Introdução Geral

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INTRODUÇÃO GERAL

Introdução Geral

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1. INTRODUÇÃO GERAL

O sistema ósseo desempenha diversas funções além da proteção de órgãos internos e

sustentação do corpo, apresentando bioquímica e metabolismo bastante complexos. O

colágeno, além de outras proteínas não-colagenosas e células, constituem a porção orgânica

do osso; os minerais cálcio, fósforo, magnésio e flúor perfazem cerca de 65% do peso do

osso e constituem a porção inorgânica do tecido ósseo (FARFÁN, 1994).

O osso é um órgão metabolicamente ativo que sofre um processo contínuo de

remodelação, caracterizado por formação e reabsorção óssea. Em condições normais a taxa

de reabsorção é semelhante à taxa de formação óssea. O balanço entre estes dois processos

é regulado por meio da ação de hormônios (estrogênio, vitamina D e hormônios esteróides)

e mediadores locais (como por exemplo, as citocinas). A idade, gênero, presença de

doenças metabólicas, consumo de alguns medicamentos, entre muitos outros, são fatores

que podem causar um desbalanço no processo de remodelação óssea, resultando em

alterações na estrutura, resistência e massa óssea (SEIBEL, 2005).

A redução da massa óssea é um fenômeno fisiológico natural e não patológico, mas se

constitui no substrato para o desenvolvimento da osteoporose. A osteoporose e a osteopenia

são diferentes estágios de doença do sistema ósseo que resultam maior fragilidade do osso e

consequente aumento da susceptibilidade à fraturas (WHO, 2003). Na mulher

menopausada, a perda óssea está associada à redução nos níveis do hormônio estrógeno, o

qual age sobre receptores localizados nas células ósseas.

No Brasil e no mundo, a incidência de osteopenia e osteoporose vêm aumentando,

acompanhando a maior expectativa de vida populacional.

Introdução Geral

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A alimentação e em particular alguns nutrientes como os minerais cálcio e magnésio,

possuem estreita relação com a saúde óssea. Recentemente, porém, hidrolisados protéicos

têm sido utilizados com finalidades clínica e nutricional, como também para melhoria de

propriedades funcionais de proteínas e alimentos de base protéica (PACHECO, 2005).

O colágeno é a principal proteína dos ossos sendo que as fibras de colágeno ainda são

parcialmente responsáveis pelas propriedades biomecânicas do osso e também, por dar

suporte aos músculos e à pele. Os hidrolisados enzimáticos de colágeno (HC) são produtos

obtidos industrialmente a partir da hidrólise da gelatina e têm recebido atenção pelas suas

possíveis propriedades no tratamento de doenças osteoarticulares (OASSER, 1999).

Introdução Geral

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1.1. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

FARFÁN, J.A. Fatores nutricionais que influem na formação e manutenção do osso. Rev. Nutrição Puccamp. Campinas, v. 7, n. 2, p. 148-172, jul./dez. 1994.

OESSER, S. et al. Oral administration of 14C-labeled gelatin hydrolysate leads to an accumulation of radioactivity in cartilage of mice (C57/BL). Journal of Nutrition . Eberbach, v. 129, p. 1891-95, mar. 1999.

PACHECO, M.T.B. et al. Propriedades funcionais de hidrolisados obtidos a partir de concentrados protéicos de soro de leite. Ciênc. Tecnol. Aliment. Campinas, v. 25, n. 2, p. 333-8, abr./jun. 2005.

SEIBEL, M.J. Biochemical markers of bone turnover part I: Biochemistry and variability. Clin Biochem Rev. Sydney, v. 26, p. 97-105, nov. 2005.

WHO (World Health Organization). Prevention and Management of Osteoporosis. Report of a WHO Scientific Group. WHO Technical Report Series. Geneva. 2003. 201 p.

Introdução Geral

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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. O osso

O osso é um tecido extremamente ativo e apresenta metabolismo bastante complexo

por desempenhar diversas funções no organismo como a proteção aos órgãos internos,

fornecimento de apoio estrutural e físico aos tendões e músculos, além de atuar como

reservatório de íons1,2. Consiste de uma matriz orgânica (células e matriz) e inorgânica

(minerais)3. O componente inorgânico é constituído principalmente por cristais de

hidroxiapatita (depositado inicialmente na matriz orgânica como sais de fosfato e cálcio),

além de outros minerais como o magnésio, flúor, potássio e sódio. A matriz orgânica é

composta por colágeno tipo I, que compreende cerca de 98% dessa fase, outras proteínas

não colágenas, como os proteoglicanos, osteocalcina e integrinas, e células1,4. Água e

lipídeos perfazem 5-8% da matriz óssea. Existem dois tipos celulares principais, os

osteoblastos e os osteoclastos5. Os osteoblastos são as células que sintetizam a porção

orgânica da matriz óssea responsáveis, portanto, pela formação do osso; já os osteoclastos

secretam algumas enzimas e ácidos (H+) que destroem a matriz e liberam o cálcio6.

Cerca de 80% do esqueleto é constituído de tecido cortical (ou compacto) e 20%,

tecido trabecular (ou esponjoso). Com a idade, ocorre uma redução da massa óssea, que é

diferente para o osso trabecular e cortical7. Isso ocorre, pois o tecido trabecular está mais

exposto aos fluidos circulantes, além de possuir maior número de células ósseas, sendo por

isso, mais responsivo ao estrógeno, ou à falta dele8,9. O osso

trabecular está presente principalmente nas vértebras, crânio, pélvis e epífise de ossos

longos; já o osso cortical é predominante na porção medial de ossos longos10.

Introdução Geral

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2.2. Remodelação óssea

O osso sofre de forma contínua o processo de remodelação11, que compreende na

deposição e reabsorção de material na estrutura óssea, em taxas relativamente baixas. No

caso de haver metabolismo positivo do osso, a constante de deposição (k1) estará

aumentada, com relação à constante de reabsorção (k2), resultando em deposição líquida de

componentes no estado sólido4. Sob condições normais, a quantidade de material

reabsorvido é igual à quantidade de osso formado11.

O processo de remodelação ocorre normalmente de forma localizada, em focos

chamados de unidades multicelulares básicas de remodelação2, com ciclos estimados de 8 a

12 semanas, em humanos. É por essa razão que o fornecimento adequado de nutrientes

pode ter um papel importante no processo de formação e reabsorção de massa óssea ao

longo da vida4.

O ciclo de remodelação óssea parece ser regulado por diferentes fatores, incluindo

diversas citocinas e hormônios. O primeiro estágio da remodelação envolve o recrutamento

de precursores de osteoclastos: IL-1 (interleucina-1), IL-6 (interleucina-6) e monócitos, os

quais estão presentes nos tecidos hematopoiéticos como a medula óssea, e respondem a

sinais físicos e hormonais. Estes fatores aumentam a reabsorção óssea e são regulados por

diversos hormônios, incluindo o estrogênio12.

Nas mulheres pós-menopausadas, a probabilidade de desenvolver osteoporose é

maior pelo fato de que a redução nos níveis séricos de estrógeno pode resultar em aumento

do turnover ósseo, ou seja, ocorre um aumento da atividade de remodelação óssea, com a

reabsorção excedendo a formação. Desta forma, a falta de estrógeno gera um aumento na

diferenciação e atividade osteoclástica, que resulta em redução de massa óssea4.

Introdução Geral

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A diferenciação osteoclástica é um fenômeno bastante complexo e inicia-se pela

ativação de monócitos à osteoclastos maduros. As células estromais também contribuem

para a osteoclastogênse por meio da produção de citocinas que estimulam a proliferação

e/ou diferenciação de precursores hematopoiéticos dos osteoclastos13.

Os monócitos atingem o osso através da circulação sanguínea e se diferenciam em

osteoclastos por meio da fusão com outras células14. Após aderir a matriz óssea, os

osteoclastos solubilizam os cristais de hidroxiapatita, por meio da acidificação do meio

extracelular, e degradam a matriz orgânica através de enzimas (colagenases e hidrolases),

resultando em perda óssea12, 15.

Para ocorrer a diferenciação dos osteoclastos é necessário a interação com

osteoblastos (Figura 1). Os receptores RANK e M-CSF (fator estimulador de colônia de

macrófago) presentes na membrana dos monócitos, são essenciais para a diferenciação em

osteoclastos. O M-CSF é necessário para a sobrevivência e proliferação dos precursores de

osteoclastos. O RANKL é um ligante encontrado na superfície dos osteoblastos, que se liga

ao receptor RANK dos osteoclastos estabelecendo um contato osteoblastos-osteoclastos.

Após o desacoplamento entre RANK-RANKL ocorre a maturação dos osteoclastos que,

neste momento, poderão degradar os componentes minerais e orgânicos da matriz óssea,

por meio da secreção de enzimas e ácido. Em resposta aos sinais de RANKL, a

diferenciação e atividade dos osteoclastos aumenta, e

a apoptose osteoclástica diminui, resultando em maior reabsorção óssea. As células “T” da

medula óssea também parecem ativar a reabsorção óssea, por meio de citocinas TNF-α 2,12,

14,16, 17.

Introdução Geral

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Os osteoblastos também secretam a osteoprotegerina (OPG), que pode se ligar ao

RANKL ou ao RANK, agindo como uma citocina antiosteoclastogênica. O estrógeno

aumenta a secreção de OPG, e reduz a atividade de M-CSF e RANK através da ativação de

citocinas IL-1, IL-6 e TNF-α12,16. O estrogênio é o principal hormônio associado ao

metabolismo ósseo, sendo que a redução nos níveis deste hormônio pode causar aumento

no número e atividade de osteoclastos, além de redução da apoptose osteoclástica.

Figura 1. Adaptado de RIGGS, 200012. OC: osteoclasto; OPG: osteoprotegerina.

Citocinas envolvidas na regulação da função dos osteoclastos. Fatores estimulatórios da atividade

osteoclástica estão demonstrados na cor laranja e fatores inibitórios, em azul. Efeitos positivos (+) ou

negativos (-) do estrogênio sobre os fatores regulatórios estão na cor vermelha. O círculo maior mostra que o

TNF-α e o RANKL agem sobre diferentes receptores, mas ambos ativam sinais intracelulares que irão

desencadear na diferenciação dos osteoclastos, e consequentemente na reabsorção óssea.

Introdução Geral

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2.3. Pico de massa óssea

Na infância e adolescência a formação óssea é dominante, ocorrendo aumento do

comprimento ósseo, que termina quando o pico de massa óssea é atingido, por volta das

primeiras duas ou três décadas de vida15,18. O aumento do conteúdo e da densidade mineral

óssea são as mudanças mais marcantes observadas entre os adolescentes, de ambos os

sexos19. Quanto maior a quantidade de massa óssea que se atingir até a maturidade, maior é

o pico de massa óssea e o risco de fraturas na idade adulta torna-se reduzido.

