Universidade Federal de Goiás
Faculdade de Farmácia
ROSA MARIA DOS SANTOS
SAZONALIDADE DOS NUTRIENTES MINERAIS E DOS
FENÓIS EM FOLHAS DE Eugenia uniflora L.
Goiânia
2007
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ROSA MARIA DOS SANTOS
SAZONALIDADE DOS NUTRIENTES MINERAIS E DOS
FENÓIS EM FOLHAS DE Eugenia uniflora L.
Dissertação apresentada no Programa de Pós-graduação
em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para
a obtenção do Título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos e medicamentos
Orientadora: Profa. Dra. Suzana da Costa Santos
Goiânia
2007
Agradeço a DEUS por toda minha vida, aos
meus queridos filhos Júnior e Natália e ao meu
marido Ramom, pela paciência, carinho,
compreensão, amor, apoio, amizade e confiança.
AGRADECIMENTOS
• À Profa. Dra. Suzana da Costa Santos pela orientação, amizade, dedicação,
apoio, compreensão, paciência e os conhecimentos a mim dados.
• Ao Prof. Dr. Pedro Henrique Ferri pela colaboração nas análises estatísticas.
• À Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos da UFG, em especial ao
Prof. Dr. Wilson Mozena Leandro, obrigado pela colaboração na análise
foliar.
• Aos técnicos do LASF, Elenilson e Carlinhos pela colaboração na análise
foliar.
• Ao Prof. Dr. Amarildo pelo auxílio com espectroscopia de absorção atômica.
• A todos os professores das disciplinas cursadas durante o curso.
• A Flávia minha colega de mestrado que me ajudou na análise multivariada e
teve muita paciência e carinho comigo.
• A Denise Oliveira Guimarães pela coleta, secagem e moagem das amostras.
• A Lorena da iniciação científica que me ajudou na rotaevaporação.
• Agradeço a minha família, pelo suporte e também pelo crédito que sempre
me concederam, pois neles encontrei força.
• Aos órgãos Capes, Funape, pelo suporte financeiro, gestão de recursos.
• Enfim, a todos que tornaram possível a conclusão deste projeto.
O Senhor produziu da terra os medicamentos; O homem sensato não os desprezará.
ECLESIÁSTICO 38, 4-8
Sumário
Resumo vii
Abstract viii
Lista de Figuras ix
Lista de Tabelas x
1. Introdução 1
1.1. As plantas medicinais 1
1.2. Eugenia uniflora 3
1.3. Compostos Fenólicos 6
1.4. Metabolismo vegetal 8
1.4.1 Biossíntese de compostos fenólicos 9
2. Objetivos 12
3. Materiais e Métodos 14
3.1. Material botânico e dados climáticos 14
3.2. Métodos de análise química 14
3.2.1. Extração para Fenóis 14
3.2.2. Extração para Análise Foliar 14
3.2.3. Ensaios para doseamento dos fenóis 15
3.2.3.1. Ensaio para Fenóis Totais 15
3.2.3.2 Ensaio para precipitação de proteínas (adstringência) 16
3.2.3.3 Ensaio para Taninos Hidrolisáveis 17
3.2.3.4 Ensaio para Flavonóides Totais 17
3.3. Análise estatística 18
4. Resultados 20
4.1. Dados Climáticos 20
4.2. Resultados da análise química 21
4.2.1. Análise foliar 21
4.2.2. Extratos liofilizados de folhas de E. uniflora 22
4.2.3. Ensaios para Fenóis 22
4.3. Analise estatística 23
5. Discussão 29
6. Conclusão 34
7. Referências Bibliográficas 36
8. Apêndices 43
Apêndice 1 43
Apêndice 2 44
vii
RESUMO
A pitangueira (E. uniflora, Myrtaceae) é usada contra diarréia, hiperglicemia e
hipertensão arterial. As atividades farmacológicas são devidas à presença de compostos fenólicos em suas folhas. Com a intenção de correlacionar os níveis de fenóis com os nutrientes foliares e as mudanças climáticas, folhas desta espécie foram coletadas mensalmente de dez/01 a dez/03 em Anápolis/GO. Extratos feitos com acetona:água foram analisados através de quatro ensaios para fenóis: fenóis totais-FT (FeCl3), taninos hidrolisáveis-TH (KIO3), flavonóides-F (AlCl3) e precipitação de proteínas-PP (ABS). Nutrientes foliares (N, P, K, S, Mg, Ca, Cu, Zn, Mn e Fe) foram determinados por espectroscopia de absorção atômica, fotometria de chama e ensaios colorimétricos. Os resultados dos ensaios para fenóis e a análise foliar junto com os dados climáticos foram analisados por métodos quimiométricos (Programas SPAD.N e SAS). A maioria dos dados, na análise de componentes principais (PCA), pôde ser representada nos três primeiros eixos, que contiveram 70,66 % da variância total (x = 31,38, y = 20,45 e z = 18,83 %). A PCA e análise de cluster demonstraram a existência de quatro grupos. O primeiro grupo (set/02-nov/02 e out/03-dez/03), constituído de folhas jovens, foi caracterizado por conter altos níveis de zinco (19,21 ± 1,23 mg/kg) e nitrogênio (3,75 ± 1,36 dag/kg), enquanto os níveis de todos os fenóis foram moderados. Os grupos II (dez/01-abr/02) e o grupo III (dez/02-abr/03) são ambos formados por amostras de folhas adultas e ocorreram na estação chuvosa, entretanto eles apresentaram comportamentos distintos. Enquanto o grupo II teve os níveis mais baixos de todos os fenóis (57,15 mg/g FT; 85,12 mg/g TH; 16,49 mg/g F; 24,55 mg/g PP) o grupo III apresentou os mais altos de todos os grupos (97,86 mg/g FT; 134,47 mg/g TH; 53,31 mg/g F; 44,55 mg/g PP). A grande diferença entre estes grupos pode ser observada nas concentrações de cobre e manganês, 8,9 e 21,4 mg/kg no grupo II e 5,8 e 13,2 mg/kg no grupo III, respectivamente. O último grupo (mai/02-ago/02 e mai/03-set/03), que consiste de folhas velhas da estação seca, foi caracterizado por conter altos níveis de ferro (499 mg/kg) e cálcio (4,58 dag/kg) e quantidades moderadas de todos os fenóis. A análise estatística sugere que altos níveis de todos os fenóis ocorrem principalmente quando os nutrientes foliares estão em concentrações baixas nas folhas, em especial os metais cobre e manganês, os quais são cofatores de enzimas envolvidas na degradação de fenóis e na biossíntese de ligninas.
viii
ABSTRACT
Pitangueira (E. uniflora, Myrtaceae) is used against diarrhoea, hyperglycemia
and hypertension. Pharmacological activities are due to the presence of phenolic compounds in leaves. In order to correlate levels of phenols with foliar nutrients and climatic changes, leaves were collected monthly from Dec/01 to Dec/03 in Anápolis/GO. Acetone:water extracts were analysed by four assays: total phenolics-TP (FeCl3), hydrolysable tannins-HT (KIO3), flavonoids-F (AlCl3) and protein precipitation-PP (BSA). Foliar nutrients (N, P, K, S, Mg, Ca, Cu, Zn, Mn and Fe) were determined by colorimetric assays and flame atomic absorption and emission spectrometry. Results from phenolic assays and foliar nutrients together with climatic data were analysed by chemometric methods (program SPAD.N). The majority of the data, in the principal components analysis (PCA), could be represented in three main axes, which contained 70.66 % of total variance (x = 31.38, y = 20.45 and z = 18.83 %). PCA and Cluster analysis demonstrated the existence of four groups. The first group (Set/02-Nov/02 and Out/03-Dec/03), constituted of young leaves, was characterized by higher levels of zinc (19.21 mg/Kg) and nitrogen (3.75 dag/Kg) and moderate levels of all phenols. Group II (Dez/01-Apr/02) and Group III (Dez/02-Apr/03) were both constituted of samples with adult leaves and from the rainy season, however they had opposite behaviour. While group II presented the lowest levels of all phenols (57.15 mg/g TP; 85.12 mg/g HT; 16.49 mg/g F; 24.55 mg/g PP) group III showed the highest ones (97.86 mg/g TP; 134.47 mg/g HT; 53.31 mg/g F; 44.55 mg/g PP). The strong difference between these groups can be explained by the concentrations of Cu and Mn, 8.9 and 21.4 mg/Kg in group II and 5.8 and 13.2 mg/Kg in group III, respectively. The last group (Mai/02-Ago/02 and Mai/03-Set/03), which comprised samples of mature leaves from dry season, was characterised by higher levels of Fe (499 mg/Kg) and Ca (4.58 dag/Kg) and moderate levels of all phenols. The statistical analysis suggested that higher levels of all phenols occur mainly when foliar nutrients are lower in leaves, in particular Cu and Mn, which are enzymes cofactors involved in phenol degradation and lignin biosynthesis.
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Árvore de Eugenia uniflora adulta com flores e frutos em detalhe. 3
Figura 2 Estrutura de dois exemplos de taninos hidrolisáveis isolados de folhas de E. uniflora.
5
Figura 3 Exemplos das duas classes de taninos, condensados e hidrolisáveis. 6
Figura 4 Esquema de biossíntese de compostos fenólicos, no metabolismo das plantas.
10
Figura 5 Dados climáticos de temperatura e umidade, fornecidos pela Base Aérea de Anápolis correspondentes ao período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003, época das coleta das folhas de E. uniflora.
20
Figura 6 Dados climáticos de precipitação, fornecidos pela Base Aérea de Anápolis correspondentes ao período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003, época das coleta das folhas de E. uniflora
20
Figura 7 Média das concentrações dos macronutrientes (P, K, S, Mg, Ca e N em dag/Kg) em folhas de E. uniflora no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.
