ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DO GÊNERO BORDETELLA E PROVASSOROLÓGICAS, A PARTIR DE CRIANÇAS COM SINTOMAS DECOQUELUCHE, ATENDIDAS NO HOSPITAL DE ISOLAMENTO

EMÍLIO RIBAS DE SÃO PAULO *

Sebastião Timo IARIA **

RSPU-B/194

IARIA, S. T. — Isolamento de bactérias do gênero Bordetella e provas soroló-gicas, a partir de crianças com sintomas de coqueluche, atendidas noHospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo. Rev. Saúde públ.,S. Paulo, 7:409-32, 1973.

RESUMO: A partir de 255 crianças com sintomas de coqueluche atendidasno Hospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo, procedeu-se a pes-quisa de bactérias do gênero Bordetella. Em 46 delas, determinou-se, também,a elevação dos níveis de anticorpos circulantes aglutinantes e fixadores decomplemento contra a B. pertussis, aglutinantes contra a B. parapertussise fixadores de complemento contra adenovirus. Por outro lado, relaciona-ram-se os resultados do exame bacteriológico com o período da doença, emsemanas, e com alguns sintomas principais apresentados. Foram tambémrelacionados os resultados das provas bacteriológica e sorológica com aconfirmação clínica do diagnóstico. Foram discutidos, por outro lado, ovalor e as limitações das provas bacteriológica e sorológica no diagnósticolaboratorial da coqueluche.

UNITERMOS: Coqueluche*; Laboratório (Diagnóstico)*; Bordetella (Isola-mento)*; Sorologia (Fixação de complemento e aglutinação).

* Resumo de Tese de Doutoramento, apresentada à Faculdade de Saúde Pública da USP,em 1971.

* * Do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicasda USP. — Av. Dr. Arnaldo, 715 — São Paulo, SP. — Brasil.

1 . I N T R O D U Ç Ã O

No Município de São Paulo, segundodados fornecidos, a pedido, pelo Serviçode Epidemiologia e Estatística do Depar-tamento Regional de Saúde da GrandeSão Paulo, da Coordenadoria de Saúdeda Comunidade da Secretaria da Saúdedo Estado de São Paulo, no período de1964 a 1970, foram registrados 3 564 casos

de coqueluche com 308 óbitos, dos quaiscerca de 90% e 95%, respectivamente,ocorreram em crianças com idades abai-xo de 5 anos e, principalmente, inferio-res a 2 anos.

Isto vem mostrar que apesar das vá-rias armas disponíveis para o seu com-bate, entre elas, principalmente, as va-

cinas e antibióticos, a coqueluche repre-senta ainda um problema médico e deSaúde Pública, especialmente em crian-ças com idades inferiores a 5 anos.

O problema da coqueluche, no passado,apresentou gravidade bem maior emtodo o mundo, polarizando a atenção deinúmeros pesquisadores.

Há cerca de um século iniciaram-se osestudos relativamente ao seu agenteetiológico, quando CARLBURGER em1883, CZAPLEWSKI & HENKEL em 1887,HENRY KOPLIK em 1898 e KRAUZE &LOCHMANN em 1901 (citados porNELSON 48, 1970) verificaram a presençade numerosos bacilos na secreção denasofaringe de crianças com coqueluche.

Porém, a Bordetella pertussis foi iso-lada pela primeira vez por BORDET &GENGou3 (1906) e posteriormente porCHIEVITZ & MEYER 15 (1916).

Anos mais tarde, BROWN 11 (1926)isolou de uma criança, com sintomas decoqueluche, uma estirpe de Bordetellabronchiseptica e observação semelhantefoi feita por CHANG 13 (1950).

Em 1938, ELDERING & KENDRICK 23 respon-sabilizaram também a Bordetella para-pertussis como causa de doença comcaracterísticas semelhantes às da coque-luche.

Assim sendo, as bactérias do gêneroBordetella (BREED et al.10 1957), ousejam, B. pertussis, B. parapertussis e B.bronchiseptica, podem provocar empessoas infectadas, sintomas muito seme-lhantes. Por outro lado, parece que omesmo pode ocorrer em casos de infec-ção por H. influenzae e Diplococcuspneumoniae (LAUTROP 40, 1960).

As dúvidas existentes, desde há muitosanos, relativamente a etiologia em casoscom sintomatologia de coqueluche, in-

cluindo uma possível participação viral,provocaram a realização de inúmeraspesquisas. Assim, através da inoculaçãode B. pertussis, SAUER & HAMBRECHT57

(1929) e RICH et al. 54 (1932), reproduzi-ram o quadro de coqueluche em macacosenquanto que MAC DONALD & MACDONALD 43 (1933) o fizeram através dainfecção experimental em crianças. Poroutro lado, McCoRDocK42 (1932) relatouo encontro de inclusões intranuclearesnas células pulmonares de crianças comsintomas de coqueluche, sugerindo umapossível participação viral nesta doença.FRAWLEY29 (1940), no entanto, não logroua reprodução da sintomatologia típica decoqueluche pela instilação de filtrados delavados nasais, de doentes com estadoença, em crianças.

Mais recentemente, novas pesquisasforam realizadas com o objetivo de veri-ficar a participação de virus em quadrosclínicos de coqueluche. Destas, serãoreferidas apenas as de OLSON et al.49

(1964) que isolaram adenovirus do tipo12 e de CONNOR 17 (1970) e PEREIRA &CANDEIAS50 (1971) que isolaram adeno-virus dos tipos 1, 2, 3 e 5, a partir decrianças apresentando sintomatologia decoqueluche.

No diagnóstico bacteriológico de coque-luche, deve-se proceder ao isolamento deB. pertussis, a partir de material colhidoda nasofaringe ou através da placa detosse, mas deve ser pesquisada, tambéma presença de B. parapertussis e de B.bronchiseptica (BROWN 11, 1926; ELDERING& KENDRICK23, 1938; LAUTROP 40, 1960 eKENDRICK et al.33, 1963). Por outro la-do, deve-se levar em conta que oisolamento de B. pertussis atinge per-centuais mais elevados, nas primeirassemanas de doença, principalmente naprimeira ou período catarral (BORDET &GENGOU 3, 1906; CHIEVITZ & MEYER 15, 1916;KRISTENSEN 38, 1933; STRAKER & WASTE-

WATER5 9 , 1937; SAITO et al.56, 1942 eMILLER JR. et al.47, 1943).

A utilização de provas sorológicas deaglutinação e de fixação de complemento(DONALD22, 1938, EVANS & MAINTLAND26,

1939 e KENDRICK et al.33, 1963) podem serde grande valor, especialmente nos casosde coqueluche atípica ou quando a doen-ça se apresenta em fases mais avança-das. Pode ser empregada também apesquisa de opsoninas (KENDRICK et al.37,1950, KENDRICK et al.33, 1963), porém émenos usada.

