatístico R
(217). Para avaliar o poder estatístico para detectar associação genética foi realizada uma
estimativa do poder estatístico post-hoc da amostra por meio do programa GPower (218),
utilizando os seguintes parâmetros: teste de regressão logística; two-tail; OR: 1,5; α = 0,005
e n = 537. Assim, foi analisado o poder estatístico para a regressão logística e essa estimativa
foi de 81,29%. O cálculo do nível de significância α foi corrigido para múltiplos testes por
meio da correção de Bonferroni e baseado no gene com maior número de polimorfismos (10
SNPs), visto que este é um estudo de genes candidatos, e não de SNPs candidatos.
O grupo de casos foi composto por 182 indivíduos com FLP isolada (99 homens
e 83 mulheres) registrados na BBDCF do PCFB. Todos os casos foram examinados por
geneticista clínico utilizando o mesmo protocolo clínico. Os sujeitos foram recrutados entre
2009 e 2013 a partir de oito centros de pesquisa participantes em três diferentes regiões do
Brasil (região Sudeste: Campinas e São José do Rio Preto, região Sul: Curitiba, Joinville e
48
Porto Alegre; região Nordeste: Maceió, Fortaleza e Natal). Todos os pacientes foram
reavaliados durante a execução desse estudo para se garantir o diagnóstico de FLP isolada.
Conforme mencionado anteriormente, os casos foram classificados como fenda
labiopalatal isolada de acordo com a International Clearinghouse for Birth Defects and
Surveillance and Research. De acordo com esta classificação estão excluídos outros defeitos
major, tais como cardiopatia, defeitos de sistema nervoso central e anomalias de trato
urinário, frequentemente descritos em indivíduos com FLP não sindrômica (212, Anexo I)
O grupo controle foi recrutado de três diferentes regiões do Brasil (Sudeste, Sul
e Nordeste) e foi composto por 355 indivíduos fenotipicamente normais e não aparentados
(140 homens e 215 mulheres) e sem história familiar de fenda oral em três gerações.
2. Estimativa da estratificação da amostra
A fim de avaliar a presença de estratificação da amostra, o que poderia gerar
resultados de associação genética não confiáveis, foram genotipados 60 InDels (Small
insertions and deletions), sendo quarenta previamente validados como marcadores
informativos para ancestralidade (219). Por meio do software STRUCTURE v.2.3.4 (220,
221) foi determinada a ancestralidade genômica de cada sujeito, em um modelo assumindo
K = 3 populações com base na tri-origem híbrida da população brasileira. Além disso, o valor
de Fst (Fixation index) foi estimado por meio do programa ARLEQUIN v.3.5.1.3 (222). Esta
parte do estudo foi realizada em colaboração com os professores Andréa Kelly Campos
Ribeiro dos Santos e Sidney Emanuel Batista dos Santos do Laboratório de Genética Humana
e Médica da Universidade Federal do Pará.
49
3. Genotipagem
A genotipagem foi realizada com o sistema TaqMan®OpenArray™ Genotyping
(Applied Biosystems). Cinquenta lâminas foram customizadas para este estudo. Cada lâmina
apresentava seu código de barras e um nome próprio. Para cada 10 lâminas de OpenArray®,
havia um TaqMan®OpenArray® Genotyping Accessories Kit (Applied Biosystems) contendo
10 minipipetas de plástico lacradas com 5mL do líquido de imersão cada, 2 seringas contendo
10 mL de goma fotossensível para a selagem das lâminas e 10 cases de vidro. Fora desse Kit,
foram necessários 5 caixas de ponteiras específicas, um tubo
TaqMan®OpenArray™Genotyping Master Mix e 6 placas de 384 poços (Applied Biosystems).
Esse sitema exige uma série de etapas para obtenção de resultados apropriados para análise,
conforme descritas abaixo.
3.1.Etapas:
3.1.1. Seleção dos genes e seus polimorfismos
3.1.2. Desenho e síntese das lâminas
3.1.3. Coleta e extração das amostras
3.1.4. Verificação da concentração e pureza das amostras
3.1.5. Diluição das amostras
3.1.6. Realização dos experimentos utilizando a plataforma
TaqMan®OpenArray™ Genotyping
3.1.7. Análise dos Dados
50
3.1.1. Seleção dos genes e seus polimorfismos
A escolha dos genes foi baseada em dados da literatura científica: estudos de
associação, estudos de ligação, em modelos animais (74, 110, 125, 142, 145, 152, 173, 203,
223-227) e resultados anteriores do PCFB. Entre estes, destacam-se os genes TCEB3
(transcription elongation factor B3), FGF22 (fibroblast growth factor 22), KIF7 (kinesin
family member 7) e SOX7 [SRY (sex determining region Y)-box 7] detectados a partir a
técnica de SNP array em pacientes com FOT (202).
Para investigar os genes selecionados foi utilizado um programa que seleciona
SNPs que não necessariamente foram asssociados com a etiologia de FLP, mas que baseados
em susa posições conseguem rastrear o gene e, dessa maneira, é possível dizer se esse gene
está associado à FLP isolada.
A seleção dos SNPs para cada gene escolhido foi realizada por meio do programa
SNPbrowser 4.0 (Applied Biosystems). Foram selecionados 253 SNPtags em 39 genes
candidatos. Esses SNPs foram selecionados usando os dados disponíveis no banco de dados
HAPMAP (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando as populações CEU, CHB, JPT e
YRI como referência, e empregando o algoritmo pairwise tagging com os seguintes
parâmetros: minor allele frequency (MAF) de 5% e pairwise r2 de 80%. O programa
seleciona o número de SNPs necessários para abranger o gene e quais são eles. Estes SNPs
são utilizados em estudos de associação indireta, ou seja, o SNP que for associado com o
fenótipo provavelmente não é a variante funcional; mas pode estar em desequilíbrio de
ligação com a variante funcional patogênica relacionada ao fenótipo estudado. A lista de
51
genes selecionados e o número de SNPs genotipados por gene são mostrados na Tabela 2. O
Apêndice I mostra quais são os SNPs selecionados para cada gene.
Tabela 2. Lista de genes selecionados e o número de SNPs genotipados por gene.
Gene Localização cromossômica Nº de SNPs genotipados
TCEB3 1p36.11 4
LHX8 1p31.1 9
IRF6 1q32.2 8
WNT3A 1q42.13 12
SUMO 1 2q33.1 6
WNT5A 3p14.3 8
MSX1 4p16.2 2
SPRY1 4q28.1 4
Wnt8A 5q31.2 4
MSX2 5q35.2 4
PRSS35 6q14.2 10
TFAP2A 6p24.3 7
HOXA2 7p15.2 2
SHH 7q36.3 1
SOX7 8p23.1 7
PTCH1 9q22.3 10
FOXE1 9q22.33 2
VAX1 10q25.3 3
TBX10 11q13.2 6
WNT11 11q13.5 11
SPRY2 13q31.1 5
PAX9 14q13.3 13
BMP4 14q22.2 3
TGFB3 14q24.3 12
JAG2 14q32.33 6
GREM1 15q13.3 13
KIF7 15q26.1 5
DVL2 17p13.1 6
ERBB2 17q12 8
RARA 17q21.2 7
WNT9B 17q21.32 9
AXIN2 17q24.1 11
FGF22 19p13.3 2
TGFB1 19q13.2 7
BCL3 19q13.31 2
APOC2 19q13.32 3
CLPTM1 19q13.32 11
TBX1 22q11.21 8
TBX22 Xq21.1 2
52
Observação: O número mínimo de polimorfismos para cobrir o gene foi de 10 SNPs, entretanto alguns SNPs
foram selecionados a mais em alguns genes por determinação do desenho da lâmina.
3.1.2. Desenho e síntese das lâminas
Dentre os formatos de lâminas de OpenArray® disponíveis, foi escolhido o de
256 ensaios/12 amostras, contendo um ensaio por subarray. Todas as sequências de interesse
haviam sido desenhadas anteriormente pela empresa Applied Biosystems, constando do
banco de dados “Made to order”.
Após a verificação das sequências feita pela empresa, foram elaborados os
ensaios contendo um par de primers em comum e duas sondas, uma contendo a sequência
selvagem, sendo marcada com o fluoróforo VIC® e outra contendo a sequência mutante,
marcada com o fluoróforo FAM®.
As informações das lâminas foram obtidas fazendo o download no site:
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Product-
Types/download openarray-tpf-and-spf-plate-files.html, por meio do número de ordem de
serviço e Lot Number. Os 50 arquivos de extensão spf (SNP Plate File) foram utilizados
como referência de cada lâmina na realização da leitura no OpenArray™ NTCycler®.
Outros arquivos, contendo as informações gerais dos ensaios, como sequência
dos primers, das sondas, entre outras também estavam presentes na pasta de arquivo, sendo
um deles em pdf (portable document format) e outro na extensão .txt (text file).