21
Figura 8 Média das concentrações dos micronutrientes (Cu, Zn, Mn e Fe em mg/Kg) em folhas de E. uniflora no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.
22
Figura 9 Teores médios (mg/g) dos ensaios espectrofotométricos de fenóis totais (FT), adstringência (PP), taninos hidrolisáveis (TH) e flavonóides totais (F) em folhas de E. uniflora no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.
23
Figura 10 Distribuição dos nutrientes minerais, fenóis e dados climáticos das amostras de folhas de E. uniflora agrupadas em quatro Clusters: I (♦), II (�), III (�) e IV (�), com o maior componente discriminante representado pelos vetores. aEixos referentes aos scores das amostras. bEixos referentes aos scores dos componentes, as variáveis discriminantes estão representadas pelos vetores.
24
Figura 11 Dendograma representando os agrupamentos hierárquicos das amostras de folhas de E. uniflora, relacionando os dados climáticos, nutrientes minerais e teores fenóis formados com a distância Euclidiana das amostras de acordo com o Método de Variância Mínima de Ward.
25
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Médias dos resultados dos ensaios de fenóis, análise foliar e dados climáticos para cada grupo obtido na análise de cluster e análise de variância.
26
Tabela 2 Sumário da Análise de Correlação Canônica dos fenóis e os nutrientes foliares.
27
Introdução
1. INTRODUÇÃO
1.1. As plantas medicinais
O uso de plantas no tratamento e na cura de enfermidades é tão antigo
quanto à espécie humana. Ainda hoje nas regiões mais pobres do país e até mesmo
nas grandes cidades brasileiras, plantas medicinais são comercializadas em feiras
livres, mercados populares e encontradas em quintais residenciais (MACIEL et al.,
2002).
O homem primitivo já fazia uso das plantas tanto para se alimentar como para
outras finalidades tais como perfumar o corpo ou o ambiente, untar-se para afastar
os insetos, curar-se de indisposições e ferimentos e também para expandir a
consciência buscando sensações diferentes da realidade do dia a dia. Foi
aprendendo a identificar as plantas e suas propriedades pela necessidade e pela
capacidade de reter e relacionar experiências (TORIANI, 2006).
No caso de plantas com propriedades terapêuticas, estas foram, na sua
grande maioria, descobertas empiricamente. Com base nestes conhecimentos
acumulados pela medicina popular, foram desenvolvidos alguns dos mais valiosos
medicamentos utilizados na medicina científica, como os digitálicos, a quinina, a
morfina, a atropina, etc. Atualmente são utilizados mais de 120 fármacos obtidos por
extração direta do vegetal, sendo em sua maioria antiinflamatórios, analgésicos,
vitaminas, hormônios e substâncias ativas no sistema nervoso central (SCHENKEL,
GOSMANN & PETROVICK, 2001).
As plantas medicinais têm sido usadas como forma alternativa ou
complementar a terapia convencional no tratamento de várias doenças. Dentre as
inúmeras vantagens está o largo uso terapêutico, baixo custo, facilidade em
obtenção para a população de baixa renda (CALIXTO, 2000), ser uma fonte
renovável e em grande parte controlada pelo homem que se livra do poder das
substâncias sintéticas e se cura sem agredir seu organismo.
As plantas contêm propriedades diversas de acordo com os seus princípios
ativos. Estes princípios não são estáveis e nem se distribuem de maneira
homogênea na planta. Estas substâncias podem se concentrar nas raízes, rizomas,
talos, caules, folhas, sementes ou flores. Seu teor também varia de acordo com a
época do ano, solo e clima onde a planta se desenvolve (TAIZ & ZEIGER, 1998).
2
Elas sintetizam vários compostos biologicamente ativos, que na maioria das
vezes, são produtos do metabolismo secundário e estão relacionados à interação da
planta com o ambiente (HARBORNE, 1988). Essa ampla diversidade de metabólitos
secundários está relacionada com diferentes atividades biológicas, justificando a
necessidade de um aprofundamento no conhecimento das propriedades das
espécies vegetais e sua utilização na formulação de medicamentos.
O homem sempre experimentou, conheceu, usou e passou às novas gerações
o jeito de curar-se pela natureza. Embora, por um bom período a sociedade não se
importou em passar estes conhecimentos elementares, hoje a população passa por
um período de resgate destes conhecimentos e esta sabedoria milenar vem
contribuindo enormemente para a recuperação da saúde, justamente numa época
de efervescência de alta tecnologia em todos os campos inclusive na área da saúde.
A Organização Mundial de Saúde (OMS) tem-se mostrado muito interessada
nos sistemas terapêuticos indígenas, especialmente nos que usam medicamentos
vegetais. É fato que 80% da população do planeta utilizam medicamentos à base de
plantas, destes apenas 30% tem indicação médica (MACIEL et al., 2002). A OMS
acredita que com o adequado estudo e desenvolvimento destes sistemas, propiciaria
que melhores cuidados de saúde possam ser alargados a todos.
Neste contexto o Brasil é um país privilegiado, tem a maior diversidade
genética vegetal do mundo, ocupa o primeiro lugar em biodiversidade, detém cerca
de 23 % do total de espécies existentes no planeta (RATES, 2001), com cerca de
55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 a 550.000
espécies, possui ampla tradição no uso das plantas medicinais, vinculada ao
conhecimento tradicional (popular), transmitido oralmente por gerações, além de
tecnologia para validar cientificamente este conhecimento (TOLEDO, 2002). A flora
medicinal brasileira constitui um arsenal terapêutico de enorme importância. Temos
cerca de 590 plantas registradas no Ministério da Saúde Brasileiro para
comercialização.
Nas últimas décadas um grande número de pesquisadores passou a se
interessar pela pesquisa de fitoterápicos. Este grande influxo nesta área propiciou o
aparecimento de novas bibliografias, com informações importantes do universo das
plantas medicinais.
3
1.2. Eugenia uniflora
A espécie botânica Eugenia uniflora L (Figura 1), conhecida como pitangueira,
pertence à Família Myrtaceae. Esta é uma das mais importantes famílias da flora
brasileira, com 23 gêneros e aproximadamente 1000 espécies. Possui uma
diversidade de espécies com aplicações medicinais já estudadas. Dentre elas,
espécies do gênero Eugenia possuem atividade na medicina popular e algumas já
foram estudadas em pesquisas científicas.
Eugenia uniflora L. é uma árvore de altura de 6-12 m, dotada de copa mais ou
menos piramidal. Tronco tortuoso e um pouco sulcado, de 30-50 cm de diâmetro,
com casca descamante em placas irregulares. Folhas simples, levemente discolores,
glabras, brilhantes na face superior, de 3-7 cm de comprimento por 1-3 cm de
largura. Flores solitárias ou em grupos de 2-3 nas axilas da extremidade dos ramos.
Fruto drupa globosa achatada e sulcada, glabra, brilhante, vermelha, amarela ou
preta quando madura, de polpa carnosa e comestível, contendo 1-2 sementes.
Floresce durante os meses de agosto-novembro e os frutos amadurecem em
outubro-janeiro (LORENZI, 1998). A fruta conhecida como pitanga é utilizada na
alimentação.
Figura 1 – Árvore de Eugenia uniflora adulta com flores e frutos em detalhe.
Ocorre naturalmente desde Minas Gerais até o Rio Grande do Sul na floresta
semidecídua do planalto e da bacia do rio Paraná (LORENZI, 1998). Sua distribuição
é muito ampla, ocorrendo em vários países da América do Sul, tais como Argentina,
4
Uruguai e Paraguai, além de países da Ásia tais como Índia, Ceilão e sul da China
(LEE et al.,1997).
A pitangueira é utilizada tradicionalmente em medicina popular. O decocto ou
infusão das folhas são usados como hipotensor e diurético (CONSOLINI et al.,
1999), no tratamento de problemas digestivos, como adstringente, antipirético e anti-
reumático (ALICE et al., 1991).
Pesquisas recentes, utilizando testes in vitro e in vivo, demonstraram que a
Eugenia uniflora possui várias atividades farmacológicas, tais como: ação
antiinflamatória e analgésica (SCHAPOVAL et al., 1994), ação antidiarréica pela
inibição do trânsito gastrointestinal, aumento da absorção de água em partes do
intestino e aumento nas contrações do músculo duodenal (SCHAPOVAL et al.,
1994; ALMEIDA et al., 1995; GBOLADE et al., 1996), ação carminativa (LEE et al.,
1997).
A atividade hipotensora foi confirmada e está relacionada à ação
vasodilatadora de vasos resistentes e aumento da diurese (CONSOLINI et al., 1999;
MORIOKA et al., 2000; CONSOLINI & SARUBIO, 2002). Outros estudos
demonstraram que o extrato hidroalcóolico das folhas de E. uniflora produz um
relaxamento dos anéis da aorta (WAZLAWICK et al, 1997).
A inibição do aumento de glicose e triglicerídeos plasmáticos foram
comprovadas em ratos tratados com diferentes frações do extrato etanólico de E.
uniflora (ARAI et al., 1999), a atividade antidiabética foi confirmada e está
relacionada com a inibição da alfa-glucosidase pelas uniflorinas isoladas do extrato
aquoso de folhas de E. uniflora (MATSUMURA et al., 2000).
O fracionamento biodirecionado do extrato de folhas de E. uniflora utilizando
ensaios in vitro com EBV DNA polimerase, enzima responsável pela replicação do
vírus Epstein-Barr, mostrou alta atividade inibitória para os elagitaninos presentes
nesta planta, sendo que eugeniflorina D-1 e D-2 foram as mais potentes (LEE et al.,
2000). Este vírus esta relacionado com o desenvolvimento do carcinoma
nasofaríngeo e o linfoma African Burkitt.