A imunidade conferida pela coquelucheé geralmente sólida e persiste por mui-tos anos, ao contrário do que ocorrecom a imunização pela vacina (BARROSF.o.1, 1968). Quer pela doença, quer pelavacinação, desenvolvem-se no organismoaglutininas, anticorpos fixadores de com-plemento e opsoninas (KENDRICK et al.33

1963).

Entre nós, não raramente, os pediatrasreferem a ocorrência de casos de coque-luche em crianças previamente vacina-das. Atribuem à doença a falhas de va-cinas ou a possíveis infecções por B.parapertussis, a que chamam de para-coqueluche.

A freqüência de infecções por B. para-pertussis no nosso meio é, no entanto,desconhecida, dado o escasso número deinvestigações sobre o assunto. Apenasa Cidade do Rio de Janeiro conta comalguma informação a respeito (BARROSF.°1, 1968 e UBATUBA60, 1969).

Para o nosso Estado e em particularo Município de São Paulo, não há dadosinformativos sobre o isolamento de B.parapertussis, a partir de crianças comcoqueluche, e existe unicamente um tra-balho sobre o isolamento de B. pertussis(LIMA 41, 1932).

Por outro lado, não se pode excluir apossibilidade de falhas no diagnósticoclínico desta doença. Como é sabido, omesmo é feito, praticamente na totali-dade dos casos, apenas clinicamente, combase na sintomatologia e, quando possí-vel, também nos dados epidemiológicosrespectivos (BASTOS 2, 1969). A respeitodisto, é sabido também que os sintomasapresentados pelos doentes, principal-mente nos períodos iniciais da doença,podem ser confundidos com os observa-dos em outras infecções do aparelhorespiratório, entre elas, adenoviroses(OLSON et al. 49, 1964 e CONNOR 17, 1970),gripe, laringites, laringo-traqueites, rino-faringites (BARROS F.o 1, 1968 e BASTOS 2,1969) e resfriado comum (RICH54 et al.,1932).

Pelas razões apontadas anteriormente,dado o número limitadíssimo de estudossobre coqueluche em nosso país e emparticular em nosso município, umasérie de dúvidas têm surgido, relativasà eficiência das vacinas empregadas e,até mesmo, quanto à etiologia dos casosclínicos desta doença, principalmente emcrianças vacinadas. Sabendo-se que a B.parapertussis e a B. bronchiseptica po-dem, também, determinar o apareci-mento de quadros clínicos semelhantesao da coqueluche, muitos atribuem aetiologia nos casos em que a criança foivacinada, possivelmente à B. paraper-tussis, dado que, em muitos casos adoença se apresenta com um carátermenos severo. Por outro lado, muitoraramente são utilizados os examesbacteriológico e sorológico, na confirma-ção laboratorial do dignóstico clínico.Tendo em vista estes fatos, resolvemoselaborar um plano de pesquisa a res-peito. O estudo que será relatado aseguir, refere-se apenas à parte do planototal de pesquisa por nós estabelecido etem por finalidade, atingir os seguintesobjetivos:

a — verificar em um grupo de criançascom sintomas de coqueluche, atendidasno Hospital de Isolamento Emílio Ribasda Secretaria da Saúde do Estado deSão Paulo, a freqüência de isolamento debactérias do gênero Bordetella;

b — verificar no soro sanguíneo dessasmesmas crianças, a elevação ou não dosníveis de anticorpos aglutinantes e fixa-dores de complemento;

c — relacionar os resultados dosexames bacteriológico e sorológico aodiagnóstico clínico.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Casos clínicos — Elegemos como cam-po das nossas observações, crianças comsintomas de coqueluche e que recorre-ram aos serviços médicos do Hospitalde Isolamento Emílio Ribas, no períodocompreendido entre julho de 1969 edezembro de 1970. Este grupo, de 255crianças, compôs-se de 121 indivíduos dosexo masculino e 134 do sexo feminino,com idades variando de 0 a 12 anos.Com relação a imunizações, de 162 indi-víduos teve-se a informação de nãoterem sido vacinados contra a coque-luche e 56 não souberam informar. Poroutro lado, 37 referiram vacinação ante-rior, dos quais, 8 receberam uma dosede vacina; 8, duas doses; 16, três doses;2, quatro doses e 3 não souberam infor-mar o número de doses.

O diagnóstico clínico ou de suspeita decoqueluche foi feito por médicos daquelehospital. Em uma ficha especialmenteelaborada, foram registradas as informa-ções dadas pelos acompanhantes dosdoentes. Posteriormente, foram obtidas,através do exame dos prontuários, as in-formações relativas à confirmação clínicado diagnóstico de coqueluche.

Coleta do material — Das 255 criançasexaminadas, apresentando suspeita de co-

queluche, de 127, procedeu-se a coleta domaterial no próprio ambulatório, utili-zando-se inicialmente o processo da placade tosse (CHIEVITZ & MEYER15, 1916 eLAUTROP 40, 1960) e, logo a seguir, danasofaringe através de uma zaragatoa(swab) por introdução per oral (BRADFORD& SLAVIN8, 1940 e LAUTROP 40, 1960). Das128 crianças restantes, logo após a suainternação, procedeu-se a coleta de ma-terial pelo método da placa de tosse ea seguir da nasofaringe pela técnica dazaragatoa por introdução per nasal(CRUICKSHANK 19, 1944 e LAUTROP 40, 1960).

De 46 crianças, das 255 estudadas,foram colhidas, também, duas amostrasde 8 ml de sangue, para provas soroló-gicas, sendo a primeira logo após a inter-nação e a segunda um mês após. Asamostras de soro, assim obtidas, forammantidas em congelador a —10°C até arealização das provas sorológicas.

Após a coleta do material, as zaraga-toas foram mantidas imersas em 0,5 mlde solução de casamino ácidos (técnico)a 1%, até o início do exame (KENDRICKet al. 32, 1947; KENDRICK et al.36, 1961 eUBATUBA60, 1969). O tempo decorrido en-tre a a coleta dos materiais e o iníciodos exames, nunca ultrapassou de duashoras (UBATUBA 60, 1969).

As zaragatoas para a coleta de mate-rial da nasofaringe por introdução peroral e per nasal, foram preparadassegundo as técnicas mencionadas porLAUTROP40 (1960). A solução de casaminoácidos (Difco-técnico) foi preparada a1% em água destilada, contendo 0,6%de cloreto de sódio e apresentando umpH final de 7,2 (KENDRICK et al.32, 1947e KENDRICK et al.36, 1961).

