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Turma 2 | Grupo 1
Professores responsveis: Dr. Cladio Sunkel e Dr. Carlos CondeRealizador por: Filipa Barros, Henrique Fernandes, Joo Rodrigues, Lisete
Moutinho e Sara Moniz
Biologia Molecular
LicenciaturaemBioqumica
2012/2013
RELATRIOS
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PREFCIO
O presente documento compila os relatrios de todos os trabalhos prticos e terico-
prticosrealizadosaolongodosegundosemestredoanolectivo2012/2013dalicenciatura
em Bioqumica (Faculdade de Cincias da Universidade do Porto e Instituto de Cincias
BiomdicasAbelSalazardaUniversidadedoPorto).Ostrabalhosforamrealizadosnombito
daunidadecurriculardeBiologiaMolecular.
Todaainformaoquenoestcontempladanomanualdostrabalhosprticosdaunidade
curricularque foi disponibilizadopeloprofessore/oumaterial utilizadonas aulas tericastemasuafontecitadanabibliografia.
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ND ICE
EXTRAODEDNAGENMICODEDROSOPHILAMELANOGASTER....................................4OBJECTIVOS..............................................................................................................................4INTRODUOTERICA.........................................................................................................4METODOLOGIA.....................................................................................................................5REAGENTES.......................................................................................................................5EQUIPAMENTOS................................................................................................................5procedimentoexperimental..............................................................................................5
RESULTADOSEXPERIMENTAIS......................................................................................................6CONCLUSES.........................................................................................................................8
EXTRACODEDNAPLASMDICODEESCHERICHEACOLI...................................................9OBJECTIVOS..............................................................................................................................9INTRODUOTERICA.........................................................................................................9METODOLOGIA...................................................................................................................10REAGENTES.....................................................................................................................10EQUIPAMENTOS..............................................................................................................10procedimentoexperimental............................................................................................10
RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................10
CONCLUSES.......................................................................................................................10
ANLISEELETROFORTICADEDNADIGERIDOCOMENZIMASDERESTRIO..................12 OBJECTIVOS............................................................................................................................12INTRODUOTERICA.......................................................................................................12METODOLOGIA...................................................................................................................14REAGENTES.....................................................................................................................14EQUIPAMENTOS..............................................................................................................14procedimentoexperimental............................................................................................14
RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................15CONCLUSES.......................................................................................................................16
ELABORAODOMAPADERESTRIODEUMPLASMIDEORECOMBINANTE.................17 OBJECTIVOS............................................................................................................................17INTRODUOTERICA.......................................................................................................17METODOLOGIA...................................................................................................................18procedimentoexperimental............................................................................................18
RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................18CONCLUSES.......................................................................................................................19DISCUSSO.............................................................................................................................22
PCRPOLIMERASECHAINREACTION..........................................................................23OBJECTIVOS............................................................................................................................23INTRODUOTERICA.......................................................................................................23
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METODOLOGIA...................................................................................................................24
REAGENTES.....................................................................................................................24EQUIPAMENTOS..............................................................................................................24procedimentoexperimental............................................................................................24
RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................25CONCLUSES.......................................................................................................................27
TRANSFORMAODEESCHERICHIACOLICOMDNAPLASMDICO....................................28OBJECTIVOS............................................................................................................................28INTRODUOTERICA.............................................................................................................28METODOLOGIA...................................................................................................................29Reagentes........................................................................................................................29ProcedimentoExperimental............................................................................................29
RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................30CONCLUSES..........................................................................................................................33
SEQUENCIAODEDNA..................................................................................................35 OBJECTIVOS............................................................................................................................35INTRODUOTERICA.............................................................................................................35RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................36CONCLUSES..........................................................................................................................38
CLONAGEMDECDNAY-TUB.............................................................................................39 OBJECTIVOS............................................................................................................................39
INTRODUOTERICA.............................................................................................................39METODOLOGIA...................................................................................................................39Reagentes........................................................................................................................39Equipamento...................................................................................................................39ProcedimentoExperimental............................................................................................39
RESULTADOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................40CONCLUSES..........................................................................................................................41
BIBLIOGRAFIA..................................................................................................................42
ANEXOS...........................................................................................................................43
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EXTRAODEDNAGENMICODEDROSOPHILA
MELANOGASTER
OBJECTIVOS
Isolamento e quantificao por
espectrofotometriadoDNAgenmico
da Drosophila melanogaster.
Avaliao dograu depureza doDNA
isolado e estudo dos efeitos de
diversos tratamentos, na integridadedoDNAgenmico.
INTRODUOTERICA
A Drosophila Melanogaster um
insecto usado emmuitos estudos na
rea da gentica, por apresentar 4
pares de cromossomas de grandes
dimenses que so formados por
vriasmultiplicaesdefilamentosdeeucromatina (cromatina
descondensada), facilitando a
visualizao microscpica dos
mesmos.Paraalmdisso,acromatina
possuiprolongamentosquepermitem
ummaiorcontactocomohialoplasma
estruturasdenominadasdepufes.
Este contacto vai permitir uma
ativaodeumamaiorrea deDNA.
Finalmenteestesseres,apresentama
vantagem da sua criao ser fcil e
barata, tm uma longevidade
pequena, uma taxa de reproduo
elevada e o seu genoma est bem
estudadoesequenciadonatotalidade.
ParaseefetuarumisolamentodeDNA
necessriorecorreraprocessosque
provoquem a lise das clulas e
permitam a purificao do mesmo.
Comalisecelulartodososcompostos
queintercelularessolibertadospara
a soluo e geralmente provocada
por rompimento mecnico ou se
necessrio, utilizando enzimas que
degradem a parede celular.
frequente utilizarem-se tambm
detergenteseassim,apurificaodo
DNA dar-se- com a libertao de
todososcompostosintercelularespor
precipitaes diferenciais e ao deenzimascomoprotaseseRNAases.
O DNA genmico obtido pelos
processos referidos anteriormente,
pode ser utilizado em variados
processos moleculares (Southern
blotting,bancosgenmicos,etc).Deve
serguardadosolubilizadoa70C(ou
20C). Porm, congelao e
descongelao sucessivas provocam
quebras nas cadeias de DNA. Ento,
para armazenamentos a longo prazo
convm ser guardado em alquotas
enquanto que a curto prazo,
aconselha-seapreservaoa4C.Para
o armazenamento, solubilizado em
tampo TE, onde o EDTA previne adegradaodoDNAporaoquelante
de metais pesados e caties que
promovem a quebra das ligaes
fosfodisterporaodasDNAases.
A electroforese em gel acionada porum
campo elctrico frequentemente
utilizada para separar e estimar o
tamanhodefragmentosdeDNA.Sujeitos
aumcampoelctrico,oscidosnucleicos
migramemdireoaoplopositivo,umavezqueapresentam carganegativaapH
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neutro. A agarose funciona como uma
rede cujos poros deixam passar mais
facilmente asmolculas mais pequenas,quevoportantomigrarmaisdoqueas
demaioresdimenses.Amigraodeum
fragmento de DNA depende da sua
conformao.
Deummodogeneralista,occcDNAmigra
mais rapidamente doqueos fragmentos
domesmo tamanho dedsDNA porque a
conformao circular tem menor raio
hidrodinmico (devido aos super-
enrolamentos).NoDNAcircular,comumaquebra numa ligao fosfodister, os
enrolamentos desaparecem pois h uma
quebradeumaligao fosfodister; este
facto torna-a a forma mais lenta de
migrao. A distncia de migrao dos
vriosfragmentosdependetambm
da voltagem aplicada e da concentrao
de agarose empregue. Pelas mesmas
razesdainflunciadopesomolecularna
mobilidade, o aumento da concentraoda agarose leva a um retardamento da
migrao electrofortica. A concentrao
de agarose a usar deve ser adaptada
gamadetamanhosdefragmentosquese
pretenderesolver.
Assim, em suma a distncia que o
fragmentopercorreuapartirdopontode
aplicao, comparada com a distncia
que outros fragmentos de tamanhos
conhecidos percorreram no mesmo gel.
Esses fragmentos so os ladders
(marcadoresdepesomolecular),misturas
de segmentos de DNA de tamanhos
variveis, e que so aplicados em um
poonogelnoinciodoprocesso.
Os gis de agarose so, geralmente,
corados com solues de brometo de
etdio(EtBr),umasubstnciaintercalante
que revela os cidos nucleicos aofluorescer sob luz ultravioleta.
Concentraesdeat1ngdeDNApodem
servisualizadas porexame diretodo gel
naluzultravioleta.
METODOLOGIA
REAGENTES
Usou-se tampo de lise e Brometo de
etdeo(mutagnicomuitoforte).
EQUIPAMENTOS
Recorreu-se a um espectrofotmetro.
Suporteparaogeldeagaroseefontede
alimentaoparaaelectroforese.
PROCEDIMENTOEXPERIMENTAL
A. Extrao de DNA genmico de
DrosophilaMelanogaster
Recolhadecercade200moscasadultas,
procendendohomogeneizaloem5ml
detampodelisepreviamentearrefecido
em gelo. Centrifugao a 1000 rpm ,
durante um minuto. Transferncia do
sobrenadante (correspondente
suspenso dencleos) para um tubo de
Falcon. Adio de 50 l de soluo de
proteinaseK(a10mg/ml)suspensode
ncleos e incubao a 37C durante 2
horas.