Outras atividades tais como: tripanossomicida (ADEWUNMI et al., 2001),
ação contra infecções intestinais causadas por S. aureus e E. coli (HOLETZ et al.,
2002), ação antifúngica (SOUZA et al., 2002), tratamento de diabetes e gota
(AURICCHIO & BACCHI, 2003) e ação contra Paracoccidioides brasilienses
(SANTOS et al., 2004), também foram comprovadas para esta planta.
5
Compostos encontrados nesta planta incluem os flavonóides mircitina,
quercetina, quercetin-3-ramnoglucosídio, esteróides e/ou triterpenóides, compostos
mono e triterpênicos, antraquinonas e fenóis (SCHMEDA-HIRSCHMANN et al.,
1987; ALICE et al., 1991; WAZLAWICK et al., 1997). Os óleos essenciais das folhas
também foram investigados e seus constituintes principais são: furanodieno, selina-
13711-tien-8ona e oxidoselina-13711-tien-8ona (HENRIQUES et al., 1993).
Estudos realizados com Eugenia uniflora mostraram que suas folhas são ricas
em taninos hidrolisáveis, sendo que os compostos isolados e identificados foram os
elagitaninos macrocíclicos Oenotheina B, Eugeniflorina D1 e Eugeniflorina D2, o
galoil éster 1,2,4,6-tetra-O-galoil-α-D-glucose, a proantocianidina monomérica
galocatequina e o flavonóide glicosídico mircetin-3-O-ramnoglucosidio (LEE et al.,
1997).
O elagitanino Oenotheina B (Figura 2) foi isolado primeiro da Oenothera
species (LEE, et al.,1997) e apresentou marcante atividade antiviral, inibindo a
proliferação do vírus herpes simplex (HSV-1 e HSV-2) em testes realizados in vitro
(FUKUCHI et al., 1989).
1'
4''
6''
2''
6'
5'4'
3'2'
1'
5
432
1
12
3
G'
C'
B'
A'
G
C
B
A
O
O
OOH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
O
O
O
4'
4'
2'
6'
6'
O
OH
HO
HO
HO
O
O
OH
R
OH
O
O
O
O
O
O
OHOH
OH
HO
HO
HO
HO
OH
6O
4
6'
6'
2'
4'
4'
HO
HO
O
O
Oenotheina B R= OH Eugeniflorina D1 R= Ogaloil
Figura 2 - Estrutura de dois exemplos de taninos hidrolisáveis isolados de folhas de E.
uniflora.
Pesquisas in vitro mostraram as várias atividades farmacológicas da
Oenoteína B, tais como: potente supressor do gene responsável pelo tumor viral na
mama de ratas (AOKI et al., 1995), hiperplasia prostática (DUCREY et al., 1997),
ação antimicrobiana (SOUZA et al., 2004), citotoxidade em culturas de células
tumorais (WANG et al., 1999), atividade citotóxica (SAKAGAMI et al., 2000), ação
antitumoral (NOMURA et al., 2005) e inibição da metallopeptidase-neural
6
endopeptidase (KISS et al., 2004 e 2006).
Em alguns casos esta atividade é exercida através da potencialização da
defesa imune do hospedeiro pela ativação dos macrófagos e indução da produção
de interleucinas (MIYAMOTO et al., 1997). A atividade anticancerígina também é
devida à inibição da mutagenicidade e inibição da fase de promoção do tumor
(MIYAMOTO et al., 1997; NOMURA et al., 2005).
No caso de hiperplasia e próstata, este elagitanino age inibindo a
proliferação celular, provavelmente através da inibição de enzimas metalopeptidases
(KISS et al., 2004 e 2006), 5-α-redutase e aromatase (DUCREY et al., 1997). A alta
atividade citotóxica observada para esta substância contra células de tumores orais
humanos e de glândulas salivares, pode ser explicada pela indução de apoptose
destas células (SAKAGAMI et al., 2000).
1.3. Compostos Fenólicos
Os fenóis formam um grupo de compostos frequentemente presentes no
nosso dia a dia. O sabor, o odor e a coloração de diversos vegetais que apreciamos
são gerados por esses compostos. Eles não são apenas atrativos para nós, mas
também para outros animais, os quais são atraídos para polinização ou dispersão de
sementes. Além disso, esse grupo de compostos é importante para proteger as
plantas contra: radiação UV, herbívoros e microorganismos patogênicos
(HARBORNE, 1988). Há inclusive certas espécies vegetais que desenvolveram
compostos fenólicos para inibir o crescimento de outras plantas competidoras (ação
alelopática).
Além de sua importância na proteção das plantas contra fatores ambientais e
bióticos adversos, acredita-se que os compostos fenólicos tenham sido
fundamentais para a própria conquista do ambiente terrestre pelas plantas. Esse é o
caso da lignina, a qual proporciona o desenvolvimento do sistema vascular, dando
rigidez aos vasos (TAIZ & ZEIGER, 1998).
Quimicamente dizendo, os chamados compostos fenólicos são substâncias
que possuem pelo menos um anel aromático no qual no mínimo um hidrogênio é
substituído por um grupamento hidroxila. Esses compostos podem ser agrupados
em várias classes, tais como: taninos, flavonóides, cumarinas, lignanas e ligninas.
Os taninos são substâncias fenólicas de alto peso molecular, que apresentam
a habilidade de formar complexos insolúveis em água com alcalóides, gelatinas e
7
outras proteínas (HASLAM et al., 1989). Eles são importantes compostos gustativos,
sendo responsáveis pela adstringência de muitos frutos e produtos vegetais.
Os taninos representam o quarto mais abundante constituinte vegetal, depois
da celulose, da hemicelulose e da lignina. As plantas que contêm altos níveis de
taninos apresentam vantagem evolucionária significativa sobre seus predadores e
outras espécies vegetais, que competem pelo mesmo nicho (SCALBERT, 1991).
Segundo sua estrutura química os taninos são classificados em dois grupos:
taninos hidrolisáveis e taninos condensados (Figura 3). Ambos são encontrados na
forma de monômeros, oligômeros e polímeros, sendo que as propriedades de
adstringência são comuns para as duas classes (MELLO & SANTOS, 2001).
O
OH
O
OH
OH
HO
OH
OH
OH
OH
OH
HO
tanino condensadotanino hidrolisável (elagitanino)
OH
HO
OO
O
O
O
O
OH
OH
HO
HO
HO
HO
OH
O
HO
O
OH
OHHO
O
Figura 3 - Exemplos das duas classes de taninos, condensados e hidrolisáveis.
Os taninos possuem três características principais, que estão relacionadas às
suas atividades biológicas e farmacológicas. A primeira é a sua capacidade de
complexar com proteínas. No processo de transformação da pele animal em couro,
os taninos atuam formando complexos com a proteína colágeno, assim produzindo
um material resistente e durável. No processo de cicatrização de feridas,
queimaduras e inflamações cutâneas também ocorrem a complexação dos taninos
com proteínas e/ou polissacarídeos presentes na pele, formando assim uma camada
protetora contra o ataque de microrganismos. Sob esta camada ocorre então o
processo de cura. Um processo similar provavelmente ocorre no trato digestivo,
onde os taninos formam uma camada, através da complexação com proteínas
digestivas, que protege a mucosa contra toxinas e outros irritantes (HASLAM et al.,
1989). Esses dados podem explicar o uso de plantas ricas em taninos no tratamento
de feridas, queimaduras, inflamações e úlceras gastrointestinais.
A segunda característica é a capacidade de complexação com íons metálicos
como: ferro, manganês, vanádio, cobre, alumínio, cálcio e outros (HASLAM, 1996).
8
Os taninos sempre foram identificados pela formação de uma coloração azul escura
ou verde quando estes entram em contato com sais de ferro. Esta propriedade tem
sido amplamente usada na fabricação de tintas de escrever. Já foi proposto e
comprovado (MILA et al., 1996) que esta capacidade de complexar com ferro (III)
leva a uma limitação no crescimento de microrganismos, como bactérias e fungos.
Taninos podem seqüestrar outros metais, tais como cobre (II) e zinco (II), que
também são essenciais para o crescimento destes microrganismos.
A terceira característica dos taninos é a sua atividade antioxidante e
seqüestradora de radicais livres. Testes in vitro demonstraram que fenóis e
polifenóis inibem a peroxidação de lipídeos e lipoxigenases, assim como possuem a
habilidade de seqüestrarem radicais livres como: hidroxil, superperóxido e peroxil
(HASLAM, 1996). Alguns taninos apresentam atividade in vitro contra diversos tipos
de tumores (OKUDA et al., 1989). Esta atividade pode estar ligada à ação
antioxidante e sequestradora de radicais livres que estas substâncias apresentam.
Os taninos como outros metabólitos secundários variam em sua concentração
nas diversas partes da planta, tais como folhas, flores, casca, tronco e raiz. Esta
variação está relacionada à biossíntese desses metabólitos, seu destino e utilização
dentro da planta. Também ocorre variação nos teores em diferentes estações do
ano, dependendo da época de floração e frutificação e de fatores climáticos, como
pluviosidade, luminosidade e umidade relativa do ar (SANTOS et al., 2006;
SALMINEN et al., 2001 e 2004; SCOGINGS et al., 2004; CLOSE et al., 2001;
GLYPHIS & PUTTICK, 1988; HATANO et al., 1986). Com isso é necessário um
acompanhamento da variação dos teores de taninos para se conhecer a dinâmica
de cada espécie e sua adaptação para as diferentes condições climáticas.