O fator genético explica aproximadamente 70% do pico de massa óssea obtido por

um indivíduo20, embora existam outros fatores que influenciam no desenvolvimento da

massa óssea. Do ponto de vista nutricional, o cálcio parece ser o nutriente mais importante

associado ao pico de massa óssea21. No entanto, diversos estudos já evidenciaram a

importância de outros nutrientes e alimentos sobre a manutenção da massa óssea, como o

potássio, magnésio, vitamina K, vitamina C, frutas, vegetais, gorduras e proteínas, além do

aporte energético9.

A prática de exercícios físicos, o status hormonal, consumo excessivo de álcool,

tabagismo, além do uso de alguns medicamentos (principalmente corticóides), também

influenciam no pico de massa óssea4. Isto explica porque mulheres menopausadas diferem

tanto nos graus de perda da massa óssea.

Indivíduos que atingem um baixo pico de massa óssea na juventude têm maior risco

de desenvolver osteoporose ao longo da vida7.

Introdução Geral

10

2.4. Perda de massa óssea

A perda de massa óssea na mulher, antes da menopausa, provavelmente é

semelhante à observada nos homens. Após os 20 anos de idade, nos homens, a reabsorção

torna-se mais predominante e o conteúdo mineral reduz em 4% por década. Já nas mulheres

menopausadas, ocorre um declínio da massa óssea de aproximadamente 15% por década18.

Isso ocorre basicamente em função do aumento do turnover ósseo, promovido pela

deficiência estrogênica, superposta à perda óssea associada à idade.

Existem algumas distinções entre a osteoporose causada pela idade, e aquela

causada pela deficiência de estrógeno. Com a idade, tanto nos homens quanto nas mulheres,

o volume de tecido ósseo é reduzido devido, principalmente, à redução no número e

atividade de osteoblastos, o que resulta na diminuição da espessura de trabéculas ósseas.

No entanto, a redução nos níveis séricos de estrógeno (que ocorre nas mulheres após a

menopausa) resulta em aumento da atividade de remodelação óssea, com a reabsorção

excedendo a formação22.

O resultado do desbalanço entre a formação e reabsorção óssea são geralmente

mudanças na estrutura, resistência e no conteúdo mineral do osso11. Assim sendo, a

deficiência de estrogênio amplifica o processo de perda óssea relativo ao envelhecimento

natural, explicando a maior incidência de fraturas nas mulheres idosas do que nos homens

da mesma idade23.

Já é bem estabelecido que o estrogênio pode regular o processo de remodelação

óssea por meio de efeitos sobre o sistema imune e células ósseas17. Já foi identificada a

presença de receptores de estrógeno nos osteoblastos 24 e em células do estroma da medula

óssea25. Desta forma, a queda dos níveis séricos de estrogênio parece induzir a um aumento

Introdução Geral

11

da secreção de fatores que estimulam a atividade osteoclástica de forma indireta (por meio

dos osteoblastos) levando a perda de massa óssea; o tratamento com este hormônio parece

inibir a estimulação destes fatores.

2.5. Osteoporose

2.5.1. Definição

A redução da massa óssea com a idade é um processo natural, não patológico, mas

se constitui no substrato para o desenvolvimento da osteoporose7. Geralmente, o tecido

ósseo na osteoporose apresenta um conteúdo mineral diferente de indivíduos saudáveis26;

além disso, o osso torna-se mais fino e frágil, mais propenso ao desenvolvimento de

fraturas16.

Segundo a Organização Mundial de Saúde, a osteoporose e a osteopenia são

estágios diferentes de doença do sistema ósseo, caracterizadas por redução da massa óssea e

deterioração da estrutura do tecido ósseo, levando a maior fragilidade do osso, com

aumento da susceptibilidade a fraturas, especialmente de quadril, coluna e punho18,27. A

osteoporose ocorre com mais frequência em populações idosas, mas pode ser resultado do

desenvolvimento inadequado do pico de massa óssea, ou à excessiva perda óssea durante a

idade adulta, devido à deficiência de estrogênio em mulheres, desnutrição ou uso de

corticosteróides18, 28.

Valendo-se da relação entre densidade mineral óssea e risco de fratura, a

Organização mundial de Saúde18 propôs a definição de osteoporose: “densidade mineral

óssea igual ou menor à 2,5 desvios-padrão da densidade mineral óssea média para mulheres

adultas saudáveis”. A osteopenia pode ser diagnosticada quando a densidade mineral óssea

Introdução Geral

12

estiver entre 1 e 2,5 desvios-padrão abaixo da média para mulheres adultas saudáveis. No

entanto, a Organização Mundial de Saúde recomenda a utilização de outros indicadores

para o monitoramento da osteoporose e da osteopenia, além da densidade mineral óssea,

como os parâmetros bioquímicos séricos e urinários. Em estudos com animais, destaca-se a

importância da realização de análises histomorfométricas do osso e resistência óssea, por

meio de ensaios biomecânicos29. A biópsia permite uma análise direta da microarquitetura

óssea, no entanto, por ser de caráter invasivo, o uso desta técnica em humanos é limitado30.

2.5.2. Epidemiologia e aspectos sócio-econômicos

No mundo inteiro a incidência de osteoporose vem aumentando consideravelmente

devido, em grande parte, ao aumento da expectativa de vida da população, que eleva o

número de idosos e de fraturas osteoporóticas31. Atualmente, estima-se que nos Estados

Unidos cerca de 25 milhões de pessoas possuem osteoporose e 1,5 milhões de indivíduos

sofram fraturas anualmente32. As fraturas de coluna vertebral são as mais comuns,

atingindo aproximadamente 700.000 indivíduos, seguidas das fraturas de quadril, que

ocorrem em cerca de 300.000 pessoas por ano16. O tratamento de fraturas por osteoporose

acarreta custos bastante altos para o serviço de saúde pública no Brasil e no mundo33.

Segundo a Organização Mundial de Saúde18, em 1990 1,7 milhões de pessoas no

mundo sofreram fraturas de quadril; devido às mudanças na pirâmide demográfica, no ano

2050 este número chegará a 6 milhões. As fraturas de quadril estão fortemente associadas à

morbidade, sendo que 50% dos pacientes tornam-se incapazes de andar sozinhos, 25%

necessitam de cuidado domiciliar por longo período de tempo e 10-20% morrem dentro de

6 meses16. No entanto, dados recentes demonstram que as fraturas de coluna vertebral são

Introdução Geral

13

grandes responsáveis por piora na qualidade de vida, que parece ser maior do que nos casos

de fratura de quadril34.

No Brasil, estudos sobre densidade óssea e prevalência de osteoporose são escassos,

embora seja a doença osteometabólica mais comum35. Adicionalmente, existem poucos

dados relacionados à utilização de recursos e custos decorrentes da osteoporose pós-

menopausa. Kowalski33, avaliando a dimensão de recursos utilizados e custos por pacientes

com osteoporose pós-menopausa, selecionados do ambulatório de doenças

osteometabólicas da Escola Paulista de Medicina (UNIFESP), concluiu que os custos

médios totais para o Sistema Público de São Paulo foram de, aproximadamente, R$

900,00/paciente/ano, e que os gastos com o tratamento da osteoporose pagos pelas

pacientes representam cerca de 11% da renda familiar mensal.

Nesse sentido, propostas de intervenções para o tratamento e prevenção da

osteoporose, que atinjam o maior número possível de pessoas e que tenham baixos custos,

devem ser implementadas.

2.5.3. Diagnóstico

A avaliação da densidade mineral óssea (DMO) é utilizada para diagnosticar

osteoporose e osteopenia. Os métodos para medir a densidade óssea dependem da absorção

de radiação pelo esqueleto e a absorciometria de Energia Dupla de Raios X (DEXA) é a

técnica de densitometria mais utilizada atualmente no mundo28.

No entanto, a utilização da densidade mineral óssea como instrumento único de

avaliação do risco de fratura não é adequada, sendo indicado utilizar outros parâmetros,

além da DMO, como a qualidade óssea e propriedades estruturais do osso36. O termo

Introdução Geral

14

“qualidade óssea” é bastante vago, mas tem sido utilizado para referir características do

osso que incluem a microarquitetura óssea, número e volume de trabéculas, espessura do

tecido cortical e composição mineral37. Essas características podem ser avaliadas por meio

da análise histomorfológica do osso e da densidade mineral óssea.

A análise histomorfométrica do osso é um instrumento fundamental para estudos

ósseos, principalmente para elucidar o mecanismo de ação de novos agentes terapêuticos

sobre o processo de remodelação óssea e para avaliar a importância de certos componentes

sobre a qualidade óssea em animais expostos a algum tipo de tratamento29.

O risco de fratura é determinado pela resistência óssea, a qual depende das

propriedades geométricas (como tipo e tamanho do osso), das atividades celulares, e das

propriedades materiais do osso, que incluem conteúdo e composição mineral, composição e

conteúdo de material na matriz, além do tamanho dos cristais de hidroxiapatita26.

Testes biomecânicos podem ser utilizados para avaliar as propriedades estruturais de

ossos provenientes de animais de pequeno ou grande porte. Os testes mais utilizados são:

flexão em três pontos, teste de compressão e teste de torção. Ainda não está claro qual

destes ensaios representa melhor o risco de fratura37.

Os ensaios biomecânicos relacionam uma carga a qual os ossos são submetidos e a

deformação apresentada pelos mesmos. O resultado pode ser graficamente demonstrado na

forma de uma curva da carga em função da deformação, e está relacionado com a rigidez

do osso, que é uma medida de resistência à força aplicada. À medida que a carga aumenta,

a carga e a deformação aumentam de maneira linear.

Através do gráfico de carga versus deformação é possível analisar algumas

propriedades mecânicas do osso, como por exemplo, a carga máxima. A carga máxima é o

Introdução Geral

15

maior valor de carga necessário para alcançar a resistência final do osso, o que provoca a

falência óssea38. No entanto, apenas a utilização da carga máxima para predizer risco de

fratura não é suficiente. Estudos com animais comprovaram que a combinação dos dados

de densidade mineral óssea e carga máxima têm boa correlação com o risco de fratura37.

Os marcadores bioquímicos do metabolismo ósseo podem refletir os processos de

formação e reabsorção óssea, auxiliando no diagnóstico e monitoramento de doenças

osteometabólicas, assim como na avaliação dos possíveis efeitos de uma intervenção5,18.

Além disso, esses marcadores têm trazido contribuições científicas importantes sobre a

fisiologia e a fisiopatologia do tecido ósseo38. Os marcadores bioquímicos do metabolismo

ósseo são diversos, entretanto o número de marcadores utilizados na prática real é bem

menor. A fosfatase alcalina óssea e/ou total, a osteocalcina e os propeptídeos do colágeno

tipo I, são os principais marcadores de formação, sendo todos medidos em soro39.

A interpretação correta dos valores dos marcadores bioquímicos requer o

conhecimento dos diversos fatores que podem interferir nos níveis dos mesmos. O horário

em que a amostra foi colhida e o tempo de meia vida podem ser responsáveis por grandes

variabilidades de resultados quando aplicados à mesma amostra40.

