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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS

DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA

CARACTERIZACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS Y DEL PERFIL

PLASMÍDICO EN CEPAS DE Staphylococcus aureus AISLADAS DE QUESOS ARTESANALES E INDUSTRIALES CONSUMIDOS EN EL MUNICIPIO DE

VALLEDUPAR CESAR-COLOMBIA

Trabajo De Grado Presentado Para Optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología

Autor: Ivonne Acosta Nieves Lcda .en Ciencias Naturales

Tutora: Lorena Atencio de Guiñez M.Sc. En ciencias biológicas

Maracaibo, Junio de 2010

Caracterización de la susceptibilidad a antibióticos y del perfil plasmídico en cepas de Staphylococcus aureus Aisladas de Quesos Artesanales e industriales consumidos en el municipio de Valledupar Cesar-Colombia

Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. Trabajo Especial de Grado presentado por: Lcda. IVONNE ACOSTA NIEVES

2

CARACTERIZACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS Y DEL PERFIL PLASMÍDICO EN CEPAS DE Staphylococcus aureus AISLADAS DE QUESOS

ARTESANALES E INDUSTRIALES CONSUMIDOS EN EL MUNICIPIO DE

VALLEDUPAR CESAR-COLOMBIA

____________________________________

Lcda en Ciencias Naturales, Ivonne Acosta Nieves

CI. 49774908

Dirección: Barrio Alfonso López Cra 18 Nº 13B-19 apart 102B. Municipio de Valledupar. Colombia.

Teléfono fijo: 5756952

Teléfono móvil: 3168685707 Dirección electrónica: [email protected]

______________________________________ Tutora: Lorena Atencio de Guiñez

M.Sc. En ciencias Biológicas

Dirección electrónica:[email protected]



3



4

Acosta N., Ivonne P. Caracterización de la susceptibilidad a antibióticos y del perfil Plasmídico en cepas de Staphylococcus aureus Aisladas de Quesos Artesanales e industriales consumidos en el Municipio de Valledupar Cesar-

Colombia. Trabajo de Grado para optar al Grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. La Universidad del Zulia, Facultad Experimental de Ciencias, División de Estudios para Graduados, Maestría en Microbiología, Maracaibo, Venezuela, 2010.

76pp.

RESUMEN

En el presente trabajo se caracterizó la susceptibilidad a antibióticos y perfil plasmídico de cepas de Staphylococcus aureus aisladas de quesos artesanales e industriales que

se consumen en el municipio de Valledupar Cesar-Colombia. Las cepas fueron aisladas de quesos blandos, semiduros y duros de origen artesanal e industrial

escogidos de forma aleatoria en expendios de quesos del municipio. Por el método de Difusión del disco en agar -se determinó la resistencia a antibióticos y con la técnica de lisis alcalina y electroforesis en gel de agarosa el perfil plasmídico. Como resultado se

obtuvo una carga microbiana por encima de 103 UFC/g que esta sobre el valor promedio máximo permitido según la norna covenin 1538-92, el cual indica que se puede desencadenar brotes por intoxicación con estafilocócos. Se demostró la presencia de S. aureus en los quesos costeños blandos (88%), seguidos por los

quesos semiduros (12%) ambos de origen (artesanal), los cuales son de alto consumo en Valledupar. Se establecieron 4 patrones diferentes de resistencia en las cepas de S.

aureus aisladas de los quesos , siendo el patrón TER común para cinco cepas, el resto

de los patrones fueron únicos (PR, CR y EI). Una cepa fue resisente a P productora de β-lactamasas su CMI más alta fue 32µg/ml; todas las cepas mostraron sensibilidad a

oxacilina, gentamicina, ciprofloxacina, cefoxitin, clindamicina, trimetoprim sulfa, vancomicina, rifampin, e imipenen . Hubo bandas plasmídicas con tamaños entre 23kb y los 2kb, encontrándose cepas con 1 y 3 plásmidos. Es el primer aporte en Valledupar que se hace a la biología molecular de los plásmidos en cepas de S. aureus autóctonas

de productos lácteos artesanales y manufacturados.

Palabras claves: Plásmidos, Quesos artesanales e industriales, Resistencia antibiótica, Staphylococcus aureus.

E-mail: [email protected]

mailto:[email protected]



5

Acosta N., Ivonne P. Characterization of antibiotic susceptibility and the plasmídic profile in strains of Staphylococcus aureus Isolated from artisan cheeses and manufacturers consumed in Municipality of Valledupar Cesar-Colombia. Proyecto

de Trabajo de Grado para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. La Universidad del Zulia, Facultad Experimental de Ciencias, División de Estudios para Graduados, Maestría en Microbiología, Maracaibo, Venezuela, 2010. 76 pp.

ABSTRACT

In this study we characterized the susceptibility to antibiotics and plasmid profile of strains of Staphylococcus aureus isolated from artisanal and industrial cheeses that are

consumed in the municipality of Valledupar, Cesar, Colombia. The strains were isolated from soft cheeses, semi-hard and hard to craft and industrial origin randomly selected cheeses in retail shops of the town. the resistance to antibiotic was determined by the

disk diffusion method and plasmid profile, by alkaline lysis and agarose gel electrophoresis. As a result, a microbial load was obtained a bioburden above of 103 CFU / g that this on the average maximum allowed under the regulation covenin 1538-

92, which indicates that it can trigger staphylococcal poisoning outbreaks. It showed the presence of S. aureus in coastal soft cheeses (88%), followed by semi-hard cheeses

(12%) were both from (artisanal), which are of high consumption in Valledupar. There were 4 different resistance patterns in strains of S. aureus isolated from cheese, in a

pattern common TER five strains, the rest were unique patterns (PR, CR and EI). One strain was resistant to P β-lactamase producing its highest CMI was 32μg/ml; all strains

were sensitive to oxacillin, gentamycin, ciprofloxacin, cephoxitin, clindamycin, sulfa trimetoprim, vancomycin, rifampin, imipenem. There plasmid bands with sizes between 23kb and 2kb, being 1 and 3 strains with plasmids. It is the first contribution in Valledupar which makes molecular biology of plasmids in strains of S. aureus native

handicrafts and manufactured dairy products.

Keywords: plasmids, artisanal and industrial cheeses, antibiotic resistance, Staphylococcus aureus.

E-mail: [email protected]

mailto:[email protected]



6

DEDICATORIA

A DIOS, por darme la oportunidad de capacitarme y acompañarme en todos los

viajes.

A MIS PADRES, MAURA Y GREGORIO, por brindarme apoyo en todo momento y

ayudarme a cuidar mis hijos.

A MI HIJA DE MI ALMA, DANIELA, por ser dulce y colaboradora cuando tengo

que alejarme de su lado.

A MI BEBE DE MI AMOR, CARLO ALEJANDRO, por brindarme una gran felicidad

al venir a mi vida

A MI ESPOSO, GUSTAVO, por su amor y comprensión.

A MIS HERMANOS SANDRA Y GREGORIO, por ser parte de mi vida.



7

AGRADECIMIENTO

A DIOS por permitir que terminara esta maestría.

A MIS PADRES, ESPOSO, HIJOS Y HERMANOS por estar siempre conmigo y

brindarme su apoyo.

A LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA en su figura del CONDES por el financiamiento de

este proyecto.

A MI TUTORA, MSc LORENA ATENCIO, por brindarme tiempo en la corrección de los

trabajos, por sus enseñanzas y creer en mí.

A LA MSc GISELA FUENMAYOR, por brindarme tiempo en las practicas de mi trabajo

y por su dedicación en enseñarme. Muchas gracias.

A LOS COMPAÑEROS DE LABORATORIO DE GENETICA Y BIOLOGIA

MOLECULAR EN VENEZUELA, JOHANDRY, RIXIO y VELINA por ayudarme a

desarrollar mis practicas.

A MIS JURADOS y a todas las personas, que de alguna forma contribuyeron a la

culminación de este trabajo.



8

INDICE GENERAL

Pág.

RESUMEN 4

ABSTRACT 5

DEDICATORIA 6

AGRADECIMIENTOS 7

INDICE DE FIGURAS 11

INDICE DE GRÁFICOS 12

INDICE DE TABLAS 13

INTRODUCCION 14

2. MARCO TEÓRICO 16

Generalidades 16

Estudios de distribución y transmisión de S. aureus asociados a

alimentos

19

Genética de Staphylococcus aureus 24

Susceptibilidad a los antibióticos 27

3. OBJETIVOS 35

4. MATERIALES Y MÉTODOS 36

4.1 Tipo de investigación. 36

4.2 Población de estudio. 36

4.2.1 Recolección de muestras de quesos 36

4.2.2 Homogenización de la muestra y aislamiento de Staphylococcus-

aureus.

37



9

4.2.3 Caracterización de la morfología celular y colonial, bioquímica de

las cepas de Staphylococcus-aureus y preservación de las muestras.

37

4.2.4 Determinación de la susceptibilidad a antibióticos en cepas de S.

aureus

38

4.2.4.1 Determinación de resistencia a los antibióticos por el

método de difusión del disco en agar

38

4.2.4.2 Determinación de la producción de β- lactamasas en cepas

de Staphylococcus aureus, mediante el método de la cefalosporina

cromogénica (Nitrocefina).

39

4.2.4.3 Detección de cepas de Staphylococcus aureus Meticilina

Resistentes (SAMR) mediante la técnica Oxacilina Screening plate.

40

4.2.4.4 Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima a los

antibióticos Oxacilina, Vancomicina y Penicilina G, empleando el

método de dilución en agar.

41

4.2.4.5 Determinación de fenotipos de resistencia a la familia

macrólidos, lincosamidas, estreptograminas B (MLSB ).

41

4.3 Extracción de ADN plasmídico de cepas de Staphylococcus-aureus

mediante lisis alcalina.

42

4.3.1 Extracción y observación de plásmidos crípticos en geles de

agarosa al 0,7% p/v.

43

4.4 Análisis estadístico. 43

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 45

5.1 Aislamiento de S. aureus en quesos artesanales e industriales. 45



10

5.2 Caracterización e identificación bioquímica de cepas de S. aureus 49

5.3 Fenotipos de susceptibilidad a los antibióticos en los aislados de S.

aureus

50

5.4 Determinación de cepas Staphylococcus aureus Meticilina

Resistentes (SAMR) mediante la técnica Oxacilina Screening plate.

55

5.5 Perfiles de DNA plasmídico en cepas de S. aureus 55

6. CONCLUSIÓN 61

7. RECOMENDACIONES 62

8. BIBLIOGRAFIA

9. ANEXOS

63

73



11

INDICE DE FIGURAS

Figura Pág. Figura 1. Porcentaje de Participación en la Producción de productos

alimenticios y de bebidas en Colombia: Producción bruta por subsectores

(2003) DANE.

15

Figura 2 y 3 Bandas plasmídicas observadas en cepas de S. aureus

............................................................................................................................

59



12

INDICE DE GRÁFICOS

Gráfico Pág.

1. Porcentaje de cepas de Staphylococcus aureus en quesos

46

2. Porcentaje de susceptibilidad a antibióticos en cepas de S. aureus 50

3. Porcentaje de Cepas de Staphylococcus aureus Resistentes a los

antibióticos ensayados

52



13

INDICE DE TABLAS

Tabla

Pág.

Tabla 1. Características que distinguen tres especies principales del género

Staphylococcus.

17

Tabla 2.- Enfermedades Transmitidas por Alimentos. Brotes según el alimento

involucrado

23

Tabla 3.- Enfermedades Transmitidas por Alimentos. Brotes según el agente

involucrado

23

Tabla 4. Enfermedades Transmitidas por Alimentos. Brotes según lugar de

consumo

24

Tabla 5. Rangos para las CIM en S. aureus según el CLSI 41

Tabla 6 Valores promedios y rango de Staphylococcus aureus en quesos 45

Tabla 7-. Nomenclatura y procedencia de las cepas de S. aureus aisladas de

quesos.

47

Tabla 8. Patrón de resistencia en cepas de S aureus aislados de quesos 50

Tabla 9. Perfiles plasmídicos en las cepas de S. aureus aisladas de quesos 60



14

INTRODUCCION

La República de Colombia es uno de los países latinoamericanos cuya actividad

pecuaria es el pilar económico fundamental, siendo el Departamento del Cesar uno de

los departamentos colombianos aventajados en este sector por cuanto el crecimiento

de la industria lechera y la cría de ganado de levante son equiparables al aumento de

la población bovina usada para este doble propósito. De acuerdo a datos estadísticos,

la población bovina en el año de 1999 era de 1.416.002 cabezas, hacia el 2003 se

registró una cifra de 1.425.319 cabezas, cuando el número de personas de la cabecera

municipal del departamento alcanzó apenas una cifra de 643.096 habitantes

(Gobernación del Cesar. El Cesar en Cifras 2000-2003 publicado por el diario el

colombiano en el 2003). Por esta razón, se considera este departamento al igual que

su capital Valledupar, como zonas ganaderas por excelencia, esto se refleja en las

diferentes manifestaciones culturales aún en las más íntimas, como por ejemplo el

folclor, ahora muy conocido a nivel mundial. De acuerdo a esto, la prestante economía

del municipio de Valledupar, goza de la presencia comercial de empresas

multinacionales como Nestlé, nacionales como Colanta y regionales como Coolesar y

Klarens, que han impulsado enormemente la industria lechera en la región.

