28/09/2017Nathalie Cellancella@usp.br

Sinalização no desenvolvimento

de membros

O que são genes

HOX/Homeobox/Homeóticos?

Propriedades das Proteínas Homeóticas

1. São fatores de

transcrição com um

domínio ligante a

DNA (domínio

homeobox ou

homeótico)

2. O domínio

homeobox tem cerca

de 60 aminoácidos

3. A ordem dos genes homeóticos no cromossomo

corresponde à ordem temporal e espacial em que

são expressos -> colinearidade

Hox existe em mamíferos e suas propriedades e importância

no desenvolvimento são conservadas

HIPÓTESE: Os genes homeobox/homeóticos definem os

segmentos corporais

UbxNormal

Deleção

para Ubx

Ubx Ubx Ubx

Anterior Posterior

RESULTADO:

A mutação/ inativação de Ultrabithorax (ubx) extende o

limite posterior do segmento torácico, OU

regride o limite anterior do segmento abdominal

O LIMITE ANTERIOR DO

DOMÍNIO DE EXPRESSÃO DO

Ultrabithorax DETERMINA O FIM

DOS SEGMENTOS ANTERIORES

HIPÓTESE: Os genes homeobox/homeóticos definem os

segmentos corporais

Mini-revisãode anatomia

braçocoxa

antebraçocanela

mãopé

Hox especifica o mesênquima que se tornaráestilopódio, zeugopódio e autopódio

Hox 9 e 10especificamestilopódio

Hox 11especificazeugopódio

Hox 12 e 13especificamautopódio (Hox 12 especifica o punho)

Hox 10especificaestilopódio

Hox 11especificazeugopódio

Hox 12 e 13especificamautopódio

camundongo knockout do Hox11 não desenvolve zeugopódio (ulna e rádio)

Mutação em Hox 13

O que determina onde obroto do membro se formará?

Genes Hox determinamo eixo antero-posterior,a segmentação do corpoe a região onde os apêndices(por exemplo, membros)se formarão

extremamente conservados

Eixo dos membros

O membro se desenvolve a partir do mesoderma.

Como sabemos disso?

• Remoção de grupo de células

• Transplante

• Marcação de células com corantes ou isótopos radioativos

Campo do membro

Qualquer pedaço do campo do membro pode dar origem a um membro completo

Placa lateral → esqueletosomitos → músculo

Os brotos do membro surgem devido a proliferação do mesoderma subjacente:

Formação do broto do membro(limb bud)

O que determina onde o

broto do membro se

formará?

Indução do broto do membro

FGF10

Células expressando FGF10 foram transplantadasno flanco de um embrião de galinha

membro ectópico

COMO a expressão de FGF10É restrita à essa região?

O que determina que um par de membros seja

Superior/Anterior?

Inferior/Posterior?

Tbx5

Tbx4

Em camundongos a especificação dos membros anteriores e posteriores não é dada por Tbx4 e Tbx5. Pitx1 especifica membro posterior

O que determina o padrão de expressão de Tbx5 e Tbx4?

Hoxd9

Hoxd9+

Hoxc9+

Hoxb9

= Tbx4

= Tbx5

Resumindo..

Padronização A-P

(Wnt, BMP, Ac. Retinoico etc)

?

FGF10 no

mesoderma

FGF8 no

ectoderma

?

Hox

Crescimento

?

Tbx5/4

Definição do membro

sup e inf

PORQUÊ AS COBRAS NÃO TÊM PERNAS?

Hoxc6

Hoxc8

AER de embrião de galinha

Indução da crista ectodérmica apical (AER)

Apical ectodermal ridge

• Mantém o mesênquima subjacente proliferando

• Expressa fatores que especificam o eixo antero-posterior

Centros sinalizadores do broto do membro

apical ectodermal ridge = crista ectodérmica apical

PZ = progress zone = zona de progresso

ZPA = zone of polarizing activity =zona de polarização

AER

PZ

FGF10 é responsável pela indução da crista ectodérmica apical

FGF10→Wnt3a →FGF8

Célula da placa lateral

Célula da crista ectodérmica apical

FGF10 Expressãode FGF8

secreçãode FGF8

Expressão de FGF8 na AER

O FGF8 secretado pela AER mantém o mesênquima abaixo dele em um estado indiferenciado e proliferativo

zona de progressão (PZ)

Interação recíproca entre a cristal ectodérmica apical e o mesênquimasubjacente

Em resumo..

