relatórios de biologia molecular.pdf

7/28/2019 Relatrios de Biologia Molecular.pdf

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Turma 2 | Grupo 1

Professores responsveis: Dr. Cladio Sunkel e Dr. Carlos CondeRealizador por: Filipa Barros, Henrique Fernandes, Joo Rodrigues, Lisete

Moutinho e Sara Moniz

Biologia Molecular

LicenciaturaemBioqumica

2012/2013

RELATRIOS


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LicenciaturaemBioqumica 2012/2013 RelatriosdaAulasPrticasdeBiologiaMolecular

1

PREFCIO

O presente documento compila os relatrios de todos os trabalhos prticos e terico-

prticosrealizadosaolongodosegundosemestredoanolectivo2012/2013dalicenciatura

em Bioqumica (Faculdade de Cincias da Universidade do Porto e Instituto de Cincias

BiomdicasAbelSalazardaUniversidadedoPorto).Ostrabalhosforamrealizadosnombito

daunidadecurriculardeBiologiaMolecular.

Todaainformaoquenoestcontempladanomanualdostrabalhosprticosdaunidade

curricularque foi disponibilizadopeloprofessore/oumaterial utilizadonas aulas tericastemasuafontecitadanabibliografia.


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ND ICE

EXTRAODEDNAGENMICODEDROSOPHILAMELANOGASTER....................................4OBJECTIVOS..............................................................................................................................4INTRODUOTERICA.........................................................................................................4METODOLOGIA.....................................................................................................................5REAGENTES.......................................................................................................................5EQUIPAMENTOS................................................................................................................5procedimentoexperimental..............................................................................................5

RESULTADOSEXPERIMENTAIS......................................................................................................6CONCLUSES.........................................................................................................................8

EXTRACODEDNAPLASMDICODEESCHERICHEACOLI...................................................9OBJECTIVOS..............................................................................................................................9INTRODUOTERICA.........................................................................................................9METODOLOGIA...................................................................................................................10REAGENTES.....................................................................................................................10EQUIPAMENTOS..............................................................................................................10procedimentoexperimental............................................................................................10

RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................10

CONCLUSES.......................................................................................................................10

ANLISEELETROFORTICADEDNADIGERIDOCOMENZIMASDERESTRIO..................12 OBJECTIVOS............................................................................................................................12INTRODUOTERICA.......................................................................................................12METODOLOGIA...................................................................................................................14REAGENTES.....................................................................................................................14EQUIPAMENTOS..............................................................................................................14procedimentoexperimental............................................................................................14

RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................15CONCLUSES.......................................................................................................................16

ELABORAODOMAPADERESTRIODEUMPLASMIDEORECOMBINANTE.................17 OBJECTIVOS............................................................................................................................17INTRODUOTERICA.......................................................................................................17METODOLOGIA...................................................................................................................18procedimentoexperimental............................................................................................18

RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................18CONCLUSES.......................................................................................................................19DISCUSSO.............................................................................................................................22

PCRPOLIMERASECHAINREACTION..........................................................................23OBJECTIVOS............................................................................................................................23INTRODUOTERICA.......................................................................................................23


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METODOLOGIA...................................................................................................................24

REAGENTES.....................................................................................................................24EQUIPAMENTOS..............................................................................................................24procedimentoexperimental............................................................................................24

RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................25CONCLUSES.......................................................................................................................27

TRANSFORMAODEESCHERICHIACOLICOMDNAPLASMDICO....................................28OBJECTIVOS............................................................................................................................28INTRODUOTERICA.............................................................................................................28METODOLOGIA...................................................................................................................29Reagentes........................................................................................................................29ProcedimentoExperimental............................................................................................29

RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................30CONCLUSES..........................................................................................................................33

SEQUENCIAODEDNA..................................................................................................35 OBJECTIVOS............................................................................................................................35INTRODUOTERICA.............................................................................................................35RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................36CONCLUSES..........................................................................................................................38

CLONAGEMDECDNAY-TUB.............................................................................................39 OBJECTIVOS............................................................................................................................39

INTRODUOTERICA.............................................................................................................39METODOLOGIA...................................................................................................................39Reagentes........................................................................................................................39Equipamento...................................................................................................................39ProcedimentoExperimental............................................................................................39

RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................40CONCLUSES..........................................................................................................................41

BIBLIOGRAFIA..................................................................................................................42

ANEXOS...........................................................................................................................43


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EXTRAODEDNAGENMICODEDROSOPHILA

MELANOGASTER

OBJECTIVOS

Isolamento e quantificao por

espectrofotometriadoDNAgenmico

da Drosophila melanogaster.

Avaliao dograu depureza doDNA

isolado e estudo dos efeitos de

diversos tratamentos, na integridadedoDNAgenmico.

INTRODUOTERICA

A Drosophila Melanogaster um

insecto usado emmuitos estudos na

rea da gentica, por apresentar 4

pares de cromossomas de grandes

dimenses que so formados por

vriasmultiplicaesdefilamentosdeeucromatina (cromatina

descondensada), facilitando a

visualizao microscpica dos

mesmos.Paraalmdisso,acromatina

possuiprolongamentosquepermitem

ummaiorcontactocomohialoplasma

estruturasdenominadasdepufes.

Este contacto vai permitir uma

ativaodeumamaiorrea deDNA.

Finalmenteestesseres,apresentama

vantagem da sua criao ser fcil e

barata, tm uma longevidade

pequena, uma taxa de reproduo

elevada e o seu genoma est bem

estudadoesequenciadonatotalidade.

ParaseefetuarumisolamentodeDNA

necessriorecorreraprocessosque

provoquem a lise das clulas e

permitam a purificao do mesmo.

Comalisecelulartodososcompostos

queintercelularessolibertadospara

a soluo e geralmente provocada

por rompimento mecnico ou se

necessrio, utilizando enzimas que

degradem a parede celular.

frequente utilizarem-se tambm

detergenteseassim,apurificaodo

DNA dar-se- com a libertao de

todososcompostosintercelularespor

precipitaes diferenciais e ao deenzimascomoprotaseseRNAases.

O DNA genmico obtido pelos

processos referidos anteriormente,

pode ser utilizado em variados

processos moleculares (Southern

blotting,bancosgenmicos,etc).Deve

serguardadosolubilizadoa70C(ou

20C). Porm, congelao e

descongelao sucessivas provocam

quebras nas cadeias de DNA. Ento,

para armazenamentos a longo prazo

convm ser guardado em alquotas

enquanto que a curto prazo,

aconselha-seapreservaoa4C.Para

o armazenamento, solubilizado em

tampo TE, onde o EDTA previne adegradaodoDNAporaoquelante

de metais pesados e caties que

promovem a quebra das ligaes

fosfodisterporaodasDNAases.

A electroforese em gel acionada porum

campo elctrico frequentemente

utilizada para separar e estimar o

tamanhodefragmentosdeDNA.Sujeitos

aumcampoelctrico,oscidosnucleicos

migramemdireoaoplopositivo,umavezqueapresentam carganegativaapH


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neutro. A agarose funciona como uma

rede cujos poros deixam passar mais

facilmente asmolculas mais pequenas,quevoportantomigrarmaisdoqueas

demaioresdimenses.Amigraodeum

fragmento de DNA depende da sua

conformao.

Deummodogeneralista,occcDNAmigra

mais rapidamente doqueos fragmentos

domesmo tamanho dedsDNA porque a

conformao circular tem menor raio

hidrodinmico (devido aos super-

enrolamentos).NoDNAcircular,comumaquebra numa ligao fosfodister, os

enrolamentos desaparecem pois h uma

quebradeumaligao fosfodister; este

facto torna-a a forma mais lenta de

migrao. A distncia de migrao dos

vriosfragmentosdependetambm

da voltagem aplicada e da concentrao

de agarose empregue. Pelas mesmas

razesdainflunciadopesomolecularna

mobilidade, o aumento da concentraoda agarose leva a um retardamento da

migrao electrofortica. A concentrao

de agarose a usar deve ser adaptada

gamadetamanhosdefragmentosquese

pretenderesolver.

Assim, em suma a distncia que o

fragmentopercorreuapartirdopontode

aplicao, comparada com a distncia

que outros fragmentos de tamanhos

conhecidos percorreram no mesmo gel.

Esses fragmentos so os ladders

(marcadoresdepesomolecular),misturas

de segmentos de DNA de tamanhos

variveis, e que so aplicados em um

poonogelnoinciodoprocesso.

Os gis de agarose so, geralmente,

corados com solues de brometo de

etdio(EtBr),umasubstnciaintercalante

que revela os cidos nucleicos aofluorescer sob luz ultravioleta.

Concentraesdeat1ngdeDNApodem

servisualizadas porexame diretodo gel

naluzultravioleta.

METODOLOGIA

REAGENTES

Usou-se tampo de lise e Brometo de

etdeo(mutagnicomuitoforte).

EQUIPAMENTOS

Recorreu-se a um espectrofotmetro.

Suporteparaogeldeagaroseefontede

alimentaoparaaelectroforese.