Isolamento de uma fraco de ncleos
isolados e ressuspendidos em 500 l.
Adio de 500 l de soluo de fenol
equilibrado em tampo TE ( 10mM Tris-
HCLpH8;1mMEDTApH8)suspenso
dencleos.Agitaoporinversodotubo
e centrifugao a 5000 rpm durante 2
minutos. Transferncia da fase aquosa
paraumnovotubo.Adiode500lda
mistura fenol/clorofrmio/lcool
isoamilico e agitar cuidadosamente porinverso do tubo. Nova centrifugao a
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Atravs da Lei de Lambert-Beer
calculada a concentrao de DNA na
amostra:
A=lc (1)
Assim:
!"# = 2,26gmL!!Uma vez que a diluio foi de 5L para
700L:
!"# = 316,4gmL!!Clculo dos pesos moleculares das
amostras
Figura 1 Electroforese em gel de
agarose.gDNA(DNAgenmico)(1),gDNA
vortexadointensamente(2);gDNAfervido(3); gDNA pipetada mltiplas vezes (4).
DNAplasmdico(5)(referenteaotrabalho
seguinteExtraodoDNAplasmdicoda
E.coli);marcadoresdeparesdebases(6).
Tabela 1 Distncias migradas pelas
bandas, respectivos pesos moleculares e
logaritmos.
dmigrada/mm PM/pb log(PM)
46,07 10000 4,000
49,88 8000 3,903
60,15 6000 3,778
65,65 5000 3,699
72,16 4000 3,602
77,91 3000 3,477
87,64 2500 3,398
95,54 2000 3,301
105,57 1500 3,176
119,51 1000 3,000
129,45 800 2,903
137,91 600 2,778
149,71 400 2,602
166,04 200 2,301
Figura2Logaritmodopesomolecular
emfunodadistnciamigrada
log(PM)=-0,0133dmigrada+4,5749R=0,9958
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
0 50 100 150 200
Log(PM)
dmigrada/mm
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Tabela2Distnciasmigradasporcada
banda nos poos de 1 a 5. Respectivo
clculodonmerodeparesdebasescombase na equao da reta obtida pela
regresso representada na figura 2. Os
valoresrelativosaopoo5serousados
naanlisedosdadosdoprximotrabalho.
Poo dmigrada/mm PM/pb
132,12120,56171,18
14051936199
2
33,45
120,10169,88
13490
950207
3 154,32 333
433,90121,82166,87
13305901227
5 141,00-174,13 501-182
CONCLUSES
A absoro de radiao ultravioleta por
parte dos cidos nucleicos a base da
metodologia utilizada para determinar o
graudepurezadoDNAequesedesigna
por mtodo espectrofotomtrico. Assim,
a quantidade que radiao ultravioleta
que absorvida relaciona-se
proporcionalmentecoma quantidadede
DNA da amostra. A amostra de DNA
genmico extrada de Drosophila
melanogaster,obtidacomumelevadograudepurezacomumaconcentraode
316,4g/mLepossucercade
Um mtodo alternativo seria um teste
utilizando fluorescncia induzida pelo
brometo de etdeo com posterior
comparaocomafluorescnciadeuma
srie de padres que apresentam uma
gama de fragmentos com vrias
dimenses. Cada barra corresponde a
umaconcentraodeDNAbemdefinida,
sendo por isso possvel a estimativa
quantitativa do DNA da amostra
relativamente a do padro (clivado comHindIII).
Ospoos1,2e4apresentamumabanda
correspondente a aproximadamente
13500 pb que corresponde, ento, ao
gDNA.Contudooaparecimentodeoutras
bandas nesses poos indicam a
contaminaodaamostra. Abandamais
intensa, provavelmente no ser uma
contaminao,dado queadeterminao
dograudepurezadogDNAresultounumvaloraprecivelparaapurezadaamostra
obtida. Assim poder tratar-se de gDNA
que sofre supercoiling e que, portanto,
apresentaumamaiordistnciapercorrida
no gele de agarose. A banda que mais
migrou corresponder, provavelmente a
contaminaes por RNA. Uma forma de
eliminar estas contaminaes, era
recorreraRNAsesquedegradassesoRNA
epurificassemassimaamostradegDNA.
EmrelaoaostratamentosaqueogDNA
foi sujeito, verifica-se que apenas a
fervurafoicapazdedestruiroDNA.Uma
vez que tanto os poos 2, como 4
apresentam um perfil idntico ao 1
(controlo).Ofactodopoo3apresentar
uma banda muito intensa que migrou
muito no gel, isto indica que o DNA foi
desnaturadoecortadoemvriaspores
fazendo com que se formassem vrias
pores de DNA com poucos pares debases(cercade300pb).Conclui-seento
queovortexaroupipetarrepetidamente
oDNAnoafeta,deformaalguma,asua
integridade.
Salvaguarda-sequearesoluodogelno
permite obter valores, relativos ao
nmero de pares de bases de cada
fragmento, quepossamser tomados em
considerao de forma absoluta. Temos
apenas dados comparativos e valoresaproximado
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EXTRACODEDNAPLASMDICODEESCHERICHEACOLI
OBJECTIVOS
Com este trabalho prtico pretende-se
preparar,empequenaescala,eparauso
de rotina, o plasmdeo pSK-polo de
Escherichiacoli.Destemodo,etendoem
conta a grande quantidade de DNA
cromossmico, necessrio separar eisolaroDNAplasmdicodabactria,para
asuafuturapreparao.
INTRODUOTERICA
Muitas bactrias, para alm do DNA
genmicocmcercade4milhesdepares
de bases, possuem DNA plasmdico em
grandes quantidades, chegando a alguns
milharesdeparesdebases.
Estas molculas, pequenas, so
constitudas por uma cadeia dupla de
cidosnucleicos,devidamenteassociados
entre si, de forma circular fechada
(cccDNA) e possuem replicao
autnoma. Estas caractersticas
morfolgicasfacilitamasuaseparaodo
DNA cromossmico. Para alm disso,
verificou-se que os plasmdeos contm
genesespecficosque,nabactriaqueospossui, codificam todo um conjunto de
informaes de elevada importncia a
nvelevolutivo.Assim,estasmolculasde
DNA, hoje em dia extremamente
manipuladas pelo homem, revelaram-se
bastante teis em Engenharia
Genticapelasuacapacidadedeconferir
fentiposvantajososevariados,taiscomo
resistncia a metais pesados, enzimas e
antibiticos, produo e catabolismo de
molculas orgnicas complexas e
aminocidos raros, bem como produo
deenzimasderestrio.
Paraalmdisso,dereferiracapacidade
detransmissodeplasmdeosparaoutros
hospedeirosdamesmaestirpeouestirpes
diferentes, pelo processo de conjugao
bacteriana, na qual o gene mob tem
especialimportncia.
Para usufruir das suas caractersticas
especiais, os plasmdeos originais das
bactrias foram alterados de modo a
aumentarasuaeficincianaclonageme
expresso gnica. Assim, surgiram novos
plasmdeoscomcaractersticasdiferentes
das originais: menor tamanho, maior
nmerodelocaisdeclonagemecpias,e
marcas seletivas convenientes, muito
teisemBiologiaMolecular.
So estes novos vectores plasmdicosde
clonagem ou de expresso que se
pretendemisolaratravsdatcnicaaque
orelatriodizrespeito.
Para ser separado o DNA plasmdico do
DNAcromossmico,necessrioinduzira
lise celular e, aps centrifugao dos
resduos resultantes, separar os dois
componentes.
necessria, tambm, uma
desproteinizao da soluo
anteriormentereferida,pararemoode
protenas associadas molcula, bem
comopassosadicionaisdepurificaoda
mesma.
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METODOLOGIA
REAGENTES
Utilizou-se meio de cultura LB; Tampo
STET;Lisozima;Isopropanoleagarose1%.
EQUIPAMENTOS
Incubadora;Vortex;microcentrfuga.
PROCEDIMENTOEXPERIMENTAL
Inoculou-se,duranteanoite,aestirpeE.
coli com o plasmdeo a purificar.
Introduziu-se1,5mldaculturanumtubo
Eppendorf e centrifugaram-se as clulas
durante3 minutos velocidademxima.
Aspirou-se, ento, o contedo
sobrenadante com ajuda de uma
micropipeta. Adicionou-se 1,5 ml da
cultura bacteriana ao sedimento obtido
no processo e 200 l do tampo STET,
ressuspendendo-se o sedimento emvortexoucomamicropipeta.Adicioinou-
se4ldelisozima(50mg/ml)eincubou-
se durante 5 minutos temperatura
ambiente.
Posteriormenteprocede-seincubaoa
95Cdurante1minuto, centrifugaodo
lisado celular durante 10 minutos
velocidade mxima. Descarta-se o
sedimento e adicionam-se 200 l de
isopropanol ao sobrenadante e vortexa-
se. Segue-se uma centrifugao
velocidademxima, durante10minutos.
Recolhe-se o sobrenadante com uma
micropipetaeseca-seosedimentoa37C
na estufa durante 10 minutos.
