relatório de toxico pratica 2(1)

Relatório de Aula Prática 2 de Toxicologia – VPT 316:

Intoxicação por plantas que contém glicosídeos cianogênicos (Holocalyx glaziovii), teste do picrato e coleta de

amostragem para avaliação de micotoxinas.

Autores: Cintia Maria Monteiro de Araújo, Jaqueline de Oliveira Sena, Mariana Ramos Queiroz e Thiago Luis Santos Gonçalves

1. INTRODUÇÃO

1.1. Plantas cianogênicas

Plantas cianogênicas são aquelas que contêm como princípio ativo o ácido cianídrico (HCN). O HCN encontra-se

ligado a carboidratos denominados glicosídeos cianogênicos, sendo liberado sob a forma de cianeto (CNˉ) durante a

mastigação ou processamento destas plantas; este produto é muito volátil e é resultado da ação de enzimas liberadas de

vesículas no momento do rompimento celular (β-glicosidade e hidroxinitrila-liase). Os glicosídeos cianogênicos têm sido

constatados em plantas de muitas famílias, entre elas: as Rosaceae, Leguminoseae, Gramíneae, Araceae, Passifloraceae e

Euforbiceae. Além das plantas, o HCN também é encontrado em cogumelos, fungos e bactérias.

Dentre as plantas cianogênicas mais importantes do Brasil estão as do gênero Manihot (Euphorbeaceae). A mais

conhecida é Manihot esculenta - mandioca brava. Os tubérculos da M. esculenta são comestíveis e a intoxicação ocorre

quando administrados aos ruminantes imediatamente após a colheita ou durante a fabricação da farinha e outros

produtos. O tratamento dos tubérculos mediante a moagem ou a ralação faz com que percam a toxicidade.

A intoxicação por essa espécie ocorre quando animais famintos invadem culturas, quando as primeiras chuvas são

seguidas de uma estiagem de vários dias e os animais ingerem as plantas em brotação ou secas, também quando são

alimentados com as folhas frescas e/ou tubérculos sem os devidos cuidados quanto à eliminação do princípio ativo

(CANELLA et al., 1968 apud AMORIM, 2006). Experimentos realizados por AMORIM et al. só conseguiram reproduzir a

intoxicação em bovinos com M. glaziovii a partir de 5g/kg/PV. Já a intoxicação cianídrica em caprinos com M. glaziovii foi

obtida a partir de 6,7 g/kg/pv. A Holocalix glaziovii, uma árvore da família Leguminoseae-Mimosoideae é, também,

cianogênica, mas a intoxicação espontânea por esta planta nunca foi descrita (ARMIEN et al. 1995 apud AMORIM, 2006).

Glicosídeos cianogênicos: características

O ácido cianídrico responsável pela toxicidade de tais plantas é resultante do desdobramento dos glicosídeos

cianogênicos. Os glicosídeos são produtos secundários do metabolismo das plantas e fazem parte do sistema de defesa

contra insetos, moluscos e herbívoros. A concentração dos glicosídeos cianogênicos é variável nas diferentes espécies de

plantas, e dentro de uma mesma espécie varia dependendo do clima e outras condições que influenciam o crescimento

da planta como adubação nitrogenada, deficiência de água e idade da planta, pois quanto mais nova e de crescimento

rápido, maior será o seu teor em glicosídeos cianogênicos. Isto se deve a intensa atividade celular, principalmente

observada nas folhas e sementes em germinação (EGEKEZE & OEHME 1980 apud AMORIM, 2006).

Os glicosídeos cianogênicos são hidrosolúveis e potencialmente liberam CNˉ. Quando o material vegetal é

dilacerado, por exemplo, mediante a mastigação, o glicosídeo é hidrolisado por ß-glicosidases, que se encontram

separadas dos glicosídeos no tecido vegetal intacto. Essa situação não faz diferença para os ruminantes, uma vez que as

1

bactérias ruminais podem hidrolisar os glicosídeos cianogênicos com rapidez, liberando o CNˉ. Por outro lado, o pH ácido

do estômago nos monogástricos faz com que as ß-glicosidases não atuem e a liberação do cianeto seja lenta, o que dá

tempo para a sua eliminação, sem alcançar a dose letal (TOKARNIA et al., 2000, RADOSTITS et al., 2000, CEREDA 2003

apud AMORIM, 2006). Sabe-se que cerca de 80% do cianeto absorvido é biotransformado pela rodanase (tiossulfato

sulfurtransferase) a um metabólito atóxico - o tiocianato (SPINOSA, 2008); entretanto, os casos de intoxicação ocorrem

quando a quantidade ingerida e absorvida ultrapassa esta capacidade de metabolização do CNˉ. A rodanase converte o

íon cianeto em tiocianato na presença de cisteína, um aminoácido doador de enxofre, sendo este metabólito eliminado

pela urina.

