Relatório Técnico TEC DOC VITAFOR 001 - 2013

VITAFOR Documento Técnico

TEC DOC 001-2013

MÉTODOS DE ANÁLISE DE NITROGÊNIO/PROTEÍNA EM SUPLEMENTOS NUTRICIONAIS À BASE DE WHEY (PROTEÍNA DO SORO DE LEITE) E VARIAÇÃO NOS RESULTADOS

Preparado por ITALO SALZANO JR. Em nome do Comitê Técnico-Científico e de Assuntos da Qualidade - CQUAL Agosto - 2013

MÉTODOS DE ANÁLISE DE NITROGÊNIO/PROTEÍNA EM SUPLEMENTOS NUTRICIONAIS À BASE DE WHEY (PROTEÍNA DO SORO DE LEITE) E VARIAÇÃO NOS RESULTADOS

VITAFOR TEC DOC Internacional 001-2013/A

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MÉTODOS DE ANÁLISE DE NITROGÊNIO/PROTEÍNA EM SUPLEMENTOS NUTRICIONAIS À BASE

DE WHEY (PROTEÍNA DO SORO DE LEITE) E VARIAÇÃO NOS RESULTADOS 1.1 Introdução Métodos analíticos têm a função de gerar dados precisos e confiáveis para uso tanto por fabricantes de suplementos nutricionais quanto por autoridades reguladoras, com os respectivos objetivos de controle de qualidade e cumprimento legal. Confiabilidade, exatidão, precisão e especificidade são as palavras-chave para que o método (a metodologia analítica) tenha utilidade, porém os analistas devem tomar ações para provar que qualquer método que eles venham a utilizam possua todas estas características, principalmente se o método for empregado no cenário crítico, ou seja, num laboratório de controle de qualidade, num laboratório clínico ou num laboratório forense. Suplementos nutricionais e seus ingredientes constituintes impõem inúmeros desafios analíticos devido à complexidade da matriz e, como consequência disso, a validação de métodos provou ser até hoje um objetivo particularmente difícil de ser atingido. Qualquer matéria prima empregada na fabricação do produto acabado é invariavelmente irregular, já que a sua composição química pode depender de fatores extrínsecos, tais como origem geográfica, micro clima e práticas de criação, cultivo, extração e colheita. Todos estes desafios são ainda mais influentes devido à escassez de métodos analíticos validados, bem como à falta de materiais de referência confiáveis, tanto botânicos quanto químicos. Felizmente, existem aproximações sistemáticas para se assegurar que um método em particular venha a produzir dados acurados e precisos. A habilidade de um método em particular para se ajustar ao propósito específico é um elemento extremamente importante de validação, o qual, porém é frequentemente desprezado. Quando se emprega métodos analíticos que estejam fora de seu escopo e aplicabilidade, eles passam a não mais serem cientificamente válidos. Possuir e empregar ferramentas analíticas a fim de avaliar identidade, pureza e potência de um suplemento nutricional não é apenas um pré-requisito sob a influência das novas diretrizes cGMP (CertifiedGood Manufacturing Practices) estabelecidas na norma 21CFR111 da FDA/EUA, mas também se constituem num fator crítico para garantir a segurança do consumidor final, para o desenvolvimento e manutenção dos padrões de garantia da qualidade e, finalmente, para uma eficácia de testes que tenha algum significado com relação a estes produtos. Ao mesmo tempo em que a indústria de suplementos nutricionais procura ir em frente e obter progressos de maneira contínua, ela ainda precisa carregar o ônus provocado por falhas

históricas enquanto reage aos novos desafios impostos pela garantia da qualidade, já que a qualidade de um produto afeta tanto o acesso ao mercado quanto o crescimento deste mercado. Isso pode certamente ser um impedimento quando produtos de baixo custo (e frequentemente de baixa qualidade) confundem e diminuem o respeito e confiança de consumidores, imprensa e agências reguladoras. A reputação de um suplemento nutricional como sendo apenas “óleo de cobra” ou “suplemento nada mais é do que uma droga anabolizante” diminui o interesse, visão, aceitação e o uso de matérias primas de alta qualidade e baseadas unicamente em ciência. Produtos fraudulentos e inseguros destroem a aceitação pelo mercado por outros produtos fabricados sem falsificações e, embora a cobertura realizada pela mídia tenha se desviado mais para produtos que não atendam o que está escrito no rótulo comparado a produtos inseguros para consumo, é justamente a reputação dessa indústria em geral que mais sofre com este cenário. A consequência inevitável disso é que profissionais de saúde, professores escolares, agências reguladoras, políticos e órgãos governamentais perpetuaram a atitude de ridicularizarem e desconsideraremsuplementos nutricionais como sendo contribuintes potenciais para uma drástica redução nos custos de saúde das populações em geral, fato que há muito tempo já está fartamente documentado na literatura científica. A implementaçãode um Programa de Garantia da Qualidade que seja específico para a fabricação de suplementos nutricionais é um desafio tanto para fabricantes quanto para empresas situadas no início da cadeia de produção, mas principalmente para os laboratórios que fornecem suporte para esta indústria. Embora investidores estejam conscientes dos assuntos relativos à qualidade e seu crescente impacto nesse ramo de atividade, os empresários de maneira isolada não necessariamente possuem o conhecimento (expertise), nível organizacional e capacidade financeira requerida para satisfazerem as exigências desse tipo de Programa. Este Documento Técnico tem como objetivo principal expor os aspectos analíticos e de qualidade que desafiam a indústria de suplementos nutricionais e as recomendações para a solução destes problemas, principalmente no que diz respeito à obrigatoriedade de uma uniformização ou padronização dos métodos de análise do conteúdo de proteína presente em produtos à base de proteína do soro de leite (whey). As informações aqui presentes também se destinam ao público leigo (consumidor final) caso este público tenha a curiosidade de comprovar as informações contidas nos rótulos de produtos acabados. 1.2 Validação de métodos analíticos Desde o final da década de 90, o assunto qualidade tem sido descrito como uma das maiores exclamações que desafiam consumidores, profissionais da saúde e agências reguladoras em todo o mundo. No entanto e de forma geral, no mundo real a qualidade de um produto tem sido definida pelas especificações técnicas de um produto, as quais são estabelecidas pelos próprios fabricantes do produto final. O aspecto de “adequado para o propósito” equaciona a qualidade através do preenchimento de uma especificação ou critério declarado.

Os desafios analíticos associados à Garantia da Qualidade vão desde a confirmação da identidade da matéria prima extraída a partir de uma matriz de soro de leite (química qualitativa) até a quantização de nitrogênio originário de proteína nutricional. Enquanto que inúmeras publicações descrevem os procedimentos para a determinação dos constituintes de interesse, poucos métodos analíticos foram avaliados nos critérios de acuidade, precisão ou confiabilidade, enquanto que muito frequentemente a análise de produtos acabados à base de proteína não está dentro do escopo do método publicado. Em outras palavras, dentro do contexto de um Programa de Garantia da Qualidade, a qualidade de um produto é frequentemente baseada em métodos analíticos e a maneira com que o fabricante assegura que um método está funcionando (isto é, adequado para o propósito) é justamente a realização de uma série de experimentos conhecidos como validação. A Conferência Internacional sobre Harmonização de Requisitos Técnicos para o Registro de Medicamentos de Uso Humano (ICH) define “adequado para o propósito” como sendo o [grau pelo qual os dados produzidos por um processo de medida permite com que um usuário tome decisões tecnicamente e administrativamente corretas para um determinado propósito]. Isso está relacionado com escopo e aplicabilidade: para que um método analítico seja útil, ele precisa ser customizado para analitos, matrizes e concentrações esperadas e específicas para o produto em análise. Também devem ser determinadas a frequência com que o método será utilizado e a aplicação específica para o mesmo (qualitativa ou quantitativa ou ambos, se o teste é de estabilidade, se o propósito for pesquisa e desenvolvimento de produto, em caso da determinação da uniformidade do processo ou com o objetivo de identificar a presença de adulterantes no produto – por exemplo, presença de melaminaoumaltodextrinano caso de adulteração do conteúdo total de proteína em um suplemento nutricional à base de whey). Existem duas classes diferentes de métodos analíticos: Método com base em especificações. – estes métodos são prescritivos, isto é, definem o tamanho da coluna cromatográfica, o tamanho de partícula da fase de injeção da coluna, porosidade, taxa de fluxo, etc. Método com base em desempenho. – estes métodos descrevem o desempenho (performance) mínimo aceitável que deve ser atingido para que os dados sejam aceitáveis. O desenvolvimento e validação de métodos analíticos é bastante desafiador quando se lida com analitos pobremente definidos (flavonóides e compostos fenólicos, bem como extratos padronizados, softgels, comprimidos, cápsulas) e principalmente matrizes complexas como a proteína do soro de leite (whey). Definir-se analitos e matrizes dentro do contexto de adequado para o propósito é importante para o desenvolvimento de um método bem sucedido. Além disso, os métodos analíticos não são universais, pois características, escopo, técnicas e aplicabilidade diferem dramaticamente entre si. Assim é essencial com que se tenha um conjunto único de instruções que podem ser usadas para validar todos os métodos.No entanto, todos os métodos analíticos também compartilham algumas semelhanças básicas.