53
3.1.3. Coleta e extração das amostras
Foram coletados de 10 a 20 ml de sangue periférico em tubos cônicos, contendo
1,0 ml de EDTA (etilenediaminotetracetato dissódico 2H2O) a 10% e pH 8,0 como anti-
coagulante. Para obtenção das amostras de DNA genômico foi utilizado o kit de extração
QIAamp® DNA Blood Midi (Qiagen) (Anexo IV). As amostras de DNA já extraídas pelo
método de extração fenol-clorofórmio (Araújo et al., 1996 – Anexo V) foram purificadas
com o kit MilliUni (Anexo VI).
3.1.4. Verificação da concentração e pureza das amostras
A reprodutibilidade, a acurácia e a precisão da técnica TaqMan®OpenArray™
estão diretamente relacionadas à integridade das amostras, à concentração correta e a pureza
das amostras. Para isso, utilizou-se o equipamento Epoch (BioTeck) para verificação da
pureza e concentração das amostras. A quantificação e a pureza do DNA foram obtidas por
leitura de absorbância na região do comprimento de onda ultravioleta (UV) de 260nm
(quantificação de ácidos nucléicos) e 280nm (quantificação de proteínas).
O grau de pureza do DNA foi avaliado com base na razão entre as leituras de
260nm e 280nm uma vez que valores iguais ou superiores a 1,8 para essa relação sugerem
que o DNA está essencialmente puro e passível de ser usado nessa técnica. A média da razão
230nm/280nm foi de 1,8 e da razão 260nm/280nm foi 2.0. Toda esta precisão foi necessária
porque para a realização do experimento eram necessárias 250 cópias haplóides do DNA do
54
indivíduo, e isto só é obtido caso as amostras apresentem as características acima
mencionadas.
3.1.5. Diluição das amostras
Todas as amostras apresentaram valores de concentração superior a 50ng/µL,
sendo necessária a realização de diluições simples. O volume final das diluições foi de 20µL.
Para cálculos, foi utilizada a fórmula de diluições simples C1.V1=C2.V2, onde C1 e V1 são
as concentrações e volumes iniciais, respectivamente. As variáveis C2 e V2 refere-se às
concentrações e volumes finais, que obedeceram aos valores de 50ng/µL e 20µL,
respectivamente. Após os cálculos, o volume inicial (V1) calculado foi transferido para tubos
e completado até o volume final de 20µL com água de injeção. Depois de diluídas as
amostras, foi verificada novamente a concentração destas. Sendo assim, todas as amostras
foram uniformemente quantificadas e diluídas a 50ng/µL.
3.1.6. Realização dos experimentos utilizando a plataforma TaqMan®OpenArray™
Genotyping
A realização dos ensaios de Openarray® é dividida em várias etapas (Protocolo
descrito no ANEXO VII):
3.1.6.1.Preparo das amostras
3.1.6.2.Distribuição das amostras nas lâminas de OpenArray®
3.1.6.3.Inserção da lâmina de OpenArray® na case
3.1.6.4.Selagem das cases
55
3.1.6.5.Termociclagem
3.1.6.6.Leitura das lâminas de OpenArray®
3.1.6.1.Preparo das amostras
Em uma placa de 384 poços, foram colocados 2,5 µL da amostra devidamente
quantificados e diluídos e 2,5 µL do TaqMan®OpenArray™ Master Mix em cada poço
previamente identificado de acordo com o estipulado pela empresa. Além disso, em cada
lâmina deveria ter controles negativos (NTC), que são amostras que contêm água ou tampão
e não devem amplificar (Figura 6). Em seguida, a placa foi selada com o adesivo de selagem
de alumínio (Thermo Scientific®) para evitar evaporação da mistura Amostra/Master Mix.
Figura 6. Ilustração da placa 384 poços de amostras e esquema de sua distribuição na lâmina
de OpenArray®.
56
3.1.6.2.Distribuição das amostras nas lâminas de OpenArray®
Foi utilizado um robô pipetador, o OpenArray®AccuFill™System (Applied
Biosystems), para a distribuição das amostras contidas na placa de 384 poços nas lâminas de
OpenArray™. No interior do OpenArray®AccuFill™System foi inserida a caixa de ponteiras
específicas e a placa de 384 poços contendo a mistura de Master Mix e das amostras. Em
seguida, as lâminas de OpenArray™ foram posicionadas no plate holder para serem
carregadas com o conteúdo da placa de 384 poços (Figura 7). Todas as operações realizadas
neste equipamento pipetador foram coordenadas utilizando o software
OpenArray®AccuFill™, presente em um computador interligado ao aparelho.
Figura 7. Foto do interior do equipamento OpenArray®AccuFill™System.
57
3.1.6.3.Inserção da lâmina de OpenArray® na case
Enquanto as lâminas de OpenArray® estavam sendo carregadas com as amostras,
as cases de vidro, usadas para colocar as lâminas de OpenArray®, foram preparadas (Figura
8). Para isso, adicionou-se o líquido de imersão o suficiente para cobrir a lâmina de
OpenArray® quando inserida na case. Esse passo permite a estabilização das reações na
lâmina e cria um ambiente ideal para a reação de amplificação, ligação e clivagem das sondas.
Figura 8. Foto das cases preparadas (a) e depois com as lâminas já inseridas na case (b).
3.1.6.4.Selagem das cases
Após a inserção das lâminas nas cases contendo o líquido de imersão, realizou-
se a etapa de selagem das cases (Figura 9), que consistiu na adição de uma goma fotossensível
58
na extremidade da lâmina para vedação. Posteriormente, já na estação de selagem, a goma
foi exposta por 2 minutos sobre ação de luz ultravioleta, solidificando-a.
Figura 9. Foto da selagem das cases na estação de selagem.
3.1.6.5.Termociclagem
As lâminas nas cases foram posicionadas no local demarcado no termociclador,
realizando a termociclagem destes no equipamento Dual Flat Block GeneAmp®PCR System
9700 (Applied BioSystems) (Figura 10). A termociclagem das lâminas foi realizada seguindo
o protocolo de 50 ciclos a 95ºC por 45 segundos para a desnaturação do DNA, seguido da
temperatura de 94ºC por 13 segundos para o anelamento dos primers e das sondas. Por
último, houve a queda da temperatura para 53ºC por 2 minutos e 14 segundos, ocorrendo a
extensão das novas fitas e a hidrólise das sondas TaqMan®. Essa termocilagem teve duração
de aproximadamente quatro horas.
59
Figura 10. (a) Foto do termociclador Dual Flat Block GeneAmp®PCR System 9700 (Applied
BioSystems). (b) Interior do termociclador com as lâminas.
3.1.6.6.Leitura das lâminas de OpenArray®.
Para a obtenção dos resultados, utilizou-se o OpenArray™NT Cycler (Applied
BioSystems) (Figura 11). Este equipamento é responsável pela captura da fluorescência das
sondas hidrolisadas. O aparato é coordenado por um computador interligado, utilizando o
programa OpenArray™SNP Genotyping Analisys (Applied BioSystems), no qual é possível
realizar a leitura de 3 lâminas por vez.
Um conjunto de câmeras CCD (Charge-coupled Device) posicionadas no interior
do equipamento capturou a fluorescência emitida nos ensaios e estas foram transformadas
em números de acordo com o comprimento de onda, que varia de acordo com o repórter
detectado (VIC® ou FAM®) e sua intensidade. No programa OpenArray™SNP Genotyping
Analisys, estes números passam por algoritmos e são convertidos em novos valores e em
60
clusters, separando os indivíduos em homozigotos selvagem, heterozigotos e homozigotos
mutantes. Os indivíduos homozigotos selvagens são representados pelo cluster de cor
vermelho, indicando que ambos os alelos do indivíduo tiveram a sonda contendo o repórter
VIC® pareada e hidrolisada. O cluster de cor verde representa os indivíduos heterozigotos,
que apresentaram um alelo selvagem e outro com a sequência mutante, apresentando, assim,
as sondas VIC® e FAM®, respectivamente, aneladas e hidrolisadas. Já o cluster de cor azul,
mostra os indivíduos com ambos os alelos mutantes, contendo apenas a hidrólise da sonda
FAM® no experimento.
Figura 11. a) Foto do equipemento OpenArray™NT Cycler acoplado a um computador; b)
Foto do interior do OpenArray™NT Cycler com as lâminas já posicionadas.
3.1.7. Análise dos dados
Para melhor análise, os arquivos gerados no OpenArray™NT Cycler (Applied
BioSystems) foram salvos e importados em outro programa com maior número de
ferramentas e opções para análise, o TaqMan®Genotyper Software (Applied BioSystems)
(Figura 12).
61
Figura 12. Visão geral do programa TaqMan®Genotyper.
4. Análise estatística
A análise da frequência (Minimum allele frequency - MAF) e do equilíbrio de
Hardy-Weinberg (HWE) foram realizadas pelo programa HAPLOVIEW. Foram aceitos para
a análise de associação apenas SNPs com MAF > 0,05 e HWE p-value > 0,05. Na análise do
desequilíbrio de ligação (Linkage disequilibrium-LD) foram aceitos SNPs com r2 < 0.8.
A análise de associação foi realizada por meio de regressão logística, utilizando
o programa PLINK (229). Os resultados foram ajustados para múltiplos testes pela correção
de Bonferroni. Posteriomente, os resultados foram confirmados utilizando uma segunda
análise por meio do FDR (False Discovery Rate). A análise de regressão stepwise foi
realizada utilizando o programa R (217).
