seminario 05: avaliação de eficácia
TRANSCRIPT
Estrutura, fisiologia e bioquímica da pele aplicadas à ciência cosmética.
Alexandre Ferreira
Avaliação de eficácia
Desafios
• Necessidade de novos Apelos
• Busca por novos ativos
– Cosméticos x “Cosmecêuticos”
• Necessidade de pesquisa & desenvolvimento
• Estudos de EFICÁCIA & SEGURANÇA
• Investimento $$$$$
Considerações GeraisDiretriz Estratégica
(Marketing) OBJETIVO Mercado
Cliente Regulamentação
Benefício(valor)
Evidência(Comprovação)
Apelo
• Hidrata
• Reduz Ruga• Energiza• Despigmenta• etc...
Resposta
Biológica
Produto MENSURAR
SIM
NÃO
OBJETIVO
O QUE ESTÁ POR TRÁS DA MENSURAÇÃO!?!?!?!?
Senso Crítico
CONHECIMENTO
Método Sistemático
Impessoal
Apenas Operacional
Como é CRIADO o
conhecimento no Mundo
Moderno????
Melhoria de
Processos
Permeia as
Organizações
Não está restrito à
Pesquisa Básica
Princípio de operação
da Ciência Básica
MÉTODO CIENTÍFICO
Resposta:
Ler MUITO!!!
Método CientíficoObservação
Sistemática
Fenômeno Hipótese
Coerência
Testável
Bibliografia
Teoria
CientíficaPrevisões
Experimentação Resultados
SIM
NÃO
Nova
Hipótese
Validam
Hipótese?
CONHECIMENTOLaboratórios
Aplicação em Processos
Planejar PD(S/C)A
Fazer
Estudar
Agir
• Experimentação
• Teste de novos processos
Oportunidade
• Definição de Hipóteses
• Desenho experimental
• Analise dos Resultados
• Validação da Hipótese
CheckStudy
Implementação de melhorias
SIMNÃO
Nova
Hipótese
Construção do Conhecimento
Conhecimento
Conhecimento
Por Trás do Sim/Não
MENSURAR
SIM NÃO
Falso Negativo
ERROS ACONTECEM!!!!!
Falso Positivo
Impacto na
OrganizaçãoImpacto no Cliente
Não Deixe de
Acreditar
Seja
Desconfiado
A INCERTEZA É INERENTE
DA EXPERIMENTAÇÃO
Prejuízo
SENSO CRÍTICO NA
INTERPRETAÇÃO DO
RESULTADO
Experimentação
• Por natureza é uma atividade artesanal
• Objetivo:
– Mensurar uma resposta e gerar evidências para testar uma hipótese
• Muito dependente do pessoal (equipe)
• Mais diversas fontes de variação
• Como detectar falhas em uma única experimentação??
Não é
possível!!!
Desenvolvimento
mais suscetível
O QUE ESTÁ POR
TRÁS DA
MENSURAÇÃO?
Por trás da Mensuração
MENSURAÇÃO
DESENHO
EXPERIMENTAL
SIGNIFICADO
BIOLÓGICO DO
TESTE E
RESULTADOS METODOLOGIA
ANÁLISE
ESTATISTICA
INCERTEZA
FORMA DE
EXECUÇÃO
ASPECTOS
ÉTICOS
O QUE FOI
MEDIDO?
Escolhendo o Apelo
Mercado
APELODiretriz
Estratégica
FÁCIL
“Reduz Ruga”
“Induz Colágeno”
“Hidrata a pele”
“Revitaliza a pele”
“Induz a regeneração celular”
“Energiza a pele”
DIFÍCIL
Mecanismo
de Ação
Produto
É RELEVANTE???
Mecanismo
biológico
É COMPATÍVEL??
Base Científica
FENÔMENO
BIOLÓGICO
J KE
GI L
M
G
HN
A
B
C
D
E
F
PROCESSO FISIOLÓGICOMECANISMO DE AÇÃO
RESPOSTA
DESEJADA
O que será mensurado?
J KE
GI L
M
GH N
A
B
C
D
E
F PRODUTO
J KE
GI L
M
GH N
A
B
C
D
E
F
APELO
Resposta
Biológica
Medição direta
Redução de Rugas
↑ Colágeno Tipo I
↑ RNA Colágeno Tipo 1
↑ Glicosaminoglicanas
↓ ROS
Medição Indireta Suporta o Apelo???
