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1

ELAINE CRISTINA KORMANN

SÍNTESE DE DERIVADOS TIAZOLIDINODIÔNICOS E

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA

E EFEITO ANTITUMORAL NO CÂNCER DE MAMA

TRIPLO-NEGATIVO

Itajaí

2017

3

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

ELAINE CRISTINA KORMANN




TRIPLO-NEGATIVO

Tese submetida à Universidade do Vale

do Itajaí como parte dos requisitos para a

obtenção do grau de Doutor em Ciências

Farmacêuticas.

Orientadora: Profa. Dra. Fátima de

Campos Buzzi.

Co-orientador: Prof. Dr. Rogério Corrêa.

Itajaí,

Setembro/2017

4

Catalogação na fonte pela Bibliteca Universitária

7

Dedico este trabalho aos meus pais Edson Kormann

e Lourdes Kormann, pelos ensinamentos, incentivos,

apoio, dedicação e por me ensinarem a importância da

família e o caminho da honestidade e persistência.

Pelo amor verdadeiro que sempre foi e será muito

importante para que eu continue minha caminhada.

9

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pois sem ele eu não teria chego

até aqui.

Aos meus pais, Lourdes e Edson pelo amor incondicional, apoio e

incentivo em todos os meus sonhos e decisões. Eu amo vocês!!!

A minha querida orientadora, Fátima de Campos Buzzi, por estar

ao meu lado desde o meu trabalho de graduação, acompanhando meu

crescimento acadêmico e agora finalizando comigo este trabalho de

Doutorado. Obrigada por tudo, quero que saibas que te admiro muito!!!

Ao meu orientador de Salamanca (Espanha), Atanasio Pandiella

Alonso, e toda sua equipe por terem me acolhido e orientado com tanto

carinho no período em que estive fazendo intercâmbio. Já sinto saudades de

todos!!!

Ao meu co-orientador Rogério Corrêa, pelo convívio diário, apoio

e observações prestadas neste trabalho. Estendo o agradecimento a

professora Luisa Mota da Silva, por toda a orientação nos testes

farmacológicos, e a sua equipe, Lincon, Luisa e Camile meus sinceros

agradecimentos.

Aos meus colegas de laboratório, Ana Carolina, Anelise, Bianca,

Bruna, Camila, Camile, Daiane, Dorimar, Eduardo, Jonathan, Luciana,

Marcel, Nayara, Thairinne, e Thaís, que fizeram os meus dias muito mais

alegres.

Ao professor e coordenador do Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas, Clóvis, por permitir através do programa de pós

graduação que eu realizasse um intercâmbio de doutorado sanduiche.

Ao professor Valdir Cechinel Filho, obrigada por toda ajuda nos

trâmites para que eu conseguisse a bolsa de doutorado sanduiche. Tivesse

grande participação nessa minha trajetória.

Aos demais professores, que de alguma forma ajudaram na

realização deste trabalho, meu muito obrigada a todos!!!

Por fim, a CAPES e ao programa Ciências sem Fronteiras pelo

apoio financeiro.

11




TRIPLO-NEGATIVO

Autor: Elaine Cristina Kormann

Setembro/2017

Orientador: Fátima de Campos Buzzi, Doutora.

Co-orientador: Rogério Corrêa, Doutor.

Número de Páginas: 297

Os fragmentos biologicamente ativos como o heterocíclo 2,4-tiazolidinodiona e o

grupo sulfonamida tem ganhado grande importância devido as suas diversas

atividades terapêuticas. Este trabalho teve como objetivo unir os fragmentos 2,4-

tiazolidinodiona e sulfonamida e avaliar o efeito antitumoral em células de câncer de

mama triplo negativo e a atividade gastroprotetora. Foram síntetizadas 6 séries (A-F)

de compostos, totalizando 37 derivados, sendo 28 inéditos. As séries de A a E foram

feitas em três etapas: formação do núcleo benzilidenotiazolidinodiona,

clorossufonação e substituições nucleofílicas. Já os derivados da série F, além das

três etapas mencionadas anteriormente, foi realizada uma nova substituição

nucleofílica apartir dos compostos A1, D1, D2, D3, e D4. Os compostos foram

purificados e caracterizados por ponto de fusão e métodos espectroscópicos usuais.

Os rendimentos foram satisfatórios, variando de 18% a 93,76%. A análise

computacional foi avaliada através da “regra dos 5” estabelecida por Lipinski, a fim

de avaliar a biodisponibilidade por via oral dos compostos sintetizados. Já as

propriedades relativas às características de fármaco e toxicidade foram calculadas a

partir do programa OSIRIS property Explorer. Os compostos demonstraram boa

biodisponibilidade por via oral. Além disso, todos apresentaram características de

fármacos e o teste de toxicidade mostrou que a maioria dos compostos não

apresentou nenhum risco tóxico. Os testes farmacológicos “in vitro” foram

realizados com células de câncer de mama triplo negativo (MDAMB-231). Para a

avaliação do efeito antitumoral foram realizados ensaios de citotoxicidade celular

através do método de MTT, efeito na apoptose e no ciclo celular e avaliação das

proteinas envolvidas no ciclo celular por Western Blot. O composto F1 foi o que

apresentou melhor atividade citotóxica, com valores de CI50 de 5,11μM, no peírodo

de 72h de incubação. Os demais testes foram realizados somente com o composto

F1, por ter sido o mais citotóxico. No entanto, não apresentou atividade relacionada

com a apoptose e sim retardo nas fases G1/S e G2/M do ciclo celular. Para a

atividade gastroprotetora foram realizados os testes em modelo de úlcera induzida

por etanol, quantificação de muco aderido a mucosa gástrica, quantificação dos

níveis de GSH através de ensaio bioquímico, avaliação da atividade da H+,

K+ATPase in vitro e avaliação da participação do óxido nítrico, grupo sulfidrílicos

12

não proteicos, prostaglandinas e receptores PPARƴ no efeito gastroprotetor. Para

esta análise os compostos testados foram o A1, C1, D1 e F1, sendo o A1 o mais

ativo, apresentando atividade gastroprotetora na dose de 3 mg/Kg. Em suma, os

compostos F1 e A1 apresentaram os resultados mais promissores, com efeito

antitumoral e atividade gastroprotetora, respectivamente, sendo de grande relevância

a continuidade de novos estudos para estes derivados a fim de se obter futuramente

fármacos mais ativos com menos efeitos adversos.

Palavras-chave: tiazolidinodiona. gastroproteção. câncer.

13

SYNTHESIS OF THIAZOLIDINEDIONIC

DERIVATIVES AND EVALUATION OF

GASTROPROTECTION ACTIVITY AND ANTITUMOR

EFFECT IN TRIPLE-NEGATIVE BREAST CÂNCER

Author: Elaine Cristina Kormann September /2017 Supervisor: Fátima de Campos Buzzi, Dra.

Co-supervisor : Rogério Corrêa, Dr.

Number of pages: 297

Biologically active fragments such as the heterocycle 2,4-thiazolidinedione and the

sulfonamide group have been increasing in importance due to their various

therapeutic activities. This study aimed to connect the 2,4-thiazolidinedione and

sulfonamide fragments, in order to evaluate antitumor effect in triple-negative breast

cancer cells and gastroprotective activity. Six series (A-F) of compounds were

synthesized, with a total of 37 compounds, of which 28 were new. Series A and E

were performed in three stages: formation of the benzylidenethiazolidinodione,

chlorossufonation and nucleophilic substitutions. In the derivatives of series F,

besides the three steps mentioned above, a new nucleophilic substitution was

performed from compounds A1, D1, D2, D3 and D4. The compounds were purified

and characterized by melting point and the usual spectroscopic methods. The yields

were satisfactory, ranging from 18% to 93.76%. The computational analysis was

evaluated using the "rule of five" established by Lipinski, in order to evaluate the

oral bioavailability of the compounds synthesized. The properties related to drug

characteristics and toxicity were calculated from the OSIRIS property Explorer

program. The compounds showed good oral bioavailability. In addition, all of them

presented drug characteristics, and the toxicity test showed that most of the

compounds did not present any toxic risk. Pharmacological tests "in vitro" were

performed with triple-negative breast cancer cells (MDAMB-231). To evaluate the

antitumor effect, cell cytotoxicity assays were performed using the MTT method,

effect on apoptosis and cell cycle and evaluation of the proteins involved in the cell

cycle by Western Blot. Compound F1 showed the best cytotoxic activity, with a IC50

value of 5.11 µM at 72h of incubation. The other tests were performed only with

compound F1, as this was the most cytotoxic one. However, it did not present

apoptosis-related activity but delayed the G1/S and G2/M phases of the cell cycle.

For the gastroprotective activity, tests were performed using the ethanol-induced

ulcer model, quantification of mucus adhered to gastric mucosa, quantification of

GSH levels by biochemical assay, evaluation of H +, K + ATPase activity “in vitro”,

and evaluation of the participation of nitric oxide, non-protein sulfhydryl groups,

14

prostaglandins and PPARƴ receptors in the gastroprotective effect. The compounds

tested were A1, C1, D1 and F1, with A1 being the most active, presenting

gastroprotective activity at the dose of 3 mg/kg. In summary, compounds F1 and A1

presented the most promising results in relation to antitumor effect and gastro

protective activity. Further studies on these derivatives are needed, to obtain more

active new drugs with fewer side effects.