PROCEDIMENTOEXPERIMENTAL

A. Extrao de DNA genmico de

DrosophilaMelanogaster

Recolhadecercade200moscasadultas,

procendendohomogeneizaloem5ml

detampodelisepreviamentearrefecido

em gelo. Centrifugao a 1000 rpm ,

durante um minuto. Transferncia do

sobrenadante (correspondente

suspenso dencleos) para um tubo de

Falcon. Adio de 50 l de soluo de

proteinaseK(a10mg/ml)suspensode

ncleos e incubao a 37C durante 2

horas.

Isolamento de uma fraco de ncleos

isolados e ressuspendidos em 500 l.

Adio de 500 l de soluo de fenol

equilibrado em tampo TE ( 10mM Tris-

HCLpH8;1mMEDTApH8)suspenso

dencleos.Agitaoporinversodotubo

e centrifugao a 5000 rpm durante 2

minutos. Transferncia da fase aquosa

paraumnovotubo.Adiode500lda

mistura fenol/clorofrmio/lcool

isoamilico e agitar cuidadosamente porinverso do tubo. Nova centrifugao a


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Atravs da Lei de Lambert-Beer

calculada a concentrao de DNA na

amostra:

A=lc (1)

Assim:

!"# = 2,26gmL!!Uma vez que a diluio foi de 5L para

700L:

!"# = 316,4gmL!!Clculo dos pesos moleculares das

amostras

Figura 1 Electroforese em gel de

agarose.gDNA(DNAgenmico)(1),gDNA

vortexadointensamente(2);gDNAfervido(3); gDNA pipetada mltiplas vezes (4).

DNAplasmdico(5)(referenteaotrabalho

seguinteExtraodoDNAplasmdicoda

E.coli);marcadoresdeparesdebases(6).

Tabela 1 Distncias migradas pelas

bandas, respectivos pesos moleculares e

logaritmos.

dmigrada/mm PM/pb log(PM)

46,07 10000 4,000

49,88 8000 3,903

60,15 6000 3,778

65,65 5000 3,699

72,16 4000 3,602

77,91 3000 3,477

87,64 2500 3,398

95,54 2000 3,301

105,57 1500 3,176

119,51 1000 3,000

129,45 800 2,903

137,91 600 2,778

149,71 400 2,602

166,04 200 2,301

Figura2Logaritmodopesomolecular

emfunodadistnciamigrada

log(PM)=-0,0133dmigrada+4,5749R=0,9958

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

4,500

0 50 100 150 200

Log(PM)

dmigrada/mm


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Tabela2Distnciasmigradasporcada

banda nos poos de 1 a 5. Respectivo

clculodonmerodeparesdebasescombase na equao da reta obtida pela

regresso representada na figura 2. Os

valoresrelativosaopoo5serousados

naanlisedosdadosdoprximotrabalho.

Poo dmigrada/mm PM/pb

132,12120,56171,18

14051936199

2

33,45

120,10169,88

13490

950207

3 154,32 333

433,90121,82166,87

13305901227

5 141,00-174,13 501-182

CONCLUSES

A absoro de radiao ultravioleta por

parte dos cidos nucleicos a base da

metodologia utilizada para determinar o

graudepurezadoDNAequesedesigna

por mtodo espectrofotomtrico. Assim,

a quantidade que radiao ultravioleta

que absorvida relaciona-se

proporcionalmentecoma quantidadede

DNA da amostra. A amostra de DNA

genmico extrada de Drosophila

melanogaster,obtidacomumelevadograudepurezacomumaconcentraode

316,4g/mLepossucercade

Um mtodo alternativo seria um teste

utilizando fluorescncia induzida pelo

brometo de etdeo com posterior

comparaocomafluorescnciadeuma

srie de padres que apresentam uma

gama de fragmentos com vrias

dimenses. Cada barra corresponde a

umaconcentraodeDNAbemdefinida,

sendo por isso possvel a estimativa

quantitativa do DNA da amostra

relativamente a do padro (clivado comHindIII).

Ospoos1,2e4apresentamumabanda

correspondente a aproximadamente

13500 pb que corresponde, ento, ao

gDNA.Contudooaparecimentodeoutras

bandas nesses poos indicam a

contaminaodaamostra. Abandamais

intensa, provavelmente no ser uma

contaminao,dado queadeterminao

dograudepurezadogDNAresultounumvaloraprecivelparaapurezadaamostra

obtida. Assim poder tratar-se de gDNA

que sofre supercoiling e que, portanto,

apresentaumamaiordistnciapercorrida

no gele de agarose. A banda que mais

migrou corresponder, provavelmente a

contaminaes por RNA. Uma forma de

eliminar estas contaminaes, era

recorreraRNAsesquedegradassesoRNA

epurificassemassimaamostradegDNA.

EmrelaoaostratamentosaqueogDNA

foi sujeito, verifica-se que apenas a

fervurafoicapazdedestruiroDNA.Uma

vez que tanto os poos 2, como 4

apresentam um perfil idntico ao 1

(controlo).Ofactodopoo3apresentar

uma banda muito intensa que migrou

muito no gel, isto indica que o DNA foi

desnaturadoecortadoemvriaspores

fazendo com que se formassem vrias

pores de DNA com poucos pares debases(cercade300pb).Conclui-seento

queovortexaroupipetarrepetidamente

oDNAnoafeta,deformaalguma,asua

integridade.

Salvaguarda-sequearesoluodogelno

permite obter valores, relativos ao

nmero de pares de bases de cada

fragmento, quepossamser tomados em

considerao de forma absoluta. Temos

apenas dados comparativos e valoresaproximado


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EXTRACODEDNAPLASMDICODEESCHERICHEACOLI

OBJECTIVOS

Com este trabalho prtico pretende-se

preparar,empequenaescala,eparauso

de rotina, o plasmdeo pSK-polo de

Escherichiacoli.Destemodo,etendoem

conta a grande quantidade de DNA

cromossmico, necessrio separar eisolaroDNAplasmdicodabactria,para

asuafuturapreparao.

INTRODUOTERICA

Muitas bactrias, para alm do DNA

genmicocmcercade4milhesdepares

de bases, possuem DNA plasmdico em

grandes quantidades, chegando a alguns

milharesdeparesdebases.

Estas molculas, pequenas, so

constitudas por uma cadeia dupla de

cidosnucleicos,devidamenteassociados

entre si, de forma circular fechada

(cccDNA) e possuem replicao

autnoma. Estas caractersticas

morfolgicasfacilitamasuaseparaodo

DNA cromossmico. Para alm disso,

verificou-se que os plasmdeos contm

genesespecficosque,nabactriaqueospossui, codificam todo um conjunto de

informaes de elevada importncia a

nvelevolutivo.Assim,estasmolculasde

DNA, hoje em dia extremamente

manipuladas pelo homem, revelaram-se

bastante teis em Engenharia

Genticapelasuacapacidadedeconferir

fentiposvantajososevariados,taiscomo

resistncia a metais pesados, enzimas e

antibiticos, produo e catabolismo de

molculas orgnicas complexas e

aminocidos raros, bem como produo

deenzimasderestrio.

Paraalmdisso,dereferiracapacidade

detransmissodeplasmdeosparaoutros

hospedeirosdamesmaestirpeouestirpes

diferentes, pelo processo de conjugao

bacteriana, na qual o gene mob tem

especialimportncia.

Para usufruir das suas caractersticas

especiais, os plasmdeos originais das

bactrias foram alterados de modo a

aumentarasuaeficincianaclonageme

expresso gnica. Assim, surgiram novos

plasmdeoscomcaractersticasdiferentes

das originais: menor tamanho, maior

nmerodelocaisdeclonagemecpias,e

marcas seletivas convenientes, muito

teisemBiologiaMolecular.

So estes novos vectores plasmdicosde

clonagem ou de expresso que se

pretendemisolaratravsdatcnicaaque

orelatriodizrespeito.

Para ser separado o DNA plasmdico do

DNAcromossmico,necessrioinduzira

lise celular e, aps centrifugao dos

resduos resultantes, separar os dois

componentes.

necessria, tambm, uma

desproteinizao da soluo

anteriormentereferida,pararemoode

protenas associadas molcula, bem

comopassosadicionaisdepurificaoda

mesma.


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10

METODOLOGIA

REAGENTES

Utilizou-se meio de cultura LB; Tampo

STET;Lisozima;Isopropanoleagarose1%.

EQUIPAMENTOS

Incubadora;Vortex;microcentrfuga.


Inoculou-se,duranteanoite,aestirpeE.

coli com o plasmdeo a purificar.

Introduziu-se1,5mldaculturanumtubo

Eppendorf e centrifugaram-se as clulas

durante3 minutos velocidademxima.

Aspirou-se, ento, o contedo

sobrenadante com ajuda de uma

micropipeta. Adicionou-se 1,5 ml da

cultura bacteriana ao sedimento obtido

no processo e 200 l do tampo STET,

ressuspendendo-se o sedimento emvortexoucomamicropipeta.Adicioinou-

se4ldelisozima(50mg/ml)eincubou-

se durante 5 minutos temperatura

ambiente.

Posteriormenteprocede-seincubaoa

95Cdurante1minuto, centrifugaodo

lisado celular durante 10 minutos

velocidade mxima. Descarta-se o

sedimento e adicionam-se 200 l de

isopropanol ao sobrenadante e vortexa-

se. Segue-se uma centrifugao

velocidademxima, durante10minutos.

