Relatório Técnico TEC DOC VITAFOR 001 - 2013

VITAFOR

Documento Técnico

TEC DOC 001-2013

MÉTODOS DE ANÁLISE DE NITROGÊNIO/PROTEÍNA EM SUPLEMENTOS NUTRICIONAIS À BASE

DE WHEY (PROTEÍNA DO SORO DE LEITE) E VARIAÇÃO NOS RESULTADOS

Preparado por

ITALO SALZANO JR.

Em nome do

Comitê Técnico-Científico e de Assuntos da Qualidade - CQUAL Agosto - 2013

MÉTODOS DE ANÁLISE DE NITROGÊNIO/PROTEÍNA EM SUPLEMENTOS NUTRICIONAIS À BASE

DE WHEY (PROTEÍNA DO SORO DE LEITE) E VARIAÇÃO NOS RESULTADOS

VITAFOR TEC DOC Internacional

001-2013/A

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predizer e tratar anormalidades metabólicas, retardar e reverter o processo de envelhecimento

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MÉTODOS DE ANÁLISE DE NITROGÊNIO/PROTEÍNA EM SUPLEMENTOS NUTRICIONAIS À BASE

DE WHEY (PROTEÍNA DO SORO DE LEITE) E VARIAÇÃO NOS RESULTADOS

1.1 Introdução

Métodos analíticos têm a função de gerar dados precisos e confiáveis para uso tanto por

fabricantes de suplementos nutricionais quanto por autoridades reguladoras, com os

respectivos objetivos de controle de qualidade e cumprimento legal. Confiabilidade, exatidão,

precisão e especificidade são as palavras-chave para que o método (a metodologia analítica)

tenha utilidade, porém os analistas devem tomar ações para provar que qualquer método que

eles venham a utilizar possua todas estas características, principalmente se o método for

empregado no cenário crítico, ou seja, num laboratório de controle de qualidade, num

laboratório clínico ou num laboratório forense.

Suplementos nutricionais e seus ingredientes constituintes impõem inúmeros desafios analíticos

devido à complexidade da matriz e, como consequência disso, a validação de métodos

provou ser até hoje um objetivo particularmente difícil de ser atingido. Qualquer matéria prima

empregada na fabricação do produto acabado é invariavelmente irregular, já que a sua

composição química pode depender de fatores extrínsecos, tais como origem geográfica,

micro clima e práticas de criação, cultivo, extração e colheita. Todos estes desafios são ainda

mais influentes devido à escassez de métodos analíticos validados, bem como à falta de

materiais de referência confiáveis, tanto botânicos quanto químicos.

Felizmente, existem aproximações sistemáticas para se assegurar que um método em particular

venha a produzir dados acurados e precisos. A habilidade de um método em particular para se

ajustar ao propósito específico é um elemento extremamente importante de validação, o qual,

porém é frequentemente desprezado. Quando se emprega métodos analíticos que estejam

fora de seu escopo e aplicabilidade, eles passam a não mais serem cientificamente válidos.

Possuir e empregar ferramentas analíticas a fim de avaliar identidade, pureza e potência de um

suplemento nutricional não é apenas um pré-requisito sob a influência das novas diretrizes

cGMP (Certified Good Manufacturing Practices) estabelecidas na norma 21CFR111 da

FDA/EUA, mas também se constituem num fator crítico para garantir a segurança do

consumidor final, para o desenvolvimento e manutenção dos padrões de garantia da

qualidade e, finalmente, para uma eficácia de testes que tenha algum significado com relação

a estes produtos.

Ao mesmo tempo em que a indústria de suplementos nutricionais procura ir em frente e obter

progressos de maneira contínua, ela ainda precisa carregar o ônus provocado por falhas

históricas enquanto reage aos novos desafios impostos pela garantia da qualidade, já que a

qualidade de um produto afeta tanto o acesso ao mercado quanto o crescimento deste

mercado. Isso pode certamente ser um impedimento quando produtos de baixo custo (e

frequentemente de baixa qualidade) confundem e diminuem o respeito e confiança de

consumidores, imprensa e agências reguladoras.

A reputação de um suplemento nutricional como sendo apenas “óleo de cobra” ou

“suplemento nada mais é do que uma droga anabolizante” diminui o interesse, visão,

aceitação e o uso de matérias primas de alta qualidade e baseadas unicamente em ciência.

Produtos fraudulentos e inseguros destroem a aceitação pelo mercado por outros produtos

fabricados sem falsificações e, embora a cobertura realizada pela mídia tenha se desviado

mais para produtos que não atendam o que está escrito no rótulo comparado a produtos

inseguros para consumo, é justamente a reputação dessa indústria em geral que mais sofre

com este cenário. A consequência inevitável disso é que profissionais de saúde, professores

escolares, agências reguladoras, políticos e órgãos governamentais perpetuaram a atitude de

ridicularizarem e desconsiderarem suplementos nutricionais como sendo contribuintes potenciais

para uma drástica redução nos custos de saúde das populações em geral, fato que há muito

tempo já está fartamente documentado na literatura científica.

A implementação de um Programa de Garantia da Qualidade que seja específico para a

fabricação de suplementos nutricionais é um desafio tanto para fabricantes quanto para

empresas situadas no início da cadeia de produção, mas principalmente para os laboratórios

que fornecem suporte para esta indústria. Embora investidores estejam conscientes dos assuntos

relativos à qualidade e seu crescente impacto nesse ramo de atividade, os empresários de

maneira isolada não necessariamente possuem o conhecimento (expertise), nível

organizacional e capacidade financeira requerida para satisfazerem as exigências desse tipo

de Programa.

Este Documento Técnico tem como objetivo principal expor os aspectos analíticos e de

qualidade que desafiam a indústria de suplementos nutricionais e as recomendações para a

solução destes problemas, principalmente no que diz respeito à obrigatoriedade de uma

uniformização ou padronização dos métodos de análise do conteúdo de proteína presente em

produtos à base de proteína do soro de leite (whey). As informações aqui presentes também se

destinam ao público leigo (consumidor final) caso este público tenha a curiosidade de

comprovar as informações contidas nos rótulos de produtos acabados.

1.2 Validação de métodos analíticos

Desde o final da década de 90, o assunto qualidade tem sido descrito como uma das maiores

exclamações que desafiam consumidores, profissionais da saúde e agências reguladoras em

todo o mundo. No entanto e de forma geral, no mundo real a qualidade de um produto tem

sido definida pelas especificações técnicas de um produto, as quais são estabelecidas pelos

próprios fabricantes do produto final. O aspecto de “adequado para o propósito” equaciona a

qualidade através do preenchimento de uma especificação ou critério declarado.

Os desafios analíticos associados à Garantia da Qualidade vão desde a confirmação da

identidade da matéria prima extraída a partir de uma matriz de soro de leite (química

qualitativa) até a quantização de nitrogênio originário de proteína nutricional (química

quantitativa). Enquanto que inúmeras publicações descrevem os procedimentos para a

determinação dos constituintes de interesse, poucos métodos analíticos foram avaliados nos

critérios de acuidade, precisão ou confiabilidade, enquanto que muito frequentemente a

análise de produtos acabados à base de proteína não está dentro do escopo do método

publicado.

Em outras palavras, dentro do contexto de um Programa de Garantia da Qualidade, a

qualidade de um produto é frequentemente baseada em métodos analíticos e a maneira com

que o fabricante assegura que um método está funcionando (isto é, adequado para o

propósito) é justamente a realização de uma série de experimentos conhecidos como

validação.

A Conferência Internacional sobre Harmonização de Requisitos Técnicos para o Registro de

Medicamentos de Uso Humano (ICH) define “adequado para o propósito” como sendo o [grau

pelo qual os dados produzidos por um processo de medida permite com que um usuário tome

decisões tecnicamente e administrativamente corretas para um determinado propósito]. Isso

está relacionado com escopo e aplicabilidade: para que um método analítico seja útil, ele

precisa ser customizado para analitos, matrizes e concentrações esperadas e específicas para

o produto em análise.

Também devem ser determinadas a frequência com que o método será utilizado e a aplicação

específica para o mesmo (qualitativa ou quantitativa ou ambos, se o teste é de estabilidade, se

o propósito for pesquisa e desenvolvimento de produto, em caso da determinação da

uniformidade do processo ou com o objetivo de identificar a presença de adulterantes no

produto – por exemplo, presença de melamina ou soja ou maltodextrina no caso de

adulteração do conteúdo total de proteína em um suplemento nutricional à base de whey).

Existem duas classes diferentes de métodos analíticos:

Método com base em especificações. – estes métodos são prescritivos, isto é, definem o

tamanho da coluna cromatográfica, o tamanho de partícula da fase de injeção da coluna,

porosidade, taxa de fluxo, etc.

Método com base em desempenho. – estes métodos descrevem o desempenho (performance)

mínimo aceitável que deve ser atingido para que os dados sejam aceitáveis.

O desenvolvimento e validação de métodos analíticos é bastante desafiador quando se lida

com analitos pobremente definidos (flavonóides e compostos fenólicos, bem como extratos

padronizados, softgels, comprimidos, cápsulas) e principalmente matrizes complexas como a

proteína do soro de leite (whey). Definir-se analitos e matrizes dentro do contexto de adequado

para o propósito é importante para o desenvolvimento de um método bem sucedido.

