rita luz biocell

8/8/2019 rita luz BioCell

1/52

Fac uldade de Medic ina d e Lisboa

BBiioo lloogg iiaa

MMoo lleecc uullaa rrdd aa CC lluullaa

1Ano2003/ 2004


2/52

FML Biologia Molecular da Clula

Este documento inclui resumos de uma parte da matrialeccionada na disciplina de Biologia Molecular da Clula. Oscaptulos correspondem aos do livro aconselhado (The Cell,

Cooper and Hausman) estando ausentes os referentes aCancro e Ciclo Celular.

Torna-se importante referir que os seguintesapontamentos no foram revistos, logo, natural que seencontrem erros.

Espero que este resumo seja til para a reviso dematria, pois sempre aconselhvel estudar pelo livro.

Rita Luz

2


3/52


33.. PPrriinncc pp iiooss FFuunndd aa mm eennttaa iiss dd aa BBiioo lloogg iiaa

Hered itariedad e, Genes e DNA

1. Genes e Crom ossomas

Genes: Nucletidos com determinada sequncia de bases no DNA Unidade dos cromossomas que transmite caractersticas de pais para filhos Unidade de diferena que torna distintos os indivduos de uma populao Registo histrico das alteraes sofridas pelos organismos ao longo do tempo. Os genes podem apresentar formas alternativas responsveis pelos caracterescontrastantes. As formas alternativas de um mesmo gene so chamadas genes alelos.

Locus: a zona de um cromossoma onde se situa um gene e corresponde, portanto, localizao fsica do gene.Loci: o plural de locus e onde os dois alelos que controlam um determinadocarcter esto localizados, nos dois cromossomas homlogos.

Genes autossmicos: so os genes que se localizam nos autossomas e o seu modo detransmisso define a hereditariedade autossmica.Factor dominante: o factor que se manifesta quando os dois factores se encontramem presena um do outro.Factor recessivo: o factor que no se manifesta quando em presena do dominantecorrespondente.

Gentipo: constituio gentica de um indivduo em relao a uma determinadacaracterstica, isto , o gentipo diz respeito poro da molcula de DNA que seexpressa numa determinada caracterstica.Fentipo: o conjunto de caracteres que um indivduo manifesta resultantes do seugentipo, corresponde ao modo como o gentipo se expressa. O fentipocompreende as caractersticas anatmicas, fisiolgicas e at comportamentais que seobservam no indivduo.

Homozigtico: quando os dois alelos de um par de cromossomas homlogos soidnticos. Todos os seus gmetas so idnticos relativamente aos genes considerados.Pode serhomozigtico dominante , se o par de alelos for o factor dominante e podeser homozigtico recessivo, se o par de alelos for o factor recessivo.Heterozigtico: se os dois alelos de um par de cromosomas homlogos so diferentes,origina gmetas que so uns portadores de uma forma allica e outros da outra forma

allica.Caritipo: conjunto de cromossomas de uma clula, que pelo nmero, forma etamanho caracteriza uma dada espcie.Cromossomas homlogos: so pares de cromossomas que so semelhantes entre si eque contm informao gentica para o mesmo fim, embora possam ser diferente.Clulas haplides: clulas cujos ncleos no apresentam cromossomas homlogos. (n)Clulas diplides: clulas cujos ncleos apresentam cromossomas homlogos. (2n)

Meiose: processo de diviso nuclear atravs do qual um ncleo diploide origina quatroncleos haplides, isto , h reduo do nmero de cromossomas em cada novaclula (passa a metade). Assim, os organismos que se reproduzem sexualmenteatravs da fecundao mantm nas suas clulas somticas o mesmo nmero de

cromossomas, de gerao para gerao. Durante a meiose, os cromossomas trocamde material, levando recombinao entre genes.

3


4/52


2. Gene s e Enzimas

Cada gene especifica a estrutura de uma nica enzima: um gene uma enzima.

3. Identific a o d o DNA c omo ma terial Gentico

Descoberta que o principio transformador era o DNA atravs da demonstrao que aactividade deste principio era abolida pela digesto enzimtica do DNA e no dasprotenas.

4. Estrutura do DNA

Constituintes dos nuc letidos: cido fosfrico: molcula com um tomo de fsforo, que confere aos cidos

nucleicos as suas caractersticas cidas. Pentoses: monossacardeo com cinco tomos de carbono. A pentose do DNA a

desoxirrobose (com apenas 4 tomos de carbono) e a pentose do RNA a ribose(com 5 tomos de carbono).

Bases azotadas (varivel de nucletido para nucletido) Purinas (anel duplo) - Adenina (A) e Guanina (G) Pirimidinas (anel simples) - Timina (T) - apenas no ADN, Uracilo (U) - apenas no

RNA, Citosina (C)

Estrutura do DNA: So polmeros constitudos pornucletidos A sua unio realizada por reaces de

condensao O grupo hidroxilo do C5 da desoxirribose reage com

o oxignio do grupo fosfato (que est ligado ao C1)resultando numa ponte fosfodister com libertaode gua.

Cada novo nucletido liga-se pelo grupo fosfato queest ligado ao carbono 5' da base azotada, aocarbono 3' da pentose do ltimo nucletido dacadeia, repetindo-se o processo 5' 3'.

Segundo o modelo da dupla hlice de Watson eCrick, cada molcula de DNA constituda por duascadeias enroladas helicoidalmente volta de ummesmo eixo, antiparalelamente.

A pentose e o cido fosfrico so hidroflicos por isso encontram-se no exterior da

estrutura do DNA. As bases azotadas so hidrofbicas por isso encontram-se naparte interior da estrutura do DNA.

As bases que se emparelham so as bases complementares: a Adenina liga-se Timina ( A = T) por duas ligaes de hidrognio; a Guanina liga-se Citosina (G C) por trs ligaes de hidrognio.Se uma cadeia tiver mais ligaes A = T torna-se mais instvel.

As duas cadeias polinucleotidcas da dupla hlice desenvolvem-se em direcesopostas. Cada uma delas inicia-se por uma extremidade 5' e termina em 3'.

4


5/52


5. Rep lica o do DNA

A descoberta da complementaridade de bases entre as cadeias de DNA sugeriu queelas poderiam separar-se para servir como molde para a sntese de novas cadeiascomplementares hiptese de replic a o semic onservativa .

Segundo a hiptese de replicao semiconservativa podem considerar-se vriasetapas:

1. As duas cadeias da dupla hlice na presena de enzimas especficas, DNApolimerases, separam-se por ruptura das ligaes de hidrognio.

2. Cada uma dessas cadeias serve de molde formao de uma cadeiacomplementar, sendo utilizados nucletidos que existem livres na clula.

3. Formam-se simultaneamente duas cadeias de desoxirribonucletidos deacordo coma regra das bases complementares. Os novos nucletidos, medida que se vo colocando, ligam-se por aco enzimtica desoxirribosedo nucletido anterior, desenvolvendo-se duas cadeias complementares dasduas cadeias originais, sendo cada cadeia antiparalela em relao que lhesserviu de molde.

4. As reaces de condensao ordenada de nucletido processam-se nosentido 5' 3', crescendo duas cadeias em sentidos opostos.

5. Quando o processo de replicao termina esto formadas duas molculas deDNA idnticas entre si e idnticas molcula original.

Replicao: provm do facto de as novas cadeias formadas serem uma rplica dascadeias originais, o que leva a uma identidade entre as molculas recm-formadas ea molcula original.Semiconservativa: pelo facto de permanecer, em cada uma das novas molculas,uma das cadeias polinucleotdicas da molcula original.

AZT

Liga-se extremidade 3 da sequncia de nucletidos Impede a ligao do grupo fosfato do nucletido seguinte eficaz no tratamento da SIDA, pois o vrus HIV ao entrar na clula tem que se

replicar, se existir AZT na extremidade da sequncia impossvel a adio de novosnucletidos

Trava o crescimento do DNA, mas no para, pois existem muitas cadeias de DNA.

5


6/52


Expresso da Informa o Gentica

Os genes actuam na determinao da estrutura das protenas, responsveis pelometabolismo celular atravs da actividade das enzimas

As protenas so polmeros de 20 aminocidos cuja sequncia determina a funoe estrutura.

1. Colinearidade de Genes e Protenas

A ordem dos nucletidos especifica a ordem dos aminocidos da protena. Mutaes num gene implica alteraes na sequncia de DNA, a qual poderia

resultar na substituio de um nucletido por outro, adio ou deleco. A posio da mutao no gene reflecte-se na posio do aminocido da

protena codificada.

2. A funo do RNA mensag eiro Apesar do DNA especificar a ordem dos aminocidos nas protenas no

necessariamente o responsvel directo pela sntese proteica. O DNA encontra-se no ncleo celular, nas clulas eucariotas, e a sntese proteica

d-se no citoplasma, logo existe uma molcula que transporta a informaogentica para os locais de sntese proteica (ribossomas)

O RNA sintetizado a partir de uma molde de DNA, sendo o intermedirio para asntese proteica.

RNA DNA, porque: constitudo por uma nica cadeiaO componente glicidico a ribose e no a desoxirriboseTem como base pirimidinica o uracilo em substituio da timina

Como o RNA se encontra no citoplasma, este aparece como intermedirio daconverso da informao do DNA para os ribossomas, assim:

As molculas de RNA so sintetizadas a partir do mode de DNA transcrio As porteinas so sintetizadas de moldes de RNA - traduo O RNA mensageiro (por servir de intermedirio) transcrito do DNA pela RNA

polimerase que cataliza a sntese de RNA a partir do molde de DNA.

Existem mais tipos de RNA importantes para a sntese proteica:RNA ribossomal (rRNA): um componente dos ribossomasRNA de transferncia (tRNA): serve como molcula adaptadora dos aminocidos

ao longo do mRNA.

6


7/52


3. Cdigo Gentic o

No existe complementaridade entre os aminocidos e o mRNA, logo existemtRNAs que servem de adaptadores durante a traduo.

Cada aminocido ligado, por uma enzima especfica, ao tRNA apropriado O emparelhamento entre as bases de mRNA e tRNA dirige o aminocido que lhe

est ligado para o local correcto do molde de mRNA. A partir de sequncias das quatro bases nucleotdicas do DNA - adenina (A), timina

(T), citosina (C) e guanina (G) - possvel formar exactamente 64 palavras cdigode trs letras diferentes, tripletos ou codes.

Estes tripletos representam a mais pequena unidade da mensagem gentica quevo codificar a ordenao de sries de aminocidos que caracterizam diversasprotenas.

Trs das 64 palavras possveis so utilizadas como sinais de paragem (cod e s STOP),significando que se, chegou ao fimdo cdigo de uma protena.