1.4. Metabolismo vegetal
O metabolismo vegetal constitui um conjunto de reações químicas que
ocorrem nas células vegetais. Essas reações visam à produção dos constituintes
químicos das plantas. Primeiramente são sintetizados os compostos necessários
para o crescimento e desenvolvimento das espécies vegetais, tais como açúcares,
aminoácidos, ácidos graxos, nucleotídeos e seus polímeros derivados, que
corresponde ao metabolismo primário das plantas. Os compostos sintetizados por
outras vias fazem parte do metabolismo secundário, que são denominados
compostos secundários. Geralmente estes produtos, que apresentam as
9
substâncias ativas, não se encontram na planta em estado puro, mas sob a forma de
complexos, cujos diferentes componentes se completam e reforçam sua ação sobre
o organismo (DI STASI, 1996).
O metabolismo secundário não é necessário para o crescimento e
desenvolvimento do indivíduo, mas é essencial para a sobrevivência e continuidade
da espécie dentro do ecossistema. Portanto o metabolismo secundário é
responsável pelas relações entre o indivíduo e o ambiente onde ele se encontra e,
por causa do seu caráter adaptativo, pode ser manipulado geneticamente. O fato de
o metabolismo secundário ser regido pelo código genético, e este interagir com o
ambiente, tem grande importância na produção de plantas medicinais, pois a
qualidade do produto final é fortemente influenciada pelas técnicas de cultivo
adotadas em sua produção e pelas características genéticas da população sob
cultivo (REIS & MARIOT, 2001). Existem três grandes grupos de metabólitos
secundários: terpenos, compostos fenólicos e alcalóides.
1.4.1 Biossíntese de compostos fenólicos
Através do metabolismo da glicose são formados praticamente todos os
metabólitos primários e secundários. No metabolismo secundário a glicose é
convertida em moléculas de ácido pirúvico que podem seguir duas vias diferentes.
Na primeira, moléculas de piruvato entram na via do ácido chiquímico que é formado
pela condensação do fosfoenolpiruvato com a eritrose-4-fosfato dando origem aos
taninos hidrolisáveis, fenilpropanóides e aminoácidos aromáticos. Na segunda, o
piruvato continua sendo oxidado até a formação de moléculas de acetil-coenzima a
(acetil-coa) originando os aminoácidos alifáticos e os alcalóides derivados dele,
terpenóides, esteróides, ácidos graxos e triglicerídeos (Figura 4).
A junção do ácido chiquímico com uma molécula de fosfoenolpiruvato forma
o ácido corísmico que gera os aminoácidos aromáticos (triptofano, fenilalanina e
tirosina) que são os precursores de vários alcalóides. Um dos primeiros grupos de
compostos fenólicos formados a partir do ácido corísmico são os fenilpropanóides
que são os precursores da lignina.
A biossíntese dos taninos hidrolisáveis difere dos outros fenilpropanóides
(ligninas, flavonóides e taninos condensados) no fato desses compostos serem
formados no início da via do ácido chiquímico, através do ácido gálico, antes da
formação da fenilalanina (OSSIPOV et al, 2003; NIEMETZ & GROSS, 2005). Em
10
contraste, este aminoácido aromático é utilizado na biossíntese dos outros
fenilpropanóides (Figura 4), competindo assim diretamente com a síntese de
proteínas (HAUKIOJA et al., 1998).
A combinação de uma unidade do ácido chiquímico e uma ou mais unidades
do acetato ou derivados destes, poderá resultar na produção de antraquinonas,
flavonóides e dos taninos condensados.
A principal enzima da via do ácido chiquímico é a fenilalanina amônio-liase
(PAL), que retira o grupo amino da fenilalanina formando o ácido cinâmico. Entre as
substâncias formadas logo após a ação da PAL estão as ligninas (Figura 4). Esta
enzima está no limite entre o metabolismo primário, síntese de proteínas, e o
secundário.
Várias outras enzimas também estão envolvidas na biossíntese de compostos
fenólicos e muitas necessitam de metais como co-fatores, por isso para o bom
funcionamento desta via é vital o suprimento adequado de micronutrientes, que
entram como catalisadores de inúmeras reações bioquímicas (YAMADA, 2004).
Figura 4 – Esquema de biossíntese de compostos fenólicos, no metabolismo das plantas.
Eritrose -4-fosfato +
Fosfoenolpiruvato
Ácido desidrochiquímico
Ácido chiquímico
Ácido gálico Taninos
hidrolisáveis
Fenilalanina Proteínas
Ligninas Cumarinas Flavonóides Taninos condensados Acetil-CoA
Objetivos
2. OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo estudar a influência dos nutrientes
minerais foliares, e também os fatores climáticos na concentração dos compostos
fenólicos em folhas de Eugenia uniflora.
Material e Métodos
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material botânico e dados climáticos
As folhas de Eugenia uniflora foram coletadas mensalmente de uma única
planta na cidade de Anápolis em Goiás (latitude 16º 20’ 12,8’’ e longitude 48º 56’
19,3’’) no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003, totalizando 25 meses.
A árvore foi plantada em 1987, tem cerca de 6 m de altura e pertence à variedade
“pitanga vermelha”. Foram coletadas folhas saudáveis nos quatro quadrantes da
árvore, em várias alturas. As amostras foram identificadas pelo Prof. Heleno D.
Ferreira do departamento de Biologia Geral/UFG. Uma exsicata foi depositada no
herbário da UFG sob o código UFG-25477.
Os dados climáticos mensais (temperatura média, precipitação e umidade
relativa do ar) do período em estudo foram cedidos pela Base Aérea de Anápolis,
Ministério da Aeronáutica.
Após a coleta, as folhas foram dessecadas à temperatura ambiente e ao
abrigo da luz solar. Em seguida, todo o material foi moído separadamente em
moinho de faca com granulação definida e conservado em freezer a -18ºC até o
momento da produção dos extratos.
3.2. Métodos de análise química
3.2.1. Extração para Fenóis
As extrações foram feitas em mesa de agitação, onde 10 g do material seco
de cada mês foram extraídos com solução de acetona 70% durante 10 minutos,
seguido de filtração (HAGERMAN, 1998). O procedimento foi repetido por quatro
vezes e os extratos foram agrupados e evaporados a vácuo em evaporador
rotatório, mantendo a temperatura entre 35 e 40ºC. O precipitado contendo clorofilas
e graxas foi separado por filtração a vácuo. A água restante foi liofilizada sobrando
apenas o extrato liofilizado, que foi usado para os ensaios de doseamento dos
fenóis.
3.2.2. Extração para Análise Foliar
As extrações foram feitas por digestão nitro-perclórica, onde 0,5 g de folha
seca e moída foram transferidas para tubos de ensaio e adicionou-se 6 mL da
15
solução nitro-perclórica (mistura de ácido nítrico e ácido perclórico na proporção de
2:1 v/v). Estas amostras foram levadas ao banho de óleo, a temperatura aumentada
gradativamente até atingir 130ºC, e mantida nessa temperatura até o volume ser
reduzido pela metade. Após esta etapa, a temperatura foi aumentada até atingir
180ºC e foi conservada até obtenção de fumos brancos de HClO4 e o extrato se
tornar incolor. Após a solução esfriar, foi transferida para balão volumétrico de 50 mL
com porções de água destilada até completar o volume. Esses extratos foram
usados para determinação de P, K, Ca, Mg, S, Cu, Fe, Mn e Zn.
Os extratos da digestão nitro-perclórica e amostras das folhas trituradas
e moídas (realização da digestão sulfúrica e determinação de Nitrogênio) foram
encaminhados ao laboratório de análise de solos e foliar, da Escola de Agronomia
da Universidade Federal de Goiás (LASF-EA/UFG), para análise foliar
(MALAVOLTA, VITTI & OLIVEIRA, 1989).
3.2.3. Ensaios para doseamento dos Fenóis
Os extratos liofilizados foram submetidos aos ensaios de quantificação de
fenóis totais, adstringência, taninos hidrolisáveis e flavonóides totais.
Os resultados obtidos em absorbância em cada ensaio foram transformados
através das equações das retas para concentrações do padrão nas amostras em
mg/mL. Para os cálculos do teor do padrão equivalente em mg/g na folha seca foi
usada a seguinte fórmula:
Teor (%) = Conc. do padrão (eq.) na amostra x peso do extrato seco x 1000
Conc. Extrato _ Peso da folha
3.2.3.1. Ensaio para Fenóis Totais
Os extratos liofilizados foram quantificados pelo método de Hagerman-Butler
(MOLE & WATERMAN, 1987). Neste método todos os fenóis são doseados via
complexação desses com cloreto férrico e produção de coloração que é medida a
510nm.
Técnica: Uma solução de concentração de 1,0 mg/mL foi preparada com o
extrato liofilizado usando água destilada. Uma alíquota de 1,0 mL desse extrato
aquoso foi colocada em um tudo de ensaio e adicinado 2,0 mL de solução lauril
sulfato de sódio/trietanolamina (1% de p/v de lauril sulfato de sódio e 5% v/v de
16
trietanolamina) e 1,0 mL de solução de cloreto férrico (1,62g de cloreto férrico em 1
litro de ácido clorídrico 0,01 mol/L). As soluções foram misturadas imediatamente em
vortex. Entre 15 e 30 minutos a absorbância foi medida a 510 nm. Todos os extratos
foram analisados em triplicata. O espectrofotômetro foi calibrado com uma “solução
branco”, que continha solução de lauril sulfato de sódio/trietanolamina (2,0 mL) e
FeCl3 (1,0 mL), antes da leitura das amostras. As medidas foram feitas dentro dos
limites de absorção: 0,1< A< 2,0.
A curva padrão foi feita com ácido tânico (Merck) nas diluições de 0,1; 0,2; 0,4;
0,5; 0,7 e 0,8 mg/mL. O coeficiente de correlação foi de R = 0,9995 e a equação da
reta obtida y = 2,4068x + 0,0003.
