SthefanyPagliari

Diagnóstico molecular da Toxoplasmose congênita e gestacional: revisão bibliográfica

Londrina

2011

SthefanyPagliari

Diagnóstico molecular da Toxoplasmose congênita e gestacional: revisão bibliográfica

Monografia apresentada ao Curso de

Especialização em Saúde Coletiva e Saúde da

Família para a Banca Examinadora do Centro

Universitário Filadélfia – UniFil, para obtenção

do título de Especialista.

Londrina

2011

SthefanyPagliari

Diagnóstico molecular da Toxoplasmose congênita e gestacional: revisão

bibliográfica

Monografia apresentada ao Curso de

Especialização em Saúde Coletiva e Saúde da

Família para a Banca Examinadora do Centro

Universitário Filadélfia – UniFil, para obtenção

do título de Especialista.

Aprovada em: ______/_____/______

_______________________________________________________________

Prof. Dr. Italmar Teodorico Navarro

Orientador

_______________________________________________________________

Prof.Ms.Vânia Oliveira Melo

Membro da Banca Examinadora

Dedicatória

Sempre aos meus pais, Ossiris e Beatriz pela dedicação e

apoio dado em todas as minhas decisões!

PAGLIARI, Sthefany. Diagnóstico molecular da Toxoplasmose congênita e gestacional:

revisão bibliográfica. 2011. 46 f. Monografia (Especialização em Saúde Coletiva e Saúde da

Família) – Centro Universitário Filadélfia, Londrina, 2001.

RESUMO

O Toxoplasma gondiié um parasita intracelular obrigatório de distribuição mundial que possui

a capacidade de invadir uma enorme variedade de hospedeiros tendo os Felídeos como

hospedeiros definitivos. O homem pode adquirir a infecção através da ingestão de oocistos

esporulados presentes no meio ambiente, ingestão de cistos teciduais e pela via

transplacentária.A transmissão congênita ocorre quando a mãe se infecta pela primeira vez

durante o período da gestação, sendo assintomática e tendo o diagnóstico da infecção

confirmado através da sorologia. Devido ao elevado número de resultados inconclusivos e de

difícil interpretação encontrados na literatura, fez-se um levantamento bibliográfico sobre a

toxoplasmose congênita e gestacional dando destaque ao diagnóstico e as principais técnicas

moleculares utilizadas na identificação da infecção. As técnicas moleculares como a PCRe o

WB, podem ajudar para uma melhor interpretação do estado real da interação

parasito/homem, embora sejam ainda pouco validadas para uso na rotina de diagnóstico

laboratorial no Brasil devido a diferenças quanto à sensibilidade e a especificidade em

decorrência da grande variabilidade genotípica das cepas de T.gondii isoladas. Portanto é

necessário ainda mais estudos envolvendo a caracterização genotípica das cepas, responsáveis

pela infecção toxoplásmica em gestantes, nos diferentes ecossistemas do nosso país.

Palavras-chave: Toxoplasmose congênita. Diagnóstico molecular. PCR. Wetern Blot.

PAGLIARI, Sthefany. Diagnóstico molecular da Toxoplasmose congênita e gestacional:

revisão bibliográfica. 2011. 46 f. Monografia (Especialização em Saúde Coletiva e Saúde da

Família) – Centro Universitário Filadélfia, Londrina, 2001.

ABSTRACT

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite with worldwide distribution. This

parasite has the capacity of invading an enormous variety of hosts, but only the feline act as

primary hosts. Humans can acquire infection through ingestion of sporulatedoocysts in the

environment, ingestion of tissue cysts or via the placenta. The congenital transmission occurs

when the mother becomes infected for the first time during pregnancy, the clinical

presentation in asymptomatic and the diagnosis can be made through serological methods.

Due to high number of inconclusive results with difficult interpretations found in the

literature, this bibliographic survey on congenital and gestational toxoplasmosis focuses on

diagnosis and the main molecular methods used for detection of this parasite. The molecular

methods, such as PCR and WB, can assist to achieve a better interpretation of the real parasite

/ human interaction, although these methods are still little validated for routine use in the

diagnosis laboratories in Brazil due to sensitivity and specificity differences. These

differences are result of the great genotypic variability between isolated T. gondiistrains.

Therefore more studies on genotypic characterization of strains are required.

Keywords: Congenital Toxoplasmosis. Molecular Diagnosis. PCR. Western Blot.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 7

2. METODOLOGIA ................................................................................................................ 9

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 10

3.1 Histórico ............................................................................................................................. 10

3.2 O protozoário: Toxoplasma gondii ..................................................................................... 11

3.3 O ciclo biológico ................................................................................................................ 12

3.4 Fontes de infecção .............................................................................................................. 16

3.5 Toxoplasmose Congênita e Gestacional ............................................................................. 18

3.6 Prevalência.......................................................................................................................... 19

3.7 Diagnóstico ......................................................................................................................... 19

3.7.1 Diagnóstico materno e fetal ............................................................................................ 22

3.7.2 Diagnóstico no neonato ................................................................................................... 24

3.8 Métodos Moleculares para detecção da toxoplasmose ....................................................... 26

3.8.1 PCR (Polimerase Chain Reaction) .................................................................................. 26

3.8.2 Western blot ..................................................................................................................... 30

3.12 Tratamento ........................................................................................................................ 32

3.13 Estratégias de prevenção e vigilância ............................................................................... 32

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................ 35

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 36

7

1. INTRODUÇÃO

A toxoplasmose é uma zoonose causada pelo Toxoplasma gondii, parasita intracelular

obrigatório, de distribuição mundial e que acomete animais de sangue quente (JACOBS;

LUNDE, 1957). A doença possui alta prevalência sorológica, podendo atingir mais de 60% da

população em determinados países, no entanto, os casos de doença clínica são menos

frequentes. Em algumas regiões, 40 a 70% da população humana adulta apresentam sorologia

positiva para a toxoplasmose (KAWAZOE, 2002). Condições ambientais, hábitos culturais e

a própria fauna constituem alguns dos fatores que podem explicar a variabilidade desta

infecção em diferentes áreas geográfica de um determinado país (DUBEY, 1977).

O homem adquire a infecção por três vias principais: ingestão de oocistos esporulados

presentes no meio ambiente, ingestão de cistos teciduais em carne crua ou mal cozida de

animais infectados e pela via transplacentária (FRENKEL; DUBEY; MILLER, 1970).

Nas gestantes, o diagnóstico precoce da infecção pelo T. gondii e o tratamento

antiparasitário adequado podem reduzir a gravidade das sequelas ao feto (FOULON;

NAESSENS; DERDE, 1994). A transmissão do T. gondii da mãe para o feto ocorre em 30% a

40% dos casos e a gravidade das sequelas varia de acordo com o período gestacional em que

ocorre a infecção aguda (DESMONTS et al., 1985).

O diagnóstico da toxoplasmose gestacional se baseia em exames laboratoriais, pois

geralmente, a gestante não apresenta sintomas da infecção, entretanto, a sorologia é complexa

e de difícil interpretação, sendo necessário o conhecimento das limitações de cada técnica, a

avaliação do perfil das classes de imunoglobulinas presentes e a sua associação com a idade

gestacional (JONES; LOPEZ; WILSON, 2003). Sem a interpretação correta dos resultados,

muitas gestantes são tratadas desnecessariamente e outras, por falha ou ausência de

diagnóstico, não são tratadas. Ambas as situações podem ser danosas tanto para mãe quanto

para o feto (REMINGTON et al., 2006).

Como auxiliar na determinação do tempo da infecção utiliza-se a detecção de

anticorpos IgM específicos, entretanto, a interpretação do resultado IgM reagente é

complicada pela persistência dessa imunoglobulina por mais de 18 meses após a infecção, e

pela reação falso positiva dos testes comerciais (JONES; LOPEZ; WILSON, 2003; WILSON;

MCAULEY, 1999).

A alta sensibilidade das técnicas sorológicas atuais trouxe a realidade da presença de

IgM residuais confundindo muitas vezes o diagnóstico final. Nesse sentido, o presente

trabalho teve como objetivo realizar um levantamento bibliográfico sobre a toxoplasmose

8

congênita e gestacional dando destaque ao diagnóstico e as principais técnicas moleculares

utilizadas na identificação desta infecção, tais como a Reação em Cadeia da Polimerase

(PCR) e Western Blot, as quais podem ajudar a uma melhor interpretação do estado real da

interação parasito/homem.

