UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA –

PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PRODOUTOR,

PIBIT E FAPESPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

Período : agosto/2014- a julho/2015

( ) PARCIAL

( x ) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa: Avaliação histopatológica renal de ratos intoxicados com

citrato de alumínio.

Nome do Orientador: Marcia Cristina Freitas da Silva

Titulação do Orientador: Doutor Neurociência e Biologia Celular

Faculdade : Enfermagem

Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas

Laboratório: Ciências aplicadas

Título do Plano de Trabalho: Avaliação imunohistoquimica renal em ratos Wistar após

exposição crônica ao alumínio.

Nome do Bolsista: Ricky Falcão S Trindade

Tipo de Bolsa: PIBIC/PRODOUTOR

1. INTRODUÇÃO

O alumínio é o metal mais comumente encontrado na crosta terrestre, não

aparece isolado em seu estado elementar, entretanto, apresenta-se em forma de vários

tipos de silicatos como bauxita e criolita. Quando exposto a água, ao oxigênio ou a

outra substância oxidante, forma-se uma camada superficial de óxido de alumínio, o que

lhe permite ser o metal com considerável resistência à corrosão (SZURKALO, 2009).

A grande reatividade do alumínio iônico é explicada por sua alta valência (+3) e

seu pequeno raio atômico, em alta temperatura tem a capacidade de reduzir cátions de

vários metais pesados ao estado metálico o que impede a evaporação (SANTOS, 2003).

Existem usos do alumínio que são reconhecidamente poluentes: a indústria, por

exemplo, onde a poluição ocorre principalmente de forma indireta através da emissão de

substâncias como o dióxido de enxofre e óxido de nitrogênio e a mineração

(CARNEIRO, 2004). Nessas atividades geralmente ocorre a poluição indiscriminada da

atmosfera, rios e lagos que podem trazer riscos à vida considerando a enorme

quantidade de rejeitos produzidos (AMBIENTAL, 2008).

Suas principais vias de introdução e absorção são as vias oral, respiratória,

parenteral e cutânea. A taxa de absorção é muita baixa em estado clínico normal,

quando alcança a corrente sanguínea liga-se a algumas proteínas de baixo peso

molecular principalmente transferrina e à albumina (SANTOS, 2003). O

armazenamento ocorre principalmente nos pulmões e ossos, todavia ainda é distribuído

para o fígado, rins e tecidos cerebrais. Tem capacidade de atravessar as barreiras

hematoencefálica e fetoplacentária.

A água potável, os utensílios de cozinha e embalagem de alimentos são formas

de exposição ao metal, mas também está presente nos antiácidos e aspirina (DANTAS

et al., 2007; FERREIRA et al., 2008). Ele está presente naturalmente na água (em

pequenas quantidades), mas em processos de tratamento hídrico pode ser adicionado o

sulfato de alumínio por ser um ótimo agente coagulante (VAZ, 2010). A contaminação

da água pode ocorrer por destino incorreto de resíduos das mineradoras. Está presente

também na dieta mundial pela utilização de utensílios domésticos feitos a partir do

metal pois partículas de alumínio podem ser retiradas no processo de cozimento de

alimentos (DANTAS et al., 2007).

2. JUSTIFICATIVA

O alumínio é utilizado no setor de transporte, de energia, embalagem e faz parte

de muitos móveis e objetos de nosso dia a dia (ABAL, 2010), sendo improvável que não

haja contato diário com o metal.

Alguns estudos comprovam a toxicidade do metal principalmente ao que se

refere a dano neural. A intoxicação experimental em ratos da linhagem Wistar com

citrato de alumínio resultou em acúmulo do metal no soro e no hipocampo dos animais

provocando estresse oxidativo e ainda prejuízos nos mecanismos de aprendizagem e

memória (SILVA JÚNIOR, 2013). Há evidências também de relação com o

aparecimento de Alzheimer (FERREIRA et al., 2008).