62
5. Análise de predição de mutações in silico
Algoritmos computacionais foram utilizados para analisar os efeitos de mutações
de sentido trocado na estrutura ou na função da proteína codificada. A sequência de
aminoácidos testada foi obtida a partir do banco de dados do National Center for
Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Dois algoritmos foram
utilizados para prever o impacto destas substituições de aminoácidos sobre a atividade da
proteína: PolyPhen-2 (230) (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) e SIFT (231)
(http://sift.jcvi.org/).
63
RESULTADOS
1. Genotipagem
A taxa de sucesso de genotipagem para os 253 SNPs em 537 amostras foi em
media de 94.88% (+ 3.98%). Duzentos e trinta e dois SNPs estavam em equilíbrio de Hardy-
Weinberg na amostra. Os 21 SNPs que não estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg e os
12 SNPs que apresentaram MAF abaixo de 5% foram excluídos da análise de regressão
logística (Figura 13). A taxa de SNP com LD maior que 0,8 foi entre dois a quatro SNPs em
16 genes (Apêndice II).
Figura 13. A) Resultados da análise da frequência do menor alelo (MAF). B) Resultados da
análise de equilíbrio de Hardy-Weinberg.
64
Tendo em vista que os SNPs utilizados para avaliar a associação entre FLP
isolada e o gene TBX22 não estavam em equilibrio de Hardy-Weinberg, este foi excluído da
análise de associação.
2. Estimativa da estratificação da amostra
As contribuições médias de descendência foram estimadas em 65,7% Europeia,
16,6% Africana, e 17,7% Indígena no grupo controle. Já no grupo de casos, foram 77,2%
Europeia, 12,5% Africana e 10,3% Indígena. Além disso, o valor de Fst foi de 0,00483. Desse
modo, não houve diferenças estatísticas significativas nas proporções de ancestralidade entre
os grupos (Figura 14), permitindo a realização de estudo de associação do tipo caso-controle.
65
Figura 14. Gráficos mostrando a ancestralidade de cada indivíduo no grupo de casos com
FLP (a) e no grupo controle (b).
66
3. Resultados de associação genética
Foi analisada a associação entre 251 SNPs em 38 genes e FLP isolada (Figura
15). Depois dos dados serem ajustados para múltiplos testes pela correção de Bonferroni e
pela segunda correção de FDR, foi encontrada associação entre 16 genes e FLP isolada
(Tabela 3).
Figura 15. Resultados da análise de regressão logística, onde cada ponto representa um SNP.
Os SNPs acima da linha cheia (-ln(p-value) > 3,00), indicam os SNPs com associação
genética estatisticamente significativa para o fenótipo. Gráfico A - baseado na análise por
Bonferroni, e gráfico B - baseado na análise por FDR.
67
Tabela 3. Resultados da análise de regressão logistica e característica dos SNPs associados
com FLP isolada nesse estudo.
SNP Cromossomo Gene Função do SNP* Alelo P
corrigido
OR (IC) MAF
rs2235541 1 TCEB3 Sentido trocado T 0,032 1,65 (1,15-2,37) 0,135
rs3775261 4 MSX1 Intron A 0,009 1,48 (1,13 -1,94) 0,348
rs300566 4 SPRY1 Intron A 0,017 1,59 (1,14 – 2,21) 0,191
rs4868442 5 MSX2 Intron A 0,02 0,69 (0,53-0,89) 0,411
rs4706180 6 PRSS35 Intron C 0,032 1,55 (1,16 -2,08) 0,245
rs512140 6 PRSS35 Intron A 0,035 0,64 (0,48 -0,86) 0,267
rs537112 6 TFAP2A Intron T 0,015 1,72 (1,22 – 2,43) 0,142
rs533558 6 TFAP2A Intron G 0,001 1,72 (1,32 – 2,25) 0,482
rs303048 6 TFAP2A Intron T 0,006 1,59 (1,21 – 2,09) 0,296
rs1675414 6 TFAP2A Intron C 0,042 0,68 (0,52 – 0,9) 0,363
rs1233556 7 SHH Intron T 0,047 1,37 (1- 1,87) 0,188
rs10787760 10 VAX1 Variante 3’UTR G 0,011 1,5 (1,14 -1,97) 0,364
rs7086344 10 VAX1 Variante 3’UTR T 0 1,9 (1,38-2,62) 0,19
rs6585429 10 VAX1 Intron A 0,013 1,52 (1,14- 2,02) 0,271
rs3758938 11 TBX10 Sentido trocado G 0,015 1,57 (1,17-2,1) 0,29
rs7936750 11 WNT11 Intron G 0,018 2,43 (1,4 -4,21) 0,053
rs1955734 14 PAX9 Intron T 0,001 1,68 (1,31-2,17) 0,48
rs17563 14 BMP4 Sentido trocado C 0,016 0,7 (0,54-0,9) 0,456
rs11621316 14 JAG2 Intron G 0,003 0,62 (0,48-0,81) 0,462
rs4932238 15 KIF7 Intron C 0,007 1,76 (1,24-2,48) 0,165
rs4932240 15 KIF7 Intron T 0,029 1,59 (1,14-2,2) 0,191
rs11655966 17 AXIN2 Intron T 0,03 1,5 (1,15-1,96) 0,331
rs2074222 17 DVL2 Intron G 0,002 0,48 (0,33-0,71) 0,406
rs222850 17 DVL2 Intron C 0,016 0,57 (0,4-0,82) 0,316
Legenda: *De acordo com Single Nucleotide Polymorphism database (dbSNP), MAF:
frequência do menor alelo de acordo com os controles, OR = Odds ratio, IC = intervalo de
confiança, 3’UTR= 3’ Untranslated region.
68
Apesar de os SNPs selecionados terem como objetivo o rastreamento dos genes
selecionados para esse estudo, todos os SNPs presentes em regiões intronicas foram
pesquisados em bases de dados (dbSNP) em busca de possível relação causal com FLP
isolada e nenhuma relação foi encontrada.
A análise de regressão stepwise mostrou que 11 SNPs em 11 genes (PAX9, MSX1,
JAG2, WNT11, DVL2, VAX1, AXIN2, PRSS35, MSX2, KIF7 e TFAP2A) que foram
associados nesse estudo correspondem, juntos, a 15,5% dos fatores envolvidos na etiologia
de FLP isolada nessa amostra. Cinco genes (BMP4, SHH, SPRY1, TBX10 e TCEB3)
apresentaram uma baixa porcentagem nesta análise e não estão representados na Figura 16.
Figura 16. Resultado da análise de regressão stepwise.
Não foi encontrada associação entre FLP isolada e 22 genes (APOC2, BCL3,
CLPTM1, ERBB2, FGF22, FOXE1, HOXA2, IRF6, LHX8, GREM1, PTCH1, RARA, SOX7,
SPRY2, SUMO1, TBX1, TGFB1, TGFB3, WNT3A, WNT5A, WNT8A e WNT9B).
69
4. Análise de predição de mutações in silico
Três dos SNPs associados com FLP neste estudo são mutações de sentido
trocado. Um algoritmo computacional foi, portanto, aplicado para avaliar seus efeitos sobre
a função da proteína. Estes resultados são apresentados na Tabela 4.
Tabela 4. Resultados dos algoritmos PolyPhen-2 e SIFT para três SNPs associados à FLP na
presente amostra.
SNP (Gene) Efeito na
proteina
PolyPhen-2 SIFT
rs17563
(BMP4 )
p.V52A Benigno
(Escore=0.002, sensibilidade: 0.99;
especificidade: 0.30)
Tolerada
(Escore=0.42)
rs3758938
(TBX10)
p.K101T Provavelmente Prejudicial
(Escore=0.999; sensibilidade: 0.14;
especificidade: 0.99)
Prejudicial
(Escore=0.01)
rs2235541
(TCEB3)
p.T145M Provavelmente Prejudicial
(Escore=0.968; sensibilidade: 0.77;
especificificidade: 0.95)
Prejudicial
(Escore=0.03)
70
71
DISCUSSÃO
Embora as FLP isoladas estejam entre os defeitos congênitos mais comuns, a
complexidade dos eventos genéticos e ambientais associados à sua patogênese representa
um enorme desafio para a caracterização etiológica deste grupo de doenças. Identificar as
alterações genéticas pode ter um impacto no aconselhamento genético e melhorar a
compreensão sobre o desenvolvimento craniofacial. Certas características deste estudo
devem ser destacadas: a) a homogeneidade fenotípica dos casos; b) a ausência de fendas
orais em três gerações no grupo controle; e c) a não estratificação da amostra estudada, o
que é importante quando se analisa uma amostra miscigenada, tal como a população
brasileira.
Em vários estudos anteriores, foi investigada a associação de genes com fenda
de lábio com ou sem fenda de palato isolada, analisando FL junto com FLP no mesmo grupo.
Há evidências que sugerem que FL e FLP podem ser entidades separadas, com diferentes
etiologias e patogênese (232-234). No presente estudo, a amostra apresentou maior
homogeneidade fenotípica, uma vez que foram incluídos apenas pacientes que apresentaram
FLP isolada.