El sector agroindustrial en Colombia según el departamento administrativo

nacional de estadística DANE, se posiciona como el sector más importante de la

industria manufacturera colombiana con una producción bruta de US$ 9.500 millones

en el 2003. Esta cifra representa aproximadamente el 31% del total de la producción

bruta total, seguido de lejos por la fabricación de sustancias y productos químicos que

representa el 14% del total de la producción industrial. Así mismo, este sector

representa el 10,2% del total nacional y genera 110.000 empleos directos. El sector

agroindustrial colombiano está diversificado. El país es un gran productor de lácteos,

bebidas, productos de molinería, cárnicos, aceites, entre muchas otras (Figura 1)

(DANE, 2004).



15

No obstante, la producción lechera del Cesar aún se maneja de manera

incipiente en los hatos ganaderos donde la tecnología no ha llegado. Es de preocupar,

de acuerdo a datos obtenidos por el sistema nacional de vigilancia en salud pública

(SIVIGILA., 2005), que reporta casos de enfermedades transmitidas por alimentos ETA

debido al consumos de quesos en Valledupar; Esto hace que la industria de lácteos se

convierta en un riesgo para la salud pública toda vez, que en la mayoría de los casos,

los alimentos son preparados por personas sin la capacitación para su correcta

manipulación en condiciones precarias de higiene, lo que facilita la aparición de las

(ETA) producidas por microorganismos como Salmonella sp., E. coli, Listeria sp.,

Campylobacter, S .aureus y Coliformes (Brooks y col., 2002).

Figura 1. Porcentaje de Participación en la Producción productos alimenticios y de bebidas en Colombia: Producción bruta por

subsectores (2004) DANE.



16

2. MARCO TEÓRICO

Generalidades de los Staphylococcus aureus

El género Staphylococcus se ubica dentro de la familia Staphylococcaceae del

orden Bacillales, la cual incluye otros tres géneros: Jeotgalicoccus, Macrococcus y

Salinococcus, caracterizadas por poseer una morfología en coco inmóvil de 0.8 – 1,0

m de diámetro, Gram positivo que se dividen en tres planos para formar racimos

irregulares de células (Sierra y col., 2002; Aranaga, 2006)

La diferenciación de las especies estafilocócicas se basa en su fisiología y

reacciones enzimáticas producidas por cada una de ellas, obteniéndose actualmente

mas de 40 especies (Mac Faddin, 2000). Según Walker, 2.000, los estafilococos se

caracterizan por ser catalasa positiva, un carácter que los diferencia de los

estreptococos que son catalasa negativos.

Durante varias décadas la taxonomía del género Staphylococcus, fue

controversial, ya que los puntos de vista de los microbiólogos clínicos y los que

estudian la sistemática bacteriana son divergentes. Se han registrado al menos trece

especies. Los estafilococos se tiñen fácilmente con colorantes básicos y son

fuertemente Gram positivos (Tabla 1). En las placas de agar, las colonias individuales

son lisas, circulares, convexas-baja, y varían de 1 – 4 mm de tamaño. Las cepas de S.

aureus son de color amarillentas (“aureus”), aunque no todas las colonias de S. aureus

tienen esta característica. La producción de pigmentos (pigmentos carotenoides) que

oscila de naranja a amarillo pálido, pueden observarse mejor por crecimiento en placas

de agar a 37° C por 24 horas, seguida de una incubación a temperatura ambiente

durante unas 24 a 48 horas. No se producen pigmentos en condiciones anaerobias

(Brooks y col., 2002; Mac Faddin, 2000; Walker, 2000).



17

Tabla 1

Características que distinguen tres especies principales del género Staphylococcus

S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus

Producción de coagulasa (s) + - -

Ácido a partir de manitol

(anaerobio)

+ - -

Producción de toxina alfa + - -

Proteína A en la pared celular + - -

Fosfato de ribitol de tipo ácido

teicoico en la pared celular

+ - +

Fosfato de glicerol de tipo ácido

teicoico en la pared celular

- + V

Crecimiento anaerobio y

fermentación de glucosa

+ + -

Sensibilidad a la novobiocina + + -

Tomado de Lancette y Bennet, 2001. Datos de Hájek y MarŠálek: Baird-Parker: Ann.N: Y: Acad.Sci., 236:7, 1974.V: variable, += 90% cepas positivas, -= 90% de cepas negativas

Los estafilococos pueden aislarse también sobre agar manitol salado, que es un

medio de alta salinidad (7,5% de NaCl) y que contiene manitol como fuente de energía,

S. aureus fermenta manitol y hace que el medio se torne amarillo, aunque los

estafilococos crecen en este medio, su capacidad para fermentar el manitol es muy

variable. Los estafilococos varían respecto a los azúcares que fermentan, pero cuando

se cultivan en tubos de fermentación cada especie produce ácido a partir de los

azúcares aunque sin desprendimiento de gases (Walker, 2000). El Agar Baird-Parker

(BPA) es el medio recomendado para el aislamiento de S. aureus de las fuentes de

alimentos contaminadas. Los agentes selectivos glicina, litio y telurito han sido

utilizados para el aislamiento de S. aureus mientras que inhiben el crecimiento de otros

microorganismos que presentan las muestras de alimentos (CESU, 2001).



18

Los estafilococos son aerobios y anaerobios facultativos. Se obtiene crecimiento

más abundante en condiciones aeróbicas; algunas cepas requieren del aumento de

tensión de CO2. Los estafilococos tienen un crecimiento en amplios rangos de

temperaturas que oscilan entre 6,5 a 46° C, cuyo óptimo para S. aureus es de 30 a 37°

C en un medio con pH de 7,0 – 7,5. (Sierra y col., 2002)

Estas bacterias pueden causar infección cuando penetran la piel a través de una

cortadura o una úlcera, o cuando ingresan al cuerpo a través de un catéter, o de un

tubo de respiración, o cuando colonizan directamente las mucosas que están en

contacto con el ambiente externo. S. aureus expresa una amplia gama de potenciales

factores de virulencia como son las proteínas de superficie que promueven la

colonización de tejidos; las invasinas (leucocidina, quinasas, hialuronidasa) que

promueven la expansión bacteriana en el tejido, los factores de superficie (micro

cápsula, proteína A) que inhiben la fagocitosis; las propiedades bioquímicas

(carotenoides, catalasa) que aumentan su supervivencia en los fagocitos; los

“disfraces” inmunológicos (proteína A, factores coagulantes como la estafilocinasa y la

coagulasa); las toxinas destructoras de membranas (hemolisinas, leucotoxina,

leucocidina) que lisan las membranas eucarióticas; las exotoxinas (SE A-G, TSST-1,

ET) que dañan los tejidos o provocan otros síntomas de la infección, y la resistencia

intrínseca o adquirida a los antibióticos (Walker, 2000).

La mayor parte de los seres humanos llevan consigo gran número de

Staphylococcus y organismos relacionados, tanto en la nariz como en la piel.

Staphylococcus epidermidis, es relativamente no patógeno, oportunista, y casi siempre

se encuentra en la flora normal de piel y mucosas de las vías respiratorias y digestivas,

mientras que el patógeno Staphylococcus aureus es componente normal de la

microflora humana autóctona, transportado asintomáticamente en ciertas zonas del

cuerpo. Este comensal persiste en piel, naríz, perineo y vagina (Lancette y Bennet,

2001).



19

Aunque S. aureus y S. epidermidis frecuentemente son transportados por

individuos sanos, hay ciertas circunstancias que pueden provocar enfermedades que

pongan la vida en peligro. Debido a su presencia en superficies corporales se hallan en

posición para invadir siempre que las defensas del huésped estén aunque sólo sea

ligeramente perturbada. En consecuencia, son causas frecuentes de infecciones de

heridas traumáticas y quirúrgicas, así como infecciones más superficiales de piel. Al

respecto, una lesión estafilocóccica frecuente y característica es el furúnculo de la piel.

Sin embargo, las bacterias pueden invadir e infectar prácticamente cualquier tejido,

provocando enfermedades tan diversas como osteomielitis, septicemia, neumonía y

enterocolitis (Walker, 2000).

Los estafilococos, son más resistentes a condiciones ambientales adversas que

muchas bacterias no esporuladas (Walker, 2000). Las cepas de S. aureus son

resistentes a muchos fármacos y resisten a la muerte frente a la mayor parte de los

desinfectantes. Las estirpes típicas de S. aureus producen: α-toxinas, coagulasa y

nucleasa termoestables (Walker, 2000).

Estudios de distribución y transmisión de S. aureus asociados a alimentos

La intoxicación alimentaria por estafilococos no es una enfermedad infecciosa

sino una intoxicación resultante de ingestión de alimentos contaminados por toxina

preformada. El origen de la contaminación suele ser la manipulación de los alimentos

por un individuo portador de S. aureus. Los microorganismos crecen con rapidez e

incluso a temperatura ambiente, y pueden acumularse concentraciones peligrosas de

enterotoxinas en los alimentos en unas pocas horas. Como las toxinas son muy

termoresistentes, el calor no hace que los alimentos que contienen enterotoxina sean

seguros para el consumo. Después de la ingestión, al cabo de una a seis horas

aparecen síntomas de náuseas, vómitos y diarrea. La enfermedad es autolimitante;

después de uno o dos días, suele lograrse la recuperación completa (Lancette y

Bennet, 2001).



20

En alimentos con un potencial hídrico (aw) de 0,9 a 0,95 o con 5 a 10% de sal, S.

aureus puede dominar, ya que la mayoría de las bacterias no pueden crecer bajo estas

condiciones. La presencia de S. aureus en un alimento usualmente indica

contaminación por la piel, boca, o nariz de los trabajadores que manejan el alimento

(Lancette y Bennet, 2001), pero también una inadecuada limpieza de equipo y

productos de origen animal son fuentes de contaminación (CESU, 2001).

La importancia de los estafilococos de aislados clínicos y alimenticios se debe a

la amplia variedad de virulencia específica que guardan en común (Jabbloski y Boach,

2001).

La intoxicación puede deberse a 6 enterotoxinas estafilocócicas: A, B, C, D E y

F. Se produce toxina suficiente en 4 a 6 horas a 32ºC, pero no con temperatura de

refrigeración, como para producir síntomas de intoxicación por alimentos. De hecho, la

intoxicación estafilocóccica alimentaria (SFP) es una causa persistente de

gastroenteritis en países desarrollados y a nivel mundial, tratarlo puede ser más

costoso, que otros patógenos asociados a alimentos (Lombard y col., 2004).

(Jabbloski y Boach, 2001).

Alimentos que se exponen a la contaminación por S. aureus posterior a su

procesamiento representan un significante riesgo para la salud, porque se han

eliminado microbios que normalmente podrían causar la exclusión de S. aureus por

competencia. El abuso de las temperaturas (es decir, inadecuada temperatura de

almacenamiento) de los alimentos también permite la proliferación de estafilococos

(Jabblonski y Boach, 2001).

Una de las dificultades asociadas con la contaminación estafilocócica es que al

crecer los microorganismos en el alimento, la presencia de estos y sus enterotoxinas,

no causan efectos sobre las características organolépticas y por consiguiente puede

pasar desapercibido (Lombard y col., 2004). (Jabblonski y Boach, 2001), la mayoría de



21

los alimentos que normalmente se ven afectados incluyen cremas fustigadas (nata),

huevos, mayonesa y carnes (Lombard y col., 2004). Un criterio para confirmar un caso

de ETA causada por Staphylococcus aureus es el aislamiento de mas de 105 unidades

formadoras de colonias (UFC/g o mL) en el alimento analizado (Ríos, 2003). Los

indicios de intoxicación alimentaria se inician de 1 a 6 horas tras la ingesta de algún

alimento rico en proteína (como pasta rellena, ensalada de jamón, ensalada de pollo,

queso cotagge o carne enlatada) infectado por una cepa de S. aureus productora de

enterotoxina. Los pacientes presentan vómitos y diarrea que duran 6 a 48 horas. La

intoxicación alimentaria por Staphylococcus aureus pone en peligro la vida de personas

de edad avanzada y lactantes, ya que estos se afectan por los cambios de hidratación

(Walker, 2000).