Validação de método é o processo utilizado para confirmar se o procedimento analítico empregado para um uso específico é adequado para o propósito. Isso inclui a verificação inicial das características de desempenho, vários testes entre laboratórios e controle de qualidade. Toda validação tem como objetivo assegurar que um processo de medidas produz resultados válidos: assim, os resultados da validação de método podem ser usados para julgar qualidade, confiabilidade e consistência dos resultados analíticos, sendo uma parte integral de uma boa prática analítica. Quando um processo de medida produz resultados válidos para uma determinada aplicação ele é considerado como sendo adequado para o propósito. Além disso, os métodos analíticos devem ser validados ou revalidados nas ocasiões seguintes: - antes da sua introdução no uso rotineiro; - quando condições (por exemplo, a matriz) diferem para as quais o método foi validado, e - quando o método é modificado e essa mudança foge do escopo original do método. Determinadas características de desempenho devem ser especificadas e atendidas a fim de que os resultados fornecidos pelo método tenham algum significado legítimo. Diversas entidades governamentais e não-governamentaisdivulgaram diretrizes expondo as metodologias aceitas na avaliação e estabelecimento das características de desempenho, com a finalidade de auxiliar na determinação daquilo que deve ser feito para se provar que o método é adequado para o propósito(1-29). É somente através da validação sistemática de métodos é que um cientista pode confiantemente demonstrar que seu método analítico é adequado para o propósito e, consequentemente, apresentar os seus dados resultantes como sendo válidos. Os diferentes níveis de validação de método incluem a Validação de Laboratório Único (SLV), a qual se aplica para um laboratório ou técnico ou equipamento específico; Validação de Verificação Anônima (PVV), a qual se aplica para vários laboratórios (de 2 a 7 laboratórios) e que fornece informações sobre como o método é interpretado fora do laboratório original e Validação de Estudo Colaborativo (FCS), a qual se aplica quando oito ou mais laboratórios fornecem dados aceitáveis usando o método em questão.Devido ao fato de que estes diferentes níveis de validação orbitam seus respectivos graus de robustez, a forma mais rigorosa de validação de método é obtida através da validação colaborativa.Tais estudos colaborativos nem sempre são práticos ou possíveis para gerenciamento pelos laboratórios, já que eles requerem comprometimentos específicos relativos à carga horária de trabalho tanto da equipe quanto de equipamentos em laboratórios múltiplos em várias partes do mundo. 1.3 Determinação da concentração total de proteína em produtos à base de whey Proteínas são polímeros de aminoácidos, sendo que um total de vinte aminoácidos ocorre naturalmente nas proteínas encontradas no corpo humano. As proteínas diferem entre si de

acordo com seu tipo, número e sequência de aminoácidos que forma a estrutura polipeptídica. Como conseqüência disso, elas apresentam estruturas moleculares variadas, atributos nutricionais amplos e propriedades fisioquímicas distintas. Elas formam os principais componentes estruturais de inúmeros alimentos naturais, frequentemente determinando a textura do alimento em geral, isto é, a maciez das carnes vermelhas e produtos à base de peixe. As proteínas isoladas são muito utilizadas como ingredientes em alimentos devido às suas exclusivas habilidades funcionais (por exemplo, habilidade em proporcionar estabilidade, textura e aparência desejáveis). Tipicamente, as proteínas são utilizadas como agentes de gelação (gelificação), emulsificantes, agentes de formação de espuma e espessantes. Muitas proteínas alimentares são enzimas capazes de acelerar a taxa de ocorrência de reações bioquímicas, sendo que tais reações podem ter um efeito tanto favorável quanto prejudicial sobre as propriedades do alimento. Normalmente, analistas de alimentos estão interessados em saber a concentração total, tipo, estrutura molecular e propriedades funcionais das proteínas contidas em um produto. Na data de redação deste TEC DOC existem inúmeros métodos de quantização da concentração de proteína em suplementos nutricionais, sendo que muitos deles são diretos e confiáveis. A escolha do método mais adequado (método ótimo) é um problema recorrente e a solução frequentemente requer o emprego de mais do que um método ou protocolo. Uma boa estratégia é se comparar os resultados de dois métodos que se baseiam em diferentes propriedades químicas. É extremamente comum a ocorrência de diferenças muito grandes nas estimativas do conteúdo total de proteína entre dois ou mais métodos, especialmente quando se analisa amostras brutas de componentes, tecidos ou alimentos, pois estas certamente podem estar carregadas com substâncias interferentes. Desta forma, a principal preocupação é como manobrar o ensaio levando em conta a presença de interferências e como eliminá-las de maneira definitiva, usando protocolos analíticos para acompanhar o progresso. Métodos analíticos para a quantização de conteúdo total de proteína em produtos à base de whey normalmente discordam entre si por um fator de até 20%, mesmo no caso de uma proteína hipoalergênica e que não carregue nenhuma substância interferente. No caso de amostras brutas, a percentagem de discordância é ainda maior e existem duas maneiras gerais de se lidar com tais discrepâncias. A primeira delas é remover componentes que provoquem interferências que possam comprometer um, ou talvez dois, ensaios, ou então lançar mão de um terceiro método (caso haja um número suficiente de amostras para a solução das diferenças). A segunda maneira é usar um novo método analítico (já validado) ou usar variantes de métodos existentes ou então usarmétodospara remoção de substâncias interferentes já que o campo da bioquímica analítica está em contínua evolução. Existe uma grande variedade de métodos instrumentais disponíveis para a determinação do conteúdo total de whey em suplementos nutricionais e eles podem ser divididos em diferentes categorias, de acordo com seus princípios fisicoquímicos: (i) medida das propriedades físicas brutas, (ii) medida de adsorção de radiação, (iii) medida do espalhamento de radiação, (iv) análise de aminoácidos, (v) análise por infravermelho (IR), (vi) fusão em gás inerte, (vii) análise cromatográfica com espectrometria de massa, e (viii) análise por proteômica de alta definição (UPLC - cromatografia líquida de ultra performance) com marcadores radioativos/estáveis. Cada método instrumental apresenta suas vantagens e desvantagens, bem como a variedade de amostras para os quais eles podem ser aplicados.

Medida das propriedades físicas brutas Densidade: A densidade de uma proteína é maior do que a grande maioria dos outros macronutrientes e, assim, existe uma elevação na densidade de um alimento conforme aumenta seu conteúdo de proteína. Índice refrativo: O índice refrativo de uma solução aquosa aumenta conforme seu conteúdo de proteína for se elevando e, portanto, medidas do índice refrativo podem seu usadas para determinar a concentração de proteína em um suplemento nutricional. Medida da adsorção de radiação UV-vis: A concentração de proteína pode ser determinada ao se mensurar a absorbância de radiação ultravioleta-visível. Infravermelho: Técnicas infravermelhas podem ser usadas para se determinar a concentração de whey em suplementos nutricionais. O whey absorve naturalmente a radiação infravermelha, devido às vibrações características (alongamento e curvatura) de alguns grupos químicos ao longo da cadeia polipeptídica. Desta forma, medidas da absorbância de radiação em determinados comprimentos de onda podem ser usadas para se quantizar a concentração de proteína em uma amostra. As técnicas IR são particularmente úteis para a obtenção de análises rápidas on-line do conteúdo de proteína, além de requererem pouco trabalho na preparação da amostra e serem ensaios não-destrutivos. Suas principais desvantagens são o alto custo inicial e a necessidade de uma permanente e completa calibração. Ressonância nuclear magnética com 13C: A espectroscopia NMR utilizando isótopos estáveis (por exemplo, carbono-13) pode ser usada na determinação do conteúdo de proteína em suplementos nutricionais à base de whey. A concentração de proteína é mensurada através do cálculo da área sob o pico num espectro NMR de desvio químico correspondente à fração de proteína. Medida do espalhamento de radiação Espalhamento de luz. A concentração de agregados de proteína em solução aquosa pode ser determinada utilizando-se técnicas de espalhamento de luz, devido ao fato de que a turbidez de uma solução é diretamente proporcional à concentração de agregados presentes na amostra. Espalhamento ultrassônico. A concentração de agregados de proteína também pode ser mensurada com o uso de técnicas de espalhamento ultrassônico, já que tanto a velocidade