Além disso, os métodos analíticos não são universais, pois características, escopo, técnicas e

aplicabilidade diferem dramaticamente entre si. Assim é essencial com que se tenha um

conjunto único de instruções que podem ser usadas para validar todos os métodos. No entanto,

todos os métodos analíticos também compartilham algumas semelhanças básicas.

Validação de método é o processo utilizado para confirmar se o procedimento analítico

empregado para um uso específico é adequado para o propósito. Isso inclui a verificação

inicial das características de desempenho, a realização de vários testes entre laboratórios e

controle de qualidade. Toda validação tem como objetivo assegurar que um processo de

medidas produz resultados válidos: assim, os resultados da validação de método podem ser

usados para julgar qualidade, confiabilidade e consistência dos resultados analíticos, sendo

uma parte integral de uma boa prática analítica.

Quando um processo de medida produz resultados válidos para uma determinada aplicação

ele é considerado como sendo adequado para o propósito. Além disso, os métodos analíticos

devem ser validados ou revalidados nas ocasiões seguintes:

- antes da sua introdução no uso rotineiro;

- quando condições (por exemplo, a matriz) diferem para as quais o método foi validado, e

- quando o método é modificado e essa mudança foge do escopo original do método.

Determinadas características de desempenho devem ser especificadas e atendidas a fim de

que os resultados fornecidos pelo método tenham algum significado legítimo. Diversas

entidades governamentais e não-governamentais divulgaram diretrizes expondo as

metodologias aceitas na avaliação e estabelecimento das características de desempenho,

com a finalidade de auxiliar na determinação daquilo que deve ser feito para se provar que o

método é adequado para o propósito(1-29). É somente através da validação sistemática de

métodos é que um cientista pode confiantemente demonstrar que seu método analítico é

adequado para o propósito e, consequentemente, apresentar os seus dados resultantes como

sendo válidos.

Os diferentes níveis de validação de método incluem a Validação de Laboratório Único (SLV), a

qual se aplica para um laboratório ou técnico ou equipamento específico; Validação de

Verificação Anônima (PVV), a qual se aplica para vários laboratórios (de 2 a 7 laboratórios) e

que fornece informações sobre como o método é interpretado fora do laboratório original e

Validação de Estudo Colaborativo (FCS), a qual se aplica quando oito ou mais laboratórios

fornecem dados aceitáveis usando o método em questão. Devido ao fato de que estes

diferentes níveis de validação orbitam seus respectivos graus de robustez, a forma mais rigorosa

de validação de método é obtida através da validação colaborativa. Tais estudos

colaborativos nem sempre são práticos ou possíveis para gerenciamento pelos laboratórios, já

que eles requerem comprometimentos específicos relativos à carga horária de trabalho tanto

da equipe quanto de equipamentos em laboratórios múltiplos em várias partes do mundo.

1.3 Determinação da concentração total de proteína em produtos à base de whey

Proteínas são polímeros de aminoácidos, sendo que um total de vinte aminoácidos ocorre

naturalmente nas proteínas encontradas no corpo humano. As proteínas diferem entre si de

acordo com seu tipo, número e sequência de aminoácidos que forma a estrutura polipeptídica.

Como conseqüência disso, elas apresentam estruturas moleculares variadas, atributos

nutricionais amplos e propriedades fisioquímicas distintas. Elas formam os principais

componentes estruturais de inúmeros alimentos naturais, frequentemente determinando a

textura do alimento em geral, isto é, a maciez das carnes vermelhas e produtos à base de

peixe. As proteínas isoladas são muito utilizadas como ingredientes em alimentos devido às suas

exclusivas habilidades funcionais (por exemplo, habilidade em proporcionar estabilidade,

textura e aparência desejáveis).

Tipicamente, as proteínas são utilizadas como agentes de gelação (gelificação), emulsificantes,

agentes de formação de espuma e espessantes. Muitas proteínas alimentares são enzimas

capazes de acelerar a taxa de ocorrência de reações bioquímicas, sendo que tais reações

podem ter um efeito tanto favorável quanto prejudicial sobre as propriedades do alimento.

Normalmente, analistas de alimentos estão interessados em saber a concentração total, tipo,

estrutura molecular e propriedades funcionais das proteínas contidas em um produto.

Na data de redação deste TEC DOC existem inúmeros métodos de quantização da

concentração de proteína em suplementos nutricionais, sendo que muitos deles são diretos e

confiáveis. A escolha do método mais adequado (método ótimo) é um problema recorrente e

a solução frequentemente requer o emprego de mais do que um método ou protocolo.

Uma boa estratégia é se comparar os resultados de dois métodos que se baseiam em diferentes

propriedades químicas. É extremamente comum a ocorrência de diferenças muito grandes nas

estimativas do conteúdo total de proteína entre dois ou mais métodos, especialmente quando

se analisa amostras brutas de componentes, tecidos ou alimentos, pois estas certamente

podem estar carregadas com substâncias interferentes. Desta forma, a principal preocupação

é como manobrar o ensaio levando em conta a presença de interferências e como eliminá-las

de maneira definitiva, usando protocolos analíticos para acompanhar o progresso.

Métodos analíticos para a quantização de conteúdo total de proteína em produtos à base de

whey normalmente discordam entre si por um fator de até 20%, mesmo no caso de uma

proteína hipoalergênica e que não carregue nenhuma substância interferente. No caso de

amostras brutas, a percentagem de discordância é ainda maior e existem duas maneiras gerais

de se lidar com tais discrepâncias. A primeira delas é remover componentes que provoquem

interferências que possam comprometer um, ou talvez dois, ensaios, ou então lançar mão de

um terceiro método (caso haja um número suficiente de amostras para a solução das

diferenças). A segunda maneira é usar um novo método analítico (já validado) ou usar

variantes de métodos existentes ou então usar métodos para remoção de substâncias

interferentes já que o campo da bioquímica analítica está em contínua evolução.

Existe uma grande variedade de métodos instrumentais disponíveis para a determinação do

conteúdo total de whey em suplementos nutricionais e eles podem ser divididos em diferentes

categorias, de acordo com seus princípios físico-químicos: (i) medida das propriedades físicas

brutas, (ii) medida de adsorção de radiação, (iii) medida do espalhamento de radiação, (iv)

análise de aminoácidos, (v) análise por infravermelho (IR), (vi) fusão em gás inerte, (vii) análise

cromatográfica com espectrometria de massa, e (viii) análise por proteômica de alta definição

(UPLC - cromatografia líquida de ultra performance) com marcadores radioativos/estáveis.

Cada método instrumental apresenta suas vantagens e desvantagens, bem como a variedade

de amostras para os quais eles podem ser aplicados.

Medida das propriedades físicas brutas

Densidade: A densidade de uma proteína é maior do que a grande maioria dos outros

macronutrientes e, assim, existe uma elevação na densidade de um alimento conforme

aumenta seu conteúdo de proteína.

Índice refrativo: O índice refrativo de uma solução aquosa aumenta conforme seu conteúdo de

proteína for se elevando e, portanto, medidas do índice refrativo podem seu usadas para

determinar a concentração de proteína em um suplemento nutricional.

Medida da adsorção de radiação

UV-vis: A concentração de proteína pode ser determinada ao se mensurar a absorbância de

radiação ultravioleta-visível.

Infravermelho: Técnicas infravermelhas podem ser usadas para se determinar a concentração

de whey em suplementos nutricionais. O whey absorve naturalmente a radiação infravermelha,

devido às vibrações características (alongamento e curvatura) de alguns grupos químicos ao

longo da cadeia polipeptídica. Desta forma, medidas da absorbância de radiação em

determinados comprimentos de onda podem ser usadas para se quantizar a concentração de

proteína em uma amostra. As técnicas IR são particularmente úteis para a obtenção de análises

rápidas on-line do conteúdo de proteína, além de requererem pouco trabalho na preparação

da amostra e serem ensaios não destrutivos. Suas principais desvantagens são o alto custo inicial

e a necessidade de uma permanente e completa calibração.

Ressonância nuclear magnética com 13C: A espectroscopia NMR utilizando isótopos estáveis

(por exemplo, carbono-13) pode ser usada na determinação do conteúdo de proteína em

suplementos nutricionais à base de whey. A concentração de proteína é mensurada através do

cálculo da área sob o pico num espectro NMR de desvio químico correspondente à fração de

proteína.

Medida do espalhamento de radiação

Espalhamento de luz. A concentração de agregados de proteína em solução aquosa pode ser

determinada utilizando-se técnicas de espalhamento de luz, devido ao fato de que a turbidez

de uma solução é diretamente proporcional à concentração de agregados presentes na

amostra.

Espalhamento ultrassônico. A concentração de agregados de proteína também pode ser

mensurada com o uso de técnicas de espalhamento ultrassônico, já que tanto a velocidade

ultrassônica quanto a absorção de ultrassom estão relacionadas com a concentração de

agregados de proteína presente na amostra.

Análise de aminoácidos

A análise padrão de aminoácidos (AAA), incluindo hidrólise por tempo resolvido, é uma

ferramenta empregada há bastante tempo para se determinar a concentração de proteína

em amostras de whey sem a necessidade de uso de um padrão externo.