El queso ha estado implicado como vehículo de enfermedades transmitidas por

alimentos (ETA) en varios casos a lo largo de toda América del Sur. En un estudio

realizado sobre alimentos sospechosos de ocasionar incidentes de ETA en Venezuela

desde 1989-1999, se halló que el agente causal encontrado con mayor frecuencia era

S. aureus y en la mayoría de los casos, el queso estaba involucrado (Ríos, 2003).

En el 2001, el Laboratorio de Microbiología del Instituto de Investigación

Nacional (Lima –Perú), obtuvo de 30 muestras de queso fresco artesanal (de leche de

vaca) analizadas, 24 (80%) que presentaban contaje de Staphylococcus aureus por

encima de 102 UFC/g límite máximo establecido por la Norma Técnica Peruana (NTP)

202.087 para el queso fresco producido de manera artesanal (Díaz y Gonzáles, 2001).

Otro estudio realizado en Chile, revela que S aureus fue aislado de las muestras

retrofaríngeas provenientes de 35 de 102 manipuladores de alimentos muestreados, es

decir, que 34% de los manipuladores analizados estaban colonizados por este

microorganismo. No se encontró diferencia significativa entre el número de cepas

aisladas del sexo femenino (17/53) y del sexo masculino (18/49). La producción de



22

enterotoxinas se evidenció en 19 de las 35 cepas aisladas (54 %). De estas cepas, 11

produjeron sólo enterotoxina A (58 %), 5 sólo enterotoxina B (26%) y 2 sólo

enterotoxina C (11 %). La producción simultánea de enterotoxina A y B fue observada

en una cepa (5 %). No se detectó la producción de enterotoxina tipo D (Figueroa y col.,

2002).

De igual forma, un análisis de 200 muestras de leche cruda a nivel de cántaras

en receptorias ubicadas en tres zonas (El Laberinto, municipio Jesús Enrique Lossada,

Machiques de Perijá y Costa Oriental del Lago de Maracaibo) de alta producción

lechera del estado Zulia, entidad donde se genera el 40 % del total nacional, se

encontró que 45 muestras (22,5%) de leche analizadas contenían antimicrobianos,

obteniéndose crecimiento bacteriano en 35 de ellas. Se aislaron 100 cepas, que se

distribuyeron en los siguientes géneros: 44 Staphylococcus, 19 Streptococcus, 17

Enterococcus, 9 Bacillus, 4 Micrococcus, 4 Corynebacterium y 3 Lactococcus. La

especie más frecuentemente aislada fue S. aureus, principal agente productor de

mastitis bovina en el estado Zulia, y microorganismo frecuentemente asociado en el

país con intoxicaciones alimentarias vehiculizadas por queso elaborado con leche

cruda (Farías y col., 2002).

En Venezuela desde 1996 hasta mediados de 2002, según la Dirección de

Vigilancia Epidemiológica del Ministerio de salud y desarrollo social MSDS (Ríos,

2003), se ha reportado en sus laboratorios a nivel nacional, que el alimento

responsable en la mayoría de los brotes confirmados de ETA es el queso con un 46,7

% de los casos (Tabla 2), donde el agente etiológico involucrado fue S. aureus en un

65,9 % del total de brotes (Tabla 3). Hogares, escuelas y restaurantes representaron el

lugar de consumo donde se ubicó la responsabilidad de los brotes ocurridos, en un

54,2 %, 40,8 % y 6,3 % respectivamente (Tabla 4). Los datos reportan que en

Venezuela, la situación de salud por ETA es mal cuantificada; encontrándose una

asociación alimentos/agente etiológico más frecuente: Queso/S. aureus. Por tal motivo

deben incrementarse las inspecciones sanitarias a queseras artesanales, ventas



23

ambulantes, empresas prestadoras de servicios a comedores escolares y la cadena “de

la granja a la mesa (Ríos, 2003).

Tabla 2

Enfermedades Transmitidas por Alimentos. Brotes según el alimento involucrado

Alimento

Brotes (1996 – 2002*) %

Queso 155 46.7

Origen marino 77 23.2

Carnes 25 7.5

Ensaladas 13 3.9

Pollo 13 3.9

Postres 8 2.4

Otros 41 12.3

Total 332

Tomado de Ríos, 2003.

Tabla 3

Enfermedades Transmitidas por Alimentos. Brotes según el agente involucrado

Agente etiológico Brotes (1.996 – 2.002*) %

Staphylococcus aureus 91 65.9

Histamina 13 9.4

Cólera 12 8.7

E. coli 5 3.6

Bacillus cereus 4 2.9

Salmonella 1 0.7

Otros 10 7.2

Total confirmado: 138

Tomado de Rios, 2003.

Mas reciente en un estudio realizado en los municipios de Maracaibo y San

Francisco, se obtuvo la presencia de Staphylococcus aureus en 25/29 de los quesos

estudiados (86,206 %), que incluían quesos industriales y artesanales de diferentes

tipos: Amarillos, Madurados, Mano, Matera, Mozarella, Palmita, Pasteurizado, y



24

Semiduro. Asi mismo se obtuvo que los quesos con mayor frecuencia de aislamiento

de S. aureus fueron los quesos Semiduros (20 %) y de Mano (16 %), cuyos quesos son

de preferencia en el consumidor zuliano (Fuentes., 2008)

Tabla 4

Enfermedades Transmitidas por Alimentos. Brotes según lugar de consumo.

Tipo local Brotes (1.996 – 2.002*) %

Hogar 180 54.2

Escuela 49 14.8

Restaurante 21 6.3

Cuartel 15 4.5

Comedor 11 3.3

Albergues 11 3.3

Hospital 4 1.2

Ambulante 4 1.2

Otros 11 3.3

Desconocido 26 7.8

Total: 332

Tomado de Ríos, 2003.

Por su parte, en una investigación realizada para determinar la calidad

microbiológica de los quesos blancos venezolanos, se encontró que ésta era deficiente

por encontrarse microorganismos tales como: Salmonella sp, levaduras, coliformes

totales, coliformes fecales, S. aureus y su enterotoxina (Rodríguez y col., 2009).

Genética de Staphylococcus aureus.

El genoma de Staphylococcus aureus consta de un cromosoma circular sencillo

de aproximadamente 2,7-2,8 mbp, además de una variedad de elementos genéticos



25

accesorios cromosomales como: plásmidos conjugativos y no conjugativos, elementos

móviles (IS, Tn, Hi), profagos y otros elementos variables (Mlynarczyk y col., 2001).

Staphylococcus aureus contiene normalmente uno o más plásmidos, de varios

tamaños que oscilan entre 1 a 60 kbp, observándose por lo menos 15 grupos de

incompatibilidad entre los plásmidos. Los plásmidos fueron clasificados por Novick

dentro de tres clases generales y una cuarta clase donde los plásmidos que no se

parecen ni pertenecen a alguna de estas tres fueron provisionalmente colocados

(Novick, 1990, Mlynarezyk y col., 2001).

Plásmidos de clase I: consisten de pequeños plásmidos 1,3-4,6 kbp, en

multicopia (10-55 copias por célula), que son crípticos o transportan un

simple, o raramente, dos determinantes de resistencia. Los plásmidos de

clase I son asignados a cuatro familias según la homología de las funciones

del replicón, estas son: pT181, pC194, pSN2 y pE194 (Novick, 1990,

Mlynarezyk y col., 2001, Velázquez, 2006).

Los plásmidos de clase II: son más grandes, de unos 15-46 kbp y existen en

un número muy bajo de copias de 4-6 por célula, los plásmidos de esta clase

incluyen la mayoría de los plásmidos de penicilinasa, la familia pSK1 de los

plásmidos que confieren resistencia a aminoglicósidos/trimetoprim y varios

plásmidos no clasificados (por ejemplo, pIP630, 22,7 kbp). Los plásmidos de

penicilinasa determinan combinaciones de resistencia a iones metálicos

(cadmio, arsenato, arsenito, antimonio, bismuto, mercurio y órgano mercurio)

y la producción de beta lactamasas (Novick, 1990, Velázquez, 2006).

Los plásmidos de clase III: consiste de grandes plásmidos de 30-60 kbp

que transportan un determinante de transferencia conjugativa (tra) y la

mayoría de ellos, una combinación de marcadores de resistencia, estos

plásmidos se han clasificado en familia pSK41 (pSK41, pG01, pG0400,

pUW3626, pJE1, pSH8, pTZ20 y pCRG1600) y un grupo hasta ahora de



26

plásmidos no clasificados: pIP156, pJ3358, pSAJ1, pTZ22, pWBG637 y

pWBG707). Los plásmidos de clase III usualmente poseen uno o dos

transposones y muchas copias de secuencias de inserción (Novick, 1990,

Velázquez, 2006).

La capacidad de los estafilococos para producir enfermedades depende de su

posibilidad de intercambiar con libertad información genética. Muchas características

son transferidas por bacteriófagos, ya sea mediante transducción generalizada o por

conversión de fago, pero también se ha descrito un proceso similar a la conjugación

entre los estafilococos. Ciertas enfermedades corresponden a grupos de fagos

específicos. Los estafilococos llevan muchos plásmidos que codifican la resistencia a

los antibióticos y se demostró que dichos plásmidos se transmiten entre ellos, tanto por

transducción como por conjugación. De este modo, a menudo los estafilococos son

resistentes a los antibióticos y por ello es muy difícil elegir un antibiótico para

combatirlos (Walker, 2000).

El perfil plasmídico de 75 cepas de S. aureus aisladas de muestras de leches y

carnes molidas, reflejó que el 71% de los aislados llevaba entre 1 a 6 plásmidos de

tamaños moleculares que iban de 0,1 a 14,5 kpb (Ombui y Col., 2000).

Para el año 2001 en la ciudad de Maracaibo-Edo Zulia, Álvarez y col., estudiaron

11 muestras de S. aureus escogidas al azar de distintas fuentes, observándose la

presencia de tres bandas plasmídicas cuyos tamaños fueron aproximadamente de

16,30 kb, 30,37 kb, 37,59 kb.

Para el 2002, Álvarez y col., reportan el análisis del perfil plasmídico de tres

cepas de S. aureus multiresistentes a antibióticos sometidas a curación, proveniente de

muestras clínicas donde se obtuvo que la resistencia a penicilina, ampicilina,

kanamicina, tetraciclina y ceftriaxona pudiera estar codificada en un plásmido común

encontrado en las cepas estudiadas, cuyo tamaño era de aproximadamente 29,4 kb.



27

Así como también, la resistencia a cefalotina en posibles plásmidos de 37,1 kb, 30,37

kb o 16,30 kb.

En otro análisis en la ciudad de Maracaibo-Edo Zulia, se aislaron 21 cepas de

muestras clínicas, a las cuales se le realizó la determinación del perfil plasmídico

obteniendo la presencia de bandas plasmídicas diferentes que oscilaban entre 1,2 kb y

88,14 kb, los cuales estaban presentes en el 95,24% de las cepas de S. aureus. En el

66,66% de las cepas se encontró un plásmido de aproximadamente 23 kb, que

probablemente le confiere resistencia a la penicilina lo que imposibilita el uso de éste

antimicrobiano para combatir a esta bacteria (Atencio y col., 2005).

En la determinación de plásmidos crípticos de 24 cepas de S. aureus aisladas

de diferentes tipos de quesos de consumo frecuente en el Edo. Zulia, se obtuvo la

presencia de bandas plasmídicas. Se observó que una sola banda plasmídica se

presentó en el 45,83% de las cepas; dos bandas en el 33,33% de las cepas; tres

bandas plasmídicas en el 16,66% y, cuatro bandas en el 4,16%. Los tamaños de estas

bandas oscilaron entre 2,130 kpb y >34,00 kpb (Rivera, 2005)

En la determinación de plásmidos crípticos de 24 cepas de S. aureus aisladas

de diferentes tipos de quesos de consumo frecuente en el Edo. Zulia, se obtuvo la

presencia de bandas plasmídicas. Se observó que una sola banda plasmídica se

presentó en el 30% de las cepas; dos bandas en el 10% de las cepas; tres bandas

plasmídicas en el 50% y, cuatro bandas el 10%. Los tamaños de estas bandas

oscilaron entre >23,130 kpb y >1.407 kpb. (Fuentes, 2008).

Susceptibilidad a los antibióticos

Staphylococcus aureus es un microorganismo que posee características

particulares de virulencia y resistencia a los antibióticos. El principal impacto de este

microorganismo se debe a que las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina



28

(SARM), que tradicionalmente se encontraban limitadas al ámbito hospitalario,

produciendo infecciones nosocomiales a nivel mundial. (Nicola y col., 2005); en años

recientes, han aparecido en la comunidad, provocando problemas en muchos países.