Keywords: thiazolidinedione. Gastroprotection. Câncer.

15

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Estrutura dos heterocíclos: (A) tiazolidina, (B)

tiazolidinona e (C) tiazolidinodiona.................................... 39

Figura 2- Diferentes mecanismos de aquecimento: convencional e

por micro-ondas…………………………………………... 42

Figura 3- Diferentes mecanismos de aquecimento: convencional e

por micro-ondas…………………………………………... 44

Figura 4- Comportamento das células cancerosas.............................. 45

Figura 5- Receptores que caracterizam as células de câncer de

mama. Receptores de estrogênio (A), receptores de

progesterona (B) e receptores HER2 (C)............................. 50

Figura 6- Quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer de

mama................................................................................... 52

Figura 7- Fases do ciclo celular........................................................... 54

Figura 8- Principais reguladores do ciclo celular................................ 55

Figura 9- Principais “Checkpoints” responsáveis pela regulação do

ciclo celular.......................................................................... 56

Figura 10- Controle da progressão do ciclo celular da fase G1 para a

fase S……………………………………………………… 57

Figura 11- Mecanismo de ação das TZDs............................................. 61

Figura 12- Esquema geral de reação de síntese dos derivados

tiazolidinodiônicos............................................................... 63

Figura 13- Esquema geral de reação de síntese dos derivados da série

F........................................................................................... 76

Figura 14- Estrutura geral dos compostos planejados como novos

protótipos de fármacos gastroprotetores e antitumorais...... 97

Figura 15- Mecanismo de condensação da tiazolidinodiona com

benzaldeído seguido de eliminação..................................... 99

Figura 16- Mecanismo de substituição eletrofílica aromática para a

formação do cloreto de 4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-

5-lideno)metil]benzenosulfo- nila (BTZDCl)..................... 100

Figura 17- Proposta de mecanismo de substituição nucleofílica

bimolecular para a formação dos derivados

tiazolidinodiônicos............................................................... 102

16

Figura 18- Espectro de IV do composto B7 (KBr, cm-1

)...................... 109

Figura 19- Espectro de RMN 1H do composto B7 (CDCl3/ 300

MHz).................................................................................... 110

Figura 20- Espectro de RMN 13

C do composto B7 (CDCl3/ 300

MHz).................................................................................... 111

Figura 21- Mecanismo de substituição nucleofílica bimolecular para

os derivados da série F......................................................... 136

Figura 22- Espectro de IV do composto F1 (KBr, cm-1

)....................... 138

Figura 23- Espectro de RMN 1H do composto F1 (CDCl3/ 300

MHz).................................................................................... 139

Figura 24- Espectro de RMN 13

C do composto F1 (CDCl3/ 300

MHz).................................................................................... 140

Figura 25- Estrutura química do composto 2-[4-[(2,4-dioxotiazolidin-

5-Ilideno)metil]fenoxi]-N-[3-(triflurometil)fenil]aceta-

mida..................................................................................... 167

Figura 26- Estruturas dos compostos: (A) 5-[2-cloro-3-(4-nitrofenil)-

2-propenilide- no]-2-(3-hidroxifenilamino)tiazol-4(5H)-

ona e (B) 5-(4-clorobenzilideno)-2-(4-hidroxifenilamino)-

tiazol-4- (5H)-ona................................................................ 167

Figura 27- Estrutura química da (Z)-5-(4-((E)-3-oxo-3-(tiofen-2-il)-

prop-1-enil)benzilideno)-1,3-tiazolidino-2,4-diona)........... 168

Figura 28- Estruturas dos compostos: (A) 2-(2,4-dioxo-tiazolidin-5-

il)-N-(4-sulfa-moil-fenil)-acetamida, (B) 2-[5-(4-dimetil-

amino-benzilideno)-2,4-dioxo-tiazolidin-3-il]-N-(2-triflu-

orometil-fenil)-acetamida e (C) 2-[5-(4-cloro-benzili-

deno)-2,4-dioxo-imidazolin-3-il]-N-(2-trifluoro-metil-

fenil)-acetamida................................................................... 169

Figura 29- Estrutura química do composto OSU-CG5......................... 170

Figura 30- Estruturas dos compostos: (A) 2-bromo-N-{3-[(Z)-{2,4-

dioxo-3-[4-(trifluorometil)benzil]-1,3-tiazolidino-5-

ilideno}metil]fenil}prop-2-enamida, (B) 2-bromo-N-(3-

{(Z)-[3-(4-clorobenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-

ilideno]-metil}fenil)prop-2-enamida e (C) 2-bromo-N-(3-

{(Z)-[3-(4-fluorobenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-

ilideno]metil}fenil)prop-2-enamida.................................... 170

Figura 31- Estruturas dos compostos: (5Z)-5-[(1-metil-1H-benzimi-

dazol-2-il)metilideno]-1,3-tiazolidino-2,4-diona-6,7- 171

17

dimetoxi-3,4-dihidroisoquinolona-2(1-H)-carbaldeído

(A), (5Z)-5-[(1-etil-1H-benzimidazol-2-il)metilideno]-1,3-

tiazolidino-2,4-diona-6,7-dimetoxi-3,4-dihidroiso-quino-

lona-2(1-H)-carbaldeído, (B) (5Z)-5-[(1-metil-1H-benzi-

midazol-2-il)metilideno]-1,3-tiazolidino-2,4-diona-N-[4-

(1,3-tiazolidino-4-il)fenil]formamida (C) e (5Z)-5-[(1-

metil-1H-benzimidazol-2-il)metilideno]-1,3-tiazolidino-

2,4-diona-N-(5-tert-butilfurano-2-il)formamida (D)...........

Figura 32- Efeito do composto F1 em apoptose na linhagem celular

MDAMB-231, na concentração de 10µM durante 24h

(A), 48h (B) e 72h (C), e posteriormente marcadas com

Anxina V-FITC e IP para sua analise mediante FACS....... 173

Figura 33- Efeito do composto F1 sobre o ciclo celular na linhagem

celular MDAMB-231, na concentração de 10µM durante

24h, 48h e 72h, e posteriormente marcadas com IP para

sua analise mediante FACS (A). Representação em

porcentagem das distintas fases do ciclo celular em

função do seu conteúdo de DNA após o tratamento com o

composto F1 a 10µM (B).................................................... 174

Figura 34- Princípio do método colorimétrico de BrdU....................... 175

Figura 35- Sincronização com nocodazol para analisar a transição da

fase G1/S.............................................................................. 178

Figura 36- Sincronização com timidina para analisar a transição da

fase G2/M............................................................................ 186

Figura 37- Estrutura química dos compostos A1, C1, D1 e F1………. 198

Figura 38- Espectros de RMN de 1H e

13C do composto A1………… 229

Figura 39- Espectro de Infravermelho do composto A1 (KBr, cm-1

)... 230




)... 232




)... 234




)... 236



18


)... 238


13C do composto B1…………. 239

Figura 49- Espectro de Infravermelho do composto B1 (KBr, cm-1

)... 240




)... 242




)... 244




)... 246




)... 248




)... 250




)... 252


13C do composto B9………… 253


)... 254


13C do composto B10………... 255

Figura 65- Espectro de Infravermelho do composto B10

(KBr, cm-1

).......................................................................... 256


13C do composto B12………. 257

Figura 67- Espectro de Infravermelho do composto B12

(KBr, cm-1

)……………………………………………….. 258


13C do composto C1…………. 259

Figura 69- Espectro de Infravermelho do composto C1 (KBr, cm-1

)... 260




)... 262




)... 264

19




)... 266




)... 268




)... 270


13C do composto D2………… 271

Figura 81- Espectro de Infravermelho do composto D2 (KBr, cm-1

)... 272


13C do composto D3………… 273


)... 274


13C do composto D4……….... 275


)... 276


13C do composto E1…………. 277

Figura 87- Espectro de Infravermelho do composto E1

(KBr, cm-1

)………………….............................................. 278




(KBr, cm-1

)……………………………………………….. 280



Figura 91- Espectro de Infravermelho do composto E3 (KBr, cm-1

)... 282




(KBr, cm-1

)…………………............................................... 284




(KBr, cm-1

)……………………………….………………. 286



Figura 97- Espectro de Infravermelho do composto E6 (KBr, cm-1

)... 288


13C do composto F1…………. 289

20

Figura 99- Espectro de Infravermelho do composto F1

(KBr, cm-1

)……………………………………………….. 290

Figura100- Espectros de RMN de 1H e


Figura101- Espectro de Infravermelho do composto F2 (KBr, cm-1

)… 292




)… 294




)… 296




)… 298

21

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Estimativas para o ano de 2016/2017 das taxas brutas de incidência por 100 mil

habitantes e de número de casos novos de

câncer, segundo sexo e localização

primária.......................................................

