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Programa de Pós-doutorado Júnior / CNPq
O EFEITO DO PATÓGENO BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS
SOBRE A COMUNICAÇÃO ACÚSTICA EM SAPOS NEOTROPICAIS
Autor: Lucas Rodriguez Forti (Universidade Estadual de Campinas)
Colaboradores: Luís Felipe Toledo (Universidade Estadual de Campinas);
Rafael Márquez (Museo Nacional de Ciências Naturales);
Rodrigo Lingnau (Universidade Tecnológica do Paraná)
Mônica Jones (Universidade Federal de São Carlos, Campus Sorocaba)
Dezembro de 2016
Resumo: Sinais acústicos exercem importantes funções na defesa de recursos e na seleção
sexual em animais sociais. Em anuros o custo energético com a vocalização é
surpreendentemente alto, uma vez que fêmeas são atraídas pela vocalização. Assim, machos
podem variar seus cantos e realizar ajustes em propriedades acústicas de acordo com fatores
externos dinâmicos, como contexto social e temperatura. Os efeitos desses fatores são
relativamente bem conhecidos, mas a relação de mudanças em traços acústicos por efeito de
infecção por patógenos ainda é incipiente. Esse tema é de alta prioridade para a conservação
de espécies, já que alterações na comunicação por efeito de patógenos pode levar à redução de
fitness reprodutivo, e potencialmente contribuir para declínios populacionais. Até o momento,
dois trabalhos recentes encontraram resultados contrastantes em relação ao efeito da presença
do fungo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) sobre comportamento acústico em anuros, o
que gera a necessidade de um trabalho mais aprofundado sobre o assunto. Baseado na
premissa de que animais doentes podem ter seu comportamento alterado, esperamos que uma
possível situação de estresse fisiológico e queda de imunidade causada pela presença de
patógenos em machos deve comprometer traços de sua vocalização. Utilizaremos a
abordagem de modelos lineares generalizados para identificar o efeito e isolar possíveis
fatores de mascaramento, como temperatura e condição social. Esse trabalho deve contribuir
diretamente na compreensão de efeitos de patógeno sobre o comportamento de anuros
neotropicais, o que disponibilizará importantes informações para a conservação de anuros
ameaçados por todo o planeta.
Acoustic communication in diseased and stressed Neotropical
frogs: implications for the evolution of acoustic signals, disease
dispersal and species conservation
December / 2016
Abstract: Acoustic signals perform important functions for resources defense and sexual
selection in social animals. In anurans, the energy cost of vocalization is surprisingly high,
since females are phonotactic in relation to the acoustic signal emitted by males. However,
males can vary their calls and make adjustments in acoustic properties according to dynamic
external factors, such as social context and temperature. The effects of these factors are
relatively well known, but the relationship of changes in acoustic traits due to pathogenic
infection is still incipient. This is a high priority subject for species conservation, since
changes in communication through pathogens can lead to reduced reproductive fitness, and it
potentially contribute to population declines. To date, two recent studies have found
contrasting results regarding the effect of the fungus Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) on
acoustic behavior in anurans, which raises the need for further work on the subject. Based on
the premise that diseased animals may have their behavior altered, we expect that possible
changes in physiological and immunological conditions, caused by pathogen presence in
males, should compromise traits of their vocalization. We will use the generalized linear
models approach to identify the effects and isolate possible masking factors such as
temperature and social condition. This work should contribute directly to the understanding of
the pathogen effects on the behavior of Neotropical anurans, which will provide important
information for the conservation of threatened anurans throughout the planet.
Enunciado do problema
A comunicação acústica para muitos animais é a base das interações sociais, já que os
sinais acústicos desempenham importantes funções associadas com territorialidade e
reprodução (Goodenough et al. 1993). Particularmente, em anuros, os machos estabelecem
territórios no ambiente reprodutivo e durante a estação chuvosa gastam grande quantidade de
energia vocalizando para manutenção do território contra competidores e para atração de
parceiras sexuais (Taigen & Wells, 1985; Wells, 2001). Tais sinais acústicos frequentemente
carregam informações sobre identidade, localização e condições morfofisiológicas do emissor
(Gerhardt & Bee, 2007; Wells, 2007). Dessa maneira, as propriedades acústicas do som
produzido por machos territoriais são fundamentais para o reconhecimento específico,
orientação, definição de conflitos territoriais, e para seleção sexual (Wells, 1977; Ryan &
Rand, 2001; Wells & Schwartz, 2007).
Em muitas espécies, o combate físico entre machos competidores pode ser evitado
através de interações acústicas, nas quais machos podem acessar a qualidade de seus
oponentes de acordo com evidências do canto territorial (Davies & Halliday, 1978). No geral,
o tamanho do corpo é proximamente relacionado com propriedades espectrais do canto, sendo
que machos maiores possuem cantos mais graves (Gingras et al., 2012). O sistema de
acasalamento baseado em preferência é predominante em anuros (Wells, 2007), e nesse caso
as fêmeas também se atentam aos traços acústicos dos cantos dos machos territoriais para o
processo de escolha de parceiros sexuais, e algumas características do canto podem ser
definitivas para o sucesso reprodutivo dos candidatos (Márquez & Bosch, 2001; Pröhl, 2003;
Ron, 2008). De modo generalizado, fêmeas possuem predileção por machos com vocalizações
mais graves e por aqueles mais esforçados, que emitem cantos em maiores taxas ou com
maior duração (Márquez & Bosch, 1997; Welch et al., 1998; Tárano & Herrera, 2003;
Márquez et al. 2008).
A vocalização em anuros tem forte determinação genética (Gerhardt et al., 1980;
Dawson & Ryan, 2009; Baugh et al., 2012), porém, apesar de uma expressão comportamental
inata, as propriedades acústicas da vocalização podem apresentar certa plasticidade sobre suas
três dimensões (tempo, potência e frequência) e serem influenciadas por diversos fatores
ambientais (Gerhardt & Huber, 2002; Wells & Schwartz, 2007). Variações no ambiente,
como temperatura, ruído de fundo e contexto social podem disparar ajustes de curto prazo na
vocalização, respeitando a plasticidade fenotípica dos indivíduos (Gerhardt & Huber, 2002;
Wells, 2007; Wells & Schwartz, 2007). Normalmente, esses três fatores determinam
propriedades acústicas temporais do sinal, como a duração do canto, a taxa de repetição de
cantos, número de notas e taxa de pulsos (Wells & Greer, 1981; Schwartz, 1986; Wells &
Taigen, 1986; Wong et al., 2004; Kaiser & Hammers, 2009). Tais propriedades acústicas
temporais são comumente classificadas como dinâmicas, pois apresentam alta variação
individual (atingindo coeficientes de variação superiores a 12 %), já que também estão
sujeitos a mudanças ambientais igualmente dinâmicas (Gerhardt, 1991).
