Universidade Federal de Goiás

Faculdade de Farmácia

ROSA MARIA DOS SANTOS

SAZONALIDADE DOS NUTRIENTES MINERAIS E DOS

FENÓIS EM FOLHAS DE Eugenia uniflora L.

Goiânia

2007

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ROSA MARIA DOS SANTOS

SAZONALIDADE DOS NUTRIENTES MINERAIS E DOS

FENÓIS EM FOLHAS DE Eugenia uniflora L.

Dissertação apresentada no Programa de Pós-graduação

em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da

Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para

a obtenção do Título de Mestre em Ciências

Farmacêuticas.

Área de concentração: Fármacos e medicamentos

Orientadora: Profa. Dra. Suzana da Costa Santos

Goiânia

2007

Agradeço a DEUS por toda minha vida, aos

meus queridos filhos Júnior e Natália e ao meu

marido Ramom, pela paciência, carinho,

compreensão, amor, apoio, amizade e confiança.

AGRADECIMENTOS

• À Profa. Dra. Suzana da Costa Santos pela orientação, amizade, dedicação,

apoio, compreensão, paciência e os conhecimentos a mim dados.

• Ao Prof. Dr. Pedro Henrique Ferri pela colaboração nas análises estatísticas.

• À Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos da UFG, em especial ao

Prof. Dr. Wilson Mozena Leandro, obrigado pela colaboração na análise

foliar.

• Aos técnicos do LASF, Elenilson e Carlinhos pela colaboração na análise

foliar.

• Ao Prof. Dr. Amarildo pelo auxílio com espectroscopia de absorção atômica.

• A todos os professores das disciplinas cursadas durante o curso.

• A Flávia minha colega de mestrado que me ajudou na análise multivariada e

teve muita paciência e carinho comigo.

• A Denise Oliveira Guimarães pela coleta, secagem e moagem das amostras.

• A Lorena da iniciação científica que me ajudou na rotaevaporação.

• Agradeço a minha família, pelo suporte e também pelo crédito que sempre

me concederam, pois neles encontrei força.

• Aos órgãos Capes, Funape, pelo suporte financeiro, gestão de recursos.

• Enfim, a todos que tornaram possível a conclusão deste projeto.

O Senhor produziu da terra os medicamentos; O homem sensato não os desprezará.

ECLESIÁSTICO 38, 4-8

Sumário

Resumo vii

Abstract viii

Lista de Figuras ix

Lista de Tabelas x

1. Introdução 1

1.1. As plantas medicinais 1

1.2. Eugenia uniflora 3

1.3. Compostos Fenólicos 6

1.4. Metabolismo vegetal 8

1.4.1 Biossíntese de compostos fenólicos 9

2. Objetivos 12

3. Materiais e Métodos 14

3.1. Material botânico e dados climáticos 14

3.2. Métodos de análise química 14

3.2.1. Extração para Fenóis 14

3.2.2. Extração para Análise Foliar 14

3.2.3. Ensaios para doseamento dos fenóis 15

3.2.3.1. Ensaio para Fenóis Totais 15

3.2.3.2 Ensaio para precipitação de proteínas (adstringência) 16

3.2.3.3 Ensaio para Taninos Hidrolisáveis 17

3.2.3.4 Ensaio para Flavonóides Totais 17

3.3. Análise estatística 18

4. Resultados 20

4.1. Dados Climáticos 20

4.2. Resultados da análise química 21

4.2.1. Análise foliar 21

4.2.2. Extratos liofilizados de folhas de E. uniflora 22

4.2.3. Ensaios para Fenóis 22

4.3. Analise estatística 23

5. Discussão 29

6. Conclusão 34

7. Referências Bibliográficas 36

8. Apêndices 43

Apêndice 1 43

Apêndice 2 44

vii

RESUMO

A pitangueira (E. uniflora, Myrtaceae) é usada contra diarréia, hiperglicemia e

hipertensão arterial. As atividades farmacológicas são devidas à presença de compostos fenólicos em suas folhas. Com a intenção de correlacionar os níveis de fenóis com os nutrientes foliares e as mudanças climáticas, folhas desta espécie foram coletadas mensalmente de dez/01 a dez/03 em Anápolis/GO. Extratos feitos com acetona:água foram analisados através de quatro ensaios para fenóis: fenóis totais-FT (FeCl3), taninos hidrolisáveis-TH (KIO3), flavonóides-F (AlCl3) e precipitação de proteínas-PP (ABS). Nutrientes foliares (N, P, K, S, Mg, Ca, Cu, Zn, Mn e Fe) foram determinados por espectroscopia de absorção atômica, fotometria de chama e ensaios colorimétricos. Os resultados dos ensaios para fenóis e a análise foliar junto com os dados climáticos foram analisados por métodos quimiométricos (Programas SPAD.N e SAS). A maioria dos dados, na análise de componentes principais (PCA), pôde ser representada nos três primeiros eixos, que contiveram 70,66 % da variância total (x = 31,38, y = 20,45 e z = 18,83 %). A PCA e análise de cluster demonstraram a existência de quatro grupos. O primeiro grupo (set/02-nov/02 e out/03-dez/03), constituído de folhas jovens, foi caracterizado por conter altos níveis de zinco (19,21 ± 1,23 mg/kg) e nitrogênio (3,75 ± 1,36 dag/kg), enquanto os níveis de todos os fenóis foram moderados. Os grupos II (dez/01-abr/02) e o grupo III (dez/02-abr/03) são ambos formados por amostras de folhas adultas e ocorreram na estação chuvosa, entretanto eles apresentaram comportamentos distintos. Enquanto o grupo II teve os níveis mais baixos de todos os fenóis (57,15 mg/g FT; 85,12 mg/g TH; 16,49 mg/g F; 24,55 mg/g PP) o grupo III apresentou os mais altos de todos os grupos (97,86 mg/g FT; 134,47 mg/g TH; 53,31 mg/g F; 44,55 mg/g PP). A grande diferença entre estes grupos pode ser observada nas concentrações de cobre e manganês, 8,9 e 21,4 mg/kg no grupo II e 5,8 e 13,2 mg/kg no grupo III, respectivamente. O último grupo (mai/02-ago/02 e mai/03-set/03), que consiste de folhas velhas da estação seca, foi caracterizado por conter altos níveis de ferro (499 mg/kg) e cálcio (4,58 dag/kg) e quantidades moderadas de todos os fenóis. A análise estatística sugere que altos níveis de todos os fenóis ocorrem principalmente quando os nutrientes foliares estão em concentrações baixas nas folhas, em especial os metais cobre e manganês, os quais são cofatores de enzimas envolvidas na degradação de fenóis e na biossíntese de ligninas.

viii

ABSTRACT

Pitangueira (E. uniflora, Myrtaceae) is used against diarrhoea, hyperglycemia

and hypertension. Pharmacological activities are due to the presence of phenolic compounds in leaves. In order to correlate levels of phenols with foliar nutrients and climatic changes, leaves were collected monthly from Dec/01 to Dec/03 in Anápolis/GO. Acetone:water extracts were analysed by four assays: total phenolics-TP (FeCl3), hydrolysable tannins-HT (KIO3), flavonoids-F (AlCl3) and protein precipitation-PP (BSA). Foliar nutrients (N, P, K, S, Mg, Ca, Cu, Zn, Mn and Fe) were determined by colorimetric assays and flame atomic absorption and emission spectrometry. Results from phenolic assays and foliar nutrients together with climatic data were analysed by chemometric methods (program SPAD.N). The majority of the data, in the principal components analysis (PCA), could be represented in three main axes, which contained 70.66 % of total variance (x = 31.38, y = 20.45 and z = 18.83 %). PCA and Cluster analysis demonstrated the existence of four groups. The first group (Set/02-Nov/02 and Out/03-Dec/03), constituted of young leaves, was characterized by higher levels of zinc (19.21 mg/Kg) and nitrogen (3.75 dag/Kg) and moderate levels of all phenols. Group II (Dez/01-Apr/02) and Group III (Dez/02-Apr/03) were both constituted of samples with adult leaves and from the rainy season, however they had opposite behaviour. While group II presented the lowest levels of all phenols (57.15 mg/g TP; 85.12 mg/g HT; 16.49 mg/g F; 24.55 mg/g PP) group III showed the highest ones (97.86 mg/g TP; 134.47 mg/g HT; 53.31 mg/g F; 44.55 mg/g PP). The strong difference between these groups can be explained by the concentrations of Cu and Mn, 8.9 and 21.4 mg/Kg in group II and 5.8 and 13.2 mg/Kg in group III, respectively. The last group (Mai/02-Ago/02 and Mai/03-Set/03), which comprised samples of mature leaves from dry season, was characterised by higher levels of Fe (499 mg/Kg) and Ca (4.58 dag/Kg) and moderate levels of all phenols. The statistical analysis suggested that higher levels of all phenols occur mainly when foliar nutrients are lower in leaves, in particular Cu and Mn, which are enzymes cofactors involved in phenol degradation and lignin biosynthesis.

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Árvore de Eugenia uniflora adulta com flores e frutos em detalhe. 3

Figura 2 Estrutura de dois exemplos de taninos hidrolisáveis isolados de folhas de E. uniflora.

5

Figura 3 Exemplos das duas classes de taninos, condensados e hidrolisáveis. 6

Figura 4 Esquema de biossíntese de compostos fenólicos, no metabolismo das plantas.

10

Figura 5 Dados climáticos de temperatura e umidade, fornecidos pela Base Aérea de Anápolis correspondentes ao período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003, época das coleta das folhas de E. uniflora.