Si no se toman las medidas adecuadas para entender y controlar la cambiante

epidemiología y sintomatología clínica, puede convertirse en un importante problema

de salud en un futuro cercano. En años recientes han reemergido las infecciones por S.

aureus. Esto se debe en parte a que la bacteria se ha vuelto resistente a los

antibióticos con los que normalmente se le combate, aunado a diseminación en la

población sana (Nicola y col., 2005).

La prevalencia de cepas de SARM no es homogénea, varía mucho de unos

lugares a otros e incluso dentro de los hospitales, ya que cursa en forma de brotes y

depende mucho del control epidemiológico. Estas cepas resistentes suponen alrededor

del 6% de las infecciones de los enfermos hospitalizados, el 10% de las nosocomiales

y el 25% de las de herida quirúrgica. Colonizan al 40% de los enfermos que están

hospitalizados en una sala donde existan estas cepas, y las infecciones que causan no

sustituyen a las producidas por otros estafilococos sensibles a penicilina, sino que se

suman, y además muchas de estas cepas son multirresistentes a antibióticos como las

penicilinas, los macrólidos, las lincosaminas, los aminoglucósidos y las quinolonas, y

presentan en ocasiones, sensibilidad disminuida a los glucopéptidos (Jones TF y col.,

2002).

El gen que codifica la resistencia a meticilina, mecA, es cromosómico, codifica

una proteína adicional de las llamadas PBP (penicillin binding proteins), la PBP2a, con

baja afinidad por todos los antibióticos betalactámicos, incluyendo penicilinas,

cefalosporinas y carbapenemes. A este gen se pueden asociar otros, portados por

transposones con genes de resistencia a otros antibióticos, que llevan a la aparición de

S. aureus multirresistentes, confiriendo la comentada insensibilidad a los

betalactámicos, aminoglucósidos, macrólidos, lincosaminas, estreptograminas,

tetraciclinas, quinolonas y otros antibióticos. (Zhang, 2001; Archer, 2001; Hiramatsu,

2001).



29

Existen factores asociados que favorecen la adquisición nosocomial de infección

por SARM entre los que destacan: i) la manipulación diagnóstico-terapéutica (catéter

intravascular, sondaje vesical, intubación orotraqueal, etc), ii) estancia en Unidades de

Cuidados Intensivos (UCI), iii) enfermedad grave de base, iv) antibioterapia previa, v)

estancia nosocomial prolongada, vi) cirugía previa o herida quirúrgica, vii) úlceras

isquémicas (Kuehnert y col., 2005).

Para tratar a los enfermos con infecciones por S. aureus resistentes a meticilina

y por Enterococcus spp., durante los últimos 20 años se ha incrementado

considerablemente el uso del glucopéptido vancomicina, antibiótico disponible desde el

año 1958, junto con la teicoplanina; ambos eran de confianza en los tratamientos

empíricos (Wilcox, 2003; Lee y col., 2005). Sin embargo, también es posible la

adquisición de resistencia a estos glucopéptidos. Esto ya se había conseguido in vitro

en el laboratorio, pero no se había detectado en cepas procedentes de enfermos

(Woodford, 2001); no obstante, hace 20 años, se empezaron a encontrar algunas

cepas clínicas con sensibilidad disminuida, con la consiguiente alarma. El nombre que

se dió a estas cepas fue el de GISA, del inglés glycopeptide intermediate S. aureus,

aunque también se han designado como VISA (vancomycin intermediate S. aureus),

siendo más correcto el primer término. La primera cepa GISA fue descrita por

Hiramatsu en Japón (Hiramatsu, y col., 2001), aislada en 1996 del exudado de una

herida infectada de un niño sometido a cirugía cardíaca, y con una concentración

inhibitoria mínima (CIM) de vancomicina de 4 a 8 µg/ml (sensibilidad intermedia).

Según el Clinical and Laboratory Standards institute (CLSI, 2008) se consideran cepas

sensibles a vancomicina aquellas que se inhiben con 0,5 a 2 µg/mL, y resistentes ≥ 16

µg/mL. Hasta la publicación del primer caso de infección humana causada por una

cepa de S. aureus resistente a la vancomicina, motivo de este editorial, sólo se habían

detectado 11 casos clínicos con cepas GISA, repartidos entre Japón (el caso ya

citado), Estados Unidos (ocho casos), Francia, Corea y China (Fridkin, 2001), todas

ellas procedentes de enfermos sometidos a tratamientos prolongados con vancomicina

y otros antibióticos, catéteres y graves enfermedades de base, similares al presente

caso.



30

A pesar del uso difundido de la vancomicina después de su introducción en

1956, un lapso de 30 años pasó antes de que S. aureus desarrolle resistencia

intermedia a vancomicina (SAVI) y a glicopépticos (SAGI). Las cepas inicialmente

aisladas fueron reportadas con CIM para ambos glicopépticos mayor a 4-16 μg/ml. No

fue hasta 2003 que apareció el primer caso de S. aureus vancomicina resistente

(SAVR) (CIM igual o mayor 16- 32 μg/ml). Aunque la vancomicina permanece como

tratamiento confiable para la gran mayoría de las infecciones estafilocóccicas, aunque

prevalece la susceptibilidad universal a vancomicina y otros glicopéptidos la difusión

potencial de SAGI y SAVR puede adquirir gran importancia (Etienne, 2005).

Un reporte realizado en los Estados Unidos (Sievert y col., 2002) se describe el

primer aislamiento de una cepa de Staphylococcus aureus resistente a vancomicina

(SARV).

Es probable que aumenten las cepas de S. aureus resistentes a los

glucopéptidos y que se diseminen, porque son muchos los factores que incrementan

las infecciones por S. aureus resistentes a los antibióticos, sea por razones asociadas

al propio enfermo o su enfermedad (incremento de los cuidados intensivos médicos,

con rotura de barreras de superficie por el uso de procedimientos diagnósticos o

terapéuticos invasores, enfermedades debilitantes, inmunodepresión, neutropenia), por

el medio ambiente (soporte para su transmisión, incluidos los portadores) o por las

propiedades intrínsecas de la bacteria para poder albergar, adquirir y expresar

mecanismos de resistencia (mutaciones, plásmidos, transposones u otros métodos),

facilitados por el uso continuo de antibióticos ya sean de amplio espectro o específicos,

como es el caso de los glucopéptidos (Miller y col.,2001).

El Sistema Nacional de Vigilancia de Infecciones Nosocomiales (National

Nosocomial Infectious Surveillance System, NNIS) de EUA determinó que en pacientes

hospitalizados, la prevalencia de cepas SARM se incrementó del 4% en 1980 a 31,9%

en 1996. En 2001 se tenía un 55% de prevalencia y para el 2003, llegó al 60,7%. En

algunos hospitales se han reportado incidencias hasta del 80% (NNIS 2004) La

prevalencia actual de cepas SARM, está sujeta a variaciones geográficas. Por ejemplo,



31

en Europa se tienen porcentajes elevados, como un 58% en Italia y 54% en Portugal,

mientras que en Japón se tiene un 70%. Por otro lado, los países escandinavos tienen

un porcentaje muy bajo de cepas SARM, alrededor del 1% (Kanafani y Fowler, 2006).

En Venezuela se determinó que en pacientes hospitalizados, la prevalencia de cepas

SARM se tiene un 45.5% en los años comprendidos de 2002-2003, la presencia de

SARM es un problema tanto hospitalario como comunitario, por lo que se recomienda

su identificación como parte del diagnóstico bacteriológico (Camarena y Sánchez,

2002). En Colombia de acuerdo al sistema de vigilancia de resistencia bacteriana cerca

del 50 al 60% de las S aureus aislados en cualquier unidad de cuidados intensivos en

Bogotá presenta este perfil de resistencia (Cruz, 2004).

El gen mecA forma parte de una estructura de los elementos del cassette

cromosomal estafilocócico mec (SCCmec) no contienen genes de virulencia y difieren

uno de otro en su repertorio de determinantes de resistencia a los antibióticos. El tipo I,

que se diseminó entre las cepas SAMR aisladas en los años 60, durante los primeros

años de la quimioterapia, sólo contiene la resistencia a los antibióticos que confiere

mecA (Hiramatsu y col., 2001).

En cambio los cassette cromosomales estafilocócicos (SCCmec) tipos II y III,

acarreados en cepas dominantes en los años 80, contienen múltiples genes de

resistencia a diferentes antibióticos. El transposón Tn554 codifica para la resistencia a

eritromicina, el ψTn554 la resistencia a cadmio, la secuencia de inserción IS431 facilita

la adquisición de resistencia a los antibióticos y la resistencia al mercurio, el plásmido

pUB110 codifica la resistencia a tobramicina/ bleomicina y el pT181 codifica la

resistencia a tetraciclina. Tanto el SCCmec tipo IV como el tipo V son elementos

pequeños, ya que les falta el fragmento donde se encuentran los transposones y

plásmidos, por lo tanto, no acarrean resistencia a otros antibióticos diferentes a los β-

lactámicos. Al igual que el tipo I, pero a diferencia del tipo II, los tipos IV y V son

altamente transmisibles (Hiramatsu y col., 2001). Estudios recientes indican que los



32

SCCmec tipos II y IV se encuentran circulando en cepas SAMR en México (Velásquez

y col., 2004).

En Colombia, en el año 2005, se utilizó la técnica de amplificación aleatoria de

ADN polimórfico (random amplification of polymorphic DNA, RAPD) para caracterizar

molecularmente cepas de Staphylococcus productoras de toxinas, aisladas de

operarios de plantas de producción de alimentos. Se presentó una alta diversidad

molecular en cuanto a aislamientos de garganta, nariz y manos de un mismo individuo,

así como en todos los aislamientos analizados, lo cual demuestra que las cepas

enterotoxigénicas de Staphylococci encontradas en los operarios analizados tienen una

alta diversidad molecular (Escartín, 2000).

En los distritos de Nairobi y Kiambu de Kenia, Ombui y col. en el 2000 reportan

la resistencia de 75 cepas de S. aureus aisladas de muestras de leches y carnes

molidas, donde la elevada frecuencia de resistencia fue observada con lincomicina

67,7%, penicilina 66,7% y cotrimoxazol 51%. Un alto porcentaje (76%) de los aislados

fueron susceptibles a minociclina, seguido por eritromicina (57,3%). La mayoría de los

aislados (80,2%) fueron resistentes a 4 o a más antibióticos.

En un estudio sobre la susceptibilidad a antibióticos de 35 cepas de S. aureus

aisladas de la cavidad retrofaríngea de 102 manipuladores de alimentos demostró que

todas las cepas fueron resistentes a penicilina y todas fueron sensibles a la acción de

la oxacilina, vancomicina, clindamicina, kanamicina y linezolid (Figueroa y col., 2002).

Son escasos los trabajos donde se ha estudiado la susceptibilidad a antibióticos

en cepas de S. aureus provenientes de alimentos de consumo frecuente en Venezuela

y Colombia. En el 2005, Rivera señaló que se establecieron 22 patrones diferentes de

resistencia a antibióticos en S. aureus aislados de los quesos de consumo frecuente en

el Edo. Zulia, siendo PenR-OxR-ErI común para dos aislados, el resto de los patrones

fueron únicos. Cepas con resistencia (completa e intermedia) a 2, 3 y 4 antibióticos



33

fueron los más comunes con un total de 16, 28 y 24 %, respectivamente. Sólo dos de

las cepas aisladas no presentaron resistencia a ningún antibiótico, una cepa de queso

Pasteurizado (Industrial) y el otro de queso Semiduro (Artesanal). En las 23 cepas

restantes fue común encontrar cepas resistentes a 2, 3 y 4 antibióticos representando

juntas el 68% del total de las cepas. Una cepa tuvo resistencia a 7 antibióticos e

igualmente una cepa tuvo resistencia a un antibiótico. Con resistencia a 5 y 6

antibióticos sólo se encontraron dos cepas para cada caso. El 56% de las cepas

aisladas mostraron resistencia múltiple a los antibióticos, considerando en este estudio

para hablar de múltiresistencia a las cepas con resistencia intermedia o completa, a

tres o más antibióticos de diferentes familias o grupos de antibióticos.

En Latinoamérica entre el año 1993 y 2002 se presentaron 719 brotes debido a

infección estafilocócica que afectaron a 27.693 personas de las cuales 3 fallecieron

(Instituto Panamericano de Protección de Alimentos y Zoonosis – Organización

Panamericana de la Salud 1993-2002). Staphylococcus aureus es encontrado en la piel

y mucosas de los humanos (Figueroa, y col., 2002), y estos pueden llegar a los

alimentos de muchas fuentes, pueden contaminar los alimentos por conducto de

quienes manejan o preparan los mismos que tengan infecciones piógenas agudas o

por portadores sanos que los albergan en fosas nasales y garganta. Esta presencia en

los alimentos se asocia a una inadecuada manipulación o al empleo de materias primas

contaminadas (ICMSF, 2000).