Além disso, ela é um pré-requisito para o emprego de outras técnicas, tais como degradação

Edman, espectrometria de massa e outras aproximações baseadas em sequenciamento. O

grande problema com esta técnica é que o erro médio entre laboratórios fica na faixa de 10-

12%, pois a hidrólise cuidadosa da amostra de proteína é um dos pontos cruciais para uma

análise bem sucedida, já que até mesmo impressões digitais inadvertidamente fornecidas pelo

técnico durante a preparação da amostra podem provocar contaminação.

Enquanto que a hidrólise enzimática e a hidrólise básica possam ser especialmente úteis, a

hidrólise ácida é a técnica mais comumente usada, sendo que a hidrólise de fase líquida é

considerada o ensaio padrão. As amostras precisam obrigatoriamente ser hidrolisadas a vácuo

ou em atmosfera inerte, a fim de se prevenir qualquer oxidação.

Derivatização pré-coluna. Este método ganhou popularidade a partir de 1994, já que este

ensaio é considerado como apresentando maior sensibilidade do que as aproximações pós-

coluna. Dentre as diversas opções de derivatização pré-coluna existentes, a mais utilizada

emprega o uso de fenilisotiocianato (PITC). A vantagem da derivatização PITC com relação a

outros ensaios pré-coluna é que ele reage tanto com aminas primárias quanto secundárias,

enquanto que outras aproximações não reagem com o aminoácido prolina. Outras vantagens

incluem sensibilidade, estabilidade e detecção UV (em oposição à fluorescência).

Um problema com a derivatização pré-coluna é que a cromatografia é realizada com o uso de

colunas C-18 de fase reversa e, assim, é vital a manutenção de uma boa coluna de guarda. As

colunas de guarda devem ser substituídas a cada 150 análises, enquanto que a coluna de

separação ainda é viável para uso num intervalo entre 400 análises e 600 análises.

As vantagens da aproximação pré-coluna incluem a simplicidade dos procedimentos de

derivatização, disponibilidade de derivatizantes estáveis, excelente separação, detecção tanto

por absorbância quanto por fluorescência e grande variedade de reagentes comerciais.

Entre as desvantagens desta aproximação estão o tempo cromatográfico muito longo (57

minutos) e alto consumo de solventes (caso não sejam empregadas colunas microbore).

Derivatização pós-coluna. A cromatografia de troca iônica para a análise de aminoácidos foi

inicialmente automatizada em 1963. A tecnologia inicial utilizava buffers grosseiros para a

eluição de aminoácidos a partir da coluna de troca iônica, porém os instrumentos mais

modernos utilizam gradientes contínuos de eluição, um avanço importante que acarretou em

um número muito menor de perturbações de linha de base.

O núcleo desta técnica é justamente a coluna, composta de resina de troca catiônica

hidrofílica. A fabricação dessa resina é extremamente complexa e não completamente

controlada, de forma que se consegue detectar diferenças entre os lotes de fabricação no que

diz respeito a efeitos de partição, efeitos de adsorção e até mesmo efeitos de exclusão de

tamanho.

Para esta técnica foram desenvolvidos vários detectores, sendo que o clássico e mais utilizado é

a nihidrina. A reação de nihidrina com aminoácidos resulta na produção de um composto

colorido (púrpura de Rhueman) e é a responsável pela especificidade desta técnica.

Desenvolvimentos recentes incluem a triona (um derivado mais estável, porém menos sensível)

e reagentes de detecção por fluorescência, incluindo fluorescamina e o-ftaldialdeído (OPA).

Quando se compara os métodos pré-coluna e pós-coluna, se verifica a existência de algumas

vantagens para este último tipo de ensaio:

- Já que as propriedades de troca iônica dominam quando a amostra de whey é carregada,

alguns contaminantes (não todos) se movem rapidamente através do sistema pós-coluna e são

descarregados antes do início da separação de aminoácidos, resultando em um melhor

rendimento.

- A preparação da amostra é mínima comparada ao método pré-coluna.

- A detecção (com nihidrina) é quimicamente específica para alfa-aminoácidos.

- Existe farta literatura referente a tempos de retenção de aminoácidos e derivados.

- A acuidade e precisão de dados podem ser mantidas em um alto nível com pequeno esforço,

especialmente quando se deseja distinguir aminoácidos estereoisoméricos.

Dentro da análise de aminoácidos, os protocolos mais comumente utilizados adotam o método

AOAC 994.12 com derivatização pós-coluna em nihidrina ou derivatização pré-coluna em PITC,

embora existam pelo menos três protocolos diferentes (AOAC 988.15 e AOAC 999.13).

Análise por infravermelho (IR)

Desde o final da década de 90, alguns protocolos passaram a ser utilizados não apenas para a

análise quantitativa de suplementos nutricionais à base de whey quanto para a detecção da

presença de adulterantes nestes produtos, tais como a Análise por Infravermelho com

Transformada de Fourier (FTIR) e a Análise de Infravermelho Próximo (NIR). Os adulterantes

apresentam diferentes assinaturas espectrais, o que faz com que seja fácil a sua distinção

mesmo entre compostos relacionados aos mesmos.

As calibrações PCA são capazes de detectar amostras ―anormais‖ com bastante sucesso:

entretanto, é crítico com que nenhuma adulteração esteja presente em tais conjuntos de

dados, já que isto iria envenenar a calibração, isto é, tornaria impossível a detecção de

adulterantes (calibração intoxicada). Tanto FTIR quanto NIR são usualmente otimizadas para

parâmetros de qualidade, tais como proteína e gordura, porém são indiscutivelmente uma

extraordinária opção para uma rápida detecção de adulterantes a um bom custo-benefício.

As adições fraudulentas de adulterantes em suplementos nutricionais à base de whey são

normalmente realizadas em níveis acima das incertezas mensuradas pelos métodos analíticos

com base em nitrogênio, isto é, > 0.2 - 0.4% maltodextrina ou > 0.05 – 0.1% melamina. A adição

de 0.1% de melamina (para fraudulentamente elevar a concentração de proteína)

corresponde num aumento de 0.4% nos valores de proteína bruta. Até a data de redação

deste TEC DOC, estavam sendo investigados diferentes esquemas de fracionamento para a

determinação de proteína bruta de whey na presença de adulterantes ilegais.

A análise da integridade espectral oferece uma ótima chance para a detecção de uma

ampla variedade de adulterantes em suplementos nutricionais à base de whey, incluindo

aqueles de natureza desconhecida (por exemplo, maltodextrina, melamina, uréia e ácido

cianúrico), já que foram desenvolvidas calibrações específicas para tais adulterantes.

Fusão de gás inerte

Este método é utilizado para a medida de nitrogênio em amostras biológicas, alimentos e

metais. Ele é baseado em um forno contendo eletrodos de cobre refrigerados a água. O ensaio

provoca a fusão da amostra de whey dentro de um cadinho de grafite nuclearmente puro

dentro do forno, a temperaturas que chegam a 3.000 graus centígrados numa atmosfera de

gás inerte. Os cadinhos de carbono se comportam como resistores extremamente eficazes, os

quais fornecem o calor necessário para fundir a amostra de whey. O nitrogênio contido no

suplemento nutricional é liberado na forma de nitrogênio molecular (N2) que é mensurado

usando uma célula de condutividade térmica.

A pureza do gás é um fator muito importante e utiliza-se o método do “escovão de gás” (gas

scrubber) para gerenciar o impacto potencial de impurezas. Neste caso, é gerado um sinal que

não é atribuído à amostra de whey e a causa disso é a combinação de impurezas do gás inerte

e do cadinho. Determina-se então a contribuição média do sinal de nitrogênio dessas duas

fontes, permitindo com que seja calculada a contribuição exclusiva da amostra de whey.

Uma desvantagem deste método é que a inconsistência dos níveis de impurezas dessas fontes

não pode ser completamente eliminada, afetando a habilidade deste método em determinar

com grande acuidade e precisão a concentração de whey em suplementos nutricionais.

Análise cromatográfica com espectrometria de massa

A cromatografia líquida foi inicialmente definida no início do século XX pelo trabalho do

botânico russo Mikhail Tswett. Seu trabalho pioneiro foi focalizado na separação de compostos

(pigmentos de folhas) extraídos de plantas utilizando-se um solvente dentro de uma coluna

preenchida com partículas. Tswett escolheu o nome de cromatografia [do grego croma,

significando cor, e graphia significando escrita] para descrever seu experimento colorido

(curiosamente, o nome Tswett em russo significa cor).

O acronismo HPLC foi idealizado pelo Prof. Csaba Horváth em seu trabalho apresentado na

PITTCON de 1970 (Pittsburg Conference), originalmente indicando que foi utilizada alta pressão

para gerar o fluxo requerido para a obtenção de cromatografia líquida em colunas

preenchidas. No início, as bombas disponíveis tinham uma capacidade de pressurizar até um

valor máximo de 500 psi (35 bar) e isso foi chamado de cromatografia líquida de alta pressão

ou HPLC. Durante a segunda metade da década de 70, houve um tremendo salto de

tecnologia, quando os novos instrumentos de HPLC passaram a desenvolver pressões que

chegavam a 6.000 psi (400 bar), além da incorporação de melhores injetores, detectores e

colunas.