As outras codificam os 20 aminocidos. Mais que uma palavra, alis entre uma e seis, podem codificar o mesmo

aminocido. A introduo ou retirada de 1 ou 2 nucletidos alteram a leitura do gene inteiro,

enquanto que a introduo ou retirada de 3 nucletidos leva a que a protenatenha mais ou menos um aminocido; o resto da sequncia mantm-se inalterada.

A leitura dos nucletidos comea num local fixo.

Caractersticas do cdigo gentico: "Universalidade" - h uma linguagem comum a quase todas as clulas, mas

existem excepes regra tal como o caso dos protozorios ou o caso do ADNdas mitocdrias.

Redundncia - neste cdigo vrios codes so sinnimos, isto , podem codificar omesmo aminocido. Este fenmeno tambm conhecido por degenerescncia docdigo gentico.

O cdigo no ambguo - o mesmo codo em regra no codifica aminocidosdiferentes.

O terce iro nucletido de c ad a c od o no to espec fico c omo o p rimeiro O tripleto AUG tem uma dupla funo - codifica o aminocido metionina e uma

codo de iniciao da sntese proteica. Os triple tos UAA, UAG e UGA so c od es de finaliza o - estes codes representam

sinais de fim de sntese e no codificam aminocidos.

4. Vrus RNA e transcri o reversa

Existem vrus que contm apenas RNA e protenas. So capazes de sintetizar RNA atravs do RNA modelo, usando o mesmo sistema

de complementaridade de bases que na replicao de DNA ou transcrio deDNA para RNA.

Este processo implica a aco de uma enzima especfica. Os vrus que contm apenas RNA (os retrovirus) replicam, via sntese de DNA

intermdio, o DNA provirus. Os retrovirus, contm uma enzima especifica (transc ripta se reversa) que cataliza a

sntese de DNA a partir de RNA transcrio reversa . A transcrio reversa importante :

1. Para a replicao dos retrovirus2. Como no restrita aos retrovirus, tambm ocorre nas clulas, responsvel

pela transposio de sequncia de DNA de um cromossoma para outro.

3. As transcriptases reversas podem ser utilizadas para gerar copias de DNA apartir do RNA, permitindo o estudo de mRNAs de clulas eucariotas.

7


8/52


DNA Rec om binante

A manipulao gentica permite a criao de uma nova molcula de DNA,geralmente pela recombinao de DNA de diferentes organismos, por meios artificiais,utilizando-se enzimas conhecidas como enzimas de restrio , e a consequenteproduo de muitas cpias de DNA recombinante. Este processo designa-seclonagem .

Os pa ssos b sicos numa experincia de clonagem molecular so os seguintes:1. Insere-se o fragmento de DNA a ser clonado numa molcula de DNA com

capacidade de auto-replicao, denominada vector, originando umamolc ula de DNA rec omb inante.

2. O vector funciona com um veculo que introduz o DNA numa clulahospedeira, geralmente bactria, embora se possam usar outros tipos declulas.

3. Uma vez no interior da clula hospedeira o vector multiplica-se, produzindo-seinmeras cpias idnticas, no s do vector mas tambm do fragmento deDNA que ele contm.

4. Quando a clula hospedeira se divide, as cpias das molculas de DNArecombinante so transmitidas descendncia e ocorre novo ciclo dereplicao.

5. Aps um grande nmero de divises celulares, uma colnia ou clone declulas hospedeiras geneticamente idnticas gerado. Cada clula do clonecontm muitas cpias da molcula de DNA recombinante; o fragmento deDNA introduzido na molcula de DNA recombinante diz-se agora clonado.

6. Para alm da obteno de mltiplas cpias idnticas de um fragmento deDNA, a clonagem de um gene num vector adequado (vector de expresso)permite a obteno de grandes quantidades de protena recombinante.

1. Vectores de c lonagem

Molculas de DNA que tm como funo transportar o DNA de interesse para aclula hospedeira.

Geralmente so vectores plasmdicos que tm como base plasmdeos naturais queso posteriormente modificados por tcnicas de engenharia gentica.

Os plasmideos so pequenas molculas de DNA circular que se replicamindependentemente (sem estarem associados ao cromossosma).

As caractersticas mais importantes de um vector de clonagem so: Origem de replicao (ORI): permite que o vector e a molcula de DNA

recombinante, se mantenha na clula e seja transmitida descendncia. Marca de seleco : a maioria dos vectores plasmdicos possui um gene que

confere resistncia a um antibitico. Assim, apenas as bactrias que possuem oDNA recombinante sobrevivem quando crescidas em presena desseantibitico.

Local de policlonagem (MCS): pequenasequncia de DNA (~100 pb) que contmlocais de corte nicos para vrias enzimas derestrio. neste local que introduzido ofragmento de DNA que se pretende clonar.

Promotor

Vector B

Local deOrigem de policlonagemreplicao

Promotor: presente apenas em vectores deexpresso e localizado a montante do localde policlonagem. A maquinaria detranscrio gentica identifica a sequnciado promotor e transcreve a partir desse local.

Serve para quando se pretende a sntese deprotenas. Resistncia a ampicilina

8


9/52


2. Enzimas de restri o

So o bisturi que permitem cortar o DNA de um modo preciso e reprodutvel. Fazem parte do grupo das nucleases, enzimas que clivam ligaes fosfodiester

entre nucletidos adjacentes. Clivam apenas as ligaes entre nucletidos com uma sequncia especfica. Existem nas bactrias servindo como o modo de defesa contra a entrada de DNA

estranho (p.ex.: viral) na clula que contenha a sequncia especifica identificadapela enzima em causa.

Reconhecem sequncias com 4 a 8 pares de bases. Existem enzimas que de modo a evitar a autodestruio de cadeia, ao

reconhecerem sequncias estranhas introduzem um grupo metilo (metilases).

Mapas de restrio: mostram os locais de quebra de diferentes endonucleases derestrio de molculas de DNA.

3. Forma o de molc ulas de DNA recomb inante

As enzimas de restrio digerem o plasmideo e o DNA deixando livresextremidades com sequncias especificas.

As extremidades do vector e do fragmento de DNA so unidas pelacomplementaridade das bases pela aco de DNA liga ses no especificas.

Se o vector e o DNA forem tratados com a mesma enzima de restrio, asextremidades so complementares, facilitando o processo, no entanto existem 4possbilidades para a ligao:

1.O vector liga-se a si prprio2.O fragmento de DNA liga-se correctamente3.O fragmento de DNA liga-se ao contrrio

4.Liga-se mais do que um fragmento de DNA ao mesmo vector.

Se as 2 extremidades forem cortadas com enzimas de restrio diferentes, aespecificidade maior, logo o fragmento s se pode ligar correctamente.

Os fragmentos de DNA que so clonados no esto limitados aqueles queterminam em locais de quebra das enzimas de restrio.

Existem DNA linkers sintticos contendo locais das endonucleases de restrioque podem ser unidos s extremidades cegas de qualquer fragmento de DNA

Estes linkers so pequenos oligonucletidos que podem ser obtidos por sntesequmica, permitindo virtualmente que qualquer fragmento esteja preparado paraa ligao com o vector.

As extremidades protuberantes tambm podem ser tornadas cegas (blunt)

atravs do uso exonucleases. O RNA tambm pode ser clonado utilizando a transc riptase reversa que sintetiza

DNA (cDNA) a partir do RNA. Como o mRNA contm sequncias que no codificam aminocidos para

determinada protena, os intres, a sntese de cDNA a partir do mRNA sem osintres, crucial para o estudo de um gene.

Fosfatases: retiram os grupos fosfato do plasmideo, no entanto a ligao s seestabelece na 1 volta da replicao, j na bactria.

9


10/52


Aps a produo de DNA recombinante, abrem-se poros na bactria (peladestabilizao dos ies) para a entrada da molcula produzida.

De seguida necessrio realizar uma seleco das bactrias que contm o DNArecombinante, partindo do principio que se o tiverem so resistentes ao antibitico.Para este processo as bactrias so colocadas num meio com antibitico, asclulas que no tiverem DNA recombinante no sobrevivem.

Depois, necessrio realizar um extraco do DNA, aps lise das paredes celulares,de modo a poder analis-lo.

O cromossoma separado do DNA recombinante por centrifugao, devido ssuas diferenas de tamanho.

O DNA recombinante novamente sujeito digesto por aco das enzimas derestrio, linearizando a molcula.

Os fragmentos de DNA so sujeitos a electroforese. Como nem todos os insertos se ligam ao vector, ou podem ligar-se correcta ou

incorrectamente, a electroforese de DNA permite distinguir pelo tamanho eutilizando enzimas de restrio, pelo estudos dos mapas de restrio, todas estassequncias.

4. Elec troforese de DNA em g el

o mtodo utilizado para separar, identificar e purificar fragmentos de DNAconsoante o seu comportamento num campo elctrico.

O gel geralmente a agarose (polmero extrado do agar) ou poliacrilamida. Os geis preparam-se fundindo a agarose na presena de um tampo apropriado. A soluo obtida deitada num molde e deixada arrefecer at solidificar. Ao solidificar forma-se uma matriz cuja densidade determinada pela

concentrao da agarose. Quando se aplica um campo elctrico atravs do gel, o DNA carregado

negativamente (devido aos grupos fosfato) migra em direco ao nodo

(elctrodo positivo). A velocidade de migrao determinada por um conjunto de parmetros, entre

os quais o tamanho da m olcula e a co ncentra o d a a garose . O gel actua como um filtro, retardando selectivamente as molculas maiores,

enquanto que as molculas mais pequenas movem-se mais rapidamente. A velocidade de migrao inversamente proporcional ao log10 do tamanho do

fragmento (em bp) e, para um mesmo tamanho de fragmento de DNA, avelocidade de migrao maior num gel com menor concentrao de agarose.

Para a separao de molculas maiores utilizam-se gis pouco concentrados evice-versa.

A migrao das molculas de DNA atravs do gel, depende ainda da voltagem aplicada; quanto mais alta for a voltagem, mais rpida a migrao.

Para visualizar o DNA nos geis de agarose utiliza-se o corante fluorescente brometode etdio. Esta substncia possui grupos qumicos que se intercalam entre as basesdo DNA. Em consequncia, o corante ligado ao DNA fluoresce com maisintensidade do que o corante livre, quando irradiado com luz ultravioleta.

O brometo de etdio permite detectar cadeias simples e duplas de cidosnucleicos, tanto DNA como RNA.

Por conveno, os gis de DNA so lidos da esquerda para a direita, com os pooscolocados no topo.

A rea do gel perpendicular ao poo designa-se pista ou lane. Ao olhar para uma laneanalisam-se os fragmentos de DNA colocados nesse poo. Fragmentos de DNA com o mesmo tamanho migram a mesma distncia no gel

dando origem a bandas. Por conveno, o tamanho de cada fragmento de DNA expresso pelo nmerode pa res de ba ses que o constituem (bp).