As diferentes espécies de alumínio, orgânico e inorgânico, podem produzir uma

variedade de alterações fisiológicas. Cunat e colaboradores (2000) verificaram que o

alumínio é melhor absorvido quando presente em sais de citrato que em outros sais, e

por apresentar farmacocinética particular, em doses equimolares consegue diminuir a

ação tecidual de cristais de oxalato e parece ter uma margem maior de segurança do que

outros sais de alumínio (LOTE et al., 1995; GUO e MCMARTIN., 2007).

Há estudos sobre mudanças na função renal do rato após exposição crônica ao

alumínio, estas ocorrem sem mudanças nos marcadores de filtração glomerular (TAN et

al., 2007; REITER et al., 2008; MAHIEU et al., 2009), apesar deste metal ser pro

oxidante in vitro e in vivo (EXLEY, 2004), ocasionando uma alteração no sistema

glutationa, peroxidação lipídica e catalase (MAHIEU et al., 2005). Também tem efeito

inibitório na atividade de Na+–K+ATPase (SILVA et al., 2005). Ji e colaboradores

(2011) observaram após exposição crônica ao alumínio estreitamento dos túbulos

renais, vasos dilatados e glomérulos necróticos. Dada a importância da célula endotelial

para a homeostasia renal e do processo inflamatório para o estabelecimento de doenças

renais, foram utilizadas marcações imunohistoquimicas para avaliar o dano renal pela

exposição crônica ao citrato de alumínio.

3. OBJETIVOS

3.1- GERAL

Analisar a imunohistoquimica renal em ratos submetidos a intoxicação crônica com

100 mg/kg de citrato de alumínio.

3.2- ESPECIFICOS

Investigar o comprometimento inflamatório no parênquima renal após intoxicação

crônica com 100 mg/kg de citrato de alumínio.

Avaliar o comportamento dos macrófagos como reguladores principais da

inflamação após intoxicação crônica com 100 mg/kg de citrato de alumínio.

Determinar a integridade das células endoteliais frente à intoxicação crônica com

100 mg/kg de citrato de alumínio.

4. METODOLOGIA

Foram utilizados ratos albinos da espécie Rattus novergicus, linhagem Wistar,

machos, experimentalmente ingênuos com peso entre 200 e 250 g com 2 meses de vida

fornecidos pelo Biotério central da Universidade Federal de Pará (UFPA). Todas as

condições experimentais e os procedimentos éticos estiveram de acordo com as normas

locais do Comitê de Ética em Pesquisa com animais experimentais, onde o presente

trabalho foi submetido e aprovado.

A intoxicação dos animais experimentais foi realizada através da administração

de citrato de alumínio (CA) para um grupo e salina (S) para outro grupo na dose de 100

mg/kg injetada em um volume de até 1 ml por via oral (gavagem) por 30 dias de acordo

com o peso do animal conforme protocolo descrito por Silva Júnior et al., 2013.

A dosagem da concentração de alumínio no soro foi realizada por analise direta

através da técnica de absorção atômica em forno de grafite (GF AAS).

O preparo das amostras biológicas para a realização das reações

imunohistoquímicas, seguiram o mesmo protocolo para inclusão em parafina. Após,

ocorreu a recuperação antigênica , incubação com anticorpos primário e secundário para

observação das marcações no tecido renal.

As reações realizadas neste trabalho foram para detecção de células endoteliais e

periquitos (CD 34), linfócitos (LCA) e macrófagos (CD 68).

Todas as lâminas imunohistoquímicas produzidas neste trabalho foram

submetidas às técnicas descritas acima incluindo os animais controle e expostos.

Toda a análise foi realizada com o auxílio do microscópio de luz comum Axio

Star Plus da Zeiss e a documentação fotomicrográfica, com o uso do microscópio com

DS-U3 Câmera Digital Control Unit Nikon – Nikon upright Microscope – Eclipse-Ci-

S/Ci-L.

Para analise estatística foi usado a analise de variância (ANOVA) teste de

Tukey. O nível de significância adotado neste estudo foi p<0,05.