Meios de cultura empregadosMeio de Bordet-Gengou — Este meio

foi preparado segundo a fórmula usadano "Statens Seruminstitut" de Copenha-gue (LAUTROP 40, 1960) ou seja: 1000 g de

batatas, limpas, descascadas e picadas,foram colocadas num saco de gase e aseguir, submersas em 2000 ml de águade torneira contendo 80 ml de glicerol.A mistura foi fervida até as batatas setornarem amolecidas. O suco concen-trado de batatas foi extraído, espremen-do-as no saco de gase. A seguir, a umvolume de suco concentrado foramadicionados 3 volumes de solução de clo-reto de sódio a 0,6%. O pH foi ajustadoa 7,2 — 7,4 e o suco diluído, distribuídoem garrafas de Roux. A seguir, apósadição de 4% de agar (Difco), a misturafoi aquecida em banho-maria ferventepara a dissolução do agar, e em seguidaesterilizada a 120°C por 20 minutos emautoclave. No momento de ser usado,o meio base era fundido em autoclavecom vapor fluente e, após ser esfriado a45-50°C, era adicionado de sangue desfibri-nado, estéril, de carneiro na proporçãode 50%.

Meio com uréia (método de Fergusson& Hook modificado — LAUTROP40, 1960)— Este meio foi preparado da se-guinte maneira: fosfato monopotás-sico — KH2PO4 anidro (0,1g), fosfa-to dipotássico — KH2PO4 anidro (0,1g),cloreto de sódio (0,5g), vermelho de fenol(1mg) e água destilada q.s.p.100ml. Asolução foi esterilizada a 120°C por 20min. e em seguida, adicionada de 1% deuréia, partindo-se de uma solução a 20%esterilizada por filtração (Seitz). Poste-riormente o meio foi distribuído emvolume de 1 ml em tubos 12 x 120 mm.Este meio foi utilizado na prova dodesdobramento da uréia. O meio utili-zado como controle da prova, foi prepa-rado da mesma maneira, porém, sem aadição da uréia.

Caldo nitratado (LAUTROP 40, 1960) —Este meio foi assim preparado: peptona-Difco (0,5g), nitrato de potássio (0,1g) eágua destilada q.s.p. 100 ml. Após ajus-

tar o pH a 7,2-7,4, foram distribuídosvolumes de 5 ml em tubos medindo16 x 160 mm; a seguir, procedeu-se àesterilização da solução em autoclave a120°C por 20 min. Este meio foi utili-zado na prova da redução de nitratos anitritos.

Citrato — Na prova do aproveitamentodo citrato foi utilizado o agar citrato deSimmons (Difco) (KENDRICK et al. 33,1963).

Agar tirosina (ESMINGER 25, 1953) — Foipreparado agar simples com 0,1% detirosina. A seguir o pH foi ajustado a7,5 adicionando-se solução de NaOH N/1.Finalmente o meio foi distribuído emplacas de Petri ou em tubos 16 x 160 mm,estes últimos mantidos em posiçãoinclinada.

Técnica de isolamento e de identifica-ção de Bordetelas — Nas placas de tosse,procedeu-se, simplesmente o espalhamen-to, na superfície, de 0,1 ml de soluçãode penicilina G potássica contendo 350unidades por ml. Por outro lado, partin-do-se das zaragatoas, realizou-se à semea-dura de placas com meio de Bordet-Gengou, rolando-se o chumaço na super-fície do meio. Em seguida, procedeu-seao espalhamento da solução de penicilinaG potássica, da maneira já descrita,usando-se uma espátula de Drigalskiestéril (UBATUBA60, 1969). A concentra-ção da solução de penicilina, usada, foiestabelecida previamente empregando-seamostras isoladas de B. pertussis, B. pa-rapertussis e B. bronchiseptica. A con-centração selecionada, 0,1 ml de soluçãode penicilina G potássica com 350 uni-dades por ml, não impedia a multiplica-ção das bactérias das três espéciescitadas, mas impedia de forma satisfa-tória o crescimento de colônias de outrasbactérias presentes em materiais denasofaringe coletados de alguns indiví-duos através de zaragatoa per nasal.

Segundo MACLEAN 44 (1937), CRUICKSHANK 19

(1944), BRADFORD et al6 (1946) eLAUTROP40 (1960) a adição de penicilinaaumenta a positividade do isolamento debordetelas.

As placas semeadas foram incubadas a35°C em estufa saturada de umidade(BRADFORD & BROOKS 5, 1941 e LACEY39 ,1954). As placas foram examinadas dia-riamente do 2.° ao 10.° dia de incubação(LAUTROP40 , 1960 e UBATUBA60 , 1969). Oreconhecimento de colônias de bordetelasfoi realizado segundo os critérios apre-sentados e discutidos por LAUTROP40),(1960). Das placas eram selecionadas 6a 8 colônias suspeitas de serem debordetelas e, as mesmas eram semeadasem novas placas com meio de Bordet-Gengou. Estas placas eram incubadas a35°C, em estufa saturada de umidade e asua verificação era feita após 24, 48 e72 h, até o 10.° dia. A partir destas cultu-ras, prepararam-se, em lâminas, esfrega-ços corados pelo método de Gram, paraa verificação da morfologia e a seguirprocederam-se às inoculações dos meiospara as seguintes provas de identifica-ção bioquímica:

Prova do desdobramento da uréia— Feita através da inoculação maciça(até a turvação) das bactérias a seremidentificadas, em meio contendo uréia.A prova positiva era revelada pelo apa-recimento de cor vermelha, dado pelaviragem do vermelho de fenol, apósalgumas horas (2 a 4 h) de incubação a35°C. Realizou.se em todos os casos, pa-ralelamente, uma prova controle ino-culando-se maciçamente a cultura emmeio preparado da mesma forma que oanterior, porém sem a adição de uréia.

Prova da redução de nitratos a nitritos— Consistiu na inoculação maciça dasbactérias a serem identificadas (até aturvação), em caldo nitratado. Após aincubação a 35°C por 24 horas, a 1 mldesta cultura, adicionaram-se algumasgotas dos reativos (solução de ácido sul-fanílico a 0,8% em sol. de ácido acético5N e solução de alfa naftilamina a 0,5%em sol. de ácido acético 5N). A provapositiva caracterizava-se pelo aparecimen-to de cor avermelhada.

Prova do aproveitamento do citrato —Foi feita por meio da semeadura dasbactérias, em identificação, na superfíciede agar citrato de Simmons, inclinado(Difco). Após incubação de até 4 dias a35°C, a prova positiva manifestava-sepelo aparecimento de coloração azul nomeio semeado.

Prova da multiplicação em agar tiro-sina a 1% — Consistiu na inoculação dasbactérias a serem identificadas, na su-perfície de agar tirosina em placas ouem tubos. Nesta prova, o resultado posi-tivo caracteriza-se pela ocorrência demultiplicação bacteriana, com escureci-mento do meio de cultura (cor bronzea-da). Este escurecimento é dado peloataque da tirosinase sobre a tirosina,produzindo-se uma pigmentação escura,do tipo melanina (LAUTROP40, 1960).