En Colombia se realizó el primer trabajo en Medellín donde se determinó la

prevalecía de S. aureus resistente a meticilina en el personal de la unidad de terapia

intensiva de la Clínica Universitaria Bolivariana de Medellín. Sus autores muestran que

la prevalecía de SARM fue de 6,7%, afortunadamente baja en comparación con otros

estudios. La región anatómica en la que se obtuvo el mayor número de aislamientos

correspondió a las fosas nasales. De especial importancia es su sugerencia de optar

por esta región anatómica en lugar de la faringe en el momento de tomar muestras en



34

el programa de vigilancia epidemiológica, puesto que allí fue encontrada la mayor

prevalencia de S. aureus (85%) (Gómez, 2006).

El segundo trabajo, en torno a la caracterización molecular de 31 cepas

toxigénicas aisladas de garganta, nariz y manos de operarios de la industria alimenticia,

utilizando la técnica de amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), se trató de

demostrar la fuente de contaminación y las rutas por las cuales el microorganismo es

transmitido al alimento. Los resultados indican que hubo un alto porcentaje de

polimorfismos (86,66%) con el oligonucleótido empleado, indicando que un individuo

puede ser portador de varios tipos de aislamientos diferentes. Con base en estos

hallazgos los autores recomiendan implementar programas de salud ocupacional en las

industrias alimenticias con las herramientas moleculares para asegurar la inocuidad de

los alimentos (Gómez, 2006).



35

3. OBJETIVOS

Objetivo general

Determinar la susceptibilidad a antibióticos y el perfil plasmídico en cepas de S.

aureus aisladas de quesos artesanales e industriales consumidos en el municipio de

Valledupar-Colombia.

Objetivos específicos

Identificar cepas de Staphylococcus aureus aisladas de quesos artesanales e

industriales.

Determinar el patrón de susceptibilidad hacia antibióticos en las cepas de

Staphylococcus aureus aisladas.

Detectar la presencia de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a

meticilina (SARM).

Comprobar la producción de β-lactamasas en las cepas de S. aureus

resistentes a la penicilina.

Detectar la capacidad de inducir resistencia a Clindamicina de las cepas de

S. aureus.

Determinar el número de bandas plasmídicas en cepas de Staphylococcus

aureus con resistencia a los antibióticos.

Comparar los perfiles plasmídicos y de resistencia antibiótica de las cepas

provenientes de diferentes muestras.



36

4. MATERIALES Y METODOS

4.1 Tipo de Investigación.

Este trabajo estuvo sujeto a una investigación del tipo descriptiva (Sampieri y

col., 1991), (Bermejo, 2004) ya que determinó la presencia de Staphylococcus aureus

en distintos tipos de quesos, así como, los diferentes fenotipos de resistencia a

antibióticos, y, el número y el tamaño aproximado de los plásmidos presentes en las

mismas.

4.2 Población de estudio.

Se estudiaron 25 cepas de S. aureus aisladas de (6 muestras) de quesos tipo

costeño, de manufactura artesanal. Este número de cepas es estadísticamente

significativo, toda vez que la frecuencia de aislamiento de este género bacteriano fue

comparado con los aislados de 25 cepas de S. aureus a partir de 29 quesos estudiados

(86,206%) por Rivera, 2005 y 35 cepas de S. aureus en 14 muestras (64%) de quesos

de las 22 estudiadas según el trabajo realizado por Fuentes, 2008, trabajos previos

realizados en Venezuela. Las muestras de quesos se obtuvieron de diferentes puntos

de ventas en el municipio de Valledupar Cesar-Colombia, tomadas de forma aleatoria

del universo presente en cada establecimiento. Se procesaron cuatro tipos de quesos

en total, tres artesanales (costeño blando, costeño duro, costeño semiduro) y uno

industrial (semidescremado). De cada queso se procesaron 3 muestras para un total de

12 muestras.

4.2.1 Recolección de las muestras de quesos.

Constaron de una muestra de 250 grs. de cada tipo de queso, guardadas en

bolsas plásticas estériles con sello hermético debidamente rotuladas con sus datos



37

tales como: fecha, tipo de queso, lugar de procedencia, entre otros y mantenidas en

caja de material isotérmico contenidos en cubos de hielo, desde el momento de la

colecta hasta el momento de la preparación homogénea de la muestra (Pinto y

Guimarães 2001), que se realizó al llegar al Laboratorio de Microbiología de la maestría

y al Laboratorio de Genética y Biología Molecular de la Facultad Experimental de

Ciencias-LUZ.

4.2.2 Homogenización de la muestra y aislamiento de Staphylococcus aureus.

De cada muestra se pesó, asépticamente, 25 g de queso y se adicionaron a un

vaso de licuadora estéril que contuvo 225 mL de solución salina peptonada (SSP)

estéril (NaCl 0,85% p/v con 0,1% p/v de peptona), a fin de obtener una dilución inicial

(10-1). Hay que indicar que la muestra se procesó hasta lograr homogenizarla

mecánicamente con el uso de una licuadora estéril de 2 a 3 minutos. Posteriormente 1

ml de esta solución se llevó asépticamente a un tubo con 9 ml de SSP 0,1%, y se

obtuvo una dilución 10-2, tal procedimiento se repitió hasta que se obtuvo las diluciones

10-3, 10-4 y 10-5 (NORMAS COVENIN, 1126-89 y 1292-89) (Pinto y Guimarães 2001).

Para el aislamiento de S. aureus, se extendió con espátula de Drigalsky 0,1 mL

de cada dilución sobre toda la superficie de placas con agar Baird Parker (BPA) por

duplicado. Éstas se incubaron por un período de 24 a 48 horas a 37º C (Pinto y

Guimarães 2001) (Norma Covenin 1292-89).

4.2.3 Caracterización de la morfología celular y colonial, y bioquímica de las cepas de

Staphylococcus aureus así como la preservación de las muestras.

Se tomaron entre 3-5 UFC caracterizadas por ser negras, con borde estrecho

blanquecino y rodeado de un halo claro, típico de cepas de S. aureus crecidas sobre

agar BPA por su capacidad de reducir telurito, producir proteasas y lecitinasas



38

respectivamente. Las mismas se sometieron a pruebas bioquímicas confirmativas para

identificar el género y especie en estudio. Estas incluyeron: morfología bacteriana,

tinción de Gram, producción de ácido a partir de manitol, Voges-Poskauer y prueba de

catalasa (Mac Faddin, 2000); y para la evaluación de la patogenicidad del

microorganismo, las pruebas de: coagulasa y nucleasa termoestable (Mac Faddin,

2000).

Las cepas que resultaron positivas para las pruebas bioquímicas confirmativas

de S. aureus, se almacenaron a -20º C en solución de glicerol al 20 % v/v para su

preservación (Atencio y col., 2009), y se activaron en caldo nutritivo para la evaluación

de la susceptibilidad a antibióticos y la determinación del perfil plasmídico.

4.2.4 Determinación de la susceptibilidad a antibióticos en cepas de S. aureus.

La resistencia de las cepas bacterianas a los antibióticos se determinaron por el

método de difusión del disco en agar descrito por Kirby-Baüer (Baüer y col.,1966), así

como la cuantificación de la actividad in vitro a algunos antimicrobianos, determinando

la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) de los antibióticos de interés mediante

dilución en placas con agar Müeller-Hinton (CLSI, 2008).

4.2.4. 1 Determinación de resistencia a antibióticos por el Método Difusión del Disco en

Agar.

Primero se activaron las cepas en caldo nutriente e incubaron a 37ºC por 24h

posteriormente se sembraron en medios nutritivos, enriquecidos (agar sangre al 5%) no

selectivos, incubando nuevamente las placas a 37 ºC por 24h para obtener colonias

aisladas, las cuales fueron resuspendidas en solución salina 0,85% estéril hasta que

alcanzaron una turbidez equivalente al tubo estándar 0,5 de McFarland, que contuvo

aproximadamente de 1-2 x 108 UFC/ml. Posterior a la preparación del inóculo, se



39

sembraron las cepas en placas conteniendo 4 mm de espesor de agar Müeller-Hinton

(HiMedia® Laboratories) con hisopo estéril, rayando en tres direcciones, rotando las

placas cada vez con giros de 60º. Se colocaron los discos asépticamente con una

pinza esterilizada. Para estas cepas se utilizaron los siguientes antibióticos

manufacturados por BD BBLTM (Sensi-DiscTM): Penicilina (10U/mL), Tetraciclina

(30µg/mL), Trimetoprim/Sulfametoxazol (1,25-23,75µg/mL), Ciprofloxacina (5µg/mL),

Gentamicina (10µg/mL), Cloranfenicol (30µg/mL), Rifampicina (5µg/mL), Vancomicina

(30µg/mL), Clindamicina (2µg/mL), Eritromicina (15µg/mL), Linezolid (30µg/mL),

Oxacilina (1µg/mL), (CLSI, 2008). Para verificar la calidad del antibiograma o de los

discos se empleó la cepa de S. aureus ATCC 25923 como control.

Las placas se incubaron de manera invertida a 37º C en atmósfera aeróbica por

18 horas para medir los halos de inhibición y se determino: Resistencia (R), Resistencia

intermedia (I) o Susceptibilidad (S) de la bacteria frente a cada antibiótico, siguiendo los

criterios de interpretación según (CLSI, 2008). Teniendo en cuenta que VA y OX se

leen a las 24 horas exactas.

4.2.4.2 Determinación de la producción de β-lactamasas en cepas de Staphylococcus

aureus, mediante el método de la cefalosporina cromogénica (Nitrocefina).

La hidrólisis de determinados preparados β-lactámicos da lugar a la formación

de productos, con un espectro de absorción en la región visible, diferente a la del

compuesto inicial. La nitrocefina es una cefalosporina cromogénica de color amarillo

que al ser hidrolizado por la β-lactamasa cambia de color amarillo al rojo intenso. Esta

técnica es de gran sensibilidad (detecta cantidades muy pequeñas de enzima) y se

utiliza frecuentemente (Mac Faddin, 2000; García y col., 2001; Livermore y Brown,

2001).

Para la prueba se utilizaron bastoncillos impregnados con nitrocefina (marca



40

OXOID®) que previamente fue humedecida con agua destilada estéril y se rotó sobre

la superficie de la colonia a partir de crecimiento fresco de 24 horas en agar sangre.

Luego se esperó hasta 1 hora el cambio de color (rojo), este efecto es indicativo de una

prueba positiva (Mac Faddin, 2000; Livermore, 2000). Seguidamente, se examinó el

extremo para detectar el cambio de color dentro de los cinco minutos seguidos a la

inoculación. Algunas especies de estafilococos tardan hasta una hora para producir

una reacción positiva (Mac Faddin, 2000; García y col., 2001; Livermore y Brown,

2001).

Este ensayo estuvo controlado con las cepas Staphylococcus aureus ATCC

25923 (ß-lactamasa -) y ATCC 29213 (ß-lactamasa +) (CLSI, 2008).

4.2.4.3. Determinación de cepas S. aureus Resistentes a Meticilina (SARM)

mediante la técnica Oxacilina Screening plate.

La naturaleza heterogénea de la expresión del gen mecA, determinante genético

responsable de la producción de la PBP2a que condiciona la resistencia a la Meticilina,

implica que la mayoría de los métodos descritos para su detección recurren a modificar

las condiciones del cultivo para facilitar la expresión de este mecanismo de resistencia.

Se reduce la temperatura de incubación de 37° C a 30-35° C, se aporta NaCl a los

medios de cultivo o se prolonga hasta 24 horas los tiempos de incubación (CLSI, 2008).

No resultaron cepas resistentes para el antibiótico Oxacilina en la prueba por

difusión en disco, Sin embargo la técnica consiste en cultivar las cepas resistentes a

oxacilina en caldo nutriente a 35° C, hasta una densidad de 0,5 del tubo de Mc.

Farland. Una vez obtenida la densidad requerida se siembran mediante hisopado en

placas con agar Müeller-Hinton suplementado con NaCl (4 %) y 6 μg/mL de Oxacilina e

incubadas a 35° C por 24 horas. El crecimiento de al menos una colonia de las cepas

ensayadas en este medio se relaciona directamente con la expresión del gen mecA,

resultando así una o más cepas SARM (García y col., 2001; CLSI, 2006).



41

4.2.4.4. Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima a los antibióticos

Oxacilina, y Penicilina G, empleando el método de dilución en agar.