ultrassônica quanto a absorção de ultrassom estão relacionadas com a concentração de agregados de proteína presente na amostra. Análise de aminoácidos A análise padrão de aminoácidos (AAA), incluindo hidrólise por tempo resolvido, é uma ferramenta empregada há bastante tempo para determinar a concentração de proteína em amostras de whey sem a necessidade de uso de um padrão externo. Além disso, ela é um pré-requisito para o emprego de outras técnicas, tais como degradação Edman, espectrometria de massa e outras aproximações baseadas em sequenciamento. O grande problema com esta técnica é que o erro médio entre laboratórios fica na faixa de 10-12%, pois a hidrólise cuidadosa da amostra de proteína é um dos pontos cruciais para uma análise bem sucedida, já que até mesmo impressões digitais podem provocar contaminação. Enquanto que a hidrólise enzimática e a hidrólise básica possam ser especialmente úteis, a hidrólise ácida é a técnica mais comumente usada, sendo que a hidrólise de fase líquida é considerada o ensaio padrão. As amostras precisam obrigatoriamente ser hidrolisadas a vácuo ou em atmosfera inerte, a fim de prevenir qualquer oxidação. Derivatização pré-coluna. Este método ganhou popularidade a partir de 1994, já que este ensaio é considerado como apresentando maior sensibilidade do que as aproximações pós-coluna. Dentre as diversas opções de derivatização pré-coluna existentes, a mais utilizada emprega o uso de fenilisotiocianato (PITC). A vantagem da derivatização PITC com relação a outros ensaios pré-coluna é que ele reage tanto com aminas primárias quanto secundárias, enquanto que outras aproximações não reagem com o aminoácido prolina. Outras vantagens incluem sensibilidade, estabilidade e detecção UV (em oposição à fluorescência). Um problema com a derivatização pré-coluna é que a cromatografia é realizada com o uso de colunas C-18 de fase reversa e, assim, é vital a manutenção de uma boa coluna de guarda. As colunas de guarda devem ser substituídas a cada 150 análises, enquanto que a coluna de separação ainda é viável para uso num intervalo entre 400 análises e 600 análises. As vantagens da aproximação pré-coluna incluem a simplicidade dos procedimentos de derivatização, disponibilidade de derivatizantes estáveis, excelente separação, detecção tanto por absorbância quanto por fluorescência e grande variedade de reagentes comerciais. Entre as desvantagens desta aproximação estão o tempo cromatográfico muito longo (57 minutos) e alto consumo de solventes (caso não sejam empregadas colunas microbore). Derivatização pós-coluna. A cromatografia de troca iônica para a análise de aminoácidos foi inicialmente automatizada em 1963. A tecnologia inicial utilizava buffers grosseiros para a eluição de aminoácidos a partir da coluna de troca iônica, porém os instrumentos mais modernos utilizam gradientes contínuos de eluição, um avanço importante que acarretou em um número muito menor de perturbações de linha de base.

O núcleo desta técnica é justamente a coluna, composta de resina de troca catiônica hidrofílica. A fabricação dessa resina é extremamente complexa e não completamente controlada, de forma que se consegue detectar diferenças entre os lotes de fabricação no que diz respeito a efeitos de partição, efeitos de adsorção e até mesmo efeitos de exclusão de tamanho. Para esta técnica foram desenvolvidos vários detectores, sendo que o clássico e mais utilizado é a nihidrina. A reação de nihidrina com aminoácidos resulta na produção de um composto colorido (púrpura de Rhueman) e é a responsável pela especificidade desta técnica. Desenvolvimentos recentes incluem a triona (um derivado mais estável, porém menos sensível) e reagentes de detecção por fluorescência, incluindo fluorescamina e o-ftaldialdeído (OPA). Quando se compara os métodos pré-coluna e pós-coluna, se verifica algumas vantagens para este último tipo de ensaio: - Já que as propriedades de troca iônica dominam quando a amostra de whey é carregada, alguns contaminantes (não todos) se movem rapidamente através do sistema pós-coluna e são descarregados antes do início da separação de aminoácidos, resultando em um melhor rendimento. - A preparação da amostra é mínima comparada ao método pré-coluna. - A detecção (com nihidrina) é quimicamente específica para alfa-aminoácidos. - Existe farta literatura referente a tempos de retenção de aminoácidos e derivados. - A acuidade e precisão de dados podem ser mantidas em um alto nível com pequeno esforço, especialmente quando se deseja distinguir aminoácidos estereoisoméricos. Dentro da análise de aminoácidos, os protocolos mais comumente utilizados adotam o método AOAC 994.12 com derivatização pós-coluna em nihidrina ou derivatiçãopré-coluna em PITC, embora existam pelo menos três protocolos diferentes (AOAC 988.15 e AOAC 999.13). Análise por infravermelho (IR) Desde o final da década de 90, alguns protocolos passaram a ser utilizados não apenas para a análise quantitativa de suplementos nutricionais à base de whey quanto para a detecção da presença de adulterantes nestes produtos, tais como a Análise por Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) e a Análise de Infravermelho Próximo (NIR). Os adulterantes apresentam diferentes assinaturas espectrais, o que faz com que seja fácil a sua distinção mesmo entre compostos relacionados aos mesmos. As calibrações PCA são capazes de detectar amostras “anormais” com bastante sucesso: entretanto, é crítico com que nenhuma adulteração esteja presente em tais conjuntos de

dados, já que isto iria envenenar a calibração, isto é, tornaria impossível a detecção de adulterantes (calibração intoxicada). Tanto FTIR quanto NIR são usualmente otimizadas para parâmetros de qualidade, tais como proteína e gordura, porém são indiscutivelmente uma extraordinária opção para uma rápida detecção de adulterantes a um bom custo-benefício. As adições fraudulentas de adulterantes em suplementos nutricionais à base de whey são normalmente realizadas em níveis acima das incertezas mensuradas pelos métodos analíticos com base em nitrogênio, isto é, > 0.2 - 0.4% maltodextrina ou > 0.05 – 0.1% melamina. A adição de 0.1% de melamina (para fraudulentamente elevar a concentração de proteína) corresponde num aumento de 0.4% nos valores de proteína bruta. Até a data de redação deste TEC DOC, estavam sendo investigados diferentes esquemas de fracionamento para a determinação de proteína bruta de whey na presença de adulterantes ilegais. A análise da integridade espectral oferece uma ótima chance para a detecção de uma ampla variedade de adulterantes em suplementos nutricionais à base de whey, incluindo aqueles de natureza desconhecida (por exemplo, maltodextrina, melamina, uréia e ácido cianúrico), já que foram desenvolvidas calibrações específicas para tais adulterantes. Fusão de gás inerte Este método é utilizado para a medida de nitrogênio em amostras biológicas, alimentos e metais. Ele é baseado em um forno contendo eletrodos de cobre refrigerados a água. O ensaio provoca a fusão da amostra de whey dentro de um cadinho de grafite nuclearmente puro dentro do forno, a temperaturas que chegam a 3.000 graus centígrados numa atmosfera de gás inerte. Os cadinhos de carbono se comportam como resistores extremamente eficazes, os quais fornecem o calor necessário para fundir a amostra de whey. O nitrogênio contido no suplemento nutricional é liberado na forma de nitrogênio molecular (N2) que é mensurado usando uma célula de condutividade térmica. A pureza do gás é um fator muito importante e utiliza-se o método do “escovão de gás” (gas scrubber) para gerenciar o impacto potencial de impurezas. Neste caso, é gerado um sinal que não é atribuído à amostra de whey e a causa disso é a combinação de impurezas do gás inerte e do cadinho. Determina-se então a contribuição média do sinal de nitrogênio dessas duas fontes, permitindo com que seja calculada a contribuição exclusiva da amostra de whey. Uma desvantagem deste método é que a inconsistência dos níveis de impurezas dessas fontes não pode ser completamente eliminada, afetando a habilidade deste método em determinar com grande acuidade e precisão a concentração de whey em suplementos nutricionais. Análise cromatográfica com espectrometria de massa