Na Tabela 1 estão resumidos os resul-tados esperados, relativos às provas deidentificação utilizadas no estudo pre-sente, segundo as características bioquí-micas pesquisadas das espécies deBordetella (LAUTROP40 , 1960 e KENDRICKet al. 33, 1963).

A seguir, procedeu-se à identificaçãosorológica através de prova rápida desoro aglutinação em lâmina*.

* O soro anti-Bordetella pertussis usado, foi preparado no Instituto Oswaldo Cruz do Riode Janeiro e gentilmente cedido pela Dra. Arlette Ubatuba. O soro anti-Bordetella paraper-tussis (Difco) foi adquirido no comércio e utilizado após diluição a 1/10 em solução decloreto de sódio a 0,85%, segundo a bula que acompanhava o produto.

A identificação sorológica das nossasculturas em lâmina, foi realizada atravésda mistura de uma gota de suspensãoespessa das bactérias que estavam sendoidentificadas, com uma gota de soroaglutinante. As leituras foram realizadasaté 5 minutos após o início da prova,com o auxílio de uma lupa. Paralela-mente, realizava-se uma prova controleusando-se uma mistura de uma gota desuspensão bacteriana espessa com umagota de solução de cloreto de sódio a0,85%.

Provas realizadas com os soros dosdoentes — Nas duas amostras de soro,colhidas com intervalo de um mês, de46 crianças, das 255 estudadas, foramdeterminados os níveis circulantes deanticorpos contra B. pertussis, pelasprovas de aglutinação e de fixação docomplemento (FC'); determinaram-setambém os títulos aglutinantes para B.parapertussis. Para isso, os soros queestavam mantidos a —10°C foram des-congelados rapidamente, colocando-se ostubos em banho de água corrente poralguns minutos.

Prova de aglutinação — Os antígenos

foram preparados empregando-se aestirpe de B. pertussis A.T.C.C. 10536,utilizada em inúmeros laboratórios nopreparo de vacina contra a coqueluche e,a estirpe de B. parapertussis 139, isoladapela Dra. Arlette Ubatuba, no InstitutoOswaldo Cruz do Rio de Janeiro. Pre-liminarmente, na estirpe A.T.C.C. 10536,foi realizada a dosagem dos antígenostermolábeis "major" de envoltório 1, 2 e3, empregando-se para tal, soros mono-específicos, tendo-se verificado a presen-ça dos três antígenos.

As provas de aglutinação foram reali-zadas, segundo a técnica de PRESTON &TE PUNGA 52 (1959), utilizando-se o micro-titulador Takatsi. Em placas "perspex",foram misturados 0,025 ml de soro a serdosado, diluído de 1/2 a 1/4096 (diluiçõescom fator 2) em solução salina fosfatadacom pH 7,4 e 0>025 ml de antígeno. Osantígenos consistiram de suspensões con-tendo 30 bilhões de B. pertussis ou B.parapertussis por ml, em solução salinafosfatada com pH 7,4 (solução de fosfatomonopotássico (KH2PO4) M/15, 10 ml,solução de fosfato dissódico (Na2HPO4)M/15, 40 ml, cloreto de sódio 8,5g, água

destilada q.s.p. 1000 ml). A concentra-ção de B. pertussis ou B. parapertussis,nas suspensões, foi determinada colori-metricamente, empregando-se o colorí-metro "EEL" portátil com filtro verdeamarelado e o padrão de opacidade do"National Institute of Health" (NIH),EUA. As misturas foram a seguir agita-das durante 15 min. em agitador deKahn (200 ciclos por min.), com ampli-tude de 3 cm. Após a agitação, as placascontendo as misturas foram mantidas nageladeira a 4°C por 20 min. e, a seguirforam efetuados as leituras, com oauxílio de uma lupa entomológica, comfoco de iluminação por cima. Foi consi-derado como título aglutinante do soro,a recíproca da maior diluição onde aindase observava reação de aglutinaçãopositiva.

Prova de fixação do complemento —Foi realizada somente contra a B. per-tussis e empregou-se a técnica deBRADSTREET & TAYLOR 9 (1962) com modi-ficações (CANDEIAS12, 1968). Nesta prova,misturou-se 0,1 ml de soro a ser titulado,em várias diluições (1/2 a 1/1024), 0,1 mlda dose ótima de antígeno, 0,1 ml decomplemento diluído de forma a conterduas unidades C'H100 e 0,2 ml de suspen-são a 2% de hemácias sensibilizadas decarneiro. Como diluente, foi usada solu-ção de cloreto de sódio a 0,85%.

O antígeno de B. pertussis empregadonesta prova foi preparado segundo atécnica de PRICE 53 (1932) modificada,descrita para o preparo do antígenogonocócico, utilizado na prova de fixaçãode complemento (CRUICKSHANK et al.20,1970). O antígeno foi constituído de umasuspensão com 10 bilhões de B. pertussispor ml, em solução de cloreto de sódioa 0,85%. Esta padronização foi feitatambém fotocolorimetricamente, usan-do-se o padrão de opacidade do "NIH"já referido. A cada 5 ml desta suspensão

foram adicionados 0,2 ml de solução dehidróxido de sódio N/1 e, a seguir, amistura foi mantida em banho-maria a37°C por 2 horas. Após esta incubação,o pH foi ajustado a 7,4 pela adição desolução de ácido clorídrico N/1. Esteantígeno foi aquecido a 56°C, em banho-maria por 30 min. para reduzir a suaanticomplementaridade e, posteriormen-te, adicionado de 0,08% de azida de sódio.

Complemento — O complemento usadona reação, obtido de cobaias, foi pre-servado pela técnica de RICHARDSON 55

(1941) e, nestas condições, pode ser con-servado por cerca de um ano (BRADSTREET& TAYLOR9, 1962). O complemento assimconservado é hipertónico e, por essa ra-zão foi diluído com salina tamponada,de pH 7,2, e água destilada, respeitan-do-se as seguintes proporções: 0,1 ml decomplemento, 0,7 ml de água destilada eum volume V de salina tamponada, afim de se obter a diluição desejada. Ovolume V de salina tamponada pode sercalculado através da fórmula:

sendo de a recíproca da diluição dese-jada do complemento.

Hemácias sensibilizadas de carneiro —suspensão de hemácias de carneiro a 2%foi sensibilizada com a dose de hemoli-sina em partes iguais, em banho-mariaa 37°C por 10 min.

3. RESULTADOS

Dos 255 casos estudados, obteve-se oisolamento de B. pertussis de 55 (21,6%).De nenhum caso se isolou B. paraper-tussis ou B. bronchiseptica.

Relativamente a semanas de doença,81 crianças foram referidas como estan-do na 1.a semana, 69 na 2.a, 39 na 3.a, 35

na 4.a e 30 na 5.a ou mais semanas. Oisolamento de B. pertussis foi obtido (Ta-bela 2), respectivamente, de 26 (32,1%),16 (23,2%), 7 (17,9%), 4 (11,4%) e de 2(6,5%).