• O mesênquima induz e sustenta a formação do AER (através de FGF10)

• O mesênquima determina que tipo de membro se formará (anterior ou posterior)

• AER (através de FGF8) mantém o mesênquima da zona de progressão proliferando, promovendo o crescimento do membro no eixo proximal-distal

Determinação dos eixos

O mesênquima especifica o eixo proximal-distal

PZ+AER de embrião mais velhotransplantado emembrião mais jovem

Mecanismo ainda MUITO discutido

Há 3 modelos – tempo, espaço e periodicidade parecem controlar esse processo

PZ+ AER jovem sobre um broto de membro em desenvolvimento

Duplicação das estruturas do membro

Determinação dos eixos

Antes do broto ser reconhecível na superfície do embrião, o mesênquima já está especificado. Se esse mesênquima for transplantado no flanco de um animal, um membro se formará com o eixo-antero-posterior do animal doador

ZPA – zona de polarização

ZPA = zone of polarizing activity =zona de polarização

Região da mesoderme na face posterior

ZPA é responsável pela polaridade do eixo antero-posterior

zona de progressão

dígitos duplicados como um espelho dos dígitos normais

Sonic hedgehog (Shh) é o responsável pelaespecificação doeixo antero-posterior

substituição de 1 base no enhancer de shh

Mutação semelhante causa polidactilia em humanos

Quem é responsável pela expressão de Shh na ZPA?

HOX

dHand knockoutnão desenvolvemembros

dHand knockoutnão expressa Shh na ZPA

Charité et al, Development 2000

dHand → ShhELCR = early limb control region

Feedback positivo entre a crista ectodérmicaapical e a zona de polarização:

Célula progenitor do dígito 4

Célula progenitora do dígito 5

Especificando a identidade dos dígitos – shhnovamente

shh knockout têm dígitos todos iguais

dedinho

dedão

A membrana interdigital especifica a identidade do dígito anterior a ela

Quando a membrana entre o digito 2 e 3 foi retirada, o digito 2 se transformou em 1. O mesmo ocorreu qdo foi retirado a membrana entre o 3 e 4.

Bead contendo noggin, inibidor de BMP

BMP expresso nas membranas interdigitaisespecifica os dígitos

Deleção de shh e Gli3 gera membro com vários dígitos sem especificação

Determinação dos eixos

Expressão de wnt7a na ectodermeespecifica o eixo dorso-ventral

normal

Wnt7a-deficient

vp = ventral padsvt = ventral tendons

vp = ventral padsvt = ventral tendonsdp = dorsal paddt = dorsal tendons

FGF8

FGF10 AER

Gremlin

BMP

ZPA

FGF8

FGF10AER

Gremlin

BMP

ZPA

FGF8

FGF10

AER

↓FGF8 = colapso do AER

SEM AER = colapso do ZPA

TÉRMINO DA EXTENSÃO DO MEMBRO

O eixo dorso-ventral também participa, pois animais deficientes para Wnt7a não desenvolvem dígitos posteriores, indicandoque Wnt7a também é importante na determinação do eixo antero-posterior

Coordenação dos 3 eixos

• Início: FGF10

• Depois: Shh ativa Gremlin, que inibe BMP

• Com o crescimento do membro, gremlin não alcança mais o ectoderma; consequentemente, BMP passa a inibir a expressão de FGF8 no ectoderma

• Sem FGF8, a AER colapsa (apoptose)

• Sem a retroalimentação do AER, a ZPA não se sustenta (apoptose)

FGF8

Esculpindo o autopódio

Fator responsável pela morte celularNas membranas interdigitais?

BMPs

Exercícios

Depois de se formar em Biologia, você é contratado por uma empresa de biotecnologia que acha que existe um mercado para frangos de 3 pares de membros. Qual das moléculas você manipularia para os seguintes “produtos”?

Como você induziria 1 par de membros a mais?

Existe uma possibilidade de que a Sadia compre mais destes frangos se os membros adicionais fossem coxas. Que molécula você manipularia para que os membros extras fossem inferiores?

Exercícios

Depois de se formar em Biologia, você é contratado por uma empresa de biotecnologia que acha que existe um mercado para frangos de 3 pares de membros. Qual das moléculas você manipularia para os seguintes “produtos”?

Como você induziria 1 par de membros a mais? FGF10

Existe uma possibilidade de que a Sadia compre mais destes frangos se os membros adicionais fossem coxas. Que molécula você manipularia para que os membros extras fossem inferiores? Tbx4

Cheryl Tickle e colaboradores realizaram transplantes exógenos de ZPA em posições variadas ao longo do eixo antero-posterior do broto de membro (Nature, v.254, 199-202, 1975). Estas posições foram marcadas de acordo com a altura do somito (somite number). Números menores correspondem a posições mais anteriores. Cada coluna na tabela corresponde a um embrião. Os números correspondem aos dígitos formados (2= mais anterior; 4= mais posterior). A letra Z em maiúsculo é a posição do ZPA exógeno e o z em minúsculo é a posição do ZPA endógeno. O que pode ser concluído sobre os resultados? Como estes resultados podem ser explicados?