47

Tabela 2 - Ordem de potência para diversos parâmetros físico-químicos proposta por

Topliss......................................................... 79 Tabela 3 - Proposta de Topliss para a seleção de

novos substituintes em função dos

prováveis parâmetros mais ativos............... 80 Tabela 4 - Estrutura, tempo reacional, rendimento,

índice de refração e ponto de fusão das

substâncias BTZD, BTZDCl e da série A,

realizadas sob agitação a temperatura

ambiente...................................................... 104 Tabela 5 - Estrutura, tempo reacional, rendimento,

índice de refração e ponto de fusão da série

B contendo diferentes átomos ligados ao

anel aromático em diferentes posições,

realizado sob agitação a temperatura



C contendo diferentes heterocíclos,



fator de retenção e ponto de fusão da série

D contendo diferentes tamanhos de

espaçadores realizadas sob agitação a

temperatura ambiente.................................. 108

Tabela 8 - Estrutura, tempo reacional, rendimento, 109

22


E contendo diferentes fenilhidrazinas


ambiente......................................................

Tabela 9 - Estrutura, tempo reacional, rendimento,

índice de refração e ponto de fusão das

substâncias da série F, por irradiação em

micro-ondas................................................. 137

Tabela 10 - Parâmetros físico-químico dos derivados

da série A..................................................... 145


da série B..................................................... 146


da série C..................................................... 147


da série D..................................................... 148


da série E..................................................... 149


da série F..................................................... 150

Tabela 16- Triagem de viabilidade celular

determinada pelo método MTT após

incubação por 72 horas com os derivados

da serie A e o composto BTZDCl............... 158

Tabela 17 - Triagem de viabilidade celular



da serie B..................................................... 159




da serie C..................................................... 161




da serie D..................................................... 162

Tabela 20- Triagem de viabilidade celular 163

23



da serie E.....................................................


determinada pelo método de MTT após


da série F..................................................... 164

Tabela 22 - Viabilidade celular dos compostos F1 e F3

em diferentes linhagens celulares................ 165

24

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1- Proliferação celular na fase S por BrdU....................... 175

Gráfico 2- Análise de expressão e quantificação densidométrica

da proteína Fosfohistona-H3 implicada no

mecanismo de retardo da fase G1/S induzida pelo

composto F1 na concentração de 10 µM…………….. 179

Grafico 3- Análise de expressão e quantificação densidométrica

da Ciclina B (A) e CDK1 (B) implicadas no

mecanismo de retardo da fase G1/S induzida pelo

composto F1 na concentração de 10 µM…………….. 181


da proteína pRbSer780

implicada no mecanismo de

retardo da fase G1/S induzida pelo composto F1 na

concentração de 10 µM................................................ 182


da Ciclina E (A) e do pRbSer807/811

(B) implicados no

mecanismo de retardo da fase G1/S induzido pelo

composto F1 na concentração de 10 µM...................... 183


da Ciclina A implicada no mecanismo de retardo da

fase G1/S induzido pelo composto F1 na



das proteínas p27 (A) e p53 (B) implicadas no

mecanismo de retardo da fase G1/S induzido pelo

composto F1 na concentração de 10 µM...................... 185

Gráfico 8- Análise de expressão e quantificação da Ciclina E

implicada no mecanismo de retardo da fase G2/M

induzida pelo composto F1 na concentração de 10

µM................................................................................ 187

Gráfico 9- Análise de expressão e quantificação da Ciclina A

(A) e da CDK2 (B) implicadas no mecanismo de

retardo da fase G2/M induzida pelo composto F1 na


25

Gráfico 10- Análise de expressão e quantificação da Ciclina B

(A) e da CDK1 (B) implicadas no mecanismo de

retardo da fase G2/M induzida pelo composto F1 na


Gráfico 11- Análise de expressão e quantificação da proteína Wee

1 implicada no mecanismo de retardo da fase G2/M

induzida pelo composto F1 na concentração de 10

µM…………………………………………………… 190

Gráfico 12- Efeito do tratamento com os compostos A1, C1, D1 e

F1 sobres as lesões gástricas induzidas pelo etanol..... 193

Grafico 13- Avaliação do efeito do composto A1 em modelo de

úlcera induzida por etanol............................................ 194

Grafico 14- Avaliação do efeito do composto C1 em modelo de


Grafico 15- Avaliação do efeito do composto D1 em modelo de


Grafico 16- Avaliação do efeito do composto F1 em modelo de


Gráfico 17- Avaliação do efeito do composto A1 (3mg/Kg) nos

níveis de muco aderido a mucosa gástrica de animais

expostos ao etanol........................................................ 199

Gráfico 18- Avaliação do efeito do composto A1 nos níveis de

GSH após indução de úlcera aguda induzida por

etanol............................................................................ 200

Gráfico 19- Avaliação do efeito do composto A1 sobre a

atividade da enzima H+K

± ATPase............................... 201

Gráfico 20- Avaliação do efeito gastroprotetor do composto A1

em animais pré-tratados com Ioimbina (10 mg/Kg,

v.IP, painel A), GW9660 (10 mg/Kg, v.IP, painel

B), NEM (10 mg/Kg, v.IP, painel C) e L-NAME (70

mg/Kg, v.IP, painel D)................................................ 202

26

LISTA DE QUADROS

Quadro 1- Anticorpos primários utilizados............................................ 82

Quadro 2- Anticorpos secundários utilizados........................................ 82

Quadro 3- Avaliação da toxicidade da BTZDCl e dos derivados da

série A...................................................................................

152

Quadro 4- Avaliação da toxicidade dos derivados da série B................ 154

Quadro 5- Avaliação da toxicidade dos derivados da série C................ 155

Quadro 6- Avaliação da toxicidade dos derivados da série D............... 155

Quadro 7- Avaliação da toxicidade dos derivados da série E................ 156

Quadro 8- Avaliação da toxicidade dos derivados da série F................ 156

27

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ADMET: Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade

AMPK: Proteína quinase ativada por adenosina monofosfato

Ar: Aromático

ATC: Ácido tricloroacético

ATP: Trifosfato de adenosina

BrdU: 5-bromo-2-deoxiuridina

BT474: Linhagem celular de câncer de mama

BT549: Linhagem celular de câncer de mama

BTZD: ((5-Z)-5-benzilideno-1,3-tiazolidino-2,4-diona)

BTZDCl: Cloreto de 4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-

lideno)metil]benzenosul- fonila

CBX: Carbenoxolona

CCD: Cromatografia em Camada Delgada

CDKs: Quinases dependentes de ciclinas

CHK1: Quinase 1

CI50: Concentração inibitória de 50%

CMTN: Câncer de mama triplo negativo

CONCEA: Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal

d: Dupleto

dd: Duplo-dupleto

DNA: Ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid)

DTIC: Dacarbazina

DTNB: 5,5‟-ditiobis-2-ácido-nitrobenzóico

DL: Drug Likeness

DMEM: Meio de cultura Eagle modificado por Dulbecco

DMF: Dimetilformamida

DMSO: Dimetilsulfóxido

DS: Drug Score

EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético (ethylenediamine tetraacetic

acid)

EROS: Espécies reativas de oxigênio

Es: Parâmetro estéreo

Et: Etano

FACS: Separador celular ativado por fluorescência.

28

GHz: Gigahertz

GSH: Glutationa reduzida

GSSG: Glutationa na sua forma oxidada

GURAV: Linhagem celular de câncer na cavidade oral

HER2: Fator de crescimento epidérmico

HPV: Virus do papiloma humano (Human papilomavirus)

Hz: Hertz

INCA: Instituto Nacional do Câncer

IP: Via intraperitoneal

IV: Infra Vermelho

J: Constante de acoplamento

K562: Linhagem celular de células leucêmicas

KB: Linhagem celular de células nasofaríngeas

L-Name: NG-Nitro-L-argininametilesterhidroclorida

LogP: Logaritmo do coeficiente de partição

LogS: Logarítmo de solubilidade aquosa

m: Multipleto

MCF7: Linhagens celulares de câncer de mama

MDAMB-231: Linhagens celulares de câncer de mama triplo negativo

MHz: Megahertz

MM: Massa Molar

MTT: brometo de 3-[4,5-dimetiazol-2-il]2,5-difeniltetrazólio

nAT: Número de átomos

NEM: N-etillmaleimida

NHA: Número de aceptores de ligação hidrogênio

NHD: Número de doadores de ligação hidrogênio

nm: Nanometro

nR: Número de ligações rotacionais

OMS: Organização Mundial da Saúde

PBS: Tampão fosfato salino (phosphate buffered saline)

PC3: Linhagem celular de câncer de próstata

PF: Ponto de fusão

PF. R: Ponto de fusão do composto recristalizado

PI: Iodeto de propídio

Pi: Fósforo inorgânico

PPARs: Receptores ativados do peroxisomo proliferador (peroxisome

proliferator-activated receptors)

29

PS: Fosfatildiserina

QV: Química verde

Rb: Retinoblastoma

RE: Receptores hormonais de estrogênio

REND. R: Rendimento do composto recristalizado

Rf: Fator de retenção

RNA: Ácido ribonucleico (ribonucleic acid)