Das 255 crianças estudadas, 155 foraminternadas e submetidas a seguimentoclínico e o diagnóstico de coqueluche foiconfirmado clinicamente, por médicos dohospital, em 129 (83,2%) e não confir-mado em 26 (16,8%). As 100 restantesnão foram internadas e serão referidascomo "casos não seguidos". A Tabela 3mostra a positividade do isolamento deB. pertussis nos 129 casos com diagnós-tico de coqueluche confirmado, nos 26não confirmados e nos 100 não seguidos.As taxas de positividade foram, respecti-vamente, de 20,2%, 7,7% e 27,0%.

A Tabela 4 mostra as taxas de isola-mento da B. pertussis, segundo a confir-mação clínica do diagnóstico e o períodode doença em semanas. Dos 129 casosconfirmados clinicamente, 40 referiramestar na 1.a semana de doença, 28 na 2.a,21 na 3.a, 22 na 4.a e 18 na 5.a ou maissemanas. Foi isolada a B. pertussis, res-pectivamente, de 40,0%, 17,9%, 14,3%,4,5% e 5,6%. Dos 26 casos não confirma-dos clinicamente, a B. pertussis foi isola-da de apenas 2 casos (22,2%) dos 9referidos de 1.a semana de doença. Dos100 casos não seguidos, 32 referiramestar na 1.a semana, 34 na 2.a, 12 na 3.a,12 na 4.a e 10 na 5.a ou mais semanas.A positividade do isolamento de B. per-tussis foi, respectivamente, de 25,0%,32,4%, 33,3%, 25,0% e 10,0%.

A Tabela 5 mostra, nos 255 casos estu-dados, a positividade para B. pertussissegundo alguns sintomas mais freqüentese segundo a confirmação clínica dodiagnóstico de coqueluche. Do total decasos, 52 apresentaram apenas tosse

comum, sem características específicas,103 apenas tosse espasmódica e 100 tosseespasmódica com vômito, guincho ou

ambos. A B. pertussis foi isolada, res-pectivamente, de 5 casos (9,6%), de 26(25,2%) e 24 (24,0%).

Na Tabela 6 estão distribuídos os re-sultados das provas de aglutinação e deFC' frente a antígenos de B. pertussis eB. parapertussis, realizadas com os sorosde 46 crianças internadas e submetidas aacompanhamento clínico. As provas deaglutinação e de FC' são referidas comopositivas quando os exames das duasamostras colhidas com intervalo de ummês, revelaram uma elevação do nível de

anticorpos circulantes, de pelo menos 4vezes. A prova de aglutinação para aB. pertussis foi positiva nos soros de 14(30,4%) e a de FC', para esta mesmabactéria, nos de 19 (413%). A prova deaglutinação para B. parapertussis foipositiva apenas em um caso (2,2%).Nesta Tabela pode ser observada tam-bém a positividade das provas sorológi-cas segundo o isolamento de B. pertussis.

Na Tabela 7, encontra-se a distribuiçãodos resultados de isolamento de B. per-tussis e das provas sorológicas segundoa confirmação clínica do diagnóstico,relativos aos 46 casos referidos. Destes,36 foram confirmados clinicamente comosendo de coqueluche e 10 não foramconfirmados. A positividade laboratorial,

levando em conta o isolamento de B. per-tussis e/ou provas sorológicas, foi res-pectivamente de 22 casos (611%) e 6casos (60,0%). Por outro lado, 14(38,9%) dos confirmados clinicamente e4 (40,0%) dos não confirmados, revela-ram-se negativos nos exames bacterioló-gico e sorológico.

4. DISCUSSÃO

Das 255 crianças estudadas, foramisoladas 55 estirpes, de B. pertussis,identificadas bioquímica e sorologica-mente. Em nenhum caso obteve-se oisolamento de B. parapertussis ou de B.bronchiseptica.

Dos estudos existentes, sabe-se que a

ocorrência de infecções pela B. bronchi-

séptica em casos clínicos de coquelucheé rara (LAUTROP40, 1960). Na Inglaterra,em pesquisa realizada pelo MEDICALRESEARCH COUNCIL 46 (1951), de 836casos de coqueluche, foi isolada a B.bronchiseptica de apenas 1 (cerca de

0,1%).

Por outro lado, a B. parapertussisocorre com freqüência maior que a ante-rior, embora de forma variável. Emestudos realizados, BRADFORD & SLAVIN7

(1937), em Nova York, isolaram B. para-pertussis de 5% de 160 casos de coque-luche confirmados bacteriológicamente;em Michigan, ELDERING & KENDRICK24

(1952), de 2% de casos clínicos positivosbacteriologicamente, isolaram essa bacté-ria. Na Dinamarca, as infecções porB. parapertussis são mais freqüentes(ELDERING & KENDRICKS24 1952) e naTchecoslováquia pela sua freqüência,apresenta-se com certa importância, oque motivou a sua inclusão na vacinacontra a coqueluche (VYSOKA-BURIANOVA,1962 apud UBATUBA60 , 1969, VYSOKA-BURIANOVA 61, 1970). No Brasil, no únicoestudo existente feito na cidade do Riode Janeiro, dos casos clínicos de coque-luche confirmados bacteriológicamente,cerca de 1% foi devido à B. parapertussis(BARROS F.° i, 1968; UBATUBA 60 ,1969).Em São Paulo, CORREA et al. 18 (1970), ten-taram determinar a freqüência de infec-ções por B. parapertussis, realizando uminquérito sorológico em 163 crianças,através da prova de aglutinação. Segun-do estes pesquisadores "dez exames mos-traram reações só relacionadas com a B.parapertussis e proporcionaram baixosteores de positividade que, talvez, não in-diquem com segurança acometimentos,no passado por esse germe".

Ressaltamos que no nosso estudo, de255 crianças estudadas, isolamos apenasa B. pertussis dos 55 casos positivos. Sehouvesse sido estudado um númeromaior de casos, é possível que viesse aser isolada alguma estirpe de B. para-pertussis.

Como é sabido, na coqueluche, o iso-lamento de B. pertussis é mais freqüentenas primeiras semanas da doença,principalmente na primeira ou fase

catarral. Nesta fase, pode-se atingiruma taxa de isolamento do agente decerca de 80% (KENDRICK & ELDERING 34, 35

1934 e 1935; STRAKER 8 WESTEWATER 59,1937; SAITO et al. 56, 1942), de 98% (SILVER-THORNE & FRASER58, 1935) ou até de 100%(DONALD22, 1938). No Brasil, CUNHA 21

(1943) em casos de coqueluche obteve naprimeira semana de doença uma positivi-dade de 46,6%. Na fase de tosse espas-módica a positividade para a B. pertussisvai decrescendo, atingindo níveis muitobaixos na 6.a e 7.a semanas. A Tabela 8mostra os resultados obtidos por váriospesquisadores em estudos relacionadoscom o isolamento de B. pertussis e o pe-ríodo de doença.