3.2.3.2 Ensaio para precipitação de proteínas (adst ringência)
Os extratos liofilizados foram doseados pelo método de Hagerman-Butler
(WATERMAN & MOLE, 1994). Os taninos são complexados com a albumina bovina
sérica, e foram separados dos outros fenóis por centrifugação, o precipitado é
dissolvido com detergente e os taninos são doseados com cloreto férrico que produz
uma coloração medida a 510 nm.
Técnica: Soluções de concentrações de 2,5 mg/mL e 3,5 mg/mL foram
preparadas com o extrato liofolizado usando água destilada. Uma alíquota de 1,0 mL
desse extrato aquoso foi colocada em um tubo de ensaio e adicionado 2,0 mL de
solução de albumina bovina (BSA; fração V, Sigma), preparada em solução tampão
de acetato 0,2 M, pH = 4.9, contendo cloreto de sódio 0,17 M, em cada tubo. A
solução foi misturada e deixada em repouso por 15 minutos à temperatura ambiente
para que o precipitado fosse formado. Em seguida, centrifugada em velocidade
máxima (3000 rpm) por 15 minutos e descartado o sobrenadante. O precipitado foi
dissolvido em 4,0 mL de solução de lauril sulfato de sódio/trietanolamina/isopropanol
(1% de p/v de lauril sulfato de sódio e 5% v/v de trietanolamina e 20% v/v de
isopropanol) e adicionado 1,0 mL de solução de cloreto férrico (1,62g de FeCl3 em 1
litro de ácido clorídrico 0,01M) homogenizada a mistura. Entre 15 a 30 minutos
depois foi feita à leitura da absorbância em 510 nm. Todos os extratos foram
analisados em triplicata. O espectrofotômetro foi calibrado com uma “solução
branco”, que continha solução de lauril sulfato de sódio/trietanolamina /isopropanol
(4,0 mL) e FeCl3 (1,0 mL), antes da leitura das amostras.
17
A curva padrão foi feita com ácido tânico (Merck) nas diluições de 0,3; 0,4; 0,5;
0,6 e 0,8 mg/mL. O coeficiente de correlação foi de R = 0,9953 e a equação da reta
obtida y = 2,07562 x -0,30376.
3.2.3.3 Ensaios para Taninos Hidrolisáveis
Os extratos liofilizados foram doseados pelo método do iodato de potássio
(WILLIS & ALLEN, 1998). Taninos hidrolisáveis formam complexo colorido com
solução aquosa de KIO3 a 2,5%.
Técnica: Uma solução de concentração de 4,0 mg/mL foi preparada com o
extrato liofilizado usando água destilada. Em um banho de água a 25ºC são
colocados tubos de ensaio contendo 5,0 mL de solução de iodato de potássio a
2,5% m/v. Esperou 10 minutos (para equilibrar a temperatura) e adicionou-se 1,0 mL
do extrato aquoso da amostra, misturou em vortex e colocou o tubo de volta no
banho. Após passar o “tempo ótimo” que foi de 5 minutos mede-se a absorbância
em 550 nm. Todos os extratos foram analisados em triplicata. O espectrofotômetro
foi calibrado, antes da leitura das amostras, com uma “solução branco” de iodato de
potássio. A curva padrão foi feita com ácido tânico (Merck) nas diluições de 0,8; 1,2;
1,6; 2,0; 2,4 e 2,8 mg/mL O coeficiente de correlação foi de R = 0,9993 e a
equação da reta obtida y = 0,242529x – 0,36715.
O ‘‘tempo ótimo’’ é determinado para cada tipo de material vegetal analisado
através da reação entre KIO3 e os taninos hidrolisáveis. O ensaio é feito com várias
amostras do mesmo material na mesma concentração. Leituras são feitas em
intervalos de 1 minuto no espectrofotômetro. O tempo ótimo é onde ocorre o máximo
de absorbância. No caso da E. uniflora este tempo foi de 5 minutos.
3.2.3.4 Ensaios para Flavonóides Totais
Os extratos liofilizados foram doseados pelo método adaptado do descrito na
Farmacopéia Helvética, 1990 (PETRY et al., 1998). Os flavonóides são complexados
com cloreto de alumínio.
Técnica: Uma solução de concentração de 2,0 mg/mL foi preparada com o
extrato liofilizado usando água destilada. Uma alíquota de 10,0 mL desse extrato
aquoso foi transferido para um balão volumétrico de 25 mL e adicionou-se 1,0 mL de
solução etanólica de cloreto de alumínio a 12% e completou o volume com solução
etanólica de ácido acético glacial a 5%. Misturou-se e após 30 minutos a
18
absorbância foi medida em 422 nm. Todos os extratos foram analisados em
triplicata. O espectrofotômetro foi calibrado com uma “solução branco” (10,0 mL do
extrato em balão de 25 mL com solução etanólica de ácido acético 5% para
completar o volume, leitura feita após 30 minutos) antes da leitura das amostras.
A curva padrão foi feita com rutina nas diluições de 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05
e 0,06 mg/mL. O coeficiente de correlação foi de R = 0,9975 e a equação da reta
obtida y = 15,4514286x + 0,0021333.
3.3. Análise estatística
Os programas estatísticos utilizados foram o Système Portable d`Analyse des
Données Numériques/SPAD.N, versão 2.5 (LEBART et al., 1994) e o Sistema de
Análise Estatística/SAS, Cary, NC (1996).
A Análise de Componentes Principais (PCA) foi utilizada para estabelecer
interrelação entre os compostos químicos, metais e dados climáticos dos anos das
coletas das amostras. A Análise de Clusters foi utilizada para estudar as
similaridades das amostras nas bases da distribuição dos constituintes. A técnica do
vizinho mais próximo pelo algoritmo de Benzécri (BENZÉCRI, 1980) foi aplicada
para verificar esta similaridade e os agrupamentos hierárquicos foram formados de
acordo com o Método de Variância Mínima de Ward (WARD, 1963).
A correlação entre o conjunto das variáveis dos fenóis e da análise foliar foi
obtida por meio da Análise de Correlação Canônica no procedimento SAS
CANCOR.
Análise de variância (clusters e variáveis químicas e clima como fatores) foi
utilizada para comparar as médias dos resultados químicos e dados climáticos de
cada cluster usando o procedimento SAS GLM. Todos os dados foram avaliados
para a homoscedasticidade das variâncias pelo teste de Hartley. Este teste revelou
heteroscedasticidade para nitrogênio, cobre, ferro e precipitação (chuva). Cobre foi
transformado pelo recíproco de Y (Y-1), precipitação (chuva) pela raiz quadrada de Y
(Y-1/2), nitrogênio e ferro pela ordem dos mesmos. Onde as diferenças entre as
médias foram estabelecidas, aplicou-se o teste de Tukey para comparação entre as
médias. Valores de P<0,05 foram considerados significativos.
Resultados
4. RESULTADOS
4.1. Dados Climáticos
Os dados de umidade relativa do ar (%), temperatura média (oC) e
precipitação (mm), estão representados nos gráficos abaixo (Figuras 5 e 6).
19
20
21
22
23
24
25
dez/
01
jan/0
2
fev/
02
mar
/02
abr/0
2
mai
/02
jun/0
2jul/0
2
ago/
02
set/0
2
out/0
2
nov/
02
dez/
02
jan/0
3
fev/
03
mar
/03
abr/0
3
mai
/03
jun/0
3jul/0
3
ago/
03
set/0
3
out/0
3
nov/
03
dez/
03
t (meses)
50
55
60
65
70
75
80
85
90TemperaturaUmidade
u m i dade %
t empe r a t u r a ºc
Figura 5 – Dados climáticos de temperatura e umidade fornecidos pela Base Aérea de Anápolis correspondente ao período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003, época das coletas das folhas de E. uniflora.
precipitação
0
50
100
150
200
250
300
350
400
dez/
01
jan/0
2
fev/
02
mar
/02
abr/0
2
mai
/02
jun/0
2jul/0
2
ago/
02
set/0
2
out/0
2
nov/
02
dez/
02
jan/0
3
fev/
03
mar
/03
abr/0
3
mai
/03
jun/0
3jul/0
3
ago/
03
set/0
3
out/0
3
nov/
03
dez/
03
t (meses)
mm
Figura 6 – Dado climático de precipitação fornecido pela Base Aérea de Anápolis correspondente ao período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003, época das coletas das folhas de E. uniflora.
Durante as coletas pode-se observar dois períodos entre maio e agosto que
correspondem à estação seca. Entre setembro e novembro existe um período de
transição com pouca chuva, onde ocorre a floração e frutificação da planta. Entre
dezembro a abril se encontra o período chuvoso (Figura 6). Este clima é típico do
planalto central Brasileiro, onde existem duas estações marcantes de uma de seca e
outra de chuva.
21
4.2. Resultados da análise química
4.2.1. Análise foliar
Os resultados obtidos na análise foliar se encontram nas Figuras 7 e 8 e
Anexo 1. O magnésio não apresentou variações significativas durante os 25 meses
nas amostras analisadas (os resultados ficaram entre 0,2 a 0,4 dag/kg) e o enxofre
apresentou poucas variações, sendo que os meses de agosto a dezembro de 2003
apresentaram as menores concentrações.
O fósforo e o potássio apresentaram as maiores concentrações nos meses de
junho de 2003 e outubro 2003, enquanto as menores ocorreram nos meses de
agosto de 2002 e agosto de 2003.
No período de maio a agosto dos dois anos (2002 e 2003) o cálcio apresentou
concentrações maiores, o que coincide com a estação seca onde as folhas estão
passando de adultas para velhas, começando a fase de queda (Figura 7).