10


11/52


5. Sequenc ia o de DNA

A clonagem molecular permite o isolamento de fragmentos individuais de DNA emquantidades adequadas para caracterizao adequada, inclusive determinaoda sequencia de nucletidos.

A sequenciao permite: Saber a protena produto Estudar as propriedades de sequencias de DNA que regulam a

expresso do gene.

Processo:1. Desnatura-se o DNA a sequenciar2. Incuba-se com um primer, na presena de DNA polimerase e dos quatrodesoxinucletidos(dATP, dCTP, dTTP, e dCTP), um dos quais radioactivo.3. O produto desta reaco depois dividido por quatro tubos, a cada um dos quaisse junta um didesoxiribonucleosido-trifosfato (ddATP, ddCTP, ddTTP, e ddCTP).

Didesoxiribonucleosido-trifosfato: nucletidos modificados so desprovidos de grupohidroxilo ligado ao carbono 3, e, portanto, impedem o alongamento das cadeias deDNA em que so incorporados.

4. Como em cada tubo existem milhes de molculas de DNA, originam-se fragmentosde diversos tamanhos consoante a posio de cada nucletido na sequncia original.5. O DNA de cada tubo (A, C, T, e G) desnaturado e colocado num gel deacrilamida com ureia (para evitar a renaturao do DNA durante a electroforese).6. No final, o gel seco e autoradiografado.

Os nucletidos radioactivos incorporados do origem a uma srie de bandas queindicam o tamanho dos fragmentos de DNA produzidos em cada tubo de

reaco. Ao contrrio dos gis de agarose, os gis de acrilamida permitem resolver

molculas de DNA cujo comprimento difere apenas num nucletido. Como a sntese de DNA ocorre de 5 para 3, os fragmentos menores resultam de

uma incorporao do dNTP mais prxima da extremidade 5. Em consequncia, a leitura do gel de baixo para cima indica a sequncia de

nucletidos da cadeia 5-3. Para iniciar a reaco de sequenciao necessrio um primer, logo o DNA

desconhecido tem de ser enquadrado numa sequncia conhecida, para a qualo primerser complementar.

Primers: oligonucletidos sintetizados quimicamente de modo a obter sequncias com

cerca de 20 bases complementares do incio da cadeia de DNA que se pretendesequenciar.

A sequenciao automtica permite acelerar e mecanizar a maior parte doprocesso de anlise dos resultados. Os diferentes produtos de reaco (G; A; T; C)tm incorporados nucletidos fluorescentes em vez de nucletidos radioactivos,cada um deles com uma cor diferente, num total de 4 cores. A leitura do sinalfluorescente feita por um scanner apropriado que, estando acoplado aoaparelho de electroforese, faz a leitura directamente do gel enquanto aelectroforese decorre. A leitura feita em simultneo com a migrao dosfragmentos atravs do gel: sempre que no local do scanner passa uma banda quefluoresce numa cor representado um pico no grfico dos resultados e o software

atribui-lhe a letra correspondente cor detectada.

11


12/52


6. PCR (po lymerase chain reac tion)

Permite obter in vitro grandes quantidades de uma sequncia definida de DNA S necessrio conhecer as sequncias que ladeiam o fragmento a amplificar uma alternativa clonagem molecular

Componentes de uma reaco de PCRMolde, templatePrimer (ligam-se s extremidades que se pretende ladear, sendo complementares

s regies que flanqueiam a sequncia a amplificar)DNA polimerase (taq polimerase, termoestvel e assegura a polimerizao 5 3)Nucletidos dNTPTermocycler (assegura ciclos rpidos de aquecimento e arrefecimento)Tampo de reaco

Processo:Desnaturao da cadeia por aquecimentoAdio de um excesso de primers e de dNTPLigao dos primers por arrefecimentoPolimerizao pela adio da DNA polimerase

12


13/52


Detec o de c idos Nucleicos e Protenas

1. Hibrida o d e c idos nucleicos

A chave para detectar sequncias especificas de cidos nucelicos o

emparelhamento de bases complementares de cadeias de DNA e RNA A temperaturas altas, as cadeias complementares de DNA separam-se(desnaturam-se) originando cadeias simples de DNA

Se as cadeias separadas forem incubadas nas condies ideais, renaturam pelacomplementaridade de bases hibrida o de c idos nucleicos.

Podem-se formar hbridos com 2 cadeias de DNA, 2 de RNA ou uma de cada. A hibridao de cidos nucleicos permite detectar sequncias de DNA ou RNA

complementares de um cido nucleico isolado, como um genoma viral ousequncia de DNA clonado.

O DNA clonado marcado radioactivamente, sendo sintetizado na presena denucletidos radioactivos.

DNA radioactivo usado como sonda para hibridao com sequnciascomplementares de DNA e RNA, detectados devido radioactividade dos hbridosresultantes de 2 cadeias.

Southern Blotting

O Southern blotting permite a anlise de fragmentos genmicos de grandesdimenses e no exige o conhecimento prvio da sequncia de nucletidos daregio de interesse.

A tcnica de Southern blotting envolve: Separao de DNA genmico por electroforese em gel de agarose Transferncia das molculas separadas para um suporte slido

(membrana ou filtro de nitrocelulose) hibridao com uma sondamarcada (em geral, radioactivamente)

Deteco do sinal da sonda (por autoradiografia).

Devido s grandes dimenses do DNA genmico, para que se possa proceder sua separao, necessrio trat-lo com uma enzima de restrio.

Esta enzima vai cortar o DNA de forma previsvel, dando origem a milhares defragmentos genmicos diferentes que cobrem um leque vasto de tamanhos,produzindo um aspecto tpico de mancha arrastada (smear) aps electroforese.

As dimenses dos fragmentos genmicos formados vo ser caractersticos de cadaindivduo, j que so consequncia da existncia de um local de restrio daenzima usada em determinada posio do genoma e, portanto, reflectem asequncia do genoma.

Aplica es da Southern blotting:

Variaes polimrficas da sequncia do genoma STRs short ta nde m rep ea ts VNTRs - variab le numb er of tandem repe ats SNPs - single nuc leo tide polymorphisms)

Mutaes podem causar diferenas no tamanho dos fragmentos derestrio observados numa populao (RFLPs - restriction fragment lengthpolymorfisms)

por destruio ou criao de locais de restrio por aumento ou reduo do nmero de nucletidos situado entre dois

locais de restrio.

So diferenas de dimenso facilmente detectveis por esta tcnica.

13


14/52


Northen Blotting

Permite analisar o RNA, da mesma forma que o Southern para DNA Como o RNA j fragmentado o passo da digesto com enzimas no

necessrio. D-nos a informao da expresso de um gene

Hibrida o in situ (FISH)

A hibridao de cidos nucleicos tambm pode ser usada para detectarsequncias de DNA ou RNA homlogas em cromossomas ou clulas intactas

Os resultados so analisados por examinao microscpica Pode ser usado para detectar

o locus do gene no cromossoma mRNAs especficos em clulas do mesmo tecido.

2. Detec o de pequenas quantida des de DNA e RNA por PCR

uma tcnica muito sensvel Amplifica-se DNA (ou RNA aps transcrio reversa) at atingir nveis detectveis Usam-se primers de oligonucletidos que hibridam com a sequncia

complementar do molde Pode detectar-se DNA especifico em pequenas quantidades de material gentico

3. Antico rpos como sonda s pa ra protenas

Os anticorpos reagem selectivamente com protenas nicas. Os anticorpos so protenas produzidas pelo sistema imunitrio (linfcitos B) que

reagem contra molculas (antignios) presentes em substncias estranhas,identificando-as.

O sistema imunitrio produz milhes de anticorpos que identificam antigniosespecficos, que podem ser protenas, carbohidratos, etc.

Um linfcitos apenas produz um tipo de antignio Os anticorpos podem ser produzidos pela inoculao de um animal com qualquer

protena diferente Os anticorpos podem ser criados contra protenas purificadas de clulas, tal como

outros materiais que podem ser utilizados para imunizao. Os anticorpos podem tambm servir para reconhecer protenas recombinantes

Existem anticorpos que reconhecem pptidos de 10 a 15 aminocidos, por isso,conhecendo apenas o inicio do gene que se pretende clonar, possvel produziranticorpos que reagem contra a protena inteira.

Western Blotting ou Imuno blo t

As protenas extradas das clulas so separadas por electroforese (electroforeseem gel de poliacrilamida-SDS), devido aos diferentes tamanhos e carga elctrica.

As protenas so colocadas numa soluo de SDS, um detergente carregadonegativamente que se liga s protenas desnaturando-as.

As protenas passam a ter uma estrutura linear, estando carregadasnegativamente.

As protenas passam depois para um filtro que permite a reaco com osanticorpos contra a protena de interesse.

14


15/52


Imunoprecipitao

As clulas so incubadas com aminocidos radioactivos que vo marcar as suasprotenas

Os extractos celulares marcados so incubados com anticorpos que se ligam com

o seu antignio-alvo Os complexos anticorpo-antignio obtidos so isolados e sujeitos a electroforese

permitindo a deteco dos antignios radioactivos por autoradiografia.

15


16/52


44.. OOrrgg aa nniizzaa oo dd oo GGeennoomm aa CCee lluullaa rr

Comp lexidade do Genoma Euca ritico

O Genoma Eucaritico muito maior e mais complexo que o procaritico. Um genoma maior nem sempre est relacionado com a complexidade gentica

de alguns eucariotas. O genoma eucriota contm no s genes funcionais, mas tambm grande

quantidade de DNA que no codifica protenas. Da totalidade do genoma humano (6x109bp) s cerca de 1,5% que contribuem

para a codificao de proteinas.

1. Intres e Exes

Gene: segmento de DNA que expresso num produto funcional (RNA ou protena)

Muito do DNA eucariotico consiste em sequncias entre genes (space sequences) Dentro do prprio gene tambm podem existir:

Exes: sequncias codificantes Intres: sequncias no cidificantes

O gene transcrito a RNA que posteriormente sofre splicing , removendo-se osintres e permanecendo os exes de modo a formar um mRNA maduro.

A quantidade de DNA em intres e exes varivel, sendo que o 1 pode sersuperior ao 2.

Os intres esto presentes na maioria dos genes eucariticos, excepto nalgunsseres mais simples e tambm em alguns procariotas

Pensa-se que os intres representam sequncias que forma importantes no inicio

da evoluo, ou que a facilitaram, permitindo a recombinao de exes dealguns genes.

O desaparecimento de intres em alguns procariotas deve-se seleco naturalpor rpida replicao como a rpida diminuio celular no vantajosa emeucariotas superiores, os intres permanecem no seu genoma.

