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Tesis de Posgrado

Regulación de la eritropoyesis enRegulación de la eritropoyesis enroedores con policitemia inducidaroedores con policitemia inducida

por hipertransfusión o porpor hipertransfusión o porexposición crónica a hipobariaexposición crónica a hipobaria

Bozzini, Carlos E.J.

1991

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires

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Cita tipo APA:Bozzini, Carlos E.J.. (1991). Regulación de la eritropoyesis en roedores con policitemia inducidapor hipertransfusión o por exposición crónica a hipobaria. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2432_Bozzini.pdf

Cita tipo Chicago:Bozzini, Carlos E.J.. "Regulación de la eritropoyesis en roedores con policitemia inducida porhipertransfusión o por exposición crónica a hipobaria". Tesis de Doctor. Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1991.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2432_Bozzini.pdf

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FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

REGULACION DE LA ERITROPOYESISEN ROEDORES CONPOLICITEMIA INDUCIDA POR HIPER TRANSFUSION O POREXPOSICION CRONICA A HIPOBARIA

Autor: Carlos E. J. Bozzini

Director Dr. Jorge Affanni

Lugar de trabajo Cátedra de Fisiología,Facultad de Odontología, 76:5; 5'

Umversrdadde BuenosAires ¿kw

712

Tesis presentada para optar al título de Doctor en Ciencias Biológicas

1991

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CAPITULO I z CONCEPTOS ACTUALES SOBRE EL MECANISMO DEREGULACION DE LA ERITROPOYESIS

Los reticulocitos sanguíneos v los eritrocitosmaduros forman un óroano. llamado "eritrón circulante" o"masa roja circulante" (MRC), que contribuye en oranmedida al transporte de Híqeno y de dióxido de carbonodentro del compartimiento sanguíneo. El primero es uneritrocito joven oue todavía contiene una oequefia cantidadde mRNAdurante un lapso aproximado de 24 horas. Es, porlo tanto. una celula capa: de sintetizar hemoolobina (l).

Las celulas constituventes de la MMCposeen dosimportantes características: 1) vida media limitada i120días en el humano, 60 días en la rata), y 2) incapacidadde auto_renovación. Autovrenovación es la capacidad deejecutar una intensa actividad proliferativa mediantemitosis sin que se observen cambios aparentes en laspropiedades de las celulas.l permitiendo asi elmantenimiento del tamaño de las poblaciones celularesfrente a las fuerzas de diferenciación y senescencia quetienden a disminuirlo.

Por lo tanto. alrededor del 1% (o 20 m1) de la WRCdesaparece cada dia de la sangre humanapor senescenvia.Para que se mantenga una masa eritrocitaria estable en lacirculación. las celulas que se pierden deben serreemplazadas a una velocidad semejante a la de sudesaparición. acción que ocurre a traves de un procesocontinuo llamado “eritropoyesis”. Esta constituye. por lotanto, el proceso vital durante el cual se formaneritrocitos funcionales (eritropoyesis efectiva) o nofuncionales (eritropoyesis inefectiva) v en la que ocurrenmecanismosde diferenciación (modificación de la'expresiónoenetica), de maduración (cambioscuantitativos iniciadosen un proceso de diferenciación y que determinan unaestructura poblacional en edades), de proliferación v deamplificación (nue implican aumento del tamaño de lapoblación durante la maduración).

Durante la vida postnatal, la eritropoyesis ocurre enla cavidad medular del esqueleto. En el ratón, la cavidadmedulares insuficiente para alojar al eritrón fijo, porlo que este se ubica también en el bazo (2). Las celulaseritropoveticas o orecursoras forman alli una poblacióntransitoria. unidireccional v suicida. con una estructuraen edades. en la que ocurren fenómenos simultáneos demaduración v amplificación. Cada célula precursora inicial(oroeritroblasto o pronormoblasto) realiza cuatro mitosisdurante su proceso madurativo, durante el cual ocurre unincremento progresivo del contenido celular dehemoolobina. Estas etapas de amplificación v maduracióndan luoar a la estructura en edades, representada por losdiversos eritroblastos con sus caracteristicastintoriales. Apartir de cada proeritroblasto se producen16 celulas: el oroeritroblasto y su progenie forman una"unidad eritropoyetica". La progenie pierde entonces elnucleo y se transforma en 16 reticulocitos. que ingresancomo tales al torrente circulatorio. Lo expuesto hastaaqui en lo relacionado con la participación de la MRC enel aporte de oxïoeno a los tejidos y el concepto de unidad

eritropovética son mostrados en forma esquematica en lasfiguras 1 y 2.