A cromatografia líquida foi inicialmente definida no início do século XX pelo trabalho do botânico russo Mikhail Tswett. Seu trabalho pioneiro foi focalizado na separação de compostos (pigmentos de folhas) extraídos de plantas utilizando-se um solvente dentro de uma coluna preenchida com partículas. Tswett escolheu o nome de cromatografia [do grego croma, significando cor, e graphia significando escrita] para descrever seu experimento colorido (curiosamente, o nome Tswett em russo significa cor). O acronismo HPLC foi idealizado pelo Prof. Csaba Horváth em seu trabalho apresentado na PITTCON de 1970 (Pittsburg Conference), originalmente indicando que foi utilizada alta pressão para gerar o fluxo requerido para a obtenção de cromatografia líquida em colunas preenchidas. No início, as bombas disponíveis tinham uma capacidade de pressurizar até um valor de 500 psi (35 bar) e isso foi chamado de cromatografia líquida de alta pressão ou HPLC. Durante a segunda metade da década de 70, houve um tremendo salto de tecnologia, quando os novos instrumentos de HPLC passaram a desenvolver pressões de 6.000 psi (400 bar), além da incorporação de melhores injetores, detectores e colunas. No ano de 2004 foram obtidos novos avanços na tecnologia de instrumentação e de fabricação de colunas cromatográficas, aumentando significativamente a resolução, velocidade e sensibilidade na cromatografia líquida. Foram disponibilizadas colunas com partículas de menor tamanho (1.7 mícrons) e instrumentação com capacidade especializada para permitir uma fase móvel a uma pressão de 15.000 psi (1.000 bar). Estes já eram novos sistemas criados holisticamente para realizarem cromatografia líquida de ultra performance, conhecida hoje como tecnologia UPLC. Na data de redação deste TEC DOC já estavam disponíveis instrumentos dotados de colunas com partículas ainda menores (1 mícron) e capazes de operar a uma pressão de 100.000 psi (6.800 bar), fornecendo assim uma boa idéia do que esperar no futuro. Um cromatógrafo típico usualmente possui um reservatório que contém o solvente (chamado de fase móvel, devido ao fato de que ele se move). Utiliza-se, então, uma bomba de alta pressão (sistema de distribuição ou gerenciamento do solvente) para gerar e mensurar uma taxa de fluxo específico da fase móvel, tipicamente em mililitros por minuto. Um injetor (gerenciador de amostras ou autosampler) introduz (injeta) a amostra na corrente da fase móvel que carrega a amostra para dentro da coluna HPLC. A coluna contém o material cromatográfico necessário para efetuar a separação e este material é chamado de fase estacionária, porque ele é mantido no lugar pela coluna. Um detector irá ver as bandas separadas dos compostos conforme eles vão eluindo da coluna HPLC (a maioria dos compostos não tem nenhuma cor, de forma que não se consegue vê-los a olho nu). A fase móvel deixa o detector e é enviada como rejeito ou então coletada como desejado. Quando a fase móvel contém uma banda separada de algum composto, a técnica HPLC fornece a habilidade de coletar esta fração (a partir do eluato que contém o composto purificado) para estudos posteriores, e isto é chamado de cromatografia preparativa (preparatória). Conforme as bandas coloridas separadas deixam a coluna, elas passam imediatamente para o detector, o qual contém uma célula de fluxo que vê (detecta) cada banda separada de composto contra um background da fase móvel (na realidade, soluções de inúmeros compostos em concentrações típicas de HPLC não têm cor nenhuma). Um detector adequado tem a habilidade de acusar a presença de um composto e enviar o seu correspondente sinal elétrico para o computador, sendo que existem inúmeros tipos de detectores disponíveis no

mercado (por exemplo, detector eletroquímico ou ED), dependendo das características e concentrações do composto a ser analisado. Gera-se então um cromatograma, que é a representação gráfica da separação ocorrida quimicamente (cromatograficamente) no sistema HPLC. O gráfico apresenta uma série de picos no eixo horizontal (eixo de tempos) representando a resposta (tempo de retenção) para cada diferente composto. Os tempos de retenção variam dependendo das interações entre a fase estacionária, as moléculas de whey e o solvente. Existem vários tipos de HPLC, tais como cromatografia de parição, cromatografia de fase normal (por exemplo, cromatografia por fluido supercrítico quiral ou CSFC), cromatografia de deslocamento, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de fase reversa, cromatografia de fluxo isocrático, cromatografia de gradiente de eluição, e cromatografia por aerosol carregado (CAD). Este último tipo é o mais utilizado no monitoramento e na avaliação de concentração de proteínas intactas, peptídeos e aminoácidos. A cromatografia HPLC-CAD acoplada com espectrometria de massa fornece a detecção universal de proteínas, tanto por via quantitativa quanto por via qualitativa, incluindo suplementos nutricionais à base de whey. Tradicionalmente a cromatografia bi-dimensional (2D) tem sido realizada por troca de cátions fortes (SCX) seguida por fase reversa (RP), devido à natureza ortogonal dos mecanismos de separação. A maior desvantagem desta aproximação é que, devido à limitada capacidade de resolução obtida com a SCX, o whey frequentemente é separado através de frações unidimensionais. Os cromatógrafos modernos empregam duas separações de fase reversa em alto pH e baixo pH: desta forma, obtém-se separações por alta resolução em ambas dimensões, ao invés de uma separação em baixa resolução (tipicamente SCX) e uma separação em alta resolução (tipicamente RP), permitindo a obtenção de melhor reprodutibilidade, maior intervalo dinâmico e muito menor transporte fração-a-fração. Análise por proteômica de alta definição (UPLC) com marcadores radioativos/estáveis A digestão enzimática de proteína em água enriquecida com 18O é um método elegante, versátil e de bom custo-benefício para a análise quantitativa de whey em suplementos nutricionais e tem sido aplicada com essa finalidade desde o ano 2000(35-37). No campo da química qualitativa, a marcação proteolítica com 18O vivenciou um desenvolvimento metodológico mais lento em relação a outros métodos químicos ou de marcação metabólica. Dentre as dificuldades deste método cita-se o tempo requerido para a análise, a variabilidade na incorporação de 18O pela amostra de whey (introdução variável de um ou dois átomos de 18O), a possibilidade de troca de rebote do marcador, um desvio de massa relativamente pequeno e a pouca disponibilidade de softwares de avaliação de dados. O tempo necessário para um run (campanha) com marcação por 18O é idêntico ao tempo necessário para o método de digestão, sendo que esse tempo pode ser minimizado para 15-30 minutos através de aceleração da digestão enzimática, por meio de tripsina imobilizada(48), radiação de ultra-som ou temperatura elevada(49).

A fim de se validar este método, houve diversas tentativas de sobrepujar aquelas dificuldades, ou seja, tentar obter a incorporação de um único átomo de 18O ou a marcação completa com dois átomos de 18O. A introdução definida de um ou dois átomos do marcador simplifica a avaliação quantitativa da amostra de whey em um padrão isotópico misto (marcada + não marcada), já que neste caso o padrão isotópico consiste de apenas dois componentes estabelecidos como 16O/18O ou 16O/18O2. Dependendo do método de fabricação do whey (troca iônica, filtragem cerâmica, ultra-nano filtração), pode haver variação nas taxas de incorporação do marcador: nestes casos, o processo de deconvolução deve considerar três componentes [16O + 18O + 18O2), onde a soma destes dois últimos isotopômeros representa a quantidade de espécies marcadas. Esta soma é independente da composição relativa, já que a interconversão das espécies 18O em espécies 18O2 não modifica a soma das espécies. Já foram desenvolvidos alguns softwares para a deconvolução de padrões isotópicos iônico-moleculares de proteínas e peptídeos marcados com 18O (incluindo whey)(50-52), porém na atualidade a maioria destes programas computacionais não está disponível na forma de arquivos de acesso aberto ou então requerem um conhecimento avançado de algoritmos de reconhecimento de padrão para análise compartimental. Como alternativa para a deconvolução de padrões iônico-moleculares, o conteúdo de 18O de proteínas e peptídeos pode ser analisado no nível de fragmento iônico. A avaliação por espectrometria de massa no nível tandem (MS)/MS fornece uma melhor acuidade dos dados quantitativos comparada à avaliação dos espectros, devido a menor ruído de fundo e melhor especificidade, de forma que foram desenvolvidos softwares para a avaliação quantitativa do conteúdo de whey em suplementos nutricionais por meio de experimentos com os marcadores 13C e 15N a nível MS/MS(53). Uma versão desse software aplicável à marcação com 18O foi incorporada à máquina de busca MASCOT (versão 2.2). Nesse tipo de análise com marcadores, a especificação do instrumento normalmente é estabelecida como UPLC-ESI-QTOF-MS (Cromatografia Líquida de Ultra Performance por Eletrospray e Tempo de Voo por Quadrupolo acoplada a Espectrometria de Massa) e os parâmetros de busca são feitos com quantificação por multiplex 18O-relacionada, combinada com uma janela de tolerância de 6 Da (Daltons) para a massa do precursor e uma janela de tolerância de 0.3 Da para a massa no MS/MS. Com essa tecnologia, tornou-se possível quantificar o conteúdo de whey em suplementos nutricionais usando-se informação MS/MS. Com o emprego do MASCOT 2.2, tal quantificação é conveniente e independente da plataforma utilizada, o que permite o uso de diferentes espectrômetros de massa sem a necessidade da transformação de dados ou o uso de algoritmos que acarretam em formatos diferentes de dados. Usando-se um instrumento QTOF no modo MS/MS, o intervalo linear da quantidade aplicável de amostra de whey é superior comparado à quantificação baseada em monitoramento, sendo que tanto identificação quanto quantificação são realizadas ao mesmo tempo. Apesar da grande variedade existente de métodos utilizados por laboratórios analíticos e descritos na introdução acima, serão apresentados a seguir os métodos mais comumente empregados para a análise da concentração de whey em suplementos nutricionais.