20

Figura 6 Dados climáticos de precipitação, fornecidos pela Base Aérea de Anápolis correspondentes ao período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003, época das coleta das folhas de E. uniflora

20

Figura 7 Média das concentrações dos macronutrientes (P, K, S, Mg, Ca e N em dag/Kg) em folhas de E. uniflora no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.

21

Figura 8 Média das concentrações dos micronutrientes (Cu, Zn, Mn e Fe em mg/Kg) em folhas de E. uniflora no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.

22

Figura 9 Teores médios (mg/g) dos ensaios espectrofotométricos de fenóis totais (FT), adstringência (PP), taninos hidrolisáveis (TH) e flavonóides totais (F) em folhas de E. uniflora no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.

23

Figura 10 Distribuição dos nutrientes minerais, fenóis e dados climáticos das amostras de folhas de E. uniflora agrupadas em quatro Clusters: I (♦), II (�), III (�) e IV (�), com o maior componente discriminante representado pelos vetores. aEixos referentes aos scores das amostras. bEixos referentes aos scores dos componentes, as variáveis discriminantes estão representadas pelos vetores.

24

Figura 11 Dendograma representando os agrupamentos hierárquicos das amostras de folhas de E. uniflora, relacionando os dados climáticos, nutrientes minerais e teores fenóis formados com a distância Euclidiana das amostras de acordo com o Método de Variância Mínima de Ward.

25

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Médias dos resultados dos ensaios de fenóis, análise foliar e dados climáticos para cada grupo obtido na análise de cluster e análise de variância.

26

Tabela 2 Sumário da Análise de Correlação Canônica dos fenóis e os nutrientes foliares.

27

Introdução

1. INTRODUÇÃO

1.1. As plantas medicinais

O uso de plantas no tratamento e na cura de enfermidades é tão antigo

quanto à espécie humana. Ainda hoje nas regiões mais pobres do país e até mesmo

nas grandes cidades brasileiras, plantas medicinais são comercializadas em feiras

livres, mercados populares e encontradas em quintais residenciais (MACIEL et al.,

2002).

O homem primitivo já fazia uso das plantas tanto para se alimentar como para

outras finalidades tais como perfumar o corpo ou o ambiente, untar-se para afastar

os insetos, curar-se de indisposições e ferimentos e também para expandir a

consciência buscando sensações diferentes da realidade do dia a dia. Foi

aprendendo a identificar as plantas e suas propriedades pela necessidade e pela

capacidade de reter e relacionar experiências (TORIANI, 2006).

No caso de plantas com propriedades terapêuticas, estas foram, na sua

grande maioria, descobertas empiricamente. Com base nestes conhecimentos

acumulados pela medicina popular, foram desenvolvidos alguns dos mais valiosos

medicamentos utilizados na medicina científica, como os digitálicos, a quinina, a

morfina, a atropina, etc. Atualmente são utilizados mais de 120 fármacos obtidos por

extração direta do vegetal, sendo em sua maioria antiinflamatórios, analgésicos,

vitaminas, hormônios e substâncias ativas no sistema nervoso central (SCHENKEL,

GOSMANN & PETROVICK, 2001).

As plantas medicinais têm sido usadas como forma alternativa ou

complementar a terapia convencional no tratamento de várias doenças. Dentre as

inúmeras vantagens está o largo uso terapêutico, baixo custo, facilidade em

obtenção para a população de baixa renda (CALIXTO, 2000), ser uma fonte

renovável e em grande parte controlada pelo homem que se livra do poder das

substâncias sintéticas e se cura sem agredir seu organismo.

As plantas contêm propriedades diversas de acordo com os seus princípios

ativos. Estes princípios não são estáveis e nem se distribuem de maneira

homogênea na planta. Estas substâncias podem se concentrar nas raízes, rizomas,

talos, caules, folhas, sementes ou flores. Seu teor também varia de acordo com a

época do ano, solo e clima onde a planta se desenvolve (TAIZ & ZEIGER, 1998).

2

Elas sintetizam vários compostos biologicamente ativos, que na maioria das

vezes, são produtos do metabolismo secundário e estão relacionados à interação da

planta com o ambiente (HARBORNE, 1988). Essa ampla diversidade de metabólitos

secundários está relacionada com diferentes atividades biológicas, justificando a

necessidade de um aprofundamento no conhecimento das propriedades das

espécies vegetais e sua utilização na formulação de medicamentos.

O homem sempre experimentou, conheceu, usou e passou às novas gerações

o jeito de curar-se pela natureza. Embora, por um bom período a sociedade não se

importou em passar estes conhecimentos elementares, hoje a população passa por

um período de resgate destes conhecimentos e esta sabedoria milenar vem

contribuindo enormemente para a recuperação da saúde, justamente numa época

de efervescência de alta tecnologia em todos os campos inclusive na área da saúde.

A Organização Mundial de Saúde (OMS) tem-se mostrado muito interessada

nos sistemas terapêuticos indígenas, especialmente nos que usam medicamentos

vegetais. É fato que 80% da população do planeta utilizam medicamentos à base de

plantas, destes apenas 30% tem indicação médica (MACIEL et al., 2002). A OMS

acredita que com o adequado estudo e desenvolvimento destes sistemas, propiciaria

que melhores cuidados de saúde possam ser alargados a todos.

Neste contexto o Brasil é um país privilegiado, tem a maior diversidade

genética vegetal do mundo, ocupa o primeiro lugar em biodiversidade, detém cerca

de 23 % do total de espécies existentes no planeta (RATES, 2001), com cerca de

55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 a 550.000

espécies, possui ampla tradição no uso das plantas medicinais, vinculada ao

conhecimento tradicional (popular), transmitido oralmente por gerações, além de

tecnologia para validar cientificamente este conhecimento (TOLEDO, 2002). A flora

medicinal brasileira constitui um arsenal terapêutico de enorme importância. Temos

cerca de 590 plantas registradas no Ministério da Saúde Brasileiro para

comercialização.

Nas últimas décadas um grande número de pesquisadores passou a se

interessar pela pesquisa de fitoterápicos. Este grande influxo nesta área propiciou o

aparecimento de novas bibliografias, com informações importantes do universo das

plantas medicinais.

3

1.2. Eugenia uniflora

A espécie botânica Eugenia uniflora L (Figura 1), conhecida como pitangueira,

pertence à Família Myrtaceae. Esta é uma das mais importantes famílias da flora

brasileira, com 23 gêneros e aproximadamente 1000 espécies. Possui uma

diversidade de espécies com aplicações medicinais já estudadas. Dentre elas,

espécies do gênero Eugenia possuem atividade na medicina popular e algumas já

foram estudadas em pesquisas científicas.

Eugenia uniflora L. é uma árvore de altura de 6-12 m, dotada de copa mais ou

menos piramidal. Tronco tortuoso e um pouco sulcado, de 30-50 cm de diâmetro,

com casca descamante em placas irregulares. Folhas simples, levemente discolores,

glabras, brilhantes na face superior, de 3-7 cm de comprimento por 1-3 cm de

largura. Flores solitárias ou em grupos de 2-3 nas axilas da extremidade dos ramos.

Fruto drupa globosa achatada e sulcada, glabra, brilhante, vermelha, amarela ou

preta quando madura, de polpa carnosa e comestível, contendo 1-2 sementes.

Floresce durante os meses de agosto-novembro e os frutos amadurecem em

outubro-janeiro (LORENZI, 1998). A fruta conhecida como pitanga é utilizada na

alimentação.

Figura 1 – Árvore de Eugenia uniflora adulta com flores e frutos em detalhe.

Ocorre naturalmente desde Minas Gerais até o Rio Grande do Sul na floresta

semidecídua do planalto e da bacia do rio Paraná (LORENZI, 1998). Sua distribuição

é muito ampla, ocorrendo em vários países da América do Sul, tais como Argentina,

4

Uruguai e Paraguai, além de países da Ásia tais como Índia, Ceilão e sul da China

(LEE et al.,1997).

A pitangueira é utilizada tradicionalmente em medicina popular. O decocto ou

infusão das folhas são usados como hipotensor e diurético (CONSOLINI et al.,

1999), no tratamento de problemas digestivos, como adstringente, antipirético e anti-

reumático (ALICE et al., 1991).

Pesquisas recentes, utilizando testes in vitro e in vivo, demonstraram que a

Eugenia uniflora possui várias atividades farmacológicas, tais como: ação

antiinflamatória e analgésica (SCHAPOVAL et al., 1994), ação antidiarréica pela

inibição do trânsito gastrointestinal, aumento da absorção de água em partes do

intestino e aumento nas contrações do músculo duodenal (SCHAPOVAL et al.,

1994; ALMEIDA et al., 1995; GBOLADE et al., 1996), ação carminativa (LEE et al.,

1997).

A atividade hipotensora foi confirmada e está relacionada à ação

vasodilatadora de vasos resistentes e aumento da diurese (CONSOLINI et al., 1999;

MORIOKA et al., 2000; CONSOLINI & SARUBIO, 2002). Outros estudos

demonstraram que o extrato hidroalcóolico das folhas de E. uniflora produz um

relaxamento dos anéis da aorta (WAZLAWICK et al, 1997).

A inibição do aumento de glicose e triglicerídeos plasmáticos foram

comprovadas em ratos tratados com diferentes frações do extrato etanólico de E.

uniflora (ARAI et al., 1999), a atividade antidiabética foi confirmada e está

relacionada com a inibição da alfa-glucosidase pelas uniflorinas isoladas do extrato

aquoso de folhas de E. uniflora (MATSUMURA et al., 2000).