A estratificação da população é uma grande preocupação em estudos de
associação de populações miscigenadas (235). Em estudos de associação é necessário avaliar
o nível de estratificação populacional e nesse estudo descobriu-se que os dois grupos tinham
estruturas genéticas semelhantes, o que permitiu realizar uma análise de associação genética
imparcial.
72
Entre os 39 genes analisados, 16 foram associados com FLP isolada, incluindo
dois novos genes, TCEB3 e KIF7, ambos propostos recentemente (202). É importante
ressaltar que a análise de regressão stepwise revelou que 15,5% da etiologia de FLP isolada
poderia ser explicada por 11 genes: VAX1, PRSS35, WNT11, AXIN2, DVL2, PAX9, MSX1,
MSX2, JAG2, TFAP2A e KIF7. Estes dados apoiam a conclusão de que parte da contribuição
genética em FLP isolada na população brasileira, que é claramente miscigenada, é diferente
de estudos anteriores (38). Embora 84,5% da etiologia do fenótipo global de FLP permaneça
incerto, esta pode, provavelmente, ser atribuída a fatores ambientais ou a genes
desconhecidos adicionais ou, ainda, a interações desses dois últimos.
O gene VAX1 codifica o fator de transcrição homeodominio ventral anterior
homeobox 1. A evidência a partir de modelos animais sugerem que Vax1 tem funções
biológicas na região craniofacial (236). Três SNPs (rs10787760*G, rs7086344*T e
rs6585429*A) na região 3'UTR do gene VAX1 foram associados com um risco aumentado
de FLP isolada nesta amostra da população brasileira, o que está de acordo com estudos
anteriores (145,147, 237).
Dois SNPs na região intrônica do gene PRSS35 foram associados com um risco
aumentado de ocorrência de FLP isolada (rs512140 e rs4706180). Letra et al. (203) também
relataram uma associação entre o gene PRSS35 SNPs (rs7753918, rs1171114 e rs512140)
com fenda de lábio com ou sem fenda de palato em um estudo de caso-controle que incluiu
famílias brasileiras, chinesas e caucasianas. Além disso, o gene Prss35 é expresso na cabeça
e no palato de embriões de camundongos durante as fases críticas da palatogênese (203).
A via de sinalização WNT/β-catenina é um componente chave no
desenvolvimento da cabeça e da face em embriões de camundongos (238, 239). Um SNP
73
(rs7936750) em uma região intrônica de WNT11 (wingless-type MMTV integration site
family, member 11) foi associado a um risco aumentado de FLP isolada. Outros genes WNT
(WNT3, WNT3A - wingless-type MMTV integration site family, member 3A, WNT5A -
wingless-type MMTV integration site family, member 5A, WNT9A - wingless-type MMTV
integration site family, member 9A, WNT11) têm sido associados com fenda de lábio com
ou sem fenda de palato isolada em várias populações (173), apoiando ainda mais a função
dos genes da família WNT na etiologia das fendas orais.
Por sua vez, o gene AXIN2 regula negativamente a via de sinalização WNT,
participando na degradação de β-catenina na ausência de ligantes WNT. Esta proteína
desempenha uma função crítica na condução de células ao seu destino durante a morfogênese
craniofacial (240). Além disso, um estudo anterior relatou uma associação de mutações
germinativas em AXIN2 com agenesia dentária familiar e esporádica (241). Axin2 mRNA e
expressão da proteína foi detectada em toda a palatogênese de camundogos (242). Neste
estudo, encontrou-se um SNP (rs11655966) na região intrônica do gene AXIN2 associada
com um risco aumentado de FLP isolada. Letra et al. (242) também observaram uma
associação entre este SNP e fenda de lábio com ou sem fenda de palato. SNPs em AXIN2
também têm sido associados com fenda de lábio com ou sem fenda de palato em outros
estudos de caso-controle ( 242, 243).
O gene DVL2 (dishevelled segment polarity protein 2) codifica uma das três
isoformas DVL que desempenham um papel crucial na sinalização Wnt/β-catenina. No
presente estudo, dois SNPs (rs2074222 e rs222850) em regiões intrônicas do gene DVL2
foram associados com um risco aumentado de FLP isolada. Mostowska et al. (244) também
encontraram três variantes DVL2 (rs35594616, rs2074222, e rs222836) que foram
74
significativamente associadas ao aumento do risco de fenda de lábio com ou sem fenda de
palato.
Os genes Paired box (PAX) codificam fatores de transcrição específicos de
ligação ao DNA que desempenham funções críticas durante o desenvolvimento embrionário.
Vários estudos têm encontrado associação entre os genes PAX e fenda de lábio com ou sem
fenda de palato em animais. Foi encontrado na presente amostra um SNP (rs1955734) na
região intrônica do gene PAX9 que foi associado com um risco aumentado de FLP isolada.
Mutações no gene PAX9 em seres humanos causam hipodontia molar, freqüentemente em
associação com fenda de lábio com ou sem fenda de palato (154). Ichikawa et al. (225)
encontraram uma mutação de sentido trocado heterozigótica em um exon do gene PAX9 em
dois irmãos japoneses com fenda de lábio com ou sem fenda de palato e sua mãe
fenotipicamente normal.
O gene TBX10 é um membro da família de genes T-box que codificam fatores
de transcrição de ligação ao DNA. Os membros desta família são conhecidos por
desempenharem funções essenciais nas estruturas da mesoderme (245). Além disso, este
gene tem sido fortemente associado com o gene TBX22, um gene conhecido por causar
apenas FP (125,128). Encontramos uma variante de sentido trocado, SNP rs3758938 no gene
TBX10, associada com um risco aumentado de FLP isolada. Os algoritimos computacionais
PolyPhen-2 e SIFT indicaram um efeito prejudicial deste SNP. Esses dados corroboram a
hipótese de uma associação entre este gene e FLP isolada.
Os genes muscle segment homeobox 1 e 2 (MSX1 e MSX2) codificam fatores de
transcrição que exercem funções críticas no desenvolvimento craniofacial e surgiram como
fortes genes candidatos para fenda de lábio com ou sem fenda de palato por meio de estudos
75
de associação em várias populações (38,125,152,246). O presente estudo detectou
associações entre MSX1 SNP rs3775261 e um risco aumentado de FLP isolada; e MSX2 SNP
rs4868442 e uma diminuição do risco de FLP isolada nesta amostra. O sequenciamento
completo do gene MSX1 em seres humanos revelou várias novas mutações que parecem
contribuir para cerca de 2% dos casos de fenda de lábio com ou sem fenda de palato isolada
(143,247). Este resultado é semelhante ao efeito encontrado neste estudo para o SNP
rs3775261, o qual contribui em 2,2% do fenótipo de FLP isolada. Camundongos Msx1
exibem FP e anomalias craniofaciais e dentárias, enquanto que o lábio e outras estruturas
orais não se desenvolvem em camundongos duplo nocaute Msx1/Msx2 (248).
O gene JAG2 codifica um ligando para a família de receptores transmembranares
Notch, que estão envolvidos na sinalização de um mecanismo essencial necessário para o
desenvolvimento normal do palato (149). Um SNP (rs11621316) em uma região intrônica
do gene JAG2 foi associado a um risco aumentado de FLP isolada. Outros estudos de
associação indicaramm envolvimento do gene JAG2 em fenda de lábio com ou sem fenda
de palato (125). Também tem sido demonstrado que a função dos genes IRF6 e JAG2 estão
em vias moleculares convergentes durante a diferenciação epitelial oral e que esta
sinalização integrada é essencial para o controle de adesão palatina e a competência de sua
fusão (151).
O gene BMP4 é um membro da proteína morfogenética óssea (BMP) e da família
TGFB, ambas as quais cumprem papéis essenciais no desenvolvimento embrionário.
Evidências experimentais indicaram que o gene Bmp4 estava envolvido na etiologia de fenda
de lábio com ou sem fenda de palato em camundongos (83). Além disso, foi encontrada uma
associação entre o gene BMP4 e fenda de lábio com ou sem fenda de palato em seres
76
humanos de diferentes grupos étnicos (249, 250, 251, 252). Um estudo anterior da população
brasileira encontrou uma associação entre fenda de lábio com ou sem fenda de palato e o
SNP rs17563 no gene BMP4, bem como observou um efeito protetor contra a ocorrência de
fenda de lábio com ou sem fenda de palato conferida pelo alelo C desta variante (253). No
presente estudo, esta associação foi confirmada em uma amostra maior. Além disso, os testes
PolyPhen-2 e SIFT indicaram o caráter benigno e tolerante deste SNP.
O gene TFAP2A é expresso em estruturas craniofaciais (121). Shi et al. (201)
verificaram que uma grande deleção incluiu o gene TFAP2A em um paciente com FL.
Associações entre quatro SNPs (rs537112, rs533558, rs303048 e rs1675414) no gene
TFAP2A e FLP isolada foram detectadas no presente estudo. Além disso, as mutações no
gene TFAP2A têm sido relatadas na síndrome brânquio-óculo-facial, que inclui fenda oral
como parte do fenótipo (123).