Recolhe-se o sobrenadante com uma

micropipetaeseca-seosedimentoa37C

na estufa durante 10 minutos.

Ressuspende-seoDNAem10ldegua

pura. Procede-se realizao de uma

electroforese em gel de agarose (1%).

Aplicaode5ldaamostramisturados

com5ldetampodeaplicao.

RESULTADOSEXPERIMENTAIS

Figura 3 Electroforese em gel de

agarose.gDNA(DNAgenmico)(1),gDNA

vortexadointensamente(2);gDNAfervido

(3); gDNA pipetada mltiplas vezes (4).

Isto referente ao trabalho prtico

Extraco do DNA genmico de

Drosophilamelanogaster.DNAplasmdico(5);marcadoresdeparesdebases(6).

CONCLUSES

De acordo com a imagem apresentada,

(Figura 3) podemos concluir que o

plasmdeo uma poro de DNA de

menor peso molecular que o DNA

cromossmico,tendoemcontaquefoio

material queapresentoumaiormigraono gel, o que est de acordo com o

esperado tendo em conta que estas

pores de material gentico so

pequenosfragmentosdeDNAbacteriano

deformacircular.

Poranlisedoresultadodaelectroforese

(Figura3Poo5),verifica-sequeoDNA

plasmdico foi separado do demais

material gentico da bactria, DNA

cromossmico,com sucesso. Isto porquenoseverificaoaparecimentodeoutras


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bandas no gel que pudessem indiciar a

presenadeoutroDNAouRNAqueesteja

a contaminar a amostra. Contudo nopodemosinferir,comtotalcerteza,acerca

dacontaminaoporRNA,umavezqueo

RNAmigraria para valores prximos dos

migradospeloDNAplasmdicoeabanda

detectada muito grande. A banda em

causa engloba fragmentos de cerca de

500a200pb,podendoportantoenglobar

RNA.Umaformadecertificaraausncia

de RNA na amostra era proceder aotratamento daamostra comRNAsesque

degradassem o DNA e repetir a

electroforese. Daqui, podemos ainda

concluir,queoDNAplasmdicoapresenta

aproximadamenteentre500a200pb.


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ANLISEELETROFORTICADEDNADIGERIDOCOMENZIMAS

DERESTRIO

OBJECTIVOS

Estudar a aco enzimtica de duas

enzimas de restrio (ER) EcoRI e

HindIIInadigestodeumaamostrade

DNA plasmdico e avaliar o resultado

dos cortes efectuados pelas

endonucleases atravs de uma

electroforeseemgeldeagarose.

INTRODUOTERICA

Os rpidos avanos da investigao

cientfica, em particular da Biologia

Molecular, que tiveram lugar nas duas

ultimas dcadas foram possveis em

grande parte, devido capacidade de

isolar determinados segmentos de

interesse de DNA procaritico eeucaritico.Aclonagemdegenesrequer

queasmolculasdeDNAsejamcortadas

deummodomuitoprecisoereprodutvel.

Atravs da utilizao das enzimas de

restrio esse objectivo facilmente

conseguido, pois possuem a capacidade

de ligao especfica a determinados

locaisdeDNAdecadeiadupla(sequncia

de reconhecimento) e sua posterior

clivagem,no interior dessa sequncia ou

adjacente a ela. De acordo com ascaractersticasdecorte,asendonucleases

de restrio so classificadas em trs

tipos.AsenzimasdotipoIeIII,paraalm

da aco nuclesica, tm aco

modificadora (metilao) no mesmo

domniode reconhecimentoda protena.

Apesar destas enzimas reconhecerem

sequencias especificas de DNA, a

actividade nuclesica ocorre de modo

aleatrionaproximidadedasequenciade

reconhecimentoedependentedeATP.

AcrescequeasenzimasdotipoIIIapenas

efetuammetilaonumadascadeias.Por

estasrazes,asenzimasdotipoIeIIIno

so frequentemente usadas em

investigao de rotina em Biologia

Molecular.

As endonucleases de restrio de tipo II

so sistemas binrios em que uma das

subunidades tem ao nuclesica e aoutra demetilao. Ambas as aes so

efectuadas em locais especficos dentro

dasequncia reconhecida. Amaiorparte

das enzimas de restrio do tipo II,

reconhecemsequnciascom48pares

de bases com simetria palindrmica. A

enzima EcoRI (produzida por Escherichia

coli) reconhece a sequncia GAATTC,

enquanto AluI (produzida por

Arthrobacter luteus) corta em AGCT.

Como h especificidade para o local decorte, estas enzimas podem ser usadas

paraadegradaodemolculasdeDNA

com obteno de fragmentos de menor

tamanho, cujas extremidades so

conhecidas em termos de sequncia

nucleotdica. As sequncias das

extremidades e o tamanho dos

fragmentos obtidos variam de acordo

comaenzimaderestriousada.

Dada apossibilidadedemanipulao emlocaisespecficosdoDNA,asenzimasde

restrio constituem nos dias de hoje,

ferramentas bsicas em Biologia

Molecular. Duma maneira geral, so

usadasparaoestabelecimentodemapas

de restrio de fragmentos deDNA cuja

sequncia desconhecida, fragmentao

de DNA genmico para separao

electroforticaeposterioranlise,criao

defragmentosdeDNAparasubclonagemnum vector apropriado e a criao de


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sondas marcadas para anlises porsouthernenorthern.

Existem trs tipos de extremidade

resultantes do corte consoante o modo

de corte da cadeia dupla. Enzimas de

restrioquecortamexatamentenomeio

da sequncia do palindroma (SmaI)

originamextremidadessemnenhumadas

duascadeiasprotuberante(bluntends).

Outras enzimas cortam na extremidade

5do palindroma reconhecido originandoextremidades protuberantes 5de 2-4

basesnaformadecadeiasimples(EcoRI)

denominadas por extremidades

5coesivas (5 sticky-ends). Outras

enzimas cortam na extremidade 3do

palindroma originando extremidades

protuberantes3de2-4basesnaformade

cadeia simples (KpnI) denominadas por

extremidades 3coesivas (3 sticky-

ends).

Comoestasenzimasderestrioso,na

sua maioria, especficas em relao

sequncia de reconhecimento e corte,

duas molculas de DNA diferentes que

foram digeridas com a mesma enzima,

por exemplo BamHI, possuiro

extremidades5iguaisquepodemassim

emparelhar utilizando as bases que

ficaramem cadeiasimples,numa reao

catalisada por uma DNA Ligase. O

resultado da ligao destasduas cadeias

serumamolcularecombinante.

Dois factores so essenciais para a

eficinciadecortedasendonucleasesde

restrio:purezadoDNAeotampode

digesto. As impurezas habituais

presentes em amostras de DNA

(protenas, fenol,clorofrmio,EDTA,SDS

eaelevadaconcentraodesais)podem

inibirporcompletodeterminadasenzimas

de restrio. A influncia de todos estesfactores varia de enzima para enzima,

peloquesedevemteremcontaquando

se verifica ausncia de atividade,

assegurando-se que as condies de

reaoforamasideais.

Os componentes essenciais dos tampes

dedigestoso:tampoTris(pH7.58.0),

iesdemagnsio,cloro,sdio,epotssio;

um agente redutor como ditioeritriol,

ditiotreitolou2-mercaptoetanol. Emborahaja especificidade da atividade em

relao a todos estes factores, o mais

importante a concentrao de ies

(fora inica). Assim, dividem-se as

enzimasemtrsgrupos:asquerequerem

elevadaforainica,mdiaforainicae

baixa fora inica. Esta propriedade

particularmente importante para

digestescomvriasenzimasderestrio

em que impossvel a digesto

simultnea com enzimas que requeremforasinicasdiferentes.Nestescasos,as

digestesdevem serfeitas emseparado,

comeando pela enzima demenor fora

inica, desnaturar a enzima por calor,

ajustaraconcentraodesaiseproceder

segundadigesto.Asconsequnciasdo

usodecondiesnoideaisemdigestes

comenzimasderestriosoaausncia

de atividade ou o fenmeno de star

activity em que a enzima perde aespecificidade para a sequncia de

reconhecimento,passandoa fazercortes

nosnoslocaisespecficosmastambm

noutroslocais.

Um factor que pode ser importante em

alguns casos o grau de metilao do

DNA.Aproduodeenzimasderestrio

ummecanismodedefesadasbactrias

contraainfecoporDNAexgeno.Para


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precaver a ao contra o prprio DNA,estas enzimas de restrio promovem a

metilaodenucletidos,ficandoentoa

sequncia de reconhecimento imune

suaao.Assim,quandosetrabalhacom

DNA plasmdico proveniente de estirpes

bacterianascomumaelevadacapacidade

de metilao, deve-se ter em ateno,

tambm,asensibilidadedaenzimaausar

para a metilao dos nucletidos da

sequncia de reconhecimento. A

estratgiamaisusadaousodeestirpesbacterianas manipuladas geneticamente

paraaperdadessacapacidade.

METODOLOGIA

REAGENTES

Utilizou-se 3 L de soluo enzimas de

restrioEcoRIeHinIIIestasdevemser

mantidas em gelo durante a actividadeprtica, sendo depois armazenadas a -

20C;11LdeplasmdicopSK-polo;6L

detampodeenzimaderestrio5x;0,4

g de agarose; tampo TAE 1x; 1 L de

brometodeetdio;5Lmarcadordepeso

molecular Bioline; 20L de tampo de

aplicao; 44 L de gua destilada e

esterilizada.

