streptococcus bovis streptococcus ”: uma avaliação...

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Complexo Streptococcus bovis / Streptococcus

equinus: Uma Avaliao Fenotpica e Genotpica

de Carter Taxonmico e Epidemiolgico

FELIPE PIEDADE GONALVES NEVES

Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Ges

Rio de Janeiro

2008

Livros Grtis

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ii




FELIPE PIEDADE GONALVES NEVES

Rio de Janeiro

2008

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Ps-graduao em Cincias

Biologicas (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Ges

(IMPPG), da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), como parte dos

requisitos necessarios obteno do ttulo de Doutor em Cincias

(Microbiologia).

Orientador: Profa. Dra. Lcia Martins Teixeira

iii




Autor: Felipe Piedade Gonalves Neves

Orientador: Lcia Martins Teixeira

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Ps-graduao em Cincias Biologicas

(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Ges (IMPPG), da Universidade Federal do

Rio de Janeiro (UFRJ), como parte dos requisitos necessarios obteno do ttulo de Doutor em

Cincias (Microbiologia).

Aprovada por:

_______________________________________

Presidente, Profa. Lcia Martins Teixeira

_____________________________________

Profa. Beatriz Meurer Moreira

_____________________________________

Profa. Vnia Lucia Carreira Merquior _____________________________________

Profa. Maria Cristina Plotkowski

_____________________________________

Profa. Regina Maria Cavalcanti Pilotto Domingues (Revisora)

Rio de Janeiro

Fevereiro 2008

iv

FICHA CATALOGRFICA

Neves, Felipe Piedade Gonalves

Complexo Streptococcus bovis / Streptococcus equinus: Uma Avaliao Fenotpica e

Genotpica de Carter Taxonmico e Epidemiolgico / Felipe Piedade Gonalves Neves. - Rio

de Janeiro: UFRJ/ IMPPG, 2008.

xvi, 158 f.: il.; 31 cm.

Orientador: Lcia Martins Teixeira

Tese (doutorado) UFRJ/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Ges/ Programa de Ps-

graduao em Cincias Biologicas (Microbiologia), 2008

Referncias Bibliogrficas: f. 134 - 158

1. Complexo Streptococcus bovis / Streptococcus equinus. 2. Caracterizao fenotpica. 3.

Caracterizao genotpica. 4. Susceptibilidade a antimicrobianos. 5. Taxonomia. 6. Epidemiologia

molecular. I. Teixeira, Lcia Martins. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de

Microbiologia Prof. Paulo de Ges, Programa de Ps-graduao em Cincias Biologicas

(Microbiologia). III. Ttulo

v

O presente trabalho foi realizado no Laboratrio de Apoio Biotecnolgico do

Departamento de Microbiologia Mdica, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de

Ges (IMPPG), Centro de Cincias da Sade (CCS), Universidade Federal do Rio

de Janeiro (UFRJ), sob a orientao da Profa. Dra. Lcia Martins Teixeira

vi

"Todos me dizem que o meu sucesso certo

afinal e que s devo preservar. Mas, apesar de

no saber como isso vai acontecer, fao tudo

quanto posso para acreditar nisso e no deixarei

de fazer o que de mim depender."

Bicketech

vii

Agradecimentos

Ao final de mais uma importante etapa em minha vida, reservo este espao para

agradecer a todos que fizeram parte, direta ou indiretamente, dessa longa caminhada e,

assim, contriburam para a realizao desse trabalho e tambm para a minha realizao

pessoal e profissional.

Primeiramente, a Deus, presena constante em minha vida e que, com certeza, me

ajudou a enfrentar todos os obstculos. S tenho a agradecer por tudo.

A minha me-guerreira, Celeste, mulher batalhadora e dedicada, que, sozinha,

enfrentou muitas barreiras e venceu. Conseguiu criar seus filhos com toda a dignidade,

formando-os para a vida. Voc merece uma esttua. Perdoe-me pelos momentos de

impacincia.

Ao meu irmo, Rafael, companheiro e amigo. Dividimos tantas coisas: segredos,

alegrias... E agora mais uma, sua filhinha Gioavana. Minha afilhada est chegando! Vou

ser um tio-padrinho coruja.

A minha namorada, Tatiana, companheira leal, pelo carinho, dedicao e

incentivo. Obrigado por voc existir e por ser essa pessoa to especial. O futuro nos reseva

uma surpresa muito boa. Te amo muito, demais, praca e ziriziguizum!

Aos meus avs maternos, Mrio e Da, que se foram durante meu Mestrado e

Doutorado. Dei-lhes o orgulho de me ver formado na faculdade e continuarei me

esforando para que sempre se sintam orgulhosos de mim. Sei que, de onde esto, sempre

olharo por mim. Saudades!

A Profa. Lcia Martins Teixeira, exemplo de profissionalismo e competncia, cuja

experincia e sabedoria me fizeram crescer pessoal e profissionalmente. Tenho certeza de

que fiz a escolha certa ao optar por seu laboratrio. Obrigado por todos os ensinamentos,

pela oportunidade e confiana.

A Profa. Vnia Lcia Carreira Merquior, amiga e orientadora, no s no

trabalho, mas tambm na vida. Contigo aprendi e continuo aprendendo muito. Ter a

oportunidade de compartilhar sua companhia como colega de laboratrio, como nos

viii

dois ltimos anos, foi uma experincia nica e com a qual tirei vrias lies. Te admiro

muito!

A Giseli da Silva da Costa, por todo o excelente trabalho desenvolvido em conjunto

e sem a qual essa dissertao jamais teria sido concluda. No sei o porqu, mas essa

menina morre de medo de mim. Ser que sou muito mau? Enfim, te agradeo por toda a

colaborao e amizade durante essa longa caminhada, no at Miguel Couto (que tambm

longe), mas sim o Doutorado. (risos)

Ao meu grande amigo Rafael Silva Duarte, um ser humano de enorme corao e

inteligncia. Foi a primeira pessoa que eu conheci quando cheguei no laboratrio em

2003, quando ainda fazia Mestrado pela UERJ. Ensinou-me muita coisa, desde tcnicas

laboratoriais a lies de vida. Obrigado por toda a confiana, respeito e carinho em mim

depositados.

A minha grande amiga Rachel Leite Ribeiro, que, desde os tempos da Graduao

em Cincias Biolgicas na UERJ, l em 1999, me acolheu como um irmo caula. Gosto

muito de ti e toro por voc sempre. Deus, com certeza, te reserva um futuro brilhante, pois

voc merece. No desista nunca.

A Camille Moura, menina divertidssima, com um bom humor mpar (s podia ser

geminiana tambm). Perco a conta de quantos momentos engraados passamos durante

esse perodo. Momentos que, com certeza, tornaram mais agradvel essa etapa da minha

vida. Valeu filhote, fica de bigode no, hein! (risos)

Ao Felipe Cruz, que chegou ao laboratrio no ltimo ano do meu Doutorado, mas

com quem logo fiz amizade. Obrigado por sempre rir das minhas piadas, que muitos

consideram sem-graa, mas na verdade s os inteligentes conseguem perceber a

sagacidade delas.

A Fabola Kegele, que entrou no laboratrio praticamente junto comigo.

Competente e dedicada, sempre vai em busca do que quer. Ela s tem um probleminha com

os seus pneumococos: eles no gostam de amplificar essas tais de pbps. , Cus! ,

Vida! (risos) Sucesso sempre.

A Jaqueline Martins e Filomena Rocha, pessoas importantssimas no laboratrio,

sem as quais o mesmo no anda. Obrigado por toda a ateno e presteza sempre que

precisei.

ix

Aos antigos e novos integrantes do Laboratrio de Apoio Biotecnolgico (IMPPG),

Bruna Bellei, Carlos Zarden, Tatiana Abreu, Gabriela Reis, Eduardo Costa, Clarissa

Christiano, Juliana Caiero, Ccero Dias, Rosana Barros, Silvia Mondino e Suely

Fracalanzza, pela convivncia sempre agradvel. Boa sorte em tudo o que almejarem.

Estarei torcendo sempre para todos vocs.

Aos meus grandes amigos Gustavo Zoletti e Marcos Dornelas, por todos os

momentos compartilhados durante esses quatro anos. Nos divertimos muito nesse tempo,

principalmente nos churrascos e seminrios. Quanta enrolao! (risos) Obrigado por toda

amizade e companheirismo gratuitos.

s amigas Karla Rodrigues, Luiza Lessa, Natalia Iorio e Roberta Caboclo por

todos os momentos vividos. Cada uma de vocs foi e continua sendo muito importante em

uma parte dessa minha trajetria. Obrigado tambm, e muito, pelas cervejas no bloco A s

sextas-feiras, afinal ningum de ferro, n?

s amigas e professoras Regina Domingues e Ktia Santos, por todo o carinho,

apoio e incentivo. Nunca esquecerei a considerao que vocs tm por mim.

A toda equipe do Streptococcus Laboratoty do CDC (Atlanta, EUA), principalmente

Arnold Steigerwalt, Bernard Beall, Glria Carvalho, Patricia Shewmaker, Richard

Facklam e Roger Morey..

Ao Prof. Jos Mauro Peralta, chefe do Laboratrio de Sorologia, por toda

considerao e respeito.

Aos amigos do Laboratrio de Sorologia do IMPPG, Carlos Ausberto, Regina

Peralta, Margareth, Mauro, Ronald, Nathlia, Adriana, Laura, Diva, Jorge, Maria Jos,

Helena e Tiana, pela ajuda sempre presente e os inmeros momentos de boas conversas.

Aos amigos dos diversos laboratrios, bibliotecas e secretarias do IMPPG, por

todo apoio, alegrias, sorrisos e carinho, principalmente Dalziza, Lo e Ricardo.

A todos os professores e funcionrios do IMPPG, pela ateno que me foi

concedida sempre que precisei.

A todos os professores e funcionrios da Disciplina de Microbiologia e Imunologia

da FCM/UERJ, por todo o carinho que sempre demonstaram por mim. Serei sempre grato

a esta instituio, pois foi ali onde tudo comeou.

x

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), a

Fundao de Amparo Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), a Finaciadora

de Estudos e Projetos (FINEP), a Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel

Superior (CAPES) e ao Ministrio da Cincia e Tecnologia (MCT/Pronex), por todo o

suporte financeiro para a execuo do projeto.

xi

RReessuummoo

Complexo Streptococcus bovis / Streptococcus equinus: Uma Avaliao Fenotpica e Genotpica de Carter Taxonmico e Epidemiolgico

Autor: Felipe Piedade Gonalves Neves Orientador: Lcia Martins Teixeira

Resumo da Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Cincias Biolgicas (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Ges (IMPPG), da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Doutor em Cincias (Microbiologia).