No ano de 2004 foram obtidos novos avanços na tecnologia de instrumentação e de

fabricação de colunas cromatográficas, aumentando significativamente a resolução,

velocidade e sensibilidade na cromatografia líquida. Foram disponibilizadas colunas com

partículas de menor tamanho (1.7 mícrons) e instrumentação com capacidade especializada

para permitir uma fase móvel a uma pressão de 15.000 psi (1.000 bar). Estes já eram novos

sistemas criados holisticamente para realizarem cromatografia líquida de ultra performance,

conhecida hoje como tecnologia UPLC. Na data de redação deste TEC DOC já estavam

disponíveis instrumentos dotados de colunas com partículas ainda menores (1 mícron) e

capazes de operar a uma pressão de 100.000 psi (6.800 bar), fornecendo assim uma boa idéia

do que esperar no futuro.

Um cromatógrafo típico usualmente possui um reservatório que contém o solvente (chamado

de fase móvel, devido ao fato de que ele se move). Utiliza-se, então, uma bomba de alta

pressão (sistema de distribuição ou gerenciamento do solvente) para gerar e mensurar uma

taxa de fluxo específico da fase móvel, tipicamente em mililitros por minuto. Um injetor

(gerenciador de amostras ou autosampler) introduz (injeta) a amostra na corrente da fase

móvel que carrega a amostra para dentro da coluna HPLC.

A coluna contém o material cromatográfico necessário para efetuar a separação e este

material é chamado de fase estacionária, porque ele é mantido no lugar pela coluna. Um

detector irá ver as bandas separadas dos compostos conforme eles vão eluindo da coluna

HPLC (a maioria dos compostos não tem nenhuma cor, de forma que não se consegue vê-los a

olho nu). A fase móvel deixa o detector e é enviada como rejeito ou então coletada como

desejado. Quando a fase móvel contém uma banda separada de algum composto, a técnica

HPLC fornece a habilidade de coletar esta fração (a partir do eluato que contém o composto

purificado) para estudos posteriores, e isto é chamado de cromatografia preparativa

(preparatória).

Conforme as bandas coloridas separadas deixam a coluna, elas passam imediatamente para o

detector, o qual contém uma célula de fluxo que vê (detecta) cada banda separada de

composto contra um background da fase móvel (na realidade, soluções de inúmeros

compostos em concentrações típicas de HPLC não têm cor nenhuma). Um detector adequado

tem a habilidade de acusar a presença de um composto e enviar o seu correspondente sinal

elétrico para o computador, sendo que existem inúmeros tipos de detectores disponíveis no

mercado (por exemplo, detector eletroquímico ou ED), dependendo das características e

concentrações do composto a ser analisado. Gera-se então um cromatograma, que é a

representação gráfica da separação ocorrida quimicamente (cromatograficamente) no

sistema HPLC. O gráfico apresenta uma série de picos no eixo horizontal (eixo de tempos)

representando a resposta (tempo de retenção) para cada diferente composto. Os tempos de

retenção variam dependendo das interações entre a fase estacionária, as moléculas de whey

e o solvente.

Existem vários tipos de HPLC, tais como cromatografia de partição, cromatografia de fase

normal (por exemplo, cromatografia por fluido supercrítico quiral ou CSFC), cromatografia de

deslocamento, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de fase reversa,

cromatografia de fluxo isocrático, cromatografia de gradiente de eluição, e cromatografia por

aerosol carregado (CAD). Este último tipo é o mais utilizado no monitoramento e na avaliação

de concentração de proteínas intactas, peptídeos e aminoácidos. A cromatografia HPLC-CAD

acoplada com espectrometria de massa fornece a detecção universal de proteínas, tanto por

via quantitativa quanto por via qualitativa, incluindo suplementos nutricionais à base de whey.

Tradicionalmente a cromatografia bi-dimensional (2D) tem sido realizada por troca de cátions

fortes (SCX) seguida por fase reversa (RP), devido à natureza ortogonal dos mecanismos de

separação. A maior desvantagem desta aproximação é que, devido à limitada capacidade

de resolução obtida com a SCX, o whey frequentemente é separado através de frações

unidimensionais. Os cromatógrafos modernos empregam duas separações de fase reversa em

alto pH e baixo pH: desta forma, obtém-se separações por alta resolução em ambas

dimensões, ao invés de uma separação em baixa resolução (tipicamente SCX) e uma

separação em alta resolução (tipicamente RP), permitindo a obtenção de melhor

reprodutibilidade, maior intervalo dinâmico e muito menor transporte fração-a-fração.

Análise por proteômica de alta definição (UPLC) com marcadores radioativos/estáveis

A digestão enzimática de proteína em água enriquecida com 18O é um método elegante,

versátil e de bom custo-benefício para a análise quantitativa de whey em suplementos

nutricionais e tem sido aplicada com essa finalidade desde o ano 2000(35-37). No campo da

química qualitativa, a marcação proteolítica com 18O vivenciou um desenvolvimento

metodológico mais lento em relação a outros métodos químicos ou de marcação metabólica.

Dentre as dificuldades deste método cita-se o tempo requerido para a análise, a variabilidade

na incorporação de 18O pela amostra de whey (por exemplo, introdução variável de um ou

dois átomos de 18O), a possibilidade de troca de rebote do marcador, um desvio de massa

relativamente pequeno e a pouca disponibilidade de softwares de avaliação de dados. O

tempo necessário para um run (campanha) com marcação por 18O é idêntico ao tempo

necessário para o método de digestão, sendo que esse tempo pode ser minimizado para 15-30

minutos através de aceleração da digestão enzimática, por meio de tripsina imobilizada(48),

radiação de ultra-som ou temperatura elevada(49).

A fim de se validar este método, houve diversas tentativas de sobrepujar aquelas dificuldades,

ou seja, tentar obter a incorporação de um único átomo de 18O ou a marcação completa com

dois átomos de 18O. A introdução definida de um ou dois átomos do marcador simplifica a

avaliação quantitativa da amostra de whey em um padrão isotópico misto (marcada + não

marcada), já que neste caso o padrão isotópico consiste de apenas dois componentes

estabelecidos como 16O/18O ou 16O/18O2. Dependendo do método de fabricação do whey

(troca iônica, filtragem cerâmica, ultra/nano filtração), pode haver variação nas taxas de

incorporação do marcador: nestes casos, o processo de deconvolução deve considerar três

componentes [16O + 18O + 18O2], onde a soma destes dois últimos isotopômeros representa a

quantidade de espécies marcadas. Esta soma é independente da composição relativa, já que

a interconversão das espécies 18O em espécies 18O2 não modifica a soma das espécies.

Já foram desenvolvidos alguns softwares para a deconvolução de padrões isotópicos iônico-

moleculares de proteínas e peptídeos marcados com 18O (incluindo whey)(50-52), porém na

atualidade a maioria destes programas computacionais não está disponível na forma de

arquivos de acesso aberto ou então requerem um conhecimento avançado de algoritmos de

reconhecimento de padrão para análise compartimental. Como alternativa para a

deconvolução de padrões iônico-moleculares, o conteúdo de 18O de proteínas e peptídeos

pode ser analisado no nível de fragmento iônico.

A avaliação por espectrometria de massa no nível tandem (MS/MS) fornece uma melhor

acuidade dos dados quantitativos em comparação à avaliação dos espectros, devido a

menor ruído de fundo e melhor especificidade, de forma que foram desenvolvidos softwares

para a avaliação quantitativa do conteúdo de whey em suplementos nutricionais por meio de

experimentos com os marcadores 13C e 15N a nível MS/MS(53). Uma versão desse software

aplicável à marcação com 18O foi incorporada à máquina de busca MASCOT (versão 2.2).

Nesse tipo de análise com marcadores, a especificação do instrumento normalmente é

estabelecida como UPLC-ESI-QTOF-MS (Cromatografia Líquida de Ultra Performance por

Eletrospray e Tempo de Voo por Quadrupolo acoplada a Espectrometria de Massa) e os

parâmetros de busca são feitos com quantificação por multiplex 18O-relacionada, combinada

com uma janela de tolerância de 6 Da (Daltons) para a massa do precursor e uma janela de

tolerância de 0.3 Da para a massa no MS/MS.

Com essa tecnologia, tornou-se possível quantificar o conteúdo de whey em suplementos

nutricionais usando-se informação MS/MS. Com o emprego do MASCOT 2.2, tal quantificação é

conveniente e independente da plataforma utilizada, o que permite o uso de diferentes

espectrômetros de massa sem a necessidade da transformação de dados ou o uso de

algoritmos que acarretam em formatos diferentes de dados. Usando-se um instrumento QTOF no

modo MS/MS, o intervalo linear da quantidade aplicável de amostra de whey é superior

comparado à quantificação baseada em monitoramento, sendo que tanto identificação

quanto quantificação são realizadas ao mesmo tempo.

Apesar da grande variedade existente de métodos utilizados por laboratórios analíticos e

descritos na introdução acima, serão apresentados a seguir os métodos mais comumente

empregados para a análise da concentração de whey em suplementos nutricionais.

1.3.1 Método Kjeldahl

O método Kjeldahl foi desenvolvido em 1883 por um cervejeiro chamado Johann Kjeldahl. Um

alimento ou produto é digerido com ácido forte de forma que ele libera seu conteúdo de

nitrogênio reduzido na forma de sulfato de amônia, o qual pode ser determinado pela técnica

de titração. A quantidade de proteína presente é então calculada através da concentração

de nitrogênio na matriz em análise.