EQUIPAMENTOS

Utilizou-se umaestufa, um suporte para

geldeagarose,umafontedealimentao

paraaelectroforeseeumtransiluminador

deUV.


Pipetar para dois tubos Eppendorf,

usando pontas de pipeta diferentes e

limpas, 15l de gua destilada e

esterilizada,2ldetampodeenzimade

restrio5,2ldeDNAplasmdicoe1l

de enzima de restrio, poresta ordem,

em que no tubo 1 adiciona-se apenas

EcoRI, e no tubo 2 adiciona-se apenas

HindIII. Preparar uma terceira soluo,

pipetando 14l de gua destilada eesterilizada,2ldetampodeenzimade

restrio5,2ldeDNAplasmdicoe1l

de cada enzima de restrio Misturar

cuidadosamentebatendolevementecom

odedonofundodotubo.Incubara37C

durante1hora.

Preparaodogel1%deagarose:

Pesar0,4gdeagaroseeadicionar40mL

detampoTAE1x.Aqueceratebuliode forma a dissolver completamente a

agarose. Adicionar 1 L de brometo de

etdeo, agitar levemente e verter a

soluosobreummolde,utilizando-seum

pente para a formao dos poos, onde

sero colocadas as amostras de DNA. O

gel deixado arrefecer para que

solidifique.Removeropenteecolocaro

gel na tina de electroforese submergido

emtampoTAE1.

Preparao das amostras em tubos

Eppendorfparacarregarogel:

No primeiro adicionar 5 l de DNA no

digeridoe5ldetampodeaplicao;no

segundoadicionar20ldeDNAdigerido

comHindIIIe5ldetampodeaplicao;

no terceiro adicionar 20 l de DNA

digeridocom EcoRIe5ldetampode

aplicao; No quarto adicionar 20 l de


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15

DNAdigeridocomHindIIIeEcoRIe5ldetampodeaplicao.Carregarogelcom

as quatro amostras, carregando um

quinto poo com 5 l de marcador de

pesomolecular.Correrogela100Vata

frentedogelchegaracercadedoisteros

do gel. Visualizar o DNA num

transiluminadordeUV.


Aps a electroforese obteve-se os

resultadosapresentadosnafigura3.

Figura 4Geldeagarose1%corridoa

100V. Da direita para a esquerda:marcador de pesos moleculares; DNA

plasmdico por digerir; DNA plasmdico

digerido com HindIII; DNA plasmdico

digerido com HindIII e EcoRI; DNA

plasmdicodigeridocomEcoRI.

Tabela2Valoresreferentesaospesos

moleculares do marcador Bioline em

pares de bases, distncia migrada de

cadabanda, em cm, e ao logaritmo dospesosmoleculares.

PM/pb dmigrada/cm Log(PM)

10000 2,40 4,00

8000 2,65 3,90

6000 2,85 3,78

5000 3,09 3,70

4000 3,30 3,60

3000 3,79 3,48

2500 4,10 3,40

2000 4,48 3,301500 5,05 3,18

1000 5,95 3,00

800 6,40 2,90

600 6,92 2,78

400 7,12 2,60

200 8,68 2,30

A partirda aplicaoda regresso linear

da distncia migrada (d) em funo do

logaritmodospesosmoleculares(logPM)

obtm-seaseguinteequao:

dmigrada=-3,811log(PM)+17,27(1)

Aplicando a equao (1) s bandas

correspondentessamostrasobtm-seos

pesos moleculares apresentados na

tabela3.


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Tabela 3 Valores referentes sdistncias de migrao das bandas das

amostras e aos respectivos pesos

moleculares.

dmigrada/cm PM/pb

Controlo2,50 7510

3,85 3322

HindIII 2,92 5827

HindIII+EcoRI

3,13 5132

3,50 4104

5,50 1226

EcoRI3,51 4079

5,40 1302

CONCLUSES

Analisando o gel, pode-se verificar a

presena de duas bandas no poo do

DNA plasmdico controlo e ainda uma

terceira, pouco visvel. O que seria deesperareraobter-se3bandasdistintas,

referentes s 3 formas de DNA

plasmdico:DNAcircular,DNAlinearde

cadeiaduplaeDNAsuperenrolado.

NoquedizrespeitoaoestudodoDNAdigerido com diferentes enzimas de

restrio, pode-se concluirquea EcoRI

possui duas zonas de corte no

plasmdeorecombinante,oqueorigina

duas bandas no gel, com pesos

molecularesde4079pbede1302pb.

Em relao enzima HindIII conclui-se

queestacortaoplasmdeoapenasuma

vez,fazendocomqueestepercaasua

conformao circular e adquira umaconformao linear, levando ao

aparecimentodeapenasumabanda.

No caso da digesto doDNA plasmdico

com as duas enzimas, observa-se trs

bandas, o que concordante com o

esperado, dado que a insero do gene

polofoifeitaentreumcorteda EcoRIeo

corte daHindIII. Assim, pode-se concluir

queofragmentoinseridocorrespondente

ao genepolo possui um peso molecular

deaproximadamente1302pb.


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Figura7Eletroforeseondeseinseriuo

fragmentoR.

Figura8Eletroforeseondeseinseriuo

fragmentoL.

Com os valores das distncias migradas

pelasbandasdecadaamostranogel(cm)

e substituindo esses resultados na

equao da reta do grfico da figura 6

traado com os dados do marcador,

obtm-se os pesos moleculares dasbandasnogel.

Tabela 5 Enzimas de restrio

utilizadas, distncias migradas e

respectivospesosmolecularesdasbandasdosfragmentosReL.

CONCLUSES

Construo do mapa de restrio do

fragmentoL

O plasmdeo pGEM-3 sem o fragmento

inserido tem 1742 pb. O seu peso

molecular foi determinado atravs do

pesomoleculardofragmentoobtidopelo

cortecomaenzimaderestrioBamHI.O

plasmdiocomofragmentoLpossu3704

pb. Os valores das determinaes so

aproximados porque as medidas esto

carregadascomerrossignificativoseisso

propaga-se em todas as operaes,

ocorrendodesviosatdezenadepb.

SabendoquetantoofragmentoLcomoo

R foram inseridos com a enzima de

restrioSalIpossvelconstruiromapa

derestriodoplasmdeo.

EnzimaFragmentoL FragmentoR

d/cm Peso/pb d/cm Peso/pb

pGEM3xBamHI

3,8 1742 3,2 2881

SalI1 3,6 2060 3,5 2240

SalI2 3,7 1895 3,6 2060

HindIII1 3,4 2436 3,1 3133

HindIII2 4,2 1246 5,1 586

PstI1 3,3 2649 3,1 3133PstI2 4,3 1146 4,7 820

XhoI1 3,1 3133 3,0 3406

XhoI2 5,0 637 4,8 754

PvuII1 3,0 3406 3,4 2436

PvuII2 5,9 300 3,7 1895

SacI 2,9 3704 2,8 4028

Xho/SacI1 3,5 2240 3,0 3406

Xho/SacI2 4,3 1146 4,8 754

Xho/SacI3 5,0 637 7,0 119


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Relativamente enzima HindIII pode-se

concluir que esta corta duas vezes

obtendo-sedoisfragmento,umcom2436pbe o outro com 1246 pb. Esta enzima

cortaopGEM-3naposio7eumaoutra,

originado duas bandas, ento ter de

possuir um outro local de corte no

fragmento inserido. Assim, o segundo

local de corte da HindIII ser a 1228pb

(1246 pb + 7 pb) do primeiro local de

corte.

Quanto Pst I , verifica-se que tambm

cortaduasvezesofragmento,tendoumdos fragmentos 2649pb e ooutro 1146

pb. Sabe-se que este enzima corta o

pGEM-3naposio23pb,ento,ooutro

localdecortedaPstIsera1146pbdo

primeirocorteeterdesernofragmento,

peloqueocorrernaposio1169pb.

Com a enzima PvuII tambm se obtm

duas bandas, o que significa que corta

duas vezes o fragmento, sendo que um

dosfragmentostem3406pbeoutro300pb.Sabe-sequetemumlocaldecortena

posio104pbdovetor,peloquecomo

fragmento inserido, este local ocorre na

posio 2164 pb do vetor com o

fragmento L.O outro localde corte ter

de ocorrer, obrigatoriamente, no

fragmentoL,assimirocorrernaposio

1864pb(2164pb300pb).

Relativamente enzima Sal I (utilizada

para inserir o fragmento no plasmdeo),

verifica-se o aparecimento de duas

bandasmuitoprximasumadaoutrano

geldeelectroforese,oquenosindicaque

o fragmento e o vetor devero ter um

tamanho muito aproximado e pesos

molecularesde2060pbe1895pb.

AenzimaSacIoriginaapenasumabanda

nogeldeagarosee sabe-seque cortao

vetornaposio56pbpeloquecortaroplasmdeonaposio2085pb.Assim,no

ternenhumcortenofragmentoinserido.