maduraciónsujeto a

El mecanismo de amplificación v decaracterístico de la eritropoyesis estamodificaciones:

a) bajo el stress de la hipoxia o la anemia, se forma unnúmero mayor de unidades eritropoyéticas. El tiempo demaduración eritroblastica se acorta ligeramente y seobserva una liberación mas temprana de eritrocitos haciala sangre. Comoconsecuencia, la producción medular deeritrocitos aumenta (3 . La primera de estas respuestases. con mucho, la mas importante v, como se vera masadelante. sujeta a regulación humoral:

h) por el contrario. la hiperoxia o la policitemia post"transfusional o post-hipóxica deprimen la eritropoyesismediante un mecanismo que involucra la disminución delnúmero de unidades eritroooyéticas generadas. Laproducción medular de eritrocitos, por lo tanto.disminuve (4).

Las celulas eritropoyeticas o precursoras (que formanlas unidades eritropovéticas) normalmente no circulan.constituvendo así el "eritrón fijo". Estas celulas no sonauto_renovables. por lo que desaparecen continuamente alser transformadas por el proceso madurativo eneritrocitos. Otro tipo celular, 1a "celula orogenitoraeritrocítica” (ERC = ervthropoietinwresponsive cell)ingresa al eritrón fijo comoproeritroblasto mediante unevento de diferenciación que se encuentra bajo controlhormonal por la "eritropoyetina" (EPÜ). La ERC. a su vez,tampoco es autonrenovable, por lo que su generación ocurremediante diferenciación y maduración de células basales(stem cells) que poseen enorme capacidad de auto"renovación, que duran durante toda la vida del animal vson capaces de producir, a través de una primera etapa dediferenciación posiblemente controlada por factores decrecimiento deriVados de linfocitos v macrófaoos, variaslíneas de celulas proaenitoras. Unacelula progenitora esun miembro de una población en transito. capaz deproliferación pero no de auto-renovación. que presenta unaestructura en edades debido a un proceso de maduración.Las celulas progenitoras poseen una capacidad restringidade diferenciación, que puede traducirse en el desarrollode una o a lo sumodos lineas de diferenciación.

La ERC es. por lo expuesto. una celula que sediferencia a oroeritroblasto bajo la influencia de EPÜ,laque actuaria de—reorimiendoparte del genomio, originandoasi la última etapa de diferenciación que une a una celulabasal hematopovetica con el proeritroblasto. Esta célula.s. por lo tanto. una celula EFG-sensible por poseerreceptores para 1a misma (5). La acción principal de lahormona es, en consecuencia, controlar el número deunidades eritropoveticas nue desarrollan en el eritrónfijo mediante control de la diferenciación de la poblaciónde ERC.

En condiciones fisiológicas, la MRCes mantenida

dentro de un tamafio óptimo para el transporte de oxigenomediante ajustes apropiados en la magnitud de laeritropoyesis. Los primeros estudios sobre la forma en nueestos ajustes son realizados fueron efectuados baiocondiciones de baja presion atmosférica (hipobaria.hipoxia hipobarica o hipoxica). Ellos permitieron alcanzarla conclusión de oue una disminución de la 002 arterialestimula la eritropovesis (ó). Sin embargo. laeritropovesis es también estimulada por anemia. a pesar dela normalidad de la apÜ2 (7). Estas observaciones puedenser reronciliadas por la hipótesis que supone que la DU?tisular. determinada por el balance entre la oferta deoxíoeno per la sangre y su demandapor los tejidos. es laque reoula la producción de eritrocitos. mas nue la apÜZper se (9).

La coneuión entre la 002 tisular v la eritropovesisesta representada por EPD. La hormona. por un lado, y eloxineno unido a la hemoglobina, por el otro. actúan comomediadores en un circuito de retroalimentación nuemantiene el volumen de la MRCen su nivel óptimo. Estemecanismo. en breve. determina que el riñón, mediante unsensor de oxioeno, modula la secreción de EPUque. a suven. ajusta la tasa eritropoyética v asi el numero decelulas transportadoras de oxigeno en la circulación(Fioura 3). Aunque este simple Circuito deretroalimentación puede ser complicado. su estructurahasi:a ha permanecido inalterable con el tiempo.

