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2010/ 2011

01 de Março de 2011

Preparação e Propriedades de Soluções Tampão

Alunas:

Andreia Sousa

n.º 40261

Alexandra Salvado

n.º 40267

Bioquímica I

1.º Ano - 2.º Semestre

2 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão


1. Apresentação, Tratamento e Discussão

de Resultados

1.1.Estudo da influência do pH na capacidade de uma solução

tampão

Cálculos:

pH

Fracção molar

H2PO4-

Fracção molar HPO4

-

Volume KH2PO4 0,1 M (mL)

Volume K2HPO4 0,1 M (mL)

pHi

c

pHiexp

pHf

c

pHfexp

∆pHc

∆pHexp

5.9 0.910 0.091 9.10 0.91 5.89 5.76 5.52 5.59 -0.37 -0.17

6.3 0.794 0.206 7.94 2.06 6.31 6.15 6.16 6.04 -0.15 -0.11

6.7 0.606 0.394 6.06 3.94 6.70 6.52 6.61 6.42 -0.09 -0.10

6.9 0.495 0.505 4.95 5.05 6.90 6.73 6.81 6.65 -0.09 -0.08

7.1 0.382 0.619 3.82 6.19 7.10 6.88 7.01 6.79 -0.09 -0.09

7.5 0.197 0.800 1.97 8.03 7.49 7.28 7.37 7.13 -0.12 -0.15

7.9 0.089 0.911 0.89 9.11 7.90 7.62 7.68 7.43 -0.22 -0.19

Quadro 1. Estudo do efeito do pH na capacidade de uma solução tampão de fosfatos

0.1M.



Concentrações

Fracção Molar

Volumes

Volume K2HPO4 Volume KH2PO4

pH inicial (pHic)

H2PO4-

HPO42- + H+

Ci cf

pH = 5.9



pH final (pHfc)

H2PO4-

HPO42- + H+

Ci cf

pHc

Concentrações

Fracção Molar

Volumes


pH inicial (pHic)

pHic = 6,31

pH

pH = 6,3

pH final (pHfc)

pHfc =6,16



Concentrações

Fracção Molar

Volumes


pH inicial (pHic)

pHic = 6,7

pH

Concentrações

Fracção Molar

Volumes


pH inicial (pHic)

pHic = 6,9

pH

pH = 6,7

pH final (pHfc)

pHfc =6,61

pH = 6,9

pH final (pHfc)

pHfc =6,81



Concentrações

Fracção Molar

Volumes


pH inicial (pHic)

pHic = 7,10

pH

Concentrações

Fracção Molar

Volumes


pH inicial (pHic)

pHic = 7,49

pH

pH final (pHfc)

pHfc =7,01

pH = 7,1

pH = 7,5

pH final (pHfc)

pHfc =7,37



Concentrações

Fracção Molar

Volumes


pH inicial (pHic)

pHic = 7,90

pH

pH = 7,9

pH final (pHfc)

pHfc =7,68



5,5

5,6

5,7

5,8

5,9

6

6,1

6,2

6,3

6,4

6,5

6,6

6,7

6,8

6,9

7

7,1

7,2

7,3

7,4

7,5

7,6

7,7

7,8

7,9

5,76 6,15 6,52 6,73 6,88 7,28 7,62

pH

Fracção molar de HPO42-

pHic e pHi

exp versus fracção molar de HPO42-

pH inicial calculado

pH inicial experimental

Gráfico 1. Gráfico que representa pHic versus fracção molar de HPO2-

4 (pontos unidos por uma linha a cheio) e pHi

exp versus fracção molar de HPO2-4 (pontos individuais). Ambos os conjuntos

de pontos são para o intervalo de valores de pH entre 5.9 e 7.9.

Os valores de pH experimentais foram em todos os casos mais baixos que o pH

calculado. Pode-se então concluir que ocorreram erros na medição dos volumes –

foram medidos volumes menores do que o devido. Tendo em conta que o erro ocorrido

manteve-se “constante” em todas as medições - a diferença entre o pH experimental e

o pH calculado é idêntica em todas – é possível considerar que a escolha do material

para a medição pode não ter sido a mais apropriada (devido ao erro associado ao

material - dever-se-ia ter optado por um material cujo erro associado fosse o menor).



pHfc pHf

exp

5.52 5.59

6.16 6.04

6.61 6.42

6.81 6.65

7.01 6.79

7.37 7.13

7.68 7.43

Gráfico 2 Gráfico que representa pH final calculado e pH final experimental versus pH inicial calculado.