Na presente pesquisa, distribuindo-se afreqüência do isolamento de B. pertussissegundo o período de doença (Tabela 2),verificamos que a taxa de positividadefoi também maior, entre os doentes que,pelas informações, estavam na 1.a sema-na de doença (32,1%). Observamos, ain-da, que a positividade depois decresceuatingindo 23,2% nos doentes de 2.a sema-na, 17,9% de 3.a, 11,4% de 4.a e 6,5% nosde 5.a ou mais semanas.

Comparando os nossos resultados comos obtidos por vários pesquisadores(Tabelas 2 e 8), verificamos que osnossos percentuais de positividade foramrelativamente baixos. No entanto, deveser salientado que aquelas pesquisasforam realizadas em épocas e locais dife-rentes e por investigadores . distintos,dando a essa comparação um valor re-lativo.

Na época em que tais pesquisas foramrealizadas, não havia a interferência dosantibióticos nos resultados dos examesbacteriológicos. Por outro lado, deve-mos também considerar as falhas nodiagnóstico clínico da doença e as falhasde ordem técnica, cuja freqüência desco-nhecemos, relacionadas à colheita do

material, à possível variação da eficiênciados vários lotes de meios de cultura, aonúmero de exames feitos para o mesmodoente, etc. Há que se considerar tam-bém o período de doença referido pelosacompanhantes dos doentes. É sabidoque grande parte dos doentes recorreao hospital em busca de assistênciamédica numa fase não inicial da doença,mas sim quando a mesma se encontrajá na fase espasmódica (DONALD 22, 1938;BARROS F.o 1, 1968). Assim sendo, devehaver casos que são referidos comosendo de 1.a, 2.a ou 3.a semana de doença,mas que na realidade estariam já na 4.a,5.a ou mais semanas.

Analisando a Tabela 4, pode-se verificarque entre os casos referidos como sendode 1.a semana de doença, obtivemos oisolamento de B. pertussis em 40% dosque tiveram o diagnóstico confirmadoclinicamente. A porcentagem de positi-vidade decresceu, como era de se esperar,atingindo 17,9% nos doentes de 2.a

semana, 14,3% nos de 3.a, 4,5% nos de4.a e 5,6% nos de 5.a ou mais semanas.Nos casos em que o diagnóstico clíniconão foi confirmado clinicamente, a posi-tividade foi de 22,2% dos que referiramestar na 1.a semana de doença. Os va-lores por nós obtidos podem mostrar,mais uma vez, a possibilidade da ocorrên-cia de falhas no diagnóstico clínico destadoença, fato já constatato ou referidopor vários autores, entre eles. CHANY14

(1958), FARBER & VAWTER28 (1961), OLSONet al. 49 (1964), BASTOS 2 (1969) e CONNOR 17

(1970).

Nos nossos casos, a positividade doisolamento de B. pertussis foi de 21,6%(55 casos), a qual consideramos relativa-mente baixa, quando comparada comas obtidas por outros pesquisadores.KENDRICK & ELDERING34 (1934), SILVER-THORNE & FRASER58 (1935), STRAKER &

WESTWATER59 (1937), SAITO et al. 56

(1942), obtiveram positividades que va-riaram de 60 a 80% e CHIEVITZ & MEYER 15

(1916), KENDRICK & ELDERING 35 (1935) eMILLER JR. et al.47 (1943), positividadesde 40 a 60%. Outros investigadores,porém, obtiveram também positividadesmais baixas, como DONALD 22 (1938),24,9% e CRUICKSHANK et al.20 (1970), 28%.

No Brasil, LIMA41 (1932), estudandocasos de coqueluche, isolou a B. per-tussis de 60% dos pacientes. Mais re-centemente, BARROS F.°1 (1968) obteveuma positividade de 48,9% e UBATUBA60

(1969) relata o isolamento de B. pertussisde 64,1% de 156 doentes estudados.

Na presente investigação já referimosalguns dos muitos fatores que poderiaminterferir, provocando baixa positividadedo isolamento de B. pertussis. Por outrolado, temos a salientar que, de acordocom a sintomatologia apresentada pelosdoentes, cerca de 80% já se mostrava nafase espasmódica; isto resulta como já ésabido, em maior número de examesnegativos.

Acreditamos, assim, ser de grande va-lor o acompanhamento dos contatos,pois caso venham alguns deles a contraira doença, a mesma poderá, nesses casossecundários, ser diagnosticada bacterio-logicamente com relativa facilidade nasua fase inicial, o que poderia, inclusive,esclarecer o diagnóstico de coqueluchede casos primários, se negativos ao exa-me de laboratório. Sabemos, entretanto,que, embora esta conduta seja a ideal,nem sempre ela pode ser realizada, pelasinúmeras dificuldades existentes.

Além do exame bacteriológico, pode-mos, como é sabido, utilizar provas soro-lógicas no diagnóstico laboratorial dacoqueluche e as mais usadas são as deaglutinação e de FC'. Estas provas foramutilizadas pela primeira vez por BORDET &GENGOU3, 4 (1906, 1907). Em estudos pos-

teriores verificou-se que a prova de FC'torna-se positiva na 2.a ou 3.a semana dedoença e atinge um máximo de positi-vidade na 7.a ou 8.a semana (WINHOLT62,1915; CHIEVITZ & MEYER 15, 1916; GUNDEL &SCHLÜTER31, 1933/1934 e DONALD 22, 1938).

No entanto, da 7.a semana de doençaem diante a positividade das provas soro-lógicas decresce (CHIEVITZ & MEYER 15,1916) a ponto de se ter reações de PC'negativas no soro de indivíduos que tive-ram coqueluche há 2, 3 e 5 anos(WINHOLT62, 1915). A fim de mostrarmelhor a positividade da reação deFC', segundo o período de doença, foramresumidos na Figura, os resultadosobtidos por CHIEVITZ & MEYER 15 (1916) eDONALD 22 (1938).

Uma reação de FC' positiva pode indi-car, com muita probabilidade, que umacriança tem ou teve a doença; por outrolado, a reação negativa não evidenciacom tanta segurança que o mesmonão tenha a doença no momento ouque não tenha apresentado anterior-mente (CHIEVITZ & MEYER 15 1916). Éóbvio que o surgimento das vacinas con-tra a coqueluche, provocou modificaçãona afirmação feita por estes pesquisado-res. Havendo sintomas de coqueluche,deve-se verificar a elevação dos níveis deanticorpos de pelo menos 4 vezes, empre-gando-se duas amostras de soro do doen-te, colhidas com intervalo apropriado.