O gene SHH é o principal membro da família hedgehog; esta regula eventos
fundamentais de desenvolvimento durante a embriogênese e tem sido associada com o
desenvolvimento anormal dos dentes e orofacial. Além disso, o gene SHH é expresso na
ectoderme dos processos frontonasais e maxilares (254). Nesta amostra, o SHH SNP
rs1233556 foi associado a um risco aumentado de FLP isolada. Mutações no gene SHH
resultam em holoprosencefalia, demonstrando a função essencial deste fator de crescimento
no desenvolvimento da face (100).
Um SNP (rs300566) numa região intrônica do gene SPRY1 foi associado a um
risco aumentado de FLP isolada nesta pesquisa. Nos vertebrados, existem quatro proteínas
Sprouty que tanto inibem ou potencializam a sinalização do receptor de tirosina quinase de
uma forma específica. Durante o desenvolvimento dos vertebrados, proteínas Spry exibem
77
padrões de sobreposição de expressão, particularmente em estruturas craniofaciais e
membros. Estudos de genes alvo revelaram ambas funções distintas e redundantes para
proteínas Spry durante o desenvolvimento (255).
O gene KIF7 (rs4932238, rs4932240) também foi associado a um risco
aumentado de FLP isolada neste estudo. Esta é a primeira vez que este gene é associado com
a o fenótipo de FLP isolada. Putoux et al. (256) encontraram mutações no gene KIF7 em
pacientes com síndrome acrocallosal. Esta síndrome é uma doença recessiva rara
caracterizada pela agenesia ou hipoplasia do corpo caloso, dismorfismo craniofacial,
duplicação do hálux, polidactilia pós-axial e retardo mental grave. O gene KIF7 é um
componente chave da via SHH e codifica uma proteína associada a cílios que pertence à
família cinesina que desempenha um papel importante na transdução de sinal de SHH (257).
O presente estudo é o primeiro a encontrar uma associação entre o gene TCEB3
(mutação de sentido trocado - rs2235541) com um risco aumentado de FLP isolada. Os
resultados dos teste in silico PolyPhen-2 e SIFT mostraram o carácter prejudicial desta
mutação, fundamentando uma associação entre este gene e FLP isolada. Esta potencial
associação foi descrita inicialmente baseada em um estudo do número de cópias em
indivíduos com fenda de lábio com ou sem fenda de palato (202). Este gene codifica uma
proteína de elongação tipo A, que consiste em uma subunidade do complexo de fator de
transcrição B dependente de RNA polimerase II. Essa proteína forma um complexo estável
com as proteínas de elongação do tipo B e C (subunidades de regulação) necessário para a
correta atividade de elongação durante a transcrição (258). Estudos protéicos evidenciam a
interação entre as proteínas de elongação B e C com domínios de ligação do tipo SPRY
(259).
78
A maioria dos genes associados com FLP isolada neste estudo possuem vias
correlacionadas. Os fatores de crescimento envolvidos no desenvolvimento orofacial
pertencem principalmente a quatro famílias: FGF, HH, TGF-β, que inclui as BMPs e
activinas, e WNT (Figura 17).
Figura 17. Esquema de articulação entre vários genes envolvidos na etiologia de FLP.
A expressão da via WNT muitas vezes coincide com a expressão da via HH e
ligantes da família TGF-β (107). Os ligantes WNT atuam através de receptores específicos
da superfície celular (Frizzled 1-10) para ativar uma via de transdução de sinal intracelular
que, em seguida, ativa a proteína citoplasmática Disheveled (DVL) (106). Após estimulação
de WNT, DVL recruta AXIN (axis inhibition protein) para a membrana plasmática, onde
DVL promove a fosforilação do co-receptor LRP6 (low density lipoprotein receptor-related
79
protein 6) (260). Esta última molécula é um inibidor competitivo direto de GSK3β (glycogen
synthase kinase 3 beta), que permite β-catenina acumular-se e operar como uma chave de
transcrição no núcleo (261). O Knockdown de Dvl1 [dishevelled, dsh homolog 1
(Drosophila)], Dvl2 [dishevelled 2, dsh homolog (Drosophila)], ou Dvl3 [dishevelled 3, dsh
homolog (Drosophila)] pode atenuar a capacidade de Wnt3a para estimular a via Wnt/β-
catenina (262). A deficiência de Wnt5a leva a fenda de palato secundário completo.
A expressão alterada dos genes Bmp4, Shh e Msx1 foi observada no palato de
camundongos Wnt5a mutantes (263). O WNT3 é o ligante que se liga a LRP6 para controlar
o desenvolvimento de lábio. Por sua vez, o LRP6 é um mediador chave necessária para ativar
a via canônica Wnt/β-catenina (238). Os camundongos deficientes de Lrp6 exibem FLP e
defeitos mandibulares (238, 264). Mais importante, foi sugerido que a sub-regulação local
de ambos os genes Msx1e Msx2 no mesênquima do primórdio orofacial poderia ser uma das
principais causas de FLP em mutantes Lrp6 (238).
As interações entre BMPs e MSX1 são importantes no desenvolvimento
orofacial, sendo que o gene Msx1 é necessário para a expressão dos genes Bmp4 e Bmp2 no
mesênquima palatal e para a expressão do gene Shh no epitélio da borda média em
camundogos (30,83,265). A expressão transgênica de Bmp4 no mesênquima palatal do
comundongo Msx1-/- mutante apresenta o fenótipo de FP. A ligação entre Bmp4 e Msx1 é
particularmente notável na medida em que os camundongos que não têm Msx1 exibem FP e
anomalias crânio faciais e no desenvolvimento dos dentes (266).
Deve-se observar que todo estudo de associação genética tem limitações, pois
utiliza apenas variantes comuns (frequência acima de 5%) e portanto não detecta variantes
raras (frequência entre 0,1% a 3%) (267). Desse modo, os genes que não foram associados
80
à FLP podem posuir variantes raras que estejam associadas com o fenótipo de FLP isolada.
Uma alternativa nesses casos é o uso de outras técnicas com o sequenciamento de alto
desempenho (Next Generation Sequencing).
Vários genes comumente associados com fendas orais, tais como IRF6, não
foram associados, neste estudo, com FLP isolada. O gene IRF6 tem sido frequentemente
estudado e mostrou-se associado com fenda oral (117,268,269). Zucchero et al. (119)
sugeriram que IRF6 poderia contribuir com 12% dos casos de fendas orais, incluindo todos
os tipos. Estes estudos anteriores encontraram associação entre o polimorfismo p.V274I
(rs2235371) e fenda de lábio com ou sem fenda de palato (269,270). O programa
SNPbrowser 4.0 (Applied Biosystems) selecionou os SNPs para rastreamento do gene
baseado em segregação, o que é fundamental em estudo do tipo caso-controle. Por este
método a variante rs2235371 do gene IRF6 analisada anteriormente por Letra et al. (2012)
e Li et al. (2012) não foi incluída para análise.
Além disso, a ausência de uma associação entre fendas orais e o gene IRF6 na
amostra da presente pesquisa pode ser devido ao fato de que foram incluídos nesse estudo
especificamente casos com FLP isolada, em contraste com outros estudos que normalmente
agrupam vários tipos de fendas orais. Outra explicação é que as interações entre fatores
genéticos e ambientais podem afetar várias populações de forma diferente. É provável que
o gene IRF6 não seja um forte fator de risco para FLP na população brasileira, ou pode fazer
contribuições específicas para um outro tipo de fenda oral, como por exemplo, FL (271).
Os resultados deste estudo sugerem que a associação de variantes de sequência
de 16 genes podem interromper a formação e/ou de fusão dos processos faciais e predispor
indivíduos a FLP isolada. A maioria dos SNPs associados com FLP isolada neste estudo
81
estão localizados em regiões intrônicas dos genes estudados. Uma vez que estes SNPs não
alteram a sequência da proteína, o desequilíbrio de ligação com uma mutação funcional ou
alterações traducionais devem ser considerados, dado que ambas estas possibilidades iriam
afetar a função proteica. Como este foi um estudo de associação indireto, os SNPs associados
apontam regiões onde podem haver variantes causais, ou seja, são hotspots, cujos genes
devem ser melhores investigados para encontrá-las.
Nesse estudo foi possível determinar alguns genes que estão associados à
etiologia de FLP isolada na população brasiliera por meio de SNPs. Deve-se destacar as
novas associações encontradas entre os genes KIF7 e TCEB3 e o risco de FLP isolada. As
novas abordagens tecnológicas utilizando o mesmo desenho da amostra deverão ajudar a
identificar as variantes de susceptibilidade etiológica.
82
83
CONCLUSÕES
Nesta amostra conclui-se que:
1. Os genes MSX1, SPRY1, MSX2, PRSS35, TFAP2A, SHH, VAX1, TBX10, WNT11,
PAX9, BMP4, JAG2, AXIN2, DVL2, KIF7 e TCBE3 foram associados à FLP isolada.
2. Os genes APOC2, BCL3, CLPTM1, ERBB2, FGF22, FOXE1, HOXA2, IRF6, LHX8,
GREM1, PTCH1, RARA, SOX7, SPRY2, SUMO1, TBX1, TGFB1, TGFB3, WNT3A,
WNT5A, WNT8A, WNT9B não foram associados à FLP isolada.