RNAm: Ácido ribonucleico mensageiro

RP: Receptores de progesterona

s: Simpleto

SFB: Soro fetal bovino

SKBr3: Linhagem celular de cancer de mama

t: Tripleto

TPSA: Área de superfície polar topográfica

TRH: Terapia de reposição hormonal

TZD: 2,4-Tiazolidinodiona

UV: Ultravioleta

VHB: Vírus da hepatite B

VIOL.: Violações

VOL: Volume

W: Watz

: Estiramento

σ: Constante sigma referente aos parâmetros eletrônicos

π: Constante pi referente aos parâmetros hidrofóbicos

α: Alfa

ƴ: Gama

Δ: Delta

30

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO……………………………………………………..... 33 2. OBJETIVOS………………………………………………………….. 36 2.1 Objetivo geral……………………………………………………....... 36 2.2 Objetivos específicos…………………………………………………....... 36 3. REVISÃO DA LITERATURA……………………………………… 38 3.1 QUÍMICA...................................................................................... ...... 38 3.1.1 QUÍMICA MEDICINAL.................................................................. 38 3.1.2 O USO DO MICRO-ONDAS NA QUÍMICA VERDE………….... 41

3.2 CÂNCER............................................................................................. 44

3.2.1 CÂNCER DE MAMA……………………………………………... 48

3.2.2 CICLO CELULAR………………………………………………… 52

3.3 ÚLCERA GÁSTRICA……………………………………………... 58

3.4 TIAZOLIDINODIONAS E SEU MECANISMO DE AÇAO……. 59

4 MATERIAL E MÉTODOS………………………………………...... 62

4.1 QUÍMICA............................................................................................ 62

4.1.1 Rota sintética dos derivados tiazolidinodiônicos……………........... 62

4.1.2 Susbtituição nucleofílica com aminas aromáticas contendo os

substituintes propostos por Topliss............................................................. 64

4.1.3 Susbtituição nucleofílica com diferentes aminas aromáticas…….... 66

4.1.4 Susbtituição nucleofílica com diferentes aminas contendo

heterocíclos…………………………….....................................................

70

4.1.5 Susbtituição nucleofílica com diferentes aminas alifáticas............... 72

4.1.6 Susbtituição nucleofílica com diferentes fenil hidrazinas................. 74

4.1.7 Substituição nucleofílica com cloreto de benzila sobre o núcleo

TZD............................................................................................................. 76

4.1.8 Purificação e caracterização estrutural…………………………….. 78

4.1.9 Análise “In silico”: Cálculos teóricos computacionais...................... 79

4.1.10 Relação Estrutura-Atividade - Método de Topliss……………...... 79

4.2 ATIVIDADE BIOLÓGICA“IN VITRO”......................................... 81

4.2.1 Reagentes e materiais………………………………………………. 81

4.2.2 Anticorpos………………………………………………………….. 81

4.2.3 Cultivo celular.................................................................................... 82

31

4.2.4 Preservação das linhagens celulares.................................................. 83

4.2.5 Amostras…………………………………………………………… 83

4.2.6 Ensaio da viabilidade celular………………………………………. 83

4.2.7 Análise da apoptose........................................................................... 84

4.2.8 Análise de proliferação de células através do método de BrdU........ 85

4.2.9 Análise do ciclo celular...................................................................... 86

4.2.10 Preparação de extratos celulares (extratos proteicos)…………….. 87

4.2.11 Eletroforese e Western Blot............................................................. 88

4.2.12 Sincronização com Nocodazol para a avaliação da fase G1/S....... 88

4.2.13 Sincronização com Timidina para a avaliação da fase G2/M.......... 90

4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA............ 90

4.3.1 Animais.............................................................................................. 91

4.3.2 Modelo de úlcera induzida por Etanol............................................... 91

4.3.3 Quantificação de muco aderido na mucosa gástrica.......................... 92

4.3.4 Preparação da fração subcelular gástrica........................................... 92

4.3.5 Quantificação dos níveis de glutationa reduzida (GSH).................... 93

4.3.6 Avaliação da atividadeda H+, K

+ ATPase in vitro............................. 93

4.3.7 Avaliação da participação do óxido nítrico, grupo sulfidrilicos não

proteicos, prostaglandinas e receptores PPAR-gamma no efeito

gastroprotetor.............................................................................................. 95

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA................................................................. 95

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................... 97

5.1 QUÍMICA............................................................................................ 97

5.1.1 Análise computacional……………………………………………... 145

5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL....................... 158

5.2.1 Avaliação da Viabilidade Celular – MTT…….................................. 158

5.2.2 Efeito na apoptose e no ciclo celular……………............................. 173

5.2.3 Avaliação da proliferação celular por pelo método de BrdU…….... 176

5.2.4 Sincronicação com nocodazol para avaliar o efeito do composto F1

na transição da fase G1/S……………………………………………….... 178

5.2.5 Sincronicação com timidina para avaliar o efeito do composto F1

na transição da fase G2/M……………………………………….............. 186

5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA............ 192

5.3.1 Efeito gastroprotetor dos compostos A1, C1, D1 e F1 em modelo

de úlcera induzida por etanol...................................................................... 192

6. CONCLUSÕES..................................................................................... 206

7. REFERÊNCIAS.................................................................................... 199

32

APÊNDICE I............................................................................................. 218

APÊNDICE II........................................................................................... 220

33

1 INTRODUÇÃO

Em vista da necessidade de novos medicamentos que sejam mais

ativos e com menos efeitos adversos para as diversas doenças, um dos

principais objetivos da química orgânica e medicinal é o desenvolvimento,

síntese e produção de moléculas com atividades terapêuticas, destacando-se

os heterocíclos tiazolidina, 4-tiazolidinona e a 2,4-tiazolidinodiona (TZD)

(MALIK; UPADHYAYA; MIGLANI, 2011). Quimicamente, o núcleo

TZD possui dois grupos carbonilas nas posições 2 e 4, além de um

nitrogênio, um enxofre e um grupo metileno, podendo ser estruturamente

modificado para o desenvolvimento de diversos análogos (CHADHA et al.,

2015).

Várias pesquisas revelam que a TZD é um importante sistema de

anel heterocíclico terapeuticamente utilizado como antidiabético,

antiinflamatório, antioxidante, antimicrobiano, anticonvulsivante,

antitumoral e gastroprotetor (ASATI; MAHAPATRA; BHARTI, 2014).

Além das TZDs, estruturas sulfonamídicas também têm demonstrado amplo

espectro de atividades biológicas, não estando somente relacionada a

atividade antimicrobiana, mas também como a atividade oncostática e

gastrica (MACHADO et al., 2011).

Câncer é o nome dado a um conjunto de doenças que têm em

comum o crescimento desordenado de células, que invadem tecidos e

órgãos (INCA, 2017), tornando-se um desafio neste presente cenário e

levando a morbidade e mortalidade em todo o mundo (POLKAM et al.,

2016), sendo o câncer de mama o mais frequente entre as mulheres

(ZHANG et al., 2016).

Ao longo dos últimos anos a taxa de sobrevivência do câncer de

mama em países desenvolvidos tem melhorado em pelo menos 30%, devido

à detecção precoce e melhores tratamentos (ZDENKOWSKI et al., 2016).

Já as úlceras gástricas constituem um dos principais transtornos

gástricos atraindo atenção global em cuidados de saúde. Cerca de 4 milhões

de pessoas são afetadas pela úlcera gástrica em todo o mundo. Além disso,

cerca de 10% a 20% desenvolvem complicações sérias devido a essa doença

(STEVEN et al., 2016).

34

Devido a isto, este trabalho propôs desenhar e sintetizar novas

moléculas a partir do núcleo TZD e da sulfonamida, unindo fragmentos

biologicamente ativos, na busca de substâncias com potencial atividade

gastroprotetora e antitumoral.

36

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Sintetizar derivados tiazolidinodiônicos e avaliar indícios de

relação estrutura-atividade e efeitos gastroprotetor e antitumoral no câncer

de mama triplo-negativo.

2.2 Objetivos Específicos:

Sintetizar diferentes séries de moléculas contendo o núcleo TZD;

Avaliar a biodisponibilidade por via oral e a permeabilidade dos

compostos sintetizados de acordo com os parâmetros estipulados na regra

dos 5 de Lipinski “in silico”;

Avaliar as possíveis características á fármacos e os efeitos de

toxicidade dos compostos “in silico”;

Avaliar a citotoxicidade dos compostos sintetizados em células de

câncer de mama triplo negativo (MDAMB-231).

Avaliar o efeito do composto mais ativo na apoptose e no ciclo

celular através de citometria de fluxo;

Avaliar a expressão de proteínas envolvidas nas fases do ciclo

celular; Avaliar o potencial gastroprotetor dos compostos no modelo de

úlcera induzida por etanol e quantificar os níveis de GSH e muco aderido à

mucosa gástrica;

Avaliar o efeito in vitro de alguns compostos sintetizados na

atividade da enzima H+, K

+- ATPase.

38

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 QUÍMICA

3.1.1 QUÍMICA MEDICINAL

A química medicinal engloba a invenção, descoberta,

planejamento, identificação e preparação de substâncias biologicamente

ativas (CAMPOS-BUZZI; CECHINEL-FILHO; CORRÊA, 2010),

centrando-se nas propriedades moleculares físico-químicas para o

desenvolvimento de fármacos com características mais favoráveis, como

por exemplo a área topológica superficial polar (TPSA), massa molécular e

LogP (MUNSON et al., 2015).