9

2. METODOLOGIA

A pesquisa bibliográfica é um levantamento científico de produções compatíveis ao

tema proposto (BIAZIN, 2008) e tem por finalidade conhecer as diferentes formas de

contribuição científica que se realizam sobre um determinado assunto, sem ser confundida

como pesquisa de documentos (OLIVEIRA, 2004).

Sendo assim a presente pesquisa foi realizada com base em Teses, Dissertações, livros,

manuais de orientação, artigos encontrados através de pesquisas em bibliotecas e pesquisa

eletrônica nas bases de dados Pubmed e Scielo no período de Outubro de 2010 a agosto de

2011. Não houve restrições de línguas e usaram-se as seguintes palavras chaves:

"toxoplasmosis”, "pregnancy", "molecular diagnosis".

Todo o material obtido durante a pesquisa foi revisado e incluído de acordo com os

seguintes critérios de seleção: revisões, artigos completos e estudos originais relacionados

com a toxoplasmose congênita e gestacional no âmbito do diagnóstico sorológico e molecular,

prevenção e tratamento, incluindo obras nacionais e internacionais.

10

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Histórico

O protozoário T. gondii foi primeiramente encontrado no baço, fígado e sangue de um

pequeno roedor popularmente conhecido como gondi (Ctenodactylus gundi), descrito por

Nicolle e Manceaux em 1908, no Instituto Pasteur da Tunísia, Norte da África sendo

denominado de Leshimania gondii (NICOLLE E MANCEAUX, 1909). Ao mesmo tempo e

independentemente Splendore isolou o parasita de um coelho mantido no Instituto Biológico

de São Paulo no Brasil e o denominou de Toxoplasma cuniculli. Somente no ano seguinte,

baseado nas características morfológicas foi proposta a denominação T.gondii para o parasita

pertence ao filo Apicomplexa, cujo gênero é derivado do grego toxon (arco) e plasma

(molde), devido ao seu formato curvado e crescente.

A primeira descrição da infecção por T.gondii em humanos ocorreu na cidade de

Praga, em uma criança de 11 meses que faleceu de hidrocefalia congênita, microftalmia e

formação de cistos oculares (JANKU, 1923). Em 1927, Torres encontrou lesões no sistema

nervoso central, coração e músculo esquelético e a presença de um parasito intracelular de

uma menina recém-nascida no Rio de Janeiro (GUIMARÃES, 1943). Somente no ano de

1939, a infecção congênita foi descrita por Wolf, Cowen e Peige, como causa da morte de

uma menina com um mês de vida que desenvolveu convulsões e coriorretinite em ambos os

olhos após três dias de idade sendo que os achados de T.gondii foram isolados de animais

inoculados com material da medula espinhal e córtex cerebral após a necropsia da mesma. No

ano de 1940, Pinkerton e Weinman foram os primeiros a descreverem a doença em um adulto

de 22 anos, do Peru, e um ano depois Pinkerton e Henderson relataram outros dois casos em

adultos com idade entre 40 a 50 anos em St. Louis, Missouri, demostrando a presença de

T.gondii como agente etiológico nos tecidos pós mortem e passagem seriada em animais.

Esses foram os primeiros relatos de toxoplasmose aguda em adultos com ausência de sinais

neurológicos (revisado por WEISS e DUBEY, 2009).

Somente após a introdução das técnicas sorológicas desenvolvidas por Albert Sabin e

Feldman Herry, como o teste de corante, que se tornou possível a realização de estudos

epidemiológicos sobre a real incidência da infecção pelo T.gondii no homem e a prevalência

mundial desta infecção (SABIN e FELDMAN, 1948).

11

3.2 O protozoário: Toxoplasma gondii

O T. gondii é um protozoário pertencente ao reino Protista, sub-reino Protozoa, filo

Apicomplexa, classe Sporozoa, subclasse Coccidia, ordem Eucoccidiida, subordem Eimeriina,

família Sarcocystidae, subfamília Toxoplasmatinae, gênero Toxoplasma, espécie Toxoplasma

gondii (KAWAZOE, 2002). É um eucarionte estruturalmente formado por uma membrana

externa, anéis polares, conóide, microtúbulos, grânulos densos, micronemas, roptrias,

mitocôndria, retículo endoplasmático, complexo de golgi, ribossomos, retículo

endoplasmático rugoso, microporo e um núcleo com parede bem definida (figura 1) (METSIS

e PETERSEN, 1995).

Três linhagens clonais tipicamente distintas do T.gondii são designadas em cepa tipo I,

II e III, que diferem em virulência e padrão epidemiológico de ocorrência. Na Europa e

América do Norte, mais de 95% dos isolados pertencem quase que exclusivamente a um dos

três tipos. Na França, mais de 600 isolados pertencem ao tipo II, inclusive os isolados da

toxoplasmose congênita (BECK et al., 2009). Em pacientes com doença congênita, são

relatados os tipos I e II, já os isolados em animais são predominante do genótipo tipo III. As

cepas de T. gondii tipo I são extremamente virulentas, produzindo altos níveis de parasitemia

com aumento do risco de transmissão transplacentária e aumento da morbi-mortalidade em

fetos em desenvolvimento. Já as cepas dos tipos II e III levam a cronificação da infecção e

produção de cistos teciduais (HOWE e SIBLEY, 1995)

12

Figura 1- Morfologia geral da forma taquizoíta de Toxoplasma gondii.

(A) Representação esquemática. O esquema foi construído a partir de corte aleatórios do

parasito observados em microscopia eletrônica de transmissão. (B) Corte longitudinal onde

várias das estruturas representadas em (A) estão assinaladas: N - núcleo, c - conóide, R -

róptrias, A - apicoplasto, CG - Complexo de Golgi, g - grânulo denso, seta - micronema, VP -

vacúolo parasitóforo. Barra: 1μm.

Fonte: Souza et al., 2010.

3.3 O ciclo biológico

O T. gondii é um parasita intracelular obrigatório que possui a capacidade de invadir

uma enorme variedade de células, tecidos e hospedeiros, porém somente os membros da

família Felidae (gatos domésticos e felídeos selvagens) são os hospedeiros definitivos do

parasita, podendo excretar 100.000 oocistos/g de fezes, no período de uma a duas semanas na

primoinfecção (FRENKEL et al., 1970) e seu ciclo biológico envolve duas fases, uma

assexuada e uma sexuada que ocorre somente nos hospedeiros definitivos (figura 2). As três

principais formas evolutivas do T.gondii são os taquizoítas, encontrado na fase aguda da

infecção como forma proliferativa capaz de invadir as células do hospedeiro, os bradizoítas ou

cistos teciduais, presente em vários tecidos na fase crônica da infecção e os oocistos que são

produzidos nas células intestinais dos felídeos sendo muito resistentes as condições

ambientais devido à presença da dupla parede (figura 3) (KAWAZOE, 2002).

13

Na fase assexuada, após a ingestão de cistos ou dos oocistos ocorre a liberação dos

bradizoítas ou esporozoítas por degradação enzimática e as formas infectantes são liberadas

no lúmen intestinal, que invadem o tecido dos hospedeiros e transformam-se em taquizoítas,

multiplicando-se localmente e se disseminando por todo o organismo pela via hematógena.

Essa série de eventos caracteriza o chamado ciclo extra-intestinal, tecidual ou sistêmico, fase

assexuada ou esquizogonia (DUBEY et al, 1998; FORTES, 1997). Em aproximadamente duas

semanas, os bradizoítas se confinam no citoplasma das células, em cistos, quando o

hospedeiro começa a desenvolver imunidade, fazendo com que a taxa de multiplicação do

parasita diminua (MARTINS, 2003). A resposta imune do hospedeiro destrói os taquizoítas,

mas os bradizoítas ficam protegidos pelo cisto intracelular e permanecem viáveis, por muitos

anos, em estado latente.