3. Não foi possível investigar a associação entre o gene TBX22 e FLP isolada.
84
85
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120
121
APÊNDICES
APÊNDICE I. Genes e SNPs selecionados para serem genotipados na amostra.
Genes Localização nº de SNPs Identificação
LHX8 1p31.1 9
rs11162567
rs1526505 rs729833
rs12041465 rs1852348 rs12138223 rs12723906 rs12409145 rs941032
IRF6 1q32.3-q41 8
rs2073485 rs674433
rs2013196 rs7552506 rs2236908 rs2073486 rs2073487 rs3753518
TCEB3 1p36.1 5
rs550850 rs2235541 rs2076345 rs2076346 rs2294495
WNT3A 1q42 11
rs697761 rs708113 rs708121
rs3094912 rs708122
rs10916258 rs3121309 rs3121310 rs13374948 rs766972 rs752107
SUMO 1 2q33 6
rs6717044 rs3769817 rs7599810 rs13000658 rs6709162 rs3754931
122
WNT5A 3p21-p14 8
rs590386 rs10865994 rs1829556 rs7622120 rs11918967 rs472631 rs815541 rs566926
MSX1 4p16.2 2 rs3775261
rs12532
SPRY1 4q28.1 3
rs300566
rs300572 rs300574
WNT8A 5q31 4
rs10041787 rs10036244 rs2040862 rs6596422
MSX2 5q35,2 4
rs4868442 rs4868443 rs4242182 rs2381939
TFAP2A 6p24 7
rs537112 rs533558 rs303048 rs303050
rs3798694 rs1675414 rs654351
PRSS35 6q14.2 10
rs592911 rs1884951 rs579599
rs1171114 rs6903293 rs4706180 rs512140 rs535787 rs504593 rs548692
HOXA2 7p15.2
2
rs706017 rs2428431
SHH 7q36 1 rs1233556
SOX7 8p23.1 7
rs11250064 rs13261103 rs1139843 rs4841432 rs10100209
123
rs7009920 rs6995692
FOXE1 9q22 2 rs1443435 rs10984009
PTCH1 9q22.3 9
rs357563 rs16909859 rs16909865 rs357564
rs2066836 rs574688
rs2297087 rs473902
rs10512249
VAX1 10q26.1 3
rs7086344 rs10787760 rs6585429
TBX10 11q13.2 6
rs3765088 rs11227871 rs2514022 rs3758938 rs2514027 rs1993839
WNT11 11q13.5 11
rs598143 rs12277860 rs17749202 rs7936750 rs10899175 rs1533763 rs882151
rs3781730 rs4944092 rs689095 rs608747
SPRY2 13q31.1 5
rs1928573 rs4728
rs7329343 rs504122 rs563692
PAX9 14q13.3 13
rs2236007 rs2295218 rs12893199 rs17104914 rs1955734 rs17104923 rs8004560 rs17104928 rs17176643 rs11156926
124
rs10131337 rs7144276 rs11847165
TGFB3 14q24 13
rs7156293 rs3917210 rs2284791 rs4252340 rs3917187 rs3917180 rs4252328 rs2268625 rs2284792 rs3917158 rs2268626 rs3917148 rs11466414
BMP4 14q22-q23 3
rs17563 rs2071047 rs762642
JAG2 14q32 6
rs2272591 rs9972231 rs2293806 rs3784240 rs2072673 rs11621316
GREM1 15q13.3 12
rs1528734 rs7497354 rs9920024 rs10519738 rs16973303 rs11854391 rs12915554 rs7162202 rs3743103
rs10318 rs1129456 rs7176378
KIF7 15q26.1 5
rs1054435 rs12914042 rs4932238 rs9672286 rs4932240
DVL2 17p13.1 6
rs2074222 rs222837 rs222836
rs2074216 rs222835 rs222850
125
RARA 17q21 9
rs7217852 rs9904270 rs12946680 rs2715554 rs2715553 rs482284
rs9894845 rs4890109 rs2229773
ERBB2 17q12
8
rs2517955 rs2517956 rs1565923 rs2952155 rs4252612 rs4252632 rs2952156 rs4252665
WNT9B 17q21 9
rs4968280 rs12150651 rs1443311 rs12601196 rs2165846 rs12952746 rs6504591 rs11079740 rs1530364
AXIN2 17q23-q24 11
rs11868547 rs7591
rs7224837 rs7210356 rs11655966 rs4128941 rs4791171 rs11079571 rs3923087 rs3923086 rs2240308
FGF22 19p13.3 2 rs7246140 rs3787002
TGFB1 19q13.1 7
rs8179181 rs8110090 rs11466334 rs1800472 rs4803455 rs2241715 rs1800469
APOC2 19q13.2 3 rs5120 rs5127
rs10421404
126
CLPTM1 19q13.3 11
rs2239375 rs204905 rs760114
rs11668758 rs16979595 rs204478
rs2075620 rs7257916 rs8111069 rs204468 rs875255
BCL3 19q13.1-q13.2 2 rs8100239 rs8103315
TBX1 22q11.21 8
rs8137465 rs1978060 rs2301558 rs2238777 rs2238778 rs737869
rs2073762 rs4819522
TBX22 Xq21.1 2 rs1429591
rs195293
127
APÊNDICE II. Estimativa dos valores de desequilíbrio de ligação entre os SNPs em termos
de r2 para os genes (I-BCL3, II-FGF22, III-HOXA2, IV-MSX1, V-APOC2, VI-BMP4, VII-
SPRY1, VIII-VAX1, IX-MSX2, X-WNT8A, XI-KIF7, XII-SPRY2, XIII-TCEB3, XIV-JAG2,
XV-SUMO1, XVI-TBX10, XVII-SOX7, XVIII-TFAP2A, XIX-TGFB1, XX-TBX1, XXI-
ERBB2, XXII-IRF6, XXIII-LHX8, XXIV-PTCH1, XXV-WNT5A, XXVI-RARA, XXVII-
WNT9B, XXVIII-PRSS35, XXIX-AXIN2, XXX-CLPTM1, XXXI- GREM1, XXXII-PAX9,
XXXIII-TGFB3, XXXIV-WNT3A, XXXV-WNT3A, XXXVI-DVL2, XXXVII-TBX22).
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
ANEXOS
ANEXO I. Nomenclatura e definições clínicas adotadas pela International Clearinghouse
for Birth Defects and Surveillance and Research para a descrição e classificação das fendas
orofaciais (ICBDSR 2007).
Distúrbio congênito: compreende qualquer anormalidade da estrutura e/ou função do
corpo, incluindo o metabolismo, que se faz presente a partir do nascimento. Pode,
portanto, ser óbvio no recém-nascido, manifestar-se na infância ou em idades mais
avançadas.
Defeito major (grave): qualquer defeito morfológico e/ou funcional com impacto
relevante sobre a saúde, podendo levar à morte ou incapacidade permanente.
Defeito isolado: qualquer caso com apenas um defeito grave ou Seqüência. Exemplo:
fenda labial bilateral + deformidades nasais.
Sequência: qualquer caso com dois ou mais defeitos que tem um defeito primário
(grave) em comum. Esses defeitos devem fazer parte de uma cascata de eventos
embriológicos ou estar patogenicamente relacionados. De acordo com essa definição,
uma seqüência é um defeito isolado. Exemplo: Sequência de Pierre Robin, dois ou mais
defeitos cardíacos.
Defeitos não relacionados: aqueles que ocorrem em diferentes órgãos, sistemas ou
locais do corpo e não fazem parte de uma cascata de eventos embriológicos, não são
patogenicamente relacionados ou não têm um defeito primário grave em comum.
Exemplo: fenda labiopalatal bilateral + anoftalmia. O quadro clínico pode ser
142
reconhecido como uma “síndrome” quando um único fator etiológico é demonstrado ou
considerado muito suspeito pela comunidade científica.
Síndrome: qualquer combinação de dois ou mais defeitos graves devida a um fator
etiológico único já demonstrado (ex.: anomalia cromossômica) ou fortemente suspeito
com base em sua recorrência em determinado número de casos (ex.: Síndrome de Catel-
Manzke).
Síndrome conhecida: situação em que uma denominação específica pode ser atribuída
ao quadro clínico e este pode ser codificado usando a CID 10 e/ou OMIM. Quando uma
anormalidade cromossômica é identificada, a fórmula do cariótipo deve ser usada como
código.
Defeitos múltiplos: Qualquer combinação de dois ou mais defeitos graves para os quais
nenhum fator etiológico foi demonstrado ou suspeito.
Defeitos aditivos randômicos: Qualquer combinação de dois ou mais defeitos graves
com clara evidência de fatores etiológicos distintos.
CID 10: Classificação Internacional de Doenças, 10ª revisão; OMIM: On-line Mendelian
Inheritance In Man.