Neste contexto, os heterocíclos ocupam uma posição central na

química medicinal por estarem envolvidos no desenvolvimento de novas

moleculas farmacologicamente ativas para a indústria farmacêutica

(SHAMSUZZAMAN, 2015), através de modificações estruturais

(SHAIKH; HONG, 2016), principalmente os que contém átomos de

oxigênio e nitrogênio (DONGAMANTI et al., 2015).

Para a síntese de heterociclos as reações de Knoevenagel e de

Perkin são as mais conhecidas e utilizadas. A reação de Knoevenagel é uma

condensação, realizada através de ligações carbono-carbono, sendo muito

utilizada entre carbonilas, aldeídos, cetonas e compostos metileno ativo, na

presença de diferentes catalizadores como os ácidos de Lewis, tais como

piperidina (CASILDA et al., 2016). Já a reação de Perkin é uma

condensação catalisada por base de um aldeído aromático com um anidrido

de ácido carboxílico, formando um ácido carboxílico α,β- insaturado

(MAYO; PIKE; FORBES, 2010).

Segundo Shamsuzzaman (2015), os heterociclos estão prevalentes

em 60% dos principais fármacos de varejo, os quais apresentam pelo menos

um núcleo heterocíclico como parte da topografia global do composto.

Além disso, compostos que contém porções heterocíclicas frequentemente

39

apresentam melhor solubilidade e podem facilitar a produção na sua forma

de sal, propriedades conhecidas por serem importantes para a absorção oral

e biodisponibilidade (SHAMSUZZAMAN, 2015).

Entre estes heterocíclos incluem a tiazolidina (A), que apresenta

um anel de cinco membros, contendo dois heteroátomos, um átomo de

enxofre e um átomo de nitrogênio nas posições 1 e 3 do anel. Na presença

de uma carbonila na posição 4 do anel tem-se a 4-tiazolidinona (B) e na

presença de duas carbonilas na posição 2 e 4 a 2,4-tiazolidinodiona (TZD)

(C) (Figura 1) (MALIK; UPADHYAYA; MIGLANI, 2011).

Figura 1 - Estrutura dos heterocíclos: (A) tiazolidina, (B) tiazolidinona e (C)

tiazolidinodiona.

5

4

S1

NH3

2

5

4

S1

NH3

2

O

2

S1

NH35

4

O

O

(A) (B) (C)

A TZD é um fragmento muito importante devido a muitos

fármacos conterem na sua estrutura este núcleo, apresentando diversas

atividades farmacológicas tais como cardiotônica, anticonvulsivante,

neuroprotetora, gastroprotetora, antifúngica, anti-hipertensiva (SWATHI et

al., 2013), antiviral, antiproliferativa, antiinflamatória (SWATHI et al.,

2013; SHARMA et al., 2015), hipoglicêmica, antibacteriana, antiarrítmica e

antitumoral (CHADHA et al., 2015).

Para a síntese orgânica a TZD é considerada um bom substrato

para reações de Knoevenagel (SWATHI et al., 2013). Além disso, a

introdução de fragmentos biologicamente ativos neste núcleo, tal como as

sulfonamidas, que têm demonstrado além da atividade antibacteriana

também atividade antitumoral e gastroprotetora (LAL et al., 2013), torna de

grande interesse as sínteses de novas moléculas.

40

Como estratégia para o direcionamento da síntese de novas

moléculas utiliza-se o método manual de Topliss, o qual é fundamentado

para a obtenção de 5 derivados contendo os seguintes substituintes: H, 4-Cl,

3,4-Cl2, 4-CH3, 4-OCH3, escolhidos devido à acessível obtenção sintética e

utilizados como ponto de partida. Em seguida avalia-se a ordem de potência

destes substituintes em relação aos parâmetros π (hidrofóbicos), Es

(estéreos) e σ (eletrônicos) (CAMPOS-BUZZI; CECHINEL-FILHO;

CORRÊA, 2010). A partir da análise do comportamento destes compostos

pode-se propor novos substituintes a fim de otimizar a atividade biológica

dos compostos em estudo (YUNES et al., 2002).

No entanto, nem todos os compostos sintetizados apresentam

características a futuros fármacos. Devido a isto, estratégias de screening

pré-clínicos, como por exemplo, ADMET (absorção, distribuição,

metabolismo, excreção e toxicidade) são consideradas uma importante

ferramenta para a identificação precoce de moléculas candidatas a futuros

fármacos no processo de desenvolvimento de medicamentos (BASANT;

GUPTA; SINGH., 2016).

Uma das características físico-químicas mais importantes a serem

avaliadas no desenvolvimento de novos fármacos é a lipofilia, por que

permite prever a permeabilidade e biodisponibilidade do fármaco no meio

aquoso extracelular ou nos tecidos celulares (NOGUEIRA et al, 2008).

Neste contexto, a “regra dos 5” de Lipinski atua como um filtro,

pois é utilizada para avaliar as propriedades moleculares, a fim de obter

compostos que sejam potentes e ativos por via oral. Neste caso a Massa

Molecular (MM) (não deve exceder a 500 g/mol), LogP (valor limite é 5),

grupos doadores de hidrogênio (valor limite é 5) e grupos aceptores de

hidrogênio (valor limite é 10) (POLKAM et al., 2016).

Além da “regra dos 5” de Lipinski, calcula-se a porcentagem de

absorção das moléculas, sendo analisados também outros parâmetros

moleculares como a solubilidade, Drug likeness, Drug score e toxicidade

para avaliar a biodisponibilidade das moléculas candidatas a fármacos.

Estes parâmetros são calculados através de software específicos

(Molinspiration e OSIRIS) (HASSAN et al., 2015).

41

3.1.2 O USO DO MICRO-ONDAS NA QUÍMICA VERDE

A química tem uma grande participação em inúmeros produtos

fundamentais à humanidade. A sua presença pode ser destacada desde

diversos combustíveis aos mais complexos medicamentos. Porém, a

produção química também gera inúmeros inconvenientes, como a formação

de subprodutos tóxicos e a contaminação do ambiente e do próprio homem

exposto a estes xenobióticos (PRADO, 2003).

Com a crescente conscientização das questões ambientais a

necessidade de reduzir o uso de substâncias químicas nocivas aos produtos

químicos vem aumentando, considerando seus efeitos e consequentemente o

risco para a saúde humana. Devido a isto, nos últimos anos a química verde

(QV) têm sido uma fascinante área de pesquisa química (KHANDELWAL;

TAILOR; KUMAR, 2016).

A escolha de solventes, reagentes e catalisadores são necessários

para o âmbito econômico, para uma química mais verde e para um ambiente

sustentável, reduzindo os resíduos químicos nocivos á saúde humana e ao

meio ambiente (RATHI et al., 2015).

Segundo Khandelwal e colaboradores (2016), a QV tem como

objetivo conceber ambientalmente processos químicos benignos e

metodologias sintéticas visando à eliminação ou redução de produtos

químicos perigosos e tóxicos em qualquer fase da produção industrial ou

laboratorial.

Em 1998 foram formulados os 12 principios da QV, a fim de

atender as necessidades da química sintética sendo eles: prevenção,

economia de átomos, síntese de compostos de menor toxicidade,

desenvolvimento de compostos seguros, diminuição de solventes e

auxiliares, eficiência energética, uso de substâncias recicladas, redução de

derivativos, catálise, desenvolvimento de compostos para degradação,

análise em tempo real para a prevenção da poluição e química segura para a

prevenção de acidentes (GALUSZKA; MIGASZEWSKI; NAMIESNIK,

2013).

Segundo Silva e colaboradores (2005), uma área importante da QV

está na investigação do meio reacional. Um dos principais problemas da

indústria química está relacionado com a utilização de solventes orgânicos

42

(voláteis ou não) em seus processos, já que, dependendo do solvente

utilizado, sua manufatura, transporte, estoque, manuseio e descarte

representam aspectos que demandam cuidados e custos.

A química orgânica assistida por micro-ondas tem sido bem

reconhecida como uma das ferramentas mais eficazes e sustentáveis na

síntese de compostos químicos e tem atraído muita atenção devido as suas

características específicas, como regulação da temperatura, homogeneidade

da reação, e possível modificação de seus parâmetros como potência e

tempo (RATHI et al., 2015).

As micro-ondas são ondas eletromagnéticas não ionizantes, com

frequências que se encontram entre 300 MHz e 30 GHz, as quais

correspondem a comprimentos de onda de 1mm a 1m. A região de micro-

ondas situa-se entre a região de infra-vermelho (IV) e ondas de rádio no

espectro eletromagnético conforme ilustrado na Figura 2 (BRAGA;

SIMÕES; GAMA, 2012).

Figura 2 - Localização da região de micro-ondas no espectro eletromagnético.

Fonte: Eletromagnetismo. Disponível em: http://imanesmedea.weebly.com/a-

teoria.html

http://imanesmedea.weebly.com/a-teoria.htmlhttp://imanesmedea.weebly.com/a-teoria.html

43

A tecnologia de irradiação por micro-ondas começou a ser

desenvolvida na década de 40, possuindo um campo de aplicação bastante

restrito, sendo utilizada principalmente na indústria de alimentos e

polímeros. A sua utilização como ferramenta pelos químicos orgânicos só

aconteceu em meados da década de 80, sendo utilizado o micro-ondas

doméstico. Já no meio da década de 90, a entrada no mercado de aparelhos

de micro-ondas desenvolvidos especificamente para a síntese orgânica

permitiu ao químico orgânico sintético controle de todos os parâmetros

reacionais (temperatura, pressão, potência) e com isso, maior

reprodutibilidade e segurança nos experimentos realizados (SOUZA;

MIRANDA, 2011).