Para esto se prepararon tubos con 20mL de agar Müeller Hinton (MH) estériles y

se llevaron a 45° C, luego se les adicionó 1mL del antibiótico en solución con una

concentración conocida, obteniendo al final en la placa ya vertida la concentración que

se desea (CLSI, 2008). Las concentraciones que se utilizaron para esta prueba se

encuentran reflejadas en el anexo 1. (CLSI, 2008).

Los antibióticos que se utilizarán son Oxacilina (Sigma-Aldrich®), y Penicilina G

Sódica® (Bristol-Myers Squibb). Las concentraciones de antibiótico utilizadas se

encuentra dentro de los criterios establecidos por el CLSI, 2008 (Tabla 5). Se utilizó la

cepa de Staphylococcus aureus ATCC 29213 como control negativo (CLSI, 2008).

Tabla 5. Rangos para las CIM en S. aureus según el CLSI.

Antibióticos CIM (ug/mL)

S I R

Oxacilina ≤2 _ ≥4

Penicilina G <0,12 _ ≥0,25

Tomados de CLSI, 2008

Los inóculos se dispusieron como se señaló anteriormente para el protocolo de

difusión en agar, al igual que las condiciones de incubación. La cepa de S. aureus

ATCC 25923 fue utilizada como control (CLSI, 2006).

4.2.4.5. Determinación de fenotipos de resistencia a la familia macrólidos,

lincosamidas, estreptomicina B (MLSB).



42

La técnica se realizó siguiendo las recomendaciones del CLSI, 2008. Dicha

técnica consistió en colocar un disco de Eritromicina (15 μ g) y otro de Clindamicina (2

μ g) separados a una distancia entre 15 – 26 mm uno del otro, de borde a borde en una

placa de agar Mueller-Hinton que ha sido previamente inoculada con una suspensión

(0,5 McFarland) del microorganismo. Después de 16-18 h de incubación a 35° C, el

achatamiento en la zona de inhibición de la Clindamicina próxima al disco de

Eritromicina (efecto zona D) indica un fenotipo de resistencia inducible, la resistencia a

Eritromicina y a Clindamicina indica un fenotipo de resistencia constitutivo y la

sensibilidad a Clindamicina es definida por la ausencia de inducción de resistencia a

Clindamicina en la zona próxima al disco de Eritromicina. Las cepas controles fueron S

aureus ATCC® 25923 sensible a ambos antibióticos (No formadora de la zona D). Las

condiciones del ensayo fueron las mismas descritas para la determinación de

resistencia a antibióticos por el Método Difusión del Disco en agar (CLSI, 2008).

4.3 Extracción de DNA plasmídico de cepas de Staphylococcus aureus. mediante lisis

alcalina.

De un cultivo fresco se inoculó la cepa bacteriana en placas de agar nutriente,

por rayado en cuadrícula mediante hisopado. Las placas se incubaron a 37º C durante

24 horas. Para recoger el volumen celular, transcurrido el período de incubación se

adicionó a la placa 0,5 mL de solución salina estéril al 0,85%, esta operación se repitió

una vez más para cosechar la mayor cantidad de colonias posible y se transfirió a

tubos eppendorf.

El volumen celular se centrifugó por 5 minutos a 10.000 r.p.m y se descartó el

sobrenadante. El pellet obtenido se resuspendió en 500 µL de buffer Tris HCl- EDTA-

Glucosa (TES), para nuevamente ser centrifugado por 3,5 minutos a 10.000 r.p.m y se

descartó el sobrenadante. Este nuevo pellet se resuspendió en 500µL de buffer Tris

HCl- EDTA (TE) glucosa y se le agregó 20 µl de lisostafina (0,5 mg/mL). Se incubó a



43

37º C por 1 hora, se agrego 75 µL de buffer de lisis y se mezcló suavemente por

inversión. La reacción se incubó a temperatura ambiente por un período de 10 minutos.

Se procedió a adicionar 400 µL de acetato de potasio 5M, se mezcló por inversión el

eppendorf, y se incubó en hielo por 30 minutos. Se centrifugó enseguida por 20

minutos, a temperatura ambiente a 10000 r.p.m. El sobrenadante obtenido fue

transferido a un tubo eppendorf estéril. La obtención del ADN precipitado se llevó a

cabo agregando 555 µL de etanol absoluto frío e incubando toda la noche a -20º C. Se

centrifugó a 10.000 r.p.m por 10 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante se

descartó, el pellet obtenido se lavó con etanol frío al 70%, seguido de 5 minutos de

centrifugación. El lavado del pellet se repitió dos veces, y finalmente se secó a

temperatura ambiente por 15 minutos (Macrina y col., 1980).

4.3.1 Extracción y observación de plásmidos crípticos en geles de agarosa al 0,7% p/v.

La separación y observación de los plásmidos se realizo según especificaciones

de Ausubel y col., (2002) por electroforesis en geles de agarosa al 0,7% con bromuro

de etidio EthBr (hasta una concentración final de 0,5µg/mL) en una cámara horizontal

sumergida a 50 voltios durante 7-8 horas. El ADN fue visualizado en un transiluminador

UVP, Chromato-Vue. El tamaño de los plásmidos se determinó utilizando el programa

computacional ORIGIN versión 6.0 para Windows, basado en la migración de las

bandas de ADN de las muestras en estudio, en comparación con las bandas del

marcador de peso molecular (PM) λ Hindlll, relacionando de esta manera el PM con la

movilidad de cada banda en el gel de agarosa (Mujica y col., 2007).

4.4 Análisis estadístico

Se realizaron cálculos porcentuales para determinar la cantidad de cepas

aisladas de cada queso, las bacterias resistentes por cada antibiótico ensayado, así

como el número de antibióticos a los que es resistente cada cepa. También se



44

correlacionaron los aislados de cada queso con los fenotipos de resistencia a

antibióticos, multiresistencia, resistencia a meticilina, producción de β- lactamasa con

los plásmidos presentes en las cepas. Para estas pruebas se aplicó la prueba de

correlación de Pearson con un valor de p>0,05.

Para el cálculo de los tamaños aproximados de las bandas plasmídicas de las

cepas de S. aureus estudiadas se utilizó la aplicación Origin Lab, Origin Pro 7,5 para

Windows (Mujica y col., 2007). Para estos análisis se utilizaron los paquetes

estadísticos Statistic for Windows versión 4,1 (Mujica y col., 2007).



45

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1 Aislamiento de S. aureus en quesos artesanales e industriales.

En primera instancia se pudo demostrar la presencia de 25 cepas de S. aureus en

6 muestras de quesos (22cepas de queso costeño blando y 3 de queso costeño

semiduro) (50%) de las 12 estudiadas, con un promedio de 1,5x105 UFC/g y un rango

entre <100 y 5,0x106 UFC/g (Tabla 6). El 41,80 % de las muestras estuvo por encima

de 103 y el 8,20% de las muestras sobre 105.

Tabla 6. Valores promedios y rango de Staphylococcus aureus en quesos

Microorganismo Promedio Promedio mínimo Promedio máximo

S. aureus ( UFC/g) 1,5x105 <100 5,0x106

Los resultados obtenidos de las 12 muestras de quesos analizadas para

determinar S. aureus sobrepasan el valor promedio máximo permitido (tabla 6)

(COVENIN 902-87, 1987; COVENIN 1538-92,1992; Diaz y col., 2001), de esta manera

se afirma que el alto recuento de este microorganismo determina las malas practicas

higiénicas en la manipulación, venta y distribución del producto, es decir, de los

quesos. Esto contrasta con los resultados obtenidos en Mérida –Venezuela donde se

encontró que en el 65% de 72 muestras de queso blanco procesados, se determinó la

presencia de S. aureus, confirmando en dicho estudio que es debido a la transferencia

de los portadores sanos durante el procedimiento o manipulación del queso; ademas al

propio proceso de elaboración de los derivados lacteos, su distribución,

almacenamiento y trasporte en malas condiciones de refrigeración que puede

asociarse como factores de riesgos en brotes e intoxicaciones futuras.(Rivero y

González, 2001).



46

Los resultados obtenidos durante esta investigación, suponen la presencia de una

virtual situación latente de brotes por intoxicación con estafilocócos, debido al consumo

de los diferentes quesos que han sido objeto de estudio, encontrándose que el 41,80 %

de las muestras contenían cargas bacterianas iguales o superiores a 103 UFC/g, siendo

este valor considerado como crítico en este tipo de producto (COVENIN 902-87, 1987,

COVENIN 1538-92,1992;).

Se observó que los quesos con mayor frecuencia de aislados de S. aureus fueron

quesos costeños blandos (88%), seguidos por los quesos semiduros (12%), ambos de

origen (artesanal), los cuales son de alto consumo en Valledupar –Colombia(Gráfico 1).

En los quesos costeños duros y procesados hubo ausencia de cepas S. aureus.

En las investigaciónes realizadas en la region zuliana por Rivera (2005), se

reportó que el mayor porcentaje de aislados de S. aureus se obtuvo a partir de los

quesos semiduros (20%, Artesanal), y en la efectuada por Fuentes (2008) a partir de

los quesos palmitas se encontraron valores similares a este trabajo (46%, Artesanal),

obteniendose que los mayores porcentajes de aislamientos se obtuvieron a partir de

quesos artesanales.

Gráfico 1. Porcentaje de cepas de Staphylococcus aureus en quesos:

CB

CSd CD

QI

12 %

88 %



47

CD: costeño duro; CB: costeño blando; C Sd: costeño semiduro; QI: industrial semidescremado

Tabla 7-.

Nomenclatura y procedencia de las cepas de S. aureus aisladas de quesos.

Cepas Tipo de Queso muestreado

Origen de Manufactura

2QB3DB2 Blando Artesanal


4QB4DA1 Blando Artesanal

5QB4BB2 Blando Artesanal









14QB2BA2 Blando Artesanal










24QSd1AA3 Semiduro Artesanal



CD: costeño duro; CB: costeño blando; C Sd: costeño semiduro; QI: industrial semidescremado



48

La presencia de estafilococos en los alimentos generalmente se debe a la

contaminación directa por manipuladores colonizados. El problema se presenta durante

la manipulación de alimentos ya procesados o cocidos, en los que la flora competitiva

está inhibida o fue eliminada favoreciendo la proliferación de S. aureus (Sandel y

McKillip, 2004).

La presencia de S. aureus en los quesos es evidente, ya que el queso fresco es el

alimento más vulnerable. El calentamiento o tratamiento suave de la leche y otros

productos se ha considerado esencial para la erradicación de enfermedades

infecciosas. Esta práctica preventiva no está generalizada en la producción de quesos.

La pasteurización de la leche se ha convertido, con el paso del tiempo, en esencial

como tratamiento previo a cualquier otro de conservación. Su aplicación se ha

generalizado no sólo a la leche como producto de consumo sino también a la mayoría

de lácteos o derivados (Jiménez y col., 2006).

Sin embargo, la norma no se cumple en todos los casos, en la actualidad se

conserva una preferencia al empleo de leches crudas para la elaborar los quesos. La

razón de esto es que con la pasteurización se desnaturalizan las proteínas endógenas

de la leche y promueve la eliminación de microorganismos propios del área geográfica

indispensables para la maduración y la diferenciación de colores propios de las

diferentes variedades de queso (González, 2002).

Durante el manipuleo, las manos aportan bacterias a la leche. Por ello, resulta

sumamente importante lavar cuidadosamente las manos y las superficies con agua

limpia. Las mejoras en las prácticas sanitarias durante la manipulación y el

procesamiento tradicional de la leche, en especial para la elaboración del queso,

pueden no ser bien recibidas debido a las creencias culturales o, simplemente, a la

falta de tiempo (Pinzón, 2004).

Debe tenerse presente que la leche es un producto biológico obtenido de

animales y, por lo tanto, plantea problemas de origen en su contaminación ya que a la

salida de la glándula mamaria este producto trae presentes microorganismos, por tal



49

razón resulta de vital importancia las buenas prácticas de manejo en cada uno de sus

procesos (Pinzón, 2004).

Si bien son incuestionables las cualidades nutritivas de la leche y los productos

lácteos, no es menos cierto que, desde su síntesis en la glándula mamaria hasta su

llegada al consumidor, estas cualidades están sometidas a un gran número de riesgos

que hacen peligrar la calidad original. Estos riesgos son: la contaminación y

multiplicación de microorganismos, contaminación con gérmenes patógenos, alteración

físico-química de sus componentes, absorción de olores extraños, generación de malos

sabores y contaminación con sustancias químicas tales como pesticidas, antibióticos,

metales, detergentes, desinfectantes, partículas de suciedad, etc. Todos éstos, ya sean

en forma aislada o en conjunto, conspiran en forma negativa sobre la calidad higiénica

y nutricional del producto y, consecuentemente, conspiran en contra de la salud pública

(Pinzón, 2004).