Glicosídeos cianogênicos: intoxicação

A intoxicação aguda por cianeto leva o animal a um quadro de hipóxia e anóxia citotóxica. Seu mecanismo primário

de ação relaciona-se com a inibição da enzima citocromo-oxidase e seu local de ação é o ferro da metalo-porfirina. O CN ˉ

reage com o ferro trivalente da citocromo oxidase e forma um complexo relativamente estável, o citocromo-oxidase-CN,

interrompendo o transporte de elétrons ao longo da cadeia respiratória, inibindo, desse modo, a cadeia de fosforilação

oxidativa (sistema de transporte de elétrons da cadeia respiratória) (SPINOSA, 2008). Como a oxihemoglobina não pode

liberar o oxigênio para o transporte de elétrons, o sangue apresenta uma coloração vermelho-brilhante (RADOSTITS et al.,

2000). A absorção do cianeto é rápida, sendo amplamente distribuído no organismo; os sinais de intoxicação cianídrica

aparecem logo após ou mesmo durante a ingestão da planta e caracterizam-se por sialorréia, paresia, espasmos

musculares generalizados, e convulsões do tipo tônico-clônicas. As membranas apresentam-se, inicialmente, vermelho-

vivas, depois cianóticas. Em relação ao quadro respiratório, o animal apresenta polipnéia e dispnéia, podendo

posteriormente sofrer parada respiratória (SPINOSA, 2008). Além disso, o animal apresenta taquicardia, andar

cambaleante a ponto de o animal cair, nistagmo e opistótono. Nos casos mais graves, ocorre queda seguida de decúbito

lateral, dispnéia cada vez mais acentuada e coma.

Glicosídeos cianogênicos: tratamento da intoxicação

Se feito a tempo, o tratamento é muito eficiente. Ele é composto por associação de tiossulfato de sódio (200

mg/mL) com nitrito de sódio (150 mg/mL). Para cada 45 kg de peso vivo, deve-se administrar 3 mL de tiossulfato de sódio

e 1 mL de nitrito de sódio, por via intravenosa. O tiossulfato se combina com o CNˉ livre para formar o tiocianato,

enquanto que o nitrito de sódio induz a formação de metahemoglobina, que tem alta afinidade pelo cianeto, deslocando-

o da citocromo oxidase. A administração de tiossulfato pode ser repetida posteriormente; entretanto, o nitrito não deve

ser associado, uma vez que há a possibilidade de esta substância produzir doses excessivas de metahemoglobina, o que

acarreta um quadro de cianose – insuficiência de oxihemoglobina para o aporte de oxigênio (SPINOSA, 2008).

Glicosídeos cianogênicos: prevenção da intoxicação

Pode-se fazer a prevenção de intoxicação por plantas cianogênicas destinadas à alimentação animal por meio do

teste do picrato. Neste teste, o preparo do papel-reagente é feito molhando-se tiras de papel filtro em uma solução

composta de 5g de carbonato de sódio e 0,5g de ácido pícrico para 100 mL de solução. Após secas, as tiras de papel assim

preparadas apresentam-se amarelas. O teste é feito a partir de uma amostra do vegetal a ser examinado acondicionada

num pequeno frasco (30 a 50 mL); fixa-se uma tira de papel-reagente na tampa (não permitir contato com a amostra) e

veda-se o frasco, que deve ser aquecido a 30-35C por 5 minutos (Figura 1). Se a tira ficar vermelho-tijolo, indicará grande 2

quantidade de cianeto na amostra. Nesse caso, é necessário realizar procedimentos, tais como moer ou secar a planta,

para promover a liberação do cianeto, diminuindo assim a quantidade de glicosídeo cianogênico disponível ao animal

(SPINOSA, 2008).