O fracionamento biodirecionado do extrato de folhas de E. uniflora utilizando

ensaios in vitro com EBV DNA polimerase, enzima responsável pela replicação do

vírus Epstein-Barr, mostrou alta atividade inibitória para os elagitaninos presentes

nesta planta, sendo que eugeniflorina D-1 e D-2 foram as mais potentes (LEE et al.,

2000). Este vírus esta relacionado com o desenvolvimento do carcinoma

nasofaríngeo e o linfoma African Burkitt.

Outras atividades tais como: tripanossomicida (ADEWUNMI et al., 2001),

ação contra infecções intestinais causadas por S. aureus e E. coli (HOLETZ et al.,

2002), ação antifúngica (SOUZA et al., 2002), tratamento de diabetes e gota

(AURICCHIO & BACCHI, 2003) e ação contra Paracoccidioides brasilienses

(SANTOS et al., 2004), também foram comprovadas para esta planta.

5

Compostos encontrados nesta planta incluem os flavonóides mircitina,

quercetina, quercetin-3-ramnoglucosídio, esteróides e/ou triterpenóides, compostos

mono e triterpênicos, antraquinonas e fenóis (SCHMEDA-HIRSCHMANN et al.,

1987; ALICE et al., 1991; WAZLAWICK et al., 1997). Os óleos essenciais das folhas

também foram investigados e seus constituintes principais são: furanodieno, selina-

13711-tien-8ona e oxidoselina-13711-tien-8ona (HENRIQUES et al., 1993).

Estudos realizados com Eugenia uniflora mostraram que suas folhas são ricas

em taninos hidrolisáveis, sendo que os compostos isolados e identificados foram os

elagitaninos macrocíclicos Oenotheina B, Eugeniflorina D1 e Eugeniflorina D2, o

galoil éster 1,2,4,6-tetra-O-galoil-α-D-glucose, a proantocianidina monomérica

galocatequina e o flavonóide glicosídico mircetin-3-O-ramnoglucosidio (LEE et al.,

1997).

O elagitanino Oenotheina B (Figura 2) foi isolado primeiro da Oenothera

species (LEE, et al.,1997) e apresentou marcante atividade antiviral, inibindo a

proliferação do vírus herpes simplex (HSV-1 e HSV-2) em testes realizados in vitro

(FUKUCHI et al., 1989).

1'

4''

6''

2''

6'

5'4'

3'2'

1'

5

432

1

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3

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4

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6'

2'

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4'

HO

HO

O

O

Oenotheina B R= OH Eugeniflorina D1 R= Ogaloil

Figura 2 - Estrutura de dois exemplos de taninos hidrolisáveis isolados de folhas de E.

uniflora.

Pesquisas in vitro mostraram as várias atividades farmacológicas da

Oenoteína B, tais como: potente supressor do gene responsável pelo tumor viral na

mama de ratas (AOKI et al., 1995), hiperplasia prostática (DUCREY et al., 1997),

ação antimicrobiana (SOUZA et al., 2004), citotoxidade em culturas de células

tumorais (WANG et al., 1999), atividade citotóxica (SAKAGAMI et al., 2000), ação

antitumoral (NOMURA et al., 2005) e inibição da metallopeptidase-neural

6

endopeptidase (KISS et al., 2004 e 2006).

Em alguns casos esta atividade é exercida através da potencialização da

defesa imune do hospedeiro pela ativação dos macrófagos e indução da produção

de interleucinas (MIYAMOTO et al., 1997). A atividade anticancerígina também é

devida à inibição da mutagenicidade e inibição da fase de promoção do tumor

(MIYAMOTO et al., 1997; NOMURA et al., 2005).

No caso de hiperplasia e próstata, este elagitanino age inibindo a

proliferação celular, provavelmente através da inibição de enzimas metalopeptidases

(KISS et al., 2004 e 2006), 5-α-redutase e aromatase (DUCREY et al., 1997). A alta

atividade citotóxica observada para esta substância contra células de tumores orais

humanos e de glândulas salivares, pode ser explicada pela indução de apoptose

destas células (SAKAGAMI et al., 2000).

1.3. Compostos Fenólicos

Os fenóis formam um grupo de compostos frequentemente presentes no

nosso dia a dia. O sabor, o odor e a coloração de diversos vegetais que apreciamos

são gerados por esses compostos. Eles não são apenas atrativos para nós, mas

também para outros animais, os quais são atraídos para polinização ou dispersão de

sementes. Além disso, esse grupo de compostos é importante para proteger as

plantas contra: radiação UV, herbívoros e microorganismos patogênicos

(HARBORNE, 1988). Há inclusive certas espécies vegetais que desenvolveram

compostos fenólicos para inibir o crescimento de outras plantas competidoras (ação

alelopática).

Além de sua importância na proteção das plantas contra fatores ambientais e

bióticos adversos, acredita-se que os compostos fenólicos tenham sido

fundamentais para a própria conquista do ambiente terrestre pelas plantas. Esse é o

caso da lignina, a qual proporciona o desenvolvimento do sistema vascular, dando

rigidez aos vasos (TAIZ & ZEIGER, 1998).

Quimicamente dizendo, os chamados compostos fenólicos são substâncias

que possuem pelo menos um anel aromático no qual no mínimo um hidrogênio é

substituído por um grupamento hidroxila. Esses compostos podem ser agrupados

em várias classes, tais como: taninos, flavonóides, cumarinas, lignanas e ligninas.

Os taninos são substâncias fenólicas de alto peso molecular, que apresentam

a habilidade de formar complexos insolúveis em água com alcalóides, gelatinas e

7

outras proteínas (HASLAM et al., 1989). Eles são importantes compostos gustativos,

sendo responsáveis pela adstringência de muitos frutos e produtos vegetais.

Os taninos representam o quarto mais abundante constituinte vegetal, depois

da celulose, da hemicelulose e da lignina. As plantas que contêm altos níveis de

taninos apresentam vantagem evolucionária significativa sobre seus predadores e

outras espécies vegetais, que competem pelo mesmo nicho (SCALBERT, 1991).

Segundo sua estrutura química os taninos são classificados em dois grupos:

taninos hidrolisáveis e taninos condensados (Figura 3). Ambos são encontrados na

forma de monômeros, oligômeros e polímeros, sendo que as propriedades de

adstringência são comuns para as duas classes (MELLO & SANTOS, 2001).

O

OH

O

OH

OH

HO

OH

OH

OH

OH

OH

HO

tanino condensadotanino hidrolisável (elagitanino)

OH

HO

OO

O

O

O

O

OH

OH

HO

HO

HO

HO

OH

O

HO

O

OH

OHHO

O

Figura 3 - Exemplos das duas classes de taninos, condensados e hidrolisáveis.

Os taninos possuem três características principais, que estão relacionadas às

suas atividades biológicas e farmacológicas. A primeira é a sua capacidade de

complexar com proteínas. No processo de transformação da pele animal em couro,

os taninos atuam formando complexos com a proteína colágeno, assim produzindo

um material resistente e durável. No processo de cicatrização de feridas,

queimaduras e inflamações cutâneas também ocorrem a complexação dos taninos

com proteínas e/ou polissacarídeos presentes na pele, formando assim uma camada

protetora contra o ataque de microrganismos. Sob esta camada ocorre então o

processo de cura. Um processo similar provavelmente ocorre no trato digestivo,

onde os taninos formam uma camada, através da complexação com proteínas

digestivas, que protege a mucosa contra toxinas e outros irritantes (HASLAM et al.,

1989). Esses dados podem explicar o uso de plantas ricas em taninos no tratamento

de feridas, queimaduras, inflamações e úlceras gastrointestinais.

A segunda característica é a capacidade de complexação com íons metálicos

como: ferro, manganês, vanádio, cobre, alumínio, cálcio e outros (HASLAM, 1996).

8

Os taninos sempre foram identificados pela formação de uma coloração azul escura

ou verde quando estes entram em contato com sais de ferro. Esta propriedade tem

sido amplamente usada na fabricação de tintas de escrever. Já foi proposto e

comprovado (MILA et al., 1996) que esta capacidade de complexar com ferro (III)

leva a uma limitação no crescimento de microrganismos, como bactérias e fungos.

Taninos podem seqüestrar outros metais, tais como cobre (II) e zinco (II), que

também são essenciais para o crescimento destes microrganismos.

A terceira característica dos taninos é a sua atividade antioxidante e

seqüestradora de radicais livres. Testes in vitro demonstraram que fenóis e

polifenóis inibem a peroxidação de lipídeos e lipoxigenases, assim como possuem a

habilidade de seqüestrarem radicais livres como: hidroxil, superperóxido e peroxil

(HASLAM, 1996). Alguns taninos apresentam atividade in vitro contra diversos tipos

de tumores (OKUDA et al., 1989). Esta atividade pode estar ligada à ação

antioxidante e sequestradora de radicais livres que estas substâncias apresentam.

Os taninos como outros metabólitos secundários variam em sua concentração

nas diversas partes da planta, tais como folhas, flores, casca, tronco e raiz. Esta

variação está relacionada à biossíntese desses metabólitos, seu destino e utilização

dentro da planta. Também ocorre variação nos teores em diferentes estações do

ano, dependendo da época de floração e frutificação e de fatores climáticos, como

pluviosidade, luminosidade e umidade relativa do ar (SANTOS et al., 2006;

SALMINEN et al., 2001 e 2004; SCOGINGS et al., 2004; CLOSE et al., 2001;

GLYPHIS & PUTTICK, 1988; HATANO et al., 1986). Com isso é necessário um

acompanhamento da variação dos teores de taninos para se conhecer a dinâmica

de cada espécie e sua adaptação para as diferentes condições climáticas.