O complexo Streptococcus bovis / Streptococcus equinus, freqentemente referido como estreptococos do grupo D, composto por espcies altamente relacionadas, cuja diferenciao difcil utilizando os mtodos convencionais de identificao. Nos ltimos anos, o interesse por esses microrganismos foi renovado, sobretudo por seu envolvimento em vrias infeces humanas, principalmente endocardite e pelas evidncias de sua associao com bacteremias e a ocorrncia de cncer de clon. Apesar das importantes contribuies de estudos recentes, a posio taxonmica precisa de algumas das espcies continua controversa. Por outro lado, variaes nas metodologias e nos critrios usados por diferentes autores dificultam a comparao dos dados existentes na literatura. Considerando a necessidade do desenvolvimento e/ou aplicao sistemtica de metodologias que permitam a discriminao e identificao precisa das diferentes espcies deste complexo, e dando continuidade a um estudo taxonmico iniciado por nosso grupo, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar fenotpica e genotipicamente uma coleo de 213 amostras isoladas de diferentes fontes clnicas, as quais haviam sido presuntivamente identificadas como pertencentes ou relacionadas a este complexo. Uma coleo de 23 amostras de referncia foi tambm includa. Das 213 amostras clnicas, 134 foram confirmadas como membros do complexo, com base nos resultados de testes fisiolgicos e de anlise dos perfis de protenas totais obtidos por eletroforese em gel de poliacrilamida em presena de dodecil sulfato de sdio. Sua identificao ficou assim distribuida: S. gallolyticus subsp. gallolyticus (55 amostras), S. gallolyticus subsp. pasteurianus (52 amostras) e S. infantarius subsp. coli (27 amostras). Tais amostras foram submetidas a testes de susceptibilidade a antimicrobianos, atravs da tcnica de disco-difuso e, quando resistentes, a testes para determinao dos respectivos genes de resistncia, atravs de reaes em cadeia da polimerase. Todas as 134 amostras clnicas foram sensveis a penicilina, a vancomicina e a nveis elevados de gentamicina. As taxas mais elevadas de resistncia foram observadas para canamicina (91,8%), tetraciclina (68,7%) e eritromicina (20,1%). O fentipo HLSR (High-Level Streptomycin Resistance) foi observado em 4,5% (6/134) das amostras. Destas, 3 apresentaram o gene ant(6)-I. Com relao aos fentipos de resistncia a

xii

eritromicina, a nica amostra com resistncia intermediria a este antimicrobiano apresentou o fentipo M e carreava o gene mef(A). Das 28 amostras resistentes a eritromicina, 18 apresentaram o fentipo iMLSB e, dessas, 14 eram portadoras dos genes erm(A) e/ou erm(B). O fentipo cMLSB foi observado em 10 amostras e todas apresentaram o gene erm(B). Dos determinantes de resistncia a tetraciclina pesquisados, o gene tet(M) foi o prevalente, sendo encontrado em 79,4% (73/92) das amostras resistentes a tetraciclina, seja isoladamente ou associado ao gene tet(L) ou ao gene tet(O). A anlise dos perfis de restrio do gene que codifica o rRNA 16S, utilizando as enzimas AflIII e HaeIII separadamente, mostrou-se menos discriminatria quando comparada a anlise dos perfis de protenas, j que, embora tenha permitido diferenciar as espcies S. equinus e S. infantarius, as amostras de S. gallolyticus e S. alactolyticus apresentaram perfis idnticos. A tcnica de PFGE, alm de servir como um instrumento de diferenciao intra-especfica (tipagem), tambm mostrou ser uma alternativa interessante para a diferenciao das espcies e, em alguns casos, das subespcies. Nossos resultados contriburam para a elaborao de um esquema de caracterizao fenotpica bastante til para a identificao das espcies e subespcies deste complexo. Palavras-chave: complexo Streptococcus bovis / Streptococcus equinus, caracterizao fenotpica, caracterizao genotpica, susceptibilidade a antimicrobianos, taxonomia, epidemiologia molecular.

Rio de Janeiro

Fevereiro 2008

xiii

AAbbssttrraacctt

Streptococcus bovis / Streptococcus equinus Complex: A Taxonomic and Epidemiological Approach based on Phenotypic and Genotypic

Characterizations Author: Felipe Piedade Gonalves Neves Advisor: Lcia Martins Teixeira

Abstract of the Dissertation presented to the Programa de Ps-graduao

em Cincias Biolgicas (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Ges (IMPPG), Univesidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), as part of the requirements to receive the degree of Doctor in Sciences (Microbiology).

The Streptococcus bovis / Streptococcus equinus complex, often referred as group D streptococci, is composed by highly related species that are normal inhabitants of human and animals intestinal tract. An increasing interest in the precise identification of these microorganisms was generated by their involvement in serious infections in humans, mainly endocarditis, and the finding of a strong association between bacteremia and the occurrence of colon cancer. In recent years, considerable progress has been achieved in the characterization and delineation of the taxonomic status of this complex of microorganisms. However, the differentiation of some of the species remains problematic because of the overlap of phenotypic and even molecular characteristics, and some controversies have arisen by the use of different methodologies and by the proposal of new species and/or subspecies. Considering the need of the development and/or plenty application of methods to assist in their accurate identification and differentiation, and continuing a taxonomic study initiated by our group, an array of phenotypic and genotypic techniques was performed to characterize 23 reference strains as well as a collection of 213 clinical isolates, mostly recovered from blood, obtained between 1970 and 2006, which had been presumptively identified as belonging or related to this complex. Based on whole-cell protein profiles analysis, in conjunction with the physiological characterization, 134 of the 213 clinical isolates were confirmed as members of this complex: S. gallolyticus subsp. gallolyticus (n=55), S. gallolyticus subsp. pasteurianus (n=52) and S. infantarius subsp. coli (n=27). The highest resistance rates among all clinical isolates tested were found to kanamycin (91.8%), tetracycline (68.7%) and erythromycin (20.1%). The only isolate that showed intermediate resistance to erythromycin carried the mef(A) gene and displayed the M phenotype. Of the 28 erythromycin resistant isolates, 18 presented the iMLSB phenotype and 14 of them carried the erm(A) and/or erm(B) genes. The cMLSB phenotype was detected in ten isolates and all of them had the erm(B) gene. Among the 92 tetracycline resistant isolates, the tet(M) gene was the prevalent (79.4%), found exclusively or associated with the tet(L) or tet(O) genes. Six isolates exhibited high-level resistance to streptomycin and three of them carried the ant(6)-I gene. 16S rRNA gene restriction analysis, using AflIII and

xiv

HaeIII enzymes separately, showed to be less discriminatory than WCPP analysis. By using this technique, S. equinus and S. infantarius species could be differentiated from S. gallolyticus and S. alactolyticus after digestion with HaeIII. AflIII restriction allowed further differentiation between S. infantarius and S. equinus strains and even the delineation of S. infantarius subspecies. However, patterns obtained for S. gallolyticus and S. alactolyticus isolates were identical. PFGE analysis was shown to be an interesting alternative for the discrimination of these species and, in some cases, subspecies. Our results contributed for the elaboration of a phenotypic characterization scheme that may be useful for the identification of the members of this complex. Key words: Streptococcus bovis / Streptococcus equinus complex, phenotypic characterization, genotypic characterization, taxonomy, antimicrobial susceptibility, molecular epidemiology.

Rio de Janeiro

February 2008

xv

SSuummrriioo

Pgina

RESUMO xi

ABSTRACT xiii

INTRODUO 1

OBJETIVOS 38

MATERIAIS E MTODOS

1. Amostras Bacterianas

2. Caracterizao Fisiolgica das Amostras Bacterianas

2.1. Colorao pelo Mtodo de Gram

2.2. Produo da Enzima Catalase

2.3. Observao do Tipo de Hemlise

2.4. Hidrlise da Esculina em Presena de Bile (BE)

2.5. Crescimento na Presena de 6,5% de Cloreto de Sdio (NaCl)

2.6. Hidrlise de L-leucina--naftilamida (LAP) e de L-pirrolidonil--naftilamida (PYR)

2.7. Hidrlise do Amido

2.8. Produo de cidos a partir de Glicognio, Inulina, Lactose, Manitol, Melibiose,

Metil--D-glicopiranosdeo, Metil--D-glicopiranosdeo, Rafinose e Trealose

3. Caracterizao Fisiolgica Atravs do Sistema Comercial Miniaturizado API 20 Strep

4. Testes de Susceptibilidade aos Antimicrobianos

4.1. Tcnica de Disco-Dufuso

4.2. Determinao de Fentipos de Resistncia a Eritromicina

5. Anlise dos Perfis de Protenas Totais

5.1. Preparao de Extratos contendo Protenas Celulares Totais

5.2. SDS-PAGE

6. Anlise atravs de Seqenciamento do Gene que Codifica o rRNA 16S (Gene rrs)

7. Anlise dos Perfis de Fragmentao dos Produtos de Amplificao do Gene rrs

7.1. Extrao do DNA

7.2. Amplificao do Gene rrs

7.3. Digesto dos Produtos de Amplificao com Endonucleases de Restrio

7.4. Eletroforese e Anlise dos Produtos Amplificados

8. Deteco atravs de Tcnicas de PCR de Genes Envolvidos na Expresso de

Resistncia a Eritromicina, Tetraciclina e Nveis Elevados de Estreptomicina

8.1. Deteco de Genes de Resistncia a Eritromicina

8.1.1. Extrao do DNA

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8.1.2. PCR

8.2. Deteco de Genes de Resistncia a Tetraciclina

8.2.1. Extrao do DNA

8.2.2. PCR Multiplex

8.3. Deteco do Gene Envolvido na Expresso de Resistncia a Nveis Elevados de

Estreptomicina

8.4. Eletroforese e Anlise dos Produtos Amplificados

9. Anlise dos Perfis de Fragmentao do DNA Cromossmico por PFGE

54

55

55

55

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57

57

RESULTADOS 60

DISCUSSO 103

CONCLUSES 132

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 134

1

IInnttrroodduuoo

Os microrganismos do gnero Streptococcus so cocos Gram-positivos

arranjados em cadeias ou aos pares. Uma caracterstica peculiar deste grupo

no produzir a enzima catalase. Os membros deste gnero so exigentes em

termos nutricionais, necessitando de meios complexos, contendo soro ou sangue,

para o seu crescimento. Embora os Streptococcus cresam na presena de

oxignio, eles so incapazes de sintetizar o composto heme e, por isso, no

possuem metabolismo respiratrio, sendo anaerbios facultativos, ainda que a

necessidade de CO2 durante o perodo de crescimento seja varivel entre as

diferentes espcies. Glicose e outros carboidratos so metabolizados por

fermentao, sendo o cido ltico o principal produto final deste metabolismo

(RUOFF, WHILEY & BEIGHTON, 1999).

A composio da parede celular dos estreptococos similar de outras

bactrias Gram-positivas, sendo formada primariamente de peptideoglicano, no

qual esto inseridos diversos carboidratos, cido teicico, lipoprotenas e

protenas antignicas de superfcie (KILIAN et al., 2005).