Nos felídeos, a fase sexuada se dá no epitélio do intestino desses animais por um

processo denominado gametogonia, já a esporogonia é o processo pelo qual o oocisto torna-se

infectante no meio ambiente contendo dois esporocistos cada um contendo quatro

esporozoítas. No interior das células epiteliais intestinais os parasitas crescem, transformam-

se em esquizontes, reproduzem-se e originam os merozoítas. Estes invadem outras células

epiteliais e prossegue o processo de multiplicação assexuada. O ciclo sexuado começa dois

dias após a ingestão dos cistos teciduais, alguns merozoítas originam macrogametócitos, e

outros, microgametócitos. Estes deixam as células da parede intestinal, atingem a luz do

intestino e são atraídos pelos macrogametas. A fecundação ocorre na célula da parede

intestinal, com a união dos dois núcleos e resultará na formação de um ovo ou zigoto que,

após segregar a parede cística, dá origem ao oocisto. As células epiteliais infectadas se

rompem e despejam os oocistos no lúmen intestinal, que começam a ser eliminados junto com

as fezes dos felídeos cinco a dez dias após o repasto infectante – isto é, o momento em que o

animal foi infectado – e a eliminação permanece por 1 a 2 semanas (DUBEY, 1994;

MILLER, 1997). Estes são encontrados em todo o intestino delgado, principalmente no íleo

em 3 a 15 dias após inoculação (DUBEY et al, 1998).

A origem dos gametas ainda não foi determinada. Nesta fase, o gato elimina os

oocistos, entretanto, estes devem esporular antes de se tornarem infectantes, processo que leva

de 1 a 5 dias após a excreção.

A esporulação ocorre no ambiente sendo dependente da temperatura e umidade

(DUBEY, 1994; DUBEY et al, 1998), após a maturação, os oocistos podem permanecer por

muito tempo viáveis no ambiente numa temperatura entre –20°C e 37°C, desde que não

14

expostos à luz solar direta e sob condições razoáveis de umidade relativa (DUBEY;

FRENKEL, 1972).

Figura 2- Ciclo biológico de Toxoplasma gondii.

Fonte: Mistuka-Breganó; Lopes-Mori; Navarro (2010).

15

Figura 3- Estágios morfológicos de T.gondii.

(A) Taquizoítas circulantes. As setas apontam taquizoítas individuais em forma crescente,

enquanto as cabeças de seta apontam taquizoítas em divisão; (B) Cistos teciduais em corte de

músculo esquelético. A seta está apontando para a fina parede do cisto, enquanto as cabeças

de seta estão apontando para bradizoítas no seu interior; (C) Cisto tecidual separado dos

tecidos do hospedeiro por homogeneização de cérebro infectado. A parede do cisto está

apontada pela seta, enquanto centenas de bradizoítas no seu interior estão apontados pelas

cabeças de seta; (D) Esquizonte com alguns merozoítas (cabeça de seta) presentes em tecido

intestinal de gato infectado; (E) Gameta masculino com dois flagelos (setas) presente em

tecido intestinal de gato infectado; (F) Oocisto não esporulado eliminado nas fezes de gato

infectado. Sua parede é formada por duas camadas (seta) circundando uma massa central

única; (G) Oocisto esporulado com uma parede mais fina (seta maior), dois esporocisto

(cabeça da seta). Cada esporocisto contém quatro esporozoítas (seta menor), não totalmente

focados nesta figura.

Fonte : HILL e DUBEY, 2002

16

3.4 Fontes de infecção

Muitos fatores estão associados à ocorrência da infecção de toxoplasmose incluindo

clima, comportamento cultural, hábitos alimentares e padrões de higiene (RORMAN et al.,

2006).

A infecção pelo T. gondii ocorre principalmente pelo consumo de carnes cruas ou mal

cozidas, contendo cistos teciduais viáveis, alimentos e águas contaminados pelos oocistos

esporulados provenientes das fezes dos felídeos. Dubey (2004) e Dubey e Shen (1991),

afirmam que as infecções causadas por oocistos esporulados, em humanos são mais severas

comparadas com aquelas induzidas por cistos teciduais, porém não existem testes capazes de

diferenciar as fontes de infecções (GAGNE, 2001). Os oocistos também podem ser veiculados

mecanicamente por artrópodes como moscas, baratas e besouros (LINDSAY; BLAGBURN;

DUBEY, 1997). O solo contaminado com oocistos do T. gondii provenientes dos gatos

domésticos é uma via de transmissão de grande importância epidemiológica, já o contato com

o animal não resulta grande perigo porque os oocistos não se aderem aos pelos do animal

(DUBEY, 2006). Além da infecção usual pela ingestão de cistos teciduais ou por oocistos

esporulados, outras vias de transmissão são os transplantes de órgãos, transmissão congênita,

transfusão sanguínea e acidentes de laboratório tem sido relatado (MONTOYA e

LIESENFELD, 2004).

A transmissão congênita ocorre quando a mãe se infecta pela primeira vez durante o

período da gestação (DUBEY, 1977) podendo causar danos de diferentes graus de gravidade

dependendo da virulência da cepa do parasito, da capacidade da resposta imune da mãe, do

período gestacional, além da fase de vida do parasita e quantidade de inóculo, ou menos

comumente quando mulheres cronicamente infectadas têm imunocomprometimento

importante durante o período gestacional (REMINGTON et al., 2001). Muitos recém-

nascidos, infectados congenitamente, podem não apresentar sintomas, no entanto deverão

desenvolver sequelas após o nascimento (MCAULEY, 1994). Os sintomas clássicos da

toxoplasmose congênita são a hidrocefalia, a coriorretinite, a calcificação cerebral e o retardo

mental, conhecida como Tétrade de Sabin que pode tanto manifestar na infância como na fase

adulta.

Diversos surtos de toxoplasmose ligados à ingestão de água não filtrada contaminada

vêm sendo relatados. No Canadá em 1995, houve um súbito aumento no número de casos de

toxoplasmose aguda, onde cerca de 100 indivíduos foram afetados e destes, 19 apresentaram

retinite e 51 tiveram linfadenopatia. Após o estudo e mapeamento dos casos concluiu-se que a

17

provável via de transmissão foi a água fornecida pelo sistema municipal, que era apenas

clorada e não filtrada (BOWIE et al., 1997).

O primeiro surto de toxoplasmose relatado no Brasil, causado pela água contaminada

ocorreu na cidade de Santa Isabel do Ivaí, no estado do Paraná, no ano de 2001, onde um dos

reservatórios que abastece a cidade foi contaminado por oocistos liberados pelos filhotes de

uma gata doméstica que vivia no local. Mais de 600 pessoas se infectaram e 10 mulheres

gestantes soro-converteram, destas, seis bebês nasceram com toxoplasmose congênita e houve

um abortamento. Segundo Silveira (2002) a Vigilância Sanitária deve ficar em alerta para a

importância da qualidade da água de beber como via de transmissão da toxoplasmose, pois

este episódio demonstrou a vulnerabilidade dos sistemas de abastecimento de água para a

contaminação por oocistos de protozoários.

Em estudos realizados por Mead et al. (1999) a toxoplasmose foi a terceira maior

causa de morte atribuída à transmissão pela ingestão de alimentos contaminados (21%),

perdendo apenas para a salmonelose (31%) e para a listeriose (28%). A maioria dos óbitos por

toxoplasmose ocorreu em pacientes HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana) positivos. Uma

pesquisa realizada pelo Serviço de Pesquisas Econômicas do Departamento de Agricultura

dos EUA concluiu que metade dos casos de toxoplasmose dos EUA são causadas pela

ingestão de carne contaminada. O custo desta infecção foi estimado em 7,7 bilhões de dólares

por ano, principalmente com a toxoplasmose congênita (BUZBY; ROBERTS, 1996).

No Brasil a prevalência da infecção em humanos é elevada, chegando a 100% em

algumas regiões, mas estes dados podem variar entre os países, áreas geográficas dentro do

mesmo país e até em grupos étnicos de uma mesma região (DUBEY et al., 2006).

Cook et al., (2000) em um estudo multicêntrico europeu, determinaram que a ingestão

de carne crua ou mal cozida corresponde ao principal fator de risco para a infecção em

gestantes, em 30% a 63% dos casos, seguido do contato com o solo contaminado, com 6% a

17% das infecções.

Em um estudo realizado por Roghmann et al. (1999) a prevalência de toxoplasmose

encontrada em um grupo de 105 pessoas pertencente a um grupo religioso, cuja alimentação

é livre de carne foi de 18%, mais baixa quando comparado ao grupo controle, composto por

146 pessoas que não tinham restrição à alimentação com carne, sendo a prevalência de 40%.

Esta informação sustenta a estimativa de que aproximadamente metade dos casos de

exposição ao T. gondii são devidos à ingestão de carne contaminada. Carne fresca e linguiça

suína tipo frescal são, provavelmente, as principais vias de transmissão do T. gondii em

muitos países, seguidas das carnes de caprinos, ovinos e aves (DUBEY; TOWLE, 1986).