Ressuspende-seoDNAem10ldegua
pura. Procede-se realizao de uma
electroforese em gel de agarose (1%).
Aplicaode5ldaamostramisturados
com5ldetampodeaplicao.
RESULTADOSEXPERIMENTAIS
Figura 3 Electroforese em gel de
agarose.gDNA(DNAgenmico)(1),gDNA
vortexadointensamente(2);gDNAfervido
(3); gDNA pipetada mltiplas vezes (4).
Isto referente ao trabalho prtico
Extraco do DNA genmico de
Drosophilamelanogaster.DNAplasmdico(5);marcadoresdeparesdebases(6).
CONCLUSES
De acordo com a imagem apresentada,
(Figura 3) podemos concluir que o
plasmdeo uma poro de DNA de
menor peso molecular que o DNA
cromossmico,tendoemcontaquefoio
material queapresentoumaiormigraono gel, o que est de acordo com o
esperado tendo em conta que estas
pores de material gentico so
pequenosfragmentosdeDNAbacteriano
deformacircular.
Poranlisedoresultadodaelectroforese
(Figura3Poo5),verifica-sequeoDNA
plasmdico foi separado do demais
material gentico da bactria, DNA
cromossmico,com sucesso. Isto porquenoseverificaoaparecimentodeoutras
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bandas no gel que pudessem indiciar a
presenadeoutroDNAouRNAqueesteja
a contaminar a amostra. Contudo nopodemosinferir,comtotalcerteza,acerca
dacontaminaoporRNA,umavezqueo
RNAmigraria para valores prximos dos
migradospeloDNAplasmdicoeabanda
detectada muito grande. A banda em
causa engloba fragmentos de cerca de
500a200pb,podendoportantoenglobar
RNA.Umaformadecertificaraausncia
de RNA na amostra era proceder aotratamento daamostra comRNAsesque
degradassem o DNA e repetir a
electroforese. Daqui, podemos ainda
concluir,queoDNAplasmdicoapresenta
aproximadamenteentre500a200pb.
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ANLISEELETROFORTICADEDNADIGERIDOCOMENZIMAS
DERESTRIO
OBJECTIVOS
Estudar a aco enzimtica de duas
enzimas de restrio (ER) EcoRI e
HindIIInadigestodeumaamostrade
DNA plasmdico e avaliar o resultado
dos cortes efectuados pelas
endonucleases atravs de uma
electroforeseemgeldeagarose.
INTRODUOTERICA
Os rpidos avanos da investigao
cientfica, em particular da Biologia
Molecular, que tiveram lugar nas duas
ultimas dcadas foram possveis em
grande parte, devido capacidade de
isolar determinados segmentos de
interesse de DNA procaritico eeucaritico.Aclonagemdegenesrequer
queasmolculasdeDNAsejamcortadas
deummodomuitoprecisoereprodutvel.
Atravs da utilizao das enzimas de
restrio esse objectivo facilmente
conseguido, pois possuem a capacidade
de ligao especfica a determinados
locaisdeDNAdecadeiadupla(sequncia
de reconhecimento) e sua posterior
clivagem,no interior dessa sequncia ou
adjacente a ela. De acordo com ascaractersticasdecorte,asendonucleases
de restrio so classificadas em trs
tipos.AsenzimasdotipoIeIII,paraalm
da aco nuclesica, tm aco
modificadora (metilao) no mesmo
domniode reconhecimentoda protena.
Apesar destas enzimas reconhecerem
sequencias especificas de DNA, a
actividade nuclesica ocorre de modo
aleatrionaproximidadedasequenciade
reconhecimentoedependentedeATP.
AcrescequeasenzimasdotipoIIIapenas
efetuammetilaonumadascadeias.Por
estasrazes,asenzimasdotipoIeIIIno
so frequentemente usadas em
investigao de rotina em Biologia
Molecular.
As endonucleases de restrio de tipo II
so sistemas binrios em que uma das
subunidades tem ao nuclesica e aoutra demetilao. Ambas as aes so
efectuadas em locais especficos dentro
dasequncia reconhecida. Amaiorparte
das enzimas de restrio do tipo II,
reconhecemsequnciascom48pares
de bases com simetria palindrmica. A
enzima EcoRI (produzida por Escherichia
coli) reconhece a sequncia GAATTC,
enquanto AluI (produzida por
Arthrobacter luteus) corta em AGCT.
Como h especificidade para o local decorte, estas enzimas podem ser usadas
paraadegradaodemolculasdeDNA
com obteno de fragmentos de menor
tamanho, cujas extremidades so
conhecidas em termos de sequncia
nucleotdica. As sequncias das
extremidades e o tamanho dos
fragmentos obtidos variam de acordo
comaenzimaderestriousada.
Dada apossibilidadedemanipulao emlocaisespecficosdoDNA,asenzimasde
restrio constituem nos dias de hoje,
ferramentas bsicas em Biologia
Molecular. Duma maneira geral, so
usadasparaoestabelecimentodemapas
de restrio de fragmentos deDNA cuja
sequncia desconhecida, fragmentao
de DNA genmico para separao
electroforticaeposterioranlise,criao
defragmentosdeDNAparasubclonagemnum vector apropriado e a criao de
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sondas marcadas para anlises porsouthernenorthern.
Existem trs tipos de extremidade
resultantes do corte consoante o modo
de corte da cadeia dupla. Enzimas de
restrioquecortamexatamentenomeio
da sequncia do palindroma (SmaI)
originamextremidadessemnenhumadas
duascadeiasprotuberante(bluntends).
Outras enzimas cortam na extremidade
5do palindroma reconhecido originandoextremidades protuberantes 5de 2-4
basesnaformadecadeiasimples(EcoRI)
denominadas por extremidades
5coesivas (5 sticky-ends). Outras
enzimas cortam na extremidade 3do
palindroma originando extremidades
protuberantes3de2-4basesnaformade
cadeia simples (KpnI) denominadas por
extremidades 3coesivas (3 sticky-
ends).
Comoestasenzimasderestrioso,na
sua maioria, especficas em relao
sequncia de reconhecimento e corte,
duas molculas de DNA diferentes que
foram digeridas com a mesma enzima,
por exemplo BamHI, possuiro
extremidades5iguaisquepodemassim
emparelhar utilizando as bases que
ficaramem cadeiasimples,numa reao
catalisada por uma DNA Ligase. O
resultado da ligao destasduas cadeias
serumamolcularecombinante.
Dois factores so essenciais para a
eficinciadecortedasendonucleasesde
restrio:purezadoDNAeotampode
digesto. As impurezas habituais
presentes em amostras de DNA
(protenas, fenol,clorofrmio,EDTA,SDS
eaelevadaconcentraodesais)podem
inibirporcompletodeterminadasenzimas
de restrio. A influncia de todos estesfactores varia de enzima para enzima,
peloquesedevemteremcontaquando
se verifica ausncia de atividade,
assegurando-se que as condies de
reaoforamasideais.
Os componentes essenciais dos tampes
dedigestoso:tampoTris(pH7.58.0),
iesdemagnsio,cloro,sdio,epotssio;
um agente redutor como ditioeritriol,
ditiotreitolou2-mercaptoetanol. Emborahaja especificidade da atividade em
relao a todos estes factores, o mais
importante a concentrao de ies
(fora inica). Assim, dividem-se as
enzimasemtrsgrupos:asquerequerem
elevadaforainica,mdiaforainicae
baixa fora inica. Esta propriedade
particularmente importante para
digestescomvriasenzimasderestrio
em que impossvel a digesto
simultnea com enzimas que requeremforasinicasdiferentes.Nestescasos,as
digestesdevem serfeitas emseparado,
comeando pela enzima demenor fora
inica, desnaturar a enzima por calor,
ajustaraconcentraodesaiseproceder
segundadigesto.Asconsequnciasdo
usodecondiesnoideaisemdigestes
comenzimasderestriosoaausncia
de atividade ou o fenmeno de star
activity em que a enzima perde aespecificidade para a sequncia de
reconhecimento,passandoa fazercortes
nosnoslocaisespecficosmastambm
noutroslocais.
Um factor que pode ser importante em
alguns casos o grau de metilao do
DNA.Aproduodeenzimasderestrio
ummecanismodedefesadasbactrias
contraainfecoporDNAexgeno.Para
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precaver a ao contra o prprio DNA,estas enzimas de restrio promovem a
metilaodenucletidos,ficandoentoa
sequncia de reconhecimento imune
suaao.Assim,quandosetrabalhacom
DNA plasmdico proveniente de estirpes
bacterianascomumaelevadacapacidade
de metilao, deve-se ter em ateno,
tambm,asensibilidadedaenzimaausar
para a metilao dos nucletidos da
sequncia de reconhecimento. A
estratgiamaisusadaousodeestirpesbacterianas manipuladas geneticamente
paraaperdadessacapacidade.
METODOLOGIA
REAGENTES
Utilizou-se 3 L de soluo enzimas de
restrioEcoRIeHinIIIestasdevemser
mantidas em gelo durante a actividadeprtica, sendo depois armazenadas a -
20C;11LdeplasmdicopSK-polo;6L
detampodeenzimaderestrio5x;0,4
g de agarose; tampo TAE 1x; 1 L de
brometodeetdio;5Lmarcadordepeso
molecular Bioline; 20L de tampo de
aplicao; 44 L de gua destilada e
esterilizada.