Os marcadores de formação óssea medem a concentração dos produtos decorrentes

da síntese osteoblástica, uma vez que a formação é dependente da ação dos osteoblastos; da

mesma maneira, os marcadores de reabsorção são resultantes da atuação do osteoclasto

sobre a matriz óssea39.

As doenças ósseas alteram o padrão de produção dos marcadores bioquímicos. Após

a menopausa, os marcadores tendem a se elevar quando comparados à idade adulta, com

um incremento maior dos marcadores de reabsorção. No entanto, na osteoporose pós-

Introdução Geral

16

menopausa é possível encontrar valores iguais, elevados ou reduzidos em relação aos

controles normais40.

A osteocalcina é considerada um marcador sensível do turnover ósseo e reflete

especificamente a atividade osteoblástica41. Representa aproximadamente 15% das

proteínas não-colágenas presentes na matriz óssea39.

Estudos recentes têm sugerido que a osteocalcina está envolvida no processo de

mineralização do osteóide (matriz óssea recém-formada). Entretanto, embora tenha sido

descoberta há mais de 20 anos, sua função ainda não foi completamente elucidada.

Pesquisas realizadas com animais transgênicos, cujo gene para osteocalcina não foi

expresso, mostram que essa proteína possui uma importante função na regulação do

turnover ósseo11,42.

Pelo fato de que a osteocalcina é incorporada pela matriz óssea, alguns estudos têm

sugerido que fragmentos dessa proteína são liberados durante o processo de reabsorção do

osso11.

A fosfatase alcalina é uma enzima localizada na membrana externa das células,

onde exerce suas atividades. A fosfatase alcalina total corresponde à soma das diversas

isoformas presentes no soro: óssea, hepática, intestinal, placentária e renal, no entanto, mais

de 90% do seu valor consiste das isoformas hepática e óssea.

A isoforma óssea da fosfatase alcalina localiza-se na membrana externa dos

osteoblastos. Embora sua função não tenha sido completamente elucidada, sabe-se que no

tecido ósseo ela possui uma importante ação sobre a mineralização e formação do

osteóide11, por meio da atuação no controle da concentração dos inibidores da

mineralização, através de um aumento dos níveis locais de íons fosfato removendo o

fosfato de outras proteínas. Estudos indicam que a atividade da fosfatase alcalina óssea é

Introdução Geral

17

proporcional à formação de colágeno, enquanto que a mineralização coincide com uma

maior produção de osteocalcina43.

2.5.4. Tratamento

As condições normais do osso não são recuperadas quando um quadro de

osteoporose já estiver instalado, no entanto, a prevenção e o diagnóstico precoce da

osteoporose são fundamentais para um tratamento mais efetivo. Estudos relatam que a

osteoporose é mais efetivamente prevenida do que tratada19. O tratamento para osteoporose

tem o objetivo de restaurar a massa óssea a um nível em que o risco de fratura seja

substancialmente reduzido38.

Os medicamentos mais utilizados atualmente para tratamento da osteoporose pós-

menopausa incluem os estrógenos44, os moduladores seletivos de receptores de estrogênios

(SERMs) e os bisfosfanatos45, que são agentes que reduzem a atividade osteoclástica.

Entretanto, existem outros medicamentos como os fluoretos, GH, e PTH44,46, que parecem

agir aumentando a deposição de matriz osteóide pelos osteoblastos. A vitamina D e o cálcio

são indicados como substâncias complementares no tratamento da osteoporose,

independente do tratamento instituído, já que ambos são essenciais para a formação de

massa óssea47.

Mesmo reduzindo a susceptibilidade a fraturas, os tratamentos para osteoporose não

são capazes de impedir sua ocorrência48.

O uso terapêutico de estrógeno após a menopausa para redução dos sintomas (ondas

de calor, irritabilidade, distúrbios de sono, dores de cabeça e irritação vaginal) e como

agente de prevenção para perda de massa óssea é bastante comum49. Jiang et al21

observaram que o tratamento com estrógeno em ratas adultas ovariectomizadas preservou a

Introdução Geral

18

densidade mineral óssea assim como as propriedades biomecânicas do osso. Shen et al44,

estudando o efeito da administração de estrógeno em ratas castradas, também encontraram

resultados semelhantes.

Estudo realizado por Hughes et al50 em camundongos sugeriu que os estrógenos

podem prevenir perda óssea pela indução de apoptose nos osteoclastos. Steeve et al51,

também observaram que o estrógeno promoveu apoptose nos osteoclastos.

Analisando os diversos estudos, o tratamento com estrógenos parece reduzir a perda

óssea tanto por meio da inibição dos fatores estimuladores de osteoclastos, como pelo

aumento da apoptose osteoclástica.

Embora a terapia hormonal com estrógenos seja amplamente utilizada por mulheres

menopausadas, e reduza o risco de fraturas, ela possui algumas restrições em função do

aumento no risco de trombose, doenças coronarianas, câncer de mama, entre outras52.

Neste contexto, observa-se a necessidade da realização de estudos que avaliem a

segurança e efetividade de tratamentos alternativos. Diversas pesquisas têm estudado o

efeito da ingestão de alguns nutrientes e alimentos funcionais, como alternativa ao

tratamento farmacológico, para prevenir ou melhorar o quadro de osteoporose, evitando

assim os efeitos colaterais dos medicamentos e os riscos da terapia de reposição

hormonal53,54. Proteínas do soro do leite, isoflavonas da soja e colágeno hidrolisado são

componentes que têm sido estudados para melhora da qualidade óssea.

2.5.5. Modelo experimental de osteoporose

A rata ovariectomizada é um modelo experimental aceito e amplamente utilizado

para simular a perda óssea em mulheres menopausadas55. Dempster et al22, avaliando as

Introdução Geral

19

mudanças acorridas no osso de ratas castradas, observaram que a ovariectomia induziu um

rápido aumento do turnover ósseo, evidenciado pelo aumento da superfície de osteoclastos,

redução do volume trabecular e número de trabéculas, concluindo que a rata

ovariectomizada pode ser usada como um modelo experimental de osteoporose e que a

perda óssea nessas ratas é induzida pela deficiência de estrógeno.

No entanto, diversos estudos com ratas ovariectomizadas mostram que a perda óssea

não é uniforme nos diferentes tipos de osso. O osso trabecular responde mais rapidamente à

queda dos níveis de estrógeno56, enquanto o tecido cortical parece não ser afetado pelo

status hormonal57. Por exemplo, a perda óssea nas vértebras é maior e mais rápida,

comparando com a diáfise de fêmures ou tíbias.

A ovariectomia resulta em perda óssea tanto nas ratas quanto nas mulheres em

função das diversas semelhanças entre os mecanismos patofisiológicos das duas espécies.

Em ambas, a perda óssea ocorre mais rapidamente após a deficiência de estrogênio e é

caracterizada pelo aumento do turnover ósseo, com a reabsorção excedendo a formação.

Nas duas espécies a perda óssea é maior no tecido trabecular que no cortical, a absorção

intestinal de cálcio é reduzida e a resposta óssea às intervenções é semelhante.

Adicionalmente, as alterações na microarquitetura óssea também são similares,

caracterizadas por danos à arquitetura do tecido trabecular, com conseqüente perda de

minerais. Estas alterações levam ao enfraquecimento e diminuição da resistência do

osso15,29.

2.6. Colágeno

O colágeno é a proteína mais abundante nos ossos, pele e tendões. Cada molécula de

colágeno é um bastão formado pelo entrelaçamento em tríplice hélice de três cadeias

Introdução Geral

20

polipeptídicas. As fibras de colágeno são parcialmente responsáveis pelas propriedades

biomecânicas do osso, como resistência à pressão sob o mesmo, e também, por dar suporte

aos músculos e à pele. São conhecidos 20 tipos diferentes de colágeno, os quais variam em

relação ao comprimento de sua hélice tríplice e sua função, mas o tipo I é o mais abundante

no tecido ósseo. Os aminoácidos glicina (33%), prolina (12,2%), hidroxiprolina (9,4%), e

alanina (10,7%), perfazem 65% dos aminoácidos do colágeno58,59.

Em nível celular, no retículo endoplasmático rugoso (RER), os colágenos são

sintetizados como procolágeno (Figura 2), que consiste de três cadeias polipeptídicas

esquerdas, formando uma tripla-hélice direita. Ainda no RER, ocorre a hidroxilação dos

aminoácidos lisina e prolina. Este processo requer o ácido ascórbico, ferro e oxigênio como

fatores14,60, além de cobre.

Um fato interessante é que a hidroxiprolina é produto da modificação enzimática

ocorrida após biossíntese da molécula do procolágeno, ou seja, de evento pós-tradução.

As moléculas de procolágeno são secretadas para o meio extracelular, onde sofrem a

remoção enzimática de suas extremidades não helicoidais (por meio da ação de

colagenases), dando origem a molécula de tropocolágeno as quais são então liberadas para

a corrente sanguínea. Estas moléculas adquirem ligações cruzadas, formando as fibrilas

colágenas as que, por sua vez, se agregam para constituir as fibras de colágeno

maduras14,60.

Introdução Geral

21

Figura 2. Adaptado de VARGAS, 199760. Biosíntese de colágeno tipo I.

Há evidências de que a quantidade e composição do colágeno ósseo encontram-se

alterados nos tecidos osteoporóticos. Paschalis et al61, avaliando a distribuição de colágeno

no osso de mulheres menopausadas que já haviam tido fraturas, observaram características

diferentes do colágeno nas superfícies trabeculares dos ossos, comparando com mulheres

saudáveis. Os autores sugerem que a má qualidade do colágeno ósseo pode contribuir para

uma maior fragilidade do osso e, consequentemente, para um maior risco de fraturas.

Molécula de procolágeno

Polimerização

Molécula de colágeno

Osteoblasto Espaço extrecelular (matriz óssea)

Agregação das fibrilas

Fibra colágena

Fibrila colágena

Vesícula

Propeptídeo aminoterminal

Propeptídeo carboxiterminal

Colagenase

Introdução Geral

22

Tendo em vista a importância do colágeno sobre a estrutura óssea, algumas

pesquisas têm investigado o efeito do consumo de hidrolisado de colágeno (HC) sobre o

metabolismo ósseo de indivíduos com osteoartrite e osteoporose.

2.7. Hidrolisado de colágeno

A qualidade nutricional de uma proteína depende da composição de aminoácidos

que ela possui e da utilização fisiológica desses aminoácidos após a digestão e absorção62.

Os hidrolisados protéicos têm sido amplamente utilizados devido às suas propriedades

funcionais (em função da presença de peptídeos bioativos) e tecnológicas (em possuir alta

solubilidade, devido ao processo de hidrólise sob condições ácidas, e produzir soluções de

baixa viscosidade mesmo em altas concentrações). Essas duas propriedades básicas,

combinadas à melhora da tecnologia, tornaram o hidrolisado protéico um ingrediente

amplamente utilizado em diversos produtos alimentícios63 para melhorar características

físicas, químicas e funcionais dos alimentos, sem prejudicar seu valor nutritivo64.

