Universidade Federal de Mato Grosso

Disciplina: Taxonomia de Fungos Filamentosos, com ênfase em Endofíticos

Docente: Profº Dr. Marcos Antônio Soares

Discentes: Mestrando: Adnaldo Brilhante (Pós Graduação em Química).Doutoranda: Ivani Souza Mello (Pós Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade - Rede Pró-Centroeste).

Cuiabá/ MT2015

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SEQUENCIAMENTO E MÉTODOS EM METABOLÔMICA DE PROTEÍNA

- COM APLICAÇÕES

Ciências ÔmicasPlataformas tecnológicas que visam isolar e

caracterizar biomoléculas.

As mais comuns são a genômica, a trancriptômica a

proteômica e a metabolômica.

A origem etimológica desse termo deriva da

genômica:

3

GENE + CROMOSSOMA = GENOMA GENÔMICA

ESQUEMA DA CIÊNCIAS ÔMICAS4

pt.slideshare.net

5

ESQUEMA DAS CIÊNCIAS ÔMICAS

Villas-Bôas & Gombert (2006).

MetabolômicaVisa as pequenas moléculas que compõem o metabolismo celular – isto é, os metabólitos – tanto para caracterização, quanto buscando uma melhor compreensão dos processos biológicos que estão ocorrendo em seus objetos de estudo.

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Metabólitos

Rotas principais

Primários Secundários

Funções específicas

Gautam et al., (2007).

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METABOLÔMICA

Villas-Bôas & Gombert, 2006

Conceitos ImportantesCaracterização metabólica:

Isolamento de moléculas alvo e a caracterização de sua via de síntese.

Metabolômica:Isolamento de todos os metabólitos de uma amostra

biológica em condições normais e sob algum tipo de estresse.

Engenharia de metabolismo:Identificação de genes e rotas metabólicas de

determinado composto, visando aumentar, reduzir ou eliminar sua produção.

8

Villas-Bôas & Gombert, 2006

Etapas da Metabolômica9

Gautam et al., (2007).

Técnicas experimentaisEletroforese 2D

Método para separação e visualização de proteínas;

Separação por carga e massa.

Espectrometria de Massa Análise de alta confiabilidade e

identificação de proteínas; Fragmentação de proteínas; Análise de peptídeos.

10

http://www.neobio.com.br/

www.alunonaweb.com.br

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A primeira dimensão

(separação por ponto isoelétrico)Gel com um gradiente de pH imobilizado;Corrente elétrica leva proteínas carregadas a se mover até alcançar o ponto isoelétrico.

2D-SDS PAGE gel

Gautam et al., (2007).

Ponto Isoelétrico (PI)Separação por carga:

12

4

5

6

78

9

10

Gradiente de pH estável

Alto pH:

Proteína carregada

-

Baixo pH:ProteínaCarregada

+No ponto isoelétrico, a proteína não tem carga e portanto não migra mais no campo elétrico.

Gautam et al., (2007).

13

A segunda Dimensão (separação por massa)pH gel strip e colocado em um gel SDS;SDS desnatura a proteína (movimento somente devido a massa) e elimina carga.

2D-SDS PAGE gel

A primeira Dimensão (separação por ponto isoelétrico)Gel com um gradiente de pH imobilizado;Corrente elétrica leva a proteínas carregadas a mover até alcançar o ponto isoelétrico.

Gautam et al., (2007).

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2D-SDS PAGE gel

Gautam et al., (2007).

Exemplo de técnica de 2D-gel15

Gautam et al., (2007).

VantagensBoa resolução para proteínas;

Detecção de modificações pós-transcricionais.

16

Não funciona bem para proteínas altamente hidrofóbicas

Limitado pelo alcance de pH Difícil detecção de proteínas

pouco abundantes Análise e quantificação são

difíceis

Desvantagens

franquiastop.com.br

Exemplo de experimento 2-D gel17

Gautam et al., (2007).

Análise de dados do experimento 2-D gel18

Gautam et al., (2007).

Exemplo de experimento 2-D gel19

Protein identification via 2DE and MALDI-TOF PMF

Kim et al., (2007)

Exemplo de experimento 2-D gel20

Kim et al., (2007)

O que é Espectrometria de massa?

Ferramenta analítica para determinar a composição

molecular de uma amostra ou os pesos moleculares;

Somente picomolares de concentrações são requeridas;

Acurácia de 0.01%, com somente 5 ppm de pequenas

moléculas orgânicas;

Para 40 kDa, erro de 4 Da;

Pode-se identificar substituições de aminoácidos ou

modificações pós-traducionais.