Um outro tipo de ajuste de curto prazo, disponível para os anuros, está relacionado
com a potência do som (amplitude de onda). Uma alternativa energeticamente custosa para
lidar com a comunicação em um ambiente com alta poluição sonora é o aumento dos níveis
de intensidade das vocalizações como um mecanismo de reduzir o mascaramento dos sinais
(Lopez et al., 1988). Esse comportamento é conhecido como efeito Lombard, primeiramente
compreendido no estudo com seres humanos (Brumm & Zollinger, 2011), porém já relatado
de forma experimental em algumas espécies de sapos (Cunnington & Fahrig, 2010; Halfwerk
et al., 2016; Shen & Xu, 2016).
A terceira dimensão acústica é composta pela variação espectral, e de modo geral, em
anuros é esperado que mudanças em ocupação de frequências ocorram apenas numa escala
evolutiva, ou seja, como respostas de longo prazo. Tais mudanças espectrais são motivadas
por pressões seletivas relacionadas a sobreposição de frequências, e que resultam em
deslocamento de caráter (ver por exemplo: Littlejohn, 1976). Muitas espécies que ocupam
ambientes ruidosos, como bordas de riachos e cachoeiras, apresentam vocalizações com
ocupação espectral superior ao ruído e algumas podendo ocupar até mesmo bandas
ultrassônicas (acima de 20 kHz) (Narins et al., 2004). Contudo, propriedades espectrais do
canto geralmente são consideradas estáticas, pois possuem baixa variação (coeficientes de
variação inferiores a 5 %) e estão envolvidas no processo de reconhecimento específico
(Gerhardt & Davis, 1988; Gerhardt, 1991). No entanto, surpreendentemente, ajustes de curto
prazo em ocupação de frequência já tem sido relatados em interações agressivas (Bee et al.
2000), na competição por nicho acústico com espécies invasoras (Both & Grant, 2012) e
anedoticamente em ambientes com alto grau de ruído natural, forçados pela sobreposição de
frequências (Grafe et al., 2012; Shen & Xu, 2016).
Esses efeitos são relativamente bem conhecidos e estudados, porém a influência de
patógenos, como o fungo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), sobre a vocalização em sapos
é ainda incipiente. Alguns estudos têm abordado o efeito de parasitas (helmintos e moscas) e
tem relatado importantes alterações no comportamento reprodutivo em diferentes grupos
animais (Cade, 1984; Martin et al., 2003). Em anuros, se destaca o trabalho de Madelaire et
al. (2013), que relataram uma diminuição na taxa de vocalização com o aumento da infecção
por helmintos em machos da espécie Hypsiboas prasinus. Propriedades temporais do canto
também parecem ser afetadas pela infecção por Bd em sapos, porém, com efeito
equivalentemente oposto, machos de Hyla japonica infectados por Bd vocalizaram mais
rapidamente e com cantos de maior duração do que machos não infectados pelo fungo (An &
Waldman, 2016). Ironicamente, essas modificações acústicas tornariam machos mais atrativos
sexualmente. Além disso, esses resultados corroboram uma hipótese de que machos
infectados por patógenos aumentam seus esforços reprodutivos em compensação pela
potencial redução em sua vida útil (Agnew et al., 2000), característica que é mais adaptativa
para a dispersão do patógeno. Na contramão desse efeito, Greespan et al. (2016) não acharam
diferenças significativas em propriedades acústicas comparando a vocalização de machos
infectados pelo Bd com a vocalização de machos não infectados pelo patógeno em Litoria
rheocola. Dessa maneira, um estudo mais robusto, incluindo um número maior de espécies
em outras regiões do globo se faz necessário para um panorama mais completo e conclusivo
sobre o assunto.
Dado a importância da quitridiomicose como uma doença emergente que está
colocando muitas espécies de anfíbios em risco de extinção em escala global (Stuart et al.,
2004), o estudo desse patógeno, tanto no Brasil, como no mundo, ainda tem focado muito nos
aspectos de sua origem, distribuição espacial e efeitos sobre o desaparecimento de populações
(Daszak et al., 1999; Weldon et al., 2004; Skerratt et al., 2007; Olson et al., 2013). No
entanto, ainda são poucos os estudos que estão se dedicando a entender os efeitos do patógeno
sobre aspectos comportamentais das espécies (e.g., Crane & Mathis, 2011). Semelhante a
outras doenças, a infecção pelo fungo Bd reduz a imunidade dos indivíduos pelos efeitos da
toxina do fungo e pelo comprometimento da integridade da pele, e abre oportunidades para
outros patógenos debilitarem ainda mais os hospedeiros, e muitas vezes de maneira mortal
(Voyles et al., 2009; Carver et al., 2010; Fites et al., 2013). Apesar do fungo se instalar na
pele e comprometer sua integridade em adultos, até o momento não há evidências
contundentes de que a infecção pelo fungo possa comprometer diretamente a regulação
hídrica ou a função da pele na respiração de indivíduos infectados (Carver et al., 2010). Por
tanto, mecanismos fisiológicos que poderiam comprometer o comportamento em adultos é
ainda pouco conhecido.
No presente trabalho pretendemos determinar a influência da presença e grau de
infecção pelo fungo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) sobre o comportamento acústico de
espécies de anuros Neotropicais, isolando efeitos como temperatura, ruído de fundo, contexto
social, tamanho do corpo e história filogenética. Nós esperamos que possíveis alterações
imunes causadas pela presença do patógeno em machos devem alterar significativamente
características das vocalizações das diferentes espécies. Para isso, numa tentativa de
compreender o possível mecanismo que pode comprometer o comportamento dos animais
infectados, também iremos avaliar o grau de stress fisiológico dos indivíduos através de
indicadores hormonais e avaliar a presença de infecções bacterianas e outros agentes
patogênicos, como endoparasitas helmintos.
Resultados esperados
Em consideração ao achado em An & Waldman, 2016, nós esperamos confirmar a
previsão de que, uma vez isolados possíveis co-fatores, a infecção pelo fungo deve alterar
características temporais das vocalizações das diferentes espécies, já que animais doentes
deverão ampliar o gasto de energia empregada em reprodução em virtude da redução na
expectativa de vida. Esse mecanismo também é esperado por representar um sistema
adaptativo para o patógeno, uma vez que tais modificações acústicas devem aumentar o poder
de dispersão do fungo. Aqui também esperamos que animais com maior carga de zoósporos
terão maior probabilidade de apresentar piores condições de stress fisiológico, com maiores
níveis de cortisol e glicose no sangue e presença de patógenos oportunistas, como parasitas
helmintos.
Esses resultados teriam grande repercussão na comunidade científica e dariam forte
suporte para aspectos da conservação de anuros em todo planeta e devem ser disseminados
em congressos e revistas científicas especializadas e de grande fator de impacto.