A identificao deste gnero relativamente complexa, levando a utilizao

de diversos esquemas fenotpicos, dentre os quais se destacam: padres

hemolticos em meios de gar-sangue de carneiro (permitindo a classificao em

2

, ou no-hemolticos), caractersticas de patogenicidade, grupagem sorolgica

baseada nas diferenas antignicas do carboidrato C (classificao de Lancefield,

1933) e caractersticas bioqumicas (LARSEN,1995).

Atualmente, embora esses esquemas ainda sejam de grande utilidade, a

introduo e ampla aplicao de mtodos moleculares tm trazido importantes

contribuies para a identificao e caracterizao precisa desses

microrganismos. Entre os membros do gnero Streptococcus cuja taxonomia e

mtodos de caracterizao tiveram avanos significativos, oriundos da aplicao

de mtodos moleculares, esto aqueles anteriormente denominados de

estreptococos do grupo D.

Os estreptococos possuidores do antgeno do grupo D eram, antigamente,

divididos em duas categorias: os enterococos e os no-enterococos. A partir de

meados da dcada de 1980, a taxonomia desse gnero sofreu modificaes

significativas (KILIAN et al., 2005). Com a alocao dos enterococos em um novo

gnero (Enterococcus), os estreptococos do grupo D ficaram representados, em

termos de importncia mdica, pela espcie Streptococcus bovis. Uma vez que

esses microrganismos tambm so positivos para o teste da hidrlise da esculina

em presena de 40% de bile, a sua diferenciao daqueles pertencentes ao

gnero Enterococcus se baseia em provas bioqumicas, tais como o crescimento

na presena de 6,5% de cloreto de sdio (NaCl) e a hidrlise do L-pirrolidonil--

naftilamida (teste do PYR), para os quais so negativos. Outra caracterstica

diferencial a sua maior susceptibilidade aos antimicrobianos, pois, em geral, os

3

enterococos so mais resistentes penicilina, a cefalosporinas e aos

aminoglicosdeos. semelhana dos enterococos, esses microrganismos so

encontrados normalmente no trato gastrintestinal em 5-16% da populao normal,

sendo este a sua principal porta de entrada para bacteremias e endocardites,

embora tambm haja suspeitas da participao do trato urinrio, da rvore

hepatobiliar ou da orofaringe atuando como origem para estas infeces

(SIEGMAN-IGRA & SCHWARTZ, 2003; SINAVE, 2007).

Uma particularidade interessante dos S. bovis sua tendncia de se

encontrar associado ao cncer de clon, embora no haja evidncia de qualquer

relao etiopatognica. Devido a esta associao, recomendvel pesquisar-se

este tipo de cncer em pacientes com bacteremia causada por esses

microrganismos (SINAVE, 2007). Acredita-se que essa associao seja resultado

de dois fatores: (i) mudanas na microbiota do clon em pacientes com carcinoma

de clon, uma vez que Klein et al. (1977) observaram um aumento na taxa de

colonizao por S. bovis (56%) nesses pacientes; e (ii) o fato de que esta bactria

possa ter uma propenso especfica tanto para invadir a mucosa intestinal quanto

para desenvolver bacteremia e endocardite. Contudo, os fatores que promovem o

aumento da colonizao, o acesso circulao sistmica e o alojamento em

vlvulas cardacas ainda permanecem por ser elucidados.

Em termos de patognese, como os S. bovis fazem parte da microbiota

intestinal, no por acaso que uma proporo razovel de pacientes com

bacteremias por esses microrganismos apresenta concomitantemente leses no

4

trato gastrintestinal (ALAZMI et al., 2006). Baseado nesse conceito, Klein et al.

(1977) descreveram os primeiros casos de endocardite por S. bovis associados

com carcinoma de clon. Desde ento, vrios relatos vm sendo descritos,

corroborando essa associao (STEINBERG & NAGGAR, 1977; CROWLEY,

AHOLA & BEHAR, 1978; LEVY, VON REYN & ARBEIT, 1978; SALTZMAN,

BRAND & MCKINLEY, 1981; ZARKIN et al., 1990; BALLET et al., 1995; GOLD,

BAVAR & SALEM, 2004).

No est claro se o S. bovis tem um papel etiolgico no carcinoma de clon

ou se meramente um marcador para a doena. Alguns pesquisadores sugerem

que o aumento da colonizao por essa bactria no trato gastrintestinal pode ser

responsvel por essas leses. Antgenos extrados da parede celular dessa

bactria foram capazes de estimular a produo de citocinas inflamatrias e

promover leses pr-malignas em modelos animais (ELLMERICH et al., 2000;

BIARC et al., 2004). Os S. bovis so capazes de causar inflamao crnica no

clon e, de um modo geral, doenas inflamatrias crnicas esto associadas a

leses malignas, como esofagite de Barrett, gastrite crnica secundria a infeco

por Helicobacter pilori levando ao carcinoma gstrico, doena inflamatria do

intestino no carcinoma de clon e hepatite B ou C crnica causando hepatoma

(KOK et al., 2007).

Em 1993, Darjee & Gibb documentaram que no havia distino entre

pacientes com cncer de clon e indivduos saudveis utilizando a tcnica de

immunoblotting para a deteco do ttulo de anticorpos contra S. bovis.

5

Por outro lado, outros estudos demonstraram resultados contraditrios.

Atravs de ensaios de espectrometria de massa por imunocaptura, utilizando

anticorpos do soro de pacientes com cncer de clon, Tjalsma et al. (2006)

analisaram 20 indivduos e conseguiram detectar antgenos de S. bovis em 11 de

12 pacientes com cncer de clon, sendo que nos oito pacientes-controle no

foram detectados antgenos de S. bovis. Alm disso, antgenos de Escherichia

coli, oriundas do trato gastrintestinal, no reagiram com os soros obtidos dos

pacientes com cncer de clon. Em adio, antgenos de S. bovis tambm foram

detectados em pacientes com plipos, indicando que a infeco por essa bactria

ocorre precocemente durante a carcinognese. Um desses antgenos detectados

foi identificado como uma protena de superfcie de ligao a heparina, que pode

estar envolvida na ligao s clulas tumorais. Segundo esses pesquisadores,

esses achados, em conjunto, reforam a hiptese de que leses no clon

fornecem um nicho especfico para S. bovis, resultando em infeces silenciosas

associadas ao tumor. Estas infeces, contudo, s se tornam aparentes em

pacientes com um sistema imune comprometido, levando bacteremia, ou com

leses nas vlvulas cardacas, causando endocardite (TJALSMA et al.,2006).

Na medida em que houve uma maior interesse acerca dos S. bovis,

principalmente devido a sua forte associao com bacteremia e a ocorrncia de

cncer de clon, e com o advento de tcnicas moleculares a partir de meados da

dcada de 1980, novas metodologias foram introduzidas para o estudo desses

microrganismos, constatando-se a complexidade dessa espcie e a necessidade

de esclarecimento de questes taxonmicas, o que tem gerado a descrio de

6

vrias espcies novas que comporiam um complexo de espcies bastante

relacionadas, que tem sido freqentemente referido como grupo ou complexo

Streptococcus bovis / Streptococcus equinus.

Este grupo de estreptococos apresenta as seguintes caractersticas em

comum: cocos Gram-positivos, que se apresentam como clulas esfricas ou

ovides arranjadas aos pares ou em cadeias curtas, catalase-negativos, imveis,

no-esporulados, no-pigmentados, anaerbios facultativos; so alfa ou no-

hemolticos e no crescem em caldo contendo 6,5% de NaCl; no hidrolisam a

arginina e o hipurato de sdio; no produzem fosfatase alcalina e PYRase;

produzem LAPase e acetona; apresentam colnias circulares, lisas e inteiras

quando crescidos em meio gar-sangue ou gar nutriente; crescem em caldo

Man, Rogosa, Sharpe (M.R.S.) sem produo de gs; crescem a 45C mas no a

50C; e a maioria hidrolisa a esculina e cresce na presena de 40% de bile

(SINAVE, 2007).

A seguir so apresentados alguns aspectos de espcies descritas, at o

momento, como pertencentes ou relacionadas ao complexo S. bovis / S.

equinus:

Streptococcus equinus______________________________________________

Streptococcus equinus (equinus, latim, eqinos = cavalo). Esta espcie foi

descrita em 1906 por Andrewes & Horder (apud HODGE & SHERMAN, 1937)

7

como sendo um microrganismo que no possua propriedades patognicas, no-

hemoltico, que apresentava a forma de cocos Gram-positivos arranjados em

cadeias curtas, isolado originalmente de intestino e estrume de cavalos.

Caractersticas adicionais compreendem a fermentao da sacarose, salicilina e

coniferina e a no fermentao de lactose, manitol e, geralmente, de rafinose e

inulina, embora algumas amostras variantes utilizem esses acares. Estes

microrganismos apresentam ainda uma temperatura mnima de crescimento

relativamente alta (25C), sendo evidenciado pouco ou nenhum crescimento em

culturas a 20C.

Hodge & Sherman (1937) demonstraram que o S. equinus no hidrolisava o

amido, sendo este teste considerado importante, visto que em muitos aspectos o

S. equinus parecia ser relacionado a espcie S. bovis, que hidrolisava amido

ativamente. Em 1962, Dunican & Seeley determinaram que o S. equinus era

capaz de hidrolisar o meio de amido se este possusse um carboidrato facilmente

fermentvel como a glicose, por exemplo, e que no estivesse em uma atmosfera

com 5% de CO2 e 95% de N2.

Streptococcus bovis________________________________________________

Streptococcus bovis (bovis, latim, bovinos). Esta espcie foi descrita por

Orla-Jensen em 1919, que a isolou de fezes bovinas. Amostras de S. bovis so

caracterizadas pelo crescimento em temperaturas que variam de 22C a 45C,

pela capacidade de formao de cpsulas e hidrlise do amido. A fermentao de

8

inulina e rafinose varivel, enquanto manitol ou outros lcoois no so

fermentados. Estes microrganismos tambm so capazes de fermentar a

arabinose (apud KIEL & SKADHAUGE, 1973).

Nesse mesmo ano (1919), Orla-Jensen isolou outro grupo de

estreptococos, semelhante ao S. bovis, encontrados no leite e em fezes bovinas,

sendo proposto o nome Streptococcus inulinaceus, pela capacidade de fermentar

a inulina mais intensamente que o S. bovis, mas no hidrolisar o amido com a

mesma intensidade. Tais amostras diferiam do S. bovis por no formar cpsulas e

por ter uma variao de temperatura de crescimento menor. Alm disso, a

fermentao do manitol foi uma caracterstica encontrada no S. inulinaceus,

enquanto que a arabinose no era fermentada (apud KIEL & SKADHAUGE, 1973).