5.2 Caracterización e identificación bioquímica de cepas de S. aureus

Las veinticinco (25) cepas seleccionadas (22 cepas procedentes de queso

blando y 3 de quesos semiduros) para la realización de este estudio fueron

caracterizadas como S. aureus (Tabla 7), por ser: Reductoras de Telurito; productoras

de las enzimas: lecitinasa, proteasas (en medio Baird-Parker Agar), catalasa,

coagulasa, y DNasa. Adicionalmente resultaron of-glucosa fermentativo y manitol;

Reacción positiva de Voges-Poskauer por su capacidad de desarrollar un color rojo-

fucsia indicando la presencia de diacetilo, producto de la oxidación de la acetoína .

(COVENIN 1292-89, 1989; Mac Faddin, 2000; Bennet y Lancette, 2001).

En esta investigación, previa confirmación con la prueba de la coagulasa y realización

de la prueba de DNAsa, Staphylococcus aureus estuvo presente en los quesos

analizados según la Norma Venezolana COVENIN 1292-89; esto se ajusta al criterio

microbiológico utilizado que establece la presencia de estafilococos coagulasa positiva,

si los recuentos se encuentran en el limite máximo o por encima de 103 UFC/g, en vista



50

de que son productores de toxina estafilocócica. La contaminación bacteriana por

especies del género Staphylococcus en queso elaborado artesanalmente se ve

favorecida por el uso de las manos en la elaboración del producto. Generalmente,

estos microorganismos se eliminan durante la cocción y su presencia en el producto

terminado obedece a contaminación post-elaboración. La inocuidad de estos quesos no

se enuncia con una sola determinación microbiológica, el perfil higiénico-sanitario debe

evaluarse conjuntamente con los demás resultados.

5.3 Fenotipos de susceptibilidad a los antibióticos en los aislados de S. aureus

Se determinaron 4 patrones diferentes de resistencia en las cepas de S. aureus

aisladas de los quesos, PR-TER-EI y CR siendo el patron TER común para cinco cepas

en cada caso,en el resto de los patrones no se observó similitud (Tabla 8).

El 20% de las cepas de S. aureus estudiadas presentaron resistencia

(intermedia y completa) a un (1 antibiótico) y el 4% a 3 antibióticos (Gráfico 2). No se

observó multiresistencia a antibióticos en este trabajo (resistencia a 5 ó mas

antibioticos de grupos diferentes). Estos resultados difieren con los obtenidos por

Rivera (2005), Morales y Ruíz (2006 ), Mujica y col (2007) y Fuentes (2008), en

aislados de alimentos, quienes mostraron patrones de resistencia a antibioticos

variables.

Gráfico 2. Porcentaje de susceptibilidad a antibióticos en cepas de S. aureus

Sensibles

1 3

Antibiótico antibióticos

20%

1 3

4% 76%



51

Tabla 8. Patrón de resistencia y producción de β lactamasa en cepas de S aureus

aisladas de quesos

CEPAS PATRÓN DE

RESISTENCIA

DETERMINACIÓN DE β

LACTAMASA

2QB3DB2 -3QB3DB1

6QB4DB1-8QB3DA2

9QB3DA1-10QB2DA2

11QB2DA1-12QB2DB2

13QB2BB1-14QB2BA2

15QB2BB2-16QB1DB1

17QB1DB2-18QB1DB3

19QB1BB2-20QB1BA2

22QB2BA1-23QB1BB1

25QSd1AA2

Sensibles a todos los

antibióticos probados

NA

4QB4DA1-5QB4BB2

7QB2DB1-24QSd1AA3

TER NA

21QB1BA1 PRTEREI +

26QSd1AA1

CR NA

P: Penicilina; TE: Tetracilina; E: Eritromicina; C: Cloranfenicol; R. Resistencia, I. Resistencia Intermedia. NA:No aplica



52

Las cepas resistentes provienen de los quesos blandos y semiduros de origen

artesanal. En cuanto a la resistencia por cada antibiótico, se puede observar que el 4 %

de las cepas resultaron con un fenotipo de resistencia frente a la Penic ilina G (gráfico

3), este bajo número de cepas resistentes puede ser debido a que en Valledupar la

medicina veterinaria tiene como principal opción para el tratamiento de la mastitis

bovina la Eritromicina y Tetraciclina ((Ruiz, y col.,2001), estos resultados son diferentes

a los reportados por Rivera (2005), Morales y Ruiz (2006) y fuentes (2008).

La determinación de la producción β-lactamasas se le realizó a una cepa que

resultó resistente a la penicilina la cual resultó positiva para la prueba (Tabla 9). Estos

resultados son semejantes a los conseguidos por Rivera (2005) quien reportó cepas

productoras de β-lactamasa en aislados derivados a partir de muestras de quesos,

empleando el método acidimétrico y Fuentes (2008) que obtuvo 7 cepas productoras

de β-lactamasa en aislados de muestras de quesos y cremas de leche utilizando el

método de la cefalosporina cromogénica (nitrocefina, Difco).

P

TE

C

Gráfico 3. Porcentaje de Cepas de Staphylococcus aureus Resistentes a los

antibióticos ensayados P: Penicilina; TE: Tetracilina; C: Cloranfenicol

El porcentaje de cepas de S. aureus resistentes a la Penicilina se obtuvo a partir

del queso blando artesanal, también es muy frecuente los aislados de S. aureus

resistentes a la Penicilina a partir de muestras clinicas en la región Zuliana, como lo

muestran los reportes de Alvarez y col. (2001, 2002), Atencio y col. (2005) y Vivas

(2006) esto indica la presencia de la contaminación humana durante la preparación del

mismo.

4% 4%

19%



53

Con la finalidad de corroborar el fenotipo de resistencia a la Penicilina se

procedió a determinar la CIM a este antibiótico a la cepa 21QB1BA1. Este resultado

también permitirá seleccionar, en futuras investigaciones, aquella concentración del

antibiótico ideal para la inducción de la replicación de los plásmidos involucrados en

dicha resistencia. La concentración mínima obtenida fue de 32 g/mL, catalogándose

dicha cepa como resistente a la penicilina (Tabla 9). El mecanismo de resistencia

utilizado por esta cepa para alcanzar dicho fenotipo es la produccion de β-lactamasa,

enzima detectada en este trabajo mediante tiras de nitrocefina (Tabla 9). Estos

resultados se pueden comparar con los reportes hechos por Rivera (2005), Morales y

Ruiz (2006) y Fuentes (2008).

La resistencia a la penicilina G y ampicilina es de interés epidemiológico ya que

puede indicar un uso indiscriminado de este grupo farmacológico de antibióticos en las

explotaciones lecheras. Además es importante mencionar que en los últimos años se

ha reportado un aumento en el mundo de cepas de Staphylococcus aureus meticilina-

resistentes. Lo que debe hacer tomar conciencia que ante un aislamiento de

Staphylococcus aureus es importante establecer su susceptibilidad a antibióticos para

hacer un control racional y evitar que se desarrollen cepas multiresistentes que podrían

llegar a ser muy difíciles de erradicar (Ruiz, y col.,2001).

Se observó un 19% de cepas resistentes a la Tetraciclina (Gráfico 3). Este

porcentaje se asemeja a los reportados en Venezuela en muestras de queso por

Rivera, 2005 un 12% y Fuentes, 2008 con un 11%, del mismo modo, los resultados

aquí obtenidos concuerdan con los porcentajes de resistencia a Tetraciclinas en S.

aureus aislados de mastitis en bovinos en Noruega, Dinamarca, Suecia, Finlandia,

Suiza, Estados Unidos e Inglaterra (Vintov y col., 2003) de 10 al 12%.

Sólo se observó resistencia intermedia a la Eritromicina en un 4% de las cepas de

S. aureus estudiadas. El mismo porcentaje pero de cepas resistentes se obtuvo ante el



54

Cloranfenicol (Gráfico 3), este reporte es similar al obtenido en Venezuela en aislados

de quesos por Rivera (2005) quien obtuvo un 76% y en cremas de leche por Fuentes

(2008) con un 14%. También es semejante al de Kenia en aislados de leche cruda y

carnes (Ombui y col.,(2000) con un 60%, y diferentes a los logrados en Ohio-EUA en

ubre de vacunos (Schultz y col., 2004).

Éstos resultados se relacionan a los reportados con los estudios de S. aureus de

ambiente clínico Colombiano (Vanegas y col., 2009), los cuales señalan que el

Staphylococcus aureus presentó el más alto nivel de sensibilidad al Trimetoprim–

sulfametoxazol, la Cefalexina, Ciprofloxacina. En Colombia el Trimetoprim-

sulfametoxazol continua siendo una excelente elección para el tratamiento de pacientes

con cuadro clínico compatible o confirmado de infección por Staphylococcus aureus

(Vanegas y col., 2009).

En Venezuela en el ámbito clínico zuliano reportaron datos similares (Pineda y

col., 2001; Álvarez y col., 2001; Atencio y col., 2005), estos últimos señalan que todas

las muestras fueron sensibles a Trimetoprim-sulfametoxazol e Imipenem.

Los reportes de S. aureus resistentes en Medicina Veterinaria, son frecuentes y

se han detectado en mastitis bovina. El tratamiento de la mastitis bovina con

antibióticos, es una práctica que debe hacerse con criterios profesionales debido a que

son muchos los factores que intervienen no sólo para una eficiente terapéutica, s ino

también para la prevención en la generación de resistencia bacterial y la presencia de

residuos de antibióticos en leche; problemas que competen no sólo a la salud animal

sino también a la salud humana. Por tales motivos el desarrollo de un programa de

control efectivo requiere un extenso conocimiento de la epidemiología de la mastitis

bovina, incluyendo la evaluación de la susceptibilidad a los antibióticos de los

microorganismos aislados de la glándula mamaria, así como programas de prevención

(Calderon, 2002).



55

5.4 Determinación de cepas Staphylococcus aureus Meticilina Resistentes (SAMR)

mediante la técnica Oxacilina Screening plate.

Las cepas de S. aureus aisladas en los quesos estudiados, fueron en un 100%

sensibles a Oxacilina por lo cual no se realizó la prueba Oxacilina Screening plate. La

presencia de cepas de S. aureus con resistencia a la Oxacilina, ya han sido reportados.

Rivera, 2005 obtuvo dos (2) cepas resistentes a oxacilina en muestras de quesos

artesanales y fuentes, 2008 reportó dos cepas; en queso artesanal y en crema de

leche.

Es importante ser vigilantes, en vista que actualmente existe preocupación

mundial acerca de la diseminación de cepas de SAMR (Mendoza y col., 2003; Hsueh y

col., 2004). Esta alarma de salud pública se debe a que su erradicación no es nada

fácil, por su amplia capacidad de multiresistencia a antimicrobianos. Inicialmente se

creía que éstas estaban confinadas a ambientes intrahospitalarios, pero hoy día se

sabe que no se limita a éstos y cada vez se incrementan en ambientes comunitarios y

en otros casos han estado asociadas a enfermedades de origen alimenticio y a

manipuladores de alimentos (Morales y Ruiz, 2006).

5.5 Perfiles de DNA Plasmídico en cepas de S. aureus

Es significativo mencionar que este es el primer trabajo realizado en Colombia

donde se estudia la presencia de plásmidos provenientes de cepas de S. aureus

aisladas de alimentos, ya que la mayoría de los trabajos se abocan a estudiar la

presencia de este microorganismo en hospitales y en la comunidad, determinando solo

los patrones de susptibilidad a antibióticos en dichas bacterias (Londoño y col., 2006;

Tibavizco y col., 2007). Por lo que se considera un estudio pionero dentro del área de la

genética microbiana de alimentos, aportando datos preliminares significativos de gran

utilidad para otros investigadores orientados en esta área. Por esta razón se



56

recomiendan estudios que permitan caracterizar la función de los plásmidos en los S

aureus aislados de muestras de quesos.

En relación a la determinacion del perfil de bandas plasmídicas de las 25 cepas

de S. aureus estudiadas, se puede mencionar que el 56% (14 cepas) mostró bandas de

DNA plasmídico, cuyos tamaños oscilaron entre los 23 kb y los 2kb (Tabla 10, Figuras

2 y 3). Estos tamaños coinciden con los reportados por Novick, 1990 en su clasificacion

de los plásmidos en Staphylococcus y por Udo y col., 2006 y Tenover y col., 2006.