Entre uma variedade de abordagens, a utilização deste método tem

sido amplamente analisada ao longo de muitos anos, e agora está

posicionada como uma das mais poderosas ferramentas na área da síntese

orgânica. Na última década seu uso atraiu muita atenção devido ao baixo

custo e simplicidade de reação. Além disso, o rendimento dos compostos

produzidos é mais elevado, ao mesmo tempo o solvente utilizado

desempenha um papel importante na reação, podendo muitas vezes estar

ausente (VIJILA et al., 2016).

Segundo Rathi e colaboradores (2015), as sínteses por micro-ondas

não são somente aplicadas para a criação ou transformação de uma

molécula simples, mas também é relevante para o desenvolvimento de

moléculas bioativas desejadas e cada vez mais se torna uma ferramenta

fundamental de escolha para a otimização de passos chaves na síntese de

compostos para a descoberta de novos medicamentos.

As sínteses realizadas através de aquecimento por micro-ondas

apresentam maior vantagem devido as micro-ondas atuarem diretamente em

moléculas dipolos ou iônicas presentes na mistura reacional, ocorrendo

transferência de energia em menos de um nanosegundo (10-9

S), culminando

em rápida ascenção da temperatura. Em contraste, os reagentes utilizados

nas reações por aquecimento convencional são ativados lentamente por

condução, o que explica o método ser relativamente lento e ineficiente para

a transferência de energia para o sistema de reação (Figura 3). Além disso,

os tempos de reação através de aquecimento por micro-ondas são mais

curtos, os produtos formados são mais puros e apresentam maiores

rendimentos (RATHI et al., 2015).

44

Figura 3 - Diferentes mecanismos de aquecimento: convencional e por micro-

ondas.

Fonte: RATHI et al., 2015.

Devido os heterocíclos possuírem grande destaque na área de

química medicinal, o conhecimento de metodologias de síntese para a

obtenção destes compostos é de grande interesse e a irradiação por micro-

ondas é uma ferramenta que tem crescente destaque neste campo

(DUARTE; SANGI; CORRÊA, 2010). Além disso, o uso da irradiação por

micro-ondas permite sínteses mais rápidas e eficientes de compostos

heterocíclos. Nesse contexto, várias abordagens sintéticas já conhecidas

para heterocíclos contendo enxofre, oxigênio e nitrogênio vêm sendo

desenvolvidas (RATHI et al., 2015).

3.2 CÂNCER

A palavra câncer é de origem latina, significando “caranguejo”,

empregada em analogia ao modo de crescimento infiltrante comparado as

pernas do crustáceo, que as introduz na areia ou lama para fixar e dificultar

sua remoção. Infelizmente, espera-se que para as próximas duas décadas

mais de 8 milhões de casos de câncer sejam diagnosticados (OATLEY;

FRY; MULLEN, 2016).

45

Os tumores são diferenciados em sólidos e não sólidos. As células

neoplásicas sólidas multiplicam-se de maneira descontrolada, possuem a

capacidade de formar novos vasos sanguíneos que as nutrirão e são

geralmente menos especializadas, fazendo com que os órgãos invadidos por

elas percam suas funções. Porém, nem todos os tumores geram metástase,

sendo os metastáticos originados por células tumorais que invadem tecidos

vizinhos, podendo chegar ao interior de um vaso sanguíneo ou linfático e

através desses disseminarem-se, chegando a órgãos distantes do local onde

o tumor iniciou. Já as células neoplásicas não sólidas dão origem aos

cânceres de sangue, também conhecidos como hematopoiéticos, ou

chamados de leucemia (Figura 4) (INCA, 2017).

A leucemia se caracteriza pela produção anormal dos leucócitos

que ocorre na medula óssea, representando um grupo heterogêneo de

células malignas, sendo classificadas em mielóide ou linfóide, dependendo

de quais leucócitos foram afetados (RABATI et al., 2017).

Figura 4: Comportamento das células cancerosas.

Fonte: INCA. Como se comportam as células cancerosas. Disponível em:

http://www1.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=318

http://www1.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=318

46

A metástase é vista como uma cascata sequencial de eventos,

partindo de um tumor primário e levando a formação de novos tumores em

locais distintos. (BOUYSSOU et al., 2014). Para que ocorra metástase e

invasão as células tumorais requerem alteração da sua capacidade de adesão

para aderirem às células vizinhas e a matriz extracelular (LUO, GUAN,

2010).

Geralmente, considera-se que a disseminação metastática ocorra

tardiamente durante a progressão do tumor, no momento em que o tumor

primário já se encontra em um tamanho considerável, de fato, para a

maioria dos tipos de câncer o volume do tumor primário representa um fator

de risco para a progressão de uma metástase: quanto maior for o volume,

maior é o risco (LORUSSO; RUEGG, 2012). Segundo Steichen e

colaboradores (2012), durante as fases iniciais do crescimento do tumor as

células dependem unicamente da difusão para obter nutrientes, limitando

seu tamanho em aproximadamente 2 mm3.

No Brasil, as estimativas para o ano de 2016/2017 apontam para a

ocorrência de aproximadamente 596.070 casos novos de câncer, incluindo

os casos de pele não melanoma, reforçando a magnitude do problema do

câncer no país (Tabela 1). É esperado um total de 295.200 casos novos para

o sexo masculino e 300.870 para o sexo feminino (INCA, 2017).

47

Tabela 1 - Estimativas para o ano de 2016/2017 das taxas brutas de incidência por

100 mil habitantes e de número de casos novos de câncer, segundo sexo e

localização primária.

Homens Mulheres

Localização Primária Casos

novos

Localização Primária Casos

novos

Próstata 61.200 Mama feminina 7.960

Traqueia,pulmão,brônquio

Cólon e Reto

Estômago

17.330

16.660

12.920

Cólon e Reto

Colo de Útero

Traqueia,pulmão,brônquio

17.620

16.340

10.890

Cavidade oral

Esôfago

Bexiga

Laringe

11.140

7.950

7.200

6.360

Estômago

Corpo do útero

Ovário

Glândula Tireoide

7.600

6.950

6.150

5.870

Leucemias

SNC

Linfoma não Hodgkin

Pele melanoma

Linfoma de Hodgkin

Glândula Tireoide

Neoplasias sem pele

Todas as neoplasias

5.540

5.440

5.210

3.000

1.460

1.90

214.350

295.200

Linfoma não Hodgkin

SNC

Leucemias

Cavidade oral

Esôfago

Pele melanoma

Bexiga

Linfoma de Hodgkin

Laringe

Neoplasias sem pele

Todas as neoplasia

5.030

4.830

4.530

4.350

2.860

2.670

2.470

1.010

990

205.960

300.870

Fonte: INCA. 27 de Novembro – Dia Nacional do Combate ao Câncer. Estimativas

2016/2017. Disponível em: http://www.inca.gov.br/wcm/dncc/2015/por-sexo.asp

De acordo com estimativas da Organização Mundial da Saúde

(OMS), 8,2 milhões de mortes por câncer foram registradas em 2012 e esse

número deverá aumentar para 13,1 milhões até 2030 (POLKAM et al.,

2016).

O desenvolvimento do câncer está relacionado a causas externas

e/ou internas ao organismo, estando ambas inter-relacionadas. As causas

internas são, na maioria das vezes, geneticamente pré-determinadas, estão

ligadas à capacidade do organismo se defender das agressões externas. As

http://www.inca.gov.br/wcm/dncc/2015/por-sexo.asp

48

causas externas referem-se ao meio ambiente e aos hábitos ou costumes

próprios de um ambiente social e cultural. Estes fatores causais podem

interagir de várias formas, aumentando a probabilidade de transformações

malignas nas células normais. De todos os casos, 80% a 90% dos cânceres

estão associados a fatores ambientais, que são tabagismo, hábitos

alimentares, alcoolismo, hábitos sexuais (HPV), medicamentos, fatores

ocupacionais e radiação solar (INCA, 2017).

Cerca de 1/3 das mortes por câncer são devido aos cinco principais

riscos comportamentais e alimentares, que são: índice de massa corporal

elevado; baixo consumo de frutas, legumes e verduras; falta de atividade

física; tabagismo e uso de álcool, sendo que o tabagismo é o fator de risco

mais importante, causando 20% das mortes por câncer e 70% das mortes

por câncer de pulmão no mundo. Além disso, em muitos países de baixa

renda, até 20% das mortes por câncer são devido á infecção pelo vírus da

hepatite B (VHB) e HPV (WHO, 2017).

Para a prevenção do câncer deve-se evitar contato com os fatores

de riscos, vacinar-se contra o HPV e VHB, controlar os riscos ocupacionais,

reduzir a exposição à luz solar e reduzir a exposição á radiação ionizante

(WHO, 2017).