18

3.5 Toxoplasmose Congênita e Gestacional

A toxoplasmose congênita é definida como a infecção contraída pela mãe e

transmitida ao feto. Embora existam relatos de que possa acorrer durante a fase crônica da

infecção, assume-se que a transmissão congênita só deve ocorrer durante a primoinfecção

materna (FRENKEL, 2004).

O parasito atinge o concepto via transplacentária causando danos de diferente

gravidade, podendo resultar em morte fetal ou em graves sintomas clínicos (SPALDING et

al., 2002), dependendo da taxa de transmissão fetal que varia de acordo com a parasitemia

materna, idade gestacional no momento da infecção e competência da resposta imunológica

materna ao T. gondii (WILSON; REMINGTON, 1992). Pode ocorrer ainda o nascimento de

crianças normais que posteriormente irão apresentar alterações de retinocoroidite, retardo

mental ou até distúrbios psicomotores.

Durante a infecção aguda, o T. gondii passa pelo epitélio intestinal, dissemina-se para

os tecidos e atravessa as barreiras biológicas, tais como a placenta e a barreira

hematoencefálica, para alcançar sítios imunologicamente privilegiados, onde o parasito causa

as patologias mais severas como: a toxoplasmose congênita disseminada (PEYRON et al.,

2003), complicações neurológicas severas em indivíduos imunocomprometidos (COHEN,

1999) e patologias oculares em indivíduos saudáveis (SILVEIRA et al., 2001).

Embora a gravidade da doença no feto seja inversamente proporcional à idade

gestacional, ou seja, no início da gestação as lesões são mais graves, a taxa da transmissão

vertical é diretamente proporcional à idade gestacional, a qual a mãe se encontra quando

adquire a primoinfecção (SÁFADI et al., 2003). Desmonts e Couvreur (1974) estudaram 180

gestantes, dividindo-as em três grupos de acordo com o trimestre em que provavelmente

adquiriram a infecção, o parasito foi transmitido para 17% dos fetos quando a infecção foi

adquirida no primeiro trimestre, 24% dos fetos adquiriram a infecção no segundo trimestre e

62% no terceiro trimestre.

Sáfadi et al. (2003) avaliaram e acompanharam 43 crianças com toxoplasmose

congênita atendidas na Santa Casa de São Paulo (SP) durante cinco anos. Os autores

encontraram uma predominância de 88% de infecção subclínica ao nascimento, 51% de

desenvolvimento de manifestações neurológicas, 95% de alterações oculares. Três crianças,

que inicialmente apresentaram exames oculares normais, desenvolveram coriorretinite após

anos do diagnóstico, mesmo tendo sido tratadas durante o primeiro ano de vida. Cinco outras

crianças com diagnóstico tardio e consequentemente não tratadas durante o primeiro ano de

19

vida manifestaram reativação de lesões oculares. Este estudo nos demonstra a importância do

diagnóstico e tratamento precoce, uma vez que na ausência do tratamento houve progressão

das lesões, já que 88% das crianças não tinham sintomas ao nascimento, mas 51%

desenvolveram manifestações neurológicas durante o acompanhamento.

3.6 Prevalência

A prevalência de anticorpos IgG anti- T. gondii apresenta variações regionais, devido à

diferenças climáticas e, sobretudo, culturais da população. Em diferentes países, a frequência

de aquisição de toxoplasmose durante a gravidez varia de um a 14 casos por 1.000 gestações,

no entanto, a infecção congênita ocorre em 0,2 a 2,0 recém-nascidos por 1.000 nascimentos.

Spalding et al. (2002) encontraram uma taxa de transmissão de 2,2 em 1.000 nascimentos e de

0,7 em 1.000 nascidos vivos apresentando sintomatologia. Neto et al. (2000) verificaram, no

Rio Grande do Sul, uma prevalência de 1: 3000 nascidos vivos.

Estudo realizado em gestantes atendidas pelo SUS, nas Unidades Básicas de Saúde de

Londrina, em 2006, revelou uma prevalência de anticorpos IgG anti- T. gondii de 51,16% e

IgM anti-T. gondii de 1,55%, segundo dados de 2009 de Lopes, a cidade de Londrina-PR

possui uma prevalência de anticorpos IgG anti-T. gondii de 49,2% e uma prevalência

observada de 1,2% dos anticorpos IgM. Foram analisados vários fatores que poderiam estar

envolvidos na infecção, sendo que a renda per capita, grau de escolaridade, presença de gato

na residência e hábito de ingerir verduras e legumes crus foram associados à maior chance de

adquirir a toxoplasmose, enquanto que a ingestão de carnes cruas ou mal passadas e o contato

com solo não demonstraram esta associação (LOPES, 2009).

3.7 Diagnóstico

A metodologia mais utilizada para o diagnóstico sorológico da toxoplasmose consiste

na pesquisa de anticorpos contra o parasita através da pesquisa de diferentes classes de

imunoglobulinas IgG, IgM, IgA e IgE – anti-toxoplasma. A presença dos anticorpos anti-

toxoplasma no curso da infecção permite a análise de perfis sorológicos muito característicos,

seja de infecção recente, em fase aguda com a detecção de IgM, ou de infecção antiga em fase

de latência ou crônica com a detecção de IgG (CONTRERAS et al., 2000). A detecção desses

20

anticorpos depende da sensibilidade dos testes, uma vez que a imunoglobulina IgM pode

persistir por períodos variáveis (LESER et al., 2003; SENSINI, 2006).

No diagnóstico de adultos imunocomprometidos e na infecção fetal, há necessidade de

testes para a detecção do T. gondii, já em indivíduos imunocompetentes os testes sorológicos

com pesquisa de IgG e IgM são suficientes para o diagnóstico, por serem sensíveis,

específicos e de fácil execução (CAMARGO, 2001).

O teste do corante de Sabin Feldman, a imunofluorescência indireta e o ensaio de

aglutinação por imunoabsorção de IgM, demonstram principalmente anticorpos dirigidos

contra os antígenos da membrana do parasita e o teste de hemaglutinação indireta e o ensaio

imunoenzimático usam o extrato antigênico de parasitas lisados (DUFFY et al, 1989).

A reação de Sabin-Feldman é o processo sorológico clássico para o diagnóstico da

toxoplasmose, este teste baseia-se no princípio imunológico, onde os parasitas expostos a um

soro contento anticorpos anti-toxoplasma, sofrem lise da membrana citoplasmática após a

reação antígeno-anticorpo e ativação do complemento, sendo corados por azul de metileno.

Quando existem anticorpos contra o parasita no soro, ele não se cora (SABIN e FELDMAN,

1948). Apesar da sua elevada sensibilidade e especificidade, seu uso se tornou restrito em

decorrência da complexidade da técnica empregada e do risco de contaminação com os

antígenos vivos de T. gondii, além de não ser possível diferenciar anticorpos IgM e IgG

(REMINGTON et al., 2001).

A reação de fixação de complemento é um método que por ser de difícil realização e

necessitar de reagentes de difícil padronização caiu em desuso, uma vez que depende do

consumo de complemento exógeno em sistemas padronizados (SANCHEZ, 1996).

A reação de aglutinação por imunoabsorção (ISAGA- immunosorbent agglutination

assay), os antígenos adicionados às placas constituem-se em uma suspensão de toxoplasmas,

que se aglutinam na presença de IgM específica. Esta reação é utilizada para identificação de

anticorpos IgM, sendo importante no diagnóstico de infecção aguda. (DESMONTS et al,

1981).

No teste de hemaglutinação indireta (HAI), hemácias de aves são recobertas com

antígenos completos do parasita e aglutinam na presença de anticorpos IgG e IgM. Apesar do

baixo custo empregado na realização do teste de hemaglutinação, este não é usualmente

recomendado para diagnósticos em rotinas laboratoriais visto que, diferentes preparações de

antígenos causam resultados distintos (REMINGTON et al., 2001) e ocasionalmente

observam-se resultados falso-positivos por interferência de anticorpos IgM “naturais”,

aglutininas IgM não-específicas, em geral de títulos baixos (CAMARGO et al., 1989).