Desafios científicos e tecnológicos e os meios e métodos para superá-los
O presente documento é uma proposta de trabalho interdisciplinar, que envolve áreas
científicas importantes, como bioacústica, patologia, fisiologia, genética e conservação
biológica. O grande e maior desafio desse trabalho é coletar, administrar e analisar
informações dentro do prazo proposto para o projeto, uma vez que nosso sistema de estudo,
representado no fluxograma da figura 1, é de grande complexidade. Porém, os recursos
técnicos para trabalhos de campo e os equipamentos para coleta de informações acústicas,
patológicas e genéticas já estão disponíveis para iniciar o projeto, uma vez que ele seja
aprovado. Por tanto, não há demandas de compras de equipamentos e não há necessidade de
treinamento humano para o início das atividades de campo. Contudo, as análises de presença
e infecção por patógenos e análises de material genético dos anfíbios representam uma nova
expertise que almejo obter com essa proposta. Acredito que a união desses conhecimentos
junto com minha experiência em trabalhos prévios com comportamento de anuros e
bioacústica poderá gerar trabalhos e publicações inovadoras e fundar uma linha de pesquisa
abrangente e interdisciplinar (comportamento animal sobre efeitos patológicos), que se apoia
em quatro pilares temáticos essenciais: (1) comportamento animal; (2) evolução e genética;
(3) fisiologia e patologia e (4) conservação da biodiversidade. Com o presente projeto em
proposta teremos o primeiro trabalho a considerar e levantar dados sobre efeitos de curto e
longo prazo sobre a determinação do comportamento acústico em anuros e também
levantaremos informações inéditas no que se refere à busca por possíveis mecanismos que
podem fazer com que patologias afetem o comportamento de anfíbios adultos. Para isso,
conto com uma rede de colaborações nacionais e internacionais definidas. A UNICAMP,
através do professor Felipe Toledo, representa um centro de pesquisa emergente e referência
mundial sobre o estudo da quitridiomicose em anuros. Para análise de material genético e
parasitologia ainda busco colaboração. E um dos maiores desafios do projeto é definir e
validar uma metodologia (uso de anticorpos) para quantificação dos níveis de cortisol e
glicose no sangue dos anfíbios. Provavelmente testaremos kits comerciais como ELISA (teste
de imunoensaio enzimático) e RIA (técnica de radioimunoensaio) para testar a reatividade
cruzada. Esses ensaios serão conduzidos em colaboração com a professora Mônica Jones da
UFSCar (Campus Sorocaba).
Figura 2 – Fluxograma com a hipótese de estudo. As flechas indicam a direção dos efeitos, o
retângulo verde indica o objeto de estudo e o retângulo vermelho indica o principal fator em
estudo.
Áreas de estudo. No presente projeto iremos trabalhar em áreas preservadas e alteradas por
atividades humanas em localidades com florestas de Mata Atlântica, presentes no sul e
sudeste do Brasil. Nossa distribuição amostral permitirá a obtenção de dados considerando a
ocupação geográfica de três espécies dentro de uma variação de condições térmicas nas
diferentes paisagens e diferentes formações vegetais (florestas ombrófilas densa e mista,
floresta Estacional Semidecídua e campos sulinos). Essa seleção de localidades nos permitirá
fazer generalizações mais abrangentes em relação a um possível efeito de patógenos sobre o
comportamento acústico em anuros e ao mesmo tempo nos permitirá realizar essas análises
sob uma perspectiva filogeográfica, explorando também variações térmicas, possíveis
barreiras geográficas e grau de antropização da paisagem. A lista das localidades se encontra
na tabela 1.
Tabela 1 – Lista de localidades como locais de amostragem.
Localidades Estado
Parque Estadual Carlos Botelho São Paulo
Parque Estadual Intervales São Paulo
Parque Estadual Turístico do Alto Ribeira São Paulo
Parque Estadual da Caverna do Diabo São Paulo
Tapiraí São Paulo
Parque Estadual do Turvo Rio Grande do Sul
Parque Estadual do Rio Guarani Paraná
Parque Nacional do Iguaçu Paraná
São Miguel do Oeste Santa Catarina
Espécies e procedimentos para a coleta de dados. Nós iremos trabalhar com três espécies
distintas, todas com populações abundantes, de fácil encontro e suscetíveis à infecção pelo
patógeno (Bd):
(1) Crossodactylus caramaschii (Família Hylodidae) é uma espécie de anuro que ocorre
em pequenos riachos de Mata Atlântica, entre o sul do estado de São Paulo e algumas
localidades no Paraná e Santa Catarina (Frost, 2016). A espécie é descrita do
município de Eldorado, estado de São Paulo e pertence ao grupo de Crossodactylus
gaudichaudii (Frost, 2016). Machos mantém atividade diurna de vocalização sobre
rochas em corredeiras ou em leitos de pequenos riachos (Bastos & Pombal Jr., 1995).
O canto de anúncio, de estrutura harmônica, é descrito aparentemente de um único
macho a partir da população topotípica, com média de duração de canto de 5,5
segundos, 49 a 69 notas por canto, frequência dominante de 5000 Hz e frequência
fundamental de 1600 Hz (Bastos & Pombal Jr., 1995). A vocalização tem faixa de
frequência ocupando aproximadamente de 2700 a 6800 Hz (Bastos & Pombal Jr.,
1995).
(2) Crossodactylus schmidti (Família Hylodidae) é uma espécie com características
ecológicas e comportamentais muito parecidas com C. caramaschii, porém ocorrem
em riachos de Mata Atlântica do interior do estado de Paraná, Santa Catarina e Rio
Grande do Sul, além de localidades no Paraguai e na Argentina, de onde é descrito a
partir da população de Misiones (Caldart et al., 2013). A vocalização de anúncio tem
estrutura igual a encontrada na vocalização de C. caramaschii, porém ocupa faixa de
frequência mais grave (Caldart et al., 2011). Junto com outras espécies forma o grupo
C. schmidti (Frost, 2016).
(3) Hypsiboas bischoffi (Família Hylidae) é uma espécie descrita do município de Taquara
(RS); contudo está amplamente distribuída na Mata Atlântica do sudeste do Brasil, do Rio
de Janeiro ao Rio Grande do Sul (Frost, 2016). Essa espécie parece reproduzir ao longo de
todas as estações do ano e nos ambientes de reprodução os machos mantém atividade de
vocalização em poleiros que vão de 50 a 80 cm de altura (Bertoluci & Rodrigues, 2002).
Seu canto de anúncio foi descrito a partir de machos da Estação Biológica de Boracéia
(SP) (Heyer et al., 1990). Os autores reconheceram dois tipos de canto, um bem comum e
outro mais raramente usado. É possível que o mais comum dos cantos seja o canto de
anúncio, que pode conter uma ou duas notas e durar de 0,07 a 0,45 s. As notas são
pulsionadas e podem conter entre 8 e 11 pulsos; a frequência dominante encontra-se entre
1100 e 2000 Hz (Heyer et al., 1990).
No campo nós coletaremos dados acústicos, morfológicos, genéticos, patogênicos e
amostras de sangue de cerca de 50 machos de cada espécie (pelo menos 5 indivíduos de cada
população). Com auxílio de um microfone Sennheiser ME66/k6 acoplado a um gravador
Tascam DR-680 nós gravaremos cada macho por 15 minutos seguidos. As gravações terão
formato “wav”, 24 bits de resolução e taxa de amostragem de 96 kHz. Para cada gravação, os
microfones serão suportados em um tripé a 70 cm do macho emissor. Com a mesma distância
e utilizando tripés, três medidores de nível sonoro Voltcraft SL-451, com precisão de 0,1 dB
RMS e ponderação de tempo: FAST, e ponderação de pico e frequência: C, serão
posicionados em torno do macho emissor. Um dos decibelímetros ficará em paralelo ao
microfone e os outros dois apontando para o sapo focal numa inclinação de 45 ° graus, lado a
lado em relação ao microfone. Este método será utilizado para obter o nível de pressão sonora
do sinal, reduzindo uma possível interferência da orientação do macho por uma mudança de
posição durante a gravação. Com o valor máximo de potência (dB) de cada medidor SPL,
calcularemos o nível médio de pressão da vocalização de cada macho.