O peso molecular relativo a esta banda

(3704 pb) o tamanho do plasmdeorecombinante(vetor+fragmento).

Sabe-se que a enzima XhoI no corta o

vetor,oquesignificaqueasduasbandas

que aparecem no gel correspondem a

dois locais de corte no fragmento. Dos

dados obtidos conclui-se que corta em

dois locais originando fragmentos com

3133pbe637pb.Paraselocalizarosdois

locaisanteriormentereferidosrecorresse

anlise dos resultados obtidos para asbandas respetivas digesto dupla com

as enzimas de restrio XhoI e SacI,

partindo j da informao de que esta

ltima apenas corta o pGEM-3. Sabe-se

que estas duas enzimas juntas cortam o

plasmdeoemtrslocais,a2240pb,1146

pbe637pb.TendoemcontaqueaSacI

cortaoplasmdeonaposio2116pb,um

doslocaisdecortedaXhoIsera970pb

(2116 pb - 1146 pb). O outro local de

cortepelaXohIacontecenaposio337

pb(970pb637pb).

O mapa de restrio obtido encontra-se

apresentadonafigura9.

Construo do mapa de restrio do

fragmentoR

RelativamenteaofragmentoRprocedeu-

sedomesmomodoparaaconstruodo

mapaderestrio.Dadoqueasenzimasderestriousadasforamasmesmaseo

vetor o mesmo. Assim o mapa de

restrioobtidoencontra-seapresentado

nafigura10.


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Figura 9 Mapa de restrio do plasmdeo construdo a partir do vetor pGEM3 e do

fragmentoL.

Figura 10Mapade restrio doplasmdeo construdo a partir do vetor pGEM3e do

fragmentoR.


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DISCUSSO

Com a realizao desta atividade

conseguiu-se analisar segmentos deDNA

distintoscortados comvriasenzimasde

restrio,bemcomocompreenderquala

dimenso dosmesmos por comparao,

relativamente a um padro conhecido.

Para isso, teve-se em ateno o grfico,

querelacionaocomprimento(cm)como

nmero de pares de bases

correspondentes. Assim, por existir uma

dependncia/necessidade de determinarcomamaiorexatidopossvelonmero

deparesdebasesnumsegmentodeDNA,

acorretaelaboraodogrficotambm

fundamental. Assim, o rigor do modelo

ser proporcional ao nmero de

fragmentos considerados, cuja migrao

no gel de agarose foi analisadaanteriormente.Portanto,paradeterminar

o nmero de pares de bases que

compem os fragmentos contidos nos

diversospoos,utiliza-seumaladderque

permite estabelecer a comparao com

basenumaproporcionalidadedireta.

Atravs da elaborao do mapa de

restrio de ambos os fragmentos foi

possvel visualizar de forma esquemtica

o processo de corte de cada uma dasenzimas.


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23

PCRPOLIMERASECHAINREACTION

OBJECTIVOS

AmplificarumasequnciadeDNAgenmito

(gDNA) e de uma sequncia de cDNA,

amabas sequncias do genepolo, porPCR.

Anlise da eficincia e caractersticas do

gDNAedocDNAporelectroforese.

INTRODUOTERICA

AtcnicadePCR(reaodepolimeraseem

cadeia) o mtodo mais usado e rpido

paraaamplificaodecertosfragmentosde

DNA ou RNA em sistemas in vitro. Esta

tcnica, como a de clonagem molecular,

permitiu o desenvolvimento da Biologia

Molecular. A PCR uma tcnica com uma

vastagamadeaplicaes,quevodesdea

clonagem de DNA ou de cDNA (DNA

complementar), ensaios de mutaes in

vitro, engenharia gentica, anlise deamostras forenses, determinao de

agentesinfecciosos,diagnsticodedoenas

genticasatsequenciaodiretadoDNA

genmicoedocDNA.

A tcnica de PCR baseia-se na atividade

catalticadeumaDNApolimeraseerequera

existncia de dois iniciados

oligonucleotdicos (primers) que se

encontramnasextremidadesdo fragmento

de DNA a ser amplificado, a designadasequncia alvo. Para alm disso, a soluo

onde se encontram as DNA polimerases,

DNAeprimerssubmetidaavriosciclosde

aumento e abaixamento da temperatura.

Assim, em cada ciclo promove-se a

desnaturaodoDNAdecadeiaduplapelo

aquecimento, hibridam-se os primers s

sequncias complementares e por fim

ocorre a extenso dos primers por

incorporao de nucletidos por ao dasDNA Polimerases. Os nucletidos so

adicionadossextremidades3dos primersseguindo a complementaridade das bases

doDNAinicialqueservedemolde.Assima

nova sequncia formada pode agora servir

de molde para futuros ciclos, dando azos

para um aumento exponencial da

quantidade do material gentico. O

tamanhodascadeiasdeDNAqueseformam

sero sempre de tamanho bem definidos

dadoqueterminamtodosnasextremidades

5dosprimersutilizados.

Apesar de se tratar de uma tcnica com

elevada aplicabilidade e rendimento,

existemvrios parmetros que tm de ser

optimizadosdemodoaqueareaoocorra

deformacorreta.Porm,oparmetroque

considerado mais complexo do ponto de

vistadaoptimizaodatcnica,trata-sedo

desenhodosprimersadequados.Assim,um

bom desenho dos primers fundamental

para gerir damelhor formao oramentoepoupar tempo, dadoque ouso deprimers

adequadosaumentarosignificativamenteo

rendimentodareao.

Paraumbomdesenhodosprimersexistem

algumasregras,queemboraalgumassejam

empricas, apresentam resultados bastante

satisfatrios. Um dos fatores mais

importantes que o primer tenha uma

sequncia nucleotdica que seja nica na

regioalvo,demodoaevitaraligaoemmltiplos locais da zona a amplificar.

Comummente,a sequncia doprimerdeve

ser perfeitamente complementar

sequncia de bases da cadeia de DNA

molde.Outrofatorimportanteacolocao

de um resduo de guanina ou citosina na

terminao 3 do primer, isto porque a

ligao queseformaajudanacorreta

hibridao, pois tratam-se de resduos que

estabelecem trs pontes de Hidrognio e

portanto fortalecem a ligao estabelecida.


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24

Contudo sequncias que possuam trs ou

mais guanina (G) ou citosinas (C) deve ser

evitado, pois em caso de emparelhamentoerrneo,torna-semaisdifcilasuaremoo

para uma nova tentativa, dada a fora da

interaoformada.Nodesenhodosprimers

deve ter-se em ateno possibilidade de

emparelhamentoentreosprpriosprimers,

assim dever-se- ter em linha de conta

possveissequnciascomplementaresentre

diferentesprimers. Se houver uma grande

probabilidade de emparelhamento entre o

pardeprimersutilizado,aocorrnciadeste

fenmeno ser superior das reao de

PCR,dadaaprefernciascomqueocorrem.

Ainda dentro dos estudos de

complementaride dos primers, estes so

devemtersequnciascommaisde4bases

quepossamsercomplementaresdentrodo

mesmo primer, pois impulsionaria a

formao de estruturas por auto-

complementaridade, estruturas secundrias

(hairpins). Como j foi referido a

composio de bases dos primers muitoimportante,daqueumprimernodever

ter menos de 17, nem mais do que 25

nucletidos e o contedo em guanina e

citosinasdeveestarentre45a55%.Outro

aspectoimportanteatemperaturaqueos

diferentesprimersdentrodeummesmopar

hibridam,dado queessa temperatura deve

ser muito semelhante (Tm). Esta

temperatura pode ser calculado com base

naequao1enodevediferiremmaisdo

que5Centrecadaprimerdentrodeumparautilizar.

!= ! + ! 4 + ! + ! 2 (1)

No que diz respeito execuo

experimental propriamente dita, existem

alguns cuidados a ter em conta como a

utilizaoduma concentraoadequadade

Cloreto de Magnsio (MgCl2), dado que o

Mg2+umco-fatorimportantenaativao

da polimerase e ainda importante naestabilidadedascadeiasdeDNA(carregadas

negativamente). Neste tipo de tcnica

necessriorecorreraDNApolimerasesque

sejam resistentes s variao detemperatura que ocorrero durante os

ciclos, da usar-se frequentemente a Taq

DNA Polimerase (DNA polimerase

termoestvel) que extrada da bastria

Thermus aquaticus pois trata-se de uma

bactria extremfila encontrada em

ambientes aquticos a elevadas

temperaturas.

METODOLOGIA

REAGENTES

Utilizou-se 1ng de cDNA; 5ng de gDNA;

solues de 0,1 mol dm-3 dosprimers 9R1

(sense primer) e 9R2IC (antisense primer);

soluo de dNTPs com a concentrao de

200 mol dm-3; tampo de reao 1x;

soluo aquosa de MgCl2; Taq DNA

polimerase: 0,25U; gua estril ultrapura.

Para a electroforese utilizou-se agarose;

Brometo de etdeo (potencialmente

cancergeno;manusearcomluvaseevitaro

contactocomasviasrespiratrias).

EQUIPAMENTOS

Recorreu-seaumamplificadortermocclico

para efetuar o programa de ciclos para as

reaesdePCRecentrfuga.Suporteparao

geldeagarosee fontede alimentaoparaaelectroforese.