Método
RE
SP
OS
TA
MÉ
TO
DO
Pessoal Procedimentos
Equipamentos Estrutura física
Pessoal
• Qualificação
• Treinamento
– Validação do treinamento
• Costuma ser uma das maiores fontes de variação dentro de um método
Equipamentos
• $$$$$$$
• Precisão
• Grau de automação
• Qualidade da capacidade de mensuração
• Passível de calibração
• Disponibilidade manutenção
• GRANDE GARGALO PARA MUITOS LABORATÓRIOS
Estrutura Física
• Fluxo de circulação
• Facilidade de limpeza
• Qualidade da rede elétrica
• Qualidade da fonte de água
• Prática de segurança
Procedimento
• Origem
– Normas / Guias
– Artigos científicos
– Desenvolvimento interno
• Aceitação
– Aprovado pela comunidade científica
– De acordo com as teorias vingentes
– Regulamentado
Procedimento
MENSURAÇÃO
MODELO
INDUÇÃOUSO DOS
EQUIPAMENTOS
DOCUMENTAÇÃO
PREPARAÇÃO
DOS REAGENTES
DESENHO
EXPERIMENTAL
ANÁLISE DOS
RESULTADOS
RESULTADO
CONCLUSÃO
ou
????????
Modelo
Animal
In Vitro Humano
Pré-Clínicos Clínicos
Obtenção das Culturas
• Obtenção do explante
• Separação do tecido
• Digestão enzimática
• Cultura em meio seletivo
• Tripsinização diferencial
• Obtenção de culturas puras
Tipos de culturas
Queratinócitos FibroblastosMelanócitos
ATERAÇÃO FISIOLÓGICA
MORTE
MODELO
MULTIPLICAÇÃO
SECREÇÃO
ADIÇÃO DE
AGENTE
INDUTORPRODUTO
Indução & Resposta
RE
SP
OS
TA
Mensuração
J KE
GI L
M
G
HN
A
B
C
D
E
F
PROCESSO FISIOLÓGICO
RESPOSTA
DESEJADA
MENSURAR
SUBJETIVA
OBJETIVA
FORMA
NÃO
PARAMÉTRICA
PARAMÉTRICA
A, B, C, D, E
ESCALA
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
INFLUENCIA FORTEMENTE
O DESEMPENHO DO
MÉTODO
A escolha do Método
Qual método escolher????
RE
SP
OS
TA
MÉTODO a
PERGUNTA
HIPÓTESE
MÉTODO b
MÉTODO c
MÉTODO d
etc...
Relevância
Preço
Desempenho
Parâmetros de desemenho do Método
MÉTODORepetibilidade
Reprodutibilidade
VARIAÇÃO
Exatidão
Seletividade
Robustez
DESEMPENHO
Linearidade
Sensibilidade
Limite de Detecção
Limite de Quantificação
Faixa de Trabalho
CORRELAÇÃO
INCERTEZAPRECISÃO
Parâmetros
Parâmetros Interligados
Repetibilidade
Exatidão
Reprodutibilidade
Seletividade
Linearidade
Sensibilidade
Limite de Detecção
Limite de Quantificação
Faixa de Trabalho
Robustez
PERFORMANCE
Exatidão e PrecisãoExatidão
Precisão
EXATIDÃO:
• Capacidade de entregar o valor verdadeiro
• Desvios do método
• Fácil correção
PRECISÃO:
• Capacidade de repetir o resultado
• Inerente do método
• Difícil correção
Precisão
REPETITIVIDADE
Reprodução do resultado após repetitivos experimentos
REPRODUTIBILIDADE
Reprodução do resultado em laboratórios Distintos
Precisão Intermediária
Reprodução dos resultados dentro de diferentes variáveis
•Técnicos•Equipamentos
•Dias
Estudo de Proficiência
Provedores de ensaios de proficiência
Laboratório 1
Laboratório 2
Laboratório 3
Laboratório n
Validação Treinamento
Validação Equipamento • Coordena atividades
• Oferece amostras de referência• Analisa os dados
ExatidãoFre
quência
Resposta
Resposta Real
X R Y
A incerteza
Método 1 Método 2
Resposta obtida em 1 experimento
Universo de respostas possíveis
Fre
quência
Resposta
Fre
quência
Resposta
Respostas unidimensionais
Linearidade
CorrelaçãoResposta
Estímulo
Sensibilidade
LQ inf.
LD
LQ sup.