EQUIPAMENTOS
Utilizou-se umaestufa, um suporte para
geldeagarose,umafontedealimentao
paraaelectroforeseeumtransiluminador
deUV.
PROCEDIMENTOEXPERIMENTAL
Pipetar para dois tubos Eppendorf,
usando pontas de pipeta diferentes e
limpas, 15l de gua destilada e
esterilizada,2ldetampodeenzimade
restrio5,2ldeDNAplasmdicoe1l
de enzima de restrio, poresta ordem,
em que no tubo 1 adiciona-se apenas
EcoRI, e no tubo 2 adiciona-se apenas
HindIII. Preparar uma terceira soluo,
pipetando 14l de gua destilada eesterilizada,2ldetampodeenzimade
restrio5,2ldeDNAplasmdicoe1l
de cada enzima de restrio Misturar
cuidadosamentebatendolevementecom
odedonofundodotubo.Incubara37C
durante1hora.
Preparaodogel1%deagarose:
Pesar0,4gdeagaroseeadicionar40mL
detampoTAE1x.Aqueceratebuliode forma a dissolver completamente a
agarose. Adicionar 1 L de brometo de
etdeo, agitar levemente e verter a
soluosobreummolde,utilizando-seum
pente para a formao dos poos, onde
sero colocadas as amostras de DNA. O
gel deixado arrefecer para que
solidifique.Removeropenteecolocaro
gel na tina de electroforese submergido
emtampoTAE1.
Preparao das amostras em tubos
Eppendorfparacarregarogel:
No primeiro adicionar 5 l de DNA no
digeridoe5ldetampodeaplicao;no
segundoadicionar20ldeDNAdigerido
comHindIIIe5ldetampodeaplicao;
no terceiro adicionar 20 l de DNA
digeridocom EcoRIe5ldetampode
aplicao; No quarto adicionar 20 l de
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DNAdigeridocomHindIIIeEcoRIe5ldetampodeaplicao.Carregarogelcom
as quatro amostras, carregando um
quinto poo com 5 l de marcador de
pesomolecular.Correrogela100Vata
frentedogelchegaracercadedoisteros
do gel. Visualizar o DNA num
transiluminadordeUV.
RESULTADOSEXPERIMENTAIS
Aps a electroforese obteve-se os
resultadosapresentadosnafigura3.
Figura 4Geldeagarose1%corridoa
100V. Da direita para a esquerda:marcador de pesos moleculares; DNA
plasmdico por digerir; DNA plasmdico
digerido com HindIII; DNA plasmdico
digerido com HindIII e EcoRI; DNA
plasmdicodigeridocomEcoRI.
Tabela2Valoresreferentesaospesos
moleculares do marcador Bioline em
pares de bases, distncia migrada de
cadabanda, em cm, e ao logaritmo dospesosmoleculares.
PM/pb dmigrada/cm Log(PM)
10000 2,40 4,00
8000 2,65 3,90
6000 2,85 3,78
5000 3,09 3,70
4000 3,30 3,60
3000 3,79 3,48
2500 4,10 3,40
2000 4,48 3,301500 5,05 3,18
1000 5,95 3,00
800 6,40 2,90
600 6,92 2,78
400 7,12 2,60
200 8,68 2,30
A partirda aplicaoda regresso linear
da distncia migrada (d) em funo do
logaritmodospesosmoleculares(logPM)
obtm-seaseguinteequao:
dmigrada=-3,811log(PM)+17,27(1)
Aplicando a equao (1) s bandas
correspondentessamostrasobtm-seos
pesos moleculares apresentados na
tabela3.
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Tabela 3 Valores referentes sdistncias de migrao das bandas das
amostras e aos respectivos pesos
moleculares.
dmigrada/cm PM/pb
Controlo2,50 7510
3,85 3322
HindIII 2,92 5827
HindIII+EcoRI
3,13 5132
3,50 4104
5,50 1226
EcoRI3,51 4079
5,40 1302
CONCLUSES
Analisando o gel, pode-se verificar a
presena de duas bandas no poo do
DNA plasmdico controlo e ainda uma
terceira, pouco visvel. O que seria deesperareraobter-se3bandasdistintas,
referentes s 3 formas de DNA
plasmdico:DNAcircular,DNAlinearde
cadeiaduplaeDNAsuperenrolado.
NoquedizrespeitoaoestudodoDNAdigerido com diferentes enzimas de
restrio, pode-se concluirquea EcoRI
possui duas zonas de corte no
plasmdeorecombinante,oqueorigina
duas bandas no gel, com pesos
molecularesde4079pbede1302pb.
Em relao enzima HindIII conclui-se
queestacortaoplasmdeoapenasuma
vez,fazendocomqueestepercaasua
conformao circular e adquira umaconformao linear, levando ao
aparecimentodeapenasumabanda.
No caso da digesto doDNA plasmdico
com as duas enzimas, observa-se trs
bandas, o que concordante com o
esperado, dado que a insero do gene
polofoifeitaentreumcorteda EcoRIeo
corte daHindIII. Assim, pode-se concluir
queofragmentoinseridocorrespondente
ao genepolo possui um peso molecular
deaproximadamente1302pb.
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Figura7Eletroforeseondeseinseriuo
fragmentoR.
Figura8Eletroforeseondeseinseriuo
fragmentoL.
Com os valores das distncias migradas
pelasbandasdecadaamostranogel(cm)
e substituindo esses resultados na
equao da reta do grfico da figura 6
traado com os dados do marcador,
obtm-se os pesos moleculares dasbandasnogel.
Tabela 5 Enzimas de restrio
utilizadas, distncias migradas e
respectivospesosmolecularesdasbandasdosfragmentosReL.
CONCLUSES
Construo do mapa de restrio do
fragmentoL
O plasmdeo pGEM-3 sem o fragmento
inserido tem 1742 pb. O seu peso
molecular foi determinado atravs do
pesomoleculardofragmentoobtidopelo
cortecomaenzimaderestrioBamHI.O
plasmdiocomofragmentoLpossu3704
pb. Os valores das determinaes so
aproximados porque as medidas esto
carregadascomerrossignificativoseisso
propaga-se em todas as operaes,
ocorrendodesviosatdezenadepb.
SabendoquetantoofragmentoLcomoo
R foram inseridos com a enzima de
restrioSalIpossvelconstruiromapa
derestriodoplasmdeo.
EnzimaFragmentoL FragmentoR
d/cm Peso/pb d/cm Peso/pb
pGEM3xBamHI
3,8 1742 3,2 2881
SalI1 3,6 2060 3,5 2240
SalI2 3,7 1895 3,6 2060
HindIII1 3,4 2436 3,1 3133
HindIII2 4,2 1246 5,1 586
PstI1 3,3 2649 3,1 3133PstI2 4,3 1146 4,7 820
XhoI1 3,1 3133 3,0 3406
XhoI2 5,0 637 4,8 754
PvuII1 3,0 3406 3,4 2436
PvuII2 5,9 300 3,7 1895
SacI 2,9 3704 2,8 4028
Xho/SacI1 3,5 2240 3,0 3406
Xho/SacI2 4,3 1146 4,8 754
Xho/SacI3 5,0 637 7,0 119
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Relativamente enzima HindIII pode-se
concluir que esta corta duas vezes
obtendo-sedoisfragmento,umcom2436pbe o outro com 1246 pb. Esta enzima
cortaopGEM-3naposio7eumaoutra,
originado duas bandas, ento ter de
possuir um outro local de corte no
fragmento inserido. Assim, o segundo
local de corte da HindIII ser a 1228pb
(1246 pb + 7 pb) do primeiro local de
corte.
Quanto Pst I , verifica-se que tambm
cortaduasvezesofragmento,tendoumdos fragmentos 2649pb e ooutro 1146
pb. Sabe-se que este enzima corta o
pGEM-3naposio23pb,ento,ooutro
localdecortedaPstIsera1146pbdo
primeirocorteeterdesernofragmento,
peloqueocorrernaposio1169pb.
Com a enzima PvuII tambm se obtm
duas bandas, o que significa que corta
duas vezes o fragmento, sendo que um
dosfragmentostem3406pbeoutro300pb.Sabe-sequetemumlocaldecortena
posio104pbdovetor,peloquecomo
fragmento inserido, este local ocorre na
posio 2164 pb do vetor com o
fragmento L.O outro localde corte ter
de ocorrer, obrigatoriamente, no
fragmentoL,assimirocorrernaposio
1864pb(2164pb300pb).
Relativamente enzima Sal I (utilizada
para inserir o fragmento no plasmdeo),
verifica-se o aparecimento de duas
bandasmuitoprximasumadaoutrano
geldeelectroforese,oquenosindicaque
o fragmento e o vetor devero ter um
tamanho muito aproximado e pesos
molecularesde2060pbe1895pb.
AenzimaSacIoriginaapenasumabanda
nogeldeagarosee sabe-seque cortao
vetornaposio56pbpeloquecortaroplasmdeonaposio2085pb.Assim,no
ternenhumcortenofragmentoinserido.
O peso molecular relativo a esta banda
(3704 pb) o tamanho do plasmdeorecombinante(vetor+fragmento).