1.4. Metabolismo vegetal

O metabolismo vegetal constitui um conjunto de reações químicas que

ocorrem nas células vegetais. Essas reações visam à produção dos constituintes

químicos das plantas. Primeiramente são sintetizados os compostos necessários

para o crescimento e desenvolvimento das espécies vegetais, tais como açúcares,

aminoácidos, ácidos graxos, nucleotídeos e seus polímeros derivados, que

corresponde ao metabolismo primário das plantas. Os compostos sintetizados por

outras vias fazem parte do metabolismo secundário, que são denominados

compostos secundários. Geralmente estes produtos, que apresentam as

9

substâncias ativas, não se encontram na planta em estado puro, mas sob a forma de

complexos, cujos diferentes componentes se completam e reforçam sua ação sobre

o organismo (DI STASI, 1996).

O metabolismo secundário não é necessário para o crescimento e

desenvolvimento do indivíduo, mas é essencial para a sobrevivência e continuidade

da espécie dentro do ecossistema. Portanto o metabolismo secundário é

responsável pelas relações entre o indivíduo e o ambiente onde ele se encontra e,

por causa do seu caráter adaptativo, pode ser manipulado geneticamente. O fato de

o metabolismo secundário ser regido pelo código genético, e este interagir com o

ambiente, tem grande importância na produção de plantas medicinais, pois a

qualidade do produto final é fortemente influenciada pelas técnicas de cultivo

adotadas em sua produção e pelas características genéticas da população sob

cultivo (REIS & MARIOT, 2001). Existem três grandes grupos de metabólitos

secundários: terpenos, compostos fenólicos e alcalóides.

1.4.1 Biossíntese de compostos fenólicos

Através do metabolismo da glicose são formados praticamente todos os

metabólitos primários e secundários. No metabolismo secundário a glicose é

convertida em moléculas de ácido pirúvico que podem seguir duas vias diferentes.

Na primeira, moléculas de piruvato entram na via do ácido chiquímico que é formado

pela condensação do fosfoenolpiruvato com a eritrose-4-fosfato dando origem aos

taninos hidrolisáveis, fenilpropanóides e aminoácidos aromáticos. Na segunda, o

piruvato continua sendo oxidado até a formação de moléculas de acetil-coenzima a

(acetil-coa) originando os aminoácidos alifáticos e os alcalóides derivados dele,

terpenóides, esteróides, ácidos graxos e triglicerídeos (Figura 4).

A junção do ácido chiquímico com uma molécula de fosfoenolpiruvato forma

o ácido corísmico que gera os aminoácidos aromáticos (triptofano, fenilalanina e

tirosina) que são os precursores de vários alcalóides. Um dos primeiros grupos de

compostos fenólicos formados a partir do ácido corísmico são os fenilpropanóides

que são os precursores da lignina.

A biossíntese dos taninos hidrolisáveis difere dos outros fenilpropanóides

(ligninas, flavonóides e taninos condensados) no fato desses compostos serem

formados no início da via do ácido chiquímico, através do ácido gálico, antes da

formação da fenilalanina (OSSIPOV et al, 2003; NIEMETZ & GROSS, 2005). Em

10

contraste, este aminoácido aromático é utilizado na biossíntese dos outros

fenilpropanóides (Figura 4), competindo assim diretamente com a síntese de

proteínas (HAUKIOJA et al., 1998).

A combinação de uma unidade do ácido chiquímico e uma ou mais unidades

do acetato ou derivados destes, poderá resultar na produção de antraquinonas,

flavonóides e dos taninos condensados.

A principal enzima da via do ácido chiquímico é a fenilalanina amônio-liase

(PAL), que retira o grupo amino da fenilalanina formando o ácido cinâmico. Entre as

substâncias formadas logo após a ação da PAL estão as ligninas (Figura 4). Esta

enzima está no limite entre o metabolismo primário, síntese de proteínas, e o

secundário.

Várias outras enzimas também estão envolvidas na biossíntese de compostos

fenólicos e muitas necessitam de metais como co-fatores, por isso para o bom

funcionamento desta via é vital o suprimento adequado de micronutrientes, que

entram como catalisadores de inúmeras reações bioquímicas (YAMADA, 2004).

Figura 4 – Esquema de biossíntese de compostos fenólicos, no metabolismo das plantas.

Eritrose -4-fosfato +

Fosfoenolpiruvato

Ácido desidrochiquímico

Ácido chiquímico

Ácido gálico Taninos

hidrolisáveis

Fenilalanina Proteínas

Ligninas Cumarinas Flavonóides Taninos condensados Acetil-CoA

Objetivos

2. OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivo estudar a influência dos nutrientes

minerais foliares, e também os fatores climáticos na concentração dos compostos

fenólicos em folhas de Eugenia uniflora.

Material e Métodos

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Material botânico e dados climáticos

As folhas de Eugenia uniflora foram coletadas mensalmente de uma única

planta na cidade de Anápolis em Goiás (latitude 16º 20’ 12,8’’ e longitude 48º 56’

19,3’’) no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003, totalizando 25 meses.

A árvore foi plantada em 1987, tem cerca de 6 m de altura e pertence à variedade

“pitanga vermelha”. Foram coletadas folhas saudáveis nos quatro quadrantes da

árvore, em várias alturas. As amostras foram identificadas pelo Prof. Heleno D.

Ferreira do departamento de Biologia Geral/UFG. Uma exsicata foi depositada no

herbário da UFG sob o código UFG-25477.

Os dados climáticos mensais (temperatura média, precipitação e umidade

relativa do ar) do período em estudo foram cedidos pela Base Aérea de Anápolis,

Ministério da Aeronáutica.

Após a coleta, as folhas foram dessecadas à temperatura ambiente e ao

abrigo da luz solar. Em seguida, todo o material foi moído separadamente em

moinho de faca com granulação definida e conservado em freezer a -18ºC até o

momento da produção dos extratos.

3.2. Métodos de análise química

3.2.1. Extração para Fenóis

As extrações foram feitas em mesa de agitação, onde 10 g do material seco

de cada mês foram extraídos com solução de acetona 70% durante 10 minutos,

seguido de filtração (HAGERMAN, 1998). O procedimento foi repetido por quatro

vezes e os extratos foram agrupados e evaporados a vácuo em evaporador

rotatório, mantendo a temperatura entre 35 e 40ºC. O precipitado contendo clorofilas

e graxas foi separado por filtração a vácuo. A água restante foi liofilizada sobrando

apenas o extrato liofilizado, que foi usado para os ensaios de doseamento dos

fenóis.

3.2.2. Extração para Análise Foliar

As extrações foram feitas por digestão nitro-perclórica, onde 0,5 g de folha

seca e moída foram transferidas para tubos de ensaio e adicionou-se 6 mL da

15

solução nitro-perclórica (mistura de ácido nítrico e ácido perclórico na proporção de

2:1 v/v). Estas amostras foram levadas ao banho de óleo, a temperatura aumentada

gradativamente até atingir 130ºC, e mantida nessa temperatura até o volume ser

reduzido pela metade. Após esta etapa, a temperatura foi aumentada até atingir

180ºC e foi conservada até obtenção de fumos brancos de HClO4 e o extrato se

tornar incolor. Após a solução esfriar, foi transferida para balão volumétrico de 50 mL

com porções de água destilada até completar o volume. Esses extratos foram

usados para determinação de P, K, Ca, Mg, S, Cu, Fe, Mn e Zn.

Os extratos da digestão nitro-perclórica e amostras das folhas trituradas

e moídas (realização da digestão sulfúrica e determinação de Nitrogênio) foram

encaminhados ao laboratório de análise de solos e foliar, da Escola de Agronomia

da Universidade Federal de Goiás (LASF-EA/UFG), para análise foliar

(MALAVOLTA, VITTI & OLIVEIRA, 1989).

3.2.3. Ensaios para doseamento dos Fenóis

Os extratos liofilizados foram submetidos aos ensaios de quantificação de

fenóis totais, adstringência, taninos hidrolisáveis e flavonóides totais.

Os resultados obtidos em absorbância em cada ensaio foram transformados

através das equações das retas para concentrações do padrão nas amostras em

mg/mL. Para os cálculos do teor do padrão equivalente em mg/g na folha seca foi

usada a seguinte fórmula:

Teor (%) = Conc. do padrão (eq.) na amostra x peso do extrato seco x 1000

Conc. Extrato _ Peso da folha

3.2.3.1. Ensaio para Fenóis Totais

Os extratos liofilizados foram quantificados pelo método de Hagerman-Butler

(MOLE & WATERMAN, 1987). Neste método todos os fenóis são doseados via

complexação desses com cloreto férrico e produção de coloração que é medida a

510nm.

Técnica: Uma solução de concentração de 1,0 mg/mL foi preparada com o

extrato liofilizado usando água destilada. Uma alíquota de 1,0 mL desse extrato

aquoso foi colocada em um tudo de ensaio e adicinado 2,0 mL de solução lauril

sulfato de sódio/trietanolamina (1% de p/v de lauril sulfato de sódio e 5% v/v de

16

trietanolamina) e 1,0 mL de solução de cloreto férrico (1,62g de cloreto férrico em 1

litro de ácido clorídrico 0,01 mol/L). As soluções foram misturadas imediatamente em

vortex. Entre 15 e 30 minutos a absorbância foi medida a 510 nm. Todos os extratos

foram analisados em triplicata. O espectrofotômetro foi calibrado com uma “solução

branco”, que continha solução de lauril sulfato de sódio/trietanolamina (2,0 mL) e

FeCl3 (1,0 mL), antes da leitura das amostras. As medidas foram feitas dentro dos

limites de absorção: 0,1< A< 2,0.

A curva padrão foi feita com ácido tânico (Merck) nas diluições de 0,1; 0,2; 0,4;

0,5; 0,7 e 0,8 mg/mL. O coeficiente de correlação foi de R = 0,9995 e a equação da

reta obtida y = 2,4068x + 0,0003.