Normalmente ele é considerado o método padrão para a determinação da concentração de

proteína, sendo também empregado na análise de solos, de efluentes em estações de

tratamento de esgotos e fertilizantes. Contudo, além deste método não ser seletivo (ele não

fornece uma medida do conteúdo real de proteína presente numa matriz, já que ele mensura

nitrogênio não proteínico juntamente com nitrogênio de proteína), sua indicação não é direta e

necessita do emprego de um fator de conversão para converter a concentração medida de

nitrogênio em concentração de proteína. Além disso, devem ser usados diferentes fatores de

conversão para as diferentes proteínas, de acordo com a sua sequência típica e particular de

aminoácidos na cadeia peptídica.

O método Kjeldahl pode ser convenientemente dividido em três passos: digestão, neutralização

e titração.

1.3.1.1 Princípios

Digestão

Uma amostra do produto a ser analisado é pesada dentro de um frasco digestor e, então,

digerida por aquecimento na presença de ácido sulfúrico (um agente oxidante que digere a

proteína), sulfato de sódio anidro (para acelerar a reação ao elevar o ponto de ebulição) e um

agente catalítico como cobre, selênio ou titânio (para acelerar a taxa de reação). Durante os

primeiros anos de uso deste método, costumava-se empregar óxido de mercúrio como agente

catalítico e, devido a preocupações de saúde ocupacional, ele foi substituído pelos agentes

acima descritos, os quais não apresentam a mesma eficiência do mercúrio, já que seu uso

resulta em valores de concentração de proteína menores que os verdadeiramente

encontrados na amostra.

A digestão converte qualquer nitrogênio presente no produto em amônia, enquanto converte

outra matéria orgânica em gás carbônico e água. Amônia gasosa não é liberada em uma

solução ácida porque ela encontra-se na forma iônica (NH4+), a qual se liga ao íon sulfato,

permanecendo na solução.

Neutralização

Após a digestão ter sido completada, o frasco digestor é conectado a um frasco de recepção

através de um tubo. Então, a solução no frasco digestor é tornada alcalina com a adição de

hidróxido de sódio, o que converte o sulfato de amônia em amônia gasosa. O gás formado é

liberado da solução, saindo do frasco digestor para o frasco de recepção, o qual contém

ácido bórico em excesso. O baixo pH da solução contida no frasco de recepção converte o

gás de amônia em amônia iônica e simultaneamente converte o ácido bórico em íon borato.

Titração

O conteúdo de nitrogênio é, então, estimado por titração do borato de amônio formado com

ácido hidroclórico ou ácido sulfúrico padrão, utilizando-se um indicador para se determinar o

ponto final de reação. A concentração de íons hidrogênio (em moles) necessária para se

atingir o ponto final de reação é equivalente à concentração de nitrogênio presente na

amostra analisada. Uma amostra de controle (blank) é normalmente analisada

simultaneamente com o material original para se levar em conta qualquer nitrogênio residual

que possa estar presente nos reagentes utilizados no processo analítico. Uma vez determinado o

conteúdo de nitrogênio, ele é convertido em conteúdo de proteína usando-se o fator de

conversão apropriado para cada caso.

1.3.1.2 Vantagens e desvantagens do método

Vantagens. O método Kjeldahl é largamente utilizado no cenário internacional e ainda

considerado o método padrão para comparação contra todos os outros métodos. Apesar de

suas sérias desvantagens, a sua universalidade, seu razoável nível de precisão e sua boa

reprodutibilidade o tornaram o método de escolha para a estimativa do conteúdo de proteína

em alimentos.

Desvantagens. O principal problema com este método é que ele não mensura o conteúdo real

de proteína, já que o nitrogênio total presente nos alimentos não está na forma de proteína.

Esta desvantagem foi definitivamente evidenciada com o incidente ocorrido com alimentos

para animais domésticos em março de 2007 e com o escândalo com leite em pó fabricado e

comercializado na China em 2008, no qual empresários inescrupulosos alteraram (técnica

conhecida como dopagem ou spiking) a composição da matéria prima com melamina, um

produto químico repleto de nitrogênio, a fim de artificialmente elevarem o conteúdo de

proteína em alimentos para animais domésticos (2007) e leite em pó (2008). Como naquela

época o método Kjeldahl era (e continua sendo) o método padrão de análise para a

concentração de proteína em alimentos, o artifício de falsificação não foi notado por nenhuma

agência reguladora de nenhum país. A melamina é normalmente utilizada como um agente

retardador de chama e estabilizante para plásticos industriais: entretanto, ela passa a ser

extremamente tóxica no caso de ingestão oral, devido à presença de algumas bactérias

(principalmente klebisiella) no trato gastrointestinal tanto em humanos quanto em animais, as

quais se alimentam com melamina e produzem ácido cianúrico como resultado dessa

metabolização. Quando combinado com a melamina, este ácido se cristaliza e provoca a

formação imediata de estruturas insolúveis que não conseguem ser desintoxicados pelos rins,

levando a nefropatia grave e até morte.

No caso do incidente de 2007, mais de 3.600 animais domésticos morreram por nefrotoxicidade

e falha renal nos EUA, Canadá, Austrália, Europa e África do Sul, embora nunca se venha saber

o número exato de mortes e envenenamentos sem morte. Inicialmente, as autoridades

desconfiaram de contaminação acidental de matéria prima com aminopterina (veneno de

rato), sendo que investigações subseqüentes comprovaram o uso proposital de melamina em

produtos fabricados com glúten de trigo e proteína concentrada de arroz (no caso dos EUA) e

com glúten de milho (no caso da África do Sul). Todos os produtos que provocaram esse evento

foram fabricados com matéria prima adquirida de duas empresas chinesas, a Xuzhou Anying

Biologic Technology Development Company e a Binzhou Futian Biology Technology Co. Ltd.

No caso do escândalo de 2008, a crise se iniciou no dia 2 de agosto daquele ano, quando

executivos do grupo Fonterra (uma empresa fabricante de ingredientes para suplementos

nutricionais baseada na Nova Zelândia e a maior empresa comerciante de produtos derivados

de leite) chegaram à China para uma reunião de trabalho na sede da sua companhia joint-

venture chinesa chamada Sanlu Group (o maior produtor de leite daquele país). Naquela

reunião, os executivos ficaram sabendo que o leite em pó fabricado pela sua parceira estava

contaminado com melamina.

Outra grande desvantagem deste método é que é necessário o uso de diferentes fatores de

correção para as diferentes proteínas, a fim de compensar as diferentes sequencias de

aminoácidos. Esta desvantagem soma-se a outras, que são a necessidade de uso de ácidos

concentrados e em altas temperaturas, além do tempo de procedimento ser excessivamente

longo (mais de uma hora para cada análise). Mais uma desvantagem deste método é sua

pequena sensibilidade em sua versão original. É possível obter-se uma sensibilidade muito maior

através do emprego de outros métodos de detecção para quantificar o amônio (NH4+) após

mineralização e destilação, como por exemplo:

- gerador de par de hidreto em linha com espectrômetro de emissão atômica (ICP-AES-HG)(30)

- eletroforese de zona capilar(31)

- cromatografia iônica(32)

- titração potenciométrica

Além de tudo isso, o método Kjeldahl não é aplicável para compostos contendo nitrogênio nos

grupo azo e nitro, além de nitrogênio localizado na estrutura anelar (por exemplo, piridina), já

que estes nitrogênios não mudam para sulfato de amônia sob as condições deste método.

Assim, o método Kjeldahl não é capaz de recuperar o conteúdo completo de nitrogênio

orgânico e de compostos heterocíclicos, além de não ser capaz de determinar frações de

nitrogênio inorgânico, tais como nitritos e nitratos. Numa tentativa de minimizar este ponto fraco,

entre os anos de 2.000 e 2.010 foram estabelecidos novos padrões Kjeldahl para nitrogênio não

proteínico usando-se precipitação com TCA(34).

1.3.2 Método de combustão de Dumas

O método Dumas em química analítica foi inicialmente descrito pelo químico francês Jean-

Baptiste Dumas em 1831(33). Este método passou a ser inicialmente utilizado na análise do

conteúdo de proteína durante a década de 80 e depois, mais extensamente, na década de

90, quando foi desenvolvida uma técnica instrumental automatizada capaz de analisar com

velocidade sem precedentes a concentração de proteína em amostras de alimento. Para a

determinação do conteúdo de proteína em produtos à base de leite e soro de leite, este

método é citado na norma DIN EN ISO 14891, § 35,01.00,10.

Neste método, amostras sólidas de proteína do soro de leite ou líquidas (em solução) entram

em combustão a altas temperaturas (1.000 graus Celsius) na presença de agentes catalíticos,

formando óxidos de nitrogênio. Com o auxílio de cobre nuclearmente puro, os óxidos são

reduzidos para nitrogênio elementar, enquanto se separa completamente os sub-produtos

dessa reação, formados por água e gás carbônico. O nitrogênio resultante pode ser analisado

com o uso de um detector de condutividade térmica sem a necessidade de fluxo de um gás

de referência. As amostras sendo analisadas caem de um auto-sampler com até 120 posições

para dentro de uma câmara de fluxo, a qual está constantemente preenchida com gás hélio.

A combustão é iniciada ao se mudar o fluxo de gás para oxigênio puro e o transporte até 1.000

graus Celsius na câmara de combustão. As cinzas da amostra são coletadas em um

reservatório de rejeitos que pode ser removido e trocado mesmo quando o instrumento atingiu

a sua temperatura operacional. Dentre todos os resíduos de combustão, os óxidos de nitrogênio

são reduzidos para nitrogênio elementar no forno de redução.