Sabe-se que a enzima XhoI no corta o
vetor,oquesignificaqueasduasbandas
que aparecem no gel correspondem a
dois locais de corte no fragmento. Dos
dados obtidos conclui-se que corta em
dois locais originando fragmentos com
3133pbe637pb.Paraselocalizarosdois
locaisanteriormentereferidosrecorresse
anlise dos resultados obtidos para asbandas respetivas digesto dupla com
as enzimas de restrio XhoI e SacI,
partindo j da informao de que esta
ltima apenas corta o pGEM-3. Sabe-se
que estas duas enzimas juntas cortam o
plasmdeoemtrslocais,a2240pb,1146
pbe637pb.TendoemcontaqueaSacI
cortaoplasmdeonaposio2116pb,um
doslocaisdecortedaXhoIsera970pb
(2116 pb - 1146 pb). O outro local de
cortepelaXohIacontecenaposio337
pb(970pb637pb).
O mapa de restrio obtido encontra-se
apresentadonafigura9.
Construo do mapa de restrio do
fragmentoR
RelativamenteaofragmentoRprocedeu-
sedomesmomodoparaaconstruodo
mapaderestrio.Dadoqueasenzimasderestriousadasforamasmesmaseo
vetor o mesmo. Assim o mapa de
restrioobtidoencontra-seapresentado
nafigura10.
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Figura 9 Mapa de restrio do plasmdeo construdo a partir do vetor pGEM3 e do
fragmentoL.
Figura 10Mapade restrio doplasmdeo construdo a partir do vetor pGEM3e do
fragmentoR.
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DISCUSSO
Com a realizao desta atividade
conseguiu-se analisar segmentos deDNA
distintoscortados comvriasenzimasde
restrio,bemcomocompreenderquala
dimenso dosmesmos por comparao,
relativamente a um padro conhecido.
Para isso, teve-se em ateno o grfico,
querelacionaocomprimento(cm)como
nmero de pares de bases
correspondentes. Assim, por existir uma
dependncia/necessidade de determinarcomamaiorexatidopossvelonmero
deparesdebasesnumsegmentodeDNA,
acorretaelaboraodogrficotambm
fundamental. Assim, o rigor do modelo
ser proporcional ao nmero de
fragmentos considerados, cuja migrao
no gel de agarose foi analisadaanteriormente.Portanto,paradeterminar
o nmero de pares de bases que
compem os fragmentos contidos nos
diversospoos,utiliza-seumaladderque
permite estabelecer a comparao com
basenumaproporcionalidadedireta.
Atravs da elaborao do mapa de
restrio de ambos os fragmentos foi
possvel visualizar de forma esquemtica
o processo de corte de cada uma dasenzimas.
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PCRPOLIMERASECHAINREACTION
OBJECTIVOS
AmplificarumasequnciadeDNAgenmito
(gDNA) e de uma sequncia de cDNA,
amabas sequncias do genepolo, porPCR.
Anlise da eficincia e caractersticas do
gDNAedocDNAporelectroforese.
INTRODUOTERICA
AtcnicadePCR(reaodepolimeraseem
cadeia) o mtodo mais usado e rpido
paraaamplificaodecertosfragmentosde
DNA ou RNA em sistemas in vitro. Esta
tcnica, como a de clonagem molecular,
permitiu o desenvolvimento da Biologia
Molecular. A PCR uma tcnica com uma
vastagamadeaplicaes,quevodesdea
clonagem de DNA ou de cDNA (DNA
complementar), ensaios de mutaes in
vitro, engenharia gentica, anlise deamostras forenses, determinao de
agentesinfecciosos,diagnsticodedoenas
genticasatsequenciaodiretadoDNA
genmicoedocDNA.
A tcnica de PCR baseia-se na atividade
catalticadeumaDNApolimeraseerequera
existncia de dois iniciados
oligonucleotdicos (primers) que se
encontramnasextremidadesdo fragmento
de DNA a ser amplificado, a designadasequncia alvo. Para alm disso, a soluo
onde se encontram as DNA polimerases,
DNAeprimerssubmetidaavriosciclosde
aumento e abaixamento da temperatura.
Assim, em cada ciclo promove-se a
desnaturaodoDNAdecadeiaduplapelo
aquecimento, hibridam-se os primers s
sequncias complementares e por fim
ocorre a extenso dos primers por
incorporao de nucletidos por ao dasDNA Polimerases. Os nucletidos so
adicionadossextremidades3dos primersseguindo a complementaridade das bases
doDNAinicialqueservedemolde.Assima
nova sequncia formada pode agora servir
de molde para futuros ciclos, dando azos
para um aumento exponencial da
quantidade do material gentico. O
tamanhodascadeiasdeDNAqueseformam
sero sempre de tamanho bem definidos
dadoqueterminamtodosnasextremidades
5dosprimersutilizados.
Apesar de se tratar de uma tcnica com
elevada aplicabilidade e rendimento,
existemvrios parmetros que tm de ser
optimizadosdemodoaqueareaoocorra
deformacorreta.Porm,oparmetroque
considerado mais complexo do ponto de
vistadaoptimizaodatcnica,trata-sedo
desenhodosprimersadequados.Assim,um
bom desenho dos primers fundamental
para gerir damelhor formao oramentoepoupar tempo, dadoque ouso deprimers
adequadosaumentarosignificativamenteo
rendimentodareao.
Paraumbomdesenhodosprimersexistem
algumasregras,queemboraalgumassejam
empricas, apresentam resultados bastante
satisfatrios. Um dos fatores mais
importantes que o primer tenha uma
sequncia nucleotdica que seja nica na
regioalvo,demodoaevitaraligaoemmltiplos locais da zona a amplificar.
Comummente,a sequncia doprimerdeve
ser perfeitamente complementar
sequncia de bases da cadeia de DNA
molde.Outrofatorimportanteacolocao
de um resduo de guanina ou citosina na
terminao 3 do primer, isto porque a
ligao queseformaajudanacorreta
hibridao, pois tratam-se de resduos que
estabelecem trs pontes de Hidrognio e
portanto fortalecem a ligao estabelecida.
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Contudo sequncias que possuam trs ou
mais guanina (G) ou citosinas (C) deve ser
evitado, pois em caso de emparelhamentoerrneo,torna-semaisdifcilasuaremoo
para uma nova tentativa, dada a fora da
interaoformada.Nodesenhodosprimers
deve ter-se em ateno possibilidade de
emparelhamentoentreosprpriosprimers,
assim dever-se- ter em linha de conta
possveissequnciascomplementaresentre
diferentesprimers. Se houver uma grande
probabilidade de emparelhamento entre o
pardeprimersutilizado,aocorrnciadeste
fenmeno ser superior das reao de
PCR,dadaaprefernciascomqueocorrem.
Ainda dentro dos estudos de
complementaride dos primers, estes so
devemtersequnciascommaisde4bases
quepossamsercomplementaresdentrodo
mesmo primer, pois impulsionaria a
formao de estruturas por auto-
complementaridade, estruturas secundrias
(hairpins). Como j foi referido a
composio de bases dos primers muitoimportante,daqueumprimernodever
ter menos de 17, nem mais do que 25
nucletidos e o contedo em guanina e
citosinasdeveestarentre45a55%.Outro
aspectoimportanteatemperaturaqueos
diferentesprimersdentrodeummesmopar
hibridam,dado queessa temperatura deve
ser muito semelhante (Tm). Esta
temperatura pode ser calculado com base
naequao1enodevediferiremmaisdo
que5Centrecadaprimerdentrodeumparautilizar.
!= ! + ! 4 + ! + ! 2 (1)
No que diz respeito execuo
experimental propriamente dita, existem
alguns cuidados a ter em conta como a
utilizaoduma concentraoadequadade
Cloreto de Magnsio (MgCl2), dado que o
Mg2+umco-fatorimportantenaativao
da polimerase e ainda importante naestabilidadedascadeiasdeDNA(carregadas
negativamente). Neste tipo de tcnica
necessriorecorreraDNApolimerasesque
sejam resistentes s variao detemperatura que ocorrero durante os
ciclos, da usar-se frequentemente a Taq
DNA Polimerase (DNA polimerase
termoestvel) que extrada da bastria
Thermus aquaticus pois trata-se de uma
bactria extremfila encontrada em
ambientes aquticos a elevadas
temperaturas.
METODOLOGIA
REAGENTES
Utilizou-se 1ng de cDNA; 5ng de gDNA;
solues de 0,1 mol dm-3 dosprimers 9R1
(sense primer) e 9R2IC (antisense primer);
soluo de dNTPs com a concentrao de
200 mol dm-3; tampo de reao 1x;
soluo aquosa de MgCl2; Taq DNA
polimerase: 0,25U; gua estril ultrapura.
Para a electroforese utilizou-se agarose;
Brometo de etdeo (potencialmente
cancergeno;manusearcomluvaseevitaro
contactocomasviasrespiratrias).
EQUIPAMENTOS
Recorreu-seaumamplificadortermocclico
para efetuar o programa de ciclos para as
reaesdePCRecentrfuga.Suporteparao
geldeagarosee fontede alimentaoparaaelectroforese.