3.2.3.2 Ensaio para precipitação de proteínas (adst ringência)

Os extratos liofilizados foram doseados pelo método de Hagerman-Butler

(WATERMAN & MOLE, 1994). Os taninos são complexados com a albumina bovina

sérica, e foram separados dos outros fenóis por centrifugação, o precipitado é

dissolvido com detergente e os taninos são doseados com cloreto férrico que produz

uma coloração medida a 510 nm.

Técnica: Soluções de concentrações de 2,5 mg/mL e 3,5 mg/mL foram

preparadas com o extrato liofolizado usando água destilada. Uma alíquota de 1,0 mL

desse extrato aquoso foi colocada em um tubo de ensaio e adicionado 2,0 mL de

solução de albumina bovina (BSA; fração V, Sigma), preparada em solução tampão

de acetato 0,2 M, pH = 4.9, contendo cloreto de sódio 0,17 M, em cada tubo. A

solução foi misturada e deixada em repouso por 15 minutos à temperatura ambiente

para que o precipitado fosse formado. Em seguida, centrifugada em velocidade

máxima (3000 rpm) por 15 minutos e descartado o sobrenadante. O precipitado foi

dissolvido em 4,0 mL de solução de lauril sulfato de sódio/trietanolamina/isopropanol

(1% de p/v de lauril sulfato de sódio e 5% v/v de trietanolamina e 20% v/v de

isopropanol) e adicionado 1,0 mL de solução de cloreto férrico (1,62g de FeCl3 em 1

litro de ácido clorídrico 0,01M) homogenizada a mistura. Entre 15 a 30 minutos

depois foi feita à leitura da absorbância em 510 nm. Todos os extratos foram

analisados em triplicata. O espectrofotômetro foi calibrado com uma “solução

branco”, que continha solução de lauril sulfato de sódio/trietanolamina /isopropanol

(4,0 mL) e FeCl3 (1,0 mL), antes da leitura das amostras.

17

A curva padrão foi feita com ácido tânico (Merck) nas diluições de 0,3; 0,4; 0,5;

0,6 e 0,8 mg/mL. O coeficiente de correlação foi de R = 0,9953 e a equação da reta

obtida y = 2,07562 x -0,30376.

3.2.3.3 Ensaios para Taninos Hidrolisáveis

Os extratos liofilizados foram doseados pelo método do iodato de potássio

(WILLIS & ALLEN, 1998). Taninos hidrolisáveis formam complexo colorido com

solução aquosa de KIO3 a 2,5%.

Técnica: Uma solução de concentração de 4,0 mg/mL foi preparada com o

extrato liofilizado usando água destilada. Em um banho de água a 25ºC são

colocados tubos de ensaio contendo 5,0 mL de solução de iodato de potássio a

2,5% m/v. Esperou 10 minutos (para equilibrar a temperatura) e adicionou-se 1,0 mL

do extrato aquoso da amostra, misturou em vortex e colocou o tubo de volta no

banho. Após passar o “tempo ótimo” que foi de 5 minutos mede-se a absorbância

em 550 nm. Todos os extratos foram analisados em triplicata. O espectrofotômetro

foi calibrado, antes da leitura das amostras, com uma “solução branco” de iodato de

potássio. A curva padrão foi feita com ácido tânico (Merck) nas diluições de 0,8; 1,2;

1,6; 2,0; 2,4 e 2,8 mg/mL O coeficiente de correlação foi de R = 0,9993 e a

equação da reta obtida y = 0,242529x – 0,36715.

O ‘‘tempo ótimo’’ é determinado para cada tipo de material vegetal analisado

através da reação entre KIO3 e os taninos hidrolisáveis. O ensaio é feito com várias

amostras do mesmo material na mesma concentração. Leituras são feitas em

intervalos de 1 minuto no espectrofotômetro. O tempo ótimo é onde ocorre o máximo

de absorbância. No caso da E. uniflora este tempo foi de 5 minutos.

3.2.3.4 Ensaios para Flavonóides Totais

Os extratos liofilizados foram doseados pelo método adaptado do descrito na

Farmacopéia Helvética, 1990 (PETRY et al., 1998). Os flavonóides são complexados

com cloreto de alumínio.

Técnica: Uma solução de concentração de 2,0 mg/mL foi preparada com o

extrato liofilizado usando água destilada. Uma alíquota de 10,0 mL desse extrato

aquoso foi transferido para um balão volumétrico de 25 mL e adicionou-se 1,0 mL de

solução etanólica de cloreto de alumínio a 12% e completou o volume com solução

etanólica de ácido acético glacial a 5%. Misturou-se e após 30 minutos a

18

absorbância foi medida em 422 nm. Todos os extratos foram analisados em

triplicata. O espectrofotômetro foi calibrado com uma “solução branco” (10,0 mL do

extrato em balão de 25 mL com solução etanólica de ácido acético 5% para

completar o volume, leitura feita após 30 minutos) antes da leitura das amostras.

A curva padrão foi feita com rutina nas diluições de 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05

e 0,06 mg/mL. O coeficiente de correlação foi de R = 0,9975 e a equação da reta

obtida y = 15,4514286x + 0,0021333.

3.3. Análise estatística

Os programas estatísticos utilizados foram o Système Portable d`Analyse des

Données Numériques/SPAD.N, versão 2.5 (LEBART et al., 1994) e o Sistema de

Análise Estatística/SAS, Cary, NC (1996).

A Análise de Componentes Principais (PCA) foi utilizada para estabelecer

interrelação entre os compostos químicos, metais e dados climáticos dos anos das

coletas das amostras. A Análise de Clusters foi utilizada para estudar as

similaridades das amostras nas bases da distribuição dos constituintes. A técnica do

vizinho mais próximo pelo algoritmo de Benzécri (BENZÉCRI, 1980) foi aplicada

para verificar esta similaridade e os agrupamentos hierárquicos foram formados de

acordo com o Método de Variância Mínima de Ward (WARD, 1963).

A correlação entre o conjunto das variáveis dos fenóis e da análise foliar foi

obtida por meio da Análise de Correlação Canônica no procedimento SAS

CANCOR.

Análise de variância (clusters e variáveis químicas e clima como fatores) foi

utilizada para comparar as médias dos resultados químicos e dados climáticos de

cada cluster usando o procedimento SAS GLM. Todos os dados foram avaliados

para a homoscedasticidade das variâncias pelo teste de Hartley. Este teste revelou

heteroscedasticidade para nitrogênio, cobre, ferro e precipitação (chuva). Cobre foi

transformado pelo recíproco de Y (Y-1), precipitação (chuva) pela raiz quadrada de Y

(Y-1/2), nitrogênio e ferro pela ordem dos mesmos. Onde as diferenças entre as

médias foram estabelecidas, aplicou-se o teste de Tukey para comparação entre as

médias. Valores de P<0,05 foram considerados significativos.

Resultados

4. RESULTADOS

4.1. Dados Climáticos

Os dados de umidade relativa do ar (%), temperatura média (oC) e

precipitação (mm), estão representados nos gráficos abaixo (Figuras 5 e 6).

19

20

21

22

23

24

25

dez/

01

jan/0

2

fev/

02

mar

/02

abr/0

2

mai

/02

jun/0

2jul/0

2

ago/

02

set/0

2

out/0

2

nov/

02

dez/

02

jan/0

3

fev/

03

mar

/03

abr/0

3

mai

/03

jun/0

3jul/0

3

ago/

03

set/0

3

out/0

3

nov/

03

dez/

03

t (meses)

50

55

60

65

70

75

80

85

90TemperaturaUmidade

u m i dade %

t empe r a t u r a ºc

Figura 5 – Dados climáticos de temperatura e umidade fornecidos pela Base Aérea de Anápolis correspondente ao período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003, época das coletas das folhas de E. uniflora.

precipitação

0

50

100

150

200

250

300

350

400

dez/

01

jan/0

2

fev/

02

mar

/02

abr/0

2

mai

/02

jun/0

2jul/0

2

ago/

02

set/0

2

out/0

2

nov/

02

dez/

02

jan/0

3

fev/

03

mar

/03

abr/0

3

mai

/03

jun/0

3jul/0

3

ago/

03

set/0

3

out/0

3

nov/

03

dez/

03

t (meses)

mm

Figura 6 – Dado climático de precipitação fornecido pela Base Aérea de Anápolis correspondente ao período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003, época das coletas das folhas de E. uniflora.

Durante as coletas pode-se observar dois períodos entre maio e agosto que

correspondem à estação seca. Entre setembro e novembro existe um período de

transição com pouca chuva, onde ocorre a floração e frutificação da planta. Entre

dezembro a abril se encontra o período chuvoso (Figura 6). Este clima é típico do

planalto central Brasileiro, onde existem duas estações marcantes de uma de seca e

outra de chuva.

21

4.2. Resultados da análise química

4.2.1. Análise foliar

Os resultados obtidos na análise foliar se encontram nas Figuras 7 e 8 e

Anexo 1. O magnésio não apresentou variações significativas durante os 25 meses

nas amostras analisadas (os resultados ficaram entre 0,2 a 0,4 dag/kg) e o enxofre

apresentou poucas variações, sendo que os meses de agosto a dezembro de 2003

apresentaram as menores concentrações.

O fósforo e o potássio apresentaram as maiores concentrações nos meses de

junho de 2003 e outubro 2003, enquanto as menores ocorreram nos meses de

agosto de 2002 e agosto de 2003.

No período de maio a agosto dos dois anos (2002 e 2003) o cálcio apresentou

concentrações maiores, o que coincide com a estação seca onde as folhas estão

passando de adultas para velhas, começando a fase de queda (Figura 7).