143
ANEXO II. Parecer do Comitê de Ética
144
145
146
ANEXO III. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Responsáveis: Milena Simioni, Vera Lúcia Gil da Silva Lopes
Eu entendo que eu ou meu filho(a) fui(foi) convidado(a) a participar do projeto
de pesquisa intitulado “Uso da técnica de SNP array para detecção de variações no número
de cópias do DNA (copy number variation, CNV) em defeitos congênitos de herança
complexa: as fendas orais como modelo”, envolvendo pessoas com fenda labial com ou sem
fenda palatal e pessoas com fenda palatal isolada. O objetivo geral deste estudo é de
contribuir para o entendimento e caracterização de como funcionam os genes envolvidos na
determinação das fendas labiopalatais. Assim, neste estudo pretende-se investigar alterações
no material genético em regiões já descritas como modificadas (mutações já conhecidas) em
pessoas com fendas labiopalatais e também identificar outras regiões alteradas. Para isso,
técnicas de biologia molecular como Denaturing High Performace Liquid
Chrormatography, (DHPLC), sequenciamento automático direto e SNP array, serão
utilizadas.
Caso aceite participar desse estudo, será coletado sangue venoso meu e (ou) do
meu filho (a) para posterior extração de DNA. Os riscos associados a esse procedimento são
mínimos, podendo ocorrer dor e manchas roxas (equimoses) no local da coleta. O
desconforto será mínimo, pois se trata de uma coleta de sangue geralmente da veia do braço,
que será realizada por profissional treinado e devidamente habilitado para efetuar tal
procedimento. Em alguns casos, será coletada saliva. Neste procedimento, não há nenhum
tipo de risco associado ou desconforto aparente. Dependendo dos resultados iniciais,
poderemos precisar de outra amostra de sangue para confirmação de dados, realizando
cultura de células e verificação dos cromossomos (exames de citogenética).
147
Entendi que não terei nenhuma vantagem direta com os resultados desta pesquisa
e que estes podem demorar alguns anos para serem concluídos. Entretanto, se for de meu
interesse e (ou) de minha família e caso eu queira tomar conhecimento, terei acesso a
qualquer informação da pesquisa realizada com o meu material genético e (ou) do meu
filho(a). Além disso, entendo que todas as conseqüências dos resultados serão devidamente
explicadas a mim em consultada agendada no Ambulatório Dismorfologia Craniofacial do
HC/UNICAMP ou pelo médico responsável. Dependendo da informação, sei que poderei
solicitar consultas adicionais para maiores esclarecimentos ou realizar aconselhamento
genético direcionado sem nenhum custo.
Em caso de dúvida ou para informação adicional, poderei contatar os
pesquisadores do Departamento de Genética Médica, no telefone (19) 3521.8907, na pessoa
da Dra. Vera L. Gil da Silva Lopes ou na pessoa de Milena Simioni. A fim de facilitar a
comunicação, comprometo-me a manter atualizado meu endereço e telefone de contato.
Eu entendo que toda informação médica, assim como os resultados dos testes
genéticos decorrentes desse projeto de pesquisa, serão sigilosos. O sigilo será mantido em
todo o estudo, a partir da utilização de um número de código para a identificação dos
indivíduos participantes. Os resultados de exames e testes, bem como do prontuário serão
acessíveis apenas aos pesquisadores envolvidos. Se os resultados ou informações fornecidas
forem utilizados para fins de publicação científica, nenhum nome será utilizado.
Eu estou ciente que a minha participação neste projeto de pesquisa não me
acarretará nenhuma despesa, já que a coleta de material será realizada em minhas consultas
regulares à Unicamp ou com meu médico assistente. Entendo, ainda, que o meu
148
acompanhamento médico ou de meu filho(a) não se modificará ou será diferenciado com a
minha (nossa) participação ou não neste estudo.
Eu entendo que a minha participação é voluntária e que eu posso me recusar a
participar ou retirar meu consentimento e interromper a minha participação ou de minha
família no estudo a qualquer momento (incluindo a retirada da amostra de sangue do
laboratório) sem comprometer os cuidados médicos que minha família recebe atualmente ou
venha a receber no HC-Unicamp. No caso de investigações familiares, entendo que o TCLE
será obtido de cada indivíduo ou responsável estudado.
Eu confirmo que a Dra. Vera L. Gil da Silva Lopes (ou médico responsável)
explicou-me o objetivo do estudo, os procedimentos aos quais serei submetido e os riscos
ou desconfortos advindos desse projeto de pesquisa. Eu li e/ou me foi explicado, assim como
compreendi esse formulário de consentimento e estou de pleno acordo em participar desse
estudo.
______________________________________________________________
Nome e RG do sujeito da pesquisa
_______________________________________________________________
Nome e RG do responsável legal
____________________________________________ ______________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou responsável legal Data
149
Fui informado que poderei autorizar que esse material genético seja guardado no
Banco de Material Biológico do Laboratório de Genética Molecular/FCM/Unicamp. Caso
este material venha a ser útil para outros estudos aprovados pelo Comitê de Ética, estou
ciente que serei informado para que autorize ou não o uso da (s) amostra (s).
__________________________________________________________________
Nome e RG do sujeito da pesquisa
__________________________________________________________________
Nome e RG do responsável legal
_____________________________________________ ______________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou responsável legal Data
RESPONSABILIDADE DO PESQUISADOR
Eu expliquei a ______________________________________________ o objetivo
do estudo, os procedimentos requeridos e os possíveis riscos que poderão advir do estudo,
usando o melhor do meu conhecimento. Eu me comprometo a fornecer uma cópia desse
formulário de consentimento ao responsável pelo participante.
__________________________________________________________________
Nome e RG do pesquisador
________________________________________ ______________
Assinatura do pesquisador Data
150
PARTICIPAÇÃO DE INDIVÍDUOS CONTROLES
Eu estou ciente de que a minha participação no estudo intitulado “Uso da técnica
de SNP array para detecção de variações no número de cópias do DNA (copy number
variation, CNV) em defeitos congênitos de herança complexa: as fendas orais como modelo”
será como um indivíduo controle em testes de biologia molecular.
Entendi que todas as informações constadas neste termo quanto a
procedimentos, sigilo, resultados e contatos para resultados (se eu desejar saber), serão
iguais aos demais indivíduos não-controle deste estudo. Fui informado também que poderei
autorizar que o meu material genético seja guardado no Banco de Material Biológico do
Laboratório de Genética Molecular/FCM/Unicamp. Caso este material venha a ser útil para
outros estudos aprovados pelo Comitê de Ética, estou ciente que serei informado para que
autorize ou não o uso da (s) amostra (s).
__________________________________________________________________
Nome e RG do indivíduo controle
_____________________________________________ ______________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou responsável legal Data
151
ANEXO IV. Protocolo de extração de DNA por Kit (Quiagen)
1 – Descartar o plasma (parte superior). Cuidado para não descartar a parte intermediária
(leucócitos);
2 – Transferir 2ml ou 1ml do sangue (se utilizar 1ml, adicionar 1ml de PBS) (parte
intermediária e inferior) para um tubo falcon de 15 ml;
3 – Adicionar 200µl de protease (previamente diluída em H2Od)
4 – Adicionar 2,5ml de tampão AL
5 – Inverter os tubos por 10 minutos.
6 – Agitar no vortex por 10 segundos.
7 – Deixar em banho Maria a 70ºC por 10 min.
8 – Adicionar 2ml de Etanol 100% (Merck)
9 – Inverter os tubos por 10 minutos
10– Agitar no vortex por 10 segundos.
11 – Transferir toda a solução para o tubo da coluna
12 – Centrifugar a 4.000 rpm por 4 min.
13 – Tirar a coluna e descartar o filtrado. Limpar a barda próxima a coluna para retirar
respingos presentes no tubo.
14 – Adicionar 2ml do tampão AW1 (previamente diluído em etanol 100%)
15 - Centrifugar a 4.000 rpm por 4 min (NÃO DESCARTAR SOBRENADANTE)
16 – Adicionar 2ml do tampão AW2 (previamente diluído em etanol 100%)
17 – Centrifugar a 4.000 rpm por 15 min.
18 – Limpar respingos que possam existir na coluna. Colocar a coluna em um tubo Falcon
novo.
152
19 – Adicionar 150µl do tampão AE, espalhando por toda a membrana. Deixar a temperatura
ambiente por 7 min.
20 – Centrifugar a 4.000 rpm por 3 min.
21 – Pegar o filtrado e colocar novamente na coluna
22 - Deixar à temperatura ambiente por 7 min.
23 – Centrifugar a 4.000 rpm por 3 min.
24 – Deixar entrar em solução overnight e depois colocar no tubo criogênico e guardar no
freezer.
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ANEXO V. Protocolo de extração de DNA pelo método Fenol-Clorofórmio
Extração de DNA – 1ª fase
1. Coletar o sangue em EDTA ou ACD, em tubos de vacunteiner em 2 alíquotas de 7-10mL.
2. Centrifugar o sangue por 10min a 2500rpm e descartar o plasma.
3. Transferir os leucócitos (+- 4mL) para um tubo falcon. Adicionar tampão RSB 1x até
completar o volume final de 11mL no tubo. Homogeneizar por 10min.