1.3.1 Método Kjeldahl O método Kjeldahl foi desenvolvido em 1883 por um cervejeiro chamado Johann Kjeldahl. Um alimento ou produto é digerido com ácido forte de forma que ele libera seu conteúdo de nitrogênio reduzido na forma de sulfato de amônia, o qual pode ser determinado pela técnica de titração. A quantidade de proteína presenteé então calculada através da concentração de nitrogênio na matriz em análise. Normalmente ele é considerado o método padrão para a determinação da concentração de proteína, sendo também empregado na análise de solos, de efluentes em estações de tratamento de esgotos e fertilizantes. Contudo, além deste método não ser seletivo (ele não fornece uma medida do conteúdo real de proteína presente numa matriz, já que ele mensura nitrogênio não proteínico juntamente com nitrogênio de proteína), sua indicação não é direta e necessita do emprego de um fator de conversão para converter a concentração medida de nitrogênio em concentração de proteína. Além disso, devem ser usados diferentes fatores de conversão para as diferentes proteínas, de acordo com a sua sequência típica e particular de aminoácidos na cadeia peptídica. O método Kjeldahl pode ser convenientemente dividido em três passos: digestão, neutralização e titração. 1.3.1.1 Princípios Digestão Uma amostra do produto a ser analisado é pesada dentro de um frasco digestor e, então, digerida por aquecimento na presença de ácido sulfúrico (um agente oxidante que digere a proteína), sulfato de sódio anidro (para acelerar a reação ao elevar o ponto de ebulição) e um agente catalítico como cobre, selênioou titânio(para acelerar a taxa de reação). Durante os primeiros anos de uso deste método, costumava-se empregar óxido de mercúrio como agente catalítico e, devido a preocupações de saúde ocupacional, ele foi substituído pelos agentes acima descritos, os quais não apresentam a mesma eficiência do mercúrio, já que seu uso resulta em valores de concentração de proteína menores que os verdadeiramente encontrados na amostra. A digestão converte qualquer nitrogênio presente no produto em amônia, enquanto converte outra matéria orgânica em gás carbônico e água. Amônia gasosa não é liberada em uma solução ácida porque ela encontra-se na forma iônica (NH4+), a qual se liga ao íon sulfato, permanecendo na solução. Neutralização

Após a digestão ter sido completada, o frasco digestor é conectado a um frasco de recepção através de um tubo. Então, a solução no frasco digestor é tornada alcalina com a adição de hidróxido de sódio, o que converte o sulfato de amônia em amônia gasosa. O gás formado é liberado da solução, saindo do frasco digestor para o frasco de recepção, o qual contém ácido bórico em excesso. O baixo pH da solução contida no frasco de recepção converte o gás de amônia em amônia iônica e simultaneamente converte o ácido bórico em íon borato. Titração O conteúdo de nitrogênio é, então, estimado por titração do borato de amônio formado com ácido hidroclórico ou ácido sulfúrico padrão, utilizando-se um indicador para determinaro ponto final de reação. A concentração de íons hidrogênio (em moles) necessária para se atingir o ponto final de reação é equivalente à concentração de nitrogênio presente na amostra analisada. Uma amostra de controle (blank) é normalmente analisada simultaneamente com o material original para se levar em conta qualquer nitrogênio residual que possa estar presente nos reagentes utilizados no processo analítico. Uma vez determinado o conteúdo de nitrogênio, ele é convertido em conteúdo de proteína usando-se o fator de conversão apropriado para cada caso. 1.3.1.2 Vantagens e desvantagens do método Vantagens.O método Kjeldahl é largamente utilizado no cenário internacional e ainda considerado o método padrão para comparação contra todos os outros métodos. Apesar de suas sérias desvantagens, a sua universalidade, seu razoável nível de precisão e sua boa reprodutibilidade o tornaram o método de escolha para a estimativa do conteúdo de proteína em alimentos. Desvantagens. O principal problema com este método é que ele não mensura o conteúdo real de proteína, já que o nitrogênio total presente nos alimentos não está na forma de proteína. Esta desvantagem foi definitivamente evidenciada com o incidente ocorrido com alimentos para animais domésticos em março de 2007 e com o escândalo com leite em pó fabricado e comercializado na China em 2008, no qual empresários inescrupulosos alteraram (técnica conhecida como dopagem ou spiking) a composição da matéria prima com melamina, um produto químico repleto de nitrogênio, a fim de artificialmente elevarem o conteúdo de proteína em alimentos para animais domésticos (2007) e leite em pó (2008). Como naquela época o método Kjeldahl era (e continua sendo) o método padrão de análisep ara a concentração de proteína em alimentos, o artifício de falsificação não foi notado por nenhuma agência reguladora de nenhum país. A melamina é normalmente utilizada como um agente retardador de chama e estabilizante para plásticos industriais: entretanto, ela passa a ser extremamente tóxica no caso de ingestão oral, devido à presença de algumas bactérias (principalmente klebisiella) no trato gastrointestinal tanto em humanos quanto em animais, as

quais se alimentam com melamina e produzem ácido cianúrico como resultado dessa metabolização. Quando combinado com a melamina, este ácido se cristaliza e provoca a formação imediata de estruturas insolúveis que não conseguem ser desintoxicados pelos rins, levando a nefropatia grave e até morte. No caso do incidente de 2007, mais de 3.600 animais domésticos morreram por nefrotoxicidade e falha renal nos EUA, Canadá, Austrália, Europa e África do Sul, embora nunca se venha saber o número exato de mortes e envenenamentos sem morte. Inicialmente, as autoridades desconfiaram de contaminação acidental de matéria prima com aminopterina(veneno de rato), sendo que investigações subseqüentes comprovaram o uso proposital de melaminaem produtos fabricados com glúten de trigo e proteína concentrada de arroz (no caso dos EUA) e com glúten de milho (no caso da África do Sul). Todos os produtos que provocaram esse evento foram fabricados com matéria prima adquirida de duas empresas chinesas, a Xuzhou Anying Biologic Technology Development Companye a Binzhou Futian Biology Technology Co. Ltd. No caso do escândalo de 2008, a crise se iniciou no dia 2 de agosto daquele ano, quando executivos do grupo Fonterra (uma empresa fabricante de ingredientes para suplementos nutricionais baseada na Nova Zelândia e a maior empresa comerciante de produtos derivados de leite) chegaram à China para uma reunião de trabalho na sede da sua companhia joint- venture chinesa chamada Sanlu Group (o maior produtor de leite daquele país). Naquela reunião, os executivos ficaram sabendo que o leite em pó fabricado pela sua parceira estava contaminado com melamina. Outra grande desvantagem deste método é que é necessário o uso de diferentes fatores de correção para as diferentes proteínas, a fim de compensar as diferentes sequencias de aminoácidos. Esta desvantagem soma-se a outras, que são a necessidade de uso de ácidos concentrados e em altas temperaturas, além do tempo de procedimento ser excessivamente longo (mais de uma hora para cada análise). Mais uma desvantagem deste método é sua pequena sensibilidade em sua versão original. É possível obter-se uma sensibilidade muito maior através do emprego de outros métodos de detecção para quantificar o amônio (NH4+) após mineralização e destilação, como por exemplo: - gerador de par de hidreto em linha com espectrômetro de emissão atômica (ICP-AES-HG)(30)

- eletroforese de zona capilar(31)

- cromatografia iônica(32)

- titração potenciométrica Além de tudo isso, o método Kjeldahl não é aplicável para compostos contendo nitrogênio nos grupo azo e nitro, além de nitrogênio localizado na estrutura anelar (por exemplo, piridina), já que estes nitrogênios não mudam para sulfato de amônio sob as condições deste método.Assim, o método Kjeldahl não é capaz de recuperar o conteúdo completo de nitrogênio orgânico e de compostos heterocíclicos, além de não ser capaz de determinar frações de nitrogênio inorgânico, tais como nitritos e nitratos. Numa tentativa de minimizar este ponto fraco, entre os anos de 2.000 e 2.010 foram estabelecidos novos padrões Kjeldahl para nitrogênio não-proteínico usando-se precipitação com TCA(34).

1.3.2 Método de combustão de Dumas O método Dumas em química analítica foi inicialmente descrito pelo químico francês Jean-Baptiste Dumas em 1831(33). Este método passou a ser inicialmente utilizado na análise do conteúdo de proteína durante a década de 80e depois, mais extensamente, na década de 90, quando foi desenvolvida uma técnica instrumental automatizada capaz de analisar com velocidade sem precedentes a concentração de proteína em amostras de alimento. Para a determinação do conteúdo de proteína em produtos à base de leite e soro de leite, este método é citado na norma DIN EN ISO 14891, §35,01.00,10. Neste método, amostras sólidas de proteína do soro de leite ou líquidas (em solução) entram em combustão a altas temperaturas (1.000 graus Celsius) na presença de agentes catalíticos, formando óxidos de nitrogênio. Com o auxílio de cobre nuclearmente puro, os óxidos são reduzidos para nitrogênio elementar, enquanto se separa completamente os sub-produtos dessa reação, formados por água e gás carbônico. O nitrogênio resultante pode ser analisado com o uso de um detector de condutividade térmica sem a necessidade de fluxo de um gás de referência. As amostras sendo analisadas caem de um auto-sampler com até 120 posições para dentro de uma câmara de fluxo, a qual está constantemente preenchida com gás hélio. A combustão é iniciada ao se mudar o fluxo de gás para oxigênio puro e o transporte até 1.000 graus Celsius na câmara de combustão. As cinzas da amostra são coletadas em um reservatório de rejeitos que pode ser removido e trocado mesmo quando o instrumento atingiu a sua temperatura operacional. Dentre todos os resíduos de combustão, os óxidos de nitrogênio são reduzidos para nitrogênio elementar no forno de redução. A maior parte da água é separada utilizando-se um sistema de tubo de membrana que opera com uma parede semi-permeável localizada no contador de fluxo. Qualquer água remanescente é capturada em uma armadilha de absorção, aonde é realizada a separação do gás carbônico em armadilhas de adsorção auto-regeneráveis. Desta forma, o nitrogênio elementar permanece e pode ser quantizado pelo detector de condutividade térmica sem qualquer fluxo gasoso de referência. A calibração do instrumento é feita analisando-se um material de pureza conhecida e também exibindo concentração conhecida de proteína (por exemplo, EDTA [9.59% de nitrogênio]). Desta forma, o sinal gerado pelo detector de condutividade térmica pode ser convertido em concentração de nitrogênio. Entretanto, da mesma forma que ocorre no método Kjeldahl, é necessário converter a concentração de nitrogênio da amostra em conteúdo de proteína com fatores de conversão que dependem da sequência exata de aminoácidos na proteína. 1.3.2.1 Vantagens e desvantagens do método