21

Outro método sorológico utilizado amplamente em laboratórios de rotina e pesquisa é

o teste de Imunofluorescência Indireta (IFI), segundo Sanchez (1996) esta técnica é

considerada de boa especificidade, sensibilidade e apresenta uma maior rapidez na execução,

reprodutibilidade e preservação dos reagentes quando comparado ao teste do corante de

Sabin-Feldman.

Na IFI, utiliza-se, como antígeno, o parasita preservado e fixado em lâminas de

microscopia, tornando-o muito mais prático e seguro para a rotina laboratorial além de

permitir a identificação dos anticorpos segundo as classes de imunoglobulina. Porém a leitura

e a interpretação dos resultados são subjetivas podendo apresentar resultados falso-positivos

IgM pela interferência de fatores reumatóides, eventualmente presentes no soro (CAMARGO

et al., 1972; REMINGTON et al., 1985; WILSON et al., 2003). Os testes para anticorpos IgM

podem também revelar resultados falso-negativos, devido à competição que os anticorpos IgG

fazem aos IgM, impedindo que estes se fixem aos antígenos parasitários (CAMARGO et al.,

1972).

Fialho e Araújo (2002) compararam as técnicas de IFI e HAI e concluíram que para

fins de diagnósticos a IFI é superior a HAI e que esta reação tem sua principal indicação em

inquéritos epidemiológicos. Os testes de IFI por serem manuais estão sendo substituídos por

tecnologias automatizadas, que apresentam maior facilidade de realização, porém devido a

sua capacidade em detectar níveis mínimos de anticorpos IgM circulantes, a interpretação dos

resultados dos testes sofreu alterações em especial quando aplicados em uma rotina, no

rastreamento de infecções assintomáticas, como é o pré-natal. Em especial para a gestante, há

a possibilidade de resultados falso-positivos para infecção aguda ou a detecção de infecções

assintomáticas em maior número (BARINI et al., 2000).

Com a introdução do ensaio imunoenzimático - ELISA (enzyme linked immunosorbent

assay) – o diagnóstico da toxoplasmose teve um grande avanço. Esta técnica é baseada na

reação se soros testes com antígenos imobilizados em placas de microtitulação de

poliestireno, onde o anticorpo específico presente na amostra testada liga-se ao antígeno

sendo demonstrado pela adição de conjugado imunoenzimático (anti-imunoglobulina marcada

com enzima) seguido pela reação da enzima com o substrato e tampão cromógeno. A

coloração gerada pode ser mensurada por meio de leitura em espectofotômetro comparada

com a coloração desenvolvida pelo controle negativo (VOLLER, et al., 1976).

No início da década de noventa, foi desenvolvido o teste ELISA – IgG para avidez,

que parece ser um marcador informativo de infecção aguda adquirida. Este método avalia a

avidez ou afinidade funcional de ligação ao antígeno dos anticorpos IgG contra o T. gondii,

22

separando os de baixa afinidade, produzidos numa fase inicial da infecção, dos anticorpos de

alta afinidade indicativos de infecção crônica (JOYNSON et al, 1990). Agentes desnaturantes

de proteínas, como a uréia, são usados para dissociar a ligação dos complexos antígenos-

anticorpo, de modo que apenas os anticorpos de maior avidez (maior afinidade) permanecem

ligados ao antígeno (HEDMAN et al., 1989).

O Ensaio Imunoenzimático de Micropartículas (MEIA) utiliza uma suspensão de

micropartículas em látex para medir a concentração de substâncias a ser analisada. As

partículas são revestidas com o antígenos para o anticorpo anti-T.gondii (BARBOSA, 2006) e

incubadas com o soro a ser testado. Em seguida, uma alíquota de complexo antígeno-

anticorpo antitoxoplasma é transferida sobre uma matriz de fibra de vidro que fixa os

complexos. Após a lavagem, são adicionadas as imunoglobulinas humanas anti-IgM ou anti-

IgG conjugadas à fosfatase alcalina. Após a segunda lavagem é acrescido um substrato

enzimático e é medida a fluorescência emitida pela desfosforilação do substrato. O resultado

de IgG é expresso em UI/ml (segundo as curvas de calibração obtida com os padrões da

OMS) enquanto que a IgM é expressa em índice (taxa de fluorescência produzida pelo soro

testado em relação à fluorescência emitida pelo calibrador do aparelho) (STELLA, 2004).

Embora estas reações estejam sujeitas a alguma discrepância de resultado, pois ainda

não estão suficientemente padronizadas, vêm assumindo importância crescente como

marcadores de infecções recentes, inclusive congênitas (DECOSTER et al., 1992; WONG et

al., 1993).

Apesar de serem considerados de grande importância no diagnóstico da toxoplasmose,

os testes sorológicos são ainda muito frágeis, requerem habilidade técnica, consomem tempo

e necessitam de equipamentos adequados. Além disso, o diagnóstico baseado apenas na

clínica e na sorologia nem sempre é possível devido à complexidade da interpretação dos

marcadores de fase aguda como, por exemplo, a persistência de IgM e da avidez de IgG que

pode gerar falhas no diagnóstico da gestante (CASTILHO-PELLOSO et al., 2005).

3.7.1 Diagnóstico materno e fetal

O diagnóstico de toxoplasmose na gestante é confirmado através de pacientes

soronegativas que apresentam soro-conversão e daquelas com perfil sorológico de

toxoplasmose recém-adquirida. Sabe-se que os anticorpos IgG normalmente aparecem uma a

duas semanas após a infecção, atingem pico dentro de um a dois meses e apresentam um

23

declínio, permanecendo definitivamente presentes e atestando imunidade adquirida. A

presença de IgG indica que ocorreu a infecção, mas o título ou grau de reatividade não indica

se a infecção foi tardia ou recente. O aparecimento dos anticorpos IgM é mais precoce e seu

declínio é mais rápido do que a IgG (LIESENFELD et al., 2001).

De acordo com os resultados, a gestante será considerada imune na presença de IgG

positiva e IgM negativa, suscetível quando os anticorpos IgG e IgM são negativos e imune ou

portadora de infecção aguda se IgG e IgM estão positivas. Devido ao grande número de

gestantes que não apresentam anticorpos para T. gondii, à necessidade de repetição dos testes

a cada quatro ou cinco semanas naquelas que permanecem soronegativas e ao número

significativo de recém-nascidos acometidos pela toxoplasmose congênita, torna-se necessário

o conhecimento das manifestações clínico-laboratoriais da toxoplasmose na gestante e o

momento da soroconversão materna, a fim de iniciar precocemente o tratamento

antiparasitário e reduzir a possibilidade de alterações no feto, para tanto são necessários testes

sensíveis para a triagem, porém de baixo custo e de execução simples, capazes de detectar

anticorpos IgG e IgM e de fornecerem resultados em curto prazo (figura 4 e 5) (JONES et al.,

2003, MISTUKA-BREGANÓ; LOPES-MORI; NAVARRO, 2010)

Figura 4 - Interpretação de resultado e condutas para gestantes com até 16 semanas de

gestação.

Fonte: MISTUKA-BREGANÓ; LOPES-MORI; NAVARRO (2010).

24

Figura 5 - Interpretação de resultado e condutas para gestantes a partir das 16 semanas de

gestação.

Fonte: MISTUKA-BREGANÓ; LOPES-MORI; NAVARRO (2010).

3.7.2 Diagnóstico no neonato

A maioria das crianças infectadas no período pré-natal não apresentam sintomas ao

nascimento, mas há probabilidade de apresentarem sequelas no futuro (JONES et al., 2001).

O diagnóstico da toxoplasmose no recém-nascido baseia-se principalmente no

acompanhamento sorológico, interpretado de forma criteriosa e sempre associado aos dados

clínicos e epidemiológicos (HOLLIMAN, 1990).

A detecção de IgM, IgA, e IgE no sangue do cordão ou no sangue do recém-nascido é

diagnóstico de infecção congênita, caso não tenha ocorrido contaminação com o sangue

materno, tanto nos casos sintomáticos como nas infecções subclínicas (REMINGTON et al.,

2001).

A pesquisa de anticorpos IgM tem sido amplamente executada como marcador de

toxoplasmose congênita pós-natal, devido ao seu peso molecular, a IgM não atravessa a

barreira placentária íntegra, indicando infecção aguda na criança (NAESSENS et al., 1999).