A maior parte da água é separada utilizando-se um sistema de tubo de membrana que opera

com uma parede semipermeável localizada no contador de fluxo. Qualquer água

remanescente é capturada em uma armadilha de absorção, aonde é realizada a separação

do gás carbônico em armadilhas de adsorção auto-regeneráveis. Desta forma, o nitrogênio

elementar permanece e pode ser quantizado pelo detector de condutividade térmica sem

qualquer fluxo gasoso de referência.

A calibração do instrumento é feita analisando-se um material de pureza conhecida e também

exibindo concentração conhecida de proteína (por exemplo, EDTA [9.59% de nitrogênio]).

Desta forma, o sinal gerado pelo detector de condutividade térmica pode ser convertido em

concentração de nitrogênio. Entretanto, da mesma forma que ocorre no método Kjeldahl, é

necessário converter a concentração de nitrogênio da amostra em conteúdo de proteína com

fatores de conversão que dependem da sequência exata de aminoácidos na proteína.

1.3.2.1 Vantagens e desvantagens do método

Vantagens. Os gases resultantes são analisados de forma direta, o que reduz o tempo

necessário para o processo como um todo. Os softwares utilizados pelos instrumentos disponíveis

no mercado realizam o ajuste automático do tempo na análise. Desta forma, leva-se apenas

de 2-3 minutos para se completar uma análise padrão com 200 mg de EDTA, comparado com

1-2 horas para o método Kjeldahl. Outra grande vantagem é que as câmaras de amostras do

auto-sampler são preenchidas com hélio e, assim, nenhum gás atmosférico penetra na câmara

de combustão. O uso de hélio como gás carregador oferece condições ótimas para a

detecção de nitrogênio pelo detector.

Neste método, o desvio padrão relativo é menor que 0.5% (absoluto) para uso de EDTA como

substância de teste e com peso inicial da amostra situando-se em 200 mg. Já que durante

cada medida analisa-se a quantidade total de nitrogênio presente na amostra de whey, o

limite de detecção deste método é de 0.01 mg (absoluto) e a quantidade máxima detectável

de nitrogênio é de 50 mg. Apesar da quantidade usual de cada amostra estar situada entre 50

e 300 mg, é possível trabalhar-se com amostras com massas entre 0.5 mg e um grama,

dependendo do conteúdo de carbono e da homogeneidade do produto comercial à base de

whey que está sendo analisado.

Devido ao fato de que tanto a precisão quanto a acuidade dos métodos analíticos podem

apenas ser tão exatas e precisas quanto a curva padrão, mais uma vantagem deste método é

a sua não dependência da equação da curva padrão, acarretando em uma precisão com

uma percentagem de coeficiente de variância (%CV) de 1.0715 em percentagem de proteína.

Outra vantagem é que o gás de combustão (oxigênio) é adicionado estequiometricamente

através de software, significando que é fornecida apenas a quantidade necessária deste gás

para que se obtenha combustão completa. Mais algumas vantagens adicionais é que não é

necessário o uso de reagentes químicos tóxicos, além de poder ser realizada a análise

simultânea de várias amostras (até 120) e o processo de análise ser extremamente simples,

incluindo a preparação da amostra.

Desvantagens. Este método apresenta um alto custo inicial, devido ao instrumento necessário

para a realização da análise. Além disso, dependendo do tipo de análise sendo realizado, o

pequeno tamanho da amostra pode tornar difícil a obtenção de uma amostra representativa.

Da mesma forma que ocorre com o método Kjeldahl, o método Dumas também não fornece

uma medida real da proteína contida na amostra, já que nem todo o nitrogênio está na forma

de proteína.

Além disso, diferentes tipos de proteínas necessitam do uso de diferentes fatores de correção,

dependendo da sequência típica de aminoácidos na cadeia. Como o método Dumas utiliza

basicamente os mesmos fatores de correção que o método Kjeldahl, ele resulta em valores

brutos para o conteúdo de proteína que são 1.4% maiores que os obtidos por Kjeldahl. É

importante lembrar-se que precisão e acuidade são características relativas a uma curva

padrão.

Substâncias encontradas em alimentos e que contêm nitrogênio não proteínico incluem ácidos

nucleicos, carboidratos contendo nitrogênio, fosfolipídios, vários alcaloides, vitaminas, nitritos e

nitratos e o cálculo do conteúdo desse nitrogênio é chamado de proteína bruta. Desta forma,

outra desvantagem do método Dumas reside no fato de que ele mensura a proteína bruta no

ensaio.

1.3.3 Métodos utilizando espectroscopia UV-vis (ultravioleta-visível)

Desde a década de 70, foram sendo incorporados inúmeros métodos analíticos para a

determinação da concentração de proteína em amostras de alimento e baseados em

espectroscopia UV-vis. Tais métodos seguiram-se ao trabalho pioneiro com digestão por bloco e

destilação a vapor, culminando com o ensaio UDY de ligação por corante. Tais métodos não

apenas aproveitam a habilidade natural das proteínas em absorver (ou espalhar) a luz na

região UV-visível do espectro eletromagnético quanto modificam quimicamente ou fisicamente

a proteína de interesse para que absorva (ou espalhe) luz nessa região do espectro.

O primeiro passo é a preparação de uma curva de calibração de absorbância (ou turbidez) de

aminoácidos aromáticos [tirosina – fenilalanina – triptofano] versus a concentração de proteína,

usando-se uma série de soluções de proteína de concentração conhecida. Então é possível

medir a absorbância (ou turbidez) da solução sendo analisada no mesmo comprimento de

onda, sendo que sua concentração de proteína pode ser determinada a partir da curva de

calibração. A principal diferença entre os vários ensaios são os grupos químicos responsáveis

pela absorção ou espalhamento de radiação, isto é, ligações peptídicas, grupos aromáticos

laterais, grupos básicos e proteínas agregadas.

No caso de suplementos nutricionais à base de whey, este trabalho é bastante dificultado pela

presença de uma grande variedade de frações bioativas encontradas nessa proteína:

- alfa-lactalbumina

- beta-lactoglobulina

- albumina de soro bovino

- imunoglobulinas

- glicomacropeptídeos

- lactoferrina

- lisozima

- proteoses

- peptonas

- lactoperoxidase

- etc.

Alguns exemplos dos métodos UV-vis mais comumente utilizados para a determinação do

conteúdo de proteína em alimentos estão discriminados abaixo.

1.3.3.1 Medida direta em 280 nm (A280)

A absorbância mensurada no comprimento de onda de 208 nm (A280) é usada para o cálculo

da concentração de proteína por comparação com uma curva padrão ou valores de

absortividade publicados para o whey. Tanto o triptofano quanto a tirosina absorvem

fortemente luz ultravioleta em 280 nm e o conteúdo destes aminoácidos é praticamente

constante na maioria das proteínas. Assim, a absorbância de soluções feitas com a proteína a

ser analisada a 280 nm pode ser utilizada para determinar a sua concentração. Este ensaio é

utilizado para se quantificar soluções cuja concentração de proteína situa-se no intervalo de 20

a 3.000 microgramas/mililitro.

Dentre as vantagens deste método estão a simplicidade de procedimento, sua natureza não

destrutiva (método não destrutivo) e a não obrigatoriedade do uso de reagentes especiais.

Entretanto, sua principal desvantagem é que ácidos nucléicos também absorvem fortemente a

280 nm e, portanto, podem provocar interferência com a medida de proteína se estiverem

presentes em concentrações suficientemente altas (que é justamente o caso do whey).

Tentando contornar este problema, foram desenvolvidas algumas alternativas para tentar

solucionar esta deficiência, como por exemplo, medir a absorbância em vários comprimentos

de onda distintos. A acuidade de uma determinação espectroscópica UV pode diminuir

significativamente por espalhamento de luz pela amostra em teste. Se a proteína existente na

solução é composta por partículas comparáveis em tamanho ao comprimento de onda da luz

mensurada (250 a 300 nm), o espalhamento do feixe de luz resulta em um aumento aparente

na absorbância da amostra.

Para se calcular a absorbância a 280 nm devida ao espalhamento de luz, se determina as

absorbâncias da solução de teste nas regiões 320, 325, 330, 335, 340, 345 e 350 nm. Usando o

método de regressão linear, é feita a plotagem do logaritmo da absorbância observada versus

o logaritmo do comprimento de onda e se consegue extrair a curva padrão que melhor se

ajuste aos pontos plotados. A partir do gráfico obtido, extrapola-se o valor da absorbância da

proteína em solução. Para se reduzir o efeito de espalhamento da luz (principalmente se a

solução tiver forte turbidez), se procede a uma filtração (0.2 µm no caso de whey) ou

clarificação por centrifugação.

1.3.3.2 Medida direta em 205nm (A205)

A determinação da concentração de proteína através da medida da absorbância no

comprimento de onda de 205 nm (A205) está baseada na absorbância da ligação peptídica. A

concentração de proteína na amostra é determinada através da absorbância medida e da

absortividade a 205 nm. Esta medida direta normalmente é utilizada quando a proteína a ser

analisada apresenta quantidades significativas de ácidos nucleicos a fim de se ter uma medida

em um comprimento de onda diferente de 280 nm.