Vantagens. Os gases resultantes são analisados de forma direta, o que reduz o tempo necessário para o processo como um todo. Os softwares utilizados pelos instrumentos disponíveis no mercado realizam o ajuste automático do tempo na análise. Desta forma, leva-se apenas de 2-3 minutos para se completar uma análise padrão com 200 mg de EDTA, comparado com 1-2 horas para o método Kjeldahl. Outra grande vantagem é que as câmaras de amostras do autosampler são preenchidas com hélio e, assim, nenhum gás atmosférico penetra na câmara de combustão. O uso de hélio como gás carregador oferece condições ótimas para a detecção de nitrogênio pelo detector. Neste método, o desvio padrão relativo é menor que 0.5% (absoluto) para uso de EDTA como substância de teste e com peso inicial da amostra situando-se em 200 mg. Já que durante cada medida analisa-se a quantidade total de nitrogênio presente na amostra de whey, o limite de detecção deste método é de 0.01 mg (absoluto) e a quantidade máxima detectável de nitrogênio é de 50 mg.Apesar da quantidade usual de cada amostra estar situada entre 50 e 300 mg, é possível trabalhar-se com amostras com massas entre 0.5 mg e um grama, dependendo do conteúdo de carbono e da homogeneidade do produto comercial à base de whey que está sendo analisado. Devido ao fato de que tanto a precisão quanto a acuidade dos métodos analíticos podem apenas ser tão exatas e precisas quanto a curva padrão, mais uma vantagem deste método é a sua não dependência da equação da curva padrão, acarretando em uma precisão com uma percentagem de coeficiente de variância (%CV) de 1.0715 em percentagem de proteína. Outra vantagem é que o gás de combustão (oxigênio) é adicionado estequiometricamente através de software, significando que é fornecida apenas a quantidade necessária deste gás para que se obtenha combustão completa. Mais algumas vantagens adicionais é que não é necessário o uso de reagentes químicos tóxicos, além de poder ser realizada a análise simultânea de várias amostras (até 120) e o processo de análise ser extremamente simples, incluindo a preparação da amostra. Desvantagens. Este método apresenta um alto custo inicial, devido ao instrumento necessário para a realização da análise. Além disso, dependendo do tipo de análise sendo realizado, o pequeno tamanho da amostra pode tornar difícil a obtenção de uma amostra representativa. Da mesma forma que ocorre com o método Kjeldahl, o método Dumas também não fornece uma medida real da proteína contida na amostra, já que nem todo o nitrogênio está na forma de proteína. Além disso, diferentes tipos de proteínas necessitam do uso de diferentes fatores de correção, dependendo da sequência típica de aminoácidos na cadeia. Como o método Dumas utiliza basicamente os mesmos fatores de correção que o método Kjeldahl, ele resulta em valores brutos para o conteúdo de proteína que são 1.4% maiores que os obtidos por Kjeldahl. É importante lembrar-se que precisão e acuidade são características relativas a uma curva padrão. Substâncias encontradas em alimentos e que contêm nitrogênio não-proteínico incluem ácidos nucleicos, carboidratos contendo nitrogênio, fosfolipídios, vários alcaloides, vitaminas, nitritos e nitratos e o cálculodo conteúdo desse nitrogênio é chamado de proteína bruta. Desta

forma,outra desvantagem do método Dumas reside no fato de que ele mensura a proteína bruta no ensaio. 1.3.3 Métodos utilizando espectroscopia UV-vis (ultravioleta-visível) Desde a década de 70, foram sendo incorporados inúmeros métodos analíticos para a determinação da concentração de proteína em amostras de alimento e baseados em espectroscopia UV-vis. Tais métodos seguiram-se ao trabalho pioneiro com digestão por bloco e destilação a vapor, culminando com o ensaio UDY de ligação por corante. Tais métodos não apenas aproveitam utilizam a habilidade natural das proteínas em absorver (ou espalhar) a luz na região UV-visível do espectro eletromagnético quanto modificam quimicamente ou fisicamente a proteína de interesse para que absorva (ou espalhe) luz nessa região do espectro. O primeiro passo é a preparação de uma curva de calibração de absorbância (ou turbidez) de aminoácidos aromáticos [tirosina – fenilalanina – triptofano] versus a concentração de proteína, usando-se uma série de soluções de proteína de concentração conhecida. Então é possível medir a absorbância (ou turbidez) da solução sendo analisada no mesmo comprimento de onda, sendo que sua concentração de proteína pode ser determinada a partir da curva de calibração. A principal diferença entre os vários ensaios são os grupos químicos responsáveis pela absorção ou espalhamento de radiação, isto é, ligações peptídicas, grupos aromáticos laterais, grupos básicos e proteínas agregadas. No caso de suplementos nutricionais à base de whey, este trabalho é bastante dificultado pela presença de uma grande variedade de frações bioativasencontradas nessa proteína: - alfa-lactalbumina - beta-lactoglobulina - albumina de soro bovino - imunoglobulinas - glicomacropeptídeos - lactoferrina - lisozima - proteoses - peptonas - lactoperoxidase - etc. Alguns exemplos dos métodos UV-vis mais comumente utilizados para a determinação do conteúdo de proteína em alimentos estão discriminados abaixo. 1.3.3.1 Medida direta em 280 nm (A280)

A absorbância mensurada no comprimento de onda de 208 nm (A280) é usada para o cálculo da concentração de proteína por comparação com uma curva padrão ou valores de absortividade publicados para o whey. Tanto o triptofano quanto a tirosina absorvem fortemente luz ultravioleta em 280 nm e o conteúdo destes aminoácidos é praticamente constante na maioria das proteínas. Assim, a absorbância de soluções feitas com a proteína a ser analisada a 280 nm pode ser utilizada para determinar a sua concentração. Este ensaio pode ser utilizado para se quantificar soluções cuja concentração de proteína situa-se no intervalo de 20 a 3.000 microgramas/mililitro. Dentre as vantagens deste método estão a simplicidade de procedimento, sua natureza não destrutiva (método não destrutivo) e a não obrigatoriedade do uso de reagentes especiais. Entretanto, sua principal desvantagem é que ácidos nucleicos também absorvem fortemente a 280 nm e, portanto, podem provocar interferência com a medida de proteína se estiverem presentes em concentrações suficientemente altas (que é justamente o caso do whey). Tentando contornar este problema, foram desenvolvidas algumas alternativas para tentar solucionar esta deficiência, como por exemplo, medir a absorbância em vários comprimentos de onda distintos. A acuidade de uma determinação espectroscópica UV pode diminuir significativamente por espalhamento de luz pela amostra em teste. Se a proteína existente na solução é composta por partículas comparáveis em tamanho ao comprimento de onda da luz mensurada (250 a 300 nm), o espalhamento do feixe de luz resulta em um aumento aparente na absorbância da amostra. Para se calcular a absorbância a 280 nm devida ao espalhamento de luz, se determina as absorbâncias da solução de teste nas regiões 320, 325, 330,335, 340, 345 e 350 nm. Usando o método de regressão linear, é feita a plotagem do logaritmo da absorbância observada versus o logaritmo do comprimento de onda e se consegue extrair a curva padrão que melhor se ajuste aos pontos plotados. A partir do gráfico obtido, extrapola-se o valor da absorbância da proteína em solução. Para se reduzir o efeito de espalhamento da luz (principalmente se a solução tiver forte turbidez), se procede a uma filtração (0.2 µm no caso de whey) ou clarificação por centrifugação. 1.3.3.2 Medida direta em 205nm (A205) A determinação da concentração de proteína através da medida da absorbância no comprimento de onda de 205 nm (A205) está baseada na absorbância da ligação peptídica. A concentração de proteína na amostra é determinada através da absorbância medida e da absortividade a 205 nm. Esta medida direta normalmente é utilizada quando a proteína a ser analisada apresenta quantidades significativas de ácidos nucleicos a fim de se ter uma medida em um comprimento de onda diferente de 280 nm. 1.3.3.3 Método de emissão por fluorescência