Faixa de Trabalho
Seletividade
• Capacidade de discriminar a resposta verdadeira de respostas falsas
• Suscetibilidade a interferentes
• Falso positivo
Método Pouco Seletivo
Método Muito Seletivo
Robustez
• Capacidade de tolerar variações em parâmetros aos quais o método é sujeito
Umidade
Lote Reagentes
pHReagentes
Temperatura
Parâmetros comuns
Alterações na
Rede elétrica
Desenho Experimental
• Garantir obtenção da resposta real
– Definição dos controles
– Necessidade de brancos / Placebo
• Garantir que resultado represente o que seria obtido em uma população
– Número de réplicas
– Aleatorização
• Evitar tendencia
– Estudo mono ou duplo cego
Análise de Resultados
CONCLUSÃO
RESULTADO
NÃO
SIM
TALVEZ
ANÁLISE CRÍTICAGESTÃO
DE RISCOS
Tipos de Distribuição de Dados
Fre
quência
Resposta Resposta
Fre
quência
Normal Não Normal
• Resultados paramétricos
• Médias
• Métodos analíticos
• Resultados não
paramétricos
• Análises sensoriais
Distribuição NormalFre
quência
Resposta
População de nrespostas obtidas
Resposta média
99% 0,5%0,5% 0,01
95% 2,5%2,5% 0,05
p-valor
Intervalo de Confiança
A VariaçãoFre
quência
Resposta
Método 1
Método 2
Resposta Esperada
X R Y
Comparando Dois Resultados
Fre
quência
Resposta
Dado 1Análise Estatística
X R
X = R ou X ≠ R
Teste T de Student
X < R
X > R
Bilateral
Unilateral
X
Dado 2
Dado 2
R2
Analisando Vários Resultados
Fre
quência
Resposta
Dado 1 ANOVA(Análise de Variância)
R1
Dado 2
R2
Apresentação dos resultados
*
Resultado = X ± Y
Valo
r
Resposta
Grupo 1
Grupo 2
Valo
r
Resposta
Amostra 1
Grupo 2
Grupo 3
a
a,b
b
Amostra Resultado
1 5 ± 1 a,b
2 8 ± 2 c
3 6 ± 1 c
4 4 ± 2 a,c
Nível de Significância:5; 1; 0,1%
Melhor se Incerteza
Conclusões
• Não terceirize a responsabilidade
• ANALISE OS RESULTADOS CRITICAMENTE
• Exija apresentação clara dos resultados através de relatório detalhado (caso se trate de uma pesquisa)
• Ensaios – sempre que disponível apenas acreditados
• Fundamental uma análise estatística
Classes de Experimentação
Ensaio Pesquisa
• Controle de qualidade • Desenvolvimento
• POPs • Protocolo + POPs
• Experimentação Única • Múltiplos experimentos
• Sujeito a validação • Não validável
• Rigidez • Flexibilidade
• Sem margem a interpretação
• Com margem a interpretação
• Pessoal treinado na execução
• Pessoal com conhecimento no tema
Garantia da qualidade
Controle de
Qualidade
Pesquisa
Inovadoras
NÃO
Estudo com
Animais
Estudo in vitro
Estudo Clínico
Boas Práticas
Laboratoriais
(BPL)
(Guia)
Boas Práticas
Clínicas
(BPC)
(Guia)
Certificação
Pesq
uis
as
En
saio
s
Acreditação
ISO 17.025SIM
(Norma)
Características Gerais
• Foco na operação (laboratório)
• Estratégia (comercial / Administrativa) não é abordada
– Exceto o que impacta no laboratório
• Estrutura da documentação
• Organização da Equipe
• Fluxo geral de trabalho
• Adequação de parte física laboratorial
ISO 17.025
Laboratório
Equipe
Coordenador
Técnicos
Boas Práticas Laboratoriais
Laboratório Patrocinador
Equipe
Pesquisador Principal
Demais Membros
Boas Práticas Clinicas
Laboratório
CEP
Patrocinador
Sujeito de Pesquisa
Equipe
Pesquisador Principal
Demais Membros
Responsabilidade
Laboratório
Agência Reguladora
Fabricante
ExigênciasDocumentação
Necessidades
Resultados
Órgão de Acreditação
Consumidor
Conflito de Interesse
Laboratório
Fabricante
OBJETIVO Cliente
OBJETIVO Cliente
Pressão
Escolha de um laboratório
• Visite o laboratório
• Quando disponível preferência para contratar laboratórios certificados/acreditados
• Qualifique o laboratório através de uma auditoria
– Sistema de documentação
– Acompanhamento do teste
Medidas Biofísicas
• Medidas da elasticidade da pele
• Medidas da hidratação da pele
• Medidas da oleosidade da pele
• Avaliação clínica do estado da pele
• Diminuição da irregularidade de rugas
Medidas Biofísicas
• Vantagem:
– utiliza como modelo experimental sistema in vivo
• Desvantagem:
– não permite compreender ao nível molecular a ação do produto
Ensaios Moleculares
• Estimulo produção de proteínas de MEC
• Inibição da produção e atividade das MMPs
• Inibição da produção de RL
• Estímulo a proliferação celular
• Entre outros...