Podem ter surgido depois da divergncia, pela insero de DNA em genes jformados como sequncias codificantes contnuas, para permitir o exon shuffling (recombinao entre regies codificantes de diferentes genes)

2. Seq unc ias repetitivas de DNA

Uma poro substancial dos genomas eucariticos consiste em sequncias de

DNA no-c odific antes, muito repetidas. As cadeias desnaturadas de DNA hibridam entre si para formar molculas de

cadeia dupla Como a hibridao de DNA um proce sso bimolec ular, a taxa de reassociao

depende da c onc entra o de c ad eias simples de DNA que colidem entre si. Os frag me ntos de DNA de E. co li forma desnaturados e criadas as condies para

hibridarem todo o DNA hbrida mesma taxa, uma Vaz que cada sequncia deDNA existe num s local por genoma (no se repete)

A reassociao de fragmentos de DNA extrado de clulas de mamferos diferente:

60% hbrida taxa esperada pois existe apenas uma vez no genoma 40% hbrida mais rapidamente, devido existncia de sequncias que

existem vrias vezes no genoma (maior a probabilidade de seencontraram e hibridarem)

16


17/52


Tipos de seq unc ias repe titivas

DNA de sequncias simples Contm milhares de copias de sequncias pequenas. Podem ser separadas do resto do genoma por centrifugao de equilbrio em

gradiente de densidade de CsCl As suas densidades so variveis, sendo que as sequncias ricas em A e T so

menos densas que as mais ricas em G e C. As sequncias que se separam da cadeia de DNA de acordo com a sua

densidade so denominadas de DNAs satlites. Estas sequncias:

no so transcritas no contm informao gentica podem desempenhar um papel importante na estrutura dos cromossomas

SINEs (elementos curtos dispersos) e LINEs (elementos longos dispersos) Sequencias repetitivas de DNA espalhadas pelo genoma

Podem mover-se por diferentes locais de DNA genmico, podendo regular aexpresso dos genes ou ter desempenhado um papel evolutivo importante,gerando diversidade gentica.

3. Fam lia d e genes e pseudogenes

A grande extenso do genoma eucaritico deve-se tambm ao facto de quemuitos genes apresentam mltiplas cpias (muito repetidas), pois podem sernecessrios para a produo de grandes quantidades de RNA ou de protenas.

Podem tambm encontrar-se no funcionais Por outro lado, a maioria dos genes dos procariotas s existe uma vez no genoma

s cpias dos genes eucariotas denominam-se famlias de genes, os quaispermitem:

Produzir RNA e protenas em grandes quantidades Membros distintos da famlia podem ser transcritos em diferentes tecidos

ou diferentes estdios de desenvolvimento Estas famlias podem estar prximas numa regio de DNA, ou estar dispersas em

diferentes cromossomas.

Orige m d as fam lias de genes

Existe duplicao do gene original ancestral Os diferentes membros da famlia divergem como consequncia de mutaes ao

longo da evoluo A divergncia pode levar evoluo de protenas envolvidas em diferentes

tecidos e estdios ou pode levar perda da capacidade de produzir protenas ouprodutos funcionais do gene.

Pseudogenes: cpias de genes no funcionais que aumentam o genoma eucariticosem apresentarem uma contribuio gentica funcional.

17


18/52


4. Nmero de Genes

Um polipptico mdio possui cerca de 400aa, que correspondem a 1200 b de ummRNA

Genoma bacteriano: Maioria do DNA codifica protenas (90%) Aproximadamente 4300 genes

Genoma de leveduras Apenas 4% de genes possui intres 70% dos genes codificam protenas

Genoma de animais superiores e humano 1,1% a 1,4% codifica protenas 45% inclui DNA repetitivo

O restante til na regulao da expresso, normalmente atravs de sequncias

reconhecidas por ehnancers e repressores. Para determinar e identificar o gene usa-se mRNA que passado para DNA por

aco da transcriptase reversa (cDNA) ficando apenas a sequncia de exes.

18


19/52


Cromossom as e Crom atina

O genoma de procariotas contm cromossomas nicos, que so normalmentemolculas de DNA circular.

O genoma de eucariotas composto por vrios cromossomas, contendo cada umuma molcula de DNA linear.

O DNA de clulas eucariotas est ligado a pequenas protenas (histonas) quecompactam o DNA de forma ordenada no ncleo.

1. Cromatina

o complexo formado pelo DNA e as protenas As protenas mais abundantes so as histonas que contm uma proporo alta de

aminocidos bsicos que facilitam a ligao molcula de DNA carregadanegativamente.

Existem outras protenas para alm das histonas (nonhistone chromossomalproteins) que participam em vrios processos como a replicao de DNA e aexpresso gentica.

Nucleossoma: a unidade estrutural bsica da cromatinaCromatossoma: subunidade da cromatina que consiste numa sequncia de 166 pbenroladas volta do ncleo das histonas. O empacotamento do DNA com as histonas compem uma fibra de cromatina

composta por cromatossomas separados por segmentos de DNA ligante (DNAlinker)

A c ondensa o da cromatina varia durante o c iclo c elular:

Interfase: A maior parte da cromatina est relativamente descondensada (eucromatina) e

distribuda para fora do ncleo. Os genes so expressos e o DNA replicado, em preparao para a diviso

celular. Os genes que so mais expressos esto num estado mais descondensado para

facilitar o acesso da maquinaria de transcrio. 10% da cromatina em interfase est altamente condensada (heterocromatina) e

est inactiva para transcrio e contm muitas sequncias repetitivas.

Mitose: os cromossomas esto muito condensados e no podem servir de molde paraa sntese de RNA, assim a transcrio cessa durante a mitose.

2. Centrmeros

uma regio especializada do cromossoma que assegura a distribuio correctados cromossomas duplicados nas clulas filhas, durante a mitose

1. O DNA replicado durante a interfase, resultando na formao de 2 cpias decada cromossoma

2. Assim que a clula entra em mitose, a condensao da cromatina leva formao de cromossoma que consistem em 2 cromtideos idnticos

3. Estes cromatdeos esto ligados na regio do centrmero4. Os microtubulos do fuso acromtico ligam-se ao centrmero e as 2

cromatideos separam-se e movem-se para plos opostos.5. No fim da mitose, a membrana nuclear reposta e os cromossomas

descondensam

19


20/52


Os centrmeros servem como locais de associao entre os cromatideos e deligao dos microtubulos.

Consistem em sequncias especificas de DNA qual protenas (centromere-associated protenas) se ligam, formando uma estrutura especializada:kinetochore .

A ligao dos microtubulos ao kinetochore medeia a juno dos cromossomas ao

fuso acromtico As protenas associadas aos centrmeros actuam como motores molculas que

conduzem o movimento dos cromossomas ao longo das fibras

3. Telmeros

So sequncias no final dos cromossomas eucariticos que so importantes para areplicao e manuteno.

Consistem em sequencias simples de DNA repetidas, contendo resduos G numacadeia.

Estas sequncias so repetidas milhares de vezes terminado com uma cadeia

simples de DNA. As sequncias repetidas do telmero formam loops no final dos cromossomas aos

quais se juntam protenas que protegem a terminao do cromossoma de serdegradado.

Os telmeros so importantes da replicao do final das molculas de DNA linear.DNA polimerase capaz de estender uma cadeia de DNA em crescimento, masno capaz de iniciar a sntese na terminao de uma cadeia de DNA linear.

Assim, as extremidades dos cromossomas no podem ser replicados pela aconormal da DNA polimerase.

A manuteno dos telmeros parece determinar a capacidade reprodutiva dasclulas.

Telomerase

Protena capaz de produzir telmeros e dos associar molcula que est a serreplicada para continuar a replicao.

uma transcriptase reversa da classe das DNA polimerases que sintetiza DNA apartir do RNA. Ela carrega consigo o RNA que lhe serve de molde e que complementar s sequncias repetidas que sintetiza os telmeros.

20


21/52


66.. SSnntteessee ee PPrroocc eessssaa mm eennttoo dd ee RRNNAA

A regulao da expresso gentica permite clula adaptar-se a mudanas nomeio ambiente e permite a diferenciao celular das plantas e animais complexos

A expresso de um gene comporta as seguintes fases:Transc rio da mensag em gentica - segmentos de DNA codificam a produo

de RNA.Processam ento de RNA (em eucariotas)Trad u o da m ensag em g entica - RNA codifica a produo de protenas.

Estrutura do RNA

O cido ribonucleico, polmero de ribonucletidos em cadeia simples, constituimolculas de dimenses muito inferiores s dimenses das molculas do DNA.

Em algumas situaes a cadeia pode dobrar-se sobre si prpria, estabelecendoligaes com bases complementares da mesma cadeia segundo acomplementaridade dos pares de bases: A = U e C G.

Apesar da sua simplicidade molecular, funcionalmente as molculas de ARN sodiferentes existindo sob trs formas: RNA mensageiro , RNA ribossmico e RNA detransferncia , variando tambm a sua estrutura.

O RNA mensageiro o que faz a ligao entre o DNA que se encontra no ncleodas clulas eucariotas e os ribossomas, onde se processa a sntese proteica.

21


22/52


Transc ri o em Procariotas

A sntese de RNA similar de DNA, tal como a DNA polimerase, a RNApolimerase cataliza o crescimento de cadeias de RNA na direco 5 3.

Ao contrrio da DNA polimerase, a RNA polimerase no necessita de um modelo(primer) para iniciar a sntese de RNA.

A transcrio comea de novo em stios especficos no incio dos genes. O incio da transcrio a etapa reguladora

1. RNA p olimerase

Cataliza a polimerizao de ribonuclesido 5trifosfatos (NTPs) constituda por mltiplas cadeias polipeptidicas constituda por 5 subunidades: 2x , , , e. A subunidade est fracamente ligada s outras O ncleo (constitudo pelas subunidades , , e) totalmente capaz de

catalizar a polimerizao (no selectiva), no sendo necessrio a presena dasubunidade . A subunidade identifica os stios correctos para iniciar a transcrio, que

convm ser no incio do gene.

2. Promoto r

a sequncia qual se liga a RNA polimerase para iniciar a transcrio dogene, mas no transcrito.

A comparao de vrios genes da E. coli revelou 2 zonas numa regio acima

do local de iniciao da transcrio comuns Estas 2 zonas so compostas por 6 nucletidos e esto colocadas a cerca de 10

e 35 pares de bases acima do local de inicio de transcrio so os elementos-10 e -35.

As regies onde a RNA polimerase se liga podem ser identificadas porfootprinting . Atravs desta tcnica incuba-se o gene de uma protena com aRNA polimerase e em seguida trata-se com DNase que digere o gene. Aspores onde a RNA polimerase se ligam ficam protegidas e no so digeridase atravs de electroforese e comparao reconhece-se os locais de ligao.