Relativamente à prova de soro-agluti-nação, EVANS & MAITLAND 26, 27 (1939) veri-ficaram que esta prova torna-se positivatambém na 3.a semana de doença; poroutro lado, concluiram que a prova deaglutinação se mostrou mais sensível doque a de FC'.

WINTER 63 (1953) de 50 casos de coque-luche positivos ao exame bacteriológico,observou elevação do título de aglutini-nas em 31 (62%).

Mais recentemente na Escócia, CRUICK-SHANK et al. 20, (1970) compararam os re-sultados das provas de aglutinação e deFC e concluiram, da sua pesquisa, quehá uma boa correlação nos resultadosobtidos por ambas as provas. Observa-ram, no entanto, que nos casos em quese isolou a B. pertussis, a prova de FC'parece ter se revelado mais sensível quea de aglutinação.

Em nosso estudo, dos 155 casos queforam internados, foi possível obter duasamostras de sangue de 46 doentes, a fimde serem realizadas as provas sorológi-cas. Dos demais casos, colheu-se, de cadadoente, somente a primeira amostra desangue e não se pôde coletar a segunda,pois os pacientes não compareceram aohospital na data marcada para o retorno,ou seja, um mês após a obtenção da pri-meira amostra.

Foi baseado nos estudos de CHIEVITZ &MEYER 15 (1916) e de DONALD 22 (1938) queelegemos o intervalo de um mês paraa coleta das duas amostras de sangue.

CRUICKSHANK et al.20 (1970) o fizeramcom intervalo de 14 dias. PRESTON 51

(1970) recomenda a coleta da primeiraamostra de sangue em época a maispróxima do início da doença e, a segundaamostra, cerca de seis semanas após.

Nas amostras de soro dos 46 pacientespor nós estudados, realizamos as provasde FC' e de aglutinação para B. per-tussis e de aglutinação para B. para-pertussis.

Pelas provas sorológicas, apenas umcaso apresentou elevação do título deanticorpos contra B. parapertussis, masrevelou, também, níveis de igual teor deanticorpos para B. pertussis. Esta in-fecção poderia, assim, ter sido devida àB. pertussis, a mais comum, tendo ocor-rido, provavelmente, uma positividadesorológica cruzada (Tabela 6).

Na mesma Tabela, podemos verificar,ainda, que a reação de FC' apresentousensibilidade maior que a de aglutina-ção, principalmente nos casos em quese isolou a B. pertussis, levando-se emconta a elevação do nível de anticorpos.Embora CRUICKSHANK et al.20 (1970)tenham feito observação semelhante, nonosso estudo não nos foi possível tirarconclusões a respeito, dado ser pequenoo número de casos examinados.

É importante salientar que de 13 casosreferidos como de 1.a semana de doença,10 possuiam anticorpos em níveis dosá-veis, já na primeira amostra de soro.Destes, um foi positivo na prova de aglu-tinação e 5 na de FC' e 4 em ambas asprovas. A presença de anticorpos cir-culantes contra a B. pertussis nestes pa-cientes, pode ser devida a vacinação an-terior, parcial ou completa, a infecçõesprévias por essa bactéria, na forma clí-nica ou sub-clínica, com sintomatologiatípica ou atípica. Por outro lado, pode-

riam estar não na primeira semana dedoença, mas sim num estágio mais avan-çado.

Analisando a Tabela 7, verificamos quedos 46 casos estudados bacteriológica esorologicamente, 36 (78,3%) tiveram odiagnóstico de coqueluche confirmadoclinicamente e 10 (21/7%) não confirma-do. No laboratório, através dos examesbacteriológico e sorológico, dos 46 casos,28 (60,9%) foram diagnosticados comosendo de coqueluche e 18 (39,1%) apre-sentaram resultados negativos.

Dos 36 casos confirmados clinicamente,foram diagnosticados laboratorialmente,através do isolamento de B. pertussise/ou provas sorológicas de aglutinaçãoe/ou de FC', 26 (61,1%). Dos 10, cujo diag-nóstico não foi confirmado clinicamente,6 (60%) revelaram-se positivos pelas pro-vas sorológicas. Aplicado o teste estatís-tico de MacNEMAR45 (1960), observou-seque a diferença entre a positividade dodiagnóstico clínico e a dos exames bacte-riológico e/ou sorológico, levando-se emconta as discordâncias (Tabela 7), não foisignificante ao nível de 5%. Entretanto,salientamos que dos 36 casos confirma-dos clinicamente como sendo de coque-luche, 14 (38,9%) mostraram-se negativosnos exames bacteriológico e sorológico;dos 10 doentes que tiveram também odiagnóstico inicial de coqueluche, o qualnão foi confirmado clinicamente, 6(60,0%) foram positivos pelos examessorológicos. Estas observações revelama importância das provas bacteriológicae sorológica no diagnóstico de coquelu-che, pois, houve casos em que a confir-mação diagnóstica foi obtida apenasatravés das provas de laboratório, nocaso, as sorológicas.

Devemos salientar, no entanto, queessas provas laboratoriais, apresentam

algumas limitações. Com relação ao iso-lamento da B. pertussis, é sabido que osresultados podem ser obtidos já apósdois a três dias, ou após um período detempo maior. Segundo LAUTROP 40 (1960),devem ser realizados exames de pelomenos três amostras consecutivas dematerial, para se considerar o resultadocomo sendo negativo. Uma outra limi-tação é a fase da doença, relativamenteao isolamento da B. pertussis. Em nossoestudo já referimos que cerca de 80% doscasos examinados apresentavam-se nafase espasmódica, na qual a positividadeao isolamento de B. pertussis é maisbaixa. Nestes casos, em que a doença seapresenta já em fases mais avançadas,as provas sorológicas podem ter grandevalor diagnóstico, medindo-se a elevaçãodo título de anticorpos circulantes espe-cíficos. No entanto, às vezes pode haverdificuldade quanto a interpretação dosresultados. LAUTROP 40 (1960) comentaa esse respeito que, na maioria das vezes,os anticorpos aparecem na 3.a e 4.a sema-nas de doença, atingem o nível máximona 7.a e 8.a semanas, o qual depois dimi-nui. Nesta fase de declínio, pode havernova elevação do título de anticorposcirculantes contra a B. pertussis, devidaa estímulos inespecíficos decorrentes,por exemplo, de infecções por outrosagentes.

Na presente investigação, pareceu-nosconduta mais acertada, considerar a posi-tividade sorológica, apenas quando houveelevação de título de anticorpos de pelomenos 4 vezes. Isto porque, não estáestabelecido um nível mínimo de anti-corpos circulantes, de valor diagnóstico,o qual poderia ser determinado em umaúnica amostra de soro do doente, colhidaem época adequada. Em qualquer re-gião, porém, onde seja extensiva a prá-tica da vacinação contra a coqueluche, apresença de anticorpos no soro dodoente, observada através de uma única

determinação, poderia representar tantoinfecção presente, como infecção ou imu-nização anteriores.