1.3.3.3 Método de emissão por fluorescência

Neste método, é possível determinar a concentração de proteína em produtos com whey ao se

mensurar a fluorescência intrínseca baseada na emissão por fluorescência pelos aminoácidos

aromáticos presentes na amostra (tirosina – fenilalanina – triptofano).

As características de fluorescência dos aminoácidos aromáticos podem ser visualizadas na

tabela abaixo:

Absorção

Absorção

Fluorescência

Fluorescência

Tempo

de vida

Comprimento

de onda

Absortividade

Comprimento

de onda

Quantum

Triptofano

2.6

280

5,600

348

0.20

Tirosina

3.6

274

1,400

303

0.14

Fenilalanina

6.4

257

200

282

0.04

Tempo de vida: nanosegundos/ Comprimento de onda: nanômetros

De maneira geral, os tempos de vida são pequenos e os valores quantum são baixos para todos

os três resíduos. O fluoroforo se origina da interação serina-tirosina-glicina, a qual é pós

translacionalmente modificada e mudanças na fluorescência intrínseca podem ser usadas para

monitorar mudanças estruturais na proteína.

Este ensaio pode ser usado para a quantização de soluções de proteína de whey exibindo

concentrações entre 5 e 50 microgramas/ml.

1.3.3.4 Métodos colorimétricos

1.3.3.4.a Método Biuret

O método Biuret é um dos ensaios mais antigos e de menor sensibilidade dentre todos os

métodos colorimétricos (espectrofotométricos). Apesar disso, o ensaio Biuret ainda é

frequentemente (e inexplicavelmente) muito utilizado, talvez devido à facilidade do

procedimento, à preparação simples dos reagentes e à sua menor susceptibilidade para

interferências químicas, comparado a outros métodos que utilizam cobre.

Este método é baseado na quelação polipeptídica de íons cúpricos (Cu2+ ou quelato colorido)

com as ligações peptídicas (quelação polipeptídica) em solução fortemente alcalina.

Compostos contendo duas ou mais ligações peptídicas reagem com os íons cúpricos,

produzindo um complexo de cor violeta-púrpura. Geralmente, as misturas de reação para

ensaios espectrofotométricos não devem ser diluídas após o desenvolvimento, mesmo se a

coloração (absorbância) for muito intensa.

No caso de análise da concentração de whey em suplementos nutricionais, utiliza-se albumina

de soro bovino (cristalizada ou liofilizada) como padrão de calibração [10 a 20 mg/ml]. Para o

caso do whey, não é necessário o uso de detergente (deoxicolato ou SDS) para ajudar a

solubilizar a proteína, pois este é um caso diferente da análise de tecido (por exemplo,

colágeno) ou biomateriais insolúveis. A tabela abaixo mostra os slopes dos pontos (plots) de

calibração para o método Biuret.

Proteína

Condições do ensaio

Slope

[A650 (µg/ml v.f.e.)-1cm-1]

BSA

---

2.3 x 10-4

BSA

---

2.6 x 10-4

BSA

Concentração de glucose 0.4 a 400 mM

2.7 x 10 -4

BSA

---

2.7 x 10-4

Beta-lactoglobulina

---

2.5 x 10-4

Enzimas celulases

---

2.2 x 10-4

BSAb

---

3.2 x 10-4

BSAC

---

1.9 a 2.8 x 10-4

BSAd

---

2.3 x 10-4

aAbreviaturas: BSA, albumina de soro bovino; v.f.e, volume final do ensaio bWatters (1978) cGoshev e Nedkov (1979) dBeyer (1983)

O reagente biuret pode ser adquirido comercialmente ou então utiliza-se sulfato cúprico

dissolvido em água (deionizada e bi-destilada) quente [solução A] e citrato de sódio dihidrato

combinado com carbonato de sódio em água quente [solução B], misturando-se as duas

soluções pós-resfriamento. Este reagente permanece estável por um período de seis meses.

Mistura-se o reagente biuret com a solução de proteína (whey que servirá como padrão

analítico) e mensura-se a absorbância a 545 nm, utilizando-se o blank analítico para calibrar o

instrumento em zero.

Normalmente ocorrem diferenças nos slopes aparentes de laboratório para laboratório, devido

a variações na quantidade de materiais inertes (NaCl ou água) a partir de proteína

incompletamente seca usada na calibração. O slope médio para o método Biuret, obtido com

o uso de várias proteínas globulares como padrão de calibração, é aproximadamente 100

vezes menor que o obtido em outros ensaios (método Hartree-Lowry e método BCA).

Uma questão ainda sem resposta dentro do trabalho de análise quantitativa de proteína é a

escolha do padrão de calibração. Alguns laboratórios usam como padrão uma amostra

purificada da proteína em análise (neste caso, whey), enquanto que outros laboratórios acham

suficiente o uso de albumina de soro bovino (BSA). Embora seja um fato que alguns métodos

(notadamente os ensaios A280 baseados em UV) sejam dependentes da composição de

aminoácidos da proteína, a química Biuret se baseia na estrutura polipeptídica e não na

composição dos resíduos da cadeia lateral. Desta forma, o método Biuret é independente da

proteína utilizada como padrão de calibração.

A principal vantagem desta técnica é que não existe nenhuma interferência de componentes

que absorvem em comprimentos de onda menores, além do fato de ser um procedimento

menos sensível ao tipo de proteína, pois utiliza absorção envolvendo ligações peptídicas que

são comuns a todas as proteínas, ao invés de utilizar absorção específica de grupos laterais da

cadeia. Entretanto apresenta sensibilidade relativamente baixa comparada aos outros

métodos UV-vis.

1.3.3.4.b Método Hartree-Lowry

O método Lowry original para a análise da concentração de proteína, publicado em 1951, tem

sido constantemente re-investigado a fim de se avaliar os efeitos de substâncias interferentes e

a habilidade de alguns detergentes em solubilizar proteínas insolúveis. O método Hartree-Lowry

fornece resultados lineares sobre uma variedade mais ampla de concentração de proteína,

além de manter a mesma sensibilidade do método original e ser superior na formulação dos

reagentes.

Este método é baseado na redução pela amostra de proteína do cromógeno ácido

fosfomolibdídico-tungstico no reagente Folin-Ciocalteu fenol, resultando numa absorbância

máxima em 750 nm. Os íons cúpricos (Cu2+) são reduzidos para íons cuprosos (Cu+) em pH

alcalino quando reagem com um peptídeo. O reagente Lowry-Folin-Ciocalteau consiste de

fosfomolibdato e fosfotungstato que provocam uma coloração azul-molibdênio (instável)

quando reduzidos e reage primariamente com resíduos de tirosina da proteína, o que pode

levar a uma variação na resposta do ensaio para diferentes tipos de proteína. A coloração é

principalmente devida ao conteúdo de tirosina presente na amostra.

Existe um pequeno pico de absorbância na região de 500 nm que pode ser usado para a

determinação de altas concentrações de whey e um pico maior na região de 750 nm que

pode ser utilizado na determinação de baixas concentrações de whey. Este método apresenta

maior sensibilidade para menores concentrações de proteína quando comparado ao método

Biuret.

A relação de absorbância para concentração de proteína é não-linear: no entanto, se o

intervalo de concentração da curva padrão for suficientemente pequeno, ela irá se aproximar

da linearidade. Utilizando o método de regressão linear, é feita a plotagem das absorbâncias

das soluções a partir das soluções padrão versus concentrações de proteína e determina-se

qual a curva padrão que melhor se ajusta aos pontos plotados. A partir desta curva padrão e

da absorbância da solução de teste, encontra-se a concentração de proteína na solução de

teste.

1.3.3.4.c Método Bradford

Nos métodos de ligação colorimétrica, adiciona-se um corante negativamente carregado

(aniônico) à amostra de whey em solução cujo pH é ajustado de forma que as proteínas sejam

positivamente carregadas (isto é, ponto isoelétrico). A proteína irá formar um complexo insolúvel

com o corante devido à atração eletrostática entre as moléculas, porém o corante não ligado

permanece solúvel. O corante aniônico se liga aos grupos catiônicos de aminoácidos básicos e

aos grupos terminais dos aminoácidos livres. Determina-se a quantidade de corante não ligado

que permanece em solução após a remoção do complexo insolúvel proteína-corante

(centrifugação) ao se medir sua absorbância, sendo que a quantidade de proteína presente

na solução original é proporcional à quantidade de corante que se liga a ela.

Este método se baseia no desvio de absorção de 470 nm para 595 nm que é observado

quando o corante azul brilhante G-250 se liga ao whey. O corante Coomassie Brilliant Blue G-

250 se liga quase que instantaneamente aos resíduos arginil, histidil e lisil na proteína, o que

pode acarretar em variação na resposta do ensaio para diferentes proteínas.

Um ponto extremamente importante quando se aplica este método é a obrigatoriedade de

NÃO se utilizar células espectrofotométricas de quartzo (sílica), pois o corante se liga fortemente

a este material. Devido ao fato de que diferentes espécies de proteínas podem resultar em

diferentes intensidades de respostas coloridas, a proteína padrão e a proteína de teste devem

ser a mesma.

Outra desvantagem deste método é a transferência de reagentes: se a amostra de whey não

for mixada de forma adequada antes de se retirar a amostra de teste, os resultados mostram

claramente uma concentração menor de proteína.