Figura 1 – Esquema do teste do picrato

1.2. Micotoxinas

A urgência em aderir ao controle da presença de micotoxinas vai além dos prejuízos causados no desempenho

animal, refletidos na economia; é um problema de saúde pública, de segurança na cadeia alimentar. Já há mais de 400

espécies de micotoxinas conhecidas e muitas outras novas ainda estão sendo descobertas, elas são produzidas por mais

de 100 espécies de fungos diferentes e têm formas químicas diversas (Mallmann et al. 2005 apud FIREMAN, 2007).

Não há dúvidas de que a contaminação fúngica, principalmente nos climas tropicais e sub-tropicais, como o do Brasil, é

favorecida pelas condições de temperatura e umidade. Mas a contaminação fúngica não ocorre somente na

armazenagem dos grãos, pode ocorrer durante praticamente todas as fases do desenvolvimento do grão. Vem daí a

necessidade de se avaliar e monitorar os níveis de micotoxinas presentes nos grãos e outros alimentos.

Há metodologias químicas e testes de imuno-ensaio para quantificar a contaminação por micotoxinas, sendo que

os métodos químicos jamais podem ser substituídos pelos de imuno-ensaio. Para ambos, um fato necessário é a coleta

apropriada de amostragem. Conforme afirmaram Miraglia et al. (2005, apud FIREMAN, 2007), a amostragem é a atividade

mais importante no monitoramento de micotoxinas. Os autores escreveram uma visão holística deste monitoramento,

baseada em dois passos principais, sem os quais um bom programa não pode ser implantado:

(1) Estabelecer Por que, Onde e Quando amostrar: embasado no objetivo da empresa, o no tempo e local

apropriados para a coleta de amostras.

(2) Estabelecer Como fazer estas amostragens seguindo um planejamento específico para colher uma amostra

representativa, já que a distribuição das micotoxinas na massa de grãos é heterogênea.

O LAMIC recomenda que, a cada 100 toneladas de ração produzidas por dia, a fábrica deve coletar 45 kg de

material moído. Deste material deve-se retirar uma amostra de no mínimo 1 kg, que será enviada ao laboratório. É muito

importante treinar o amostrador e conscientizá-lo de forma muito clara desta responsabilidade. O tempo entre coleta da

amostra e chegada ao laboratório não deve exceder 48h (FIREMAN, 2007).

3

2. OBJETIVOS

2.1) Acompanhamento da progressão de uma intoxicação aguda experimental de bovinos por planta cianogênica,

com monitoramento da sintomatologia apresentada e verificação da eficácia do tratamento.

2.2) Avaliação, por meio do teste do picrato, dos níveis de cianeto presentes em amostras de mandioca mansa

(Manihot utilissima), mandioca brava (Manihot esculenta)e alecrim-de-campinas (Holocalyx glaziovii).

2.3) Simular coleta de amostragem para avaliação da presença de micotoxinas, fazendo-se uso de mistura de grãos

de arroz (100 pintados de preto).

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Animais e Condições de Alojamento

Três bezerros, pesando 125 Kg, 75 Kg e 130 Kg, foram utilizados por três dias consecutivos, um em cada dia. Os

animais foram mantidos em jejum antes da realização do experimento.

3.2. Soluções, Reagentes e Substâncias Utilizadas

3.2.1. Intoxicação dos bezerros:

Extrato de Holocalyx glaziovii

Nitrito de sódio (250 mg/mL)

Tiossulfato de sódio (200 mg/mL)

Solução de 10 mL de Blotrol® e água

3.2.2. Teste do Picrato:

50 mL de água

5 g de carbonato de sódio

0,5 g de ácido pícrico.

3.3. Delineamento Experimental

3.3.1. Intoxicação do Bezerros:

Foi feita a mensuração das funções vitais dos bezerros (frequências cardíaca, respiratória e de movimentos

ruminais) antes do início da intoxicação experimental. Após a administração do extrato de Holocalyx glaziovii através de

sonda esofágica (deposição direta no rúmen), novas avaliações desses mesmos parâmetros foram feitas a cada cinco

minutos para o acompanhamento do quadro. Os animais receberam uma solução de 2,2 g/kg de extrato de Holocalyx

glaziovii, planta cianogênica da família Leguminoseae-Mimosoideae. Quando os alunos julgaram necessária a

administração do tratamento, esta foi feita por via intravenosa (veia jugular externa) e uma nova mensuração das funções

4

vitais dos animais foi feita para constatação do restabelecimento da normalidade. O tratamento foi feito com nitrito de

sódio na concentração de 250 mg/mL e tiossulfato de sódio na concentração de 200 mg/mL para cada 45 Kg de peso vivo.