Nucletido +1: o 1 nucletido a ser reconhecido e a partir do qual comea atranscrio.

O promotor prprio de cada tipo de organismo. O promotor da bactria no

serve no DNA humano Tem uma direco de transcrio A RNA polimerase identifica a sequncia do promotor pela subunidade . O promotor est sempre ligado extremidade 5 do gene, de modo a tornar

possvel a transcrio. Promotor induzvel: pode estar on/off, para a transcrio Sequnc ias de c onsenso : sequncias que esto conservadas em vrios genes,

ou seja, so mais frequentemente encontradas naquelas posies. Promotor fraco: tem menos atraco para a polimerase, ou seja, menos

consensual, pois a ligao entre o promotor e a polimerase tanto mais forte eestvel quanto mais consensual for a sequncia do promotor.

Promo tor forte: mais consensual e atrai mais a polimerase. Os genes que tmpromotores fortes so mais frequentemente transcritos.

22


23/52


3. Transcri o

A RNA polimerase liga-se ao DNA numa regio de 60 pb (-40 e +20) A subunidade liga-se especificamente s sequncias das regies -35 e -10. Sem a subunidade , a RNA polimerase liga-se no especificamente e com menor

afinidade. A RNA polimerase liga-se ao promotor formando um complexo promotor-fechado,

pois o DNA est enrolado. A polimerase desenrola o DNA numa regio de 14 pb formando um complexo

promotor-aberto, em que uma nica cadeia de DNA serve de molde para atranscrio.

A transcrio iniciada pela juno de 2 NTPs. Depois da adio de 10 nucletidos, a subunidade libertada da RNA

polimerase que continua o alongamento da cadeia de RNA. A RNA polimerase vai desenrolando DNA, mantendo sempre um espao de 15pb

desenroladas. A sntese de RNA continua at que a polimerase encontre um sinal de terminao,

aps o qual a transcrio pra, o RNA liberta-se da polimerase e esta dissocia-se

do DNA modelo. Na E. coli, o sinal de paragem consiste numa sequncia de RNA rica em C e G,

interrompida por 4 ou mais resduos A, o que vai conduzir a uma destabilizao dacadeia pela complementaridade de bases disrupo do processo.

4. Rep ressores e c ontrolo neg ativo da transc rio

O estudo da expresso de enzimas no metabolismo da lactose na E. coli, permitiucompreender a regulao da transcrio em procariotas, pois sabia-se que asenzimas envolvidas neste metabolismo (ex. -galactosidase, permease etransacetilase) s so expressas quando existe lactose no meio.

Opero: unidade de expresso das enzimas do metabolismo da lactoseOperador: regula a transcrio do opero, adjacente ao local de iniciao datranscrio do gene.Repressor: bloqueia a transcrio ligando-se ao operador.

No metabolismo da lactose, esta liga-se ao repressor que j no se liga ao operador.

Elementos de controlo c is-actuantes: sequencias reguladoras que afectam aexpresso de genes ligados na mesma molcula de DNA, tal como o operador.Factores trans-actuantes: afectam a transcrio de genes localizados noutroscromossomas, assim como o repressor.

5. Controlo positivo da transc rio

O estudo do efeito da glucose na expresso de genes que codificam enzimasenvolvidas no metabolismo de outros acares um exemplo de controlo positivo,pois aquelas enzimas apenas so expressas quando a glucose no est disponvel.

Quando existem baixos nveis de glucose, a adenil ciclase converte ATP emAMPc.

O AMPc liga-se a uma protena reguladora da transcrio (CAP cataboliteactivator protein), que se vai ligar sequencia de DNA alvo (sequencia do lacopero)

CAP interage com a RNA polimerase, facilitando a sua ligao ao promotor eactivando a transcrio.

23


24/52


RNA polimerases Euc ariticas e Fac tores de Transc ri o

A transcrio ocorre do mesmo modo em todas as clulas, no entanto maisum processo mais complexo em eucariotas que nos procariotas, pois:

Enquanto que os procariotas tm uma RNA polimerase que transcreve todos osgenes, nos eucariotas existem diferentes RNA polimerases que transcrevemclasses de genes distintas.

A RNA polimerase eucariota necessita de interagir com vrias protenas parainiciar o processo factores de transcrio.

1. RNA po limerases euc arioticas

RNA polimerase II: transcreve genes codificantes de protenas (mRNAs).RNA polimerase I: transcreve espcies maiores de rRNARNA polimerase III: transcreve espcies pequenas de rRNAs e tRNAs; RNAs envolvidosem splicing e transporte de protenas (snRNAs e scRNAs)RNA polimerase mitocondrial: transcreve o DNA deste organelo.

RNA polimerases: So enzimas complexas (12 a 17 subunidades) Reconhecem promotores diferentes Transcrevem classes de genes distintas.

2. Fac tores de transc rio ge rais e inicio d a transc rio pe la RNA polimerase II

A actividade da RNA polimerase II diferente da RNA polimerase procariota A RNA polimerase II apenas inicia a transcrio se forem adicionadas protenas

fac tores de transcri o

Fac tores de transcri o : Factores de transcrio gerais (envolvidos na transcrio de todos os

promotores da polimerase II) Factores de transcrio especficos para o gene (ligam-se a sequencias de

DNA que controlam a expresso de genes individuais)

Fac tores de transcri o nec essrios pa ra iniciar a transcrio : TFIID TFIIB TFIIF TFIIE TFIIH Complexo proteico mediador (permite a resposta da RNA polimerase II a

factores reguladores)

Os promotores de vrios genes transcritos pela polimerase II contm umasequncia semelhante a TATAA com 25 a 30 nucletidos (TATAA box) acima dolocal de iniciao da transcrio

Um factor de transcrio geral (TFIID) liga-se a TATAA box, atravs da TATA-bindingprotein (TBP) e a outros nucletidos atravs de TBP-associated factors (TAFs).

Depois liga-se outro factor (TFIIB) que se liga a TBP tal como sequncia de DNAque est atrs da TATA box.

A TFIIB serve como uma ponte para a RNA polimerase II que se liga ao complexo

TBP-TFIIB em associao ao TFIIF De seguida ligam-se mais 2 factores de transcrio (TFIIEe TFIIH)

24


25/52


A TFIIHdesenrola o DNA na regio do inicio da transcrio e fosforila uma parte daRNA polimerase (CTD) libertando-a do complexo de iniciao.

Para alm da TATAA box, muitos promotores transcritos pela RNA polimerasecontm outro sequncia importante (sequnc ia inic iadora o u Inr) que expande aregio iniciadora.

Existem promotores que no tm a TATAA box, mas a sequncia iniciadora e uma

outra (DPE downstream promotor element) que so reconhecidas por TBP-associated factors (TAFs) pois no existe TATAA box para ser reconhecida pela TBPque continua a ter um papel fundamental neste processo.

3. Transc rio pe la RNA polime rase I

A TBP (TATAA binding protein) requerido pelas 3 polimerases, apesar de cadauma reconhecer promotores distintos.

A RNA polimerase I transcreve genes ribossomais que leva formao de 48S pr-rRNA que processado e forma os rRNAs 28S, 18S e 5,8S.

O promotor dos genes ribossomais reconhecido por 2 factores de transcrio: UBF

(upstream binding factor) e SL1 (selectivity factor 1; que contem a TBP); que sejuntam RNA polimerase I formando o complexo de iniciao.

Na ausncia da TATAA box no promotor, a TBP no se liga a sequnciasespecficas, so algumas protenas do SL1 que se ligam ao promotor.

4. Transc rio pe la RNA p olime rase III

A polimerase III transcreve o tRNA, 5S rRNA e algum RNA pequeno envolvido emsplic ing (snRNA).

Estes genes so transcritos a partir de diferentes promotores

5S rRNA: ligao de TFIIIA a sequncias especificas no promotor e formao de um

complexo iniciador (TFIIIC, TFIIIB e polimerase).

tRNA: o promotor no contm a sequncia reconhecida por TFIIIA, logo o TFIIIC liga-sedirectamente ao promotor formando o complexo com a ligao do TFIIIB e dapolimerase.

RNAs envolvidos em Splicing: o promotor contm a TATAA box (reconhecida pela TFIIIBatravs da TBP) tal como um local de ligao para outro factor (SNAP). A polimeraseligao posteriormente TFIIIB.

25


26/52


Regula o da Transc ri o em Eucariotas

Tipos de controlo: Ao nvel da iniciao da transcrio Ao nvel do elongamento Protenas reguladoras Enrolamento do DNA Metilao do DNA

1. Sequnc ias regulado ras cis-ac tuante: promotores e enhanc ers

A transcrio na bactria regulada pela ligao de protenas a sequncias cis-activadoras que regulam a transcrio dos genes adjacentes.

No eucariotas tambm existe um gnero de regulao similar a esse.

Para estudar essas sequncias em eucariotas: Liga-se a sequncia reguladora a um gene reprter (codifica uma enzima

facilmente detectvel) A expresso do gene reprter promove um conhecimento sobre a funo da

sequncia reguladora clonada.

Os genes transcritos pela RNA polimerase II tm 2 elementos centrais no promotor:TATAA box e a sequncia Inr, que servem de locais especficos de ligao dosfactores de transcrio gerais.

Outras sequncias cis-activadoras servem de local de ligao para uma grandevariedade de factores de regulao que controlam a expresso individual degenes. Estas sequncias esto muito frequentemente acima da TATAA box.

Enhancers: So sequncias que, embora estejam longe do local de transcrio, podem

estimul-la. Funcionam, tal como os promotores, pela ligao de factores de transcrio que

regulam a RNA polimerase Isto possvel pela formao de um DNA looping que permite que os factores

ligados ao enhancer interajam com as protenas associadas RNA polimerase eao promotor.

A ligao de factores aos enhancers reponsvel pelo controlo da expressogentica durante o desenvolvimento e diferenciao, tal como durante a respostaa hormonas e factores de crescimento.

Os enhancers geralmente contm inmeros elementos sequenciais funcionais quese ligam a diferentes protenas reguladoras de transcrio.

a expresso especfica de cada tecido em protenas reguladoras que resultamem diferentes combinados de diferentes elementos no enhancer.

2. Protenas regulado ras de transc ri o

O isolamento de protenas reguladoras de transcrio baseado na sua ligaoespecfica a um promotor ou a sequncias amplificadoras

Estudo desta ligao:

1. Footprinting

26


27/52


2. Elec tropho retic- mo bility shift assay (ensaio de retardamento em gel) Incubao de DNA marcado radioactivamente com protenas Electroforese num gel no desnaturante A ligao s protenas detectado pelo retardamento damobilidade electrofortica do fragmento de DNA.