No período de agosto de 2002 a novembro de 2002 ocorreram as maiores

concentrações de nitrogênio, época de brotação e crescimento de novas folhas

(Figura 7).

0

1

2

3

4

5

6

7

dez/0

1jan/0

2

fev/02

mar/02

abr/0

2

mai/02

jun/02

jul/02

ago/0

2

set/0

2

out/0

2

nov/0

2

dez/0

2jan/0

3

fev/03

mar/03

abr/0

3

mai/03

jun/03

jul/03

ago/0

3

set/0

3

out/0

3

nov/0

3

dez/0

3

t(meses)

conc

(dag

/kg)

P K S x10 Mg Ca N

Figura 7 – Média das concentrações dos macronutrientes (P, K, S, Mg, Ca e N em dag/Kg) em folhas de E. uniflora no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.

22

0

10

20

30

40

50

60

70

80

dez/

01

jan/

02

fev/

02

mar

/02

abr/0

2

mai

/02

jun/

02ju

l/02

ago/

02

set/0

2

out/0

2

nov/

02

dez/

02

jan/

03

fev/

03

mar

/03

abr/0

3

mai

/03

jun/

03ju

l/03

ago/

03

set/0

3

out/0

3

nov/03

dez/

03

t(meses)

conc

(mg/

kg)

Cu Zn Mn Fe x 10-1

Figura 8 – Média das concentrações dos micronutrientes (Cu, Zn, Mn e Fe em mg/Kg) em folhas de E. uniflora no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.

O ferro apresentou dois momentos de concentração máxima nos dois anos,

esses períodos coincidem com o período de seca que vai de maio a novembro,

sendo que de julho a setembro é a época das folhas mais velhas caírem dando lugar

ao surgimento de folhas novas no início das chuvas (Figura 8).

O zinco apresentou concentrações elevadas nos meses de setembro de 2002

a novembro de 2002 e outubro de 2003 a dezembro 2003 coincidindo com o período

de troca das folhas, logo a planta apresenta muitas folhas jovens (Figura 8).

No período de dezembro de 2001 a fevereiro de 2002 o manganês apresentou

suas maiores concentrações, o que corresponde à época de chuva e a planta está

com suas folhas todas renovadas e adultas (Figura 8).

4.2.2. Extratos liofilizados de folhas de E. uniflora

Os rendimentos dos extratos apresentaram grande variação, de 11,77 a

24,52%, obtendo uma média de 19,7% (Apêndice 2). Os meses de julho e agosto

(2002 e 2003) apresentaram os maiores rendimentos nos dois anos analisados,

enquanto os meses de dezembro de 2001 e janeiro 2002 foram os de menores

rendimentos.

4.2.3 Ensaios para Fenóis

Os teores de fenóis totais, taninos hidrolisáveis, adstringência e flavonóides

totais foram maiores nos meses de dezembro de 2002 e janeiro 2003 quando

23

comparadas as 25 amostras. No mês de julho 2002 também ocorreu um máximo nos

teores de polifenóis, coincidindo com o período mais seco, havendo depois uma

queda com mínimo em dezembro de 2001, quando a planta estava em frutificação

(Figura 9).

Pode-se observar uma flutuação nos teores das substâncias fenólicas, o que

mostra que esta espécie possui um metabolismo dinâmico e mesmo em períodos de

seca, onde outras plantas entram em dormência, ela continua sintetizando altos

teores de metabólitos secundários.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

dez/01

jan/02

fev/02

mar

/02

abr/0

2

mai/02

jun/02

jul/0

2

ago/02

set/0

2

out/0

2

nov/02

dez/02

jan/03

fev/03

mar

/03

abr/0

3

mai/03

jun/03

jul/0

3

ago/03

set/0

3

out/0

3

nov/03

dez/03

t(meses)

conc

. mg/

g Fenóis totaisPrecipitação ProteínasTaninos HidrolisáveisFlavonóides Totaisx10

Figura 9 – Teores médios (mg/g) dos ensaios espectrofotométricos de fenóis totais (FT), adstringência (PP), taninos hidrolisáveis (TH) e flavonóides totais (F) em folhas de E. uniflora no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.

É interessante notar que ocorrem concentrações máximas tanto no período

chuvoso quanto no período de seca (Figura 9), o que significa que não são apenas

os fatores climáticos que estão influenciando na produção destes metabólitos

secundários, outros fatores tais como floração, frutificação, concentração dos metais

e ataque herbívoros e patógenos podem também estar contribuindo para a variação

na síntese destas substâncias.

4.3. Analise estatística

Análise de Componentes Principais (PCA) foi utilizado para estabelecer inter-

relação entre os constituintes químicos, nutrientes minerais e dados climáticos. A

Análise de Clusters foi utilizada para estudar as similaridades das amostras nas

bases da distribuição dos componentes.

24

Os dados climáticos, os resultados dos nutrientes minerais e teores de fenóis

foram submetidos à análise de Clusters e PCA. A PCA foi feita principalmente

utilizando a primeira e segunda componente principal. A porcentagem de informação

dos dados foi de 31,4% no maior autovalor e 20,5% no segundo maior autovalor.

Durante a análise de componentes principais foi constatado que as variáveis:

fósforo, magnésio e enxofre não contribuíram para a variância nos três primeiros

eixos, por isso elas foram retiradas da análise.

-4 -2 0 2 4

-3

-2

-1

0

1

2

3

Fe

Ca

Cu

Mn

Prec

Temp

F PP

FTTH

NZn

�

� �

��

��

�

�

�

�

��

��

� ��

PC

b-2

PCb-1

0,0

1,0

1,0

-1,0

-1,0 0,0

�

�

�

�

�

�

�

PCa-1 (31.4%)

PC

a -2 (2

0.5%

)

Figura 10 – Distribuição dos nutrientes minerais, fenóis e dados climáticos das amostras de folhas de E. uniflora agrupadas em quatro Clusters: I (♦), II (�), III (�) e IV (�), com o maior componente discriminante representado pelos vetores. aEixos referentes aos scores das amostras. bEixos referentes aos scores dos componentes, as variáveis discriminantes estão representadas pelos vetores.

Os resultados obtidos mostraram a posição relativa dos indivíduos em um

espaço discriminante em relação ao sistema axial originado pela PCA (Figura 10). A

porcentagem de informação extraída dos dados nos três eixos foi de 70,66%.

A Primeira Componente Principal (PC-1) separou todos os fenóis dos

metais manganês e cobre. A Segunda Componente Principal (PC-2) separou cálcio

e ferro dos dados climáticos e dos nutrientes zinco e nitrogênio. È interessante

observar que a maioria dos nutrientes se direciona para a parte inferior do gráfico,

ou seja, onde se localizam as amostras de folhas jovens.

25

A Análise de Cluster mostra claramente o agrupamento das amostras em

quatro clusters (Figura 11). O primeiro cluster (set/02-nov/02 e out/03-dez/03),

constituído de folhas jovens, foi caracterizado por conter altos níveis de zinco (19,21

mg/kg) (P < 0,0001) e nitrogênio (3,75 dag/kg) (P < 0,002), enquanto os níveis de

todos os fenóis foram moderados (Tabela 1).

O cluster II (dez/01-abr/02) e o cluster III (dez/02-abr/03) são ambos formados

por amostras de folhas adultas e ocorrem na estação chuvosa, entretanto eles

apresentam comportamentos distintos. Enquanto o grupo II possui os níveis mais

baixos de todos os fenóis (Tabela 1) o grupo III apresentou os mais altos de todos os

grupos (Tabela 1). A grande diferença entre estes grupos pode ser observada nas

concentrações de cobre e manganês, 8,9 e 21,4 mg/kg no grupo II e 5,8 e 13,2

mg/kg no grupo III, respectivamente.

O último cluster (mai/02-ago/02 e mai/03-set/03), que consiste de folhas

velhas da estação seca, foi caracterizado por conter altos níveis de ferro (499 mg/kg)

(P < 0,0001) e cálcio (4,58 dag/kg) (P < 0,014) e quantidades moderadas de fenóis

(Tabela 1).

Figura 11 - Dendograma representando os agrupamentos hierárquicos das amostras de folhas de E. uniflora, relacionando os dados climáticos, nutrientes minerais e teores fenóis formados com a distância Euclidiana das amostras de acordo com o Método de Variância Mínima de Ward. A análise de variância (Tabela 1) confirmou que não existe diferença

significativa nos teores de fenóis totais, adstringência, taninos hidrolisáveis e

flavonóides entre os clusters I e IV. No caso dos flavonóides apenas o grupo II se

26

diferencia dos outros. Dentre os metais, potássio não apresenta nenhuma diferença

significativa entre os grupos.

Tabela 1 – Médias dos resultados dos ensaios de fenóis, análise foliar e dados climáticos para cada grupo obtido na análise de cluster e análise de variância.

Grupo

A

FT

mg/g

PP

mg/g

TH

mg/g

F

mg/g

Umidade

%

Temp.

ºC

Prec.

mm

I 6 82,61a 35,06a 112,21a 3,57a 69,67ab 22,95a 143,63a

II 5 57,15b 24,55b 85,12b 2,09b 77,00a 22,10ab 197,62a

III 5 97,86c 44,55c 134,97c 4,23a 83,20a 22,04ab 214,92a

IV 9 83,68a 33,43a 118,05a 3,36a 62,11b 21,26b 11,84b

Grupo

A

K

dag/kg

Ca

dag/kg

N

dag/kg

Cu

mg/kg

Zn

mg/kg

Mn

mg/kg

Fe

mg/kg

I 6 0,94a 2,48a 3,75a 8,33a 19,21a 17,58ab 350,92a

II 5 0,79a 4,23b 2,28ab 8,90a 13,46b 21,40a 251,00b

III 5 0,93a 4,15b 2,26ab 5,80ab 15,33bc 13,20b 235,60b

IV 9 0,83a 4,58b 2,40b 5,33b 15,63c 15,56b 499,11a

Os valores de média acompanhados da mesma letra na mesma coluna não são significativamente diferentes (p < 0,05) usando teste de Tukey.