As principais formas de tratamento do câncer são cirurgia,

radioterapia, quimioterapia ou transplante de medula óssea. Em muitos

casos é necessário combinar mais do que uma terapêutica (INCA, 2017).

Segundo Polkam e colaboradores (2016), existem quimioterápicos

que não são eficazes contra o câncer devido à resistência desenvolvida para

eles, existindo a necessidade de identificação e geração de novos agentes

para vencer os obstáculos no seu tratamento.

3.2.1 CÂNCER DE MAMA

O câncer de mama é o diagnóstico mais comum entre os tipos de

câncer na mulher e a principal causa de morte por câncer em mulheres em

todo o mundo (FABRY, LOMBAERT, LISON, 2016). Antes dos 35 anos é

49

considerado relativamente raro, porém acima desta idade sua incidência

cresce progressivamente, especialmente após os 50 anos (INCA, 2017).

Segundo Puglisi e colaboradores (2015), a OMS revelou que mais

de 508 mil mulheres morreram de câncer de mama no ano de 2011. Cerca

de 5% - 10% apresentam câncer de mama metastático (CMM) no momento

do diagnóstico, enquanto que 20% – 40% com câncer de mama vão

desenvolver CMM, sendo este uma doença incurável com uma sobrevida

média de 2 a 3 anos.

Os fatores de risco para a doença são exposição a estrogênio, idade

precoce para inicio do ciclo menstrual, idade tardia na primeira gravidez,

curto período de amamentação, menopausa tardia, uso de terapia de

reposição hormonal, IMC (Indice de massa corporal) elevado, baixa

atividade física e histórico familiar de câncer de mama. O consumo de

álcool e exposição á radiação estão também entre os fatores relatados

(FABRY, LOMBAERT, LISON, 2016).

Segundo o Instituto Nacional do Câncer (2017), a prevenção do

câncer de mama não é totalmente possível em função da multiplicidade de

fatores relacionados ao surgimento da doença e ao fato de vários deles não

serem modificáveis. Estima-se que por meio da alimentação, nutrição e

atividade física é possível reduzir em até 28% o risco de a mulher

desenvolver câncer de mama. Controlar o peso corporal e evitar a

obesidade, por meio da alimentação saudável e da prática regular de

exercícios físicos, e evitar o consumo de bebidas alcoólicas são

recomendações básicas para prevenir o câncer de mama. A amamentação

também é considerada um fator protetor. Além disso, a terapia de reposição

hormonal (TRH), quando estritamente indicada, deve ser feita sob rigoroso

controle médico e pelo mínimo de tempo necessário.

O câncer de mama é classificado de acordo com sua expressão de

receptores de estrogênio, progesterona e fator de crescimento epidérmico

(HER2) (Figura 5) (ZORDOKY et al., 2014), sendo que os agentes

quimioterápicos utilizados vem sendo desenvolvidos com base nas

características moleculares do tumor (PARK et al., 2016).

50

Figura 5: Receptores que caracterizam as células de câncer de mama. Receptores de

estrogênio (A), receptores de progesterona (B) e receptores HER2 (C).

Fonte: Para as figuras 5A e 5B adaptado em:

http://portaldocorticoide.blogspot.com.br/2010 /12/estrogenios.html. Para a figura

5C adaptado de LEITÃO, 2012.

Os receptores hormonais de estrogênio (RE) estão presentes em

aproximadamente 75% dos cânceres de mama. A presença destes receptores

torna-se um fator muito importante para o prognóstico (FRASOR et al.,

2015). Tumores RE-positivo tendem a ter melhor prognóstico (CHEN et al.,

2015), além disso, são dependentes de hormônio e propensos a responder a

terapias hormonais com inibidores da aromatase e tamoxifeno (FRASOR et

al., 2015), reduzindo a taxa de mortalidade em pacientes com RE-positivo

em mais de 30% (HAN, 2014).

A expressão de receptores de progesterona (RP) esta associada

com a expressão de RE, estando presentes em mais da metade dos tumores

RE-positivos. Tumores que apresentam RE e RP possuem parâmetros

patológico, prognóstico e resposta aos tratamentos hormonais mais

favoráveis. Além disso, pacientes com RE-positivo que possuem alto nível

de RP e que são tratados com tamoxifeno tendem a ter um resultado melhor

que os pacientes que possuem baixa expressão de RP. No entanto, pacientes

RE-positivo com RP-negativo ou com baixa expessão de RP estão mais

propensos a tumores agressivos e com taxas de proliferação mais altas,

resultando em pior prognóstico. O prognóstico de câncer de mama que

apresenta apenas RP não é bem claro (HAN, 2014).

O HER2 é um receptor de tirosina kinase transmembrana e um

alvo terapêutico bem estabelecido no câncer de mama (PARK et al., 2016).

Está envolvido em muitos efeitos oncogênicos como aumento da

http://portaldocorticoide.blogspot.com.br/2010%20/12/estrogenios.html

51

proliferação celular, redução da apoptose, aumento da motilidade da célula

tumoral e propensão para a disseminação metastática (ZARDAVAS,

FOUAD, PICCART., 2015). É sobre expresso em aproximadamente 20% a

25% dos tumores de câncer de mama, estando relacionado com o aumento

da agressividade do tumor e menor sobrevida dos pacientes em relação aos

pacientes com HER2 negativo (WAN et al., 2015).

Já o câncer de mama triplo negativo (CMTN) é definido como um

nível imunohistoquímico por não apresentar receptores hormonais (RE e

RP) e fator de crescimento epidérmico (HER2), e representa 15% dos casos

de câncer de mama (MONTERO et al., 2014).

Histologicamente, mais de 70% dos tumores triplonegativos

apresentam-se com grau elevado na sua fase inicial, não podendo ser

tratados com terapias anti-HER2 ou hormonais. Por conta do mau

prognóstico e falta de opções no tratamento o CMTN apresenta alta taxa de

mortalidade (CHANG et al., 2016). Além disso, é mais susseptivel a

metástase, o que torna seu prognóstico pior (ZORDOKY et al., 2014),

sendo que menos de 30% dos pacientes com metástase sobrevivem até 5

anos (CHANG et al., 2016).

As terapias utilizadas são baseadas em quimioterápicos como as

classes dos taxanos, vinerolbina e platina, eficazes neste tipo de tumor

devido a sua taxa de proliferação rápida e distúrbios frequentes no

mecanismo de reparação do DNA (Figura 6). Infelizmente, na fase inicial

do tratamento as resistências aos quimioterápicos são frequentes, sendo

estas, vistas no contexto metastático (MONTERO et al., 2014).

52

Figura 6 - Quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer de mama.

Apesar dos avanços globais nas áreas da biologia e oncologia, o

tratamento do CMTN tem permanecido um desafio, e o prognóstico para

pacientes com metástase é ruim, o que justifica as pesquisas com

substâncias farmacologicamente ativas (CHANG et al., 2016), tais como os

derivados tiazolidinodiônicos, com potencial atividade antitumoral.

3.2.2 CICLO CELULAR

O clico celular é dividido em duas fases distintas, chamadas de

intérfase e mitose (fase M). A intérfase combina a fase inicial de

crescimento (G1), síntese de DNA (fase S) e uma segunda fase de

crescimento (G2) que serve para expandir o volume da célula e assegurar

uma quantidade suficiente de organelas para serem partilhadas entre as

células filhas durante a divisão celular. Já as células que não se dividem

53

estão em uma fase de repouso pós-mitótico chamada de G0 (Figura 7)

(JONGSMA; BERLIN; NEEFJES, 2015).

A fase G1, também chamada de fase de crescimento, inicia-se logo

após o processo mitótico, a qual é caracterizada pela síntese de proteínas e

RNAm, levando a um aumento do citoplasma e consequentemente um

aumento do tamanho celular. Além disso pode ser dividida em G1-precoce e

G1-tardia, sendo que as células que estão na fase G1-tardia possuem maior

quantidade de RNA e proteínas quando comparadas a fase G1-precoce pós

mitóticas, podendo diretamente passar para a fase S, enquanto que as

células presentes na fase G1-precoce necessitam aumentar sua quantidade

de RNA para serem capazes de iniciar a replicação de DNA (BEDOLLA et

al, 2014).

Na seguinte fase, chamada de S, a célula é responsável pela

replicação do DNA, assim, ao término desta fase o dobro de DNA e de

cromossomos é produzido (BEDOLLA et al, 2014).

A fase G2 é a segunda fase de crescimento do ciclo celular,

estando situada entre o final da síntese de DNA e início da fase M

(ZHANG; CHENG; LIEW., 2014). Ela dura até que a célula entra em

mitose e é caracterizada por um conteúdo de DNA não afetado e por uma

intensa atividade biosintética (BEDOLLA et al, 2014). Essa transição da

fase G2 para a fase M é muito importante na regulação da divisão celular,

pois se ocorre algum dano ao DNA a progressão celular é interrompida para

que este seja reparado antes de ser transmitido a outras células (ZHANG;

CHENG; LIEW., 2014).