3. Purifica o d e protenas po r c romatografia de DNA po r afinida de Liga-se oligonucletidos iguais a esferas (composto celular) numa

coluna Introduz-se extracto celular As protenas que se ligaram s esferas envolvidas naquela sequnciaficaram presas enquanto que as outras saem depois da lavagem.

3. Estrutura e funo dos ac tivad ores de transc rio

Activadores: Ligam-se a sequncias de DNA reguladoras e estimulam a transcrio.

Tm 2 regies: Onde a protena se liga especificamente ao DNA Outra que activa a transcrio interagindo com outros componentes

da maquinaria de transcrio.

4. Repressores eucariotas

Ligam-se a sequncias de DNA e inibe m a transc ri o Podem apenas interferir com a ligao de outro factor de transcrio de DNA ou

da RNA polimerase. Outros repressores competem com activadores no local de ligao ao DNA,

possuindo o domnio da ligao mas no o domnio da activao Os repressores activos inibem a transcrio por interaco entre as protenas.

27


28/52


5. Rela o entre a estrutura d a c romatina e a transc rio

O DNA de todas as clulas eucariotas est intimamente ligado a histonas,formando os nucleossomas.

O empacotamento do DNA no ncleo interfere com a transcrio Os genes transcritos activamente so encontrados numa cromatina

descondensada, mas o DNA continua enrolado nos nucleossomas, constituindo umobstculo maquinaria de transcrio.

A cromatina activa para transcrio atravessa determinadas modificao, talcomo:

Modificao das histonas Rearranjos nos nucleossomas Associao a 2 proteinas (nonhistone chromossomal proteins) protenas

HMGN

Ac etila o da s Histonas As histonas tm 2 pores, uma envolvida no ncleo e enrolamento do DNA e um

dom nio a mino-terminal. O domnio amino-terminal rico em lisina que pode ser modificada por acetilao. A acetilao:

Reduz a carga positiva das histonas enfraquecendo a ligao destas aoDNA.

Facilita a ligao dos factores de transcrio.

6. Regulao da transc ri o por RNAs no cod ifica ntes

Um forma da actuao de RNAs no codificantes inibir a traduo porinterferncia de RNA

Reprime a transcrio de alguns loci cromossomais, pela induo dacondensao da cromatina

7. Metilao de DNA

Controla a transcrio em vertebrados Resduos de citosina podem ser modificados pela adio de grupos metil ao C5 Esta metilao ocorre em Cs que precedem Gs, na cadeia de DNA

(dinucletidos CpG) Esta metilao est relacionada com a reduo da transcrio, em genes que

contm grande frequncia de dinucletidos CpG, atravs da interferncia na

ligao de factores de transcrio e pela ligao de repressores. Parece que a metilao apenas serve para manter e estabilizar a inactivao de

um gene

Genomic imprinting Controla a expresso de alguns genes envolvidos no desenvolvimento embrionrio

de mamferos Na maior parte dos casos os 2 alelos so expressos em clulas diploides, no entanto

existem alguns genes imprinted cuja expresso depende de quem so herdados. A metilao importante na distino entre os alelos maternos ou paternos dos

genes imprinted.

28


29/52


Proc essamento de RNA e Turnover

O pr-RNA tem de sofrer modificaes para se tornar funcional, excepto o RNAbacteriano.

Procariotas: os ribossomas tm acesso directo ao mRNA e a traduo comea com omRNA nascente, enquanto a transcrio ainda est a ocorrer.

Eucariotas: o mRNA sintetizado no ncleo tem que ser transportado para o citoplasmaantes de ser usado como molde para sntese proteica.

No entanto, todo o rRNA e tRNA necessita de processamento, quer em clulaseucarioticas quer em procariotas.

1. Proc essam ento d e mRNA em euc ariotas

Processam ento do mRNA: Modificao das extremidades (caping e adenilao) Remoo de intres (splicing)

A transcrio e o processamento do mRNA so processos que esto coordenadosdevido a uma poro (CTD) da RNA polimerase II que serve como local de ligaopara as enzimas envolvidas no processamento.

Modificao da extremidade 5 (capping) Adio de uma estrutura (7-metilguanosina cap), pelas caping enzimes, que

estabiliza o RNA e alinha-o com o ribossoma, na traduo.

Modificao da extremidadde 3 (poliadenilao) Clivagem desta terminao e adio de uma cauda poli-A poliadenilao. Um sinal de poliadenilao (hexanucletido AAUAAA, em mamferos) localiza-se 10

a 30 nucletidos acima do local de poliadenilao. Estas sequncias so reconhecidas por um complexo de protenas:

uma endonuclease que corta o RNA a poli-A polimerase que adiciona a cauda poli-A

a poliadenilao representa o fim da transcrio, estando o complexo proteico depoliadenilao associado RNA polimerase II.

Regula a transcrio e a estabilidade do mRNA

2. Mec anismos de Splic ing

Splicing: remoo de intres do pr-RNA e produo de mRNA funcional.Este mecanismo ocorre em 5 passos:

1. O pr-mRNA clivado na extremidade 5 do splicing site.2. A terminao 5 do intro unida a um nucletido de adenina dentro do

intro (prximo da extremidade 3) resulta numa ponte de ramificao (umloop) devido unio a extremidade 5 ao 2 OH da adenina.

3. Clivagem da extremidade 34. Ligao dos 2 exes.5. Linearizao e degradao do intro.

O pr-mRNA contm sequncias consensuais em cada posio critica,

permitindo que a maquinaria de splinging reconhea o pr-mRNA e desenvolva asreaces de clivagem e ligao.

29


30/52


Spliceossomas: Complexos envolvidos no processo de splicing, compostos por protenas e RNAs

(snRNAs: U1, U2, U4, U5, U6). Cada snRNA est complexado com 6 a 10 protenas formando small nuclear

ribonucleoprotein particles (snRNPs) que exercem o papel principal no processo: U1, U2 e U5 so molculas isoladas U4 e U6 esto num complexo formando um nico snRNP.

Associao do spliceossoma:1. Ligao do snRNP U1 extremidade 5 do splicing site (devido

complementaridade de bases com a extremidade 5do snRNA U1)2. snRNP U2 liga-se ao ponto de ramificao (tambm por complementaridade

de bases)3. O complexo formado snRNPs U4/U6 e U5 incorporam-se no spliceossoma,

ligando-se o U5 acima do ponto de ramificao.

Rearranjos antes de comear o splicing:

1. U6 dissocia-se do U4 e retira o U1 da extremidade 5.2. U5 liga-se sequncia da extremidade 33. Exciso do intro e ligao dos exes.

snRNAs: Reconhecem as sequncias no ponto de ramificao e na extremidades Catalizam as reaces directamente

Alguns RNAs podem fazer auto-splicing

Factores de Splicing: direccionam os spliceossomas para os locais de splicing correctosatravs da ligao de sequncias de RNA nos exes e depois recrutando os snRNPs

U1 e U2 para os locais apropriados no pr-mRNA por intereces protena-proteina.

3. Splic ing Alternativo

Processo que ocorre em eucariotas e permite a regulao da expresso genticaem diferentes tecidos e durante o desenvolvimento. Obtm-se diferentes combinaes de locais de splicing originando vrios

RNAs. Combinaes dos mesmos exes.

4. Edio d e RNA

Processo que altera as sequncias codificantes de protenas de alguns mRNAs. Resulta na mudana de bases como resultado de reaces de modificao de

bases: desaminao da citosina a uridina desaminao da adenosina a inosina.

30


31/52


5. Deg rad a o de RNA

Os processos acima descritos resultam na formao de RNA maduro, que transportado para o citoplasma onde ocorre a sntese proteica

No entanto muitas sequncias transcritas para pr-mRNA so degradadas noncleo , tal como os intres.

Esta funo exercida por: uma enzima que reco nhece a l iga o 2-5 formada no ponto de ramificao outras enzimas que reconhecem as extremidades 3 e 5 e catalizam a

degradao de RNA em qualquer direco.

As clulas possuem um sistema de controlo de qualidade (nonsense-mediatedmRNA dec ay ) que leva degradao de: mRNAs que no tm a sequncia completa prevenindo a sntese de protenas

anormais codo de terminao prematuro encontrado pelo ribossoma (no caso das

bactrias)

A degradao no citoplasma outro modo de controlo da expresso dos genes: O rRNA e tRNA so muito estveis O mRNA bacteriano rapidamente degradado, permitindo respostas rpidas

e variaes ambientais. mRNA eucariota tem um degradao variada, com vista a facilitar a

regulao dos genes.

Processo de degradao no citoplasma: Encurtamento das cadeias poli-A Remoo do cap na extremidade 5 Degradao por nucleases a partir das extremidades.

mRNAs instveis: Codificam protenas reguladoras Contm muitas sequncias ricas em AU perto da extremidade 3.

31


32/52


77.. SSnntteessee PPrroo ttee iicc aa

Tradu o de mRNA

A traduo corresponde transformao da mensagem contida no mRNA nasequncia de aminocidos que constituem a cadeia polipeptdica.

O mRNA contm a informao para a sntese proteica e lido de 5 para 3. A cadeia polipeptidica sintetizada da extremidade amina para a terminao

carbolixo. Cada aminocido especificado por codes do RNA O mecanismo de traduo semelhante em todas as clulas

Intervenientes: mRNA : contm a informao gentica para a sntese de protenas Aminocidos: molculas bsicas para a construo das protenas. tRNA: selecciona e transporta o aminocido apropriado e reconhece o codo

correspondente do ARNm. Funcionam como intrpretes entre a linguagem doARNm e a linguagem das protenas.

Ribossomas: sistemas de leitura. Promovem a ligao entre aminocidos. Na suaconstituio entra o RNA ribossmico (rRNA) e protenas.

Enzimas: catalisam as reaces que ocorrem em todo o processo ATP: Transfere energia para o sistema.

1. RNA de transfernc ia ( tRNA)

Cada um dos 20 aminocidos tem que ser alinhado com os codescorrespondentes do mRNA

O tRNA serve como adaptador para este processo, fazendo a ligao entre omRNA e o aminocido correspondente.

Tem uma estrutura de L, requerida para se encaixar do ribossoma durante atraduo

Todos terminam em CCA ao qual se liga o aminocido, na extremidade 3 Contm um anticodo na outra extremidade que se liga ao codo respectivo,

devido complementaridade das bases. A ligao dos aminocidos no tRNA especifico catalizada pela aminoacil

tRNA sinte tase, que reconhece um aminocido para o tRNA correcto. Esta reaco ATP-d ep end ente .

2. Ribossoma

o local de sntese proteica de todas as clulas Faz a ligao entre o tRNA e o mRNA Tem 2 subunidades que normalmente esto separadas no citoplasma e s se

ligam para realizar a sntese proteica, contendo cada uma delas protenascaractersticas e rRNA.