Neste método, é possível determinar a concentração de proteína em produtos com whey ao se mensurar a fluorescência intrínseca baseada na emissão por fluorescência pelos aminoácidos aromáticos presentes na amostra (tirosina – fenilalanina – triptofano). As características de fluorescência dos aminoácidos aromáticos pode ser visualizada na tabela abaixo:

Absorção

Absorção

Fluorescência

Fluorescência

Tempo de vida

Comprimento

de onda

Absortividade

Comprimento

de onda

Quantum

Triptofano

2.6

280

5,600

348

0.20

Tirosina

3.6

274

1,400

303

0.14

Fenilalanina

6.4

257

200

282

0.04

Tempo de vida: nanosegundos/ Comprimento de onda: nanômetros

De maneira geral, os tempos de vida são pequenos e os valores quantum são baixos para todos os três resíduos. O fluoroforo se origina da interação serina-tirosina-glicina, a qual é pós-translacionalmente modificada e mudanças na fluorescência intrínseca podem ser usadas para monitorar mudanças estruturais na proteína. Este ensaio pode ser usado para a quantização de soluções de proteína de whey exibindo concentrações entre 5 e 50 microgramas/ml. 1.3.3.4 Métodos colorimétricos 1.3.3.4.a Método Biuret O método Biuret é um dos ensaios mais antigos e de menor sensibilidade dentre todos os métodos colorimétricos (espectrofotométricos). Apesar disso, o ensaio Biuret ainda é frequentemente (e inexplicavelmente) muito utilizado, talvez devido à facilidade do procedimento, à preparação simples dos reagentes e à sua menor susceptibilidade para interferências químicas, comparado a outros métodos que utilizam cobre.

Este método é baseado na quelação polipeptídica de íons cúpricos (Cu2+ ou quelato colorido) com as ligações peptídicas (quelação polipeptídica) em solução fortemente alcalina. Compostos contendo duas ou mais ligações peptídicas reagem com os íons cúpricos, produzindo um complexo de cor violeta-púrpura.Geralmente, as misturas de reação para ensaios espectrofotométricos não devem ser diluídas após o desenvolvimento, mesmo se a coloração (absorbância) for muito intensa. No caso de análise da concentração de whey em suplementos nutricionais, utiliza-se albumina de soro bovino (cristalizada ou liofilizada) como padrão de calibração [10 a 20 mg/ml]. Para o caso do whey, não é necessário o uso de detergente (deoxicolato ou SDS) para ajudar a solubilizar a proteína, pois este é um caso diferente da análise de tecido (por exemplo, colágeno) ou biomateriais insolúveis. A tabela abaixo mostra os slopes dos pontos (plots) de calibração para o método Biuret.

Proteína

Condições do ensaio

Slope

[A650 (µg/ml v.f.e.)-1cm-1]

BSA

---

2.3 x 10-4

BSA

---

2.6 x 10-4

BSA

Concentração de glucose0.4 a 400 mM

2.7 x 10 -4

BSA

---

2.7 x 10-4

Beta-lactoglobulina

---

2.5 x 10-4

Enzimas celulases

---

2.2 x 10-4

BSAb

--- 3.2 x 10-4

BSAC

---

1.9 a 2.8 x 10-4

BSAd

---

2.3 x 10-4

aAbreviaturas: BSA, albumina de soro bovino; v.f.e, volume final do ensaio bWatters (1978) cGoshev e Nedkov (1979) dBeyer (1983) O reagente biuret pode ser adquirido comercialmente ou então utiliza-sesulfato cúprico dissolvido em água (deionizada e bi-destilada) quente [solução A] e citrato de sódio dihidrato combinado com carbonato de sódio em água quente [solução B], misturando-se as duas soluções pós-resfriamento. Este reagente permanece estável por um período de seis meses.Mistura-se o reagente biuret com a solução de proteína (whey que servirá como padrão analítico) e mensura-se a absorbância a 545nm, utilizando-se o blank analítico para calibrar o instrumento em zero. Normalmente ocorrem diferenças nos slopes aparentes de laboratório para laboratório, devido a variações na quantidade de materiais inertes (NaCl ou água) a partir de proteína incompletamente seca usada na calibração. O slope médio para o método Biuret, obtido com o uso de várias proteínas globulares como padrão de calibração, é aproximadamente 100 vezes menor que o obtido em outros ensaios (método Hartree-Lowry e método BCA). Uma questão ainda sem resposta dentro do trabalho de análise quantitativa de proteína é a escolha do padrão de calibração. Alguns laboratórios usam como padrão uma amostra purificada da proteína em análise (neste caso, whey), enquanto que outros laboratórios acham suficiente o uso de albumina de soro bovino(BSA). Embora seja um fato que alguns métodos (notadamente os ensaios A280 baseados em UV) sejam dependentes da composição de aminoácidos da proteína, a química Biuret se baseia na estrutura polipeptídica e não na composição dos resíduos da cadeia lateral. Desta forma, o método Biuret é independente da proteína utilizada como padrão de calibração. A principal vantagem desta técnica é que não existe nenhuma interferência de componentes que absorvem em comprimentos de onda menores, além do fato de ser um procedimento menos sensível ao tipo de proteína, pois utiliza absorção envolvendo ligações peptídicas que são comuns a todas as proteínas, ao invés de utilizar absorção específica de grupos laterais da cadeia. Entretanto apresenta sensibilidade relativamente baixa comparada aos outros métodos UV-vis. 1.3.3.4.b Método Hartree-Lowry

O método Lowry original para a análise da concentração de proteína, publicado em 1951, tem sido constantemente re-investigado a fim de se avaliar os efeitos de substâncias interferentes e a habilidade de alguns detergentes em solubilizar proteínas insolúveis. O método Hartree-Lowry fornece resultados lineares sobre uma variedade mais ampla de concentração de proteína, além de manter a mesma sensibilidade do método original e ser superior na formulação dos reagentes. Este método é baseado na redução pela amostra de proteína do cromógenoácido fosfomolibdídico-tungstico no reagente Folin-Ciocalteu fenol, resultando numa absorbância máxima em 750 nm. Os íons cúpricos (Cu2+) são reduzidos para íons cuprosos (Cu+) em pH alcalino quando reagem com um peptídeo. O reagente Lowry-Folin-Ciocalteau consiste de fosfomolibdato e fosfotungstatoque provocam uma coloração azul-molibdênio (instável) quando reduzidos e reage primariamente com resíduos de tirosina da proteína, o que pode levar a uma variação na resposta do ensaio para diferentes tipos de proteína. A coloração é principalmente devida ao conteúdo de tirosina presente na amostra. Existe um pequeno pico de absorbância na região de 500 nm que pode ser usado para a determinação de altas concentrações de whey e um pico maior na região de 750 nm que pode ser utilizado na determinação de baixas concentrações de whey. Este método apresenta maior sensibilidade para menores concentrações de proteína quando comparado ao método Biuret. A relação de absorbância para concentração de proteína é não-linear: no entanto, se o intervalo de concentração da curva padrão for suficientemente pequeno, ela irá se aproximar da linearidade. Utilizando o método de regressão linear, é feita a plotagem das absorbâncias das soluções a partir das soluções padrão versus concentrações de proteína e determina-se qual a curva padrão que melhor se ajusta aos pontos plotados. A partir desta curva padrão e da absorbância da solução de teste, encontra-se a concentração de proteína na solução de teste. 1.3.3.4.c Método Bradford Nos métodos de ligação colorimétrica, adiciona-se um corante negativamente carregado (aniônico) à amostra de whey em solução cujo pH é ajustado de forma que as proteínas sejam positivamente carregadas (isto é, ponto isoelétrico). A proteína irá formar um complexo insolúvel com o corante devido à atração eletrostática entre as moléculas, porém o corante não ligado permanece solúvel. O corante aniônico se liga aos grupos catiônicos de aminoácidos básicos e aos grupos terminais dos aminoácidos livres. Determina-se a quantidade de corante não ligado que permanece em solução após a remoção do complexo insolúvel proteína-corante (centrifugação) ao se medir sua absorbância, sendo que a quantidade de proteína presente na solução original é proporcional à quantidade de corante que se liga a ela. Este método se baseia no desvio de absorção de 470 nm para 595 nm que é observado quando o corante azul brilhante G-250 se liga ao whey. O corante Coomassie Brilliant Blue G-250 se liga quase que instantaneamente aos resíduos arginil, histidile lisilna proteína, o que pode acarretar em variação na resposta do ensaio para diferentes proteínas.