PROCEDIMENTOEXPERIMENTAL
PreparaodomeioreacionalparaPCRde
gDNA
ParaumtubodePCRpipetar1Ldasoluo
degDNA;5Ldetampodereao;1Lde
cadauma das soluesdeprimers; 4Lda
soluo de dNTPs; e 6L da soluo deMgCl2. Adicionar gua para perfazer um
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volumetotalde50L(tendoemcontaque
se ir adicionar,posteriormente, 0,25Lde
Taq DNA Polimerase), assim deve seradicionado um volume de gua estril de
31,75L.Misturarsuavementeamisturae
centrifugar.Adicionar0,25Ldasoluode
Taq DNA polimerase e misturar muito
suavementecomapontadapipeta.
PreparaodomeioreacionalparaPCRde
cDNA
Repetir o procedimento anterior, com a
exceodaadiode1LdegDNA,queemvez disso, dever ser adicionado 1L da
soluodecDNA.
Colocar ostubos dePCR embanho a 95C
durante 5 minutos. Segue-se o
acondicionamento dos tubos de PCR no
suporte do aplificador termocclico e
programar 15 ciclos. Cada ciclo dever
compreenderumperodode15segundosa
94C(promoveadesnaturao),seguidode
30segundosa50C(hibridao)e1minuto
a 72C (extenso). Aps o ltimo ciclo, as
amostrasdeveroficar10minutosa72C.
Retirar os tubos do amplificador
termocclicoeacondicion-losa4C.
Aplicarasamostrasemgeldeagarosea1%.
RESULTADOSEXPERIMENTAIS
DESENHODOSPRIMERS
Oprimer9RI(senseprimer)foiobtidocom
basenasregrasdefinidasnaintroduoeobtido diretamente a partir da sequncia
53.
J o primer 9R2IC (antisense primer)
obtidoapartirdasequnciadaextremidade
opostaecomoterdepolimerizarnacadeia
oposta,oprimer,terdesercomplementar
sbasesquecompeasequnciaescolhida.
Extremidade5dasequnciasensedaporoaamplificar
5AGCTATGCTATGCTATGCTAGCCAGTCAGCTGAACGTG3 Sequnciasense
5TATGCTAGCCAGTCAGC3 Primersense
Extremidade3dasequnciasensedaporoaamplificar
5TCTAATTCCAAGCCAATTGCCAAAAAGGAACCG3 Sequnciasense
3AGATTAAGGTTCGGTTAACGGTTTTTCCTTGGC5 Sequnciaantisense
3CGGTTAACGGTTTTTCC5 Primerantisense
O primer sense constitudo por 17
nucletidos, dos quais 9 so guanina ou
citosinas (53% de G/C) e apresenta uma
Tm=52C(calculadocombasenaequao1.
Para o primer antisense, o nmero de
nucletidos o mesmo (17), possu 8guaninas ou citosinas (47% de G/C) e
apresenta uma Tm=50C. Assim o par de
primers escolhido por ser usado para PCR,
dado que possuem um nmero de
nucletidosaceitvel,apercentagemdeG/C
estdentrodosparmetrosestipulados,ea
Tmdifereapenasem2Centrecadaumdosprimers.
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Combasenaequaodaretadeterminadae
nas distncias migradas pelas bandas do
cDNA (dmigrada=16,0 mm) e do gDNA(dmigrada=15,4 mm) possvel determinar o
nmerodeparesdebasesdecadaumdos
fragmentos,Tabela2.
Tabela 7 Valores referentes migrao
docDNAedogDNAemgeldeagarosea1%
erespectivonmerodeparesdebases.
dmirada
/mm pb
cDNA 16,0 463
gDNA 15,4 546
Como seria de esperar, o cDNA apresenta
um menor nmero de pares de bases
(menos83pb)doqueocorrespondegDNA.
IstoporqueocDNAobtidoatravsdeuma
transcriptase reversa a partir do mRNA
correspondente. Ora, o mRNA sofre um
processo de splicing ps transcrio demodo que os intres so removidos e
portanto, leva ao encurtamento da
sequncias de mRNA e consequente
encurtamentodasequnciadecDNA.Assim
podemosinferirquecercade80pbdogene
polo correspondem a intres e que no
codificamparaaprotena.
CONCLUSES
No que diz respeito ao desenhos dos
primers, estes seguem todas as condies
para optimizarem a reao de PCR, para
almdosrequisitosquesatisfazemequej
fora supracitados, apresentamainda pouca
probabilidade deemparelharem um com o
outro, para almde que no existemmais
doque3guaninasoucitosinasconsecutivas
emcadaumdosprimers.
O DNA genmico (gDNA) composto por
intres,exesefragmentosqueregulama
expresso gnica. Porm, apenas os exescontminformaoparaasnteseproteca,
dado que os intres so transcritos para
mRNA mas so eliminados durante o
processo de splicing domRNA.Assim de
esperar que o mRNA tenha menos bases
queoogDNAquelhedeuorigem.Comoo
DNAcomplementar(cDNA)obtidoapartir
do mRNA por ao enzimtica de uma
transcriptase reversa, esta poro de DNA
terumnmerodebasesinferioraogDNA
inicial, da o cDNA migrar mais do que o
gDNAemgeldeagarose.
Detectou-seainda amigrao demais trs
fragmentos diferentes no poo carregado
comgDNA,istodeve-seaestruturasdeDNA
com elevado efeito de supercoilling que
apresentamumamenor distnciasmigrada
no gel. Contudo, estas e a outra banda
detectvel no poo carregado com cDNA
podem dever-se a contaminaes do
material gentico utilizado. No que diz
respeito intensidade das bandas, esta
uma boa forma de avaliar a eficincia da
PCR qualitativamente. Verifica-se que a
banda correspondente ao gDNA deveras
mais intensa doque a decDNA, isto pode
estar relacionado com temperaturas que
noseajustavamtobemamplificaodo
cDNAcomooqueaconteceucomogDNA.
Pode aindapensar-se quea quantidadede
Mg2+ adicionada foi demasiado elevada equelevouaumasobreatividadedaTaqDNA
polimerase e que aumenta a
inespecificidade da tcnica, diminuindo a
eficincia e aumentanto o nmero de
bandas correspondentes a bandas no
desejveis.
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TRANSFORMAODEESCHERICHIACOLICOMDNA
PLASMDICO
OBJECTIVOS
Transformar E.coli com DNA plasmdico.
Transformar as clulas com plasmdeo
pBR322, pBR322-CAT, pEMBL9 e pEMBL9-
CAT.Avaliaraeficinciadatransformao.
INTRODUOTERICA
Define-se como transformao o processo
de introduo de DNA em clulas. Esta
tcnica atualmenteamplamenteutilizada
paraaamplificaodecertosfragmentosde
DNA.Aprimeiradescriodetransformao
deE.coliaconteceucercade40anosatrs
quando Mendel e Higa demonstraramque
clulas de E.coli tratadas com solues
geladas de cloreto de clcio, seguidas de
aquecimento, eram capazes de importarpara o seu interiorDNAdobacterifago .
Apesar de no se perceber muito bem o
mecanismo, a verdade que bactrias
sujeitasabaixastemperaturasemsolues
comcatiesficamcapazesdeimportarDNA
exgeno. Ao longos dos tempos tm sido
feitosvriosensaiosnosentidodemelhorar
a eficincia do processo, contudo nem
sempresepercebeofundamentopordetrs
detaisexecues.
Neste trabalho recorrer-se- ao cloreto de
clcio de modo a tornar as bactrias
competentes na importao do DNA. O
cloreto de clcio liberta caties clcio em
soluoqueneutralizamascargasnegativas
doDNAeajudam-noamigrarparaointerior
das bactrias. O choque trmico que se
sucede desorganiza momentaneamente as
membranas e faz com que o DNA consiga
migrar para o seu interior. As bactrias
crescem ento em meio no seletivo edepoissotranspostasparameiosseletivos.
Aeficinciadatransformaoobtidapela
razodetransformantesporgdeDNA.Nas
transformaes com cloreto de clcio
podem ser obtidas eficincias superiores a
108 transformantes por g de DNA. No
entanto, no laboratrio de rotina de
esperar valores na ordem dos 106-7
transformantesporgdeDNA.Paraquea
eficincia seja mxima necessrio ter
alguns pontos em considerao como arecolhadasbactriasnafaseexponencialdo
seucrescimento,manterasclulasemgelo,
prolongarotempodecontactoentreDNA,
cloreto de clcio e clulas e usar material
limpoereagentespuros.
Aps o choque trmico, adicionadomeio
noseletivoeprocede-seaumaincubao
de 30 a 60 minutos a 37C para que seja
expressoogenederesistnciaaoantibitico
(Amp). Ter de haver protena suficiente
antes das colnias serem plaqueadas em
meio seletivo. A enzima que confere a
resistncia a -lactamse que degrada o
antibitico.