Após a adição de 0,1 mL de HCl registaram-se os valores

finais do pH. Através do Quadro 2 é possível observar que houve

alguma discrepância entre os valores de pH calculados e

experimentais. No entanto, como foi referido anteriormente, os

erros na medição mantiveram-se e por isso, no final, a variação

de pH experimental, na maioria dos casos, foi aproximadamente

igual à calculada, como se pode comprovar no gráfico abaixo

(Gráfico 2).

Numa solução tampão o ácido e a sua base conjugada encontram-se em

equilíbrio. Quando se adiciona pequenas quantidades de ácido ou base a variação de

pH é quase insignificante.

O valor de pH para o qual se considera efectivo um sistema tampão é o valor

que tiver menos variação de pH, ou seja, é o valor para o qual o ácido e a sua base

0

0,03

0,06

0,09

0,12

0,15

0,18

0,21

0,24

0,27

0,3

0,33

0,36

0,39

5,89 6,31 6,7 6,9 7,1 7,49 7,9

|Δp

H|

pHic

ΔpH experimental e ΔpH calculado versus pHc

i

Δ pH final calculado

Δ pH final experimental

Quadro 2 Quadro com os valores de pH finais, calculados e experimentais.



conjugada têm a mesma concentração, já que é quando reagem e neutralizam de igual

modo tanto as bases como os ácidos adicionados, respectivamente. Através da

equação de Henderson-Hasselbalch concluímos então que a capacidade tamponante é

máxima quando o pH é igual ao pKa.

Pode-se comprovar o que foi dito anteriormente no gráfico, pois quando o pH é

mais perto de 6.89 (que é o valor de pKa) a variação que ocorreu por se adicionar HCl

foi muito mais pequena do que para os outros valores de pH, tanto para a esquerda

como para a direita do gráfico – quanto mais longe o valor de pH estiver do de pKa

mais efeito tem o HCl, pois mais variação ocorre. Logo, existe uma menor capacidade

tampão do sistema.

1.2.Preparação de uma solução tampão de fosfatos por diferentes

métodos

Quando se preparam soluções tampão o pH nem sempre é o que se esperava.

A razão para tal é que o pH é medido em relação à actividade do par ácido-base e não

pela concentração do ácido ou da base conjugada. Assim, quando queremos preparar

uma solução com um pH exacto muitas das vezes é necessário acertá-lo gota a gota.

No caso dos cálculos do grupo 4, que foi o que os operadores realizaram, o volume de

NaOH igual a 13,42 mL não resultou no valor de pH esperado (7,2), visto que

ultrapassou esse valor (7,4). Não se pôde adicionar HCl para fazer descer o pH porque

iria reagir com o NaOH o que, numa solução tampão não é permitido, visto que não é

suposto os reagentes reagirem. Então a solução é repetir o procedimento e adicionar

menos quantidade volúmica de NaOH. Experimentou-se, então, realizar esta parte do

procedimento com um volume de 12 mL e pH também ainda não era o esperado, mas

como não o ultrapassava foi-se adicionando, gota-gota, NaOH até perfazer o pH de

7,2. Para agitar melhor a solução e para se observar o efeito do aumento do pH mais

rapidamente utilizou-se uma barra magnética.



Grupo 1

Método 1 – Toda a molaridade provém do ácido.

A relação entre a concentração do ácido e da base é igual para todos.

pH tampão fosfatos 0,05 M

Método 2 – Toda a molaridade provém da base conjugada




Grupo 2


[





[


Grupo 3


[





[


Grupo 4


[





[




1.3. Estudo da influência da molaridade na capacidade de uma

solução tampão

Quadro 3 Estudo do efeito da molaridade na capacidade de uma solução tampão de fosfatos (pH7,2) – registo dos resultados calculados e experimentais.

Solução pHic pHi

exp pH f*c pHf*exp pHc pHexp

Tampão de Fosfatos (pH = 7,2) 0,05M

7,2 7,19 7,01 6,87 -0,19 -0,32

Tampão de Fosfatos (pH = 7,2) 0,10 M

7,2 7,26 7,18 7,05 -0,02 -0,21


7,2 7,27 7,2 7,13 0 -0,14


7,2 7,21 7,20 7,15 0 -0,06

Na apresentação desta tabela é de salientar que não se mediu o pH da água

destilada devido à falta de tempo com que nos deparámos. No entanto, teoricamente

sabemos que o pH da água destilada deveria ser 7, mas experimentalmente o pH

deveria ser um pouco mais baixo devido ao seu contacto com o ar (que contem CO2),

pois ocorre a reacção: H2O + CO2 H2CO3. Ao adicionar HCl o pH deveria descer

ainda mais, o que causaria uma variação de pH negativa (sendo a maior variação de

todos os casos, já que não é uma solução tampão) tanto teórica como

experimentalmente.