Analisando os outros metais foi constatado que o manganês é o único que

apresenta diferença significativa entre os grupos II e III, ambos formados por folhas

adultas. Cálcio, nitrogênio, cobre e zinco foram os nutrientes que se diferenciaram

entre as folhas jovens e velhas (clusters I e IV respectivamente). Ferro e manganês

não mostraram diferenças significativas entre estes mesmos clusters.

Procedeu-se a análise de correlação canônica, entre as variáveis dos fenóis e

os nutrientes das folhas, com o intuito de se estabelecer quais as variáveis que se

correlacionam fortemente entre os dois grupos. Um resumo da análise está

apresentado na Tabela 2.

27

Tabela 2 − Sumário da Análise de Correlação Canônica dos fenóis e os nutrientes foliares.

Compostos fenólicos (mg/g) (conjunto 1)

Variável

canônica (V1)

Nutrientes foliares (mg/kg) (conjunto 2)

Variável

Canônica (W1)

Fenóis Totais 0,969 Cobre - 0,645 Adstringência 0,893 Zinco 0,388 Taninos Hidrolisáveis 0,846 Manganês - 0,812 Flavonóides 0,736

Autovalor 1,313

Correlação Canônica 0,753

Lambda de Wilks 0,219

Graus de liberdade 16

P 0,0215

Índice de Redundância (%)

42,47

A correlação canônica demonstrou que existe uma forte correlação negativa

entre todos os fenóis do primeiro conjunto (Tabela 2) com cobre e manganês do

segundo conjunto, os quais discriminam as amostras do cluster II (dez/01-abr/02).

Ao contrário do zinco que apresenta correlação positiva com todos os fenóis do

primeiro conjunto. Existe uma moderada capacidade de predição da relação entre

compostos fenólicos e nutrientes foliares (42,47%).

O resultado da correlação canônica confirma o que havia sido observado na

PCA (Figura 10), quanto maiores os níveis de Manganês e Cobre menores serão os

teores dos compostos fenólicos. O zinco tem efeito contrário ao Manganês e Cobre,

influenciando positivamente nas quantidades de todos os fenóis.

Discussão

5. DISCUSSÃO

A Análise de Componentes Principais e Análise de Cluster conseguiram

correlacionar às variações nos teores dos compostos fenólicos com a sazonalidade

dos nutrientes foliares, possibilitando a formação de quatro grupos distintos. O

primeiro grupo é constituído de folhas jovens, apresenta altas concentrações de

zinco e nitrogênio e moderados níveis de fenóis. O segundo é formado por folhas

adultas, está no período de chuva, apresenta as maiores concentrações de cobre e

manganês, e as mais baixas de todos os fenóis. O terceiro também é constituído de

folhas adultas, está no período de chuva, e apresenta os mais altos níveis de fenóis

e os mais baixos de Manganês e Cobre. O quarto grupo compõe-se de folhas

maduras, está no período da seca e é rico em ferro e cálcio, com moderada

quantidade de fenóis.

Pode-se observar que três grupos estão no período de chuva (1, 2 e 3) e

apenas o grupo 4 está no período da seca. Ocorreram variações nas quantidades

dos compostos fenólicos nos grupos da época de chuva, mostrando que existem

outros interferentes, além das condições climáticas na produção dos fenóis.

Os metabólitos secundários são afetados por muitos fatores que influenciam

sua estabilidade, biosíntese e degradação. Na biossíntese de fenilpropanóides a

enzima fenilalanina amônia-liase (PAL) é especialmente relevante, porque pode ser

induzida por condições de stress ambientais. As polifenol oxidases e as peroxidases

são enzimas responsáveis tanto pela degradação como pela síntese de diferentes

fenóis (TOMAS-BARBERAN & ESPIN, 2001; LIN, CHEN & LIU, 2005; NIEMETZ &

GROSS, 2005).

A síntese de fenilpropanóides e seus compostos derivados (taninos

condensados e flavonóides) competem diretamente com a síntese de proteínas, e

consequentemente com o crescimento vegetal. Os precursores comuns entre eles

são os aminoácidos fenilalanina e tirosina. Na produção de taninos hidrolisáveis esta

competição com a síntese de proteínas não acontece, pois eles são formados em

etapas anteriores, Figura 4 (HAUKIOJA et al., 1998).

No cluster I constituído de folhas jovens foi encontrado predomínio de

nitrogênio e zinco que estão ligados à formação de células novas e síntese de

proteínas. O nitrogênio é de fundamental importância para o crescimento vegetativo,

serve de constituinte dos componentes celulares (TAIZ & ZEIGER, 1998).

30

Estudo com a Digitalis obscura encontrou altas concentrações de nitrogênio

nas folhas jovens, enquanto nas folhas maduras houve predominância do cálcio. No

período de crescimento da planta e na formação de folhas novas, ela requer mais

carbono e macronutrientes, principalmente fósforo e nitrogênio que são requeridos

para síntese protéica e de RNA, priorizando o metabolismo primário. Nas folhas

completamente desenvolvidas, os índices de nitrogênio e fósforo são mais baixos e

o carbono é mais convergido para o metabolismo secundário (ROCCA-PEREZ et al.,

2005).

Plantas deficientes em nutrientes possuem taxa de crescimento mais baixa e

concentrações mais elevadas de compostos secundários baseados no carbono

(fenóis e terpenos) do que plantas com acesso amplo aos nutrientes. Vários

trabalhos observaram que a produção de fenóis diminui com aumento da

disponibilidade de nitrogênio (HAUKIOJA et al., 1998; YAMADA, 2004; HIKOSAKA

et al., 2005; MONTEIRO et al, 2005).

No presente estudo não houve correlação entre a quantidade de nitrogênio e

os teores de todos os fenóis, como podem ser observados na Tabela 1, onde os

clusters I e IV não apresentam diferenças significativas nas quantidades de todos os

fenóis, apesar dos níveis de nitrogênio serem significativamente diferentes. A análise

por correlação canônica também não mostrou nenhuma correlação entre fenóis e

nitrogênio. Este resultado pode ser explicado primeiro pelo fato dos fenóis

majoritários da planta pertencer ao grupo dos taninos hidrolisáveis, que não

competem com a síntese de proteínas (HAUKIOJA et al., 1998). Outra explicação

seria o fato dos níveis de nitrogênio estar dentro dos limites adequados, comparando

com plantas do mesmo porte (BERGMANN, 1992, citado por MARSCHNER, 1997),

ou seja, neste estudo não houve nem deficiência nem excesso de nitrogênio.

O cluster I também apresentou os mais altos níveis de zinco, e neste caso

existe correlação positiva deste metal com os compostos fenólicos, comprovada pela

Análise de Correlação Canônica, Tabela 2. Estudo recente relaciona o suprimento

de zinco com a expressão de genes ligados à biossíntese de ligninas (VAN DE

MORTEL et al., 2006). Este estudo mostra que este metal participa de sistemas

enzimáticos da via do ácido chiquímico (Figura 4).

Os clusters II e III foram separados pela primeira componente principal (PC-

1), Figura 9, e apresentam comportamentos opostos em relação aos níveis de

compostos fenólicos e os metais Manganês e Cobre. A Análise de Correlação

31

Canônica confirmou a existência de correlações negativas entre esses metais e os

fenóis, Tabela 2. A explicação para estas correlações pode ser encontrada no papel

desses metais em enzimas que participam de reações redox nas células vegetais.

O cobre é cofator das enzimas polifenol oxidases que atuam oxidando os

orto-difenóis para orto-quinonas, reação necessária para biossíntese de ligninas. A

deficiência de cobre leva a diminuição da atividade destas enzimas e como

conseqüência os compostos fenólicos se acumulam e a produção de lignina diminui

(MARSCHNER, 1997; LIN, et al., 2005). Cobre também pode aumentar a atividade

das peroxidases e laccases, que atuam juntas na biossíntese da lignina (LIN, et al.,

2005). Na biossíntese dos elagitaninos são necessárias reações de acoplamento

oxidativo que são realizadas por uma enzima fenol oxidase do tipo lacase, isolada

de folhas de Tellima grandiflora (NIEMETZ & GROSS, 2005).

O manganês ativa diversas enzimas da via do ácido chiquímico, conduzindo a

biossíntese de aminoácidos aromáticos e vários produtos secundários, tais como

lignina, flavonóides e ácido indol acético. Este metal afeta a atividade da fenilalanina

amônia-liase e estimulam as peroxidases que atuam na biossíntese de lignina e que

requerem compostos fenólicos e H2O2 como substratos (MARSCHNER, 1997).

Em vista do papel destes metais em enzimas que promovem a oxidação dos

fenóis pode-se sugerir que os teores mais baixos desses metabólitos no cluster II

foram devidos mais ao aumento da degradação deles, para síntese de lignina, do

que propriamente à diminuição de sua biossíntese.

A maior quantidade de ligninas também pode levar a uma maior interação dos

taninos com este polímero, o que diminui a quantidade de taninos solúveis. Houve

um aumento na quantidade de elagitaninos insolúveis durante o desenvolvimento

das folhas, de jovens para maduras. Estes estariam ligados aos polímeros da

parede celular, tais como celulose e lignina (SALMINEN et al 2001.; SALMINEN et

al.,2002). Essa associação dos taninos com a parede celular aumentaria ainda mais

a rigidez da folha, tornando-a mais resistente ao ataque de herbívoros.