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Villas-Bôas & Gambert (2006), Wang et al., (2003).

Que tipo de informação é gerada?

Informação estrutural;

Tandem de espectrometria de massa – particularmente, uma sequencia definida;

Fragmentação de amostra – análise de produtos;

Sequenciamento de peptídeos;

Identificação de compostos individuais em misturas complexas;

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Wang et al., (2003); Jewett et al., (2006); Espindola et al., (2010).

Como funciona um espectrômetro?

3 partes fundamentais: fonte de ionização, o analisador e o detector

Amostras fáceis de manipular se ionizadas

Separação no analisador de acordo com a razão massa-carga (m/z)

Detecção de íons em separado e abundância relativa

Sinais enviados ao sistema de dados e apresentados em um espectro m/z

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Esquematização de um espectrômetro

O analisador, o detector e o ionizador estão em vácuo, para evitar movimento indesejado de íons;

A operação está sob completo controle de sistema.

24

Moraes & Lago (2003).

25

mcponline.org

Esquema típico de um TOF-MS26

http://www.abrf.org/abrfnews/1997/june1997/jun97lennon.html

Introdução da amostra e IonizaçãoIonização direta ou via cromatografia para separação de componentes (HPLC, GC, eletroforese capilar);

Ionização pode resultar em íons positivamente carregados (proteínas) ou negativamente carregados (sacarídeos e oligonucleotídeos).

27

http://uab.ifsul.edu.br/tsiad/conteudo/modulo1/fis/fis_ua/at1/img/pag03-img03.gif

Metodologias de IonizaçãoPressão atmosférica Ionização Química (APCI);Ionização Química (CI);Impacto de Elétron (EI);Ionização por Eletro spray (ESI);Bombardeamento Atómico Rápido (FAB);Dessorção de Campo / campo de ionização (FD/FI);Matriz Laser Assistida por Dessorção de Ionização (MALDI);

Ionização por Termo spray.

28

Detecção dos ÍonsO detector monitora o íon, amplifica seu sinal e o transmite

para o sistema

Detectores comuns: fotomultiplicador, eléctron multiplicador chapa de micro canal

29

altered-states.net prezi.com

Espectrometria de massas é uma metodologia poderosa para analisar a estrutura de compostos orgânicos, mas tem algumas limitações:

Nada pode ser caracterizado se não estiver em uma solução DEVIDAMENTE LIMPA;

A técnica não tem habilidade de apresentar uma análise seletiva de uma mistura complexa;

Para moléculas grandes, resultados são difíceis de interpretar.

30

Tandem MS ou MS/MS tem 2 espectro de massa em série:

O primeiro (MS1) é usado para selecionar, de uma fonte primária de íons, aqueles que possuem um m/z particular, o qual passa para a região de fragmentação, onde ocorrerá a dissociação. No segundo (MS2), haverá a análise dos íons gerados. Na verdade, MS1 é uma fonte de íons para MS2.

MS2MS1

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Sequenciamento de peptídeos

Peptídeos de 2.5 kDa ou menos dão melhores resultados.

Proteínas retiradas de géis 2-D e digeridas;

Peptídeos fragmentados nas ligações peptídicas na Tandem da espectrometria de massa;

Alguns peptídeos geram informações para uma sequência completa, enquanto a maioria gera sequencias parciais de 4-5 aa;

Geralmente essas “tag” de sequencias são suficientes para identificação por database.

32

33

Identificação de proteínas por MS

Espectro

artificial

Tripsinizado

artificialmente

Database desequências(ex. SwissProt)

Spot removido do gel

Fragmentação

com tripsina

Espectro dos

Fragmentos

MATCH

Libr

ary

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Como funciona o sequenciamento de proteínasTandem MS: dois analisadores de

massa em série com uma célula de colisão no meio;

Célula de colisão: um local aonde os íons colidem com um gás (He, Ne, Ar) resultando em fragmentação do íon;

A fragmentação dos petídeos na células de colisão ocorre de maneira previsível, principalmente nas ligações peptídicas;

Os íons resultantes tem massas que são consistentes com uma database de pesos moleculares de dipeptídeos, tripeptídeos, tetrapeptídeos.