PreparaodomeioreacionalparaPCRde

gDNA

ParaumtubodePCRpipetar1Ldasoluo

degDNA;5Ldetampodereao;1Lde

cadauma das soluesdeprimers; 4Lda

soluo de dNTPs; e 6L da soluo deMgCl2. Adicionar gua para perfazer um


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25

volumetotalde50L(tendoemcontaque

se ir adicionar,posteriormente, 0,25Lde

Taq DNA Polimerase), assim deve seradicionado um volume de gua estril de

31,75L.Misturarsuavementeamisturae

centrifugar.Adicionar0,25Ldasoluode

Taq DNA polimerase e misturar muito

suavementecomapontadapipeta.

PreparaodomeioreacionalparaPCRde

cDNA

Repetir o procedimento anterior, com a

exceodaadiode1LdegDNA,queemvez disso, dever ser adicionado 1L da

soluodecDNA.

Colocar ostubos dePCR embanho a 95C

durante 5 minutos. Segue-se o

acondicionamento dos tubos de PCR no

suporte do aplificador termocclico e

programar 15 ciclos. Cada ciclo dever

compreenderumperodode15segundosa

94C(promoveadesnaturao),seguidode

30segundosa50C(hibridao)e1minuto

a 72C (extenso). Aps o ltimo ciclo, as

amostrasdeveroficar10minutosa72C.

Retirar os tubos do amplificador

termocclicoeacondicion-losa4C.

Aplicarasamostrasemgeldeagarosea1%.


DESENHODOSPRIMERS

Oprimer9RI(senseprimer)foiobtidocom

basenasregrasdefinidasnaintroduoeobtido diretamente a partir da sequncia

53.

J o primer 9R2IC (antisense primer)

obtidoapartirdasequnciadaextremidade

opostaecomoterdepolimerizarnacadeia

oposta,oprimer,terdesercomplementar

sbasesquecompeasequnciaescolhida.

Extremidade5dasequnciasensedaporoaamplificar

5AGCTATGCTATGCTATGCTAGCCAGTCAGCTGAACGTG3 Sequnciasense

5TATGCTAGCCAGTCAGC3 Primersense

Extremidade3dasequnciasensedaporoaamplificar

5TCTAATTCCAAGCCAATTGCCAAAAAGGAACCG3 Sequnciasense

3AGATTAAGGTTCGGTTAACGGTTTTTCCTTGGC5 Sequnciaantisense

3CGGTTAACGGTTTTTCC5 Primerantisense

O primer sense constitudo por 17

nucletidos, dos quais 9 so guanina ou

citosinas (53% de G/C) e apresenta uma

Tm=52C(calculadocombasenaequao1.

Para o primer antisense, o nmero de

nucletidos o mesmo (17), possu 8guaninas ou citosinas (47% de G/C) e

apresenta uma Tm=50C. Assim o par de

primers escolhido por ser usado para PCR,

dado que possuem um nmero de

nucletidosaceitvel,apercentagemdeG/C

estdentrodosparmetrosestipulados,ea

Tmdifereapenasem2Centrecadaumdosprimers.


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27

Combasenaequaodaretadeterminadae

nas distncias migradas pelas bandas do

cDNA (dmigrada=16,0 mm) e do gDNA(dmigrada=15,4 mm) possvel determinar o

nmerodeparesdebasesdecadaumdos

fragmentos,Tabela2.

Tabela 7 Valores referentes migrao

docDNAedogDNAemgeldeagarosea1%

erespectivonmerodeparesdebases.

dmirada

/mm pb

cDNA 16,0 463

gDNA 15,4 546

Como seria de esperar, o cDNA apresenta

um menor nmero de pares de bases

(menos83pb)doqueocorrespondegDNA.

IstoporqueocDNAobtidoatravsdeuma

transcriptase reversa a partir do mRNA

correspondente. Ora, o mRNA sofre um

processo de splicing ps transcrio demodo que os intres so removidos e

portanto, leva ao encurtamento da

sequncias de mRNA e consequente

encurtamentodasequnciadecDNA.Assim

podemosinferirquecercade80pbdogene

polo correspondem a intres e que no

codificamparaaprotena.

CONCLUSES

No que diz respeito ao desenhos dos

primers, estes seguem todas as condies

para optimizarem a reao de PCR, para

almdosrequisitosquesatisfazemequej

fora supracitados, apresentamainda pouca

probabilidade deemparelharem um com o

outro, para almde que no existemmais

doque3guaninasoucitosinasconsecutivas

emcadaumdosprimers.

O DNA genmico (gDNA) composto por

intres,exesefragmentosqueregulama

expresso gnica. Porm, apenas os exescontminformaoparaasnteseproteca,

dado que os intres so transcritos para

mRNA mas so eliminados durante o

processo de splicing domRNA.Assim de

esperar que o mRNA tenha menos bases

queoogDNAquelhedeuorigem.Comoo

DNAcomplementar(cDNA)obtidoapartir

do mRNA por ao enzimtica de uma

transcriptase reversa, esta poro de DNA

terumnmerodebasesinferioraogDNA

inicial, da o cDNA migrar mais do que o

gDNAemgeldeagarose.

Detectou-seainda amigrao demais trs

fragmentos diferentes no poo carregado

comgDNA,istodeve-seaestruturasdeDNA

com elevado efeito de supercoilling que

apresentamumamenor distnciasmigrada

no gel. Contudo, estas e a outra banda

detectvel no poo carregado com cDNA

podem dever-se a contaminaes do

material gentico utilizado. No que diz

respeito intensidade das bandas, esta

uma boa forma de avaliar a eficincia da

PCR qualitativamente. Verifica-se que a

banda correspondente ao gDNA deveras

mais intensa doque a decDNA, isto pode

estar relacionado com temperaturas que

noseajustavamtobemamplificaodo

cDNAcomooqueaconteceucomogDNA.

Pode aindapensar-se quea quantidadede

Mg2+ adicionada foi demasiado elevada equelevouaumasobreatividadedaTaqDNA

polimerase e que aumenta a

inespecificidade da tcnica, diminuindo a

eficincia e aumentanto o nmero de

bandas correspondentes a bandas no

desejveis.


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28

TRANSFORMAODEESCHERICHIACOLICOMDNA

PLASMDICO

OBJECTIVOS

Transformar E.coli com DNA plasmdico.

Transformar as clulas com plasmdeo

pBR322, pBR322-CAT, pEMBL9 e pEMBL9-

CAT.Avaliaraeficinciadatransformao.

INTRODUOTERICA

Define-se como transformao o processo

de introduo de DNA em clulas. Esta

tcnica atualmenteamplamenteutilizada

paraaamplificaodecertosfragmentosde

DNA.Aprimeiradescriodetransformao

deE.coliaconteceucercade40anosatrs

quando Mendel e Higa demonstraramque

clulas de E.coli tratadas com solues

geladas de cloreto de clcio, seguidas de

aquecimento, eram capazes de importarpara o seu interiorDNAdobacterifago .

Apesar de no se perceber muito bem o

mecanismo, a verdade que bactrias

sujeitasabaixastemperaturasemsolues

comcatiesficamcapazesdeimportarDNA

exgeno. Ao longos dos tempos tm sido

feitosvriosensaiosnosentidodemelhorar

a eficincia do processo, contudo nem

sempresepercebeofundamentopordetrs

detaisexecues.

Neste trabalho recorrer-se- ao cloreto de

clcio de modo a tornar as bactrias

competentes na importao do DNA. O

cloreto de clcio liberta caties clcio em

soluoqueneutralizamascargasnegativas

doDNAeajudam-noamigrarparaointerior

das bactrias. O choque trmico que se

sucede desorganiza momentaneamente as

membranas e faz com que o DNA consiga

migrar para o seu interior. As bactrias

crescem ento em meio no seletivo edepoissotranspostasparameiosseletivos.

Aeficinciadatransformaoobtidapela

razodetransformantesporgdeDNA.Nas

transformaes com cloreto de clcio

podem ser obtidas eficincias superiores a

108 transformantes por g de DNA. No

entanto, no laboratrio de rotina de

esperar valores na ordem dos 106-7

transformantesporgdeDNA.Paraquea

eficincia seja mxima necessrio ter

alguns pontos em considerao como arecolhadasbactriasnafaseexponencialdo

seucrescimento,manterasclulasemgelo,

prolongarotempodecontactoentreDNA,

cloreto de clcio e clulas e usar material

limpoereagentespuros.

Aps o choque trmico, adicionadomeio

noseletivoeprocede-seaumaincubao

de 30 a 60 minutos a 37C para que seja

expressoogenederesistnciaaoantibitico

(Amp). Ter de haver protena suficiente

antes das colnias serem plaqueadas em

meio seletivo. A enzima que confere a

resistncia a -lactamse que degrada o

antibitico.