25

A demonstração de anticorpos IgM depende da idade gestacional no momento da

infecção materna, a taxa de soropositividade é 10% quando a infecção materna ocorre na 10ª

semana, 20% e 60% de soropositividade na 20ª e 30ª semana respectivamente

(REMINGTON et al., 2006). Resultados falso-positivos podem ocorrer devido a presença de

fator reumatoide, anticorpos antinucleares, grande quantidade de anticorpos IgG maternos

(que podem suprimir a produção neonatal específica de IgM) e lesão com escape placentário

de IgM materno (CAMARGO, 2001; REMINGTON et al., 2001; SÁFADI e FARHAT,

1999;), portanto, um resultado IgM não reagente com suspeita clínica não exclui

toxoplasmose congênita, sendo aconselhável a repetição do exame em 1 e 2 meses após o

nascimento (CAMARGO, 2001). Para evitar essas falsas reações, utilizam-se testes de captura

de IgM, mais sensíveis e específicos (CAMARGO, 2001).

Em relação à análise do líquor de recém-nascidos, a presença de anticorpos para T.

gondii é altamente sugestiva de infecção no sistema nervoso central, uma vez que o anticorpo

materno não atravessa a barreira hematoencefálica normal e sua presença indica uma lesão.

Mas, o diagnóstico definitivo se estabelece a partir da evidenciação do parasito por PCR

(REMINGTON et al., 2001).

A síntese de anticorpos IgG contra o Toxoplasma geralmente se inicia no terceiro mês

de vida se o lactente não é tratado. Nos casos em que o lactente é submetido à terapêutica

precoce, tal síntese poderá se iniciar somente após o sexto mês de vida. Desta maneira, é

possível fazer o diagnóstico da infecção congênita através da monitorização sequencial das

dosagens de anticorpos IgG contra o Toxoplasma (SÁFADI e FARHAT, 1999). Os títulos de

anticorpos IgG para T. gondii caem progressivamente, nos recém-nascidos não infectados, até

a negativação em prazos de poucos meses a um ano, porém, nos infectados, estes títulos são

ascendentes (LEBECH et al., 1996).

Devido aos resultados falso-negativos dos métodos de diagnóstico fetal, todas as

crianças nascidas de mães com toxoplasmose aguda devem ser submetidas a exames

sorológicos e clínicos para a detecção de possível infecção e sequelas. Após a confirmação do

diagnóstico materno e/ou neonatal, o tratamento deve ser instituído o mais precocemente

possível (OLIVEIRA, 2002).

26

3.8 Métodos Moleculares para detecção da toxoplasmose

Os métodos moleculares que não dependem da resposta imune e permite a detecção do

parasita, têm sido usados para estabelecer o diagnóstico mais acurado da infecção assim como

na caracterização genotípica do isolado, determinando a cepa envolvida (SWITAJ, 2005).

Devido ao amplo número de hospedeiros e à distribuição em nível mundial, uma grande

variabilidade genética entre os isolados do T. gondii tem sido descrita (DUBEY et al., 2004)

Vários antígenos de T.gondii têm sido definidos e caracterizados por anticorpos

policlonais e monoclonais em reações de Western blot. A maioria destes antígenos está

associada com estruturas da superfície do parasita (SAG), ou no interior das organelas

secretoras (MIC), as roptrias (ROP) e os grânulos densos (GRA). A partir da análise por

Western Blot é possível diferenciar IgG e IgM produzidos a partir da infecção fetal daqueles

produzidos pela mãe (REMINGTON et al., 2005).

Segundo Camargo (2001), a evidenciação do parasito, por isolamento a partir do

material do paciente ou pela demonstração de seus componentes, como antígenos ou

segmentos do DNA, é de alto valor diagnóstico, especialmente nos imunocomprometidos,

seja por imunodepressão, como nos aidéticos ou transplantados, ou por imunoimaturidade

como no feto e no recém-nascido.

3.8.1 PCR (Polimerase Chain Reaction)

Em 1985, a estratégia para se amplificar um alvo genômico mediante a replicação do

DNA in vitro foi descrita (SAIKI, 1985), os avanços recentes no conhecimento do genoma do

T. gondii tornaram possível a utilização da PCR para a detecção do parasito (BASTIEN,

2002; WONG e REMINGTON, 1994).

A técnica de PCR baseia-se na detecção do DNA do T. gondii em fluídos corporais ou

fragmentos de tecidos e na amplificação de uma sequência dos genes específicos do T. gondii.

Teoricamente, a partir de um único parasito na amostra, a PCR permite obter mais de

1.000.000 de cópias de um fragmento de genoma de algumas centenas de pares de bases após

30 ciclos de amplificação (COUTO et al., 2003). Um resultado positivo na PCR não permite

distinguir entre taquizoítas e formas císticas, mas a evidenciação do parasito, independente de

sua forma, em pacientes imunossuprimidos e fetos, é diagnóstico de infecção (CAMARGO,

2001).

27

A primeira etapa da PCR é a hibridização de primers específicos do genoma do

parasita, escolhida com base na existência de várias cópias dessa sequência no DNA do

mesmo. Vários segmentos do DNA correspondentes a diferentes genes, podem ser utilizados

para a identificação do Toxoplasma, por apresentarem maior sensibilidade (AUBERT et al.,

2000).

O gene B1 encontrado em diferentes cepas, foi isolado e descrito por Boothroyd e

Grigg. (2002), possui um tamanho de 2,2Kb, é a sequência mais utilizada possuindo 35 cópias

genômicas (BURG et al., 1989). Junto a 100 mil células humanas, esses autores conseguiram

detectar até um único parasito, mostrando a alta especificidade do gene B1 do T. gondii e a

característica de ser uma região conservada em todas as cepas testadas. Apesar de estudos

recentes demostrarem a baixa especificidade desse sistema, uma vez que foi evidenciada a co-

amplificação de outras sequências-alvo nos cromossomos humanos, o gene B1 ainda continua

sendo o alvo mais usado no diagnóstico de parasitemia (KOMPALIC-CRISTO et al., 2004).

Em um estudo realizado por Reischl et al. (2003), utilizando a sequência AF146527 de

529 pb, que apresenta 200-300 cópias genômicas, demostram um aumento em 10 vezes a

sensibilidade da técnica, pois o limite de detecção do DNA genômico foi de 20fg e de 200 fg

quando usado o gene B1. Porém, Filisetti et al. (2003) ao compararem a sequência do gene

B1, Af 146527 e a sequência do DNA ribossomal 18S, não encontraram diferença

significativa entre os três primers, tanto na especificidade quanto na sensibilidade da técnica.

A detecção de sequências específica do genoma do parasita pode ser realizada a partir

de amostras de líquido amniótico, sangue, líquor, urina, humor vítreo, humor aquoso, lavado

broncoalveolar, fluído pleural e peritoneal, fragmentos de placenta e tecidos diversos

(REMINGTON, THULLIEZ, MONTOYA, 2004; SWITAJ, et al., 2005). A PCR só será

positiva em casos de parasitemia, assim, esta técnica será de utilidade apenas quando houver

disseminação ou passagem do parasito para o sangue, tal como ocorre na etapa aguda dessa

parasitose (KHALIFA et al., 1994).

O diagnóstico pré-natal da toxoplasmose congênita utilizando a PCR no líquido

amniótico foi inicialmente proposto por Grover et al. em 1990, sendo indicado para todas as

gestantes com resultados positivos, sugestivos de infecção aguda adquirida durante a gestação

ou quando há existência de danos fetais observados pela ultrassonografia (HOHLFELD et al.,

1994). O valor preditivo positivo e a especificidade da PCR em líquido amniótico são

próximos a 100% para o diagnóstico pré-natal da toxoplasmose congênita, já a sensibilidade e

o valor preditivo negativo variam de acordo com a idade gestacionais sendo maiores quando a

infecção ocorre entre as 17º e 21º semana de gestação (ROMAND et al., 2001).

28

Holfeld et al. (1989) utilizando a técnica de PCR por amniocente, encontrou uma

sensibilidade de 92% e especificidade de 100%, ao passo que Jenum et al. (1998) encontraram

33% e 94%, respectivamente, no diagnóstico pré-natal de infecção fetal. Em 1994, Hohlfeld et

al. estudaram 339 mulheres que soro-converteram durante a gestação, cuja infecção congênita

foi demonstrada através dos métodos convencionais (inoculação do líquido amniótico e/ou

sangue do cordão umbilical em camundongos e/ou cultivo celular e pesquisa de IgM no soro

do cordão umbilical) em 34 dos 339 fetos. A PCR, utilizando o gene B1, foi positivo em todos

os 34 fetos e em três outros, cujo resultado dos testes convencionais foram negativos. A

sensibilidade foi de 97,4% contra 89,5% pelos métodos convencionais e o valor preditivo

negativo foi de 99,7% contra 98,7% dos métodos convencionais, concluindo que o método de

PCR é rápido, seguro e confiável para o diagnóstico pré-natal da toxoplasmose congênita.