4. Adicionar 6 gotas de nonidet P40. Homogeneizar por 10min.
5. Centrifugar por 10min a 2500rpm e desprezar o sobrenadante.
6. Ressuspender o pellet em 500μL de tampão RSB 1x.
7. Lisar os núcleos com 3mL de SDS e misturar por inversão repetidamente.
8. Adicionar 80μL de proteinase K. A concentração final deve ser de 100μg/mL. Encubar
por 2-3h ou overnight a 37ºC.
9. Esperar 1 semana para a 2ª fase.
Extração de DNA – 2ª fase
1. Adicionar 3mL de fenol saturado. Misturar, invertendo o tubo gentilmente, e
homogeneizar por 10min. Centrifugar por 10min a 2500rpm.
2. Remover a porção superior do tubo (transparente) com uma pipeta pasteur para outro tubo
falcon. Tomar cuidado para não agitar a porção inferior, a qual será descartada.
3. Adicionar 1,5mL de clorofórmio álcool isoamílico e 1,5mL de fenol saturado.
Homogeneizar por 10min e centrifugar por 10min, 2500rpm. Remover a porção inferior do
tubo (fenol) com pipeta Pasteur e descartar.
154
4. Adicionar 3mL de clorofórmio álcool isoamílico, misturar a solução e homogeneizar por
10min. Centrifugar a 2500rpm por 10min. Remover completamente a porção inferior do
tubo e descartar.
5. Adicionar 6mL de etanol 100% gelado e misturar levemente, até observar a precipitação
do DNA.
6. Levar o frasco para a geladeira overnight.
7. “Pescar” o DNA precipitado com pipeta Pasteur de vidro e ressuspendê-lo em 200-250μL
de TE 1x.
155
ANEXO VI. Protocolo de purificação do kit MilliUni.
1. Aplicar 500µl do DNA na coluna com o tubo coletor (caso não tenha este volume de
DNA completar com H2O deionizada)
2. Centrifugar a 14.000 G ou 14.000 RFC (temperatura ambiente) por 12 minutos.
3. Colocar a coluna em um novo tubo coletor de ponta cabeça e centrifugar por 2
minutos a 1000 G ou 1000 RCF.
4. No tubo coletor ficará a amostra concentrada e limpa.
156
ANEXO VII. Protocolo para realização do ensaio de Open Array.
1. Escolha das sequências:
A. Made to order: São os ensaios que já foram validados pela Applied e estão no banco
de dados deles.
No site da Applied BioSystems, clicar na aba[Protudos]
Para genotipagem, clicar em [TaqMan SNP Genotyping Assay]
Clicar na aba [Assay Search]
Procurar o SNP pelo rs, ou pelo ID.
B. Customizados – Ensaios ainda não validados pela Applied, tendo que ser
“montado” do zero.
Sabendo o SNP que deseja, entrar no dbSNP ou outro banco de dados que
forneça as sequências próximas do SNP.
Selecionar aproximadamente 250-300pb, sendo que o SNP deve ter no mínimo
100pbs a sua esquerda e 100pbs a sua direita (onde serão desenhados os primers
e as sondas).
Entrar no site [RepeatMasker] – www.repeatmasker.org
Clicar em [Repeating Masking]
Colar a sequência desejada para o ensaio contendo o nucleotídeo correto, sem
o SNP e o sinal [X/Y] coletada conforme informações acima.
Verificar a presença de regiões repetitivas no genoma através da letra “N”.
Onde aparecer a letra N após o mascaramento, a Applied não desenhará nem
primer, nem sonda alguma, para não ter problema de inespecificidade.
157
Copiar a sequência que o RepeatMasker gera, contendo os “N” e adicionar a
sequência, junto com os demais ensaios já verificados para a placa (podem ser
tanto o ID, quanto as sequências), pelo software [FileBuilder].
2. Escolha do layout:
2.1. Escolher o layout da placa de OpenArray.
2.2.Inserir os dados do layout e dos ensaios contendo as mutações a serem analisadas no
software File Builder, da Applied BioSystems.
3. Preparo das amostras:
3.1.Avaliar o grau de pureza utilizando o NanoDrop ou NanoVue: Valor de A260/230 e
A230/280 entre 1,8 e 2,0
3.2. Quantificar utilizando o Qubit.
3.3.Carregar as amostras na placa de 384 well
3.4. Utilizar, para cada ensaio, concentração inicial de 50 ng/μL (são necessárias 250
cópias do genoma haploide)
Volume em µL
Layout de 16
ensaios
Layout de 32
ensaios
Demais Layouts
Amostra de DNA
(concentração: 50ng/µL)
1,5 2,0 2,5
TaqMan OpenArray
Genotyping Master Mix
1,5 2,0 2,5
VOLUME FINAL 3,0 4,0 5,0
3.5. Selar a placa para evitar evaporação de amostras, pois o volume é pequeno
3.6. Após selar a placa de 384, dar um spin a 1000rpm por 1 minuto.
3.7.Carregar o mix na placa de OpenArray em até 30 minutos.
4. Carregamento da placa OpenArray com o AccuFill
158
4.1. Ligar o computador por primeiro
4.2. Ligar o AccuFill em seguida
4.3. Verificar a limpeza interna do AccuFill
4.4.Posicionar a caixa de ponteiras (Tips) no local específico, sem a tampa!
4.5.Posicionar a placa de 384 poços contendo a amostra e o mix. Não esquecer de retirar
o selante do quadrante que for utilizar.
4.6.Posicionar a lâmina de OpenArray no local indicado. O Código de barras fica no lado
esquerdo (“Left to Load”)
4.7. Fechar o AccuFill
4.8.Abrir o software AccuFill
4.9.Fazer o Self-Test
4.10. Clicar em <Setup and Load>
4.11. Nomear o experimento
4.12. Escolher qual posição a lâmina de OpenArray ocupará
4.13. Fazer a leitura do código de barras da lâmina
4.14. No campo <Samples per subarray>, escolher quantas amostras terá por subarray.
No caso de uma placa de 32 ensaios/ 96 amostras, a quantidade de amostras por
subarray é de 2.
4.15. Escolher <Plate Holder>, onde estará a lâmina de OpenArray, selecioná-lo e, com
o scan, ler o código de barras do chip.
4.16. Clicar em <Next>.
4.17. No mapa da caixa das ponteiras (Tip Box), selecionar os quadrantes das ponteiras
que serão utilizadas.
159
4.18. Preparar a case com o líquido de imersão antes de posicionar a lâmina de
OpenArray. (A lâmina carregada dura apenas 1’30” fora do fluído)
4.19. Clicar em <Load> e aguardar o termino do carregamento.
5. Estabilizando a lâmina de OpenArray
5.1.Após colocar a lâmina de OpenArray dentro da case com líquido de imersão,
certificar que o mesmo está cobrindo toda a placa do OpenArray, sem ter nenhuma
bolha!
5.2.Selar a case com a goma, adicionando de forma que não fique nenhuma bolha
também. OBS: A goma é fotosensível, então não se deve demorar muito para aplicá-
la, muito menos esquece-la em local iluminado, pois corre o risco de endurecer.
5.3.Posicionar a case completa na estação de selagem, de tal forma que a borda preta da
case esteja voltada para frente e o código de barras para cima.
5.4.Ligar a estação por, no mínimo, 2 minutos, no caso de placa para genotipagem, ou 3
minutos de cada lado, para placa de expressão gênica.
6. Termociclador
6.1. Posicionar as bordas pretas das cases para cima, juntamente com a “espuma” para
pressionar a placa na chapa do termociclador.
6.2. Correr o programa <OPENARRAY>. Duração de aproximadamente 4h.
6.3. Retirar a case com cuidado, pois a espuma pode ficar grudada, aumentando o risco
da placa de OpenArray cair.
7. Leitura da Lâmina no Biotrove
7.1. Ligar o computador do Biotrove
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7.2. Fazer uma cópia do CD inteiro que veio com os ensaios na pasta [C://Programs
Files/Biotrove/PlateFiles]
7.3. Ligar o Biotrove
7.4. Abrir o software OpenArray SNP Genotyping Analysis
7.5. Para acender ou apagar a luz no interior do Biotrove, entrar no software, clicar em
<Actions> e clicar em <Light On> ou <Light Off>.
7.6. Ao abrir o Biotrove, haverá local para posicionar 3 cases para a leitura, respeitando
sempre as posições 01, 02 e 03. A case que ficar no fundo do aparelho é a 01, a do
meio 02 e a mais próxima da porta é a 03.
7.7. Colocar a case no Biotrove. A borda preta da case deve estar para cima, e o código
de barras da placa de OpenArray deve estar voltado para cima e para a direita (“Right
to Read”)
7.8. No software, clicar em <Image>
7.9. Na janela que se abrirá, clicar em <Locate Files> e escolher o arquivo contendo as
informações da lâmina, presente na pasta PlateFiles correspondente.
7.10. Colocar as informações das amostras no campo <Sample ID>: é obrigatório e podem
ser importados a partir do Excel.
7.11. Para nomear cada ensaio, ainda na janela <Image>, após o carregamento do
arquivo.spf correspondente ao ensaio, clicar em <Edit>.
7.12. Editar e clicar em <OK>.
7.13. A leitura tem duração de aproximadamente 40’ por lâmina
7.14. Após a leitura, utilizar um CD para copiar o arquivo .spf para ser lido no
Genotyper software.