Durante as gravações os dados de temperatura e umidade relativa do ar serão obtidos
por termohigrômetro digital Instrutemp, modelo ITWH1280 instalados no ambiente. O
contexto social de cada macho durante a gravação será observado e três possíveis categorias
serão registradas: (1) macho em isolamento; (2) macho em coro; e (3) macho em situação de
corte. Após cada gravação o macho será capturado diretamente com sacos plásticos, sem que
sejam tocados diretamente e contaminados pela mão do pesquisador. Esses indivíduos ficarão
acondicionados nas bolsas plásticas umedecidas até o final da amostragem de sua população.
O comprimento rostro-cloacal de cada indivíduo capturado será aferido com auxílio de
paquímetro digital Mitutoyo 200 mm (precisão 0.1 mm). Amostras de material micótico serão
recolhidas da pele de cada indivíduo seguindo a técnica do swabing, descrita em Lambertini et
al. (2013) e protocolizado por Hyatt et al. (2007). Ao final de toda amostragem micótica os
indivíduos serão inspecionados para avaliar e contabilizar a ocorrência de possíveis lesões na
pele e depois os mesmos serão mortalmente anestesiados com xilocaína e extrairemos o
fígado como material para análise genética. Os tecidos serão armazenados em criotubos de 1,5
mL com álcool absoluto e conservados em freezer à -80°C até o momento da extração e os
indivíduos serão fixados em formalina. Em laboratório nós examinaremos o trato digestivo, a
cavidade abdominal, pulmões e bexiga urinária de todos indivíduos para a análise qualitativa
e quantitativa de parasitos helmintos usando estereomicroscópio. Os parasitos helmintos serão
identificados segundo os procedimentos adotados por Madelaire et al. (2012). Após o exame
parasitológico todos indivíduos coletados serão depositados como material testemunho no
Museu de Zoologia da Universidade Estadual de Campinas (ZUEC).
No dia que antecede as gravações dos machos, o perfil acústico (ocupação de
frequência e espectro de potência) do habitat será obtido com três gravadores autônomos e
três decibelímetros do tipo Voltcraft SL-451 com armazenadores de dados instalados em três
pontos diferentes do ambiente reprodutivo. Esses aparelhos serão usados para monitorar a
ocupação espectral do ruído de fundo e a variação de nível de pressão acústica ao longo de 24
horas.
Análises acústicas. As vocalizações de todos os machos serão analisadas no software Raven
Pro 64 1.4 (Cornell Lab of Ornithology - Bioacoustics Reserch Program, 2011). A filtragem
de possíveis ruídos de fundo serão realizadas no mesmo programa usando a função “Batch
Band Filter”. Após as medições de nível de pressão médio para cada sinal, nós
normalizaremos todos os cantos que serão analisados com a amplitude de -0.8 dB no software
Audacity 2.0.5.
Sobre a dimensão temporal das vocalizações nós mediremos as seguintes propriedades
acústicas quantitativas: (1) Duração do canto; (2) Duração da nota; (3) duração do pulso; (4)
taxa de repetição de cantos; (5) taxa de repetição de notas (quando aplicável); (6) Taxa de
pulsos (quando aplicável); (7) número de notas (quando aplicável); (8) número de pulsos por
canto; (9) Intervalo entre cantos; (10) intervalo entre notas; (11) Intervalo entre pulsos; Em
consideração à dimensão espectral, nós mediremos: (1) amplitude de frequência; (2)
frequência mínima; (3) pico de frequência dominante; e (4) frequência máxima. Para análises
espectrais nós usaremos FFT (Fast Fourier Transformation) de 1024 e sobreposição de janela
(overlap) de 75 %. A seleção dos cantos e medições de pulsos serão feitas no ocilograma.
Para obtenção dos valores de cada propriedade nós utilizaremos o recurso “choose
measurements” com as seguintes funções: (1) Delta Time (s); (2) Frequency 5% (Hz) e (3)
Frequency 95% (Hz)- as duas medidas incluem frequência mínima e máxima ignorando 5 %
de intervalo de confiança para energia total do canto selecionado; (4) Bandwidth 90% (Hz)-
mede a amplitude de frequência usando o mesmo intervalo de confiança (diferença entre
Frequency 95% e Frequency 5%); e (5) Peak Frequency (Hz) - mede o pico da frequência
dominante (frequência na qual a potência é máxima dentro do canto selecionado).
A análise de ocupação espectral (Amplitude espectral do ruído de fundo) será feita no
software Raven, usando FFT de 1024 e sobreposição de janela de 75 %. Em cada áudio nós
selecionaremos 5 amostras de 3 segundos e utilizaremos as funções “Frequency 5%” e
“Frequency 95%” para determinar precisamente a ocupação espectral registrada por cada
áudio.
Análise genética. Para extração de DNA, a partir dos tecidos armazenados, nós usaremos o
mesmo procedimento adotado por Veiga-Menocello et al. (2014). Nós visamos a ampliação e
sequenciamento de 4 marcadores moleculares: (1) NADH (subunidade 2 - ND2), (2) RAG1;
(3) β-Fibrinogen; e (4) 28S. Esses marcadores tem sido aplicados para estudos filogeográficos
(Prado et al., 2012; Tonini et al., 2013; Menezes et al., 2016). O DNA mitocondrial tem sido
especialmente utilizado nesse nível por sua elevada taxa de evolução (Brow et al., 1982;
Brow, 1985). Fragmentos serão purificados usando kit de purificação GE Healthcare Life
Science (São Paulo, Brazil). As sequências serão obtidas usando primers no kit de ciclo de
sequenciamento BigDyeTM
3.1 (Applied Biosystems Foster City, CA, USA). A leitura das
placas do sequenciamento será feita no sequenciador automático modelo ABI 3700/Prism.
Todas sequências serão verificadas por observação direta usando o software BioEdit v.5.0.9 e
o alinhamento faremos com programa Muscle (Edgar, 2004).
Para cada espécie nós iremos estimar uma árvore de relação genética entre indivíduos
usando o método de verossimilhança máxima e inferência bayesiana, como implementado em
RAxMLGUI v.1.3 (Stamatakis, 2006) e MrBayes 3 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003),
respectivamente. Em todas analises, modelos de substituição serão obtidos usando
JmodelTest2 (Darriba et al., 2012) de acordo com o valor de AIC (Akaike Information
Criterion). A análise de verossimilhança será realizada em 100 rodagens e com bootstrap de
1000 replicações. Na análise de inferência bayesiana nós realizaremos duas rodadas
independentes de MCMC, cada uma com quarto cadeias a 20 milhões de passos, amostrando
1000 gerações e descartando os dois primeiros milhões de burn-up. A convergência de
parâmetro será verificada no software Tracer v1.6 (http://beast.bio.ed.ac.uk/Tracer).