Ensaios Moleculares
• Vantagens
– Possível medir parâmetros que não podem ser medidos in vivo
– Podem ser feitos em larga escala
– No geral são altamente reprodutíveis com baixa variabilidade
• Desvantagens
– Geralmente é sistema longe do in vivo
– Necessário, desenvolvimento e domínio de técnicas envolvendo alta tecnologia
Quando usar
• Como teste pré-clínicos de eficácia
• Para a substituição de modelos animais
• Quando o parâmetro não pode ser medido in vivo
• Para prospecção de ativos
Desenvolvimento
• Conhecimento do processo biológico a ser medido.
– Anti-envelhecimento – envelhecimento
– Clareamento cutâneo – melanogêneses
– Proteção Solar – produção de ROS por incidência de UV, danos ao DNA e reposta imunológica associada.
• Identificação do ponto no processo que é o alicerce da resposta biológica de interesse.
• Validação da técnica a ser usada.
Eficácia via tópica
• Não prevê se ele permeia até o local de ação
• Necessário avaliar a entrega do ativo via tópica
• A eficácia de um ativo: in vitro x in vivo
• Determinação de permeação percutânea in vitro
Testes in vitro
• Simular in vitro processos biológicos do envelhecimento
• Medir esses processos
• Avaliar resposta induzida por ativo
• Inferir a eficácia
Uso de Culturas de células e pele
• Usadas para:
– Teste eficácia
– Teste de segurança
• Permitem medir:
– Alterações da fisiologia intra e extra celular
– Indução de morte
Estresse oxidativo
• Determinação da inibição do efeito biológicos de ROS
– Indução de MMPs; morte celular; fatores de transcrição AP1.
• Quantificação do ROS
– Indireto: usando moléculas específica
– Direto: EPR (Electron paramagnetic resonance)
Determinação de No. Células
• Aplicado a culturas
• Indicativo de proliferação, inibição de crescimento e morte
– Contagem de células
– Incorporação de DNA (Timina marcada)
– Exclusão de corantes – Trypan Blue;
– Metabolismo celular – MTT
• Redução de corante pelo metabolismo celular
Danos ao DNA
• Danos oxidativos ou por UV
• Ensaio do cometa
Matriz Extracelular
• Indução ou inibição da produção:
– Proteínas de matriz
– MMPs
– TIMPs
ADIÇÃO DE
AGENTE
INDUTOR
Componentes Matriz Extracelular
• MMPs – atividade enzimática
• Dosagem bioquímicas específicas
• Técnicas imunológicas
– Western Blots
– Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
• Quantificação de mRNA
– Northern blots
– RTPCR
Vias de Sinalização Intracelular
• Fosforilação
• Expressão de proteínas da via
• Translocação citoplasma/núcleo
Determinação Enzimáticas
• Detecção do produto
– Absorção
– Fluorescência
– Luminescência
+
ENZIMA SUBSTRATO PRODUTOS
Determinação Bioquímicas
• Detecção do produto
– Espectroscopia
– Fluorescência
+
COLÁGENO LIGANTE
Western Blot
+ELETROFORESE
-
TRANSFERÊNCIA HIBRIDIZAÇÃO
ANTICORPO
LAVAGEM REVELAÇÃO
ELISALAVAGEM
ANTICORPOREVELAÇÃO
ADIÇÃO DA
AMOSTRA
PLACA
CONTENDO
ANTICORPO
• Leitura
– Absorção
– Fluorescência
– Luminescência
Northern Blot
+ELETROFORESE
-
TRANSFERÊNCIA HIBRIDIZAÇÃO LAVAGEM REVELAÇÃO
SONDA
Imunofluorescência
AGENTE
INDUTOR
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