Um ponto extremamente importante quando se aplica este método é a obrigatoriedade de NÃO se utilizar células espectrofotométricos de quartzo (sílica), pois o corante se liga fortemente a este material. Devido ao fato de que diferentes espécies de proteínas podem resultar em diferentes intensidades de respostas coloridas, a proteína padrão e a proteína de teste devem ser a mesma. Outra desvantagem deste método é a transferência de reagentes: se a amostra de whey não for mixada de forma adequada antes de se retirar a amostra de teste, os resultados mostram claramente uma concentração menor de proteína. 1.3.3.4.d Método BCA (ácido bicinchinônico) Este método foi desenvolvido por P. K. Smith em 1985 e se baseia na redução realizada pela amostra de whey do íon cúprico (Cu2+) em íon cuproso (Cu+), numa reação biuret em ambiente fortemente básico. O íon cuproso resultante é quelado com o reagente BCA, sendo que este quelado Cu+-BCA apresenta uma cor brilhante com um pico de absorção em 562 nm. Assim, a absorbância nesse comprimento de onda [A562] é diretamente dependente da concentração de whey, quando são mantidas as condições do ensaio. O método BCA compara-se favoravelmente com o antigo método Lowry ou com o método Hartree-Lowry no que diz respeito a sensibilidade e conveniência. Esta sensibilidade pode ser aumentada com o uso de uma concentração maior do reagente BCA (solução contendo ácido bicinchinônico, carbonato de sódio monohidratado, tartrato de sódio, hidróxido de sódio e bicarbonato de sódio). Entretanto, o custo do reagente BCA é bastante elevado e o aumento fracional da sensibilidade pode não valer o maior custo. Da mesma forma que ocorre com o método Hartree-Lowry, a relação de absorbância para concentração de proteína é não-linear: no entanto, se o intervalo de concentração da curva padrão for suficientemente pequeno, ela irá se aproximar da linearidade. Utilizando o método de regressão linear, é feita a plotagem das absorbâncias das soluções a partir das soluções padrão versus concentrações de proteína e determina-se qual a curva padrão que melhor se ajusta aos pontos plotados. A partir desta curva padrão e da absorbância da solução de teste, encontra-se a concentração de proteína na solução de teste. O método BCA é menos susceptível a interferências provocadas por detergentes do que outros ensaios, porém ele apresenta maior susceptibilidade a interferências provocadas por açúcares redutores, e até mesmo por açúcares ostensivamente não-redutores, tais como sucrose (eventualmente adicionado pelo fabricante na composição do suplemento nutricional à base de whey), já que a sucrose libera açúcares redutores na hidrólise parcial. 1.3.4 Vantagens e desvantagens dos métodos colorimétricos

Vantagens. As técnicas UV-vis são relativamente rápidas e simples de serem realizadas e possuem razoável sensibilidade para baixas concentrações de proteína. Desvantagens. Para a maioria das técnicas UV-vis é necessário o uso de soluções diluídas e transparentes e completamente isentas de contaminantes e interferentes que possam absorver ou espalhar a luz no mesmo comprimento de onda da proteína que está sendo analisada. Esta necessidade para soluções transparentes significa que a maioria dos alimentos (e em especial os produtos à base de whey) deve passar por extensos e detalhados procedimentos de preparação da amostra antes da análise, isto é, homogenização, extração por solvente, vortexação, centrifugação e filtração, o que pode consumir um tempo significativo e ser bastante trabalhoso. Além disso, muitas vezes é difícil extrair quantitativamente proteínas a partir de determinados tipos de alimento, especialmente após eles terem sido processados de forma que as proteínas se tornaram agregadas (caso do soro de leite) ou covalentemente ligadas com outras substâncias. Mais ainda, a absorbância depende do tipo de proteína sendo analisada, já que diferentes proteínas apresentam diferentes sequências de aminoácidos na cadeia. 1.3.5 Comparação entre os métodos Cientistas nutricionais e diretores de laboratórios analíticos frequentemente se vêem na posição de ter de escolher uma técnica em particular para a avaliação da concentração de proteína em suplementos nutricionais ostensivamente vendidos no mercado legítimo. Também com bastante frequencia a dúvida principal entre eles é sobre como decidir qual método é o mais apropriado para uma aplicação em particular. Além disso, análises laboratoriais solicitadas voluntariamente pelos próprios fabricantes de suplementos nutricionais apresentam grande variedade de ensaios e técnicas analíticas mesmo para cada lote de fabricação, e uma comparação dos resultados obtidos para cada fabricante torna-se confusa e incapaz de fornecer qualquer conclusão definitiva e que tenha um mínimo de credibilidade. Um dos primeiros aspectos a se determinar é para qual objetivo a informação sobre o conteúdo de whey irá ser usada. No caso da análise estar sendo feita com propósitos oficiais (requisitos legais, forenses ou de rótulo), então é vital o uso de métodos oficialmente validados, conforme foi discutido no início deste documento técnico. Para isso, o método Kjeldahl e o método Dumas já foram oficialmente aprovados para esse tipo de análise, mesmo com todos os seus pontos fracos inerentes e já relatados nos capítulos acima. A espectroscopia UV-vis também já tem sido oficialmente aprovada para este tipo de análise, embora apresente menor variedade de aplicações quando comparado com os dois métodos anteriores. Entretanto, a cada dia é maior a aceitação e a tentativa de validação dos métodos instrumentados mais modernos e mais rápidos, não apenas para este propósito específico (avaliação do conteúdo de whey em suplementos nutricionais), mas também para propósitos de controle de qualidade. Neste caso, as técnicas por infravermelho (IR), as técnicas baseadas em HPLC e também as técnicas utilizando a novíssima UPLC têm ganhado terreno dentro dos quesitos validação e credibilidade. O único e ainda constante problema está relacionado com o custo dos instrumentos modernos, embora as técnicas mais recentes (UPLC) necessitem de quantidades significativamente menores de reagentes e consumíveis em geral.

Outros fatos que devem ser considerados são a quantidade requerida de preparação da amostra, sua sensibilidade e sua velocidade de procedimento. Os métodos Kjeldahl, Dumas e IR necessitam de muito pouca preparação de amostra e, após ter sido selecionada uma amostra representativa de whey, ela pode ser usualmente ser testada de forma direta. Por outro lado, os vários métodos UV-vis requerem uma extensa preparação de amostra antes da análise. Dependendo da fórmula do suplemento nutricional à base de whey, a proteína deve ser extraída do produto para dentro de uma solução diluída, o que usualmente envolve procedimentos como homogenização demorada, extração por solvente, filtração e centrifugação. Além disso, as várias técnicas apresentam sensibilidades bastante variáveis, isto é, a menor concentração de proteína que ela é capaz de detectar. Com exceção das novas tecnologias cromatográficas, os métodos UV-vis apresentam a maior sensibilidade, sendo capazes de detectar concentrações de proteína tão baixas quanto 0.001% por peso. A sensibilidade dos métodos Kjeldahl, Dumas e IR situa-se ao redor de 0.1% por peso. Outros fatores também bastante importantes são o tempo requerido para o procedimento analítico e o número de amostras de whey que pode ser avaliado simultaneamente, já que são outros aspectos a se considerar no momento da escolha de qual ensaio será empregado na campanha. Os métodos por IR são capazes de analisar concentrações de proteína de forma muito rápida (< 1 minuto), desde que a calibração já tenha sido feita. O método Dumas instrumentalizado moderno é totalmente automatizado e pode mensurar a concentração de whey em amostras de suplementos nutricionais em menos de 5 minutos, comparado com o método Kjeldahl que leva de 30 minutos a 2 horas para realizar a análise. Os vários métodos utilizando UV-vis apresentam tempos analíticos variando entre alguns minutos até uma hora (dependendo do tipo de corante utilizado e quanto tempo o mesmo leva para reagir), embora eles apresentem a vantagem de análise simultânea de várias amostras. Apesar disso, nesses métodos é usualmente necessária a realização de uma demorada preparação da amostra antes da análise, a fim de se obter uma solução transparente. Outros fatores adicionais importantes para a escolha da técnica analítica apropriada são a disponibilidade de equipamento, facilidade de operação, a acuidade desejada para o resultado analítico e se a técnica é não-destrutiva. Conclusões A análise quantitativa de proteína (incluindo a análise da concentração de whey em suplementos nutricionais) é uma atividade complexa, envolvendo boa quantidade de tecnologia, que deve adotar muitos passos como procedimento e impossível de ser realizada com um mínimo de credibilidade e confiabilidade no nível amador ou doméstico. Mesmo que o protocolo analítico seja realizado por laboratórios oficialmente (formalmente) credenciados, os resultados podem apresentar uma variação significativa nos resultados, dependendo da escolha do método analítico, da preparação das amostras, da calibração dos equipamentos, da análise estatística dos dados e do treinamento e expertise da equipe.

Até mesmo um erro na coleta da amostra pode ser introduzido já no início do procedimento. Para que os erros sejam minimizados, devem ser estabelecidos vários check points (pontos de conferência) em cada etapa do procedimento, incluindo novas soluções e reagentes que estejam eventualmente sendo utilizados na análise. Este TEC DOC procurou apresentar os vários tipos de ensaio e os vários equipamentos e tecnologias utilizadas no momento da redação deste documento. Contudo, é preciso salientar que o objetivo deste TEC DOC foi discutir os procedimentos analíticos quantitativos para whey em suplementos nutricionais. Em vários cenários é preciso realizar a avaliação qualitativa de proteína (isto é, do tipo de whey contido no produto e a possibilidade de contaminação acidental ou fraudulenta com outras substâncias que possam elevar a concentração de proteína ou modificar favoravelmente o sabor do produto final). Este assunto é objeto de outro documento VITAFOR (TEC DOC 003-2013).