Nós iremos estimar o tempo de divergência usando o método tree no software
*BEAST 1.8.0 (Drummond et al., 2012). A árvore no *BEAST será construída no CIPRES
Science Gateway (Miller et al., 2010). Em nosso modelo (strict clock) nós fixaremos a taxa de
substituição em 0.00957 mutações/local/ milhões de anos (Crawford, 2003). Para
substituições nucleares nós usaremos distribuição log-normal default (média = 0 e desvio
padrão = 1) e permitiremos o programa co-estimar as taxas. Nós realizaremos três rodagens
MCMC independentes de 200 milhões de gerações, com amostragens a cada 10.000 gerações.
As árvores resultantes serão combinadas e sumarizadas usando o TreeAnotator.
Procedimentos para análise de stress fisiológico. Nós faremos a quantificação de níveis de
cortisol e glicose no plasma sanguíneo dos anuros através da validação de métodos já
consolidados usando kits comerciais em procedimentos semelhantes aos usados para peixes.
Nós iremos usar o kit ELISA (teste de imunoensaio enzimático) para testar a reatividade
cruzada e determinar a concentração do cortisol. Para essa análise usaremos os procedimentos
descritos em Velasco-Santamaría & Cruz-Casallas (2007). Para o radioimunoensaio nós
usaremos o kit comercial “Coat-a-Count Cortisol®” - DPC (Diagnostic Products
Corporations, Los Angeles, CA, USA) e faremos a determinação dos níveis de glicose pelo
método colorimétrico de Trinder (1969).
Extração de DNA e PCR para análise de presença e infecção do patógeno Bd. Para extração
de DNA nós adicionaremos 50 μL do reagente PrepMan ULTRA® (Applied Biosystems) em
cada criotubo contendo o swab. Por dois ciclos os tubos serão agitados em vortex por 45
segundos, e depois centrifugados por 30 segundos a 12.000 RPM. Após a conclusão de dois
ciclos desse processo nós iremos seguir o seguinte procedimento para concluir a extração: (1)
aquecer os tubos em banho com água fervente por 10 minutos, (2) resfriar em temperatura
ambiente por 2 minutos, (3) centrifugar por 1 minuto a 12.000 RPM, (4) inverter o swab
dentro do criotubo (utilizando pinças flambadas a cada inversão), (5) centrifugar por 5
minutos a 12.000 RPM, (6) descartar os swabs, (7) centrifugar rapidamente (por alguns
segundos), (8) transferir 45 μL da solução para novos tubos; (9) centrifugar por 10 minutos a
12.000 RPM e (10) preparar uma diluição 1:10 do material genético para estocar (também
poderá ser utilizada nas reações de qPCR).
A amplificação do DNA será realizada através da técnica de PCR (Polymerase Chain
Reaction), de acordo com o protocolo de Annis et al. (2004), utilizando os primers específicos
do Bd: Bd1a (5’‑ CAGTGTGCCATATGTCACG‑ 3’), e Bd2a
(5’‑ CATGGTTCATATCTGTCCAG‑ 3’). Para uma reação com volume final de 25 μL, nós
iremos preparar uma mistura de primers, contendo 1 μM de cada um, MgCl2 (0.9 mM),
1XTaq Buffer, 0.2 mM de cada dNTP e 0.8 U de TaqPolymerase. Um controle negativo de
água destilada será adicionado à reação. As condições de amplificação serão: denaturação
inicial a 93°C por 10 minutos, seguida de 30 ciclos de 45 segundos a 93°C, 45 segundos a
60°C, 1 minuto a 72°C, e extensão final a 72°C por 10 minutos. Após a reação de PCR,
aproximadamente 10 μL de cada amplificado deve ser analisado em gel de agarose 0,7%,
juntamente com um DNA ladder como um padrão de tamanho de DNA. O gel será corado
com brometo de etídio e visualizado em transluminador de luz ultravioleta. O resultado será
considerado positivo para presença de Bd quando forem visualizadas bandas de amplificação
de aproximadamente 300 pb (pares de base).
Para aqueles indivíduos que atestarem positivos com a presença do Bd nós faremos a
quantificação de zoósporos seguindo a técnica da qPCR. Para realizar essa reação nós
primeiro prepararemos os padrões que serão utilizados como parâmetros no processo de
quantificação através da cultura do Bd em placas de ágar Triptona 1% (Longcore et al. 1999;
Vieira & Toledo, 2012). As culturas serão mantidas em estufa à 21°C por aproximadamente 7
dias. Uma vez observada atividade dos zoósporos, nós adicionaremos 10 mL de água MilliQ
em cada placa, e aguardaremos 30 minutos para que os zoósporos fiquem livres na solução.
Após esse procedimento, iremos raspar as placas com alça plástica estéril, e transferir todo o
conteúdo para tubos tipo Falcon de 50 mL. Os tubos serão agitados em vortex por 25
segundos para depois coletar a suspensão com uma seringa de 20 mL com bico LuerLok®
(BD) e filtraremos a suspensão utilizando filtros de membrana com poros de 10 μm de
diâmetro. Após esse procedimento nós adicionaremos o filtrado em outro tubo tipo Falcon de
50 mL.
Este procedimento será realizado para determinar a concentração da suspensão de
zoósporos utilizada no preparo dos padrões que serão utilizados na reação. Nesse momento é
necessário preparar uma solução v/v com volume final de 100 μL, contendo a suspensão de
zoósporos e iodo a 2%. Após 10 minutos os zoósporos serão colorificados e sequencialmente
iremos preencher ambos os lados de um hemocitômetro (câmara de Neubauer) com
aproximadamente 10 μL da suspensão e realizar a contagem. Para a contagem, nós
contabilizaremos os zoósporos presentes em 10 quadrados do quadrante central de cada lado
da câmera. Após a obtenção da média dos 10 quadrados de cada lado nós multiplicaremos o
valor por 25. E depois multiplicaremos esse resultado por 10 e seguidamente por 2. Esse
procedimento matemático é devido a diluição com iodo, obtendo assim a média de zoósporos
presentes em 1 μL. Segundo experiências iniciais (Lambertini et al. 2013), a concentração
pode variar, mas o número de zoósporos da suspensão deve ser 2 × 106 para iniciar a diluição
seriada, e a contagem deve ser repetida no mínimo 10 vezes, ou seja, em 5 câmaras.
Análise de dados. Para testar nossa hipótese representada na Figura 1, nós utilizaremos a
abordagem de modelos lineares generalizados (GLM), separadamente para cada espécie.