Neste trabalho foram usados dois

plasmdeosdiferentesoclssicopBR322na

sua forma original contm os genes

responsveis pela resistncia ampicilinae

tetraciclina. Este plasmdeo foi tambmmodificado dando origem ao pBR322-CAT

por isero do gene CAT no local do gene

quecodificaparaaresistnciatetraciclina,

desativando-o. O segundo plasmdeo

utilizadoopEMBL9pertenceaumanova

gerao de vetores onde a insero dos

fragmentos de DNA ocorre num polylinker

localizado na extremidade 5 do gene que

codificaparaagalactosidase.Oplasmdeo

contm todos os elementos do promotor

necessrio para a induo da expressodesta enzima, quando na presena de


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Tabela 8 Volumes das solues

preparadas acima que foram plaqueadas e

respectivosmeios de cultura utilizados. Ostubos 1, 2, 3 e 4 correspondemaos tubos

preparados acima com os plasmdeos

pEMBL9, pEMBL9-CAT, pBR322 e pBR322-

CAT, respectivamente. O tubo 5

corresponde apenas soluo de clulas

competentes resultante do procedimento

A..

Tubo Volume/L Meiodecultura

1 125 Mac/Lac/Amp

LA/Amp2 Mac/Lac/Amp

LA/Amp

3 LA/Amp/Tet

LA/Amp

4 LA/Amp/Tet

LA/Amp

5 La/Amp

As placas so ento incubadas a 37C

durante a noite. Procede-se ento

contagem das colnias e toma-se nota das

suascoresnasplacasMac/Lac.

Para induzir a expresso do gene CAT e

testar a resistncia das clulas ao

cloranfenicol, procede-se transferncia,

com palitos esterilizados, de 10 colnias

individuais, dos meios anteriores, para

novos meios. Assim dever-se- tranferircolnias referentes ao pEMBL9, pEMBL9-

CAT e pBR322-CAT a partir dos meios

LA/Amp para placas (diferentes) com os

meios Mac/Lac/Clo. As placas so ento

incubadasa37Cduranteanoite.Verifica-se

entoocrescimentodascolnias.


As figuras abaixo correspondem s placasincubadasa37Cduranteumanoite.

Figura 13 Placa com meio de cultura

LA/Amp.ControloTubo5.

Figura 14 Placas com meio de cultura Mac/Lac/Amp (esquerda) e LA/Amp (direita).

CorrespondeincubaodasbactriascomoplasmdeopEMBL9Tubo1.


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Figura 15 Placas com meio de cultura Mac/Lac/Amp (direita) e LA/Amp (esquerda).

CorrespondeincubaodasbactriascomoplasmdeopEMBL9-CATTubo2.

Figura 16 Placas com meio de cultura LA/Amp/Tet (esquerda) e LA/Amp (direita).

CorrespondeincubaodasbactriascomoplasmdeopBR322Tubo3.

Figura 17 Placas com meio de cultura LA/Amp/Tet (direita) e LA/Amp (esquerda).

CorrespondeincubaodasbactriascomoplasmdeopBR322-CATTubo4.


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Figura 18 Placas com meio de cultura

Mac/Lac/Clo. Corresponde incubao das

bactrias com o plasmdeo pEMBL9previamenteincubadasemLA/Amp.


Mac/Lac/Clo. Corresponde incubao das

bactrias com o plasmdeo pEMBL9-CAT

previamenteincubadasemLA/Amp.


Mac/Lac/Clo. Corresponde incubaodas

bactrias com o plasmdeo pBR322-CATpreviamenteincubadasemLA/Amp.


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resultado esperado para as bactrias com

pEMBL9 e pBR322-CAT porque o pEMBL9

no possu o gene que codifica para aclornfenicol acetil transferase e que

portanto no consegue degradar o

antibitico. As bactrias com pBR322-CAT,

apesardeteremogeneCATnoconseguem

express-lo porque falta-lhes os elementos

do promotor para a transcrio. Seria de

esperar que as bactrias compEMBL9-CAT

expressassemo gene CATporquepossuem

os elementos do promotor necessrios e

encontravam-se em condies com o seu

indutornatural,alactose.Ofactodenose

ter verificado o crescimento de bactriasnestemeiopodetersidocausadopelomal

acondicionamento das colnias, m

transfernciadascolniasdomeioLA/Amp

para o meio com clornfenicol, as colnias

transferidas no eram resistentes ao

clornfenicol, podendo at pensar-se que a

lactosenosejaoindutordaexpressodo

geneCATnoplasmdiopEMBL9.


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SEQUENCIAODEDNA

OBJECTIVOS

SequenciarumgenepelomtododeSanger.

Isolar uma protena por mtodos

bioqumicos e determinao dos primeiros

10aminocidos(N-terminal).Istopermiteo

desenho de primers degenerados que

podemserusadosnaaplificaodocDNAna

bibliotecagenmica(cDNA).

INTRODUOTERICA

Aclonagemapenasoinciodoestudode

um gene, posteriormente procede-se

anliseestrutural e funcionaldessemesmo

gene.Asequenciaodeumgeneumadas

etapas mais importantes na caracterizao

genmica, dado que oferece informao

acerca da estrutura gentica. O passo

decretrioparaasequenciaodoDNAacapacidade de obter fragmentos bem

definidos de DNA. Isto justifica a relao

estreitaentreaclonagemeasequenciao

e um gene, uma vez que a clonagem

possibilitaaobtenodumelevadonmero

de amostras do fragmento deDNA que se

pretendeestudar.

No mbito das tcnicas de DNA

recombinante,muitoimportanteconhecer

asequnciadogeneparaquesepossafazero devido manuseamento posteriori.

Normalmente, depois de sequenciado o

gene, a sequncia introduzida e corrida

por um software que procura os locais de

restrio, oferecendo assim um estudo

detalhadodetudodogeneemestudo.Estas

informaes so muito importantes, por

exemplo, se quisermos utilizar o gene em

causa como vetor para expresso proteica

ou subclonagem. A sequncia analisada

por software de modo a obter as regies

codificantes (ORF Open Reading Frame)

para alinhamento com as sequncias

aminoacdicasenucleotdicasresidentesnas

bases de dados. Isto permite obter

informaodebastanterelevnciaacercada

funo e estrutura do gene, sendo ainda

possvel obter informao acerca da

evoluo do gene em relao a outros

semelhantesjregistados.

Conhecer a sequncia do gene d-nostambm informao importante acerca de

pores no codificantes do gene 5 e 3,

isto utilizado para perceber melhor o

funcionamento da regulao gnica e

possibilita a aplicao de tcnicas de

mutao dirigida a um determinado gene.

Porfim,eumdospapismaisimportantes

da sequenciao aplicada diretamente

medicina, a deteco de zonas que

apresentem alteraes em determinados

nucletidos e que podem originar doenas

genticas. Este conhecimento permite a

produo aprimorada de tcnicas e

frmacosparaotratamentodamutaoem

causa.

Nos meados da dcada de 70 comeam a

surgir as primeiras tcnicas de clonagem

moleculareconsigotambmastcnicasde

sequenciao.O investigadorRobertHolley

criaraumatcnicadesequenciaodetRNAque fora usada, inicialmente, para

sequenciarDNAemboracomresultadosno

muito relevantes. Mais tarde Gilbert e

Sanger trabalhamarduamentena tentativa

deencontrarumatcnicaquepossibilitasse

a sequenciao do DNA. Daqui surgiram

duas tcnicas, a degradao qumica de

MaxameGilberteomtodoenzimticode

Sanger. Apesar dos princpios subjacentes

serem diferentes, ambos se baseavam na

produodepopulaesdeoligonucletidosque comeavam sempre num local


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especfico e conhecido e terminavam num

determinado resduo. Os locais de

terminao so, portanto, nucletidosespecficos mas que ocorrem em locais

aleatriosaolongodoDNA.Assimpodemos

obter populaes de oligonucletidos que

acabam em A, T, G ou C. Assim sero

obtidos oligonucletidos de comprimentos

diferentes, consoante a altura em que foi

incorporado um ddNTPs e portanto no

possvelocrescimentodasequnciaapartir

desse ponto. Os fragmentos so ento

corridos em gel de poliacrilamida onde

possvel distinguir fragmentos que diferem

apenasnumnucletido.

OmtodoeGilbertencontra-seemdesuso

pelo uso de marcadores radiativos nos

extremosdosfragmentosdeDNAqueeram

posteriormente degradados por reaes

especficas. Assim a posio de cada

nucletido na cadeia de DNA era

determinadapeladistnciaentreopontode

degradao e a extremidade radioativa

visualizadaporautoradiografia.

O outro mtodo mais comummente

utilizadoebaseia-senaadiodeumddNTP

especficoaumamisturadetodososdNTPs,

o que, aleatoriamente, ir incorporar um

ddNTP e finalizar a polimerizao de uma

dascadeias.Istoaconteceporquenoexiste

ogrupoOHnoC3.Istoimpedeaformao

da ligao fosfodister entre dois

nucletidos vizinhos, impedindo acontinuao do alongamento da cadeia.

Nestemtodo, recorre-se aumprimerque

hibridrizanacadeiasimplesdeDNAeleva

polimerizao de uma nova cadeia

complementar. Repete-se o procedimento

comquatromeiosreacionaisdiferentesem

que cadaum delescontmum dos quatro

tipos de ddNTPs. O primer est marcado

radioactivamente ou por um marcador

fluorescente, fazendo com que os

fragmentospossamseridentificadosemgel.AadiodeumapequenaporodeddNTP

faz com que ocorra a competio entre a

inclusodosdNTPsquelevamcontinuao

doalongamento da cadeia e a incluso deumddNTPquefinalizaacadeia.Fazendoa

reaocomosquatroddNTP, obtm-se os

respectivosoligonucletidoscomosprimers

na extremidade 5. Estes fragmentos so

corridos em gel em 4 poos diferentes. A

revelao feita por fluorescncia ou por

exposioaumaplacafotogrfica(RaiosX).