Repetiu-se, cerca de dez minutos depois, nova dose de tiossulfato de sódio. Solução de 10 mL de Blotrol® em água foi

administrada (V.O.) ao final do experimento, para eliminação dos gases.

3.3.2. Teste do Picrato

Avaliamos 3 amostras de plantas cianogênicas: Manihot esculenta (mandioca brava), Manihot utilissima (mandioca

mansa) e Holocalyx glaziovii (alecrim-de-campinas). Para isso, colocamos amostras de cada uma delas em 3 frascos

distintos, fixando à tampa uma tira de papel-reagente preparado anteriormente (embebidos em solução de 50 mL de

água, 5 g de carbonato de sódio, 0,5 g de ácido pícrico). Tais amostras foram aquecidas a 33/35 C por 5 minutos;

observando-se a nova coloração da tira.

3.3.3. Amostragem para avaliação de micotoxinas

Para observarmos a importância da coleta correta de amostras para avaliação de micotoxinas, utilizamos 2 kg de

arroz (104712 grãos, estimados pela pesagem de 100 grãos – 1,91 g). Estes 100 grãos foram pintados de preto e

misturados aos outros. Visto isso, tem-se que a proporção entre grãos pretos e brancos é de 1:1047. O recipiente de

coleta tem capacidade de armazenar 32,8 g arroz (cerca de 1717 grãos), sendo esperados 1,63 grãos pretos em cada

amostra.

Foram coletadas 10 amostras de arroz, sendo que a cada coleta foram contados os grãos pretos presentes; depois

disso, devolveu-se o conteúdo do recipiente aos 2 kg, homogeneizando-se bem antes de cada coleta e tomando-se o

cuidado de fossem aleatórias (escolher pontos diferentes, sem olhar para dentro do pote, que era escuro justamente para

evitar que o resultado fosse tendencioso).

4. RESULTADOS

4.1. Intoxicação dos bezerros

Dia 1 (Grupo 3) – Monitoramento das Funções Vitais e Avaliação de Mucosas

Período Freqüência Cardíaca (bpm)

Freqüência Respiratória (mpm)

Movimentos Ruminais (m/3’)

Mucosa

Antes da intoxicação 92 50 1 ++Intoxicação por Holocalyx glaziovii (logo após mensurações)

5 min após intoxicação 180 34 0 +++

Tratamento – 6 min após a intoxicação10 min após intoxicação 81 24 1 ++

OBS.: Após 5 minutos da administração do extrato de H. glaziovii, o bezerro apresentou fasciculações e recebeu o

tratamento no minuto seguinte, via IV, sendo posicionado em decúbito lateral. Passados 2 minutos da administração do

nitrito de sódio + tiossulfato de sódio, o animal colocou-se em decúbito esternal, sendo que seguidos 3 minutos após o

tratamento o animal já estava em estação.

Peso do bezerro: 125 kg.

5

Dia 2 (Grupo 1) Monitoramento das Funções Vitais e Avaliação de Mucosas



Movimentos Ruminais (m/3’) Mucosas

Antes da intoxicação 90 48 3 ++Intoxicação por H. glaziovii (logo após mensurações)

5 min após intoxicação

148 24 0 +

10 min após intoxicação 130 26 0 +

Tratamento – 12 min após a intoxicação17 min após intoxicação

84 28 2 ++

OBS.: 10 minutos após a intoxicação por extrato de H. glaziovii, o animal caiu em decúbito lateral; em 11 minutos a contar

da administração do extrato, o bezerro apresentou convulsão tônico-clônica. O tratamento foi feito 12 minutos após a

intoxicação, sendo que passado 1 minuto o animal estava em decúbito esternal, ficando em estação 4,5 minutos após o

tratamento.