Primeiramente faremos correlações múltiplas entre variáveis dentro de cada classe de
variáveis (dependentes e independentes). Essas correlações visam possíveis reduções de
variáveis na exploração de nossos modelos, que terão as seguintes variáveis independentes:
(1) Comprimento rostro-cloacal (mm); (2) contexto social; (3) Temperatura do ar (0C); (4)
Nível de pressão sonora do ruído de fundo (dB); (5) grau de sobreposição espectral com ruído
de fundo; (6) Presença de Bd; (7) grau de infecção de Bd (média de zoósporos presentes em 1
μL); (8) Nível de concentração de cortisol; (9) Nível de concentração de glicose sanguínea;
(10) Número de lesões na pele; (11) Grau de infecção por parasitas helmintos e (12) substrato
de vocalização. As variáveis dependentes serão as propriedades acústicas já mencionadas
acima. Para seleção de modelos nós utilizaremos os valores AIC (Akaike information
criterion) e os níveis de significância de 0,05. Para avaliar se a distância genética afeta a
variação acústica entre indivíduos, nós faremos o teste de Mantel para correlacionar a matriz
acústica, com a matriz de distância genética.
De maneira adicional, nós faremos uma Análise de Componentes Principais (PCA)
para compreender o grau de contribuição de cada variável independente sobre a determinação
da distribuição de dados acústicos. Todas análises estatísticas serão realizadas no software
STATISTICA version 7.1 (Statsoft, 2005).
Cronograma de execução do projeto e atividades didáticas
2017 2018 2019 2020
Atividades/Período 2° Semestre 1°Semestre 2° Semestre 1°Semestre 2° Semestre 1°Semestre
Revisão teórica X X X X X X
Trabalho de campo X X X
Análise bioacústica
X X
Análise da presença e infecção por
Bd X X
Análise parasitológica
X X
Testes para quantificação de níveis
hormonais X X
Análise genética
X
Análise de dados
X X X
Oferecimento de cursos de extensão
e participação como professor em
disciplina de pós-graduação
X
X
X
Orientação de projetos de mestrado e
doutorado X X X X X X
Participação em congresso X X
X X
Relatórios
X
X
Redação de manuscritos X X X X X X
Disseminação e avaliação
O Bd é um dos principais causadores de declínios populacionais de anfíbios no mundo
(Stuart et al., 2004; Skerratt et al., 2007). Esse patógeno emergente já tem sido registrado em
associação com diversas espécies, tanto na região neotropical, como em outras regiões do
planeta (Olson et al., 2013). Por essa razão, o conhecimento de seu funcionamento, dinâmica
e seus efeitos sobre o comportamento das espécies é de extrema importância para a
conservação dos anfíbios. Esse tipo de informação também é fundamental para ações
paliativas e pode auxiliar a execução de planos de manejo inteligentes na defesa da
biodiversidade.
Atualmente temos apenas dois trabalhos que exploraram possíveis efeitos da infecção
por Bd sobre a expressão de características acústicas em sapos. Porém, esses trabalhos
apresentam dados contrastantes e pontuais, já que encontraram resultados opostos em apenas
uma espécie em suas regiões (Coréia do Sul e Austrália: An & Waldman, 2016; Greenspan et
al., 2016). Nosso trabalho será o primeiro a abordar o assunto na região neotropical, e também
contará com uma amostragem mais diversificada, também explorando a variação de potência
do sinal, o ponto de vista social do processo de comunicação acústica e a ocorrência de outras
doenças epidêmicas e oportunistas.
Todos dados gerados com esse projeto deverão ser divulgados através da participação
em congressos e de publicações científicas em revista de grande impacto. Ocasionalmente os
resultados também poderão ser disseminados através de revistas de divulgação científica.
Outros projetos poderão ser implantados dentro do mesmo universo e esforço amostral e
poderão gerar o envolvimento de alunos de iniciação científica, de mestrado e também de
doutorado, além de possíveis estágios para alunos de graduação.
Abaixo seguem propostas de projetos que pretendo conduzir dentro do período da
bolsa:
Iniciação científica 1: “Exibições acústicas sob efeito de parasitas helmintos em sapos
Neotropicais”
Mestrado 1: “Indicadores de condições de imunidade e stress fisiológico em anuros sob os
efeitos da quitridiomicose”
Doutorado 1: “Evolução dos sinais acústicos no gênero Crossodactylus: o papel da genética e
do ambiente”
Referências
AN, D. & WALDMAN, B. 2016. Enhanced call effort in Japanese tree frogs infected by amphibian
chytrid fungus. Biology Letters, 12: 20160018.
ANNIS, S.L., DASTOOR, FP., ZIEL, H., DASZAK, P. & LONGCORE, JE. 2004. A DNA-based
assay identifies Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians. Journal of Wildlife Diseases,
40:420‑ 428.
ARAÚJO, CB, GUERRA, TJ., AMATUZZI, COM. & CAMPOS, LA. 2012. Advertisement and
territorial calls of Brachycephalus pitanga (Anura: Brachycephalidae). Zootaxa, v. 3302, p. 66–67.
BASTOS JP. & POMBALJR JP. 1995. New species of Crossodactylus (Anura: Leptodactylidae) from
the Atlantic rain forest of southeastern Brazil. Copeia 1995:436-439.
BAUGH, AT., HOKE, KL. & RYAN, MJ. 2012. Development of communication behaviour: receiver
ontogeny in Túngara frogs and a prospectus for a behavioural evolutionary development. Sci World J
2012:680632. doi:10.1100/2012/680632
BEE, MA., PERRILL, SA. & OWEN, PC. 2000. Male green frogs lower the pitch of acoustic signals
in defense of territories: a possible dishonest signal of size?—Behav. Ecol. 11: 169-177.
BERTOLUCI J & RODRIGUES MT. 2002. Seasonal patterns of breeding activity of Atlantic
Rainforest anurans at Boracéia, Southeastern Brazil. Amphibia-Reptilia,, 23:161-167.
BIOACOUSTICS RESEARCH PROGRAM. (2011). Raven Pro: Interactive Sound Analysis Software
(Version 1.4) [Computer software]. Ithaca, NY: The Cornell Lab of Ornithology. Available from
http://www.birds.cornell.edu/raven.
BOTH, C. & GRANT, T. 2012. Biological invasions and the acoustic niche: the effect of bullfrog calls
on the acoustic signals of white-banded tree frogs. Biology Letters 8: 714-716.
BROWN, WM., PRAGER, EM., WANG, A. & WILSON, AC. 1982. Mitochondrial DNA sequences
of primates: Tempo and mode of evolution. J. Mol. Evol., (18) 225-239.
BROWN, WM. 1985. The mitochondrial genome of animals, in Molecular Evolutionary Genetics (ed.
R.J. Maclntyre), Plenum Press, New York, pp. 95-130.
BRUMM, H. & ZOLLINGER, SA. 2011. The evolution of the Lombard effect: 100 years of
psychoacoustic research. Behaviour 148, 1173 e1198.
CADE, WH. 1984. Effects of fly parasitoids on nightly calling duration in field crickets. Can. J. Zool.
62:226–228.
CALDART, VM., IOP, S., DE SÁ, FP., DA ROCHA, MC., DE ARRUDA, LS., SANTOS, TGD. &
CECHIN, STZ. 2013. New records of Crossodactylus schmidti Gallardo, 1961 (Anura: Hylodidae) for
the state of Rio Grande do Sul, Brazil, with data on morphometry and an updated geographic
distribution map . Check List. Journal of Species Lists and Distribution 9: 1552–1555.