O rRNA tem um papel cataltico, pois so essenciais para a juno deribossomas funcionais in vitro e um papel estrutural, na qual se renem asprotenas ribossomais.

O ribossoma mantm os aminocidos juntos, permitindo a ligao peptidica,catalisada pela subunidade maior.

A cadeia vai crescendo medida que se vai adicionando aminocidos.

32


33/52


A cada mRNA correspondem 3 locais de leitura diferentes que correspondem aaminocidos diferentes.

O ribossoma tem que saber o quadro de leitura para a sequncia deaminocidos que se pretende sintetizar.

3. A organiza o do mRNA e o inicio da tradu o

A traduo no comea na extremidade 5 do mRNA, mas em locais especficosde iniciao.

Vo existir locais entre a extremidade 5 e o local de iniciao que no vo sertraduzidas UTR (untranslated region)

O mRNA eucaritico codifica apenas uma cadeia polipeptidica especifica(monocistronico ), enquanto que o mRNA procaritico pode codificar mais do queuma, dependendo do local de iniciao (policistronico)

Em ambas as clulas, a traduo comea no codo AUG que codifica oaminocido metionina .

A sequncia de iniciao diferente nos eucariotas e procariotas. O mRNA bacteriano contm uma sequncia (sequncia de Shine-Delgarno) que

alinha o mRNA no ribossoma para a traduo pela complementaridade das basesdo rRNA.

Esta sequncia impede que a traduo comece na extremidade 5 e noutroslocais de iniciao internos.

O RNA humano no contem a sequencia de Shine-Delgarmo, logo o ribossomano reconhece o sitio a partir do qual comea a sntese. Quando se corta o DNAplasmidico para se introduzir o Gene necessrio ter em conta este factor.

4. Processo de Traduo

composta por 3 etapas: iniciao, alongamento e finalizao

1. Iniciao: Verifica-se a ligao do mRNA e de um tRNA iniciador, que transporta

usualmente o aminocido metionina subunidade menor de um ribossoma. A subunidade maior do ribossoma liga-se ao conjunto. O ribossoma est ento funcional. necessrio protenas no ribossomais especificas factores eucariticas de

transcrio que reconhecem a extremidade 5 e 3 do mRNA, sendoresponsveis pela estimulao da poliadenilao durante a traduo.

2. Alongamento: a fase de traduo dos codes sucessivos do mRNA e da ligao dos

aminocidos. Os locais do ribossoma a que se liga o tRNA designam-se stios P, A e E. O tRNA iniciador liga-se ao stio P O prximo tRNA liga-se ao sitio A, pelo emparelhamento com o segundo

codo. H a formao de uma primeira ligao peptdica entre o aminocido que ele

transporta e a metionina. Durante este processo o ribossoma move 3 nucletidos ao longo do mRNA,

posicionando o codo seguinte no sitio A vazio. O alongamento do pptido continua at que um codo STOP seja translocado

no sitio A do ribossoma.

33


34/52


3. Finalizao: Os codes de finalizao no tm nenhum anticodo complementar, mas

existem factores de libertao que reconhecem os sinais e terminam a snteseproteica.

Estes factores ligam-se a um codo STOP no sitio A e estimulam a hidrlise dopolipptido completo do ribossoma.

O tRNA libertado, as subunidades do ribossoma e o mRNA dissociam-se

Caractersticas da biossntese de protenas:- Complexidade: faz interferir vrios agentes- Rapidez: uma clula eucaritica junta 140 aminocido de uma cadeia de

hemoglobina em dois a trs minutos.- Amplificao: a mesma zona de DNA pode ser transcrita vrias vezes,

formando-se assim vrias molculas de mRNA idnticas. Por outro lado, ospolirribossomas mostram que a traduo da mesma mensagem descodificada simultaneamente por vrios ribossomas. Originam-se, destemodo, vrias cadeias polipeptdicas idnticas, resultando cada uma delas da

traduo efectuada por cada ribossoma. Desta forma, apesar de o mRNA tercurta durao, como a sua mensagem podem ser traduzida vrias vezes amplificada a sua actividade.

5. Regulao da Trad uo

Um mecanismo de regulao deste processo a ligao de prote nas repressorasa sequncias especficas de mRNA, bloqueando a traduo.

A ligao da mesma protena reguladora a diferentes stios nas molculas demRNA pode ter efeitos distintos na expresso gentica:

inibir a traduoestabilizar o mRNA para aumentar a sntese proteica.

Outro mecanismo regulador envolve a modulao da actividade de factores deiniciao.

34


35/52


88.. NNcc lleeoo A presena de ncleo a principal diferena entre clulas eucariotas

eprocariotas. O ncleo serve como reservatrio para a informao gentica e como centro de

controlo da clula

Processos que ocorrem no ncleo: Replicao de DNA Transcrio Processamento de RNA

Invlucro Nuc lear e o Trfico entre o Nc leo e o Citoplasma

Invlucro nuclear: Separa o contedo nuclear do citoplasma consitituido por 2 membranas Impede a passagem livre de molculas entre o ncleo e o citoplasma Mantm o ncleo como um compartimento bioqumico distinto interrompido porporos que permitem a passagem de molculas Permite um trfico selectivo de protenas e RNAs.

1. Estrutura do inv lucro nuc lear

2 membranas nuc leares: So uma expanso do retculo endoplasmtico A externa est directamente em contacto com o RE O espao intermembranar contacta com o lmen do RE A membrana externa tem ribossomas ligados superfcie citoplasmtica So constitudas por uma bicamada fosfolipidica apenas permevel a molculas

apolares (pequenas)

Lmina nuclear Localiza-se na membrana interna Fornece suporte estrutural ao ncleo consitituido por protenas as lminas As protenas filamentosas relacionam-se entre si formando filamentos Esta associao comea com a formao de dimeros, nos quais as regies em -

hlice enrolam-se entre si.

Depois estes dimeros associam-se uns aos outros. Existem lminas que servem como pontos onde a cromatina se vai juntar A organizao normal da lmina nuclear essencial para a replicao do DNA e

na regulao da transcrio.

2. Comp lexo do poro nuclear

Poros: So canais que permitem a passagem de pequenas molculas polares, ies e

macromolculas (protenas e RNAs) Desempenha um papel fundamental na clula eucaritica visto que controlam a

passagem de substncias entre o citoplasma e o ncleo So estruturas selectivas e complexas

35


36/52


Molcula que sai do ncleo: RNA

Molculas que entram no ncleo: Protenas com funes nucleares (polimerase) Hitonas

Consoante o tamanho da molcula, existem diferentes mecanismos de passagem

pelos poros:

Molc ulas peq uenas: Passam livremente pelo poro nos 2 sentidos (ncleo citoplasma; citoplasma

ncleo) Passam por difuso passiva

Molc ulas grand es (protenas e RNAs) Passam por um processo activo

As protenas e RNAs so reconhecidas pelos poros e so seleccionadas numadireco especfica.

3. Transpo rte selec tivo de protenas pa ra e do nc leo

Protenas essenciais para o transporte atravs do poro nuclear: Rec ep tor de transporte nuclea r Importinas (transportam macromolculas para dentro do ncleo) Exportinas (transportam macromolculas para o citoplasma)

Protena ligante do GTP (small GTP-binding protein) Ran

A actividade e conformao da Ran so reguladas pela ligao de GTP ehidrlise.

As enzimas que estimulam a passagem de GTP a GDP encontram-se no ladocitoslico do invlucro, enquanto que as que transformam GDP em GTP localizam-se no lado nuclear.

Este facto vai gerar um gradiente GTP/Ran ao longo do poro nuclear que poderdeterminar a direco do transporte nuclear.

Protenas imp ortada s pa ra o ncleo Tem um sinal de reconhecimento nuclear composto por aminocidos que no

necessitam de estar juntos na cadeia polipeptidica (sequnc ia bipartida ) Durante a importao de protenas, a importina reconhece o sinal de

reconhecimento nuclear da protena, processo facilitado pela interaco comRan.

1. O complexo importina-Ran/GDP liga-se protena que contm o sinal dereconhecimento nuclear.

2. O complexo formado liga-se a filamentos citoplasmticos do poro.3. Ligao a protenas nucleares especificas que se vo localizando cada vez

mais longe o poro.4. O GDP ligado ao Ran transformado em GTP, o que vai modificar a

conformao da importina que se separa da protena importada.5. O complexo imp ortina-Ran/ GTP exportado para o complexo do poro6. O GTP hidrolisado a GDP para regenerar o complexo importina-Ran/GDP.

Existem protenas que entram e saem do ncleo : transportadores (p. ex. de RNA) oucoordenadores de funes nucleares e citoplasmticas.

36


37/52


Protenas exp ortada s do nc leo pa ra o citop lasma :

Contm um sinal de e xporta o nuc lear Este sinal reconhecido pelas exportinas, se ligam a Ran Ran/ GTP promove a formao de complexos estveis entre as exportinas e as

protenas O complexo atravessa o poro nuclear O GTP hidrolisado a GDP levando dissociao da protena.

4. Transporte de RNAs

O RNA transportado do ncleo para o citoplasma O transporte de RNA um processo activo, dependente de energia que requere

Ran para se ligar ao GTP. Os RNAs so transportados como co mp lexos ribonucleicos (RNPs) Algumas protenas do complexo tm sinais de exportao nuclear que so

reconhecidos pelos rece ptores de transpo rte nuc lear. O rRNA est associado a protenas ribossomais, mRNA especifico e s subunidades

ribossomais.

37


38/52


Organiza o Interna no Nc leo

O ncleo mais que um contentor de cromatina, RNAs e protenas nuclearespois contm uma estrutura interna que organiza o material gentico e localiza asfunes nucleares para domnios especficos.

Durante a interfase, existe :

Heterocromatina : cromatina que se mantm condensada Heterocromatina constutiva: contm DNA que nunca transcrito Heterocromatina facultativa: contm DNA que no transcrito naquela

clula, mas pode ser noutra. Eucromatina : cromatina que descondensa e distribui-se para fora do ncleo.

Durante a interfase os cromossomas esto organizados e divididos em domniosfuncionais discretos que impe um papel importante na regulao da expressogentica.

Os genes transcritos activamente esto localizados na periferia destes territrios,perto de canais que separam os cromossomas.

Como clulas diferentes, expresso genes diferentes, a heterocromatina facultativa diferente e varia nos cromossomas.

38


39/52


Nuclolo

o local de transcrio e processamento de rRNA e da formao de ribossomas. uma fbrica de ribossomas designada para preencher as necessidades de

produo regulada e eficiente de rRNA e formao das subunidades doribossoma.

O nuclolo no est envolvido por membrana, est associado s regiescromossmicas que contm os genes que transcreve: 5,8S, 18S e 28S.