No período de agosto de 2002 a novembro de 2002 ocorreram as maiores
concentrações de nitrogênio, época de brotação e crescimento de novas folhas
(Figura 7).
0
1
2
3
4
5
6
7
dez/0
1jan/0
2
fev/02
mar/02
abr/0
2
mai/02
jun/02
jul/02
ago/0
2
set/0
2
out/0
2
nov/0
2
dez/0
2jan/0
3
fev/03
mar/03
abr/0
3
mai/03
jun/03
jul/03
ago/0
3
set/0
3
out/0
3
nov/0
3
dez/0
3
t(meses)
conc
(dag
/kg)
P K S x10 Mg Ca N
Figura 7 – Média das concentrações dos macronutrientes (P, K, S, Mg, Ca e N em dag/Kg) em folhas de E. uniflora no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.
22
0
10
20
30
40
50
60
70
80
dez/
01
jan/
02
fev/
02
mar
/02
abr/0
2
mai
/02
jun/
02ju
l/02
ago/
02
set/0
2
out/0
2
nov/
02
dez/
02
jan/
03
fev/
03
mar
/03
abr/0
3
mai
/03
jun/
03ju
l/03
ago/
03
set/0
3
out/0
3
nov/03
dez/
03
t(meses)
conc
(mg/
kg)
Cu Zn Mn Fe x 10-1
Figura 8 – Média das concentrações dos micronutrientes (Cu, Zn, Mn e Fe em mg/Kg) em folhas de E. uniflora no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.
O ferro apresentou dois momentos de concentração máxima nos dois anos,
esses períodos coincidem com o período de seca que vai de maio a novembro,
sendo que de julho a setembro é a época das folhas mais velhas caírem dando lugar
ao surgimento de folhas novas no início das chuvas (Figura 8).
O zinco apresentou concentrações elevadas nos meses de setembro de 2002
a novembro de 2002 e outubro de 2003 a dezembro 2003 coincidindo com o período
de troca das folhas, logo a planta apresenta muitas folhas jovens (Figura 8).
No período de dezembro de 2001 a fevereiro de 2002 o manganês apresentou
suas maiores concentrações, o que corresponde à época de chuva e a planta está
com suas folhas todas renovadas e adultas (Figura 8).
4.2.2. Extratos liofilizados de folhas de E. uniflora
Os rendimentos dos extratos apresentaram grande variação, de 11,77 a
24,52%, obtendo uma média de 19,7% (Apêndice 2). Os meses de julho e agosto
(2002 e 2003) apresentaram os maiores rendimentos nos dois anos analisados,
enquanto os meses de dezembro de 2001 e janeiro 2002 foram os de menores
rendimentos.
4.2.3 Ensaios para Fenóis
Os teores de fenóis totais, taninos hidrolisáveis, adstringência e flavonóides
totais foram maiores nos meses de dezembro de 2002 e janeiro 2003 quando
23
comparadas as 25 amostras. No mês de julho 2002 também ocorreu um máximo nos
teores de polifenóis, coincidindo com o período mais seco, havendo depois uma
queda com mínimo em dezembro de 2001, quando a planta estava em frutificação
(Figura 9).
Pode-se observar uma flutuação nos teores das substâncias fenólicas, o que
mostra que esta espécie possui um metabolismo dinâmico e mesmo em períodos de
seca, onde outras plantas entram em dormência, ela continua sintetizando altos
teores de metabólitos secundários.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
dez/01
jan/02
fev/02
mar
/02
abr/0
2
mai/02
jun/02
jul/0
2
ago/02
set/0
2
out/0
2
nov/02
dez/02
jan/03
fev/03
mar
/03
abr/0
3
mai/03
jun/03
jul/0
3
ago/03
set/0
3
out/0
3
nov/03
dez/03
t(meses)
conc
. mg/
g Fenóis totaisPrecipitação ProteínasTaninos HidrolisáveisFlavonóides Totaisx10
Figura 9 – Teores médios (mg/g) dos ensaios espectrofotométricos de fenóis totais (FT), adstringência (PP), taninos hidrolisáveis (TH) e flavonóides totais (F) em folhas de E. uniflora no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.
É interessante notar que ocorrem concentrações máximas tanto no período
chuvoso quanto no período de seca (Figura 9), o que significa que não são apenas
os fatores climáticos que estão influenciando na produção destes metabólitos
secundários, outros fatores tais como floração, frutificação, concentração dos metais
e ataque herbívoros e patógenos podem também estar contribuindo para a variação
na síntese destas substâncias.
4.3. Analise estatística
Análise de Componentes Principais (PCA) foi utilizado para estabelecer inter-
relação entre os constituintes químicos, nutrientes minerais e dados climáticos. A
Análise de Clusters foi utilizada para estudar as similaridades das amostras nas
bases da distribuição dos componentes.
24
Os dados climáticos, os resultados dos nutrientes minerais e teores de fenóis
foram submetidos à análise de Clusters e PCA. A PCA foi feita principalmente
utilizando a primeira e segunda componente principal. A porcentagem de informação
dos dados foi de 31,4% no maior autovalor e 20,5% no segundo maior autovalor.
Durante a análise de componentes principais foi constatado que as variáveis:
fósforo, magnésio e enxofre não contribuíram para a variância nos três primeiros
eixos, por isso elas foram retiradas da análise.
-4 -2 0 2 4
-3
-2
-1
0
1
2
3
Fe
Ca
Cu
Mn
Prec
Temp
F PP
FTTH
NZn
�
� �
��
��
�
�
�
�
��
��
� ��
PC
b-2
PCb-1
0,0
1,0
1,0
-1,0
-1,0 0,0
�
�
�
�
�
�
�
PCa-1 (31.4%)
PC
a -2 (2
0.5%
)
Figura 10 – Distribuição dos nutrientes minerais, fenóis e dados climáticos das amostras de folhas de E. uniflora agrupadas em quatro Clusters: I (♦), II (�), III (�) e IV (�), com o maior componente discriminante representado pelos vetores. aEixos referentes aos scores das amostras. bEixos referentes aos scores dos componentes, as variáveis discriminantes estão representadas pelos vetores.
Os resultados obtidos mostraram a posição relativa dos indivíduos em um
espaço discriminante em relação ao sistema axial originado pela PCA (Figura 10). A
porcentagem de informação extraída dos dados nos três eixos foi de 70,66%.
A Primeira Componente Principal (PC-1) separou todos os fenóis dos
metais manganês e cobre. A Segunda Componente Principal (PC-2) separou cálcio
e ferro dos dados climáticos e dos nutrientes zinco e nitrogênio. È interessante
observar que a maioria dos nutrientes se direciona para a parte inferior do gráfico,
ou seja, onde se localizam as amostras de folhas jovens.
25
A Análise de Cluster mostra claramente o agrupamento das amostras em
quatro clusters (Figura 11). O primeiro cluster (set/02-nov/02 e out/03-dez/03),
constituído de folhas jovens, foi caracterizado por conter altos níveis de zinco (19,21
mg/kg) (P < 0,0001) e nitrogênio (3,75 dag/kg) (P < 0,002), enquanto os níveis de
todos os fenóis foram moderados (Tabela 1).
O cluster II (dez/01-abr/02) e o cluster III (dez/02-abr/03) são ambos formados
por amostras de folhas adultas e ocorrem na estação chuvosa, entretanto eles
apresentam comportamentos distintos. Enquanto o grupo II possui os níveis mais
baixos de todos os fenóis (Tabela 1) o grupo III apresentou os mais altos de todos os
grupos (Tabela 1). A grande diferença entre estes grupos pode ser observada nas
concentrações de cobre e manganês, 8,9 e 21,4 mg/kg no grupo II e 5,8 e 13,2
mg/kg no grupo III, respectivamente.
O último cluster (mai/02-ago/02 e mai/03-set/03), que consiste de folhas
velhas da estação seca, foi caracterizado por conter altos níveis de ferro (499 mg/kg)
(P < 0,0001) e cálcio (4,58 dag/kg) (P < 0,014) e quantidades moderadas de fenóis
(Tabela 1).
Figura 11 - Dendograma representando os agrupamentos hierárquicos das amostras de folhas de E. uniflora, relacionando os dados climáticos, nutrientes minerais e teores fenóis formados com a distância Euclidiana das amostras de acordo com o Método de Variância Mínima de Ward. A análise de variância (Tabela 1) confirmou que não existe diferença
significativa nos teores de fenóis totais, adstringência, taninos hidrolisáveis e
flavonóides entre os clusters I e IV. No caso dos flavonóides apenas o grupo II se
26
diferencia dos outros. Dentre os metais, potássio não apresenta nenhuma diferença
significativa entre os grupos.
Tabela 1 – Médias dos resultados dos ensaios de fenóis, análise foliar e dados climáticos para cada grupo obtido na análise de cluster e análise de variância.
Grupo
A
FT
mg/g
PP
mg/g
TH
mg/g
F
mg/g
Umidade
%
Temp.
ºC
Prec.
mm
I 6 82,61a 35,06a 112,21a 3,57a 69,67ab 22,95a 143,63a
II 5 57,15b 24,55b 85,12b 2,09b 77,00a 22,10ab 197,62a
III 5 97,86c 44,55c 134,97c 4,23a 83,20a 22,04ab 214,92a
IV 9 83,68a 33,43a 118,05a 3,36a 62,11b 21,26b 11,84b
Grupo
A
K
dag/kg
Ca
dag/kg
N
dag/kg
Cu
mg/kg
Zn
mg/kg
Mn
mg/kg
Fe
mg/kg
I 6 0,94a 2,48a 3,75a 8,33a 19,21a 17,58ab 350,92a
II 5 0,79a 4,23b 2,28ab 8,90a 13,46b 21,40a 251,00b
III 5 0,93a 4,15b 2,26ab 5,80ab 15,33bc 13,20b 235,60b
IV 9 0,83a 4,58b 2,40b 5,33b 15,63c 15,56b 499,11a
Os valores de média acompanhados da mesma letra na mesma coluna não são significativamente diferentes (p < 0,05) usando teste de Tukey.