Em estudos citados por Wong e Remington (1993) e realizados por Thulliez et al.

(1992), foi demonstrado que a sensibilidade e a especificidade da PCR amplificando o gene

B1 de parasitos presentes no líquido amniótico foi de 100%, em contraste com a inoculação

de sangue fetal ou líquido amniótico em camundongos e culturas.

Castro et al. (2001) avaliaram a eficácia do método de PCR no líquido amniótico,

utilizando-se um primer do gene B1, para a detecção da infecção fetal pelo T. gondii em

gestantes com infecção aguda e correlacionou com a técnica de inoculação em camundongos

e a histologia da placenta. Neste trabalho a sensibilidade da técnica de PCR foi de 66,7% e a

especificidade de 87%. A inoculação em camundongos apresentou sensibilidade de 50%,

100% de especificidade já para a histologia da placenta foram 80% e 66,7%.

Vidigal et al. (2002) encontrou uma sensibilidade de 62,5% e a especificidade de

97,4% na PCR contra 42,9% de sensibilidade e 100% de especificidade na inoculação em

camundongos. Bessières et al. (2002) também compararam a técnica de PCR com a

inoculação em camundongos do líquido amniótico de 261 gestantes com toxoplasmose

adquirida durante a gestação, na França e encontraram sensibilidade de 90% para o PCR

contra 70% para a inoculação e especificidade de 100% em ambos.

A principal vantagem da PCR, além da alta especificidade e sensibildade é a rapidez

na obtenção dos resultados. Porém a principal desvantagem são os altos custos dos

equipamentos, a escasses de Kits comerciais padronizados e o não estabelecimento da fase da

doença (SWITAJ et al., 2005). Além disso, muitos dos resultados falso-positivos ocorrem

principalmente devido a contaminação com produtos de amplificação (COUTO et al., 2003),

presença de inibidores da Taq polimerase, o período entre a infecção e a coleta da amostra ser

muito longo, a parasitemia ser fugaz e as pacientes terem iniciado seu tratamento antes de

29

efetuar a coleta ou ainda devido a uma transmissão mais tardia do parasito ao feto, posterior à

realização do PCR, apesar do tratamento com espiramicina (DAFFOS et al., 1988;

SPALDING et al., 2002). Países, como o Brasil, o acompanhamento sorológico em gestantes,

quanto realizado, é trimestral, tornando o diagnóstico de soro-conversão materna tardio,

portanto no momento da amniocentese pode não haver mais parasitas detectáveis, fator que

poderia contribuir para a baixa sensibilidade.

É importante enfatizar que como o PCR ainda apresenta algumas limitações na

sensibilidade e especificidade de acordo com a metodologia e o primer utilizado em cada

laboratório, esta técnica não deve ser utilizado isoladamente no diagnóstico (CASTRO et al.,

2001) embora seja um método promissor, não irá substituir os métodos sorológicos, pois

necessita de maiores estudos para melhorar sua eficácia.

Além do diagnóstico pré-natal, a técnica de PCR quantitativa do líquido amniótico

pode ser utilizada como marcador do prognóstico precoce da infecção fetal pelo T. gondii.

Romand et al. (2004) observaram que infecções maternas adquiridas antes de 20 semanas com

uma carga parasitária maior que 100/ml tem maior risco de desenvolver sequelas fetais

severas.

A PCR em tempo real é uma metodologia rápida, sensível e quantitativa de detecção

do T. gondii em amostras clínicas, nessa metodologia são combinados os tempos de

amplificação e detecção numa mesma fase (COSTA et al., 2000; REMINGTON et al., 2004).

A técnica pode ser usada para estimar a concentração de parasitos no fluído corporal e no caso

de líquido amniótico é capaz de contribuir precocemente para o prognóstico da toxoplasmose

congênita, ao permitir avaliar a concentração de parasitos no mesmo (REMINGTON et al.,

2004; ROMAND et al., 2004), podendo ser usado na rotina de laboratórios em combinação

com testes sorológicos.

Resultados obtidos por Romand et al. (2004) mostram excelente relação entre carga

parasitária, período da infecção materna e risco de infecção fetal, abrindo novas perspectivas

para a valorização da PCR em tempo real como um ensaio que pode contribuir

significantemente na orientação diagnóstica e terapêutica (ROMAND et al., 2004). A carga

parasitária pode ser determinada e relacionada com a sintomatologia e o tratamento sendo de

utilidade para o monitoramento da eficácia do tratamento e no entendimento da patogênese da

reativação da toxoplasmose (COSTA et al., 2000), porém mais estudos são necessários para

explorar o potencial dessa técnica no diagnóstico da toxoplasmose (KOMPALIC-CRISTO,

2004).

30

A caracterização genotípica do T. gondii tem sido feita principalmente através da

PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorfism), que

utiliza as endonucleases de restrição para que organismos possam ser diferenciados pela

análise de padrões derivados da clivagem do seu DNA.

A análise genotípica da população de T. gondii por PCR-RFLP identifica, na Europa e

EUA, o predomínio de três linhagens clonais que são designadas como cepas tipo I, II e III.

(HOWE e SIBLEY, 1995). Segundo Boothroyd e Grigg (2002) tem ocorrido um aumento no

número de isolamentos de cepas que não se encaixam na classificação de cepas tipo I, II e III.

Estas cepas estão incluídas em duas classes gerais: cepas recombinantes que possuem

genótipos semelhantes aos três tipos predominantes, e cepas exóticas oriundas de hospedeiros

não usuais e que tem sido fonte da maioria das amostras analisadas atualmente. O

sequenciamento detalhado de multilocus das cepas chamadas recombinantes indica que estão

presentes alelos semelhantes aos encontrados nas cepas tipo I e tipo III, mas quase nunca ao

tipo II (FAZAELI et al., 2000; LEHMANN et al., 2000).

Khan et al. (2006) analisaram isolados clínicos humanos e de animais do Brasil utilizando a

técnica de PCR-RFLP multilocus (5’SAG2, 3’SAG2, BTUB, GRA6 e SAG3). Estes autores

observaram que os isolados diferem substancialmente do que tem sido descrito para linhagens

clonais e que a análise define novos haplotipos que parecem ser predominantes no Brasil.

Esse padrão pode indicar que cepas de T. gondii no Brasil sofrem mais frequentemente

recombinação sexual o que resultaria em genótipos mistos das cepas, dificultando assim a

utilização da técnica de PCR para o diagnóstico da toxoplasmose congênita.

3.8.2 Western blot

Também denominado como Immunoblotting, o Western blot consiste em um ensaio

imunoenzimático onde a fase sólida é realizada sobre a superfície de uma membrana. O teste

é utilizado como um valioso recurso na caracterização de frações antigênicas

imunodominantes e identificação da reatividade específica de anticorpos detectados por um

teste de triagem utilizando múltiplas frações antigênicas (teste confirmatório ou

suplementar). Para a detecção da interação antígeno-anticorpo é necessário em primeiro lugar

à obtenção da membrana com as frações da mistura antigênica, onde as proteínas são

separadas de acordo como o seu tamanho, através de eletroforese em gel de poliacrilamida,

31

depois de separadas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose onde ficam inertes e

posteriormente serão utilizadas como suporte para a detecção da interação antígeno-anticorpo.

Machado et al., (2010) ao avaliarem 215 recém nascidos, obtiveram uma sensibilidade

de 73.5% e especificidade de 97,4% para WB-IgG e para WB-IgM uma sensibilidade de

54,8% e especificidade de 94,7% e ao combinarem WB-IgG e WB-IgM, a sensibilidade

aumento para 86,5%.

Em 2001 Pinon et al. estudaram 105 crianças de mães que apresentaram soro-

conversão durante a gestação, destas 55 infectadas e 50 não infectadas, a sensibilidade

encontrada foi de 65,4% e a especificidade foi de 96% no WB-IgG e uma sensibilidade de

68,5% e especificidade de 98% WB-IgG. Ao combinarem os dois testes WB-IgG e WB-IgM

a sensibilidade e especificidade observada foi de 77,7% e 96% respectivamente.