Gráfico 3 Gráfico que representa pH final calculado e pH final experimental versus molaridade da solução tampão.

Nos restantes casos, soluções tampão, a variação de pH variou com diferentes

concentrações de fosfatos. Ao adicionar HCl, foram adicionados iões H+ à solução que

contribuíram para o gasto da base conjugada e para a formação de ácido, fazendo o

pH descer ligeiramente.

Através da análise do quadro e do gráfico acima representados (Quadro 3,Gráfico

3, respectivamente) pode-se concluir que quanto maior a concentração de fosfatos,

mais pequena é a variação de pH. Assim, podemos dizer que a molaridade tem

consequências na capacidade tampão: quanto maior a molaridade da solução, maior a

capacidade tampão. Isto deve-se ao facto de quando a molaridade é maior o número

de moles em solução também é maior – haverá maior o número de iões que

neutralizam o ácido e consequentemente haverá menor variação de pH.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

0,22

0,24

0,26

0,28

0,3

0,32

0,34

0,05 0,1 0,15 0,2

|Vari

ação

de p

H|

Molaridade da Solução tampão

ΔpH experimental e ΔpH calculado versus molaridade da solução tampão

Δ pHc

Δ pHexp



1.4. Estudo da influência da temperatura no valor de pH de uma

solução tampão

Quadro 4 Estudo do efeito da temperatura no valor de pH de uma solução tampão – registo de resultados.

Solução Tampão

Condições Usadas

Temperatura (ºC)

pHexp

Tampão de

Fosfatos (pH 7,2)

0,1 M

1 – Gelo

2 7,29

2- Temperatura Ambiente

20 7,19

3 – Banho Termostatizado

37 7,17

Como é visível no quadro acima apresentado (Quadro 4) o valor de pH aumenta

com a diminuição de temperatura. Como referido anteriormente, o pH é medido em

relação à actividade do par ácido-base por isso, com o aumento da temperatura, a

actividade dos iões H+ aumenta e consequentemente o pH ( ) diminui.

Quando a temperatura diminui a actividade dos iões H+ diminui e portanto o pH

aumenta. Nesta actividade laboratorial, por falta de tempo, as soluções 1 e 3 só

estiveram colocadas no gelo e em banho de água, respectivamente, durante cerca de

15 minutos e não os 30 minutos devidos, também não foi possível realizar o

procedimento com o Tris-HCl.

2. Bibliografia

Simões, José A. Martinho, Guia do laboratório de Química e Bioquímica, 2ª

edição, Lidel, Lisboa, 2008;

Voet, D. e Voet, J.G. (1995) Biochemistry, 2ª ed., John Wiley & Sons: New York,

pp. 56-62 & 105-119.



3. Questionário

3.1. Quais são os critérios gerais mais importantes a considerar na escolha de uma solução

tampão a ser usada em experiencias bioquímicas? Justifique sucintamente.

A escolha de uma solução tampão deve ser feita em relação aos seguintes

critérios: o intervalo de pH que se vai estudar; deve ser impermeável relativamente às

membranas celulares (muito solúvel em água e pouco solúvel noutros solventes); não

deve interferir nos processos biológicos; não deve absorver radiação visível ou UV; não

deve formar compostos insolúveis (precipitação); de ter uma contribuição mínima para

a composição iónica (força iónica do meio influencia processos biológicos); a influência

da temperatura na alteração do pH deve ser limitada e o pKa deve distar pouco do pH.

3.2 Muitos protocolos de purificação de proteínas requerem que todos os procedimentos

sejam realizados a 4ºC para se minimizar a inactivação das proteínas. No caso de se

trabalhar com uma proteína muito sensível ao valor de pH do meio, a preparação das

soluções tampão e o acerto final do seu valor de pH são realizadas numa câmara

frigorífica. Justifique o procedimento anterior.

Como foi provado nesta actividade laboratorial, a temperatura afecta o valor de

pH logo, se se está a trabalhar com uma enzima que é muito sensível ao pH, deve-se

preparar a solução tampão nas condições em que a proteína está activa, para quando

a solução estiver em contacto com ela não sofrer (ou sofrer poucas) alterações e a

proteína não ser desactivada/desnaturada.

Assim, como a proteína está activa aos 4ºC prepara-se a solução tampão num

frigorífico à mesma temperatura para evitar mudanças no valor de pH e a inactivação

da mesma.

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