39


40/52


99.. SSee lleecc oo ee TTrraa nnsspp oo rrttee PPrroo ttee iicc oo

Cada protena pode ter diferentes destinos, consoante o seu tipo e funo. Os destinos possveis so:

Ncleo Retculo endoplasmtico Aparelho de Golgi Membrana Plasmtica Lisossomas Secreo Citoplasma Peroxissomas Mitocondrias

Retculo Endoplasmtico

um centro de membranas em tubos e sacos (cisterna) que se estende doinvlucro nuclear para o citoplasma

Tipos de RE: Rugoso (coberto de ribossomas) Transitrio (local onde as vesculas saem para o aparelho de Golgi) RE liso ( envolvido em lpidos)

1. Retculo endop lasm tico e sec re o de protenas

Via de secreo:

RE rugoso A. Golgi Vesculas de Secreo LisossomasMembrana celular Exterior da clula

As protenas que so transferidas para o retculo endoplasmtico so sintetizadasnos ribossomas ligados ao RE (rugoso), apesar do incio ocorrer em ribossomas livresno citoplasma.

As protenas que ficam no citoplasma so sintetizadas em ribossomas livres(sempre)

Existem 2 tipos de translocao:

Transloc a o c o-translac ional: sntese proteica nos ribossomas do RE.

Transloc a o p s-translac ional: sntese proteica nos ribossomas livres.

Transloc a o c o-translac ional

1. Associao de ribossomas com o RE: Os ribossomas esto marcados para se ligarem ao RE pela cadeia polipeptidica

que est a ser sintetizada. Os ribossomas ligados ao RE e livre no tm diferena alguma. A sntese comea sempre com ribossomas livres.

2. Marcao da protena por um sinal: A marcao ocorre na extremidade amina

O sinal constitudo poram inocidos hidrofbic os Este sinal marca as protenas para a sua correcta localizao

40


41/52


O sinal reconhecido e liga-se partcula reconhecedora do sinal (SRP) = 6pptidos.

O SRP liga-se ao ribossoma tal como o sinal, inibindo a traduo, marcando ocomplexo para o RE pela ligao ao receptor SRP

Esta ligao liberta o SRP do ribossoma e do sinal

3. Ligao do ribossoma a um complexo proteico de translocao O sinal entra para dentro do canal membranar ou transloco.

4. Sntese da cadeia polipeptidica para dentro do RE O sinal liga-se a uma peptidase e o polipptido libertado para o lmen do RE.

Transloc a o po s-translac ional

1. Sntese em ribossomas livres no citoplasma2. O sinal reconhecido por protenas receptoras associadas ao transloco

3. necessrio a ligao de Hsp70 c itoslic o cadeia polipeptidica para manter acadeia numa conformao para entrar no transloco

4. Hsp70 serve para puxar para dentro a cadeia polipeptidica (BiP)

2. Inser o de p rotenas na m embrana do RE

As protenas destinadas incorporao da membrana plasmtica ou outrasmembranas so inicialmente inseridas na membrana no RE, em vez de irem para olmen.

As protenas membranares so embebidas na membrana por regies hidrofbicas

que se expandem da bicamada fosfolipidica. A poro intramembranar destas protenas geralmente em -hlice consistindo

em 20 a 25 am inocido s hidrofbic os. A formao da -hlice maximiza as pontes de hidrognio entre o pptido e os

aminocidos hidrofbicos das cadeias laterais interagem com os cidos gordosdos fosfolipidos da bicamada.

Variaes na insero de protenas intrnsecas:

Algumas tm mais que um domnio transmembranar A orientao pode ser diferente (extremidade carboxilo para o lado citoslico ou

para o interior do lmen)

A orienta o da s protenas ma ntm-se a o longo da via:

A parte que est virada para o lmen fica virada para o lado extracelular (no casode protenas da membrana plasmtica), pois a composio do lmen do RE semelhante do espao extracelular.

A poro que contacta com o citosol, permanece sempre em contacto com ocitosol.

41


42/52


Insero de protenas transmembranares com a extremidade carboxilo orientada parao citosol:

1. O sinal da extremidade amina que direcciona a protena para o retculoendoplasmtico clivado

2. A sntese continua at que uma sequncia STOP transferncia bloqueia a

transferncia e a protena fica ancorada membrana por um domnio -hlice.

3. O transloco fecha devido sinalizao4. A poro com a extremidade C sintetizada no citosol5. As subunidades do transloco separam-se e o domnio transmembranar fica na

bicamada.

Insero de protenas transmembranar ancoradas pelo sinal de internalizao:

O sinal de internalizao reconhecido pela SRP O sinal no clivado e actua como um domnio transmembranar em -hlice.

A protena fica ancorada membrana atravs do sinal.

As protenas inseridas na membrana deste modo podem estar orientadas dos 2modos possveis, dependendo de onde se encontra o sinal.

As protenas transmembranares com mais que um domnio membranar tm sriesalternativas de sequncias de sinalizao interna e seqncias STOP transferncia.

3. Molda gem e p roc essam ento proteico no RE

Na via secretria, as protenas so moldadas durante a sua translocao no RE ou jdentro do lmen

Processos que ocorrem no RE: Moldao de protenas (para 3 dimenses) Formao de subunidades Formao de ligaes dissulfito (o ambiente oxidante do RE permite a

formao destas ligaes numa reaco catalizada pela Protena DisulfitoIsomerase)

Glicolisao (primeiras etapas N glicolizao) Adio de ancoras de glicolipidos

Chape rona Hsp70 (Bip): liga-se cadeia polipeptidica durante a sua passagem para oRE e medeia a moldagem e formao de subunidades nas protenas.

Glicosilao: Ocorre nos resduos de asparagina (N-glicolisao) Os oligossacardeos (14 aucares) so sintetizados num lipido (dolicol) ligado

membrana do RE. A enzima, oligossacarideo transferase , transfere o bloco para os resduos de

asparagina 4 aucares (3 glicose e 1 manose) so removidos Processam-se vrias alteraes antes da protena passar para o A. Golgi.

42


43/52


Algumas protenas esto ligadas membrana por glicolipidos ncoras deglicosilfosfatidilinositol (GPI) atravs da extremidade carboxilo. Estas protenas sotransportadas tal como as protenas transmembranares na via secretria.

Muitas protenas so degradadas assim que so produzidas, devido suaincorrecta formao

Um papel do RE marcar essas protenas e dirigi-las para a via de degradao controlo de qualidade.

4. Exporta o de prote nas e lpidos do RE

Tanto as protenas como os lpidos viajam ao longo da via secretria em vesculas As membranas das vesculas fundem-se com as do organelo para onde viajam. As protenas que so transportadas por meio de vesculas mantm a sua

orientao o lado que est virado para o citosol fica no citosol. Algumas protenas permanecem no RE, estando sinalizadas.

Sinal das protenas: Que ficam no RE (KDEL protenas que voltam para o RE; KKXX protenas

transmembranares que ficam no RE) Que vo para o A. Golgi

Se ocorrerem mutaes ao nvel dos sinais que identificam as protenas que ficamno RE, vo ocorrer alteraes no seu destino. Estas vo passar para o A. Golgi evo ser secretadas para fora da clula.

A introduo do sinal KDEL vai fazer com que as protenas que normalmente iriampara o Golgi permaneam no RE.

43


44/52


Apa relho de Golgi

1. Organiza o do Golgi

consitituido por membranas em cisterna associadas a vesculas Tem uma polaridade diferente na sua estrutura e funo As protenas do RE entram, na face cis (face de entrada) e saem pela face trans

(face de sade) O aparelho de Golgi aparenta ter 4 regies distintas

Cis Golgi Golgi Stack Medial Trans

Trans Golgi

2. Glicolisa o proteic a no aparelho de Golgi O processamento de protenas no aparelho de Golgi envolve a modificao e

sntese de carbohidratos das glicoproteinas, tal como a modificao da ligao N-glicosodica (realizada no RE)

Aps a glicosilao no RE, a protena processada sendo alterada por diversosprocessos:

1. Remoo de 3 residuos adicionais de manose2. Adio sequencial de N-acetilglucosaminas3. Adio de 3 galactores e 3 cidos sialicos

As glicoproteinas processadas podero ser diferentes dependendo da protena edas enzimas presentes neste processo que vo originar diferentes ligaes N-glicosidicas.

O processamento das ligaes N-glicosidicas das protenas lisossomais difere daquelas

que so sec reta das e d as p lasm tica s.

1. Adio de N-acetilglucosamina fosfato a resduos especficos de manose2. Remoo do grupo N-acetilglucosamina, deixando os resduos de manose 6-

fosfato na ligao N-glicolitica

Estes resduos de manose 6-P so depois reconhecidos por receptores ao nvel damembrana do trans Golgi que direcciona o transporte destas protenas para oslisossomas.

O passo crtico deste processo envolve o reconhecimento da forma da protenalisossomas pela enzima que adiciona a N-acetilglucosamina fosfato.

No aparelho de Golgi tambm ocorre a O-glicosilao, pela adio decarbohidratos a cadeias laterais.

3. Metab olismo lipdico e po lissac ardeo no A. Golgi

O glicerol, fosfolipidos, colesterol e ceramida so sintetizados no RE A Esfingomielina e glicolipidos so sintetizados a partir da ceramida no Aparelho de

Golgi A esfingomielina sintetizada no interior do A. Golgi mas a adio de glicose

ceramida ocorre no lado citoslico.

44


45/52


4. Selec o de p rotenas e exporta o d o apa relho de Golgi

As protenas, lipidos e polissacardeos so transportados do aparelho de Golgi pelavia secretria

As vesculas formam-se no trans Golgi e entregam o contedo aos locais celularesapropriados

Existem protenas que tm que se manter no aparelho de Golgi, contendo o seusinal na parte transmembranar, evitando a incorporao em vesculas deixando otrans Golgi

Via secretria constitutiva: Existe a incorporao de novas protenas e lipidos na membrana plasmtica Leva a uma secreo de protenas no regulada

Veia secretria regulada Protenas especficas so secretadas de acordo com sinais do meio.

45


46/52


Mec anismo d e Transpo rte Vesicular

O transporte vesicular responsvel pelo trfico molecular entre os vrioscompartimentos membranares.

A selectividade do transporte baseada num envolvimento selectivo dependentedas vesculas que reconhecem e se fundem com a membrana apropriada.

1. Selec o , protenas e vesculas

Processos da via secretria, na qual as protenas transmembranares e protenas do

lmen e os seus recep to res so e nvo lvidos em vesc ulas

1. Protenas so selecionadas de protenas marcadas para outros destinos e deprotenas que necessitam de ficar para trs.

2. Formao da vescula por enrugamento da membrana3. Transporte da vescula para a membrana marcada.

Vesculas revestidas por clatrina: responsveis pela endocitose e transporte doaparelho de Golgi para o li

rita luz biocell

Documents