Hidrolisados protéicos são indicados no caso de algumas doenças ou condições

clínicas como, por exemplo, na doença de Crohn, colite ulcerativa e alergias alimentares. A

hidrólise extensiva dos peptídeos pode resultar em produtos menos alergênicos64.

Adicionalmente, a possibilidade de liberar peptídeos biologicamente ativos tem

gerado bastante interesse62. Estudos já puderam evidenciar diversos efeitos dos

hidrolisados, incluindo redução da pressão sanguínea62, diminuição dos níveis de colesterol

sérico, aumento da absorção mineral e efeitos imunomodulatórios65. Postlethwaite et al66,

em 1976, já relatava a relação entre peptídeos de colágeno e resposta imune, e concluía que

a atividade quimioestática do colágeno estaria relacionada aos peptídeos, e não à

composição aminoacídica da proteína.

Introdução Geral

23

Os hidrolisados possuem uma propriedade fisiológica bastante importante, que é a

de uma absorção gastrointestinal mais efetiva, quando comparada às proteínas intactas, ou

mesmo à ingestão de aminoácidos livres63.

Desde 1914, estudos já haviam observado que oligopeptídeos “desapareciam” do

lúmen intestinal mais rapidamente que aminoácidos, sugerindo que algumas proteínas

poderiam ser absorvidas sob a forma de peptídeos. No entanto, estas pesquisas foram

sumariamente ignoradas e, apenas em 1935, em estudo realizado por Heath e Fullerton, esta

teoria foi comprovada67. Diversas pesquisas foram realizadas ao longo dos anos e

atualmente sabe-se que a absorção de proteínas ocorre tanto na forma de aminoácidos como

de pequenos peptídeos, por mecanismos independentes. A absorção dos aminoácidos é

mediada por transportadores e é um mecanismo de absorção saturável; os pequenos

peptídeos (di e tri-peptídeos) são absorvidos intactos e podem ou não sofrer hidrólise intra-

celular. Já os oligopeptídeos (com quatro ou mais aminoácidos) são hidrolisados pelas

peptidases da borda em escova e são absorvidos sob a forma de aminoácidos ou como di ou

tri-peptídeos67,68. Desta forma, os hidrolisados protéicos disponíveis comercialmente se

diferenciam em relação à composição de di, tri e oligopeptídeos69.

O hidrolisado de colágeno (HC) é um produto da indústria de gelatina, atualmente

comercializado para o público em geral pelo mercado farmacêutico, como produto de

venda livre. A sua inocuidade à saúde humana é testemunhada pelo status concedido pela

FDA americano, como um produto seguro - GRAS (generally recognized as safe)70.

O HC é obtido pela hidrólise limitada do colágeno de pele suína ou bovina,

constituído por peptídeos de PM entre 2,5 e 10kDa, sobre o qual existem estudos mostrando

a sua maior biodisponibilidade, efeitos provavelmente estimulatórios da regeneração das

Introdução Geral

24

fibras colagenosas do rato e do homem, quando comparado com o colágeno intacto ou a

gelatina71. A gelatina possui um peso molecular da ordem dos 100kDa.

Dados recentes indicam que fragmentos de colágeno com peso molecular menor que

10kDa são absorvidos pelo intestino e, preferencialmente, acumulam na cartilagem e nos

ossos. Oesser71, investigando o tempo de absorção de um hidrolisado de colágeno e sua

subseqüente distribuição nos diversos tecidos de ratos, observou que 95% do hidrolisado

foi absorvido nas primeiras 12 horas após a ingestão, indicando que mesmo os peptídeos de

maior peso molecular (10kDa) foram absorvidos; a distribuição do hidrolisado nos

diferentes tecidos foi semelhante ao grupo controle (que recebeu apenas o aminoácido

prolina), exceto para os ossos e cartilagens. Esses resultados sugerem que ocorre a absorção

intestinal de peptídeos, mesmo de alto peso molecular, provenientes do hidrolisado de

colágeno, e mostram que o hidrolisado é preferencialmente utilizado para ser incorporação

aos ossos e cartilagens, sugerindo que a administração oral de HC pode resultar em efeitos

benéficos sobre esses tecidos.

Estudos realizados com pacientes portadores de osteoartrose que foram tratados com

HC oral relataram uma diminuição significativa na sintomatologia da doença, mostrando a

sua utilidade no tratamento de osteoartrose.

Adam et al72 avaliaram por meio de um ensaio duplo cego aleatorizado, em 52

pacientes com osteoartrose em pulso e joelho, o efeito da suplementação com 3 diferentes

produtos a base de HC (10g/dia, durante 2 meses): colágeno hidrolisado, produzido por

meio da hidrólise enzimática da gelatina; gelatina; gelatina + glicina + fosfato de cálcio em

relação ao consumo de albumina de ovo, como grupo controle, sobre a dor e consumo de

analgésicos. No final do estudo os pacientes que consumiram a gelatina hidrolisada

Introdução Geral

25

apresentaram maiores reduções de dor, em relação aos outros tratamentos. Além disso,

esses pacientes tinham reduzido o consumo de analgésicos em relação ao consumo relatado

antes de iniciar o tratamento. Os autores sugeriram que o HC teria efeito analgésico e que o

“pool” de aminoácidos fornecido ao organismo pelos produtos melhorou significativamente

a matriz estrutural das articulações. Este estudo demonstrou efeitos benéficos da

suplementação com colágeno hidrolisado sobre a dor de pacientes com osteoartrose além de

ter evidenciado que a gelatina, embora tenha a mesma composição aminoacídica que o HC,

não acarretou os mesmos efeitos sobre a dor nestes pacientes.

Beuker et al73 observaram, em 100 pacientes tratados com 10g/dia de HC, durante 6

meses, um aumento significativo nos níveis sanguíneos de hidroxiprolina, o principal

aminoácido constituinte tanto do colágeno ósseo como do HC, e uma redução da dor de

joelhos e pulsos. Os pesquisadores postularam que o efeito benéfico do HC estaria

relacionado ao aumento da síntese de colágeno articular e cartilagem.

Adam et al74 avaliaram clinicamente o efeito do HC no metabolismo ósseo de pessoas

com osteoporose. Para tanto, conduziram um ensaio tipo duplo-cego em 94 mulheres

menopáusicas (com menos de 80% da densidade mineral óssea normal), 47 foram tratadas

com calcitonina (100 unidades/3 vezes por semana) mais uma dieta rica em HC (10g/dia) e

as outras 47 receberam o tratamento com calcitonina mais placebo de lactose durante 6

meses. Observaram que os níveis de piridinolinas urinárias (marcadores de ressorção óssea)

estavam elevados nas mulheres no início do estudo, em relação a mulheres normais. Ao

final do tratamento, os níveis desses mesmos marcadores diminuíram significativamente

(p=0,05). Ainda, as pacientes que foram tratadas com calcitonina mais HC na dieta,

mostraram decréscimos significativamente maiores às tratadas com calcitonina mais

Introdução Geral

26

placebo. Houve nas mulheres que receberam HC uma maior inibição da ressorção óssea,

que melhorou a resposta ao tratamento com calcitonina.

Os estudos comentados, além de demonstrarem efeitos positivos do HC ósseo-

articulares em humanos, provam a segurança do uso de HC por períodos de até 6 meses, em

concentrações de 10g/dia já que não se apresentaram efeitos adversos importantes70,73,74.

Um estudo realizado no Japão, por Wu et al75, teve como objetivo avaliar a

efetividade da administração oral de peptídeo de colágeno sobre o metabolismo ósseo, em

ratos adultos e em crescimento. A quantidade do peptídeo oferecido aos animais foi

proporcional ao recomendado como suplemento para humanos (10g/dia para um adulto de

60 kg; grupo “Coll-1”); avaliou-se também o efeito de uma quantidade 10 vezes maior

(grupo “Coll-10”), e cem vezes maior (grupo “Coll-100”). Nos ratos em crescimento, a

densidade mineral óssea do grupo “Coll-100”, nos fêmures, foi significantemente maior

que os outros grupos após 1 mês de intervenção, entretanto observou-se uma hipertrofia

renal nesses animais. Já nos ratos adultos, o grupo “Coll-10” apresentou um aumento da

densidade mineral óssea nos fêmures e vértebras, após 8 semanas de intervenção. Concluiu-

se que a administração oral de peptídeos de colágeno em uma quantidade 10 vezes maior

que o recomendado para humanos, trouxe efeitos benéficos para os ossos de animais

adultos, sugerindo que a ingestão de HC pode contribuir para uma melhora na qualidade

óssea também em humanos.

Contudo, este trabalho não observou o efeito da administração de HC sobre outros

parâmetros químicos dos ossos, como teor de proteínas, peso ósseo, além das características

biomecânicas. Por isso, há necessidade de mais estudos que analisem diversos parâmetros

Introdução Geral

27

ósseos principalmente para elucidar o mecanismo de ação do HC sob o metabolismo do

osso.

Nomura et al76 estudaram o efeito da ingestão de um colágeno hidrolisado de

origem marinha (pele de tubarão) sobre características ósseas de ratas ovariectomizadas

como a densidade mineral óssea (DMO), teor de colágeno e glicosaminoglicanos, além de

alterações na histomorfologia. A densidade mineral óssea nos fêmures dos grupos que

receberam o hidrolisado foi maior que nas ratas sham-operated que não receberam o

suplemento. Isto foi verificado por maiores valores na DMO, além de uma densidade óssea

maior entre estes grupos. Adicionalmente, o conteúdo de colágeno tipo I e de

glicosaminoglicanos aumentou, em relação ao grupo controle com albumina. Concluiu-se

que a ingestão do hidrolisado promoveu aumento da densidade mineral óssea pelo aumento

na síntese de fibrilas de colágeno e de glicosaminoglicanos na matriz óssea, sugerindo que

o consumo de HC pode ser útil como suplemento dietético no tratamento da osteoporose.

Embora este estudo tenha analisado características histomorfológicas e químicas do

osso, não foi verificado se a melhora da DMO e o aumento do teor de colágeno

promoveram alterações nas características biomecânicas do osso, o que seria de

fundamental importância já que a resistência óssea está fortemente associada ao risco de

fraturas.

Esses resultados sobre a utilização do hidrolisado de colágeno no tratamento de

osteoporose parecem encorajadores, entretanto são ainda escassos e, portanto, novas

pesquisas em humanos e em animais, são justificáveis para se estabelecer o verdadeiro

potencial do HC, assim como seu mecanismo de ação sobre a fisiologia óssea, quando

consumido via oral como ingrediente ou suplemento alimentar.