CALDART VM., IOP S., CECHIN SZ. 2011. Vocalizations of Crossodactylus schmidti Gallardo,
1961 (Anura, Hylodidae): advertisement call and aggressive call. North West J Zool 7:118–124.
CARVER, S., BELL, BD. & WALDMAN, B. 2010. Does chytridiomycosis disrupt amphibian skin
function? Copeia 2010, 487–495.
CRANE AL & MATHIS A. 2011. Morphological and behavioral changes of salamanders Infected
with amphibian chytrid fungus (Batrachochytrium dendrobatidis). IRCF Reptiles & Amphibians,
18(3): 139-143.
CRAWFORD AJ. 2003. Huge populations and old species of Costa Rican and Panamanian dirt frogs
inferred from mitochondrial and nuclear gene sequences. Molecular Ecology, 12:2525–2540.
CUNNINGTON, GM. & FAHRIG, L. 2010. Plasticity in the vocalizations of anurans in response to
traffic noise. Acta Oecol. 36:463–470.
DARRIBA, D., TABOADA, GL., DOALLO, R. & POSADA, D. 2012. JModelTest 2: more models,
new heuristics and parallel computing. Nature Methods, 9: 772–772.
DAWSON, B. & RYAN, MJ. 2009. Early experience leads to changes in the advertisement calls of
male Physalaemus pustulosus. Copeia 2009:221–226.
DRUMMOND, AJ., XIE, W. & HELED, J. 2012. Bayesian Inference of Species Trees from
Multilocus Data Using *BEAST. Molecular Biology and Evolution, 29:1969–1973.
EDGAR, RC. 2004. Muscle: multiple sequence alignment with high accuracy and high
throughput. Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797.
ESRI. Arcview 10.1. 2012. Redlands, CA, USA.
FITES, JS. et al. 2013. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses.
Science 342, 366–369. (doi:10.1126/science.1243316)
FORTI, L.R., MARQUEZ, R. & BERTOLUCI, J. (2015) Advertisement call of Dendropsophus
microps (Anura: Hylidae) from two populations of southeastern Brazil. Zoologia 32:187–194.
FROST, D.R. 2016. Amphibian Species of the World: an Online Reference. Version 6.0 (Date of
access). Electronic Database accessible at http://research.amnh.org/herpetology/amphibia/index.html.
American Museum of Natural History, New York, USA.
GERHARDT, HC. & DAVIS, MS. 1988. Variation in the coding of species identity in the
advertisement calls of Litoria verreauxi (Anura: Hylidae). Evolution 42: 556-565.
GERHARDT, HC., GUTTMAN, SI. & KARLIN, AA. 1980. Natural hybrids between Hyla cinerea
and Hyla gratiosa: morphology, vocalizations and electrophoretic analysis. Copeia 1980:577–584.
GINGRAS, B., BOECKLE, M., HERBST, CT. & FITCH, WT. 2013. Call acoustics reflect body size
across four clades of anurans. J Zool. 289: 143-150.
GRAFE, TU., PREININGER, D., SZTATECSNY, M., KASAH, R., DEHLING, JM., PROKSCH, S.
& HÖDL, W. 2012. Multimodal communication in a noisy environment: a case study of the Bornean
rock frog Staurois parvus. PLoS One 7:e37965
GREENSPAN, SE., ROZNIK, EA., SCHWARZKOPF, L., ALFORD, RA. & PIKE, DA. 2016.
Robust calling performance in frogs infected by a deadly fungal pathogen. Ecology and Evolution
2016; 6(16): 5964-5972. doi: 10.1002/ece3.2256
HALFWERK, W., LEA, AM., GUERRA, MA., PAGE, RA. & RYAN, M. J. 2015. Vocal responses to
noise reveal the presence of the Lombard effect in a frog. Behav. Ecol. first published online
December 6, 2015, doi: 10.1093/beheco/arv204
HEYER, WR., RAND, AS., CRUZ, CAG., PEIXOTO, OLL., NELSON, CE. 1990. Frogs of
Boracéia. Arquivos de Zoologia 31(4): 231–410.
HIJMANS RJ, CAMERON SE, PARRA J L, JONES PG, JARVIS A. 2005 Very high resolution
interpolated climate surfaces for global land areas. Int J Climatol. 25: 1965-1978.
HYATT, AD., BOYLE, DG., OLSEN, V., BERGER, L., OBENDORF, D., DALTON A., KRIGER,
K., HERO, A., HINES, H., PHILLOT, R., CAMPBELL, R., MARANTELLI, G., GLEASON, F. &
COLLING, A. 2007. Diagnostic assays and sampling protocols for the detection of Batrachochytrium
dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms, 73:175‑ 192.
KAISER, K. & HAMMERS, JL. 2009. The effect of anthropogenic noise on male advertisement call
rate in the neotropical treefrog, Dendropsophus triangulum. Behaviour 146:1053-1069.
LAMBERTINI, C., RODRIGUEZ, D., BRTIO, FB., LEITE, DS. & TOLEDO LF. 2013. Diagnóstico
do fungo Quitrídio: Batrachochytrium dendrobatidis. Herpetol Bras. 2013; 2: 12-17.
LITTLEJOHN, MJ. 1976. The Litoria ewingi complex (Anura: Hylidae) in south-eastern Australia IV.
Variation in mating-call structure across a narrow hybrid zone between L. ewingi and L. paraewingi.
Australian Journal of Zoology 24: 283- 293.
LONGCORE, JE., PESSIER, AP. & NICHOLS, DK. 1999. Batrachochytrium dendrobatidis gen. et
sp. nov., a chytrid pathogenic to amphibians. Mycologia, 91:219‑ 227.
LOPEZ, PT., NARINS, PM., LEWIS, ER. & MOORE, SW. 1988. Acoustically induced call
modification in the white-lipped frog Leptodactylus albilabris. — Anim. Behav. 36: 1295-1308.
MADELAIRE, CB., DA SILVA, RJ. & GOMES, FR. 2013. Calling behavior and parasite intensity in
treefrogs, Hypsiboas prasinus. J. Herpetol. 47:450–455.
MADELAIRE, C. B., F. R. GOMES, AND R. J. SILVA. 2012. Helminth parasites of Hypsiboas
prasinus (Anura: Hylidae) from two Atlantic Forest fragments, São Paulo State, Brazil. Journal of
Parasitology 98:560–564.
MÁRQUEZ, R. & BOSCH, J., 1997. Female preference in complex acoustical environments in the
midwife toads Alytes obstetricans and Alytes cisternasii. Behavioral Ecology 6: 588-594.
MÁRQUEZ, R. & BOSCH, J. 1997. Male advertisement call and female preference in sympatric and
allopatric midwife toads (Alytes obstetricans and Alytes cisternasii). Animal Behaviour 54:1333–
1345.
MÁRQUEZ, R., BOSCH, J. & EEKHOUT, X. 2008. Intensity of female preference quantified
through playback setpoints: call frequency versus call rate in midwife toads. Animal Behaviour 75:
159-166.