Neste trabalho foram usados dois
plasmdeosdiferentesoclssicopBR322na
sua forma original contm os genes
responsveis pela resistncia ampicilinae
tetraciclina. Este plasmdeo foi tambmmodificado dando origem ao pBR322-CAT
por isero do gene CAT no local do gene
quecodificaparaaresistnciatetraciclina,
desativando-o. O segundo plasmdeo
utilizadoopEMBL9pertenceaumanova
gerao de vetores onde a insero dos
fragmentos de DNA ocorre num polylinker
localizado na extremidade 5 do gene que
codificaparaagalactosidase.Oplasmdeo
contm todos os elementos do promotor
necessrio para a induo da expressodesta enzima, quando na presena de
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Tabela 8 Volumes das solues
preparadas acima que foram plaqueadas e
respectivosmeios de cultura utilizados. Ostubos 1, 2, 3 e 4 correspondemaos tubos
preparados acima com os plasmdeos
pEMBL9, pEMBL9-CAT, pBR322 e pBR322-
CAT, respectivamente. O tubo 5
corresponde apenas soluo de clulas
competentes resultante do procedimento
A..
Tubo Volume/L Meiodecultura
1 125 Mac/Lac/Amp
LA/Amp2 Mac/Lac/Amp
LA/Amp
3 LA/Amp/Tet
LA/Amp
4 LA/Amp/Tet
LA/Amp
5 La/Amp
As placas so ento incubadas a 37C
durante a noite. Procede-se ento
contagem das colnias e toma-se nota das
suascoresnasplacasMac/Lac.
Para induzir a expresso do gene CAT e
testar a resistncia das clulas ao
cloranfenicol, procede-se transferncia,
com palitos esterilizados, de 10 colnias
individuais, dos meios anteriores, para
novos meios. Assim dever-se- tranferircolnias referentes ao pEMBL9, pEMBL9-
CAT e pBR322-CAT a partir dos meios
LA/Amp para placas (diferentes) com os
meios Mac/Lac/Clo. As placas so ento
incubadasa37Cduranteanoite.Verifica-se
entoocrescimentodascolnias.
RESULTADOSEXPERIMENTAIS
As figuras abaixo correspondem s placasincubadasa37Cduranteumanoite.
Figura 13 Placa com meio de cultura
LA/Amp.ControloTubo5.
Figura 14 Placas com meio de cultura Mac/Lac/Amp (esquerda) e LA/Amp (direita).
CorrespondeincubaodasbactriascomoplasmdeopEMBL9Tubo1.
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Figura 15 Placas com meio de cultura Mac/Lac/Amp (direita) e LA/Amp (esquerda).
CorrespondeincubaodasbactriascomoplasmdeopEMBL9-CATTubo2.
Figura 16 Placas com meio de cultura LA/Amp/Tet (esquerda) e LA/Amp (direita).
CorrespondeincubaodasbactriascomoplasmdeopBR322Tubo3.
Figura 17 Placas com meio de cultura LA/Amp/Tet (direita) e LA/Amp (esquerda).
CorrespondeincubaodasbactriascomoplasmdeopBR322-CATTubo4.
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Figura 18 Placas com meio de cultura
Mac/Lac/Clo. Corresponde incubao das
bactrias com o plasmdeo pEMBL9previamenteincubadasemLA/Amp.
Figura 19 Placas com meio de cultura
Mac/Lac/Clo. Corresponde incubao das
bactrias com o plasmdeo pEMBL9-CAT
previamenteincubadasemLA/Amp.
Figura 20 Placas com meio de cultura
Mac/Lac/Clo. Corresponde incubaodas
bactrias com o plasmdeo pBR322-CATpreviamenteincubadasemLA/Amp.
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resultado esperado para as bactrias com
pEMBL9 e pBR322-CAT porque o pEMBL9
no possu o gene que codifica para aclornfenicol acetil transferase e que
portanto no consegue degradar o
antibitico. As bactrias com pBR322-CAT,
apesardeteremogeneCATnoconseguem
express-lo porque falta-lhes os elementos
do promotor para a transcrio. Seria de
esperar que as bactrias compEMBL9-CAT
expressassemo gene CATporquepossuem
os elementos do promotor necessrios e
encontravam-se em condies com o seu
indutornatural,alactose.Ofactodenose
ter verificado o crescimento de bactriasnestemeiopodetersidocausadopelomal
acondicionamento das colnias, m
transfernciadascolniasdomeioLA/Amp
para o meio com clornfenicol, as colnias
transferidas no eram resistentes ao
clornfenicol, podendo at pensar-se que a
lactosenosejaoindutordaexpressodo
geneCATnoplasmdiopEMBL9.
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SEQUENCIAODEDNA
OBJECTIVOS
SequenciarumgenepelomtododeSanger.
Isolar uma protena por mtodos
bioqumicos e determinao dos primeiros
10aminocidos(N-terminal).Istopermiteo
desenho de primers degenerados que
podemserusadosnaaplificaodocDNAna
bibliotecagenmica(cDNA).
INTRODUOTERICA
Aclonagemapenasoinciodoestudode
um gene, posteriormente procede-se
anliseestrutural e funcionaldessemesmo
gene.Asequenciaodeumgeneumadas
etapas mais importantes na caracterizao
genmica, dado que oferece informao
acerca da estrutura gentica. O passo
decretrioparaasequenciaodoDNAacapacidade de obter fragmentos bem
definidos de DNA. Isto justifica a relao
estreitaentreaclonagemeasequenciao
e um gene, uma vez que a clonagem
possibilitaaobtenodumelevadonmero
de amostras do fragmento deDNA que se
pretendeestudar.
No mbito das tcnicas de DNA
recombinante,muitoimportanteconhecer
asequnciadogeneparaquesepossafazero devido manuseamento posteriori.
Normalmente, depois de sequenciado o
gene, a sequncia introduzida e corrida
por um software que procura os locais de
restrio, oferecendo assim um estudo
detalhadodetudodogeneemestudo.Estas
informaes so muito importantes, por
exemplo, se quisermos utilizar o gene em
causa como vetor para expresso proteica
ou subclonagem. A sequncia analisada
por software de modo a obter as regies
codificantes (ORF Open Reading Frame)
para alinhamento com as sequncias
aminoacdicasenucleotdicasresidentesnas
bases de dados. Isto permite obter
informaodebastanterelevnciaacercada
funo e estrutura do gene, sendo ainda
possvel obter informao acerca da
evoluo do gene em relao a outros
semelhantesjregistados.
Conhecer a sequncia do gene d-nostambm informao importante acerca de
pores no codificantes do gene 5 e 3,
isto utilizado para perceber melhor o
funcionamento da regulao gnica e
possibilita a aplicao de tcnicas de
mutao dirigida a um determinado gene.
Porfim,eumdospapismaisimportantes
da sequenciao aplicada diretamente
medicina, a deteco de zonas que
apresentem alteraes em determinados
nucletidos e que podem originar doenas
genticas. Este conhecimento permite a
produo aprimorada de tcnicas e
frmacosparaotratamentodamutaoem
causa.
Nos meados da dcada de 70 comeam a
surgir as primeiras tcnicas de clonagem
moleculareconsigotambmastcnicasde
sequenciao.O investigadorRobertHolley
criaraumatcnicadesequenciaodetRNAque fora usada, inicialmente, para
sequenciarDNAemboracomresultadosno
muito relevantes. Mais tarde Gilbert e
Sanger trabalhamarduamentena tentativa
deencontrarumatcnicaquepossibilitasse
a sequenciao do DNA. Daqui surgiram
duas tcnicas, a degradao qumica de
MaxameGilberteomtodoenzimticode
Sanger. Apesar dos princpios subjacentes
serem diferentes, ambos se baseavam na
produodepopulaesdeoligonucletidosque comeavam sempre num local
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especfico e conhecido e terminavam num
determinado resduo. Os locais de
terminao so, portanto, nucletidosespecficos mas que ocorrem em locais
aleatriosaolongodoDNA.Assimpodemos
obter populaes de oligonucletidos que
acabam em A, T, G ou C. Assim sero
obtidos oligonucletidos de comprimentos
diferentes, consoante a altura em que foi
incorporado um ddNTPs e portanto no
possvelocrescimentodasequnciaapartir
desse ponto. Os fragmentos so ento
corridos em gel de poliacrilamida onde
possvel distinguir fragmentos que diferem
apenasnumnucletido.
OmtodoeGilbertencontra-seemdesuso
pelo uso de marcadores radiativos nos
extremosdosfragmentosdeDNAqueeram
posteriormente degradados por reaes
especficas. Assim a posio de cada
nucletido na cadeia de DNA era
determinadapeladistnciaentreopontode
degradao e a extremidade radioativa
visualizadaporautoradiografia.
O outro mtodo mais comummente
utilizadoebaseia-senaadiodeumddNTP
especficoaumamisturadetodososdNTPs,
o que, aleatoriamente, ir incorporar um
ddNTP e finalizar a polimerizao de uma
dascadeias.Istoaconteceporquenoexiste
ogrupoOHnoC3.Istoimpedeaformao
da ligao fosfodister entre dois
nucletidos vizinhos, impedindo acontinuao do alongamento da cadeia.