Introdução Geral

28

Propõe-se a suplementação da dieta com HC no tratamento da osteoporose e

osteopenia, como uma possível terapia alternativa para pacientes com restrições para as

terapias medicamentosas clássicas, ou como coadjuvante alimentar para os casos em que

não há restrição. A proposta está fundamentada no fato de que a sua administração é

segura, pois se trata de um derivado da gelatina, produto alimentício já utilizado há muito

tempo. O HC pode ser incorporado à dieta de diversas maneiras, com características

sensoriais aceitas pela população e com baixo custo.

Introdução Geral

29

2.8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Introdução Geral

36

71. OESSER, S. et al. Oral administration of 14C-labeled gelatin hydrolysate leads to an accumulation of radioactivity in cartilage of mice (C57/BL). Journal of Nutrition . Eberbach, v. 129, p. 1891-95, mar. 1999.

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Introdução Geral

37

OBJETIVOS

Introdução Geral

38

3. OBJETIVOS

3.1. Geral

Avaliar o efeito fisiológico-metabólico da administração oral de hidrolisado de

colágeno (HC) sobre os marcadores bioquímicos, características composicionais,

biomecânicas e histológicas de ratas ovariectomizadas, modelo experimental de

osteoporose.

3.2. Específicos

- Avaliar o efeito do consumo de HC suplementar, em comparação ao consumo de

gelatina, sobre os marcadores bioquímicos de formação óssea (osteocalcina e fosfatase

alcalina séricas).

- Avaliar o efeito da ingestão de HC suplementar, em comparação ao consumo de

gelatina, sobre características histomorfológicas de fêmures e vértebras.

- Avaliar o efeito do consumo de HC suplementar, em comparação ao consumo de

gelatina, sobre a resistência óssea, em fêmures e vértebras, utilizando dados de carga

máxima.

- Avaliar o efeito da ingestão de HC suplementar, em comparação ao consumo de

gelatina, sobre a composição química óssea, por meio da análise do teor protéico, de

minerais, umidade e cinzas.

Introdução Geral

39

ARTIGO I

Introdução Geral

40

Efeito da suplementação alimentar com hidrolisado de colágeno nos

marcadores bioquímicos e nas características composicionais,

biomecânicas e histológicas ósseas de ratas osteopênicas

Elisa Jackix, Florência Cúneo, Jaime Amaya-Farfan

RESUMO

A osteoporose constitui a enfermidade do esqueleto de maior incidência mundial e é caracterizada por redução da massa óssea levando ao aumento da susceptibilidade a fraturas. Nas mulheres, a osteoporose está associada à queda dos níveis de estrogênio, que acompanha a menopausa. O colágeno compreende cerca de 95% das proteínas dos ossos, e é parcialmente responsável pelas propriedades biomecânicas do osso. Os hidrolisados enzimáticos de colágeno (HC) são produtos obtidos a partir da hidrólise da gelatina e têm recebido atenção por suas propriedades no tratamento de doenças osteoarticulares. Objetivo: avaliar o efeito de um HC sobre características ósseas em modelo osteopênico com ratas. Métodos: 48 ratas adultas foram divididas em 6 grupos: 3 ovariectomizados, 1 sham-operated e 2 intactos, tratados com dieta AIN-93 M, suplementada com HC ou gelatina (controle), em dois níveis: (1) quantidade equivalente a 5X ao recomendado para humanos (10g/D), e outro (2) com nível 10X maior. Após 8 semanas, os ossos do fêmur e da coluna vertebral foram extirpados, e o sangue coletado; determinaram-se osteocalcina e fosfatase alcalina sérica, e no osso, determinou-se peso, teor protéico, conteúdo mineral (Ca, Na, Zn, Fe, K, P, Mg, Mn, Pb e Cu). Realizou-se também a análise de cortes histológicos dos diferentes grupos. Avaliou-se a resistência biomecânica por meio dos testes de flexão em três pontos nos fêmures e compressão nas vértebras. Resultados: As vértebras do grupo que recebeu a maior dosagem de HC suportaram uma carga 4X maior, e tiveram percentuais de proteína óssea e valores de osteocalcina maiores, do que aquelas que não tiveram suplementação ou receberam gelatina (p≤0,05). A análise histológica mostrou maior espessura das trabéculas ósseas nos fêmures e vértebras das ratas que receberam HC. Conclusão: O HC contribuiu para uma maior conservação, composição e resistência óssea, quando comparado à gelatina. Palavras-chave: colágeno; hidrolisado protéico; osteoporose; ovariectomia.

Introdução Geral

41

Effect of consumption of collagen hydrolyzate as food supplement on the

biochemical markers and on the compositional, biodynamic and

histological characteristics of the bone of osteopenic rats

Elisa Jackix, Florência Cúneo, Jaime Amaya-Farfan

SUMMARY

Osteoporosis, the skeletal disease of highest incidence in the world is characterized by the reduction of bone mass and commonly leads to increased susceptibility of fractures. In women, osteoporosis is associated to the cessation of estrogen secretion and menopause. Collagen accounts for approximately 95% of the bone proteins and is to a large extent responsible for its biomechanical properties. Collagen hydrolyzates (CH) consist of mixtures of peptides obtained by a partial hydrolysis of gelatins, which have received considerable scientific attention as potential repositories of osteoraticular tissues. Objective: to evaluate the effect of supplementing the diets of ovariectomized rats with a commercial CH upon the compositional, biomechanical and histological characteristics of the bone. Methods: 48 adult female rats were divided into 6 groups: 3 of them ovariectomized, 1 sham-operated and 2 intact, fed the AIN 93-M diet, supplemented with either CH or gelatin (Control), in two levels: (1) a dose equivalent to 5x the amount suggested for humans (10g/D) and (2) a dose 10x greater. After eight weeks of treatment, the bones of femurs and vertebrae were excised the blood collected and serum osteocalcin and serum alkaline phosphatase determined. For the bone, gross weight, protein and mineral content (Ca, Na, Zn, Fe, K, P, Mg, Mn, Pb and Cu) were determined. Histological analysis of bone tissue sections was also performed to compare the different treatments. Biomechanical strength was assessed by means of 3-point flexion and compression tests of the femurs and vertebrae, respectively. Results: the vertebrae of the ovariectomized group that received the higher dosage of CH withstood a load 4x greater and exhibited higher levels of protein and osteocalcin content than those that received the gelatin or no supplementation at all. Histological analysis of the femurs and vertebrae of castrated rats that received the CH showed greater thickness than those receiving the gelatin supplementation. Conclusion: CH consumption as a diet supplement by the ovariectomized rat had an unequivocal contribution in the conservation or preservation of bone mass not seen when gelatin was used as a supplement. keywords: collagen; protein hydrolyzate; bone; osteoporosis; ovariectomy; gelatin.

Introdução Geral

42

1. INTRODUÇÃO

A osteoporose constitui a enfermidade do esqueleto de maior incidência mundial,

sendo responsável por 1,5 milhões de fraturas por ano nos EUA1. O tratamento de fraturas

por osteoporose acarreta custos bastante elevados para o serviço de saúde pública no Brasil

e no mundo2.

A osteopenia e a osteoporose são diferentes estágios da doença óssea, caracterizadas

pela redução da massa óssea e deterioração da estrutura do tecido ósseo, levando à maior

fragilidade do osso, com aumento da susceptibilidade a fraturas. A osteoporose ocorre com

mais freqüência em populações idosas, mas pode ser resultado do desenvolvimento

inadequado do pico de massa óssea, ou à excessiva perda óssea durante a idade adulta 3,4.

Nas mulheres, a osteoporose está intimamente associada à queda dos níveis de estrogênio,

que acompanha a menopausa5.

Diversos estudos têm utilizado a rata castrada como modelo experimental para simular

a osteopenia ou osteoporose em mulheres menopáusicas, em função das semelhanças entre

os mecanismos biológicos responsáveis pelo ganho e perda de massa óssea6-11. A perda de

massa óssea que ocorre na mulher após a menopausa, assim como na rata castrada é

decorrente, principalmente, da redução nos níveis séricos de estrogênio12.

Geralmente, o tratamento da osteoporose inclui o uso de bifosfanatos, raloxifeno,

derivados de paratormônio, ou a terapia hormonal (TH) que, quando associados a

exercícios físicos, suplementação de vitamina D e cálcio promove uma melhora na massa

óssea e redução do risco de fraturas. No entanto, a TH aumenta os riscos do

desenvolvimento de câncer e os medicamentos utilizados podem acarretar efeitos colaterais

Introdução Geral

43

indesejáveis13. Neste contexto, observa-se a necessidade da realização de estudos que

avaliem a segurança e efetividade de tratamentos alternativos.

O colágeno compreende cerca de 95% das proteínas dos ossos, e é abundante também

na pele e tendões14. São conhecidos 20 tipos diferentes de colágeno, os quais variam em

relação ao comprimento de sua tripla-hélice, os resíduos glicídicos e a sua função, mas o

tipo I é predominante no tecido ósseo. As fibras de colágeno são parcialmente responsáveis

pelas propriedades biomecânicas do osso, como resistência à pressão sob o mesmo, e

também, por dar suporte aos músculos e à pele 15,16.

A alimentação e alguns nutrientes específicos possuem uma estreita relação com a

saúde óssea. Hidrolisados protéicos têm sido utilizados tanto com finalidades clínica e

nutricional como para melhoria de propriedades funcionais de proteínas e alimentos de base

protéica17. Sabe-se que os di e tripeptídeos são absorvidos mais rapidamente, quando

comparados aos aminoácidos livres ou à proteína intacta. Adicionalmente, algumas

pesquisas evidenciaram efeitos dos hidrolisados relacionados à ação bioativa dos peptídeos,

como redução da pressão sanguínea18,19, aumento da absorção mineral e efeitos

imunomodulatórios20.

Os hidrolisados enzimáticos de colágeno (HC) são produtos obtidos a partir da hidrólise

da gelatina e já são comercializados para o público em geral pelo mercado farmacêutico,

como produto de venda livre. A sua inocuidade à saúde humana é testemunhada pelo status

concedido pela FDA americana de GRAS (generally recognized as safe)13. Esse produto

tem recebido atenção pelas suas possíveis propriedades no tratamento de doenças

osteoarticulares. No entanto, são poucos os estudos que buscaram estudar o efeito

fisiológico da administração oral de hidrolisado de colágeno sobre o osso osteoporótico.

Introdução Geral

44

Diante dessas considerações, este estudo teve como objetivo principal investigar o

efeito da administração oral de hidrolisado de colágeno, como suplemento protéico, sobre

os marcadores bioquímicos de formação óssea, resistência biomecânica, e composição

óssea e características histológicas de ratas ovariectomizadas, utilizadas como modelo

experimental de osteoporose.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Animais

Quarenta e oito ratas da linhagem Wistar, provenientes do Centro Multidisciplinar

para investigação Biológica (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP

foram mantidas em gaiolas individuais, em ambiente com controle de temperatura 22±2°C

e ciclos de luz-escuro alternados a cada 12h. O experimento foi aprovado pelo Comitê de

Ética, do Instituto de Biologia da UNICAMP (anexo 1).