Sherman (1937), aparentemente negligenciando a importncia dada por

Orla-Jensen para a capacidade de S. bovis formar cpsulas e incapacidade de

fermentar o manitol, concluiu que essas diferenas no justificavam a

considerao de S. inulinaceus como uma espcie distinta, propondo que deveria

ser considerado como uma variante do S. bovis. Num artigo seguinte, Sherman

(1938) relatou que uma proporo substancial de amostras de S. bovis fermentava

manitol. Este ponto de vista tem sido geralmente aceito a partir de ento (apud

KIEL & SKADHAUGE, 1973).

Em 1937, Sherman publicou o seu esquema de classificao que separava

o gnero Streptococcus em quatro grupos (piognicos, lticos, enterococos e

9

viridans). A diviso dos enterococos de Sherman exclua o S. bovis e o S.

equinus, pois estes microrganismos no cresciam a 10C e nem em meio

contendo 6,5% de cloreto de sdio, sendo por estes motivos agrupados na diviso

viridans.

Em 1964, Deibel descreveu em seu trabalho de reviso sobre os

estreptococos do grupo D que, sorologicamente, os estreptococos pertencentes a

diviso dos enterococos de Sherman possuam o antgeno do grupo D de

Lancefield. Os estreptococos do grupo D foram reconhecidos, desde ento, como

S. bovis, S. equinus e a diviso denominada, por Sherman, de enterococos, que

consistia de S. faecalis, S. faecium e sua variante durans.

Facklam (1972) descreveu que os microrganismos S. bovis, S. bovis

variante e S. equinus eram reconhecidos por no crescerem em caldo

Streptococcus faecalis (SF), nem temperatura de 10C e nem em caldo

contendo NaCl a 6,5%. A hidrlise do amido e a formao de polissacardeos

mucides em gar ou caldo contendo 5% de sacarose eram as caractersticas

singulares de S. bovis entre as amostras do grupo D. Facklam verificou que as

amostras de S. bovis variante no hidrolisavam o amido, nem formavam muco em

gar ou caldo contendo 5% de sacarose ou produziam cidos a partir do manitol.

Tais amostras cresciam em leite litmus ou formavam cidos a partir da lactose,

diferindo, portanto, de S. equinus. Facklam hesitou em designar o biotipo S. bovis

variante do grupo D como uma nova espcie devido ao nmero limitado de

amostras reportadas e limitao do espectro de testes. Ficou desde ento

10

definido que amostras tpicas de S. bovis, encontradas em seres humanos, seriam

pertencentes ao biotipo I, enquanto que as amostras de S. bovis variante

comporiam o biotipo II (FACKLAM, 1972).

Portanto, levando-se em considerao inicial a fermentao do manitol, foi

desenvolvida a caracterizao fenotpica de amostras de S. bovis em dois

biotipos: o biotipo I, que compreende amostras manitol positivas e o biotipo II,

compreendendo amostras manitol negativas. O biotipo II pode ainda ser dividido

em dois subtipos, baseado em caractersticas fenotpicas determinadas pelo

sistema Rapid Strep. O biotipo II.1 composto por amostras que fermentam

amido, melibiose e glicognio, mas no trealose, e que no produzem -

glicuronidase e -galactosidase (GARVIE & BRAMLEY, 1978; COYKENDALL &

GUSTAFSON, 1985). As amostras do biotipo II.2 fermentam trealose, mas no

amido e glicognio e produzem -glicuronidase e -galactosidase (COYKENDALL

& GUSTAFSON, 1985; KNIGHT & SHLAES, 1985). Esta terminologia foi, at

algum tempo atrs, comumente usada para a identificao de amostras de origem

clnica (RUOFF et al., 1989).

Com base em resultados de estudos de hibridizao DNA-DNA, Farrow et

al. (1984) propuseram uma classificao em seis grupos genmicos, a maioria dos

quais englobaria amostras do complexo S. bovis / S. equinus e outras espcies

relacionadas. Esses autores concluram que o S. equinus e o S. bovis so

sinnimos por apresentarem grau de homologia de DNA-DNA acima de 70% e os

enquadraram no grupo de homologia 1. O epteto S. equinus deveria ter prioridade

11

de uso sobre a denominao S. bovis, mas raramente usado em bacteriologia

clnica humana. Utilizando esta mesma metodologia, outros autores demonstraram

no haver similaridade suficiente entre amostras de S. bovis dos biotipos I e II

isoladas de humanos e as amostras-tipo de S. bovis e S. equinus para consider-

las variantes de uma mesma espcie. Foi observado tambm que amostras de S.

bovis biotipo II.2 de origem humana eram muito relacionadas geneticamente s

amostras de S. bovis biotipo I (COYKENDALL & GUSTAFSON, 1985; KNIGHT &

SHLAES, 1985).

A partir de 1984, ano marcado pela publicao da proposta de criao do

gnero Enterococcus (SCHLEIFER & KILPPER-BLZ, 1984), separando esses

microrganismos dos demais estreptococos do grupo D, e do trabalho acima

referido de Farrow et al. (1984), apresentando resultados de estudos moleculares

sobre esses microrganismos, diversos outros estudos foram sendo publicados,

sobretudo a partir de meados da dcada de 1990, contribuindo para a aquisio

de um conhecimento mais amplo e o aumento do nmero de espcies

consideradas como pertencentes a essa categoria de estreptococos, como

apresentado a seguir:

Streptococcus alactolyticus__________________________________________

Streptococcus alactolyticus (a.lac.to.ly.ti.cus., prefixo grego a = no; nome

latino lac, lactis = leite; adjetivo grego lyticus = que digere; alactolyticus, que no

digere leite). Espcie descrita por Farrow et al. (1984), pertencente ao grupo de

12

homologia 6, para englobar amostras lactose negativas isoladas de porcos e

galinhas, que eram previamente chamadas de S. equinus. Entretanto, Bentley,

Leigh & Collins (1991) relataram que a espcie S. alactolyticus, aparentemente

associada exclusivamente a animais claramente um txon distinto, embora sua

afinidade filogentica com o complexo S. bovis / S. equinus seja evidente.

Streptococcus intestinalis___________________________________________

Streptococcus intestinalis (in.test.in.alis., adjetivo masculino latino

intestinalis, pertencendo ao intestino), Em 1988, Robinson et al. propuseram o

nome de S. intestinalis para um grupo de estreptococos beta-hemolticos e

ureolticos que eram membros predominantes da microbiota intestinal de porcos.

Em 1999, Vandamme et al. verificaram que o motivo para a espcie S. intestinalis,

descrita por Robinson et al. em 1988, ser beta-hemoltico estaria no fato de os

pesquisadores terem usado o meio Brain-Heart Infusion Agar (BHI-A) acrescido de

5% de sangue, um meio que no normalmente usado para caracterizao de

hemlise, e demonstraram que as amostras de S. intestinalis eram alfa-

hemolticas em gar Columbia suplementado com sangue. Baseados, ainda, em

ensaios de hibridizao DNA-DNA e em perfis de protenas totais, estes autores

sugeriram que Streptococcus intestinalis (ROBINSON et al., 1988) fosse um

sinnimo jnior de Streptococcus alactolyticus (FARROW et al., 1984), o que

posteriormente foi confirmado por Schlegel et al. (2003).

13

Streptococcus caprinus_____________________________________________

Streptococcus caprinus (caprinus, latim, da cabra). A espcie S. caprinus foi

descrita por Brooker et al. em 1994 englobando estreptococos encontrados no

intestino de cabras selvagens. capaz de crescer em meio complexo contendo

cido tnico, formando halos de clareamento, e tambm de crescer em meio

complexo com menos de 2,5% (p/v) de taninos condensados, derivados de Acacia

aneura. Entretanto, Sly et al. (1997) observaram que a espcie S. caprinus

tratava-se de um sinnimo da espcie Streptococcus gallolyticus (OSAWA,

FUJISAWA & SLY, 1995), mas o epteto especfico gallolyticus tem a prioridade

nomenclatural.

Streptococcus gallolyticus___________________________________________

Streptococcus gallolyticus (gallolyticus, adjetivo masculino latino, que digere

galato). Osawa et al. (1995) demonstraram que amostras isoladas de coalas,

ces, vacas e outros animais pertenciam ao grupo de homologia 2 de Farrow et al.

(1984) e propuseram o nome de Streptococcus gallolyticus, baseado na

capacidade destas amostras degradarem o galato. Os autores observaram que

essas amostras degradavam os taninos com liberao de cido glico e, em

seguida, havia descarboxilao do cido glico em pirogallol. Algumas amostras

requerem crescimento em atmosfera enriquecida com CO2. Estes microrganismos

crescem a 10C e 45C, mas sua temperatura tima de crescimento de 37C.

14

Estes autores tambm incluram em seus estudos amostras de infeco

humana de S. bovis pertencentes aos biotipos I e II e, baseados em estudos de

reassociao de DNA, relacionaram as amostras dos biotipos I e II.2 a espcie S.

gallolyticus. Estudos posteriores confirmaram, atravs da anlise do perfil de

protenas totais e da utilizao de sondas especficas para o rRNA 16S, que

nenhuma amostra de origem humana denominada S. bovis pelos critrios at

ento utilizados estava relacionada ao grupo de homologia 1 descrito por Farrow

et al. (1984), o qual compreendia as amostras de referncia de S. bovis e S.

equinus, e foi sugerido que todas as amostras humanas de S. bovis I e II.2 fossem

identificadas oficialmente como S. gallolyticus (NELMS et al., 1995; DEVRIESE et

al., 1998). Por sua vez, Clarridge et al. (2001) demonstraram, atravs de testes

fenotpicos e do sequenciamento do gene que codifica o rRNA 16S, que as

amostras de S. bovis do biotipo II.2 constituam uma genoespcie distinta de S.

bovis, S. gallolyticus e S. infantarius.

Streptococcus infantarius____________________________________________

Streptococcus infantarius (in.fan.tari.us., adjetivo latino infantarius

relacionado aos infantes). Em 1997, Bouvet et al. propuseram a nomenclatura de

Streptococcus infantarius para algumas amostras do grupo de homologia 4

proposto por Farrow et al. (1984). Em 2000, Schlegel et al. validaram a

nomenclatura e propuseram a diviso em duas subespcies: S. infantarius subsp.

infantarius para amostras -glicosidase negativas e esculina variveis e S.

infantarius subsp. coli para amostras -glicosidase e esculina positivas. As

15

amostras descritas por Coykendall & Gustafson (1985) e Knight & Shlaes (1985)

como S. bovis II.1 foram relacionadas a espcie S. infantarius e encontravam-se

distribudas em ambas as subespcies.

Streptococcus macedonicus_________________________________________

Streptococcus macedonicus (ma.ce.do.ni.cus., adjetivo masculino latino;

macednicos, da Macednia, Norte da Grcia, de onde a bactria foi

primeiramente isolada). Espcie descrita por Tsakalidou et al. (1998), isolada do

queijo grego Kasseri (feito com leite de ovelha e/ou cabra). No hidrolisa a

esculina.