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Ser-Glu-Leu-Ile-Arg-Trp

Célula de colisão

Ser-Glu-Leu-Ile-Arg

Ser-Glu-Leu

Ser-Glu-Leu-Ile

Etc…

Bioinformática e Integração de técnicas e conhecimentos

36

Espindola et al., 2010

Exemplo de Experimento com MS37

http://iitb.vlab.co.in/userfiles/Slide2%289%29.jpg

38

Exemplo de Experimento com MS

Gautam et al, 2007

VantagensDeterminação de peso molecular e sequencia de aa;

Detecção de modificações pós-transcricionais;

Alta confiabilidade.

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Alto custo Requer sequencia de

peptídeos em database.

Desvantagens

franquiastop.com.br

Etapas da MetabolômicaFatores que influenciam as análises metabolômicas durante a seleção do organismo a ser analisado:

Tratamento;

Idade;

Tamanho.

40

www.bagozzi.edu.br novosinsolitos.blogspot.com

Etapas da Metabolômica

Fatores que influenciam as análises metabolômicas

durante o preparo da amostra:Quantidade de amostra;Maceração;Horário de coleta.

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Villas-Bôas & Gombert (2006).

Etapas da Metabolômica Fatores que influenciam as análises metabolômicas durante o pré fracionamento:

Escolha do solvente mais adequado;

Evitar interferência nos equipamentos;

Evitar reações indesejadas entre o solvente e a amostra.

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Etapas da MetabolômicaTécnicas comumente utilizadas no fracionamento:

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RMN e EMFT-ICR-MS

Etapas da MetabolômicaRequisitos básicos para realizar análises metabolômicas:

Grande capital para investimento;

Espaço físico adequado;

Profissionais capacitados.

44

http://aston.chem.purdue.edu/research/metabolomics

Etapas da Metabolômica

Fator que influencia as análises metabolômicas durante a conversão de valores:

Colocar os resultados obtidos por diferentes

técnicas de fracionamento em uma linguagem

comum.

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www.nextidea.com.brMorgenthal (2005); Espindola et al., (2010)

Etapas da Metabolômica

Principal metodologia de análise estatística:Análise de Componente Principal (ACP):

Identificação de componentes mais abundantes;Organização hierárquica dos componentes identificados.

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Morgental (2005)

Aplicabilidade da MetabolômicaAplicações em diversas áreas:

Farmacologia;

Nutrição;

Ecologia;

Evolução;

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Villas-Bôas & Gombert (2006); Weckwerth & Fiehn, 2002..

Metabolômica na farmacologia48

Seleção Síntese Industrialização

Ensaios de toxicidade in vitro e in vivo

Busca de marcadores de

toxicidade

Mecanismos de toxicidade

Villas-Bôas & Gombert (2006); Weckwerth & Fiehn, 2002..

Metabolômica na nutriçãoConhecer as modificações causadas pela alimentação no metaboloma do indivíduo:

49

Villas-Bôas & Gombert (2006); Weckwerth & Fiehn ( 2002).

www.scielo.br

Alimento

Nutrientes Não-nutrientes

FitoquímicosInsumos agrícolas

Micro-nutrientes

Macro-nutrientes

Contaminantes Defensivos

Metabolômica na nutrição50

Metabolômica na ecologiaObservar diferenças imprevistas entre cultivares selvagens e modificadas geneticamente:

Glutamato desidrogenase em Nicotiana tabacum (Mungur et al.,

2005):

+ de 350 compostos alterados;

9 compostos carcinogênicos;

14 fármacos em potencial.

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Metabolômica na ecologiaIdentificar metabólitos comuns e diferenciais entre plantas resistentes e susceptíveis a uma determinada praga:

Já realizado pela transcriptômica e

pela proteômica;

Poucos trabalhos utilizando a

metabolômica (Forst, 2006).

52

br.freepik.com

Metabolômica na ecologia Diferenciação de populações a partir de RMN de biofluidos:

Haliotis rufescens (mariscos) – (Viant et al., 2003);

Organização evolutiva a partir da presença de determinados metabólitos: Streptomyces – (Challis & Hopwood, 2003);

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Perspectivas para a MetabolômicaDeterminação de um protocolo padrão;

Desenvolvimento de ferramentas para um melhor aproveitamento dos dados gerados;

Integração das ômicas (Biologia de Sistemas).

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Considerações finais

Ômica mais nova e bastante promissora;

Grupo de moléculas muito diverso;

Necessita de padronização e melhoramento das técnicas.

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