Aos três meses de idade os animais foram divididos em 6 grupos: 3

ovariectomizados (“OVX”), 2 intactos (“I”), os quais não sofreram qualquer procedimento

cirúrgico, e um grupo sham-operated, submetido apenas a uma cirurgia simulando a

ovariectomia. Embora não haja um consenso no tempo para que a osteopenia ou

osteoporose se desenvolva nas ratas, alguns estudos referem que a osteopenia se manifesta

um mês após a ovariectomia21,22. Neste estudo a ovariectomia foi realizada segundo técnica

descrita por CARVALHO22 em ratas com 3 meses de idade. O controle de ganho de peso e

consumo alimentar das ratas foi feito três vezes por semana.

Introdução Geral

45

Ao final do experimento, os animais foram anestesiados com cetamina, 80 mg/kg, e

xilazina, 8 mg/kg23. Amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca e as vértebras

e fêmures, extirpados.

2.2. Dietas

Água e ração comercial (Nuvital, Curitiba) foram oferecidas ad libitum até os 4

meses de idade. Ao iniciar o tratamento com HC (após a instalação de um quadro de

osteopenia), a alimentação passou a ser controlada utilizando-se como referência o

consumo dos grupos intactos, a fim de minimizar o aumento do peso corpóreo das ratas

associado à ovariectomia24. O tratamento teve oito semanas de duração (até o momento em

que as ratas completaram 6 meses de idade).

Para a formulação das dietas experimentais utilizaram-se os ingredientes

recomendados pelo American Institute of Nutrition para ratos adultos25. Na dieta

tratamento, suplementou-se HC (GELITA South America), adicionado na forma de pó às

dietas experimentais. A dieta controle foi suplementada de gelatina, grau farmacêutico,

também na forma de pó, de acordo com a quantidade de HC adicionado às experimentais.

A composição centesimal das dietas utilizadas encontra-se no anexo 2 e o protocolo

dietético para os diferentes grupos experimentais, na tabela 1.

A quantidade de HC suplementada foi em dois níveis: HC5, proporcional a 5 vezes

a quantidade recomendada como suplemento para humanos (10g/dia para um adulto de

60kg), e HC10, ou duas vezes o nível 5.

Introdução Geral

46

Tabela 1. Protocolo dietético

Grupos Tratamentos Dosagens (g/D)

Dosagens

OVX-HC5 Hidrolisado de colágeno 0,207 equivalente a 5x a dose (10g/D) para humanos

OVX-HC10

Hidrolisado de colágeno 0,415 equivalente a 10x a dose (10g/D) para humanos

OVX-G

Gelatina 0,415 equivalente a 10x a dose (10g/D) para humanos

I-G

Gelatina 0,415 equivalente a 10x a dose (10g/D) para humanos

I-HC

Hidrolisado de colágeno 0,415 equivalente a 10x a dose (10g/D) para humanos

SHAM-HC

Hidrolisado de colágeno 0,415 equivalente a 10x a dose (10g/D) para humanos

2.3. Composição química dos fêmures e vértebras

Determinou-se o teor de Ca, Na, Zn, Fe, K, P, Mg, Mn, Pb e Cu por meio de

espectrometria de emissão atômica por plasma indutivamente acoplado (ICP-AES) em

equipamento BAIARD ICP 2000, do Instituto de Tecnologia de Alimentos – ITAL; cinzas

(A.A.C.C., 1990)26 e proteínas totais pelo método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1975)27,

utilizando como fator de conversão de proteínas: 6,25.

2.4. Parâmetros físicos dos fêmures e vértebras

Os ossos foram limpos por meio da retirada dos tecidos moles com a utilização de

tesoura e bisturi. Realizou-se a medição do peso de todos os ossos e diâmetros menor e

maior das epífises dos fêmures.

2.5. Parâmetros biomecânicos

Após extirpação, os ossos foram armazenados individualmente, envoltos em gases

umedecidas com solução salina (0,9% de NaCl) e, congelados à -20ºC durante um mês.

Para o ensaio, fêmures e vértebras foram descongelados por 12 horas e mergulhados em

Introdução Geral

47

solução salina (0,9% de NaCl), onde permaneceram por mais aproximadamente 4 horas,

segundo técnica descrita por MELLO28.

Realizou-se o teste de flexão em três pontos para os fêmures, e o teste de

compressão nas vértebras. No teste de flexão em três pontos os fêmures foram apoiados em

suas extremidades, sobre dois suportes distanciados 18 mm. Foi então aplicada uma força

na porção medial do osso. No teste de compressão as vértebras foram apoiadas sobre uma

superfície plana. Para ambos os testes a velocidade da força aplicada foi de 2mm/min. A

cada incremento de carga registrou-se a deformação correspondente para construção do

gráfico carga vs deformação, por meio do software acoplado ao equipamento MTS modelo

TestStar II, da Faculdade de Engenharia Mecânica/UNICAMP. A partir desse gráfico

calculou-se a carga máxima, que corresponde a maior carga aplicada durante o ensaio, até o

momento de ruptura do osso28.

2.6. Análise histológica do tecido ósseo

Com o objetivo de observar alterações nas características das trabéculas ósseas,

cortes histológicos coletados de animais submetidos aos diferentes tratamentos foram

descalcificados, corados e fotografados em microscópio de luz. As imagens foram

capturadas em câmera digital, e processadas no programa Image Pro-Plus do Departamento

de Histologia e Embriologia, Instituto de Biologia da UNICAMP.

2.7. Marcadores bioquímicos de formação óssea

Fosfatase Alcalina Total e Óssea: foi realizada pelo laboratório LAB&VET (SP)29 em soro.

A fração óssea (termolábil) foi determinada por diferença entre a fração total e a termo-

estável (hepática, intestinal, placentária, Nagao, Regan e Kasahara).

Osteocalcina: determinada em soro, por meio de imunoensaio enzimático (Metra

Osteocalcin - Quidel).

Introdução Geral

48

2.8. Tratamento estatístico dos dados

A análise dos dados foi feita pela ANOVA multivariada do software GraphPad

Instat 3, utilizando-se o teste de Tukey para verificar as diferenças entre os tratamentos, no

nível mínimo de significância convencional de 5%.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Modelos de osteoporose experimental geralmente são representados pela rata

ovariectomizada. O tratamento da osteoporose com proteína do soro do leite, isoflavonas da

soja e estradiol, por exemplo, tem sido utilizado em ratas ovariectomizadas para suprimir os

efeitos da redução dos níveis de estrogênio, ocasionados pela ovariectomia. Este estudo

utilizou a rata castrada para avaliação do efeito do HC sobre algumas características ósseas.

Analisando a evolução de peso após a cirurgia, observou-se que as ratas

ovariectomizadas tiveram maior ganho de peso comparado com as intactas e sham-

operated (Figura 1), embora sem diferenças significativas na ingestão alimentar entre esses

grupos (p=0,1198).

Introdução Geral

49

190

210

230

250

270

290

310

330

350

1° sem. 2° sem. 3° sem. 4° sem. 5° sem. 6° sem. 7° sem. 8° sem. 9° sem. 10°sem.

11°sem.

Data

Méd

ia d

e pe

so s

eman

al (

g)

OVX-HC5

OVX-HC10

I-G

OVX-G

SHAM-HC

I-HC

Figura 1. Evolução ponderal das ratas dos diferentes grupos experimentais registrada durante as 11 semanas após ovariectomia.

n = 8 ratas por grupo; p<0,05 (teste Tukey): * vs intactos (I-G e I-HC) e Sham-operated (SHAM-HC).

Apesar do maior ganho de peso nos animais castrados em relação aos intactos, não

foram encontradas diferenças nos diâmetros das diáfises dos fêmures entre os grupos.

Tais resultados se mostram coerentes com os encontrados na literatura27, 21,28. O

maior ganho de peso nas ratas castradas parece estar associado à falta do efeito regulatório

do estrogênio sobre a gordura corporal. Segundo HIDAKA 11, as ratas ovariectomizadas

consomem maior quantidade de alimento e o utilizam mais eficientemente, o qual é

consistente com o fato de que os grupos ovariectomizados ganharam mais peso, mesmo na

condição de consumo pareado. Entende-se que a ausência do estrogênio precipita o

acúmulo da gordura corporal e o desenvolvimento da osteoporose.

O sucesso da ovariectomia também pode ser verificado no momento do sacrifício

dos animais, uma vez que o tecido uterino encontrava-se atrofiado.

* * *

Introdução Geral

50

19,520,5

21,522,5

23,524,5

25,526,527,5

28,529,5

SHAM-HC OVX-HC5 OVX-HC10 OVX-G I-G I-HC

Grupo

% p

rote

ína

nas

vért

ebra

s

Figura 2. Valores médios e erro padrão dos teores protéicos das vértebras, obtidos após 8 semanas de suplementação, nos diferentes grupos. n= 6 ratas por grupo; * p<0,05 (teste Tukey): OVX-HC10 vs OVX-G; † p<0,05 (teste Tukey): OVX-HC10 vs SHAM-HC

O conteúdo protéico das vértebras nas ratas castradas que receberam HC na maior

proporção foi maior quando comparado às ratas que consumiram gelatina, indicando que o

hidrolisado pode contribuir para um maior teor de proteínas no osso de ratas osteopênicas.

Quanto aos fêmures, embora os resultados não tenham apresentado diferença estatística no

teor protéico entre os grupos experimentais (p=0,1914), as ratas castradas que receberam

HC apresentaram fêmures com maior teor protéico em relação às castradas, com gelatina

(22,3% e 21,3%, respectivamente).

O HC e a gelatina possuem a mesma composição aminoacídica, entretanto, a

gelatina não acarretou em aumento no teor protéico nas vértebras ou fêmures. Os

resultados encontrados sugerem que o maior teor de proteínas, encontrado nas vértebras,

pode ser decorrente de uma absorção mais efetiva do hidrolisado em relação à gelatina.

OESSER et al30, ao investigar o tempo de absorção de um HC e sua distribuição nos

diversos tecidos de ratos observou que, 95% do hidrolisado foi absorvido nas primeiras 12

*

†*

†

Introdução Geral

51

horas após a ingestão, o que indica que mesmo peptídeos de maior PM (10 kDa) podem ser

absorvidos. Adicionalmente, observou-se uma maior deposição de colágeno nos ossos e

cartilagens nos grupos que consumiram HC. Em estudo in vitro, realizado mais

recentemente pelo mesmo autor, observou-se uma maior estimulação de condrocitos

(principais células encontradas nas cartilagens) após a adição de HC, indicando que o HC

pode estimular a síntese de colágeno tipo II31. A maior síntese e deposição de colágeno nos

ossos contribui para um aumento no teor protéico do osso.

NOMURA et al32, observaram maior teor de colágeno tipo I em ratas

ovariectomizadas que consumiram HC, em relação ao grupo controle (com albumina).