Analisando os outros metais foi constatado que o manganês é o único que
apresenta diferença significativa entre os grupos II e III, ambos formados por folhas
adultas. Cálcio, nitrogênio, cobre e zinco foram os nutrientes que se diferenciaram
entre as folhas jovens e velhas (clusters I e IV respectivamente). Ferro e manganês
não mostraram diferenças significativas entre estes mesmos clusters.
Procedeu-se a análise de correlação canônica, entre as variáveis dos fenóis e
os nutrientes das folhas, com o intuito de se estabelecer quais as variáveis que se
correlacionam fortemente entre os dois grupos. Um resumo da análise está
apresentado na Tabela 2.
27
Tabela 2 − Sumário da Análise de Correlação Canônica dos fenóis e os nutrientes foliares.
Compostos fenólicos (mg/g) (conjunto 1)
Variável
canônica (V1)
Nutrientes foliares (mg/kg) (conjunto 2)
Variável
Canônica (W1)
Fenóis Totais 0,969 Cobre - 0,645 Adstringência 0,893 Zinco 0,388 Taninos Hidrolisáveis 0,846 Manganês - 0,812 Flavonóides 0,736
Autovalor 1,313
Correlação Canônica 0,753
Lambda de Wilks 0,219
Graus de liberdade 16
P 0,0215
Índice de Redundância (%)
42,47
A correlação canônica demonstrou que existe uma forte correlação negativa
entre todos os fenóis do primeiro conjunto (Tabela 2) com cobre e manganês do
segundo conjunto, os quais discriminam as amostras do cluster II (dez/01-abr/02).
Ao contrário do zinco que apresenta correlação positiva com todos os fenóis do
primeiro conjunto. Existe uma moderada capacidade de predição da relação entre
compostos fenólicos e nutrientes foliares (42,47%).
O resultado da correlação canônica confirma o que havia sido observado na
PCA (Figura 10), quanto maiores os níveis de Manganês e Cobre menores serão os
teores dos compostos fenólicos. O zinco tem efeito contrário ao Manganês e Cobre,
influenciando positivamente nas quantidades de todos os fenóis.
Discussão
5. DISCUSSÃO
A Análise de Componentes Principais e Análise de Cluster conseguiram
correlacionar às variações nos teores dos compostos fenólicos com a sazonalidade
dos nutrientes foliares, possibilitando a formação de quatro grupos distintos. O
primeiro grupo é constituído de folhas jovens, apresenta altas concentrações de
zinco e nitrogênio e moderados níveis de fenóis. O segundo é formado por folhas
adultas, está no período de chuva, apresenta as maiores concentrações de cobre e
manganês, e as mais baixas de todos os fenóis. O terceiro também é constituído de
folhas adultas, está no período de chuva, e apresenta os mais altos níveis de fenóis
e os mais baixos de Manganês e Cobre. O quarto grupo compõe-se de folhas
maduras, está no período da seca e é rico em ferro e cálcio, com moderada
quantidade de fenóis.
Pode-se observar que três grupos estão no período de chuva (1, 2 e 3) e
apenas o grupo 4 está no período da seca. Ocorreram variações nas quantidades
dos compostos fenólicos nos grupos da época de chuva, mostrando que existem
outros interferentes, além das condições climáticas na produção dos fenóis.
Os metabólitos secundários são afetados por muitos fatores que influenciam
sua estabilidade, biosíntese e degradação. Na biossíntese de fenilpropanóides a
enzima fenilalanina amônia-liase (PAL) é especialmente relevante, porque pode ser
induzida por condições de stress ambientais. As polifenol oxidases e as peroxidases
são enzimas responsáveis tanto pela degradação como pela síntese de diferentes
fenóis (TOMAS-BARBERAN & ESPIN, 2001; LIN, CHEN & LIU, 2005; NIEMETZ &
GROSS, 2005).
A síntese de fenilpropanóides e seus compostos derivados (taninos
condensados e flavonóides) competem diretamente com a síntese de proteínas, e
consequentemente com o crescimento vegetal. Os precursores comuns entre eles
são os aminoácidos fenilalanina e tirosina. Na produção de taninos hidrolisáveis esta
competição com a síntese de proteínas não acontece, pois eles são formados em
etapas anteriores, Figura 4 (HAUKIOJA et al., 1998).
No cluster I constituído de folhas jovens foi encontrado predomínio de
nitrogênio e zinco que estão ligados à formação de células novas e síntese de
proteínas. O nitrogênio é de fundamental importância para o crescimento vegetativo,
serve de constituinte dos componentes celulares (TAIZ & ZEIGER, 1998).
30
Estudo com a Digitalis obscura encontrou altas concentrações de nitrogênio
nas folhas jovens, enquanto nas folhas maduras houve predominância do cálcio. No
período de crescimento da planta e na formação de folhas novas, ela requer mais
carbono e macronutrientes, principalmente fósforo e nitrogênio que são requeridos
para síntese protéica e de RNA, priorizando o metabolismo primário. Nas folhas
completamente desenvolvidas, os índices de nitrogênio e fósforo são mais baixos e
o carbono é mais convergido para o metabolismo secundário (ROCCA-PEREZ et al.,
2005).
Plantas deficientes em nutrientes possuem taxa de crescimento mais baixa e
concentrações mais elevadas de compostos secundários baseados no carbono
(fenóis e terpenos) do que plantas com acesso amplo aos nutrientes. Vários
trabalhos observaram que a produção de fenóis diminui com aumento da
disponibilidade de nitrogênio (HAUKIOJA et al., 1998; YAMADA, 2004; HIKOSAKA
et al., 2005; MONTEIRO et al, 2005).
No presente estudo não houve correlação entre a quantidade de nitrogênio e
os teores de todos os fenóis, como podem ser observados na Tabela 1, onde os
clusters I e IV não apresentam diferenças significativas nas quantidades de todos os
fenóis, apesar dos níveis de nitrogênio serem significativamente diferentes. A análise
por correlação canônica também não mostrou nenhuma correlação entre fenóis e
nitrogênio. Este resultado pode ser explicado primeiro pelo fato dos fenóis
majoritários da planta pertencer ao grupo dos taninos hidrolisáveis, que não
competem com a síntese de proteínas (HAUKIOJA et al., 1998). Outra explicação
seria o fato dos níveis de nitrogênio estar dentro dos limites adequados, comparando
com plantas do mesmo porte (BERGMANN, 1992, citado por MARSCHNER, 1997),
ou seja, neste estudo não houve nem deficiência nem excesso de nitrogênio.
O cluster I também apresentou os mais altos níveis de zinco, e neste caso
existe correlação positiva deste metal com os compostos fenólicos, comprovada pela
Análise de Correlação Canônica, Tabela 2. Estudo recente relaciona o suprimento
de zinco com a expressão de genes ligados à biossíntese de ligninas (VAN DE
MORTEL et al., 2006). Este estudo mostra que este metal participa de sistemas
enzimáticos da via do ácido chiquímico (Figura 4).
Os clusters II e III foram separados pela primeira componente principal (PC-
1), Figura 9, e apresentam comportamentos opostos em relação aos níveis de
compostos fenólicos e os metais Manganês e Cobre. A Análise de Correlação
31
Canônica confirmou a existência de correlações negativas entre esses metais e os
fenóis, Tabela 2. A explicação para estas correlações pode ser encontrada no papel
desses metais em enzimas que participam de reações redox nas células vegetais.
O cobre é cofator das enzimas polifenol oxidases que atuam oxidando os
orto-difenóis para orto-quinonas, reação necessária para biossíntese de ligninas. A
deficiência de cobre leva a diminuição da atividade destas enzimas e como
conseqüência os compostos fenólicos se acumulam e a produção de lignina diminui
(MARSCHNER, 1997; LIN, et al., 2005). Cobre também pode aumentar a atividade
das peroxidases e laccases, que atuam juntas na biossíntese da lignina (LIN, et al.,
2005). Na biossíntese dos elagitaninos são necessárias reações de acoplamento
oxidativo que são realizadas por uma enzima fenol oxidase do tipo lacase, isolada
de folhas de Tellima grandiflora (NIEMETZ & GROSS, 2005).
O manganês ativa diversas enzimas da via do ácido chiquímico, conduzindo a
biossíntese de aminoácidos aromáticos e vários produtos secundários, tais como
lignina, flavonóides e ácido indol acético. Este metal afeta a atividade da fenilalanina
amônia-liase e estimulam as peroxidases que atuam na biossíntese de lignina e que
requerem compostos fenólicos e H2O2 como substratos (MARSCHNER, 1997).
Em vista do papel destes metais em enzimas que promovem a oxidação dos
fenóis pode-se sugerir que os teores mais baixos desses metabólitos no cluster II
foram devidos mais ao aumento da degradação deles, para síntese de lignina, do
que propriamente à diminuição de sua biossíntese.
A maior quantidade de ligninas também pode levar a uma maior interação dos
taninos com este polímero, o que diminui a quantidade de taninos solúveis. Houve
um aumento na quantidade de elagitaninos insolúveis durante o desenvolvimento
das folhas, de jovens para maduras. Estes estariam ligados aos polímeros da
parede celular, tais como celulose e lignina (SALMINEN et al 2001.; SALMINEN et
al.,2002). Essa associação dos taninos com a parede celular aumentaria ainda mais
a rigidez da folha, tornando-a mais resistente ao ataque de herbívoros.