Peso do bezerro: 75 Kg

Dia 3 (Grupo 2) Monitoramento das Funções Vitais e Avaliação de Mucosas



Movimentos Ruminais (m/3’) Mucosas

Antes Intoxicação 80 35 1 +Intoxicação por H. glaziovii (logo após mensurações)

5 min após intoxicação 196 45 0 ++1º Tratamento – 7 min após a intoxicação

10 min após intoxicação 160 70 0 +++2º Tratamento – em 8,5 min

5 min após 2ª aplicação do tratamento 108 35 1 +

OBS.: O bezerro apresentou tremores depois de aproximados 4 minutos após a intoxicação. Foi mensurada a temperatura

antes da intoxicação (38,3 ºC) e após o 2º tratamento (38,2 ºC).

Peso do bezerro: 130 kg.

Os gráficos a seguir ilustram os parâmetros vitais mensurados ao longo dos experimentos.

Frequência Cardíaca (bpm)

81 84

108

180

92

148

90

130

196

160

80

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

antes da intoxicação 5' após intoxicação 1 0' após intoxicação ≈ 1 5' após intoxicação

t (min)

FC

(b

pm

)

Bezerro 1 Bezerro 2 Bezerro 3

6

Frequência Respiratória (mpm)

34

242428

45

70

35

50

26

48

35

0

20

40

60

80


t (min)

FR

(m

pm

)


Movimentos Ruminais (m/3min)

1

2

1

0

1

0

3

000

1

0

1

2

3

4


t (min)

MR

(m

/3m

in)


4.2. Teste do Picrato

Após decorridos os 5 minutos necessários para a volatilização do cianeto e reação com a fita-reagente, as

colorações de cada fita foi observada (Figura 2): a fita correspondente à mandioca mansa apresentou-se amarela, com

discreta tonalidade laranja, a fita da mandioca brava apresentou-se alaranjada, tendendo ao marrom e a correspondente

ao alecrim-de-campinas mostrou-se escurecida (vermelho/marrom tijolo).

Figura 2 – Resultados das reações do teste do picrato.

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4.3. Amostragem para avaliação de micotoxinas

A contagem dos grãos pretos em cada amostra encontra-se na seguinte tabela:

Amostragem de Arroz (32,8 g/amostra)

Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média

Grãos Pretos 4 0 0 2 2 1 1 3 2 1 1,6

Obtivemos, portanto, a média de 1,6 grãos pretos por amostra coletada.

5. DISCUSSÃO

5.1. Intoxicação dos bezerros

O primeiro animal apresentou o quadro de intoxicação apenas três minutos após a administração do extrato de

Holocalyx glaziovii, sendo que um minuto depois o animal cambaleou e foi colocado em decúbito lateral e, apenas cinco

minutos após a exposição, houve a necessidade de realização do tratamento para que o animal não apresentasse

convulsões. Essa resposta tão rápida se deve a dois fatores evidentes: 1) o jejum ao qual o bezerro foi submetido, o que

aumentou a velocidade de absorção do princípio ativo tóxico; 2) a quantidade de extrato administrada ao animal. Isso

confirma que a resposta é dose dependente.

Taquicardia, bradipnéia, atonia ruminal, espasmos musculares, andar cambaleante e membranas avermelhadas

apresentados pelo bezerro são devidos à maior ocorrência da enzima citocromo-oxidase estar nos tecidos que

apresentam elevado metabolismo oxidativo, como o sistema nervoso central e a musculatura cardíaca. O cianeto liberado

quando a integridade da planta é quebrada se liga a essa enzima, fazendo com que o sistema de transporte da cadeia de

elétrons seja paralisado, causando hipóxia e anóxia citotóxica e ocasionando a sintomatologia apresentada.

O animal 2 apresentou, num tempo parecido, os mesmos sinais de intoxicação vistos no animal 1 acrescidos de

convulsões do tipo tônico-clônicas. Pode-se supor duas razões para a ocorrência dessas convulsões: o reduzido peso do

animal e a demora na realização do tratamento (cerca de doze minutos após a administração da planta).

Já o animal 3 apresentou aumento da frequência respiratória ao invés da queda observada nos demais, o que pode

ser proveniente de uma variação individual ou de um erro no momento da captação do dado. Os demais sintomas

também foram observados: taquicardia, atonia do rúmen, espasmos musculares e membranas avermelhadas. O

tratamento foi feito antes que o animal apresentasse convulsão (cerca de sete minutos após a administração do agente

tóxico).