O cluster IV é constituído de folhas maduras e ocorre predomínio de ferro e

cálcio. Normalmente ocorre um declínio no nível de metais durante o

envelhecimento das folhas, devido a translocação dos nutrientes para folhas mais

jovens e também pelo efeito de diluição, conseqüência do aumento de compostos

estruturais da folha (MARSCHNER, 1997). Entretanto foi observado que cálcio e

ferro são exceções apresentando maiores concentrações em folhas mais velhas,

32

possivelmente em função do menor transporte desses metais no floema e

conseqüente acúmulo nas folhas maduras (SÁNCHEZ-ALONSO & LACHICA, 1987;

ROCCA-PEREZ et al., 2005). Outra hipótese pode ser acúmulo de poeira nas folhas,

o solo do local da coleta é rico em ferro e as folhas não foram lavadas.

Apesar de esses nutrientes ninerais caracterizarem o cluster IV, a Análise de

Correlação Canônica mostrou que não existe correlação significativa deles com

nenhum dos fenóis. Ou seja, a quantidade de fenóis independe dos níveis de cálcio

e ferro, pelo menos neste estudo. Entretanto existem correlações significativas

destes metais com fatores climáticos, cálcio tem correlação negativa com a

temperatura (p<0,05) e ferro apresentou correlação negativa com precipitação

(p<0,01), segundo a matriz de correlação da Análise de Componentes Principais.

Pelos resultados obtidos para as folhas de E. uniflora foi possível verificar que

existe uma dinâmica de síntese e decomposição de compostos fenólicos que se

relaciona não apenas com os fatores climáticos e bióticos, mas também com a

composição de nutrientes dentro da própria planta. A forte correlação positiva com

manganês e cobre indica que existe uma competição interna entre a síntese de

taninos hidrolisáveis e flavonóides e a síntese de ligninas. Este dado é um dos que

deve ser considerado quando se pretende aumentar os níveis de compostos

biologicamente ativos durante o cultivo da planta.

Foi observado que o período de chuva associado à deficiência de manganês e

cobre propicia a maior produção de fenóis (taninos), portanto para maior rendimento

dos princípios ativos com fins terapêuticos a coleta deve ser preferencialmente na

época chuvosa e com deficiência nutricional de manganês e cobre.

Conclusão

6. CONCLUSÃO

� Existe uma considerável influência de pelo menos três micronutrientes nos

níveis dos compostos fenólicos.

� O zinco apresenta uma moderada correlação positiva.

� O manganês e cobre possuem forte correlação negativa.

� Esses dados indicam que existe uma competição entre a biossíntese e

degradação das diferentes classes de compostos fenólicos, que dependendo

do balanço desses metais nas folhas, uma dessas classes será favorecida.

� Neste estudo não houve correlação dos fenóis com os fatores climáticos.

Referências Bibliográficas

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Apêndices

8. APÊNDICES Apêndice 1 – Concentrações dos macronutrientes (N, P, K, S, Ca e Mg) e micronutrientes (Zn, Cu, Mn e Fe), dosados por espectroscopia e fotometria em folhas de pitangueira no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.

Amostra

N

dag/kg

P

dag/kg

K

dag/kg

S

dag/kg

Mg

dag/kg

Ca

dag/kg

Cu

mg/kg

Zn

mg/kg

Mn

mg/kg

Fe

mg/kg

dez/01 2,24 0,281 0,77 0,115 0,30 4,35 16 14,3 27,5 254,50 jan/02 2,49 0,322 0,72 0,135 0,40 4,00 8,0 13,4 22,5 279,50 fev/02 2,49 0,375 0,81 0,170 0,30 2,70 8,0 14,4 21,5 263,50 mar/02 2,13 0,514 0,82 0,155 0,40 4,70 6,5 13,2 16,5 216,50 abr/02 2,07 0,375 0,82 0,155 0,30 5,40 6,0 12,1 19,0 241,00 mai/02 2,35 0,316 0,75 0,105 0,30 6,35 6,0 12,3 21,5 326,50 jun/02 2,04 0,310 0,91 0,150 0,35 4,40 7,5 18,0 18,0 349,50 jul/02 2,02 0,348 0,80 0,180 0,25 3,55 6,0 15,9 13,5 478,50

ago/02 4,90 0,291 0,65 0,150 0,30 4,40 4,0 15,7 16,5 550,00 set/02 4,54 0,445 0,83 0,160 0,40 2,45 8,5 18,6 18,5 381,00 out/02 4,96 0,416 0,86 0,150 0,30 2,10 9,5 19,9 16,0 373,00 nov/02 5,38 0,388 0,96 0,100 0,20 3,70 9,0 18,6 19,5 325,50 dez/02 2,35 0,403 0,90 0,105 0,30 3,15 6,5 16,6 13,0 229,00 jan/03 2,27 0,416 0,98 0,140 0,25 3,75 5,5 14,9 11,5 232,50 fev/03 2,27 0,430 1,02 0,130 0,30 4,30 5,5 14,0 10,0 231,50 mar/03 2,13 0,348 0,80 0,135 0,25 4,45 6,0 15,2 17,5 248,50 abr/03 2,30 0,438 0,96 0,145 0,35 5,10 5,5 16,1 14,0 236,50 mai/03 2,10 0,273 0,80 0,155 0,25 4,00 5,0 14,2 13,5 292,50 jun/03 1,88 0,588 1,19 0,155 0,35 4,30 6,0 16,4 10,5 485,50 jul/03 2,07 0,375 0,84 0,150 0,30 4,00 4,0 15,8 12,0 721,50

ago/03 2,21 0,279 0,75 0,100 0,30 5,10 4,0 15,6 17,5 572,50 set/03 2,02 0,316 0,80 0,100 0,20 5,15 5,5 17,1 17,0 715,50 out/03 2,94 0,613 1,19 0,105 0,35 2,05 11,5 21,5 17,0 445,00 nov/03 2,32 0,368 0,98 0,080 0,20 2,10 6,0 18,5 13,5 323,00 dez/03 2,38 0,368 0,82 0,070 0,40 2,50 5,5 18,4 21,0 258,00

44

Apêndice 2 – Teores médios e desvio padrão dos rendimentos totais dos extratos liofilizados (RTEL), fenóis totais (FT), adstringência (PP), taninos hidrolisáveis (TH) e flavonóides totais (F) em folhas de pitangueira no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.

Amostra

RTEL %

Fenóis Totais* mg/g

Precipitação Proteínas*

mg/g

Taninos Hidrolisáveis*

mg/g

Flavonóides Totais**

mg/g dez/01 13,88 52,59 (1,35) 20,97 (0,31) 83,31 (0,41) 1,52 (0,01) jan/02 11,77 54,13 (0,79) 26,77 (0,09) 80,80 (0,42) 2,43 (0,01) fev/02 15,56 58,86 (1,36) 24,79 (0,05) 89,65 (0,91) 1,91 (0,04) mar/02 14,66 58,12 (0,45) 24,63 (0,22) 80,81 (0,25) 2,26 (0,02) abr/02 16,40 62,04 (0,47) 25,58 (0,19) 91,03 (0,33) 2,34 (0,00) mai/02 20,23 85,17 (1,71) 33,97 (0,40) 108,85 (0,83) 2,92 (0,36) jun/02 20,05 77,98 (0,91) 36,39 (0,27) 118,72 (0,11) 2,76 (0,04) jul/02 23,06 87,98 (1,37) 42,61 (0,20) 135,37 (1,55) 4,08 (0,04)

ago/02 24,52 90,32 (1,03) 32,08 (0,09) 121,88 (0,68) 3,15 (0,01) set/02 20,53 81,52 (0,72) 35,97 (0,45) 121,87 (0,62) 4,30 (0,05) out/02 19,64 77,89 (1,27) 30,10 (0,20) 104,45 (0,65) 4,89 (0,06) nov/02 19,82 82,49 (0,29) 38,96 (0,40) 121,67 (0,39) 3,00 (0,06) dez/02 23,92 101,88 (0,81) 52,22 (0,21) 156,40 (1,18) 5,00 (0,03) jan/03 22,95 105,34 (0,51) 49,61 (0,26) 149,13 (0,21) 4,49 (0,02) fev/03 20,49 96,10 (1,72) 41,60 (0,10) 124,72 (0,32) 3,12 (0,05) mar/03 20,68 89,47 (0,62) 36,17 (0,23) 119,19 (0,59) 4,46 (0,04) abr/03 21,14 96,51 (1,09) 43,14 (0,49) 125,40 (1,76) 4,07 (0,04) mai/03 21,91 80,92 (1,09) 28,36 (0,07) 117,08 (0,51) 3,83 (0,03) jun/03 20,68 77,36 (0,67) 31,02 (0,16) 107,43 (0,19) 2,40 (0,01) jul/03 23,67 97,69 (0,98) 37,79 (0,26) 125,32 (0,82) 3,44 (0,04)

ago/03 24,05 79,03 (0,93) 31,30 (0,06) 118,08 (0,38) 4,15 (0,02) set/03 18,82 76,63 (1,01) 27,32 (0,22) 109,76 (0,82) 3,47 (0,06) out/03 16,44 79,72 (0,42) 29,56 (0,05) 106,79 (0,30) 3,65 (0,03) nov/03 17,16 80,66 (0,35) 35,70 (0,06) 104,73 (0,35) 2,31 (0,01) dez/03 19,89 93,37 (0,83) 40,04 (0,17) 113,75 (1,26) 3,25 (0,02)

*resultados em ácido tânico equivalente mg/g de folha seca. ** resultados em rutina equivalente mg/g de folha seca.

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