1.3.3.4.d Método BCA (ácido bicinchinônico)

Este método foi desenvolvido por P. K. Smith em 1985 e se baseia na redução realizada pela

amostra de whey do íon cúprico (Cu2+) em íon cuproso (Cu+), numa reação biuret em ambiente

fortemente básico. O íon cuproso resultante é quelado com o reagente BCA, sendo que este

quelado Cu+-BCA apresenta uma cor brilhante com um pico de absorção em 562 nm. Assim, a

absorbância nesse comprimento de onda [A562] é diretamente dependente da concentração

de whey, quando são mantidas as condições do ensaio.

O método BCA compara-se favoravelmente com o antigo método Lowry ou com o método

Hartree-Lowry no que diz respeito a sensibilidade e conveniência. Esta sensibilidade pode ser

aumentada com o uso de uma concentração maior do reagente BCA (solução contendo

ácido bicinchinônico, carbonato de sódio mono hidratado, tartarato de sódio, hidróxido de

sódio e bicarbonato de sódio). Entretanto, o custo do reagente BCA é bastante elevado e o

aumento fracional da sensibilidade pode não valer o maior custo.

Da mesma forma que ocorre com o método Hartree-Lowry, a relação de absorbância para

concentração de proteína é não-linear: no entanto, se o intervalo de concentração da curva

padrão for suficientemente pequeno, ela irá se aproximar da linearidade. Utilizando o método

de regressão linear, é feita a plotagem das absorbâncias das soluções a partir das soluções

padrão versus concentrações de proteína e determina-se qual a curva padrão que melhor se

ajusta aos pontos plotados. A partir desta curva padrão e da absorbância da solução de teste,

encontra-se a concentração de proteína na solução de teste.

O método BCA é menos susceptível a interferências provocadas por detergentes do que outros

ensaios, porém ele apresenta maior susceptibilidade a interferências provocadas por açúcares

redutores, e até mesmo por açúcares ostensivamente não redutores, tais como sucrose

(eventualmente adicionado pelo fabricante na composição do suplemento nutricional à base

de whey), já que a sucrose libera açúcares redutores na hidrólise parcial.

1.3.4 Vantagens e desvantagens dos métodos colorimétricos

Vantagens. As técnicas UV-vis são relativamente rápidas e simples de serem realizadas e

possuem razoável sensibilidade para baixas concentrações de proteína.

Desvantagens. Para a maioria das técnicas UV-vis é necessário o uso de soluções diluídas e

transparentes e completamente isentas de contaminantes e interferentes que possam absorver

ou espalhar a luz no mesmo comprimento de onda da proteína que está sendo analisada. Esta

necessidade para soluções transparentes significa que a maioria dos alimentos (e em especial

os produtos à base de whey) deve passar por extensos e detalhados procedimentos de

preparação da amostra antes da análise, isto é, homogenização, extração por solvente,

vortexação, centrifugação e filtração, o que pode consumir um tempo significativo e ser

bastante trabalhoso. Além disso, muitas vezes é difícil extrair quantitativamente proteínas a

partir de determinados tipos de alimento, especialmente após eles terem sido processados de

forma que as proteínas se tornaram agregadas (caso do soro de leite) ou covalentemente

ligadas com outras substâncias. Mais ainda, a absorbância depende do tipo de proteína sendo

analisada, já que diferentes proteínas apresentam diferentes sequências de aminoácidos na

cadeia.

1.3.5 Comparação entre os métodos

Cientistas nutricionais e diretores de laboratórios analíticos frequentemente se veem na posição

de ter de escolher uma técnica em particular para a avaliação da concentração de proteína

em suplementos nutricionais ostensivamente vendidos no mercado legítimo. Também com

bastante frequência a dúvida principal entre eles é sobre como decidir qual método é o mais

apropriado para uma aplicação em particular. Além disso, análises laboratoriais solicitadas

voluntariamente pelos próprios fabricantes de suplementos nutricionais apresentam grande

variedade de ensaios e técnicas analíticas mesmo para cada lote de fabricação, e uma

comparação dos resultados obtidos para cada fabricante torna-se confusa e incapaz de

fornecer qualquer conclusão definitiva e que tenha um mínimo de credibilidade.

Um dos primeiros aspectos a se determinar é para qual objetivo a informação sobre o conteúdo

de whey irá ser usada. No caso da análise estar sendo feita com propósitos oficiais (requisitos

legais, forenses ou de rótulo), então é vital o uso de métodos oficialmente validados, conforme

foi discutido no início deste documento técnico. Para isso, o método Kjeldahl e o método

Dumas já foram oficialmente aprovados para esse tipo de análise, mesmo com todos os seus

pontos fracos inerentes e já relatados nos capítulos acima. A espectroscopia UV-vis também já

tem sido oficialmente aprovada para este tipo de análise, embora apresente menor variedade

de aplicações quando comparado com os dois métodos anteriores.

Entretanto, a cada dia é maior a aceitação e a tentativa de validação dos métodos

instrumentados mais modernos e mais rápidos, não apenas para este propósito específico

(avaliação do conteúdo de whey em suplementos nutricionais), mas também para propósitos

de controle de qualidade. Neste caso, as técnicas por infravermelho (IR), as técnicas baseadas

em HPLC e também as técnicas utilizando a novíssima UPLC têm ganhado terreno dentro dos

quesitos validação e credibilidade. O único e ainda constante problema está relacionado com

o custo dos instrumentos modernos, embora as técnicas mais recentes (UPLC) necessitem de

quantidades significativamente menores de reagentes e consumíveis em geral.

Outros fatos que devem ser considerados são a quantidade requerida de preparação da

amostra, sua sensibilidade e sua velocidade de procedimento. Os métodos Kjeldahl, Dumas e

IR necessitam de muito pouca preparação de amostra e, após ter sido selecionada uma

amostra representativa de whey, ela pode ser usualmente ser testada de forma direta.

Por outro lado, os vários métodos UV-vis requerem uma extensa preparação de amostra antes

da análise. Dependendo da fórmula do suplemento nutricional à base de whey, a proteína

deve ser extraída do produto para dentro de uma solução diluída, o que usualmente envolve

procedimentos como homogenização demorada, extração por solvente, filtração e

centrifugação. Além disso, as várias técnicas apresentam sensibilidades bastante variáveis, isto

é, a menor concentração de proteína que ela é capaz de detectar.

Com exceção das novas tecnologias cromatográficas, os métodos UV-vis apresentam a maior

sensibilidade, sendo capazes de detectar concentrações de proteína tão baixas quanto 0.001%

por peso. A sensibilidade dos métodos Kjeldahl, Dumas e IR situa-se ao redor de 0.1% por peso.

Outros fatores também bastante importantes são o tempo requerido para o procedimento

analítico e o número de amostras de whey que pode ser avaliado simultaneamente, já que são

outros aspectos a se considerar no momento da escolha de qual ensaio será empregado na

campanha. Os métodos por IR são capazes de analisar concentrações de proteína de forma

muito rápida (< 1 minuto), desde que a calibração já tenha sido feita. O método Dumas

instrumentalizado moderno é totalmente automatizado e pode mensurar a concentração de

whey em amostras de suplementos nutricionais em menos de 5 minutos, comparado com o

método Kjeldahl que leva de 30 minutos a 2 horas para realizar a análise. Os vários métodos

utilizando UV-vis apresentam tempos analíticos variando entre alguns minutos até uma hora

(dependendo do tipo de corante utilizado e quanto tempo o mesmo leva para reagir), embora

eles apresentem a vantagem de análise simultânea de várias amostras. Apesar disso, nesses

métodos é usualmente necessária a realização de uma demorada preparação da amostra

antes da análise, a fim de se obter uma solução transparente.

Outros fatores adicionais importantes para a escolha da técnica analítica apropriada são a

disponibilidade de equipamento, facilidade de operação, a acuidade desejada para o

resultado analítico e se a técnica é não-destrutiva.

Conclusões

A análise quantitativa de proteína (incluindo a análise da concentração de whey em

suplementos nutricionais) é uma atividade complexa, envolvendo boa quantidade de

tecnologia, que deve adotar muitos passos como procedimento e impossível de ser realizada

com um mínimo de credibilidade e confiabilidade no nível amador ou doméstico. Mesmo que o

protocolo analítico seja realizado por laboratórios oficialmente (formalmente) credenciados, os

resultados podem apresentar uma variação significativa nos resultados, dependendo da

escolha do método analítico, da preparação das amostras, da calibração dos equipamentos,

da análise estatística dos dados e do treinamento e expertise da equipe.

Até mesmo um erro na coleta da amostra pode ser introduzido já no início do procedimento.

Para que os erros sejam minimizados, devem ser estabelecidos vários check points (pontos de

conferência) em cada etapa do procedimento, incluindo novas soluções e reagentes que

estejam eventualmente sendo utilizados na análise.

Este TEC DOC procurou apresentar os vários tipos de ensaio e os vários equipamentos e

tecnologias utilizadas no momento da redação deste documento. Contudo, é preciso salientar

que o objetivo deste TEC DOC foi discutir os procedimentos analíticos quantitativos para whey

em suplementos nutricionais. Em vários cenários é preciso realizar a avaliação qualitativa de

proteína (isto é, do tipo de whey contido no produto e a possibilidade de contaminação

acidental ou fraudulenta com outras substâncias que possam elevar a concentração de

proteína ou modificar favoravelmente o sabor do produto final). Este assunto é objeto de outro

documento VITAFOR (TEC DOC 003-2013).

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