MÁRQUEZ, R., PARGANA, JM. & CRESPO, EG. 2001. Acoustic competition in male Pelodytes
ibericus: interactive playback tests. Copeia 2001, 1142-1150
MARTIN, LB., SCHEUERLEIN, A. & WIKELSKI, M. 2003. Immune activity elevates energy
expenditure of house sparrows: a link between direct and indirect costs? P. Roy. Soc. Lond. B Biol.
270:153–158.
MENEZES, L., CANEDO, C., BATALHA-FILHO, H., GARDA, AA., GEHARA, M. & NAPOLI,
MF., 2016. Multilocus Phylogeography of the Treefrog Scinax eurydice (Anura, Hylidae) Reveals a
Plio-Pleistocene Diversification in the Atlantic Forest. PLoS One 11 (6):e0154626. doi:
10.1371/journal.pone.0154626.
MILLER, MA., PFEIFFER, W. & SCHWARTZ, T. 2010. Creating the CIPRES Science Gateway for
inference of large phylogenetic trees. Gateway Computing Environments Workshop (GCE). 2010;1–8.
NARINS, PM., FENG, AS., LIN, WY., SCHNITZLER, HU., DENZINGER, A., SUTHERS, RA. &
XYU, CH. 2004. Old World frog and bird, vocalizations contain prominent ultrasonic harmonics. J.
Acoust. Soc. Am. 115: 910-913.
OLSON, DH., AANENSEN, DM., RONNENBERG, KL., POWELL, CI., WALKER, SF., BIELBY,
J., GARNER, TW., WEAVER, G., BD. MAPPING GROUP & FISHER MC. 2013. Mapping the
global emergence of Batrachochytrium dendrobatidis, the amphibian chytrid fungus. PLoS One
8(2):e56802. doi: 10.1371/journal.pone.0056802.
PRADO, CP., HADDAD, CF. & ZAMUDIO, KR. 2012. Cryptic linages and Pleistocene population
expansion in a Brazilian Cerrado frog. Mol. Ecol. 21, 921-941.
PRÖHL, H. 2003. Variation in male calling behaviour and relation to male mating success in the
strawberry poison frog (Dendrobates pumilio). Ethology, 109(4): 273-290.
RON, SR. 2008. The evolution of female mate choice for complex calls in túngara frogs. Anim.
Behav. 76: 1783-1794.
RONQUIST, F., HUELSENBECK, JP. 2003. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under
mixed models. Bioinformatics, 19:1572–1574.
RYAN, MJ. & RAND, AS. 2001. Feature weig ting in signal recognition and discrimination by
t ngara frogs. In Anuran Communication. Ed. by M.J. Ryan. Smithsonian Institution Press,
Washington D.C. P. 86–101.
SCHWARTZ, JJ. 1986. Male calling behaviour and female choice in the Neotropical frog Hyla
microcephala. Ethology 73: 116-127.
SHEN, JX. & XU, ZM. 2016. The Lombard effect in male ultrasonic frogs: Regulating antiphonal
signal frequency and amplitude in noise. Scientific Reports 6, Article number: 27103.
doi:10.1038/srep27103
SKERRATT, LF., BERGER, L., SPEARE, R., CASHINS, S., MCDONALD, KR., PHILLOTT, AD.,
ET AL. 2007. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of
frogs. EcoHealth 4:125–134
STAMATAKIS, A. 2006. RAxML-VI-HPC Maximum likelihood-based phylogenetic analyses with
thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics, 22:2688–2690.
STATSOFT Inc. 2005. STATISTICA (data analysis software system), version 7.1. www.statsoft.com.
STUART, SN., CHANSON, JS., COX, NA., YOUNG, BE., RODRIGUES, ASL., FISCHMAN, DL.
& WALLER, RW. 2004. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science
306:1783–1786.
TAIGEN, TL. & WELLS, KD. 1985. Energetics of vocalization by an anuran amphibian (Hyla
versicolor). Journal of Comparative Physiology, B 155 (2): 163-170.
TAMURA, K., PETERSON. D., PETERSON, N., STECHER, G., NEI, M. & KUMAR S. 2011.
MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary
Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28:2.731-2.739.
TÁRANO, Z. & HERRERA, EA. 2003. Female preferences for call traits and male mating success in
the neotropical frog Physalaemus enesefae. Ethology 109:121–134.
TONINI, JFR., COSTA, LP. & CARNAVAL, AC. 2013. Phylogeographic structure is strong in the
Atlantic Forest; predictive power of correlative paleodistribution models, not always. J Zool Syst Evol
Res. 51: 114-121.
TRINDER P. 1969. Determination of blood glucose using an oxidase-peroxidase system with a non-
carcinogenic chromogen. J. Clin. Pathol. 22: 158-161.
VEIGA-MENOCELLO, AC., LOURENÇO, LB., STRUSSMANN, C., ROSSA-FERES, DC.,
ANDRADE, GV., GIARETTA, AA. & RECCO-PIMENTEL, SM. 2014. A phylogenetic analysis of
Pseudopaludicola (Anura) providing evidence of progressive chromosome reduction. Zoologica
Scripta 43(3):261-272.
VELASCO-SANTAMARÍA, Y., CRUZ-CASALLAS, P. 2007. Methodology for determination of
plasma cortisol in fish using competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Revista
MVZcordoba 12:869-877.
VIEIRA, CA. & TOLEDO, LF. 2012. Isolamento, cultivo e armazenamento do fungo quitrídio:
Batrachochytrium dendrobatidis. Herpetologia Brasileira, 1:18‑ 19.
VOYLES, J. et al. 2009 Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines.
Science 326, 582–585.
WELCH, AM., SEMLITSCH, RD., & GERHARDT, HC. 1998. Call duration as an indicator of
genetic quality in male gray tree frogs. Science 280:1928–1930.
WELLS KD. 2001. The energetics of calling in frogs. In Anuran Communication. Ed. by Ryan MJ.
Smithsonian Institution Press. Washington D.C. P. 45-60.
WELLS KD. 2007. The Ecology and Behavior of Amphibians. Chicago, The University of Chicago
Press.
WELLS, KD. & GREER, BJ. 1981. Vocal responses to conspecific calls in a neotropical hylid frog,
Hyla ebraccata. — Copeia: 615-624.
WELLS, KD. & SCHWARTZ, JJ. 2006. The behavioral ecology of anuran communication. In: Narins
PM, Feng AS, Fay RR, Popper AN (eds) Hearing and sound communication in amphibians, vol 28.
Springer, Berlin Heidelberg New York, pp 44–86.
WELLS, KD. & TAIGEN, TL. 1986. The effect of social interactions on calling energetics in the gray
treefrog (Hyla versicolor). Behav. Ecol. Sociobiol., 19:9-18.
WONG, BBM., COWLING, ANN., CUNNINGHAM, RB., DONNELLY, CF. & COOPER, PD.
2004. Do temperature and social environment interact to affect call rate in frogs (Crinia signifera)?
Austral Ecology, 29(2):209–214.