Em todos os casos, ao receber o tratamento, o animal apresentou melhora no tempo de um a dois minutos,

colocando-se de pé e com funções vitais próximas do normal cerca de cinco minutos após. Tendo em vista o mecanismo

de ação pelo qual ocorre a intoxicação por Holocalyx glaziovii, o tratamento feito com nitrato de sódio e tiossulfato foi

eficiente pelo fato de o nitrato de sódio formar metahemoglobina, que retira o cianeto da citocromo-oxidase, formando

cianometemeglobina, e o tiossulfato de sódio se combinar ao cianeto livre, formando tiocianato, que é atóxico. No

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entanto, deve-se tomar cuidado com a dose de nitrato de sódio administrada, pois a metemoglobina possui baixa

afinidade por O2 e em altas concentrações pode levar o animal à morte num quadro de cianose.

5.2. Teste do Picrato

O teste do picrato permite a avaliação qualitativa da quantidade de cianeto presente em uma amostra de planta

cianogênica. Como era esperado, o alecrim-de-campinas (Holocalyx glaziovii) causou a maior alteração de cor na fita,

sendo a planta que possui maior teor de glicosídeos cianogênicos dentre as amostras analisadas, seguido pela mandioca

brava (M. esculenta) e pela mandioca mansa (M. utilissima), esta última possui quantidades muito baixas de cianeto. Visto

isso, temos que este teste é de essencial importância para a avaliação da necessidade de se tratar o vegetal antes de

introduzi-lo na alimentação dos ruminantes, evitando as intoxicações por erro no manejo de tais plantas.

5.3. Amostragem para avaliação de micotoxinas

Comparando-se a média obtida pelo experimento (1,6 grãos pretos por amostra) àquela calculada inicialmente

(1,63 grãos pretos por amostra), pode-se inferir que este experimento foi válido para constatar que a execução correta do

método de coleta de amostras (numerosas e aleatórias) garante um resultado fidedigno para o laudo a ser dado numa

avaliação de micotoxinas. Uma única amostra ou poucas podem superestimar (amostras 1, 4, 5, 8 e 9) ou subestimar

(amostras 2, 3, 6, 7 e 10) o valor verdadeiro de micotoxinas presente num carregamento de cereais, por exemplo.

6. CONCLUSÃO

Embora a intoxicação por plantas cianogênicas seja uma das poucas intoxicações que tem tratamento específico,

com recuperação imediata, na maioria das vezes os animais acometidos são encontrados mortos, dado a rapidez com que

ocorre a morte. Assim, a prevenção é a medida mais eficaz de se evitar perdas econômicas, já que muitas plantas

cianogênicas são utilizadas na alimentação animal.

Essa prevenção de intoxicação por plantas cianogênicas pode ser feita realizando-se o teste do picrato, para a

identificação de plantas que possam colocar em risco a saúde dos animais, da moagem ou secagem das plantas que

apresentarem níveis altos de cianeto e da exposição prévia dos animais a referido tipo de planta para induzir a produção

da enzima rodanase, que transforma o cianeto em tiocianato, aumentando a tolerância do animal à alimentação

oferecida.

Quanto à técnica de coleta de amostras para avaliação de micotoxinas, pode-se concluir que é eficiente para o fim

ao qual se destina, pois, como visto, o método permite que uma amostragem seja coletada e analisada de modo mais fiel

à condição real.

6. BIBLIOGRAFIA

AMORIM, S. L.; MEDEIROS, R. M. T.; RIETCORREA F. Intoxicações por Plantas Cianogênicas no Brasil. Ciência Animal,

16(1):17-26, 2006.

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FIREMAN, A. Micotoxinas - A Importância do Gerenciamento, dos Métodos Diagnósticos Corretos e da Escolha do

Produto Certo Para Evitar seus Efeitos Deletérios Sobre a Produção Animal. In

http://www.avisite.com.br/cet/default.asp, acessado em 20 de novembro de 2010.

SPINOSA, H.S.; GÓRNIAK, S.L.; PALERMO-NETO, J. Toxicologia Aplicada à Medicina Veterinária. Barueri: Manole, 2008.

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