Nesse estudo, os autores relatam que a metodologia utilizada para quantificar o colágeno

extrai apenas o colágeno novo, ou seja, apenas o colágeno que ainda não está preso aos

cross-linkings da matriz óssea. Dessa forma, o colágeno analisado tinha sido sintetizado

recentemente, demonstrando que a suplementação com HC foi capaz de induzir a produção

de colágeno tipo I.

Portanto, o maior teor protéico encontrado nas vértebras das ratas que receberam o

HC na maior proporção, pode ser justificado pela maior absorção de peptídeos provenientes

do HC, além de uma maior deposição desses peptídeos nos ossos. Além disso, pode ter

ocorrido um estímulo da síntese de colágeno tipo I pelos osteoblastos, pela possível

presença de peptídeos bioativos na proteína hidrolisada, mas não na intacta.

Introdução Geral

52

Tabela 2. Valores médios de peso (g) e erro padrão (fêmures e vértebras) dos diferentes grupos, obtidos após 8 semanas de suplementação. Grupos Peso médio dos fêmures (g) Peso médio das vértebras (g)

I-G 0,71 + 0,013 0,15 + 0,003

I-HC 0,62 + 0,025 0,08 + 0,005#

SHAM-HC 0,62 + 0,015 0,12 + 0,005

OVX-HC5 0,76 + 0,021*† 0,12 + 0,013

OVX-HC10 0,73 + 0,022*† 0,14 + 0,005*

OVX-G 0,66 + 0,029 0,13 + 0,010

n = 8 Para fêmures: p<0,05 (teste Tukey): * vs I-HC † vs SHAM-HC Para vértebras: p<0,05 (teste Tukey): * vs I-HC # vs I-G

Comparando o peso dos fêmures, entre os grupos que receberam HC, observou-se

que os ossos dos animais ovariectomizados pesavam mais do que os intactos e sham

operated (Tabela 2). Esse resultado demonstra que o tratamento com HC foi capaz de

elevar o peso ósseo das ratas com osteoporose, mas não dos animais saudáveis, sugerindo

que a ação dos peptídeos bioativos de colágeno são efetivas apenas quando a massa óssea

estiver comprometida. Adicionalmente, embora sem diferença estatística, o peso médio dos

fêmures foi menor para o grupo ovariectomizado que recebeu gelatina, comprovando que o

tratamento com HC pode ter acarretado um aumento de peso nos fêmures desses animais.

Isso pode ser reflexo de uma maior deposição protéica nos ossos, observado pelo maior teor

de proteína óssea encontrado nos fêmures, embora não tenha sido significativo

estatisticamente.

No caso das vértebras, entre os grupos intactos, aquele que recebeu gelatina teve

maior peso (Tabela 2), sugerindo que para as ratas não osteopênicas a gelatina pareceu

Introdução Geral

53

exercer um efeito aditivo sobre o peso ósseo. Ainda com relação às vértebras, o grupo

intacto tratado com HC apresentou menor média de peso em relação ao grupo

ovariectomizado que recebeu o mesmo tratamento. Esse resultado se mostra coerente com

aqueles encontrados nos fêmures, o que reforça a hipótese de que a suplementação com HC

tem efeito apenas nos ossos osteopênicos.

0

10

20

30

40

50

60

70

SHAM-HC OVX-HC5 OVX-HC10 OVX-G I-G I-HC

grupos

carg

a m

axim

a (N

)

Figura 3. Carga máxima para vértebras (valores médios e erro padrão), obtida por meio do ensaio de compressão, após 8 semanas de suplementação, nos diferentes grupos. n= 4 por grupo; * p<0,05 (teste Tukey): OVX-HC10 vs OVX-G; † p<0,05 (teste Tukey): OVX-HC10 vs I-G.

O desempenho mecânico do osso pode ser estudado por meio da realização de testes

biomecânicos. A caracterização funcional do osso, como uma estrutura dinâmica pode

fornecer dados fundamentais sobre a resistência óssea e conseqüentemente, sobre a

qualidade do osso.

Os resultados do ensaio mecânico (Figura 3) mostram que as vértebras das ratas que

receberam suplementação com HC na maior proporção suportaram maior carga, em relação

*†

† *

Introdução Geral

54

às que receberam gelatina, indicando que o HC pode contribuir para uma maior resistência

do osso ao esforço e à pressão na rata osteopênica.

Em relação à carga máxima nos fêmures (dados não mostrados graficamente)

observou-se que não houve diferença estatística entre os grupos tratados com HC e os

tratados com gelatina (p=0,3521). Tudo parece indicar que nos fêmures, a resposta ao

tratamento com HC foi diferente ao das vértebras, já que possuem maior quantidade de

osso cortical, diferentemente das vértebras, onde o osso trabecular é predominante,

metabolicamente mais ativo e mais sensível às alterações metabólicas. Desta maneira, a

perda de massa óssea no tecido trabecular resulta ser maior do que no cortical. Sendo

assim, os dados sugerem que a perda óssea no tecido cortical, causada pela ovariectomia,

não tenha sido suficiente para ocasionar uma alteração na resistência mecânica dos

fêmures.

Assim, a carga máxima aumentada observada nas vértebras dos grupos

ovariectomizados tratados com HC pode ser o reflexo da melhora da estrutura, ou aumento

da robustez, do tecido trabecular.

Os efeitos do HC sobre a biomecânica do osso ainda não foram observados. No

entanto, este estudo mostrou que o HC parece contribuir para a preservação da resistência

máxima das vértebras.

Introdução Geral

55

Tabela 3. Valores médios e erro padrão de osteocalcina sérica (ng/mL), analisados após 8 semanas de suplementação, nos diferentes grupos. Grupos Osteocalcina (ng/mL)

I-G 7,2 + 0,17*

I-HC 6,32 + 0,33

SHAM-HC 7,38 + 0,13*

OVX-HC5 6,39 + 0,4

OVX-HC10 5,26 + 0,43

OVX-G 7,69 + 0,32*

n= 4; * p<0,05 (teste Tukey): vs OVX-HC5.

A osteocalcina reflete especificamente a atividade osteoblástica, sendo que após

liberação pelo osteoblasto, a maior parte desta proteína é incorporada pela matriz

extracelular uma vez que possui forte interação com o cálcio e com cristais de

hidroxiapatita33. Uma pequena fração do total é liberada para a circulação, onde pode ser

detectada por meio de imunoensaios.

Os níveis séricos de osteocalcina foram maiores no grupo ovariectomizado que

recebeu gelatina, em comparação ao grupo tratado com HC (Tabela 3). Isso indica que a

concentração de osteocalcina liberada na circulação sanguínea foi menor nas ratas que

receberam o hidrolisado na maior dosagem porque mais moléculas de osteocalcina foram

retidas no osso, restando apenas uma pequena fração para ser liberada na corrente

sanguínea.

Outros estudos envolvendo a administração de fatores promotores da deposição de

massa óssea (PTH e estrogênio) em ratas castradas também demonstraram uma menor

concentração sérica de osteocalcina nos grupos tratados34. A conclusão dos autores foi que

a combinação destes fatores deve contribuir no tratamento da osteoporose pós-

Introdução Geral

56

menopausica. SZULC e cols35, em estudo realizado com 195 mulheres idosas, por sua vez,

observaram que os níveis séricos de osteocalcina nos grupos tratados com cálcio e vitamina

D foram menores do que naqueles que receberam o placebo, sugerindo que esses nutrientes

têm uma ação indireta sobre o turnover ósseo e podem contribuir para a manutenção da

massa óssea.

Na Figura 4 estão expressos os resultados de fosfatase alcalina total e óssea, obtidos

ao final do ensaio para os diferentes grupos experimentais. Comparando, tanto os valores

de FAT, como os de FAO dos grupos ovariectomizados (OVX), os intactos (I), foi

constatado que as ratas ovariectomizadas que receberam HC na maior proporção,

apresentaram valores estatisticamente maiores de FAT e FAO (p=0,025 e 0,0081,

respectivamente). Esse resultado não era esperado, pois demonstrou que a ovariectomia,

por si só, pode ter uma influência na massa óssea, contrária ao aumento da atividade

enzimática, sugerindo que a maior atividade da fosfatase alcalina é apenas compatível com

a tentativa compensatória do organismo, mas não necessariamente com um aumento na

massa óssea.

Introdução Geral

57

Figura 4. Valores de Fosfatase Alcalina Total (FAT) e Óssea (FAO) (valores médios e erro padrão), obtidos após 8 semanas de suplementação, nos diferentes grupos. n = 4 por grupo; FAT: # p<0,05 (teste de Tukey): OVX-G vs I-G

FAO:

* p<0,05 (teste de Tukey): OVX-HC10 vs I-G e I-HC

† p<0,05 (teste de Tukey): OVX-G vs I-HC

0

20

40

60

80

100

120

SHAM-HC OVX HC5 OVX HC10 OVX G I G I HC

#

†* †

*

Média FAO (U/L)

Média FAT (U/L)

Introdução Geral

58

Tabela 4. Valores médios e erro padrão do conteúdo mineral ósseo (mg/kg) de fêmures. Grupos Elemento

(mg/kg) OVX-HC10 I-G OVX-HC5 OVX-G SHAM-HC I-HC

Cálcio 193569 + 3063 200822 + 9550 189200 + 6984 173010 + 21149 198447 + 330 159295 + 11673*

Cobre 26 + 1 27 + 1 26 + 1 20 + 3 25 + 2 19+ 2 *

Ferro 62 + 6 76 + 14 72 + 8 62 + 22 65 + 12 42 + 12

Potássio 2120 + 88 1852 + 106 1875 + 206 1784 + 120 † 17801 + 196 1502 + 180 †

Manganês 0,86 + 0,26 0,65 + 0,08 0,84 + 0,15 0,69 + 0,08 2,02 + 1,32 0,65 + 0,21

Sódio 5044 + 91 5256 + 249 4948 + 125 5077 + 174 5106 + 35 4681 + 181

Fósforo

93286 + 1706 86199 + 4107 82012 +

3403

68721 +

14876

86407 +

562

62505,9 +

8996,44 †

Chumbo 0 0 0 0 0 0

Zinco 185 + 10 211 + 12 180 + 7 155 + 25 177 + 5 135 + 8 *

Magnésio 3187 + 44 3449 + 124 3246 + 91 2737 + 374 3157 + 87 2338 + 122*†#

n = 4; p<0,05 (teste de Tukey):

* vs I-G

† vs OVX-HC10

# vs OVX-HC5

Tabela 5. Valores médios e erro padrão do conteúdo mineral ósseo (mg/kg) de vértebras. Elemento (mg/kg) Grupos

OVX-HC10 I-G OVX-HC5 OVX-G SHAM-HC I-HC

Cálcio 157190 + 9393 189792 + 6943 194675 + 4889 181225 + 9487 178198 + 1945 204678 +

2377

Cobre 9,27 + 7,82 7,62 + 7,28 3,12 + 2,63 10,78 + 4,82 18,08 + 1,66 4,54 + 2,65 #