Assim podemos ler a sequncia do fundo

para o topo, sendo essa a ordem dos

nucletidosdaextremidade5>3.

Atcnicamaisrecenteparaasequenciao

do DNA marca os ddNTPs ao invs de

marcar osprimers. Assim basta fazer uma

reao,poisosoligonucletidosobtidosso

depois corridos em gel no interior de

capilares (electroforese capilar) e os

diferentes ddNTPs so identificados por

anliselaseremequipamentosautomticos.

Isto possvel por marcao dos ddNTPs

com marcadores fluorescentes de cores

diferentes.


SequnciadeAminicidos:

N-Ser-Tyr-Cys-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Ala-C

Sequncia reconhecida pela enzima de

restrioEcoRI:

5GAATTC3

Sequncia reconhecida pela enzima de

restrioHindIII:

5AAGCTT3

Por anlisedosresultadosde electroforese

(Anexo 1) possvel obter a sequncia da

cadeiaqueseformouporemparelhamentocom a cadeia a sequenciar, sendo que as


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Acima encontra-se a sequncia codificante

do clone B e respectiva sequncia de

aminocidosquecodificam(negrito).

CONCLUSES

Atravs do mtodo de Sanger foi possvel

descobrirqueprimerfoiusadonosensaios

de PCR de cada umdos clones. Para alm

disso foi possvel identificar a sequncia

codificantequecodificaparaasequnciade

aminocidos em causa, sendo essa

correspondenteaoclone B.A identificao

dos primers utilizados para a amplificaodassequnciasporPCRfoifeitoporanlise,

na sequncias codificante, dos nucletidos

queagrupados3a3diferiamnomximono

ltimo nucletidodesses tripletos. Isto por

definio de mistura de primers

degenerados.


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CLONAGEMDECDNAY-TUB

OBJECTIVOS

Clonar o gene de cDNA y-TUB. Verificar,

experimentalmente, o resultado da

transformao de bactrias com DNA com

diferentestratamentos.

INTRODUOTERICA

ODNAcomplementar(cDNA)amplamenteutilizadoquandosepretendeamplificarum

gene que codifica para uma determinada

protena. A vantagem do cDNA que no

contm os intres que o gene original

conteria, assim apenas amplificada a

sequncia codificante, poupando-se

recursos e ignorando o processamento do

mRNA.Ogeneemcausa,nestecasocDNA,

inserido num vetor, que pode ser um

plasmdeo,eintroduzidoembactriasdemodo a que o crescimento das colnias

aumente a quantidade de cDNA e leve

formaodecolniascomogeneemcausa.

METODOLOGIA

REAGENTES

Usou-se soluo contendo o plasmdeo

recombinante pSK-yTUB digerido com aenzima de restrio EcoRI; Agarose (1%);

marcadores de pesos moleculares;

membrane binding solution; membrane

wash solution; tampo de ligao (5x);

soluo de T4-ligase; soluo de E.coli

JM101 competentes; placas com meio

Mac/Lac/Amp.

EQUIPAMENTO

Usou-se o transiluminador de UV; mini-

colunaSV;centrfuga


A.DigestoepurificaodoDNA

O plasmdeo recombinante pSK-yTUB

previamente digerido comEcoRIdeacordo

com o procedimento descrito em Anlise

electroforritca de DNA digerido com

enzimas de restrio. Aplicar em gel de

poliacrilamida o marcador de pesos

moleculares,oplasmdeorecombinanteno

digeridoeosprodutosdadigesto.Correro

geldepoliacrilamidaa100Vatafrentedo

gelpercorrer2/3dogel.Visualizarogelnum

transiluminadorUV.Excisarasbandasdogel

correspondentes aos produtos dadigesto.Colocar as bandas num Eppendorf.

Determinaramassadabandaexcisadapor

pesagemdotuboEppendorfantesedepois

da adio da exciso. Adicionar 1L de

Membrane Binding Solution por cada 1mg

degel.Vortexarvigorosamenteeincubara

65C at a agarose se dissolver

completamente. Transferir a soluo

resultante para uma mini-coluna SV

previamente inserida num tubo coletor.

Centrifugar velocidademximadurante1

minuto, descartar o filtrado e voltar a

colocar a colunadentrodo tubo.Adicionar

700L de Membrane Wash Solution.

Centrifugar velocidademximadurante1

minuto. Descartar o filtrado e colocar a

coluna dentro do tubo. Repetir o passo 8.

Com 500L de Membrane Wash Solution.

Transferir a mini-coluna SV para um

Eppendorf limpo e adicionar 50L de gua

ultra-pura e centrifugar velocidademximadurante1minuto.Porfimdescartar


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a mini-coluna SV e guardar o filtrado em

gelo.

B.Ligao

Preparam-se quatro solues com a

composioapresentadanatabelaabaixo.

Tabela10Volumesmedidospara4tubos

eppedorf diferentesdemodo a provocar a

ligaodocDNAaovetorpKS.

ReaesSoluo A B C D

VetorpKSdigerido 5L 5L 5L

cDNA 10L 10L 10L

Tampodeligao 4L 4L 4L 4L

Taqligase 1L 1L 1L

Agitar suavemente a mistura por colises

suaves com o dedo no fundo do tubo.

Incubar a 37C durante uma hora, em

alternativapoder-se-incubara4Cduranteanoite.Congelaramisturaa-20C.

C.Transformao

Descongelarumaalquotadeclulas E.Coli

JM101 competentes em gelo. Colocar num

Eppendorf5LdepKSenumoutro5Lda

mistura de ligaoobtidano procedimento

B. Para umoutro tubomedir 5L de gua

ultra-pura, este sero controlonegativo.A

cada um dos tubos adicionar 50L dasclulas competentes e misturar com

movimento circulares efectuados com a

ponta dapipeta. Incubaros tubos emgelo

durante 20 minutos. Provocar o choque

trmico das clulas colocando-as a 42C

durante2minutosecolocarnovamenteem

gelodurante2minutos.Adicionar200Lde

meio LB e incubar a 37C durante 30

minutos com agitao. Plaquear as clulas

em meio Mac/Lac/Amp. Incubar as placasduranteanoitea37C.


Apsa incubao,asplacasobtidas tinhamoaspectodasfigurasabaixoapresentadas.

Figura21Placaresultantedocrescimento

decolniasdebactriastransformadascom

amisturareacionalA.



amisturareacionalB.


decolniasdebactriastransformadascomamisturareacionalC.


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amisturareacionalD.

Tabela 11 Contagem das colnias e

avaliaodaeficinciadatransformao.

ColniasColnias

TransformadasEficincia

(%)

A 128 29 22,6

B 0 0 0,0

C 0 0 0,0

D 63 0 0,0

CONCLUSES

A reao A corresponde poro onde

realmenteteriadehaveratransformaoe

realmente isso aconteceu, isto porque

existem algumas colnias amarelas que

correspondem s colnias de bactrias

transformadas,umavezquenoexpressam

ogeneLACequeportantonoproduzem-

galactosidade que degrada a lactoseoriginado cido frmico que leva a um

abaixamento do pH. Esse abaixamento

evidenciado pelo aparecimento da cor

violeta em corante neutral red. Caso o pH

no baixe as colnias apresentam-se

brancas. Assim, verifica-se que a placa A

apresenta colnias de bactrias queincorporarm o cDNA. A no expresso do

gene LAC quando o cDNA incorporado

explicado pelo facto da incorporao

acontecernomeiodogeneLAC,impedindo

asuaexpresso.

Noquedizrespeitoreaonaausnciade

cDNA,ovetorfechaexpressosemocDNA

inserido. Isto faz com que as bactrias

resistam ampicilina mas que todas elas

expressem para a -galactosidade, fazendocom que todas as colnias sejam violetas

(diminuiodopHprovocadapelalibertao

decidofrmico).

As placas B e C no apresentam colnias,

porque as bactrias so incapazes de

sobreviver. No C no apresentam o vetor

que contm o gene que codifica para a

resistncia ampicilina, dando origem a

bactrias susceptveis e que no resistem.

NocasodoB,comonoseadicionaaTaqLigase,oplasmdeonocapazdeciclizare

portanto no possvel proceder

transcrioparaaqueogenederesistncia

ampicilina seja expresso e portanto as

bactriasnoseconseguemdesenvolver.

Porcontagemdascolnias,verifica-sequea

transformao ocorreu em 22,6% das

bactrias que deram origems respectivas

colnias.


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BIBLIOGRAFIA

Sunckel,C;ProtocolosdasaulasexperimentaisdeBiologiaMolecular; InstitutodeCincias

BiomdicasAbelSalazar;Porto;2009/2010

Andrysik, Zdenek ; Bernstein,William Z. ; Deng, Li; The novel mouse Polo-like kinase 5

respondstoDNAdamageandlocalizesinthenucleolus,NucleicAcidsResearchs,38,9,2010,

2931-2943.


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ANEXOS

relatórios de biologia molecular.pdf

Documents