Streptococcus waius________________________________________________

Streptococcus waius (waius, substantivo neo-zelands maori waiu = leite).

Espcie descrita por Flint, Ward & Brooks (1999), compreendendo amostras de

estreptococos isoladas do leite e laticnios e que toleram a pasteurizao (72C/

15 s), crescem em temperaturas acima de 52C, em caldo contendo NaCl a 7% e

em uma faixa de pH variando de 4,0 a 10,0. Baseados em anlises da seqncia

do espaador intergnico 16S-23S, anlises de fingerprinting de DNA obtidos

atravs do polimorfismo gentico gerado a partir da amplificao randmica de

segmentos de DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA - Polymerase Chain

Reaction, RAPD-PCR) e da tcnica de eletroforese em campo pulsado (Pulsed

Field Gel Electrophoresis, PFGE), experimentos de hibridizao DNA-DNA e em

16

testes fenotpicos, Manachini et al. (2002) consideraram as espcies S.

macedonicus e S. waius sinnimos, sendo que S. macedonicus tem prioridade

nomenclatural.

Streptococcus pasteurianus__________________________________________

Streptococcus pasteurianus (pas.teu.ri.an.us., do Instituto Pasteur, onde a

espcie foi caracterizada). Espcie descrita por Poyart, Quesne & Trieu-Cuot

(2002) que compreende amostras anteriormente caracterizadas como S. bovis

biotipo II.2.

Streptococcus lutetiensis____________________________________________

Streptococcus lutetiensis (lu.teti.en.sis., de Lutcia, Paris, onde a espcie

foi caracterizada). As amostras de Streptococcus lutetiensis, espcie descrita por

Poyart, Quesne & Trieu-Cuot (2002), eram previamente designadas como S.

infantarius subsp. coli.

Apesar de estudos recentes terem trazido importantes contribuies, ainda

h controvrsias com relao taxonomia de algumas espcies desse grupo de

microrganismos. Portanto, diferentes propostas de classificao taxonmica tm

sido descritas desde ento.

17

Poyart, Quesne & Trieu-Cuot (2002), com base no seqenciamento do gene

sodA, que codifica a enzima superxido dismutase dependente de mangans (Mn-

SOD), definiram cinco diferentes clusters dentre as espcies que compem o

complexo S. bovis / S. equinus:

As amostras-tipo de S. equinus e S.bovis compreenderiam um cluster, e, por

questo de prioridade nomenclatural, prevaleceria a designao S. equinus;

As amostras-tipo de S. gallolyticus, S. caprinus, S. macedonicus e S. waius

foram alocadas em um cluster, correspondendo a uma nica espcie,

denominada S. gallolyticus;

As duas subespcies que constituam a espcie S. infantarius foram

separadas em dois clusters distintos, sendo que um desses clusters

compreendeu a espcie S. infantarius e incluiu a amostra-tipo de S.

infantarius subsp. infantarius. O outro cluster foi representado por S.

infantarius subsp. coli, levando a proposio de sua reclassificao como

uma nova espcie, denominada S. lutetiensis;

O cluster restante compreendeu todas as amostras previamente identificadas

como S. bovis biotipo II.2, cuja nomenclatura proposta foi S. pasteurianus.

Em seguida, Schlegel et al. (2003; 2004) publicaram novos estudos sobre a

sistemtica das espcies deste complexo e, com base em resultados fenotpicos,

anlises genticas e filogenticas (hibridizao DNA-DNA e seqenciamento do

gene que codifica o rRNA 16S) propuseram que as espcies S. gallolyticus (S.

bovis biotipo I e S. caprinus), S. bovis biotipo II.2 (S. pasteurianus), S.

18

macedonicus e S. waius constituam um mesmo DNA cluster dividido em trs

diferentes subgrupos. De acordo com os critrios atuais para definio de

espcies, foram propostas as denominaes S. gallolyticus subsp. gallolyticus

subsp. nov., S. gallolyticus subsp. pasteurianus subsp. nov. e S. gallolyticus

subsp. macedonicus subsp. nov.. Esses autores tambm confirmaram que S.

alactolyticus, S. equinus, S. gallolyticus e S. macedonicus so, respectivamente,

sinnimos anteriores de S. intestinalis, S. bovis, S. caprinus e S. waius e dividiram

as espcies deste complexo em quatro genomoespcies distintas. So elas:

Genomoespcie 1 corresponde espcie S. equinus, agrupando as

amostras-tipo de S. equinus e S. bovis;

Genomoespcie 2 inclui as espcies previamente identificadas como S.

gallolyticus, S. macedonicus e S. pasteurianus, as quais foram subdivididas

em trs subespcies: S. gallolyticus subsp. gallolyticus, S. gallolyticus subsp.

macedonicus e S. gallolyticus subsp. pasteurianus;

Genomoespcie 3 rene a espcie S. infantarius, que foi novamente

dividida em duas subespcies: S. infantarius subsp. infantarius e S.

infantarius subsp. coli, as quais haviam sido reclassificadas,

respectivamente, como S. infantarius e S. lutetiensis por Poyart, Quesne &

Trieu-Cuot (2002);

Genomoespcie 4 representada pela espcie S. alactolyticus.

Devido variao das metodologias, critrios e denominaes empregadas

pelos diversos autores, torna-se difcil a comparao e avaliao de vrias

19

informaes j existentes na literatura sobre os membros desse complexo de

microrganismos. Algumas espcies ou variantes de estreptococos do complexo

S. bovis / S. equinus no so conhecidas como agentes etiolgicos de infeces

em seres humanos, embora estabeleam infeces em animais. Outras raramente

so isoladas de processos patolgicos em hospedeiros humanos. Na rea de

microbiologia mdica, os estreptococos do grupo D que apresentam importncia

clnica so ainda freqentemente referidos como S. bovis e seus biotipos, uma vez

que ainda faltam estudos empregando as denominaes mais recentemente

propostas.

Embora ocasionalmente os estreptococos do grupo D estejam associados

com infeces do trato urinrio, peritonite espontnea, meningite e sepse

neonatais e raramente com artrite sptica, endoftalmite, osteomielite vertebral e

peritonite associada dilise peritoneal ambulatorial contnua, a bacteremia e a

endocardite so os quadros clnicos mais comuns causados por estes

microrganismos (CALDERN, PEIR & PEALVER, 1992; HECHMANN-

WITTRUP et al., 1999; VILAICHONE et al., 2002; GAVIN et al., 2003; BLEIBEL et

al., 2007; SINAVE, 2007).

No entanto, esses microrganismos no so freqentemente isolados a partir

de bacteremias nos EUA e o SENTRY Antimicrobial Surveillance Program no

lista os estreptococos do grupo D entre os 20 microrganismos mais freqentes

responsveis por infeces da corrente sangnea naquele pas. Eles foram

identificados apenas em 0,8% das bacteremias causadas por estreptococos,

20

sendo que S. pneumoniae foi a espcie mais freqente deste gnero causadora

deste tipo de infeco. De acordo com o SCOPE Program de 30 hospitais norte-

americanos, os estreptococos em geral correspondem a 6% de todas as amostras

isoladas de hemoculturas e, dessas, os S. bovis representam 2,4% (SINAVE,

2007).

Internacionalmente, os dados do SENTRY indicam que os estreptococos do

grupo D foram identificados em 1,3% e 6,9% das bacteremias estreptoccicas no

Canad e na Amrica Latina, respectivamente (SINAVE, 2007).

Por outro lado, nos EUA, os microrganismos mais comumente encontrados

como agentes etiolgicos de endocardite infecciosa subaguda em vlvulas nativas

de pacientes que no haviam sido submetidos a tratamento com drogas

intravenosas foram os estreptococos da categoria dos viridans e os S. bovis

(SINAVE, 2007). Na Alemanha, Kupferwasser et al. (1998), analisando 177 casos

de endocardite infecciosa, verificaram que os S. bovis foram responsveis por

12,5% dos casos.

Os estreptococos do grupo D respondem por cerca de 5,0% a 15,1% de

todos os casos de endocardite infecciosa (KUPFERWASSER et al., 1998;

HERRERO et al., 2002; TRIPODI et al., 2004; FERREIROS et al., 2006). Em

alguns pases, a freqncia de endocardite por S. bovis vem aumentando

significativamente nos ltimos anos. A proporo de endocardites estreptoccicas

cresceu de 10,9% para 23,3% aps 1989, sendo que, na Frana, essa proporo

21

foi para 56,7%, em contraste com o resto da Europa (9,4%) e os Estados Unidos

(6,0%). Estudos recentes revelaram que os S. bovis so responsveis por 25% de

todos os episdios de endocardite infecciosa na Frana (HOEN et al., 2002; 2005;

GIANNITSIOTI et al., 2007).

Estas infeces acometem principalmente os idosos, com idade acima de

50 anos (idade mdia 67 anos). Essa faixa etria consideravelmente superior

dos pacientes com endocardite causadas por outros estreptococos, estafilococos

e outras bactrias (SINAVE, 2007). Tambm apresentam uma alta taxa de

mortalidade (45%), quando comparadas a endocardites causadas por outros

microrganismos (25%) (KUPFERWASSER et al., 1998). Por outro lado, Tripodi et

al. (2004) observaram uma taxa de mortalidade menor (16,7%) em pacientes com

endocardite por S. bovis.

Bacteremia por esses microrganismos tambm so comuns em pacientes

HIV positivos com uma taxa de mortalidade bastante elevada (71%). O papel da

AIDS em facilitar o desenvolvimento desse processo infeccioso incerto, porm

acredita-se que alteraes na regulao imune e mudanas na microbiota do

clon possam promover essa infeco sistmica (ALAZMI et al., 2006).

O S. bovis biotipo I est relacionado a bacteremias com ou sem endocardite

e leses malignas ou pr-malignas no clon, enquanto que o S. bovis biotipo II

est mais associado com bacteremia de origem hepatobiliar (SINAVE, 2007).

Corredoira et al. (2005) observaram que, em 50% dos pacientes com bacteremia

22

por S. bovis II, a porta de entrada para a infeco foi a rvore hepatobiliar, em

contraste com apenas 5% dos pacientes com bacteremia por S. bovis I. Ruoff et

al. (1989) e Corredoira et al. (2005) investigaram a associao entre neoplasias

intestinais e bacteremias por S. bovis e observaram que, respectivamente, em

seus estudos, 71% e 57% dos pacientes com bacteremias por S. bovis I

apresentavam leses malignas ou pr-malignas no clon. Em contrapartida, S.

bovis II estava associado a leses no clon em apenas 17% e 15% dos casos,

respectivamente. Da mesma maneira, a associao entre bacteremia e

endocardite foi muito maior com S. bovis I em ambos os estudos (94% e 74%,

respectivamente) do que com S. bovis II (18% e 15%, respectivamente). Adotando

as nomenclaturas recentemente propostas, a subespcie S. gallolyticus subsp.

gallolyticus estaria mais freqentemente associada a bacteremias em pacientes

com cncer de clon do que S. gallolyticus subsp. pasteurianus e as duas

subespcies de S. infantarius.