Ferro 231 + 54 206 + 67 183 + 21 106 + 19 106 + 17 473 + 29

Potássio

2441 +

179

3205 +

333

2486 +

251

1083 +

194 †*

1088 +

344 †*

520 +

195 †

Manganês ND ND ND ND ND ND

Sódio

4623 +

162

5491 +

193

5812 +

281

4276 +

377

4391 +

399

4238 +

257

Fósforo

74915 +

3930

91804 +

3915

93333 +

3372

83874 +

4708 82977 +

2719

94722 +

1064

Chumbo ND ND ND ND ND ND

Zinco

239 +

45

256 +

5

275 +

18

244 +

2

254 +

11

284 +

10

Magnésio

2746 +

156

3498 +

116

3387 +

91 ND 3410 +

107 ND

n = 4; p < 0,05 (teste de Tukey):

* vs I-G

† vs OVX-HC10

# vs SHAM-HC

Introdução Geral

59

O conteúdo mineral ósseo encontrado está descrito nas Tabelas 4 e 5. Os valores de

massa óssea devem ser considerados válidos quando forem menores nas ratas

ovariectomizadas do que as do grupo basal28. Este estudo não utilizou um grupo sem

suplementação nenhuma, já que o objetivo era comparar o efeito da suplementação de

hidrolisado de colágeno com a gelatina. Por isso, compararam-se as médias entre o grupo

ovariectomizado consumindo o HC e a gelatina. Embora sem diferença estatística,

observou-se uma maior concentração de minerais (cálcio, cobre, potássio, manganês,

fósforo, zinco e magnésio) nos fêmures e vértebras das ratas que receberam o hidrolisado

de colágeno, quando comparado às que receberam gelatina. Ou seja, os animais castrados

que foram suplementados com gelatina (grupo controle) apresentaram quantidades menores

de minerais ósseos.

Este resultado evidencia que a ingestão de HC contribuiu para um aumento do

conteúdo mineral ósseo, o que não foi visto nos animais osteopênicos suplementados com

gelatina. Resultados semelhantes foram encontrados nos estudos realizados por Wu et a114

e Nomura et al2l. Em ambos observou-se um aumento da densidade mineral óssea nos

grupos que receberam tratamento com HC, embora não tenham qualificado os minerais

ósseos.

Observa-se que, tanto nas vértebras como nos fêmures, houve uma maior

concentração de potássio entre os grupos castrados que receberam o hidrolisado de

colágeno comparado com o castrado, com gelatina (p<0,05). Adicionalmente, entre os

grupos intactos, aquele que recebeu gelatina teve uma concentração óssea de cálcio, cobre,

fósforo e magnésio significativamente maior nos fêmures, sugerindo que o hidrolisado não

tem efeito benéfico sobre o osso de ratas saudáveis e que, nestes casos, a gelatina parece

aumentar mais o conteúdo mineral ósseo do que o hidrolisado. Ainda com relação aos

Introdução Geral

60

fêmures, o grupo intacto que recebeu hidrolisado teve a menor concentração de minerais

em relação a todos os outros grupos.

FUGITA e colaboradores (2002), estudaram o efeito da suplementação, por um

período de 4 meses, de cálcio com colágeno sobre a dor nas articulações em mulheres

idosas com osteoartrite. Os autores observaram que os grupos tratados tiveram redução da

dor, comparando com os grupos placebo. FUGITA sugere que este fato pode estar

associado a uma redução na reabsorção óssea, e que o colágeno pode agir sobre o sistema

imune, impedindo ou reduzindo a liberação de citocinas que estimulem a reabsorção óssea

por meio da liberação de colagenases. Portanto, os peptídeos de colágeno parecem

contribuir para a preservação de massa óssea, também pela ação sobre o sistema imune.

Entretanto, no atual estudo isso não foi verificado, embora sejam informações que nos

auxiliam a explicar e entender os resultados encontrados.

Introdução Geral

61

Figura 5. Microscopia da epífise de fêmur de ratas ovariectomizadas que receberam dieta suplementada com gelatina (OVX-G). Coloração com hematoxilina eosina. Aumento de 20 X. (OT) Tecido Ósseo Trabecular; (TC) Tecido cartilaginoso.

Figura 6. Microscopia da epífise de fêmur de ratas ovariectomizadas que receberam dieta suplementada com hidrolisado de colágeno (OVX-HC10). Coloração com hematoxilina eosina. Aumento de 20 X. (OT) Tecido Ósseo Trabecular; (TC) Tecido cartilaginoso.

OT

OT

OT

TC

OT

TC

OT

OT TC

OT

OT

Introdução Geral

62

Figura 7. Microscopia da vértebra de ratas ovariectomizadas que receberam dieta suplementada com gelatina (OVX-G). Coloração com hematoxilina eosina. Aumento de 20 X. (T) Trabéculas; (OT) Tecido Ósseo Trabecular. (TC) Tecido Cartilaginoso.

Figura 8. Microscopia da vértebra de ratas ovariectomizadas que receberam dieta suplementada com hidrolisado de colágeno (OVX-HC10). Coloração com hematoxilina eosina. Aumento de 20 X. (OT) Tecido Ósseo Trabecular. (TC) Tecido Cartilaginoso.

OT

OT

OT

OT

OT

OT

OT

Introdução Geral

63

As fotografias histológicas dos fêmures das ratas ovariectomizadas podem ser

observadas nas figuras 5 e 6; as vértebras podem ser observadas histologicamente nas

figuras 7 e 8. As imagens obtidas pela microscopia de luz evidenciam algumas diferenças

estruturais da região da cabeça femural e nas vértebras entre os grupos ovariectomizados

tratados com gelatina e HC.

A presença de trabéculas e de tecido ósseo foi observada qualitativamente, não se

utilizando métodos morfométricos. A formação e reabsorção óssea nos fêmures foram

analisadas nas epífises, onde há maior presença de tecido esponjoso, o qual é mais

susceptível à alterações, por ser mais vascularizado.

No grupo que recebeu dieta suplementada com hidrolisado de colágeno, observam-

se trabéculas ósseas mais espessas quando comparado ao grupo controle (com gelatina). É

possível observar no grupo tratado com o hidrolisado uma menor perda de osso trabecular

do que no grupo que recebeu gelatina.

Esses resultados sugerem que no grupo ovariectomizado suplementado com gelatina

houve diminuição de tecido ósseo com aumento da reabsorção óssea, observada pelo

adelgaçamento das trabéculas, o que torna o osso mais susceptível a fraturas. A

suplementação com gelatina não foi capaz de suprimir a perda óssea causada pela

ovariectomia.

Em relação às vértebras, a análise qualitativa das fotos histológicas mostra tecido

trabecular ósseo mais espesso e maior conectividade entre as trabéculas no grupo castrado

que recebeu HC, comparado àquele que recebeu gelatina.

Resultados semelhantes foram observados por NOMURA et al32, ao comparar a

administração de um hidrolisado de colágeno contra albumina (grupo controle) em ratas

ovariectomizadas. Neste estudo o autor encontrou maior número de trabéculas ósseas nas

Introdução Geral

64

ratas castradas que receberam albumina, quando comparado com o grupo suplementado

com o hidrolisado, sob as mesmas condições.

Estudos que analisem as características morfométricas são necessários para

esclarecer a ação do HC sobre o número e espessura de trabéculas no osso de ratas

osteopênicas.

4. CONCLUSÃO

No presente estudo demonstrou-se que a rata ovariectomizada pode ser utilizada

como um modelo experimental seguro para simular a perda óssea em mulheres

menopausadas. Isto pode ser evidenciado pelo aumento de peso nas ratas submetidas à

castração e pela atrofia dos ovários.

Em relação à suplementação com o HC observou-se que o tratamento com esta

proteína mostrou ser eficaz, quando analisamos determinados parâmetros como a

osteocalcina, resistência mecânica e teor protéico.

Adicionalmente, a análise dos cortes histológicos indica diferenças estruturais entre

os grupos tratados e o controle, com maior preservação de tecido trabecular ósseo no grupo

ovariectomizado que recebeu HC.

Entretanto, o efeito benéfico do HC não foi igualmente verificado nas vértebras e

nos fêmures, o que pode ser justificado pela diferença nos tipos de tecido presentes

predominantemente em cada um desses tipos de osso.

A administração oral de HC foi capaz de aumentar a massa óssea, especialmente nas

ratas ovariectomizadas, evidenciando que a ingestão de peptídeos de colágeno traz efeitos

benéficos em ratas osteopênicas. Isto sugere que esses efeitos também possam ser

observados em mulheres menopausadas. No entanto, mais estudos em humanos e animais

Introdução Geral

65

devem ser realizados para comprovar a eficácia e elucidar o real mecanismo de ação destes

hidrolisados sobre o metabolismo ósseo.

Agradecimentos. Os autores reconhecem o auxílio financeiro do CNPq (Proc. 474573-

2004-4).

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Introdução Geral

66

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Introdução Geral

67

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Introdução Geral

68

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28. MELLO, L.C.P.; GOMIDE, L.B. Respostas físicas, químicas e biomecânicas do osso de ratas ovariectomizadas submetidas a diversas ingestões de flúor suplementar. Rev Nutr. v. 18, n. 5, p. 593-600. 2005.

29. Av. Escola Politécnica, 4445 São Paulo – SP 05350-000 Tel/Fax: (11) 819-2297 e-mail: lab&vet@xpnet.com.br.

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33. INGRAM, R.T. et al. Age and gender-related changes in the distribution of osteocalcin in the extracellular matrix of normal male and female bone. Possible involvement of osteocalcin in bone remodeling. J Clin Invest. v. 93, n. 3, p. 989-97. 1994.

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Introdução Geral

69

ANEXO 1

Introdução Geral

70

Introdução Geral

71

ANEXO 2

Introdução Geral

72

Composição centesimal das dietas utilizadas

Grupo experimental

% cinzas1 % umidade2 %proteínas3 % lipídeos4 % carboidratos5

OVX HC 5 2,27 + 0,28 7,72 + 0,28 13,12 + 0,47 4,25 + 0,14 72,33 + 0,88

OVX HC 10 2,45 + 0,66 7,77 + 0,49 13,78 + 0,28 4,85 + 0,01 71,31 + 1,66

OVX G 2,25 + 0,92 7,37 + 0,45 15,43 + 1,71 4,93 + 0,44 69,96 + 1,42

SHAM HC 2,42 + 0,09 8,45 + 0,68 13,78 + 0,6 4,04 + 0,28 70,78 + 0,3

I G 2,64 + 0,01 7,8 + 0,28 15,43 + 0,3 4,59 + 0,36 69,54 + 0,46

I HC 2,1 + 0,1 8,17 + 0,17 13,78 + 0,18 4,53 + 0,09 72,30 + 0,19

1. Obtida pelo método cinzas (A.A.C.C., 1990)26 2. Obtida pelo método Instituto Adolfo Lutz, 1985. 3. Obtidas pelo método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1975)27 4. Obtidos pelo método de Bligt & Dyer, 1959 5. Obtidos por diferença.