Las cepas de S. aureus mostraron entre 1 y 3 bandas de DNA plasmídico, donde

el 48% (12 cepas) mostró sólo una banda, la cual fue de 23 kb encontrándose en el

44% (11 cepas) de las aislados. Sólo en el 4% (1 cepas) la banda manifestada fue de 2

kb. Por otro lado, en el 8% (2 cepas) se obtuvo tres bandas de DNA plasmídico cuyos

tamaños fueron de 23 kb, 2,3-2,1 kb y 2 kb aproximadamante (Tabla 10, figuras 2 y 3).

Estos resultados son similares a los obtenidos por Rivera , 2005 y Fuentes, 2008, en

ambos estudios se obtuvieron cepas que presentaban bandas plasmídicas

aproximadamente de 23kb acompañada de una banda de 2.1kb. De igual forma estos

trabajos presentaron cepas con una, y tres bandas plásmidicas; sin embargo estos

difieren con el presente estudio en que obtuvieron cepas multirresistentes.

Con respecto a la presencia de las bandas plasmídicas y el perfil de resistencia

encontrado en los aislados estudiados, se observa que el 20% de los aislados (5

cepas: QB4DA1, QSd1AA1, QSd1AA3, QB2DB1, QB2BA1)) con alguna resistencia mostró por lo

menos una banda de DNA plasmídico (Tabla 10, Figuras 2 y 3).

De las cepas de S. aureus que mostraron sólo resistencia a la Tetraciclina, el 8%

(2 cepas: QSd1AA3, QB4DA1) reveló una banda única de 23 kb. Mientras que una cepa:

QB4BB2 (4%) no mostró bandas de DNA plasmídico, y en la cepa: QB2DB1 (4%) se

observó sólo la banda de 2 kb . La resistencia a TE se debe a la metilación ARN

ribosomal de la subunidad 50s y la presencia de estaas bandas puede debrse a la



57

presencia de plasmídos que le confieran resistencia a la bacteria. Con respecto a la

cepa(QSd1AA1)que mostró resistencia al Cloranfenicol, se encontró que sólo contenía

también una banda de 23 kb (Tabla 10, Figuras 2 y 3).

La única cepa, en que se manifestó resistencia a 3 tres antibioticos tuvo

presencia de una banda de 23 kb. (la cepa: QB2BA1); en la que se logró observar la

presencia de tres bandas de DNA plasmídico (2 cepas: QB2BB1, QB2DA1) no mostraron

resistencia a ninguno de los antibióticos probados (Tabla 10, Figuras 2 y 3).

Como se observa en la Tabla 10 y en las Figuras 2 y 3, no hay coincidencia

entre la presencia de las bandas de DNA plasmídico y el perfil de resistencia

encontrado. Aunque no se demostró durante este estudio que estos elementos

extracromosomales estén involucrados con la resistencia a los antimicrobianos, no se

descarta esta posibilidad, ya que la resistencia para muchos de los antibacterianos

ensayados, se hayan codificadas a nivel plasmídico. La presencia de bandas

plasmídicas en la mayoría de los aislados, permite presumir alguna diseminación de

genes de resistencia en este grupo bacteriano no patógeno (Stuart, 2000).

Los datos obtenidos en esta investigacion no permiten dilucidar la ubicación

genética de los marcadores de resistencia a antibióticos, ni los posibles fenotipos

codificados en dichas bandas de DNA, por tal razon deberán aplicarse otras

metodologías que permitan su estudio adecuado, profundizando el conocimiento del

genotipo de las bacterias autoctonas de la región de Valledupar.

Sin embargo el fenómeno biológico de la resistencia puede depender de la

aparición y conservación de los genes de resistencia, como elementos génicos

cromosómicos y extracromosómico. En pocas palabras es la modificación en el

genoma lo que determina la aparición de dichos genes; estos cambios se clasifican en

microevolutivos y macroevolutivos. Los primeros son el resultado de mutaciones únicas

que comprometen nucleótidos pareados, mientras las macroevolutivas afectan

segmentos de ADN. Los plásmidos y transposones son elementos genéticos móviles



58

donde se transportan los genes de resistencia. Los plásmidos son fragmentos de DNA

bacteriano con longitud variable, algunos con capacidad para replicarse independiente

de la maquinaria genética que dispone la célula, lo que les da el apelativo de

conjugativos y no conjugativos según esta capacidad. Por otro lado los transposones

son secuencias de DNA (doble cadena) que pueden ser traslocados entre cromosomas

o de un cromosoma a un plásmido o entre plásmidos, gracias a un sistema de

recombinación propio; esto sumado a la capacidad de los plásmidos de trasladarse de

una célula a otra, durante la conjugación, permite la adquisición de genes de

resistencia entre bacterias de la misma especie o especies distintas lo que facilita la

expansión epidémica de la resistencia (Burke, 2000).

Estudios realizados en aislados de S. aureus provenientes de quesos en la

región Zuliana, se obtuvo que las bandas plasmídicas aisladas estaban relacionadas

con resistencia a a Penicilina y Eritromicina (Rivera, 2005) y (Fuentes, 2006).

Igualmente col y Udo. De 2006, señala que en aislados de Staphylococcus

aureus esistentes a la meticilina provenientes de Infecciones en hospitales y de la

comunidad con resistencia a eritromicina, tetraciclina, trimetoprim, ácido fusídico,

ciprofloxacina, cloranfenicol, rifampicina, mupirocina, acetato de cadmio, cloruro de

mercurio, propamidina isetionato y el bromuro de etidio pero susceptibles a

vancomicina, teicoplanina y linezolid, contenían plásmidos de 1,9, 2,8, 3,0, 4,4, 27 y 38

kb. Donde el plásmido de 38 kb transportaba la información genética para la resistencia

a altos niveles de mupirocina, así como resistencia a a cloranfenicol relacionada con la

presencia de las bandas plasmídicas de 2.8 –4.4 kb, y la resistencia a la eritromicina

con las bandas de 2.8–3.0 kb. Por último, Tenover y col., 2006 señalan que en el

análisis de los plásmidos provenientes de las cepas de Staphylococcus aureus aisladas

de pacientes se observa una banda de DNA de 4,3kb relacionada con la resistencia a

la Tetraciclina.

La determinación de los perfiles plasmídicos en cepas de S. aureus provenientes

de alimentos, es de importancia biológica, clínica y comunitaria, toda vez que estos



59

elementos genéticos son fuente de diseminación de múltiples genes de resistencia. Los

datos obtenidos coinciden con los reportados en cepas de S. aureus de aisladas de

muestras clínicas y de alimentos (Álvarez y col., 2002; Atencio y col., 2005, Rivera

2005, Lu y col., 2005; Atencio y col., 2008, Fuentes, 2008).

Figura 2. Bandas plasmídica observadas en las cepas 1: QB3DB2 , 2: QB3DB1, 3: QB4DA1, 6: QB2DB1,

8: QB3DA1, 9: QB2DA2, 10: QB2DA1, 11: QB2DB2, 12: QB2BB1, 18: QB1BB2, 19: QB1BA2. M: λ Hind III.

Figura 3. Bandas plasmídica observadas en las cepas 21: QB2BA1,, 23: QSd1AA3,

25: QSd1AA1

23 kb

2,3 kb

2,1 kb 2 kb

23kb



60

Tabla 9. Perfiles plasmídicos en las cepas de S. aureus aisladas de quesos .

Cepas

Perfiles plasmídicos aprox. Perfil de resistencia

QB3DB2 23 kb -

QB3DB1 23 kb -

QB4DA1 23 kb TER

QB4BB2 - TER

QB4DB1 - -

QB2DB1 2 kb TER

QB3DA2 - -

QB3DA1 23 kb -

QB2DA2 23 kb -

QB2DA1 23 kb, 2,3kb y 2 kb -

QB2DB2 23 kb -

QB2BB1 23 kb, 2,1kb y 2 kb -

QB2BA2 - -

QB2BB2 - -

QB1DB1 - -

QB1DB2 - -

QB1DB3 - -

QB1BB2 23 kb -

QB1BA2 23 kb -

QB1BA1 - -

QB2BA1 23 kb PRTEREI

QB1BB1 - -

QSd1AA3 23 kb TER

QSd1AA2 - -

QSd1AA1 23 kb CR

P: Penicilina; TE: Tetracilina; E: Eritromicina; C: Cloranfenicol; R. Resistencia, I.

Resistencia Intermedia.



61

6. CONCLUSIONES

1. Se detectó la presencia de Staphylococcus aureus, en los quesos artesanales

de alto consumo en la Ciudad de Valledupar; los cuales estuvieron por encima de los

límites permisibles, donde se evidencia la insuficiente calidad en estos alimentos.

2. Las cepas de Staphylococcus aureus estudiadas solo mostraron resistencia a

los antibióticos Tetraciclina, Cloranfenicol, Penicilina, y Eritromicina, indicando la baja

resistencia a estos fármacos en los aislados provenientes de quesos de alto consumo

en Valledupar.

3. No se manifestó multiresistencia a los antibióticos en las cepas de S. aureus,

siendo la resistencia a Tetraciclina el resultado común en cinco de las cepas

estudiadas.

4. Todas las cepas fueron sensibles a Oxacilina, Gentamicina, Ciproxacilina,

Cefoxitin, Clindamicina, Trimetoprim-sulfa, Vancomicina, Rifampicina e Imipenen, lo

que señala que pueden ser buenos fármacos para el control de brotes epidémicos de

S. aureus por intoxicaciones alimentarias en la Ciudad de Valledupar.

5. La cepa(QB2BA1) de S. aureus resistente a Penicilina (QB2BA1) fue capaz de

producir β-lactamasa expresando esta capacidad como mecanismo de resistencia a

este β-lactámico.

6. No se encontró cepas de SARM, esto es de gran importancia porque

eventualmente se podrian controlar los potenciales brotes de esta bacteria con el uso

racional de este tipo de antibiótico en la región estudiada.

7. Se encontraron bandas plasmídicas en los aislados de S. aureus provenientes

de queso, oscilando sus tamaños entre 23 y 2 kb.

8. No se encontró coincidencia entre la presencia de las bandas de DNA

plasmidico y el perfil de resistencia a antibióticos observado en los aislados de S.

aureus provenientes de quesos de alto consumo en la Ciudad de Valledupar.



62

7. RECOMENDACIONES

1. Se recomienda realizar estudios de Genética microbiana, y Biología

molecular (enzimas de restricción, PCR) con la finalidad de profundizar sobre la

presencia y ubicación de genes de resistencia a antibióticos en los aislados de S.

aureus provenientes de quesos de alto consumo en la Ciudad de Valledupar.

2. Se recomienda a la secretaria de salud de la ciudad realizar vigilancia

continua a todos los sitios donde se comercialicen quesos, con el fin de prevenir

enfermedades transmitidas por estos y asegurar el bienestar de los consumidores.

3. Instruir en forma permanente a los manipuladores involucrados en la

producción de alimentos y a los consumidores, en buenas prácticas de

manufactura como estrategia fundamental para prevenir brotes de enfermedades

transmitidas por alimentos por este microorganismo.

4. Sensibilizar a la comunidad médica sobre el uso correcto de los

antibióticos, con el fin de evitar la transmisión de microorganismos con resistencia a

estos fármacos.



63

8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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http://www.biologianaweb/biomural/divulga/staph/socorro1.html



74

ANEXOS



75

ANEXO 1

Régimen para preparar la dilución antimicrobiana

Agentes microbianos que se emplearán en la dilución en agar para pruebas de susceptibilidad

Nota: Este cuadro es modificado por Ericsson, HM., Sherris, JC. Pruebas de sensibilidad a antibióticos.

Informe de estudio y de colaboración internacional. Acta de fotográfica de escaneo microbiológico. 1971;

217 (B Suppl): 1-98 (CLSI 2008).

Solución

antimicrobiana

pasos concentración

(ug/mL)

Fuente Volumen

(mL)

Diluyente

(mL)

Concentración

Intermedia

(ug/mL)

Concentración

Final

At 1:10 dilución

en agar(ug/mL)

Log2

5120 Valor - - 5120 512 9

1 5120 Valor 2 2 2560 256 8

2 5120 Valor 1 3 1280 128 7

3 5120 Valor 1 7 640 64 6

4 640 Paso 3 2 2 320 32 5

5 640 Paso 3 1 3 160 16 4

6 640 Paso 3 1 7 80 8 3

7 80 Paso 6 2 2 40 4 2

8 80 Paso 6 1 3 20 2 1

9 80 Paso 6 1 7 10 1 0

10 10 Paso 9 2 2 5 0.5 -1

11 10 Paso 9 1 3 2.5 0.25 -2

12 10 Paso 9 1 7 1.25 0125 -3



76

Laboratorio de Genética y Biología Molecular

Universidad del Zulia

Facultad Experimental de Ciencias 2010

repÚblica bolivariana de venezuela...

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