El rol de la NRCen el transporte de oxioeno desdelos pulmones hacia los tejidos es evidente. Sin embargo.otros componentes fisiolooicos deben también operar enForma altamente integrada para asegurar la provisión de unaporte de oxigeno a los tejidos adecuado. La pÜEtisulares e] producto entre el volumenminuto circulatorio, 1aconcentracion de hemoglobina_v la saturación de oxigeno dela hemoolobina (Sat 02). Ademas. la distribucion del fluiosanouíneo a tejidos individuales y desplazamientos de lacurva de disociación de la hemoglobina pueden operar paraajustar el aporte de oxigeno, especialmente cuando aumentala demandatisular del gas. Cada uno de los principalescomponentes puede ser modificado por las necesidades deoxioeno. Un incremento general del metabolismo tisularestimula al volumenminuto circulatorio. 1a ventilaciónpulmonar y. por su influencia sobre el pH. desplaza lacurva de disociación para liberar mas oxioeno a losteiidos. La reduccion sostenida de la 002 tisular no soloestimula la eritropovesis mediante EPÜ. sino pue aumentala ventilación alveolar minuto v la produccionintraeritrocítica de 2.3”DPG.que disminuye la a{inidad dela hemoglobina por el oxioeno.

En años recientes. la clonación del oene oue codiiicapara EPÜ en el hombre v el raton v la subsiguienteproduccion de EPÜ mediante la metodologia del DNArecombinante (rHumEPÜ)ha posibilitado a los fisiólooos eldesarrollo de nuevas tecnicas experimentales y a losclinicos la utilizacion de un aoente terapeutico muveficaz (9). ‘

BIOLOGIA DE LA ERITRÜPDYETINA

Varias observaciones efectuadas a comienzo del SigloXX llevaron a la hipótesis de que un servomecanismohumnral estaba involucrado en el control de laeritropovesis. Pero recién a mediados del Biolo, variosinvestigadores demostraron directamente la existencia detal "factor eritropoyético" (b. 7, 10. ll).Específicamente. se demostro que la .xposicion acondiciones de hipoxia hioóxica de un miembro de ratasnarabioticas resultaba en incremento de la eritroooyesisen el otro miembro normal y que 1a invección de grandesvolumenes de plasma obtenido de animales anemicos aanimales normales era capaz de incrementar laconcentracion de reticulocitos en sanore .o laincorporacion de Fe59 al eritron. El {actor humoral fuedenominado"eritropoyetina", el que no parecia afectar laproducción de leucocitos v de plaquetas. Du'ante los 30años siguientes, la bioquímica v la fisiología de EPDhansido estudiadas intensamente (12, 13 . Esta ahora bienestablecido que EPÜ es una alucooroteina oroducidaprincioalmente por el riñón. que constituye el factorprincinal que inicia v regula la produccion de eritrocitosen los vertebrados. Además. el gene para EPÜ ha sidoclonado (9. 14. 15), siendo 1a hormona recombinantedisoonible ahora en cantidad suiiciente para lainvestigación clinica v de laboratorio. Esto ha permitidoun mejor conocimiento de varios aspectos de la biologia dela EPÜv su uso como agente terapeutico en humanos.

A) PURIFICACION Y QUIMICA DE LA ERITRDPÜYETINA

La ouriïicación de EPÜdemostró ser Htremadamentedificil 'dado oue cantidades muy pequefias (oicooramos)estan nresentes en suero u orina. E1 trabajo inicial fuerealizado utilizando plasma de ovejas anemicas v lueqo deuna laroa secuencia de procedimientos se logró unapreparación con una potencia de 8250 U/mo de proteína(lo). Sin embargo. el recobramiento fue solo del 0.4 Z. Laorina de pacientes anémicos demostro ser una fuente dehormona con menor cantidad de oroteína contaminante (17).La metodologia desarrollada para purificar la EPÜ deolasma ovino fue aplicada a las preparaciones urinariashumanas, loqrandose un material con una potencia de 70400U/mg de proteina (9). Este material contenia 30 Z deolúcidos. consistente en 11 Z de acido sialico. 11 Z deheunsas totales v B Z de N-acetilglucosamina: mostro unabanda única en SDSnelectroforesis en del de poliacrilamidav un meso molecular estimado de 34.000 daltons (18. 19).Se hiso oronto evidente que los residuos de acido sialiroeran necesarios para la actividad biolooica in vivo perono para la actividad completa in vitro (20). La formaasialidada de la hormona, comoocurre con muchas otrasqlucooroteinas, era rapidamente removida por el hígadodebido a la interacción de los residuos de qalactosa ahoraexpuestos y el hepatocito. La oxidación de estos residuos.o la administración simultanea de asialonorosomucoide. eracana: de reconstituir 1a actividad in vivo de 1a EPÜasialidada 21).