Testes comerciais baseado no WB encontram-se disponíveis para a determinação da

infecção pelo T.gondii, sendo pouco utilizado na rotina laboratorial como ferramenta

adicional.

O LDBio IgG é um teste imunoenzimático qualitativo em que antígenos parasitários

são separados por eletroforese e transferidos por eletrobloting para tiras de nitrocelulose.

Franck, Garin e Dumon (2008) realizaram um estudo restrospectivo utilizando 569 amostras

de gestantes, imunocomprometidos e recém-nascidos para avaliar o uso do teste LDBio

TOXO II IgG como teste confirmatório para pacientes de risco. A sensibilidade encontrada no

presente estudo foi de 99,2% e especificidade de 100%, quando comparado ao teste de

referência Dye Test de Sabin e Feldman mostrando que o LDBio TOXO II IgG é uma

ferramenta útil para o diagnóstico e acompanhamento de mulheres gestantes e recém-nascidos

ou para indivíduos com deficiência imunológica.

A utilização do teste comercial LDBio no diagnóstico da toxoplasmose congênita

também foi avaliada por Magi e Migliorini (2011), no qual o perfil imunológico de mães e

crianças foi comparado para a diferenciação entre os anticorpos maternos transmitidos

passivamente e anticorpos sintetizados pelos recém-nascidos nos primeiros três anos de vida.

Magi e Migliori, concluíram que o WB foi a única técnica capaz de diferenciar o IgG materno

do de origem fetal ou neonatal e capaz de diagnosticar a toxoplasmose congênita em três

amostras de crianças com menos de três meses de idade, o que não é possível de ser realizado

pelos métodos sorológicos convencionais.

32

3.12 Tratamento

A terapia é benéfica somente contra a forma taquizoíta, mas não tem erradicado a

forma cística, especialmente no sistema nervoso central e olhos. O parasita provavelmente

nunca é eliminado mediante terapia específica e a cura da doença depende do genótipo do

parasito envolvido, dos órgãos comprometidos e do tempo de duração da infecção no início

do tratamento. (REMINGTON et al., 2005).

O tratamento preconizado pelo Ministério da Saúde (2000), para gestante com

infecção aguda confirmada, independentemente da idade gestacional, é a administração de

espiramicina (500 mg) 3,0 g/dia, via oral, divididos em 3 tomadas. Após informar sobre os

riscos da infecção para o feto/recém-nascido, propor o diagnóstico da infecção fetal. Para a

infecção fetal, instituir o tratamento tríplice materno (pirimetamina, 25 mg de 12/12 horas por

via oral; sulfadiazina, 3 g/ dia, via oral, divididas em duas tomadas e ácido folínico, 10

mg/dia). O tratamento tríplice alterna com espiramicina por um período de 3 semanas, até o

termo. Interromper o uso de sulfadiazina 2 semanas antes do parto.

3.13 Estratégias de prevenção e vigilância

A prevenção da toxoplasmose humana baseia-se em cuidados para evitar a ingestão de

cistos teciduais e oocistos presentes no meio ambiente, já que não existe, até o momento, uma

vacina capaz de proteger o homem e os animais.

O manual “Toxoplasmose adquirida na gestação e congênita: vigilância em saúde,

diagnóstico, tratamento e condutas”, traz as seguintes recomendações para as gestantes na

prevenção da infecção pelo T. gondii (Mistuka-Breganó; Lopes-Mori; Navarro, 2010).

Medidas de prevenção da infecção por oocistos presentes no solo, água e alimentos

Alimentar gatos com ração ou carne bem cozida, não alimentá-los com carnes cruas ou

mal cozidas.

Cuidado na manipulação de terra - usar luvas ou lavar bem as mãos após manipular a

terra.

Lavar bem as frutas e vegetais com água corrente, esfregando mecanicamente.

Limpar, DIARIAMENTE, as caixas sanitárias dos gatos – gestantes não devem

realizar esta tarefa.

33

Controlar moscas e baratas.

Proteger as caixas de areia em áreas de recreação infantil para que gatos não defequem

nelas.

Ingerir apenas água tratada ou fervida.

Medidas de prevenção da infecção por cistos presentes na carne ou por taquizoítas

Ingerir carne bem cozida (67º C por 10 minutos).

Ingerir embutidos frescais bem cozidos ou salgados (2,5% de sal por 48 horas).

Congelar produtos cárneos (- 18º C por 7 dias). O congelamento dos produtos cárneos

eliminam a maioria dos cistos teciduais.

Lavar as mãos e a superfície de preparação (tábuas e facas) após manusear carne crua.

Não experimentar carne crua.

Leite de cabra deve ser fervido ou pasteurizado antes do consumo.

Realizar monitoramento sorológico e tratamento da gestante para evitar a transmissão

e diminuir as sequelas na criança.

Lavar bem as frutas e verduras, esfregando em água corrente.

Proteger os alimentos de moscas e baratas.

Ingerir apenas água tratada ou fervida.

Lavar as mãos após mexer na terra ou areia.

Não alimentar os gatos com carne crua.

Peça para outra pessoa retirar as fezes do animal diariamente.

Estas orientações, quando aplicadas no pré-natal, contribuem com a redução de 63% da

primoinfecção na gravidez (Foulon, 1992). A realização do “screening” sorológico durante o

pré-natal tem como finalidade detectar e tratar infecções agudas pelo T.gondii, a fim de

reduzir as sequelas da toxoplasmose congênita através da administração de antibiótico, a

espiramicina, ou de agentes quimioterápicos, a pirimetamina e a sulfadiazina, nas gestantes

em que se evidencia a infecção aguda.

Segundo Hill e Dubey (2002), a conscientização sobre os perigos da doença e o

acompanhamento sorológico durante a gestação tem grande importância na prevenção da

toxoplasmose. O Brasil, apesar de não incluir a toxoplasmose no programa nacional de

triagem neonatal (Teste do Pezinho) na rede pública de saúde, possui uma das maiores

experiências mundiais em termos de triagem neonatal para esta infecção. Este fato deve-se à

34

existência de laboratórios que disponibilizam o teste comercialmente, aliado às dimensões

continentais e à numerosa população do país (CADERMATORI, 2007).

35

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Como a toxoplasmose é uma zoonose de importância mundial, principalmente pela

ocorrência da transmissão congênita que pode provocar alterações neonatais, o diagnóstico

precoce durante a gravidez é altamente desejável permitindo a rápida intervenção nos casos de

infecção reduzindo assim, a probabilidade de infecção fetal e consequentemente as lesões

fetais.

O diagnóstico da toxoplasmose é baseado na sorologia, porém, concomitantemente, deve-

se fazer a interpretação clínica dos resultados. Os testes sorológicos têm sido considerados

importantes métodos para a detecção da infecção pelo T. gondii, porém é evidente a

fragilidade desses métodos, que apesar dos avanços obtidos com o advento das técnicas

automatizadas, o diagnóstico sorológico trouxe à tona a presença de anticorpos residuais

tornando os resultados inconclusivos e de difícil interpretação nos casos clínicos como: IgM

reagente até três anos após infecção; soroconversão com níveis de IgM muito baixos;

presença de IgM inespecífico; resposta retardada de IgG (dois meses após detecção de IgM);

reativação sorológica com aumento do título de IgG, aparecimento de IgA, ausência de IgM e

IgG de forte avidez.

Assim, técnicas moleculares tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e Western

Blot (WB), podem ajudar para uma melhor interpretação do estado real da interação

parasito/homem, embora sejam ainda pouco validadas para uso na rotina de diagnóstico

laboratorial devido às diferenças significativas de sensibilidade e especificidade de acordo

com a metodologia utilizada. No caso do Brasil, que tem apresentado uma grande

variabilidade nos genótipos das cepas de T.gondii isoladas, às diferenças tem sido mais

significativas quanto, a sensibilidade e a especificidade. Para tanto, seria ainda necessário

iniciar estudos envolvendo a caracterização genotípica das cepas, responsáveis pela infecção

toxoplásmica em gestantes, nos diferentes ecossistemas do nosso país.

Sendo é fundamental a introdução de diagnósticos mais sensíveis e precoce para a

avaliação da infecção na gestante, isso só será possivel, após estudos que validem as técnicas

moleculares utilizando-se de genótipos isolados nas diferentes regiões do nosso país.

36

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