Outros possveis fatores de risco para o desenvolvimento de bacteremia por

S. bovis so plipos neoplsicos e outras leses malignas no trato gastrintestinal,

como carcinoma de esfago, estmago e pncreas e linfoma gstrico

(HERRINGTON et al., 1980; PIGRAU et al., 1988). H tambm relatos de

bacteremias por S. bovis associadas com doena crnica do fgado (ZARKIN et

al., 1990; TRIPODI et al. 2004), doena inflamatria do intestino (MOSHKOWITZ

et al., 1992) e parasitose intestinal (colite por Strongyloides stercoralis) (LINDER et

al., 2000).

23

S. infantarius subsp. infantarius pode ser isolado de fezes de humanos e j

foi detectado em hemoculturas, inclusive em casos de endocardite (MIHAILA-

AMROUCHE, SCHLEGEL & BOUVET, 2004). Amostras desta subespcie

tambm j foram isoladas de produtos alimentcios (laticnio e ervilha congelada).

J S. infantarius subsp. coli tem sido isolado exclusivamente de humanos, porm

de diversos espcimes clnicos, como fezes, urina e sangue, incluindo alguns

casos de endocardite (EUZBY, 2003).

Na literatura, h apenas a descrio de um caso de infeco por S.

gallolyticus subsp. macedonicus em seres humanos. Em 2002, Herrero et al.

reavaliaram os casos de endocardite causados por S. bovis entre os anos de 1975

e 1985 em um hospital nos EUA, atravs da anlise do gene que codifica o rRNA

16S. Assim, os autores demonstraram que uma amostra responsvel por um

quadro de endocardite no ano de 1978 era estreitamente relacionada a amostra-

tipo de S. macedonicus. Entretanto, no se sabe se quadros de endocardite

causados por S. gallolyticus subsp. macedonicus esto associados com cncer de

clon. Neste caso em particular, o paciente apresentava plipo cecal.

Atualmente, S. alactolyticus, S. equinus e as trs subespcies de S.

gallolyticus so as espcies pertencentes ao complexo S. bovis / S. equinus de

interesse na microbiologia veterinria.

S. alactolyticus normalmente encontrado no intestino de porcos e galinhas

e pode ser isolado de suas fezes, sendo uma das espcies predominantes no

24

clon de sunos. Esta espcie tambm j foi isolada em associao com

Corynebacterium suicordis de um caso de pericardite em suno, mas at o

presente momento nenhuma infeco foi atribuda formalmente a esta espcie

(EUZBY, 2003).

Amostras de S. equinus podem ser isoladas de intestino e fezes de seres

humanos, ruminantes (bovinos e ovinos), cavalos e porcos, sendo, s vezes,

isoladas da vagina de eqinos e, com menor freqncia, do tero de cadelas.

Estes microrganismos podem causar bacteremias em seres humanos, mastite em

ruminantes e, eventualmente, septicemia em ces (HODGE & SHERMAN, 1937;

EUZBY, 2003).

O S. bovis biotipo I foi renomeado por Osawa, Fujisawa & Sly (1995) como

S. gallolyticus e por Schlegel et al. (2003) como S. gallolyticus subsp. gallolyticus,

estando preferencialmente relacionado a infeces septicmicas em pombos,

denominadas estreptococoses (DE HERDT et al., 1994). Dentro dessa espcie,

diferentes fentipos podem ser reconhecidos em pombos: cinco biotipos e dois

sub-biotipos; cinco sorotipos e seis fentipos de sobrenadante de cultura. Um

esquema de caracterizao bioqumica, que compreende a fermentao de L-

arabinose, inulina, manitol e trealose, a produo de polissacardeo extracelular

em meio contendo sacarose e a observao de -hemlise, define os biotipos (1,

2a, 2b, 3, 4 e 5). Os cinco sorotipos (1-5), por sua vez, so determinados aps

ensaios de aglutinao em lmina utilizando soros hiper-imunes preparados contra

cinco amostras de referncia isoladas de pombos (DE HERDT et al., 1992). J os

25

seis fentipos de sobrenadante so classificados baseados na presena das

protenas extracelulares T1 (70kDa), T2 (68kDa) ou T3 (74kDa) e na presena ou

ausncia da protena A (185kDa), conforme observado aps eletroforese em gel

de poliacrilamida na presena de dodecil sulfato de sdio (SDS-PAGE) das

protenas do sobrenadante da cultura (VANROBAEYS et al., 1996). Embora o

papel dessas protenas na patognese ainda seja desconhecido, h uma alta

correlao entre o fentipo de sobrenadante e a virulncia da amostra, uma vez

que estudos sobre infeces experimentais demonstraram que as amostras

pertencentes aos fentipos A+T1, A+T2, A+T3 e A-T1 so altamente virulentas para

pombos, com uma morbidade ps-inoculao de 70% a 100%, enquanto que

amostras A-T3 e A-T2 so moderadamente ou pouco virulentas para essas aves,

respectivamente (VANROBAEYS et al., 1997).

S. gallolyticus subsp. gallolyticus tambm tem sido isolado de casos de

mastite bovina, assim como do rmen de cabras selvagens e fezes de diversos

animais, como ruminantes, cavalos, ces, pombos, coalas, cangurus e outros

(DEVRIESE et al., 1998).

S. gallolyticus subsp. pasteurianus j foi isolado de diversos espcimes

clnicos humanos, como lquor, sangue, urina e espcimes vaginais, sendo

responsvel por casos de sepse e meningite neonatais, infeces do trato urinrio

e endocardite (GAVIN et al., 2003; MIHAILA-AMROUCHE et al., 2004). Casos de

septicemia em aves (pato e peru) tambm j foram relatados para esta espcie

(EUZBY, 2003).

26

A espcie S. gallolyticus subsp. macedonicus foi isolada de queijo grego do

tipo Kasseri e tambm de queijos italianos. Amostras desta espcie foram isoladas

de biofilmes presentes em peas de ao inoxidvel utilizadas na indstria de

laticnios (TSAKALIDOU et al., 1998; FLINT, WARD & BROOKS, 1999; EUZBY,

2003).

Em seres humanos, os microrganismos pertencentes a este complexo,

principalmente S. gallolyticus subsp. pasteurianus, tambm so capazes de

causar sepse ou meningite neonatais fulminantes, que so clinicamente

indistinguveis daquelas causadas por estreptococos do grupo B. Nos casos de

infeco na forma precoce (dentro da primeira semana de vida), bacteremia a

manifestao clnica mais comum (72%), enquanto que meningite corresponde a

20% dos casos (GAVIN et al., 2003). Embora a sua associao com infeces

neonatais seja rara, possvel que a real freqncia destas infeces seja

subestimada, uma vez que muitas amostras clnicas de S. bovis podem ser

identificadas equivocadamente como enterococos ou estreptococos pertencentes

categoria dos viridans, como Streptococcus salivarius. A identificao precisa

de amostras de S. bovis causadoras de infeces neonatais tem importantes

implicaes na escolha do tratamento adequado, pois a penicilina G considerada

suficiente para o tratamento de infeces neonatais por esses microrganismos,

enquanto que vancomicina ou a associao com um aminoglicosdeo pode ser

necessria para o tratamento de infeces neonatais causadas por enterococos e

algumas espcies de estreptococos da categoria dos viridans (AMERICAN

ACADEMY OF PEDIATRICS, 2000).

27

Por outro lado, dados referentes resistncia aos antimicrobianos entre os

microrganismos desse complexo so raros na literatura. Em geral, amostras de S.

equinus, S. gallolyticus subsp. gallolyticus e S. gallolyticus subsp. pasteurianus

so sensveis in vitro aos beta-lactmicos e glicopeptdeos, mas j foi evidenciada

resistncia aos macroldeos, lincosamidas, cloranfenicol, nitrofurantona,

tetraciclina, sulfamida e trimetropim. Amostras de S. gallolyticus subsp.

macedonicus so susceptveis vancomicina, clindamicina, eritromicina e

oxacilina (EUZBY, 2003).

Mouton et al. (1997), analisando 19 amostras de S. bovis, observaram que

as concentraes mnimas inibitrias capazes de inibir 50% (CMI50) e 90% (CMI90)

das amostras para penicilina foram, respectivamente, 0,06g/mL (categorizado

como susceptvel) e 1g/mL (susceptibilidade intermediria). Apenas duas

amostras foram resistentes a esse antimicrobiano (CMI = 2g/mL).

Embora haja relatos de amostras resistentes a penicilina, a grande maioria

das amostras clnicas permanece sensvel (CMI 0,1g/mL). A penicilina G a

droga de escolha para o tratamento de infeces causadas por esses

microrganismos, inclusive endocardite. Para amostras com susceptibilidade

reduzida (CMI > 0,1g/mL e 0,5g/mL), a associao com um aminoglicosdeo

se faz necessria. J para as raras amostras com CMI > 0,5g/mL, o tratamento

deve ser idntico ao da endocardite enteroccica: associao sinrgica entre

ampicilina e gentamicina. Ceftriaxona e vancomicina podem ser utilizadas como

28

antimicrobianos alternativos em alguns casos, como por exemplo, em pacientes

alrgicos a penicilina (SINAVE, 2007).

Teng et al. (2001) observaram uma alta prevalncia de amostras de S.

bovis biotipo II.2 (S. gallolyticus subsp. pasteurianus) resistentes a tetraciclina e a

nveis elevados de eritromicina (71,7%). Em um estudo conduzido por Lee et al.

(2003), foi observado que todas as amostras de S. bovis isoladas de bacteremia

foram susceptveis a penicilina, cefalotina e vancomicina, sendo detectada

resistncia a clindamicina e eritromicina em 41% e 65% das amostras,

respectivamente. Siegman-Igra & Schwartz (2003) evidenciaram que duas

amostras de S. bovis isoladas de quadros de endocardite apresentaram

resistncia a nveis elevados de clindamicina (> 256g/mL).

Em 2004, Mihaila-Amrouche et al. realizaram um estudo sobre o impacto da

susceptibilidade aos antimicrobianos em amostras de estreptococos e enterococos

isoladas de pacientes com endocardite. Entre as 61 amostras de estreptococos do

grupo D, S. gallolyticus subsp. gallolyticus foi a espcie predominante (83,6% dos

casos), com 39% das amostras apresentando resistncia a altos nveis de

estreptomicina. Amostras de S. gallolyticus subsp. pasteurianus (6,6%) e S.

infantarius subsp. infantarius (9,8%) tambm foram analisadas neste estudo e as

trs espcies apresentaram baixos nveis de resistncia a gentamicina e

tobramicina. Tambm foi observada resistncia a eritromicina e clindamicina em

67% das amostras de estreptococos do grupo D. Embora a maioria das amostras

fosse resistente a vrios antimicrobianos, elas foram susceptveis aos

29

antimicrobianos recomendados para profilaxia durante procedimentos intestinais,

que incluem penicilina, amoxicilina, gentamicina e vancomicina.