O cluster IV é constituído de folhas maduras e ocorre predomínio de ferro e
cálcio. Normalmente ocorre um declínio no nível de metais durante o
envelhecimento das folhas, devido a translocação dos nutrientes para folhas mais
jovens e também pelo efeito de diluição, conseqüência do aumento de compostos
estruturais da folha (MARSCHNER, 1997). Entretanto foi observado que cálcio e
ferro são exceções apresentando maiores concentrações em folhas mais velhas,
32
possivelmente em função do menor transporte desses metais no floema e
conseqüente acúmulo nas folhas maduras (SÁNCHEZ-ALONSO & LACHICA, 1987;
ROCCA-PEREZ et al., 2005). Outra hipótese pode ser acúmulo de poeira nas folhas,
o solo do local da coleta é rico em ferro e as folhas não foram lavadas.
Apesar de esses nutrientes ninerais caracterizarem o cluster IV, a Análise de
Correlação Canônica mostrou que não existe correlação significativa deles com
nenhum dos fenóis. Ou seja, a quantidade de fenóis independe dos níveis de cálcio
e ferro, pelo menos neste estudo. Entretanto existem correlações significativas
destes metais com fatores climáticos, cálcio tem correlação negativa com a
temperatura (p<0,05) e ferro apresentou correlação negativa com precipitação
(p<0,01), segundo a matriz de correlação da Análise de Componentes Principais.
Pelos resultados obtidos para as folhas de E. uniflora foi possível verificar que
existe uma dinâmica de síntese e decomposição de compostos fenólicos que se
relaciona não apenas com os fatores climáticos e bióticos, mas também com a
composição de nutrientes dentro da própria planta. A forte correlação positiva com
manganês e cobre indica que existe uma competição interna entre a síntese de
taninos hidrolisáveis e flavonóides e a síntese de ligninas. Este dado é um dos que
deve ser considerado quando se pretende aumentar os níveis de compostos
biologicamente ativos durante o cultivo da planta.
Foi observado que o período de chuva associado à deficiência de manganês e
cobre propicia a maior produção de fenóis (taninos), portanto para maior rendimento
dos princípios ativos com fins terapêuticos a coleta deve ser preferencialmente na
época chuvosa e com deficiência nutricional de manganês e cobre.
Conclusão
6. CONCLUSÃO
� Existe uma considerável influência de pelo menos três micronutrientes nos
níveis dos compostos fenólicos.
� O zinco apresenta uma moderada correlação positiva.
� O manganês e cobre possuem forte correlação negativa.
� Esses dados indicam que existe uma competição entre a biossíntese e
degradação das diferentes classes de compostos fenólicos, que dependendo
do balanço desses metais nas folhas, uma dessas classes será favorecida.
� Neste estudo não houve correlação dos fenóis com os fatores climáticos.
Referências Bibliográficas
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Apêndices
8. APÊNDICES Apêndice 1 – Concentrações dos macronutrientes (N, P, K, S, Ca e Mg) e micronutrientes (Zn, Cu, Mn e Fe), dosados por espectroscopia e fotometria em folhas de pitangueira no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.
Amostra
N
dag/kg
P
dag/kg
K
dag/kg
S
dag/kg
Mg
dag/kg
Ca
dag/kg
Cu
mg/kg
Zn
mg/kg
Mn
mg/kg
Fe
mg/kg
dez/01 2,24 0,281 0,77 0,115 0,30 4,35 16 14,3 27,5 254,50 jan/02 2,49 0,322 0,72 0,135 0,40 4,00 8,0 13,4 22,5 279,50 fev/02 2,49 0,375 0,81 0,170 0,30 2,70 8,0 14,4 21,5 263,50 mar/02 2,13 0,514 0,82 0,155 0,40 4,70 6,5 13,2 16,5 216,50 abr/02 2,07 0,375 0,82 0,155 0,30 5,40 6,0 12,1 19,0 241,00 mai/02 2,35 0,316 0,75 0,105 0,30 6,35 6,0 12,3 21,5 326,50 jun/02 2,04 0,310 0,91 0,150 0,35 4,40 7,5 18,0 18,0 349,50 jul/02 2,02 0,348 0,80 0,180 0,25 3,55 6,0 15,9 13,5 478,50
ago/02 4,90 0,291 0,65 0,150 0,30 4,40 4,0 15,7 16,5 550,00 set/02 4,54 0,445 0,83 0,160 0,40 2,45 8,5 18,6 18,5 381,00 out/02 4,96 0,416 0,86 0,150 0,30 2,10 9,5 19,9 16,0 373,00 nov/02 5,38 0,388 0,96 0,100 0,20 3,70 9,0 18,6 19,5 325,50 dez/02 2,35 0,403 0,90 0,105 0,30 3,15 6,5 16,6 13,0 229,00 jan/03 2,27 0,416 0,98 0,140 0,25 3,75 5,5 14,9 11,5 232,50 fev/03 2,27 0,430 1,02 0,130 0,30 4,30 5,5 14,0 10,0 231,50 mar/03 2,13 0,348 0,80 0,135 0,25 4,45 6,0 15,2 17,5 248,50 abr/03 2,30 0,438 0,96 0,145 0,35 5,10 5,5 16,1 14,0 236,50 mai/03 2,10 0,273 0,80 0,155 0,25 4,00 5,0 14,2 13,5 292,50 jun/03 1,88 0,588 1,19 0,155 0,35 4,30 6,0 16,4 10,5 485,50 jul/03 2,07 0,375 0,84 0,150 0,30 4,00 4,0 15,8 12,0 721,50
ago/03 2,21 0,279 0,75 0,100 0,30 5,10 4,0 15,6 17,5 572,50 set/03 2,02 0,316 0,80 0,100 0,20 5,15 5,5 17,1 17,0 715,50 out/03 2,94 0,613 1,19 0,105 0,35 2,05 11,5 21,5 17,0 445,00 nov/03 2,32 0,368 0,98 0,080 0,20 2,10 6,0 18,5 13,5 323,00 dez/03 2,38 0,368 0,82 0,070 0,40 2,50 5,5 18,4 21,0 258,00
44
Apêndice 2 – Teores médios e desvio padrão dos rendimentos totais dos extratos liofilizados (RTEL), fenóis totais (FT), adstringência (PP), taninos hidrolisáveis (TH) e flavonóides totais (F) em folhas de pitangueira no período de dezembro de 2001 a dezembro de 2003.
Amostra
RTEL %
Fenóis Totais* mg/g
Precipitação Proteínas*
mg/g
Taninos Hidrolisáveis*
mg/g
Flavonóides Totais**
mg/g dez/01 13,88 52,59 (1,35) 20,97 (0,31) 83,31 (0,41) 1,52 (0,01) jan/02 11,77 54,13 (0,79) 26,77 (0,09) 80,80 (0,42) 2,43 (0,01) fev/02 15,56 58,86 (1,36) 24,79 (0,05) 89,65 (0,91) 1,91 (0,04) mar/02 14,66 58,12 (0,45) 24,63 (0,22) 80,81 (0,25) 2,26 (0,02) abr/02 16,40 62,04 (0,47) 25,58 (0,19) 91,03 (0,33) 2,34 (0,00) mai/02 20,23 85,17 (1,71) 33,97 (0,40) 108,85 (0,83) 2,92 (0,36) jun/02 20,05 77,98 (0,91) 36,39 (0,27) 118,72 (0,11) 2,76 (0,04) jul/02 23,06 87,98 (1,37) 42,61 (0,20) 135,37 (1,55) 4,08 (0,04)
ago/02 24,52 90,32 (1,03) 32,08 (0,09) 121,88 (0,68) 3,15 (0,01) set/02 20,53 81,52 (0,72) 35,97 (0,45) 121,87 (0,62) 4,30 (0,05) out/02 19,64 77,89 (1,27) 30,10 (0,20) 104,45 (0,65) 4,89 (0,06) nov/02 19,82 82,49 (0,29) 38,96 (0,40) 121,67 (0,39) 3,00 (0,06) dez/02 23,92 101,88 (0,81) 52,22 (0,21) 156,40 (1,18) 5,00 (0,03) jan/03 22,95 105,34 (0,51) 49,61 (0,26) 149,13 (0,21) 4,49 (0,02) fev/03 20,49 96,10 (1,72) 41,60 (0,10) 124,72 (0,32) 3,12 (0,05) mar/03 20,68 89,47 (0,62) 36,17 (0,23) 119,19 (0,59) 4,46 (0,04) abr/03 21,14 96,51 (1,09) 43,14 (0,49) 125,40 (1,76) 4,07 (0,04) mai/03 21,91 80,92 (1,09) 28,36 (0,07) 117,08 (0,51) 3,83 (0,03) jun/03 20,68 77,36 (0,67) 31,02 (0,16) 107,43 (0,19) 2,40 (0,01) jul/03 23,67 97,69 (0,98) 37,79 (0,26) 125,32 (0,82) 3,44 (0,04)
ago/03 24,05 79,03 (0,93) 31,30 (0,06) 118,08 (0,38) 4,15 (0,02) set/03 18,82 76,63 (1,01) 27,32 (0,22) 109,76 (0,82) 3,47 (0,06) out/03 16,44 79,72 (0,42) 29,56 (0,05) 106,79 (0,30) 3,65 (0,03) nov/03 17,16 80,66 (0,35) 35,70 (0,06) 104,73 (0,35) 2,31 (0,01) dez/03 19,89 93,37 (0,83) 40,04 (0,17) 113,75 (1,26) 3,25 (0,02)
*resultados em ácido tânico equivalente mg/g de folha seca. ** resultados em rutina equivalente mg/g de folha seca.
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