5. RESULTADOS

1. DOSAGEM DE ALUMINIO NO SORO DE RATOS ADULTOS

A dosagem de alumínio no soro dos animais demonstrou que o grupo

intoxicado apresentou a concentração média de 5000±43 µg/l no final dos 30 dias de

intoxicação.

Figura 1: Concentração de Alumínio no soro de ratos adultos após 30 dias de

intoxicação. Houve diferença significativa entre os grupos estudados

(p<0,05, ANOVA/Teste Tukey)

2. IMUNOHISTOQUIMICA NAS LÂMINAS DE RIM DE RATO

A reação imunohistoquímica para a detecção de células endoteliais e pericitos

(CD34) em células renais de ratos mostrou positividade nas paredes dos vasos

sanguíneos nos animais expostos com citrato de alumínio semelhante aos animais

controle. (Figura 2)

Figura 2: Fotomicrografia de rim de rato após reação imunohistoquimica para CD 34.

As setas indicam as células endoteliais nos vasos renais do controle (A1) e exposto

(A2). Aumento original 100x

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Citrato de aluminio Salina

Co

nce

ntr

açã

o d

e A

lum

inio

no

soro

µg/l

A 1 A 2

A reação imunohistoquímica para a detecção de comprometimento inflamatório no

parênquima renal mostrou que não houve deflagração da resposta imunológica nos

animais tratados. A fotomicrografia mostra a semelhança entre o controle e o exposto

(Figura 3).

Figura 3: Fotomicrografia de rim de rato após reação imunohistoquimica para LCA.

Não foi observado infiltrado linfocitário no controle (Aumento original 20x, B1) e

exposto (Aumento original 40x, B2).

A reação imunohistoquímica para a detecção dos reguladores principais da

inflamação no rim (CD 68) mostrou que não houve marcação de células do sistema

macrofágico mononuclear.(Figura 4)

B 1 B 2

Figura 4: Fotomicrografia de rim de rato após reação imunohistoquimica para CD 68.

Observa-se que reação negativa para as lâminas do controle (C1) e do exposto (C2)

Aumento original 100x.

6. DISCUSSÃO

O rim apresenta sensibilidade aumentada a tóxicos devido ao elevado fluxo

sanguíneo, ser um local de liberação de metabólitos além de ter a habilidade de

concentrar a urina. Com isto, metais, como o alumínio podem causar danos renais

(Zhuo, 2008; Ji et al., 2011).

O modelo de intoxicação utilizada no presente estudo foi baseado no trabalho de

Silva Junior (2013), no qual o alumínio induziu alterações em regiões hipocampais,

como rarefação no número de células e desorganização celular, e na imunomarcação

para proteína ácida fibrilar glial (GFAP) detectaram alterações na reatividade.

As doenças renais crônicas são caracterizadas por processos patogênicos como

disfunção endotelial e desregulação imunológica. Em intoxicação por cloreto de

alumínio, Shi–liang e colaboradores (2013) observaram danos tubulares e nos capilares

renais. Neste estudo, a exposição a 100 mg.Kg -1

de citrato de alumínio por trinta dias

C 1 C 2

consecutivos não deflagrou resposta inflamatória apesar do metal ter sido absorvido e

esta em concentração elevada no soro.

A concentração do alumínio encontrada no soro neste estudo no grupo exposto

foi elevada, mas não acumulou no tecido renal, talvez pelo fato do adjuvante , apesar de

amplificar a absorção no tecido nervoso, não ter sido efetivo no parênquima renal. Na

literatura, os compostos de alumínio formados com cloretos (Ji et al., 2011; Shi-lang et

al., 2013) e fosfetos (Gibbs e Sevigny, 2007; Fritschi et al., 2008; Sim et al., 2009)

induzem danos severos no parênquima renal, enquanto hidróxidos e fosfatos apresentam

riscos baixos quando utilizados como adjuvantes nas vacinas (Mitkus et al., 2011).

Neste modelo experimental, a intoxicação crônica por citrato de alumínio em

Rattus norvergicus, o metal não deflagrou resposta inflamatória e não alterou as células

endoteliais renais.

7.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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