Por fim, a mitose é um processo de divisão celular (LIU et al,

2014), possuindo quatro fases consecutivas (prófase, metafase, anáfase e

telofase) onde a membrana nuclear se desintegra, o DNA condensa e os

cromossomos são divididos em duas porções iguais (BEDOLLA et al,

2014), formando dois núcleos, os quais se separam resultando na produção

de duas células filhas, sendo estas idênticas a célula de origem (LIU et al,

2014).

54

Figura 7– Fases do ciclo celular.

Fonte: O controle do ciclo celular e a origem do câncer. Disponível em:

http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Citologia2/nucleo11.php

A progressão do ciclo celular é mediada por ciclinas e por cinases

dependentes de ciclinas (CDKs) que atuam em conjunto para induzir a

transição da fase G1 para a fase S e da fase G2 para a mitose (LIU et al.,

2015). Diferentes complexos ciclina-CDK fosforilam varios substratos,

como por exemplo a proteína retinoblastoma (Rb), desencadeando varios

eventos (RENZO et al., 2016). No entanto, este complexo ciclina-CDK é

negativamente regulado por inibidores do ciclo celular, tais como as

proteínas p21, p27 e p57 (LIU et al., 2015).

Existem 21 genes que codificam as CDKs e 29 que codificam as

ciclinas no genoma humano, sendo que as CDKs 1, 2, 4 e 6 e as ciclinas A,

B, D, e E são identificadas como as maiores reguladores do ciclo celular

(BRETONES et al, 2015) e as CDKs 7 e 9 são responsáveis pela regulação

da transcrição de genes (SCHMITZ; KRACHT, 2015).

Dois aspectos cruciais que estão envolvidos na regulação do ciclo

celular é a existência de pontos de verificação e de restrição (BERTOLI;

SKOTHEIM; BRUIN, 2013). Os pontos de verificação funcionam como um

http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Citologia2/nucleo11.php

55

bloqueio quando há um processamento anormal da replicação do DNA, a

fim de reparar este dano. Caso os danos ao DNA sejam reparados o ciclo

celular será reiniciado, caso contrário a célula entrará em apoptose (WANG

et al, 2015). Já o ponto de restrição está presente no final da fase G1, para

garantir que o DNA esteja intacto e que a célula esteja funcionando

normalmente e possa progredir para a fase S (figura 8) (BERTOLI;

SKOTHEIM; BRUIN, 2013).

Figura 8 – Principais reguladores do ciclo celular.

Fonte: Principais reguladores do ciclo celular. Disponível em:

https://www.studyblue.com/notes/note/n/neoplasia-vii-cancer-critical-genes-and-

familial-cancer-syndromes/deck/12635734

Os dois “checkpoints” mais estudados que inibem o ciclo celular

são a quinase 1 (CHK1) e a quinase Wee-1. Tanto a CHK1 quanto a Wee-1

medeiam a entrada do ciclo nas fases S e G2. A CHK1 fosforila e inibe a

CDC25, a qual inibe as CDK1/2, causando parada no ciclo celular,

https://www.studyblue.com/notes/note/n/neoplasia-vii-cancer-critical-genes-and-familial-cancer-syndromes/deck/12635734https://www.studyblue.com/notes/note/n/neoplasia-vii-cancer-critical-genes-and-familial-cancer-syndromes/deck/12635734

56

enquanto que a Wee-1 quando ativada fosforila e inibe diretamente as

CDK1 e CDK2 (WAHL; LAWRENCE., 2015).

Outra maneira de regular a progressão do ciclo celular se dá

através do gene p53, o qual atua como um protetor do DNA e também como

um indutor de apoptose. Ele bloqueia o ciclo celular na fase G1, através da

ativação do gene p21 o qual inibe os complexos ciclina D - CDK4/6 e

ciclina E – CDK2, quando iniciado um proceso de reparação ao DNA,

determinando assim o destino da célula (Figura 9) (ALAIZARI et al., 2015).

Figura 9 – Principais “Checkpoints” responsáveis pela regulação do ciclo celular.

Fonte: WAHL; LAWRENCE, 2015.

Na fase G1-precoce sinais mitogênicos são detectados primeiro e

integrados pela expressão das ciclinas D que se ligam preferencialmente as

CDK4 e CDK6 ativando-as e fosforilando a proteína retinoblastoma (Rb)

57

permitindo a acumulação do fator de transcrição E2F. Já na fase G1-tardia a

CDK2 é ativada pela ciclina E, formando outro complexo muito importante,

o qual hiperfosforila o Rb, permitindo que as células passem pelo ponto de

restrição liberando por completo o fator E2F, o qual codifica proteínas

necessárias para a progressão da fase G1 para a fase S. (Figura 10)

(BRETONES; DELGADO; LEÒN, 2015).

Figura 10 - Controle da progressão do ciclo celular da fase G1 para a fase S.

Fonte: WEINBERG, 2014.

Na fase S, existe um complexo entre a CDK2 e a ciclina A, que

permite que a célula progrida para a fase G2. Além disso a ciclina A é

importante na fase S por ser necessária para a replicação do DNA, sendo

expressa também na fase G2 (BRETONES; DELGADO; LEÒN, 2015).

Durante a fase G2, antes de entrar em mitose, a CDK1 fosforila

centenas de substratos que juntos dirigem-se para entrar na fase M, que é

uma fase condicionada pela ativação do compelxo entre a ciclina B e a

CDK1 (TAVERNIER; LABBÉ; PINTARD, 2015).

Segundo Tavernier e colaboradores (2015), antes de iniciar a fase

M a CDK1 é mantida inativada pela quinase Wee-1, porém quando a Cdc25

é desfosforilada esta ativa a CDK1 e inibe a quinase Wee-1, dando inicício

58

a mitose. Outra proteína específica no final da fase G2 e início da fase M é a

fosfohistona-H3, a qual está associada com a condensação da cromatina

(GINTER et al., 2016).

3.3 ÚLCERA GÁSTRICA

A mucosa gástrica é exposta continuamente á múltiplos fatores e

substâncias nocivas que podem vir dos alimentos, ou ainda da presença de

ácido gástrico, ácidos biliares, pepsina, produtos bacterianos e

medicamentos, podendo desencadear o aparecimento de úlceras gástricas

(STEVEN et al., 2016)

A úlcera gástrica constitui uma importante classe de desordens

gástricas, atraindo atenção global em cuidados á saúde (STEVEN et al.,

2016). São erosões que geralmente iniciam no revestimento da mucosa do

estômago, podendo penetrar nas camadas mais profundas do tecido de

revestimento do epitélio gástrico. Este processo ocorre quando a barreira da

mucosa gástrica é rompida, fazendo com que a pepsina e o HCl atuem no

epitélio gástrico (MARIANO, 2016).

Por muitas décadas foi identificada como uma lesão da parede da

mucosa gástrica, sendo a causa mais frequente de cirurgia, com alta taxa de

morbidade e mortalidade (BARKA et al., 2017). Cerca de 4 milhões de

pessoas são afetadas por esta doença em todo o mundo, sendo que destas,

aproximadamente 10% a 20% desenvolvem complicações (STEVEN et al.,

2016). Os sinais e sintomas podem apresentar um ou mais dos seguintes

itens: dor abdominal, inchaço, perda de apetite, perda de peso, náuseas ou

vômitos (LI et al., 2016).

Os principais fatores predisponentes incluem stress, infecção por

Helicobacter pylori, consumo de álcool, anti-inflamatórios não esteroidais

(BARKA et al., 2017) e tabagismo (LI et al., 2016), sendo identificados

como fatores importantes para o seu desenvolvimento, pois aumentam a

quantidade de pepsina e a secreção do ácido gástrico, suprimem a produção

das prostaglandinas, inibem a proliferação e crescimento das células da

mucosa e alteram a mobilidade gástrica. Estudos também sugerem que a

59

formação de espécies reativas de oxigênio (EROS), redução do fluxo

sanguíneo, infiltração de neutrófilos, secreção de citocinas pró-inflamatórias

desempenham papel significativo para a formação da ulcera gástrica (HUI;

FANGYU, 2017).

A fisiopatologia da úcera gástrica não é totalmente elucidada,

porém acredita-se que se deve ao desequilibrio de agentes agressivos (ácido

clorídrico (HCl), pepsina e estress oxidativo) e defensivos (secreção de

muco e bicarbonato, renovação celular, fluxo sanguíneo e antioxidantes)

resultando em lesões ulcerativas (ASHMAWY et al., 2016; BARKA et al.,

2017).

As principais estratégias terapêuticas propostas para a prevenção e

tratamento da doença é a redução da produção de ácido gástrico

(CHOUDHARY et al., 2016). Antagonistas dos receptores histaminérgicos

do tipo 2 e inibidores da bomba de prótons são habitualmente utilizados

como tratamento antiúlcera. No entanto, apesar da eficácia das terapias

atuais, alguns pacientes sofrem de recorrência da úlcera e/ou efeitos

adversos (RIBEIRO et al., 2016).

3.4 TIAZOLIDINODIONAS E SEU MECANISMO DE AÇÃO

As TZDs tornaram-se uma importante classe de compostos

heterocíclicos com atividade biológica desde a sua introdução na forma de

glitazonas (KUMAR et al, 2011), sendo conhecidas comercialmente como

Rosiglitazona (Avandia®), Pioglitazona (Actos®), Muraglitazona

(Pargluva®) (que não chegou a ser comer

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