Em contrapartida, a resistncia a glicopeptdeos j foi detectada em duas

espcies pertencentes ao complexo S. bovis / S. equinus. Duas amostras de S.

gallolyticus (S. gallolyticus subsp. gallolyticus), portadoras dos genes vanA e

vanB2 concomitantemente, e uma nica amostra de S. lutetiensis (S. infantarius

subsp. coli), que carreava apenas o determinante vanB2, foram isoladas de fezes

de bezerros na Holanda (MEVIUS et al., 1998). Em 2003, Dahl & Sundsfjord

confirmaram a identificao dessas amostras, atravs da anlise do gene sodA, e

demonstraram a transferncia in vitro do gene vanB2 presente nestas amostras

para amostras de Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium, sugerindo a

possibilidade de disseminao destes determinantes de resistncia a vancomicina

para outras bactrias patognicas.

A aceitao e o uso amplo das novas designaes de membros do

complexo S. bovis / S. equinus depender da adoo, pelos microbiologistas

clnicos, de procedimentos que identifiquem, com preciso, cada uma das distintas

espcies (FACKLAM, 2002).

A caracterizao dos estreptococos do complexo S. bovis / S. equinus tem

sido realizada tradicionalmente atravs de testes fisiolgicos convencionais ou de

sistemas comerciais de identificao (p. ex. API 20 Strep, Rapid ID 32 Strep e

outros) e sorotipagem. A maioria destes sistemas comerciais destina-se a

30

identificao de microrganismos de importncia mdica e possui vantagens como:

necessidade de pouca manipulao e fornecimento de resultados rpidos e de

fcil interpretao. Entretanto, alguns problemas tm sido encontrados quanto

identificao de espcies novas, cujos testes fisiolgicos necessrios no so

conhecidos ou as informaes so incompletas. Outra desvantagem a

dificuldade apresentada por esses sistemas para a identificao de amostras de

origem animal (FERTALLY & FACKLAM, 1987; BASCOMB & MANAFI, 1998).

Alm disso, essas caracterizaes fenotpicas no so muito confiveis, devido

expresso varivel de determinadas caractersticas e a freqente ambigidade na

interpretao de alguns resultados (POYART, QUESNE & TRIEU-CUOT, 2002).

Desse modo, diferentes pesquisadores (FARROW et al., 1984; BENTLEY,

LEIGH & COLLINS, 1991; KAWAMURA et al., 1995; POYART et al., 1998;

SCHLEGEL et al., 2004) tm usado tecnologias baseadas em cidos nuclicos

para aprimorar a identificao das espcies bacterianas, inclusive dos

estreptococos.

Uma parte significativa destes estudos envolve a aplicao de tcnicas

baseadas na reao em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR),

associada ou no a outras tcnicas moleculares, empregando uma variedade de

determinantes genticos como alvo. Um alvo universal de DNA, ideal para ser

utilizado na identificao microbiana ao nvel de espcies, deve conter seqncias

de nucleotdeos bem conservadas para cada espcie, mas tambm variao

suficiente para permitir a identificao espcie-especfica (GOH et al., 1996).

31

As diferentes subunidades do rRNA, principalmente 16S e 23S, tm sido

utilizadas em estudos relacionados a evoluo e identificao de gneros e

espcies bacterianas, devido ao seu grau de constncia funcional, o que assegura

uma relativa representatividade da taxa de mudana evolutiva numa linha de

descendentes. Eles so universais, ou seja, esto presentes em todos os

organismos e assumem diferentes posies em suas seqncias, mudando ao

acaso em taxas muito diferentes, permitindo que a maioria das relaes

filogenticas seja medida. Essas seqncias so longas, o que permite que elas

forneam informaes adequadas (WOESE, 1987).

A ampla utilizao da anlise das seqncias de genes que codificam o

rRNA 16S como ferramenta taxonmica em bacteriologia permitiu a redefinio

das relaes genticas e filogenticas, previamente baseadas na anlise do

metabolismo celular (JENSEN, WEBSTER & STRAUS, 1993). Anlises

comparativas do rRNA 16S revelaram que as suas seqncias altamente

conservadas contm regies variveis, permitindo a diferenciao de gneros e

espcies e a determinao de suas relaes filogenticas e evolutivas (JAYARAO,

DOR & OLIVER, 1992). Esta metodologia bastante utilizada para a

identificao de espcies de estreptococos, onde as amostras que apresentam

seqncias com similaridade igual ou superior a 97% so consideradas como

pertencentes a uma mesma espcie (MAGEE, 1998).

A avaliao do carter polimrfico de seqncias-alvo pode ser

estabelecida atravs da amplificao parcial ou integral por tcnicas de PCR,

32

utilizando oligonucleotdeos iniciadores que reconheam regies altamente

conservadas que flanqueiam estes alvos de DNA. O tamanho e a seqncia do

produto desta amplificao podem ser utilizados para a identificao de gneros e

espcies. A anlise deste produto pode ser realizada atravs do seu

seqenciamento ou, alternativamente, atravs de sua digesto com

endonucleases de restrio e os fragmentos resultantes podem ser separados

eletroforeticamente. Se o produto de PCR contiver stios de reconhecimento por

enzimas de restrio, o perfil de fragmentao deste produto pode ser indicativo

de uma espcie em particular (JENSEN, WEBSTER & STRAUS, 1993).

Outras seqncias de DNA j foram analisadas com esse propsito,

inclusive para aplicao ao estudo do complexo S. bovis / S. equinus. Dentre

elas, destacam-se:

Anlise dos espaadores internos dos genes que codificam o rRNA 16S e

23S (Internally Transcribed Spacer, ITS) (MANACHINI et al., 2002).

O gene cpn60, que codifica a protena do choque trmico de 60kDa

(HSP60), tambm conhecida como chaperonina molecular (Cpn60),

homlogo GroEL ou MopA (GOH et al., 1996; 2000; HILL et al., 2004).

O gene rpoB, que codifica a subunidade da RNA polimerase

(DRANCOURT et al., 2004).

O gene sodA, que codifica a enzima Mn-SOD (POYART, QUESNE &

TRIEU-CUOT, 2002; SASAKI et al., 2004).

33

Diversos fatores contribuem para as dificuldades encontradas na

identificao dos microrganismos do gnero Streptococcus, tanto por mtodos

fenotpicos quanto por moleculares. A taxonomia desse grupo de bactrias tem

estado sob freqente reviso e muitas novas espcies vm sendo descritas,

freqentemente sem informaes suficientes sobre caractersticas diferenciais e a

extenso das variaes fenotpicas e genticas dentro das espcies propostas

(FACKLAM, 2002).

Nas ltimas dcadas, a taxonomia de procariotos sofreu profundas

alteraes na direo de um sistema que refletisse as relaes evolutivas entre os

organismos aproximando a classificao microbiana o melhor possvel da

realidade biolgica. O uso da homologia DNA-DNA associada a uma variedade de

caractersticas ecolgicas e fenotpicas na classificao de microrganismos foi

denominada de taxonomia polifsica por Colwell (1970). Colwell props a

integrao da informao do nvel molecular ao ecolgico de forma a se obter

identificaes e classificaes mais precisas e confiveis. Em princpio, toda

informao genotpica, fenotpica e filogentica pode ser incorporada na

taxonomia polifsica, mas a hibridizao de DNA tem papel central no

delineamento de espcies. A abordagem polifsica da taxonomia tem sido

praticada nos ltimos 20 anos e pressupe que as descries polifsicas de

espcie devem refletir relaes filogenticas, ser baseadas em hibridizao de

DNA do genoma total e fornecer informao genotpica, fenotpica e

34

quimiotaxonmica adicional que d consistncia espcie definida em termos

filogenticos.

Em 1977, Woese & Fox publicaram um trabalho sobre o uso de seqncias

do cronmetro rRNA 16S para a reconstruo da rvore da Vida.

Subseqentemente, demonstrou-se que a anlise das seqncias do rRNA 16S

seria extremamente til na afiliao filogentica de bactrias em espcies,

gneros e famlias (WOESE, 1987), sendo, ento, esta prontamente incorporada

taxonomia polifsica (STACKEBRANDT & GOEBEL, 1987).

Sob o ponto de vista metodolgico, um dos principais problemas na

taxonomia de procariotos, em geral, a identificao de linhagens em nvel de

espcie por meio apenas de testes fenotpicos e de seqncias de rRNA 16S, pois

as caractersticas fenotpicas entre as espcies existentes so muito semelhantes

e a natureza conservativa das seqncias do gene do rRNA 16S muitas vezes

limita o poder de discriminao deste mtodo em distinguir linhagens

geneticamente prximas.

Neste caso, o critrio decisivo para definir a relao ao nvel de espcie

ainda a similaridade obtida em ensaios de hibridizao de DNA entre genomas

de dois organismos (STACKEBRANDT et al., 2002). Amostras demonstrando

similaridade igual ou superior a 70% em condies timas de reassociao, igual

ou superior a 60% em condies de estringncia e com divergncia nas regies

homlogas igual ou inferior a 5% so consideradas como pertencentes a mesma

35

espcie (WAYNE et al., 1987). A hibridizao de DNA a parte mais laboriosa e

demorada na taxonomia de procariotos e requer equipamentos especiais, alm de

pessoal treinado. Os resultados obtidos com esta tcnica no so cumulativos em

bases de dados, sendo que cada experimento novo deve incluir as linhagens de

referncia.

Atualmente, a taxonomia polifsica um consenso entre sistematas, pois

integra dados fenotpicos, quimiotaxmicos, moleculares e genmicos com o

objetivo de representar a biodiversidade nos seus diferentes nveis, isto , de

linhagem supra-famlia (VANDAMME et al., 1996). Neste contexto, diversas

tcnicas moleculares, tanto fenotpicas quanto genotpicas, baseadas, em sua

maioria, em padres de bandas (fingerprintings), foram aplicadas na dcada

passada (DIJKSHOORN, TOWNER & STRUELENS, 2002). Dentre elas,

destacam-se: anlise do perfil de protenas totais atravs de eletroforese em gel

de poliacrilamida na presena de dodecil sulfato de sdio (Sodium Dodecyl Sulfate

- Polyacrilamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE), determinao da composio

de cidos graxos de cadeia longa por cromatografia lquido-gasosa (Gas-Liquid

Chromathograph, GLC), anlise de perfis plasmidiais, RAPD-PCR, PCR de

elementos repetitivos (Repetitive Elements - PCR, rep-PCR), PCR seguido de

polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrio (PCR - Restriction

Fragment Length Polymorphisms, PCR-RFLP) de seqncias conservadas,

ribotipagem, polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados (Amplified

Fragment Length Polimorphism, AFLP), entre outras.