Em nossa pesquisa, apesar de sersabido que o nível de anticorpos decresceapós a 7.a semana de doença, indivíduosque se apresentavam na 8.a semana oumais, mostraram ainda elevação dos títu-los de anticorpos contra a coqueluche.Houve casos, mesmo, em que a segundacoleta do sangue ocorreu na 13.a e 14.a

semanas de doença e ainda assim obser-vamos aumento dos títulos de anticorposcontra a B. pertussis.

Apesar das limitações apresentadas,relativas aos exames bacteriológico e so-rológico, na coqueluche, estes devem serrealizados, pois os seus resultados sãoimportantes, não só para os clínicos, mastambém à Saúde Pública.

Como já foi referido, segundo obser-vações mais recentes, pode haver casosapresentando sintomatologia de coque-luche, devidos a infecções por adeno-vírus (CHANY et al.14, 1958; FABER &VAWTER28, 1961; OLSON et al.40, 1964;COLLIER et al.16, 1966 e CONNOR40, 1970).Em vista disto, embora não fosse um dosnossos objetivos, no presente estudo,resolvemos determinar nas amostras desoro dos 46 casos referidos, o título deanticorpos fixadores de complementocontra adenovírus. Nestas dosagens, em-pregou-se a técnica de BRADSTREET &TAYLOR9 (1962) modificada, usada porCANDEIAS 12 (1968). Verificou-se que dos 46casos, 7 (15,2%) apresentaram elevaçãodo nível de anticorpos FC' somente con-tra adenovírus, 9 (19.6%) contra adenoví-rus e B. pertussis, nesta última pelasprovas de aglutinação e/ou FC' e 16(34,8%), unicamente contra a B. per-tussis; 14 casos (30,4%) não revelaramaumento do título de anticorpos contraambos os agentes.

Dos 16 casos em que se observou aelevação do nível de anticorpos FC'contra adenovírus, isolou-se de dois aB. pertussis e nestes casos o diagnósticoclínico de coqueluche foi também confir-mado. Dos 4 restantes, não se isolou a B.pertussis e destes, 7 revelaram elevaçãodo título circulante de anticorpos, unica-mente contra B. pertussis e 7 somentecontra adenovírus. Nestes dois gruposverificou-se nos prontuários que a con-firmação clínica do diagnóstico de co-queluche foi, respectivamente, de 85,7%,ou seja, em 6 casos cada.

Entretanto, dado o fato de não ter si-do examinado um grupo controle, nãonos é possível tirar conclusões sobre aparticipação de adenovírus no desenca-deamento da sintomatologia de coquelu-che, apresentada pelos doentes estuda-dos.

5. CONCLUSÕES

Segundo os resultados obtidos na pre-sente investigação e de acordo com adiscussão por nós desenvolvida, acredita-mos ter contribuído com algumas infor-mações a respeito da coqueluche em nos-so meio, sintetizadas nas conclusões quepassaremos a enumerar:

1. De 255 crianças apresentando sin-tomas de coqueluche, isolou-se a B. per-tussis de 55 (21,6%). Não foram isoladasestirpes das outras espécies de bactériasdo gênero Bordetella, ou sejam, B. para-pertussis e B. bronchiseptica.

2. De 129 doentes cujo diagnóstico decoqueluche foi confirmado clinicamente,a positividade do isolamento de B. per-tussis foi de 20,2% (26 casos). Dentre ospacientes referidos como se encontrandona primeira semana de doença, a positivi-dade foi de 40%, depois decresceu, atin-gindo 5,6% nos casos já na quinta oumais semanas. De 26 casos não confirma-

dos clinicamente, como sendo de coquelu-che, isolou-se a B. pertussis de dois(7,7%), dos que foram referidos como es-tando na primeira semana de doença.

3. Dos 46 casos estudados bacterioló-gica e sorologicamente, 36 (78,3%) tive-ram o diagnóstico confirmado clinica-mente. Destes, 22 (611%) revelaram re-sultados positivos nos exames bacterioló-gico e/ou sorológico. Nos 10 casos(21,7%) restantes, o diagnóstico inicial decoqueluche não foi confirmado clinica-mente, porém, 6 (60,0%) deles revelaramelevação do nível de anticorpos contra aB. pertussis, através das provas soroló-gicas. Portanto, dos 46 doentes, atravésdo exame bacteriológico e/ou das provassorológicas, de fixação de complementoe de aglutinação, foram diagnosticadoscomo sendo de coqueluche, 28 casos(60,9%).

4. Dos 46 doentes, cujos soros foramsubmetidos a provas sorológicas, 14 ca-sos (30,4%) revelaram elevação do nívelde anticorpos na prova de aglutinação e19 (41,3%), na de fixação de complemen-to. Oito casos (17,4%) foram positivosem ambas as provas; 6 (13,0%), somentena de aglutinação e 11 (23,9%), unicamen-te na de fixação de complemento. Estasobservações sugerem que a reação de fi-xação de complemento foi mais sensívelque a de aglutinação.

5. Os exames bacteriológico e soroló-gico mostraram-se elementos muito im-portantes no diagnóstico da coqueluche,pois, através deles, confirmaram-se, co-mo sendo desta doença, casos suspeitosque não haviam sido confirmados clini-camente. Quanto às provas sorológicas,acreditamos ser conveniente o empregoconcomitante da prova de aglutinação ede fixação de complemento. Note-se quepelas nossas observações, se tivéssemosrealizado apenas a prova de fixação decomplemento, teríamos obtido 19 casos

positivos, ao passo que o emprego de am-bas proporcionou a evidenciação de 25casos.

6. AGRADECIMENTOS

A todos que colaboraram, direta ou in-diretamente na realização desta pesquisa.

RSPU-B/194

IARIA, S. T. — [Isolation of bacteria of genus Bordetella and serologicalstudies in Brazilian children with symptoms of whoping-cough] Rev.Saúde públ., S. Paulo, 7:409-32, 1973.

SUMMARY: Cultures from cough plates and swabs were performed in 255children with whooping-cough symptoms, hospitalized at "Hospital de Iso-lamento Emilio Ribas" in S. Paulo. Complement fixation and agglutinationtests for Bordetella pertussis, agglutination tests for B. parapertussis andcomplement fixation test for adenovirus were performed in 46 children,using two blood samples taken one month apart; the isolation results forbacteria of genus Bordetella were correlated to the, period of illness, someof the major symptoms and the clinical diagnosis. A discussion of theefficiency and limitations of both bacteriological and serological tests in thelaboratory diagnosis is presented.

UNITERMS: Whooping-cough *; Laboratory, diagnosis *; Bordetella,isolation*; Serology (complement fixation and agglutination tests).

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Recebido para publicação em 17-9-1973

Aprovado para publicação em 9-10-1973