Nestemtodo, recorre-se aumprimerque
hibridrizanacadeiasimplesdeDNAeleva
polimerizao de uma nova cadeia
complementar. Repete-se o procedimento
comquatromeiosreacionaisdiferentesem
que cadaum delescontmum dos quatro
tipos de ddNTPs. O primer est marcado
radioactivamente ou por um marcador
fluorescente, fazendo com que os
fragmentospossamseridentificadosemgel.AadiodeumapequenaporodeddNTP
faz com que ocorra a competio entre a
inclusodosdNTPsquelevamcontinuao
doalongamento da cadeia e a incluso deumddNTPquefinalizaacadeia.Fazendoa
reaocomosquatroddNTP, obtm-se os
respectivosoligonucletidoscomosprimers
na extremidade 5. Estes fragmentos so
corridos em gel em 4 poos diferentes. A
revelao feita por fluorescncia ou por
exposioaumaplacafotogrfica(RaiosX).
Assim podemos ler a sequncia do fundo
para o topo, sendo essa a ordem dos
nucletidosdaextremidade5>3.
Atcnicamaisrecenteparaasequenciao
do DNA marca os ddNTPs ao invs de
marcar osprimers. Assim basta fazer uma
reao,poisosoligonucletidosobtidosso
depois corridos em gel no interior de
capilares (electroforese capilar) e os
diferentes ddNTPs so identificados por
anliselaseremequipamentosautomticos.
Isto possvel por marcao dos ddNTPs
com marcadores fluorescentes de cores
diferentes.
RESULTADOSEXPERIMENTAIS
SequnciadeAminicidos:
N-Ser-Tyr-Cys-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Ala-C
Sequncia reconhecida pela enzima de
restrioEcoRI:
5GAATTC3
Sequncia reconhecida pela enzima de
restrioHindIII:
5AAGCTT3
Por anlisedosresultadosde electroforese
(Anexo 1) possvel obter a sequncia da
cadeiaqueseformouporemparelhamentocom a cadeia a sequenciar, sendo que as
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Acima encontra-se a sequncia codificante
do clone B e respectiva sequncia de
aminocidosquecodificam(negrito).
CONCLUSES
Atravs do mtodo de Sanger foi possvel
descobrirqueprimerfoiusadonosensaios
de PCR de cada umdos clones. Para alm
disso foi possvel identificar a sequncia
codificantequecodificaparaasequnciade
aminocidos em causa, sendo essa
correspondenteaoclone B.A identificao
dos primers utilizados para a amplificaodassequnciasporPCRfoifeitoporanlise,
na sequncias codificante, dos nucletidos
queagrupados3a3diferiamnomximono
ltimo nucletidodesses tripletos. Isto por
definio de mistura de primers
degenerados.
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CLONAGEMDECDNAY-TUB
OBJECTIVOS
Clonar o gene de cDNA y-TUB. Verificar,
experimentalmente, o resultado da
transformao de bactrias com DNA com
diferentestratamentos.
INTRODUOTERICA
ODNAcomplementar(cDNA)amplamenteutilizadoquandosepretendeamplificarum
gene que codifica para uma determinada
protena. A vantagem do cDNA que no
contm os intres que o gene original
conteria, assim apenas amplificada a
sequncia codificante, poupando-se
recursos e ignorando o processamento do
mRNA.Ogeneemcausa,nestecasocDNA,
inserido num vetor, que pode ser um
plasmdeo,eintroduzidoembactriasdemodo a que o crescimento das colnias
aumente a quantidade de cDNA e leve
formaodecolniascomogeneemcausa.
METODOLOGIA
REAGENTES
Usou-se soluo contendo o plasmdeo
recombinante pSK-yTUB digerido com aenzima de restrio EcoRI; Agarose (1%);
marcadores de pesos moleculares;
membrane binding solution; membrane
wash solution; tampo de ligao (5x);
soluo de T4-ligase; soluo de E.coli
JM101 competentes; placas com meio
Mac/Lac/Amp.
EQUIPAMENTO
Usou-se o transiluminador de UV; mini-
colunaSV;centrfuga
PROCEDIMENTOEXPERIMENTAL
A.DigestoepurificaodoDNA
O plasmdeo recombinante pSK-yTUB
previamente digerido comEcoRIdeacordo
com o procedimento descrito em Anlise
electroforritca de DNA digerido com
enzimas de restrio. Aplicar em gel de
poliacrilamida o marcador de pesos
moleculares,oplasmdeorecombinanteno
digeridoeosprodutosdadigesto.Correro
geldepoliacrilamidaa100Vatafrentedo
gelpercorrer2/3dogel.Visualizarogelnum
transiluminadorUV.Excisarasbandasdogel
correspondentes aos produtos dadigesto.Colocar as bandas num Eppendorf.
Determinaramassadabandaexcisadapor
pesagemdotuboEppendorfantesedepois
da adio da exciso. Adicionar 1L de
Membrane Binding Solution por cada 1mg
degel.Vortexarvigorosamenteeincubara
65C at a agarose se dissolver
completamente. Transferir a soluo
resultante para uma mini-coluna SV
previamente inserida num tubo coletor.
Centrifugar velocidademximadurante1
minuto, descartar o filtrado e voltar a
colocar a colunadentrodo tubo.Adicionar
700L de Membrane Wash Solution.
Centrifugar velocidademximadurante1
minuto. Descartar o filtrado e colocar a
coluna dentro do tubo. Repetir o passo 8.
Com 500L de Membrane Wash Solution.
Transferir a mini-coluna SV para um
Eppendorf limpo e adicionar 50L de gua
ultra-pura e centrifugar velocidademximadurante1minuto.Porfimdescartar
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a mini-coluna SV e guardar o filtrado em
gelo.
B.Ligao
Preparam-se quatro solues com a
composioapresentadanatabelaabaixo.
Tabela10Volumesmedidospara4tubos
eppedorf diferentesdemodo a provocar a
ligaodocDNAaovetorpKS.
ReaesSoluo A B C D
VetorpKSdigerido 5L 5L 5L
cDNA 10L 10L 10L
Tampodeligao 4L 4L 4L 4L
Taqligase 1L 1L 1L
Agitar suavemente a mistura por colises
suaves com o dedo no fundo do tubo.
Incubar a 37C durante uma hora, em
alternativapoder-se-incubara4Cduranteanoite.Congelaramisturaa-20C.
C.Transformao
Descongelarumaalquotadeclulas E.Coli
JM101 competentes em gelo. Colocar num
Eppendorf5LdepKSenumoutro5Lda
mistura de ligaoobtidano procedimento
B. Para umoutro tubomedir 5L de gua
ultra-pura, este sero controlonegativo.A
cada um dos tubos adicionar 50L dasclulas competentes e misturar com
movimento circulares efectuados com a
ponta dapipeta. Incubaros tubos emgelo
durante 20 minutos. Provocar o choque
trmico das clulas colocando-as a 42C
durante2minutosecolocarnovamenteem
gelodurante2minutos.Adicionar200Lde
meio LB e incubar a 37C durante 30
minutos com agitao. Plaquear as clulas
em meio Mac/Lac/Amp. Incubar as placasduranteanoitea37C.
RESULTADOSEXPERIMENTAIS
Apsa incubao,asplacasobtidas tinhamoaspectodasfigurasabaixoapresentadas.
Figura21Placaresultantedocrescimento
decolniasdebactriastransformadascom
amisturareacionalA.
Figura22Placaresultantedocrescimento
decolniasdebactriastransformadascom
amisturareacionalB.
Figura23Placaresultantedocrescimento
decolniasdebactriastransformadascomamisturareacionalC.
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Figura24Placaresultantedocrescimento
decolniasdebactriastransformadascom
amisturareacionalD.
Tabela 11 Contagem das colnias e
avaliaodaeficinciadatransformao.
ColniasColnias
TransformadasEficincia
(%)
A 128 29 22,6
B 0 0 0,0
C 0 0 0,0
D 63 0 0,0
CONCLUSES
A reao A corresponde poro onde
realmenteteriadehaveratransformaoe
realmente isso aconteceu, isto porque
existem algumas colnias amarelas que
correspondem s colnias de bactrias
transformadas,umavezquenoexpressam
ogeneLACequeportantonoproduzem-
galactosidade que degrada a lactoseoriginado cido frmico que leva a um
abaixamento do pH. Esse abaixamento
evidenciado pelo aparecimento da cor
violeta em corante neutral red. Caso o pH
no baixe as colnias apresentam-se
brancas. Assim, verifica-se que a placa A
apresenta colnias de bactrias queincorporarm o cDNA. A no expresso do
gene LAC quando o cDNA incorporado
explicado pelo facto da incorporao
acontecernomeiodogeneLAC,impedindo
asuaexpresso.
Noquedizrespeitoreaonaausnciade
cDNA,ovetorfechaexpressosemocDNA
inserido. Isto faz com que as bactrias
resistam ampicilina mas que todas elas
expressem para a -galactosidade, fazendocom que todas as colnias sejam violetas
(diminuiodopHprovocadapelalibertao
decidofrmico).
As placas B e C no apresentam colnias,
porque as bactrias so incapazes de
sobreviver. No C no apresentam o vetor
que contm o gene que codifica para a
resistncia ampicilina, dando origem a
bactrias susceptveis e que no resistem.
NocasodoB,comonoseadicionaaTaqLigase,oplasmdeonocapazdeciclizare
portanto no possvel proceder
transcrioparaaqueogenederesistncia
ampicilina seja expresso e portanto as
bactriasnoseconseguemdesenvolver.
Porcontagemdascolnias,verifica-sequea
transformao ocorreu em 22,6% das
bactrias que deram origems respectivas
colnias.
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