36

Aplicando ento uma abordagem polifsica, envolvendo tcnicas

moleculares fenotpicas (anlise dos perfis de protenas totais por SDS-PAGE e

determinao da composio de cidos graxos de cadeia longa por GLC) e

genotpicas (seqenciamento do rRNA 16S e hibridizao DNA-DNA), nosso

grupo iniciou um estudo com o intuito de melhor esclarecer as relaes

taxonmicas das espcies pertencentes ao complexo S. bovis / S. equinus e

props a sua diviso em quatro espcies e sete subespcies (TEIXEIRA et al.

2005):

Streptococcus alactolyticus;

Streptococcus equinus, subdividida em 2 subespcies:

S. equinus subsp. equinus;

S. equinus subsp. bovis;

Streptococcus gallolyticus, subdividida em 3 subespcies:

S. gallolyticus subsp. gallolyticus;

S. gallolyticus subsp. macedonicus;

S. gallolyticus subsp. pasteurianus;

Streptococcus infantarius, subdividida em 2 subespcies:

S.infantarius subsp. infantarius;

S.infantarius subsp. coli;

Entretanto, como nos demais estudos taxonmicos, foram includas apenas

algumas amostras de referncia, sendo necessria a aplicao mais ampla das

37

recomendaes resultantes, envolvendo a anlise de amostras isoladas em

laboratrios de rotina diagnstica. Ou seja, estudos adicionais precisam ser

realizados levando em considerao os novos conhecimentos sobre a taxonomia

e nomenclatura dentro do complexo S. bovis / S. equinus, j que esses

microrganismos continuam sendo isolados, com freqncia significativa, em

hemoculturas de pacientes com bacteremia, sepse e endocardite.

Tais estudos contribuiro para a validao de novas metodologias e

recomendaes para a identificao, assim como para o conhecimento da

associao das diferentes espcies com quadros clnicos diversos, podendo

tambm servir de base para a elucidao de vrias outras questes sobre esses

microrganismos que permanecem por ser esclarecidas.

38

OObbjjeettiivvooss

Com base nos resultados j obtidos e considerando que os estreptococos

do complexo Streptococcus bovis / Streptococcus equinus ainda apresentam

aspectos a serem esclarecidos com relao a sua taxonomia e critrios de

identificao e, ainda, a necessidade do desenvolvimento e/ou aplicao

sistemtica de metodologias que permitam a discriminao e identificao precisa

das diferentes espcies pertencentes a este complexo, aliada a escassez de

trabalhos aplicando as recomendaes taxonmicas mais recentes ao estudo de

amostras isoladas de materiais clnicos, o presente trabalho teve como objetivos:

I. Dar continuidade ao estudo taxonmico, atravs da aplicao das

recomendaes do trabalho iniciado por nosso grupo para a identificao

fisiolgica das espcies pertencentes ao complexo S. bovis / S. equinus e de

tcnicas moleculares, baseadas na anlise de protenas e de DNA. Para tal,

amostras de referncia das diferentes espcies descritas at o momento como

pertencentes ou relacionadas a este complexo, bem como uma coleo de

amostras de origem clnica, foram analisadas comparativamente, quanto :

Caractersticas fenotpicas atravs de testes fisiolgicos convencionais e de

um sistema miniaturizado de identificao;

Anlise do perfil de protenas totais por SDS-PAGE;

39

Determinao dos padres de restrio dos produtos de amplificao do

gene que codifica o rRNA 16S (gene rrs);

Anlise por seqenciamento do gene rrs;

II. Caracterizar fenotpica e genotipicamente uma coleo de amostras isoladas de

materiais clnicos diversos. Para tal, foram empregadas as seguintes

metodologias:

Determinao do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos por tcnica

de disco-difuso;

Determinao de fentipos de resistncia a eritromicina por tcnica de duplo-

disco;

Deteco, por tcnica de PCR, da presena de genes envolvidos na

expresso de resistncia a eritromicina, tetraciclina e nveis elevados de

estreptomicina;

Caracterizao genotpica atravs da anlise dos perfis de fragmentao do

DNA cromossmico por PFGE;

40

MMaatteerriiaaiiss && MMttooddooss

1. AMOSTRAS BACTERIANAS

Foram estudadas 236 amostras, incluindo 23 amostras de referncia, sendo

12 amostras-tipo e 11 outras amostras de referncia das diferentes espcies

pertencentes ou relacionadas ao complexo Streptococcus bovis / Streptococcus

equinus (Tabela 1), e 213 amostras de origem clnica, em sua maioria cedidas

pelo Dr. Richard Facklam do Streptococcus Laboratory, Centers for Disease

Control and Prevention (CDC), Atlanta, Georgia, EUA. As amostras clnicas foram

isoladas de seres humanos (208 amostras) e animais (5 amostras) entre 1970 e

2006 e haviam sido presuntivamente identificadas como pertencentes ou

relacionadas a este complexo.

As amostras esto mantidas em tanques de N2 lquido, sob a forma de

suspenses em soluo contendo Skim Milk (Difco Laboratories, Detroit, Michigan,

EUA) a 10% (p/v) e glicerol (Reagen, Quimibrs Indstrias Qumicas S/A, Rio de

Janeiro, Brasil) a 10% (v/v). A reativao das amostras foi feita atravs da

semeadura em placas contendo Trypticase Soy Agar (TSA, Difco Labs.)

suplementado com 5% de sangue desfibrinado de carneiro (TSA-S) e incubao a

352C por 20h-24h em atmosfera com 5% de CO2.

41

2. CARACTERIZAO FISIOLGICA DAS AMOSTRAS BACTERIANAS

As amostras bacterianas foram caracterizadas por testes fisiolgicos

convencionais, com base nas recomendaes de Facklam (2002) e de Teixeira et

al. (2005), empregando os seguintes testes: observao das caractersticas morfo-

tintoriais pelo mtodo de Gram, produo de catalase, observao do tipo de

hemlise, hidrlise da esculina em presena de 40% de bile, crescimento na

presena de 6,5% de cloreto de sdio, hidrlise de L-leucina--naftilamida e de L-

pirrolidonil--naftilamida, hidrlise do amido, produo de cidos a partir de inulina,

lactose, manitol, melibiose, rafinose e trealose. Os critrios para interpretao

foram aqueles apresentados na Tabela 2. As amostras foram tambm testadas

quanto produo de cidos a partir de glicognio, metil--D-glicopiranosdio e

metil--D-glicopiranosdio.

2.1. Colorao pelo Mtodo de Gram

Aps o crescimento das amostras em TSA-S a 352C por 20h-24h em

atmosfera de CO2, foram preparadas suspenses bacterianas em soluo salina

fisiolgica (NaCl 0,85%) e, destas, foram feitos esfregaos em lminas de vidro.

Aps colorao pelo mtodo de Gram, os esfregaos foram observados ao

microscpio ptico em objetiva de 100X (imerso).

42

2.2. Produo da Enzima Catalase

A observao da produo de catalase foi efetuada por metodologia

convencional, em lmina de vidro. A partir de um crescimento recente em meio

TSA-S, uma suspenso espessa do microrganismo foi depositada sobre uma gota

de perxido de hidrognio (H2O2) a 3% (v/v). A formao de bolhas, resultante da

hidrlise da H2O2 por ao da enzima catalase, foi indicativa de reao positiva.

Os microrganismos do gnero Streptococcus so negativos para esse teste.

2.3. Observao do Tipo de Hemlise

As propriedades hemolticas foram observadas a partir do crescimento das

amostras em placas contendo meio TSA-S, aps incubao a 352C por 20h-24h

em atmosfera com 5% de CO2. Durante a semeadura, foram feitas picadas em

profundidade no gar com o auxlio de uma ala bacteriolgica, a fim de facilitar a

verificao do tipo de hemlise. A formao de halos de hemlise total ao redor

das colnias foi definida como -hemlise. Amostras que apresentaram halos de

hemlise parcial, adquirindo a colorao esverdeada, foram caracterizadas como

-hemolticas. Amostras que no produziram alterao dos eritrcitos presentes

no meio foram definidas como no-hemolticas.

43

2.4. Hidrlise da Esculina em Presena de Bile (BE)

As amostras foram semeadas em gar Bile Esculina (Bile Esculin Agar,

BEA, Difco Labs.) e incubadas a 352C por 20h-24h. A positividade do teste foi

considerada pelo escurecimento do meio, em funo da hidrlise da esculina em

esculetina, na presena de bile.

2.5. Crescimento na Presena de 6,5% de Cloreto de Sdio (NaCl)

O crescimento na presena de cloreto de sdio a 6,5% foi verificado atravs

da inoculao das amostras em meio HIB (Heart Infusion Broth, Difco Labs.),

suplementado com cloreto de sdio na concentrado de 6,5% (p/v); 0,1% de

soluo alcolica de prpura de bromocresol a 1,6% (p/v) e 0,1% (p/v) de D-

glicose. O resultado positivo foi indicado atravs da turvao do meio,

acompanhada ou no da mudana de cor do indicador, de prpura para amarelo,

em at sete dias de incubao na temperatura de 352C.

2.6. Hidrlise de L-Leucina--Naftilamida (LAP) e L-Pirrolidonil--

Naftilamida (PYR)

Para a execuo destes testes, uma suspenso espessa de cada amostra,

obtida a partir de um crescimento recente, foi preparada em 0,2mL de caldo Todd-

Hewitt (Todd-Hewitt Broth, THB, Difco Labs.) contendo 0,01% de PYR ou 0,02%

de LAP (Sigma Chemical Co., St Louis, EUA). Aps um perodo de 4h de

44

incubao a 352C, foram adicionadas uma a duas gotas de soluo reveladora

contendo dimetilamino cinamaldedo (Sigma Co.) a 1% em HCl a 10% (v/v). A

leitura do teste foi feita imediatamente e em at 10 min, aps agitao suave. A

positividade do teste foi considerada pelo aparecimento de colorao rosa forte ou

prpura.

2.7. Hidrlise do Amido

Para a verificao da produo de amilases, os microrganismos foram

cultivados em meio HIA (Heart Infusion Agar, Difco Labs.) contendo amido solvel

a 2% (p/v) (Sigma Co.) e incubados a 352C por 18h-24h. A reao positiva foi

verificada pelo aparecimento de uma regio no corada ao redor do crescimento,

aps adio de soluo lugol sobre a superfcie da placa. A colorao azul escura

(ou roxa) em toda a placa indicou a ausncia de hidrlise.

2.8. Produo de cidos a partir de Glicognio, Inulina, L

streptococcus bovis streptococcus ”: uma avaliação...

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