La principal dificultad para preparar grandescantidades de hormona pura pudo ser superada cuando fueposible la clonación del gene para EPÜy su expresion encelulas de ovario de hamster (celulas CHÜ)(9. 14, 15) o encelulas de rifion de hamster (células HHK)(22). El oene,oue aparece comocooia única, esta formado por cuatrointrones v cinco exones. Su producto incluve una secuencialeader hidrofóbica de 27 aminoácidos que es separadadurante la secreción hormonal y que esta unida al extremoNmterminal de la hormona activa. Esta última se mensoinicialmente que estaba formada por 166 aminoácidos con unpeso molecular excluyendo los glúcidos de 18.398 daltons(23). Sin embaroo. la evidencia reciente indica due tantola proteina recombinante como la hormona natu'al hanoerdido la arqinina carboxi-terminal (Aro 166)preestablecida a partir de la estructura del oene (E4).Esta EPÜ truncada. que se piensa es el resultado de unoroceso post_translacional debido a una carboxineptidasaintracelular. posee una actividad especifica de ÉOÜ.ÚÚÚU/mn de ornteína v muy posiblemente represente la {nrmafisiológicamente activa de la hormona. Comola natural‘ larecombinante esta muyolicosilada. El peso molecular dn lahormona olicosilada es de 29.900 daltons (9) con unaactividad especifica de 120.000 U/mgde hormona. siendo laestructura olucidica indistinguible de la EPÜ urinariasalvo por una pequeña diterencia en la sialidacion (9.25). Por el otro lado. la hormona recombinante obtenida enEscherichia coli no contiene olúcidos. Esta EPÜderivadade bacterias, al ioual que la EPOnatural nue. ha sidodeolicosilada enzimáticamente, ha perdido qran parte de suactividad in vivo, aunque su actividad in vitro estaconservada. El mecanismo de este fenomeno es incierto oeroprobablemente diferente de la captación hepática vaseñalada.

B) ENSAYO DE ERITRDPÜYETINA

Varios metodos han sido utilizados nara determinar laactividad biolooica de EPÜ. En condiciones adecuadas. lamayoria de ellos son capaces de detectar la nresencia dela hormonaen forma cuantitativa. lo que ha posibilitadoel control de los procesos de purificación de la hormona.En General. los metodos o ensayos pueden ser clasiiicadosen dos amplios gruoos metodológicos, a saber bioensavos einmunoensavos. El primero puede ser dividido en ensayos invivo e in vitro. El ensayo in vivo utiliza animales(Generalmente ratones) en los cuales la secreción de EPUes disminuida mediante policitemia inducida portransfusión o por exposición previa a hioobaria. EPÜo lasustancia cuva actividad eritropovetica deseadeterminarse. es entonces inyectada. cuantificándose elporcentaje de una dosis trazadora de Fefi? incorporado aleritrón en respuesta a la misma (26). Los ensavos in vitrose basan usualmente en la cuantificación de un e{ectoeritropovetico en celulas hemopoyéticas en cultivo. ¡"aracultivos compuestos por una mezcla de oroqenies. el efectomedido debe .ser esoecifico para las células eritroides.como son la incorporacion de FeS? al hem (27. 28) o laenumeración de colonias eritroides (29). ñdemas. puedeutilizarse un efecto menosespecífico. comoel incrementode la síntesis de DNA. en una poblacion {ormada por un

alto porcentaje de celulas eritroides (30). losinmunoensavos pueden ser también divididos en dos orupns,aquellos realizados con una cantidad limitada deanticuerpo (radioinmunoensavo o RIE) v aquellos realixadoscon exceso de anticuerpo (ELISA). Un RIE requiere de unantioeno trazador altamente purificado que no es alteradoinmunológicamente por el proceso de marcación, mientrasque FLISA requiere relativamente grandes cantidades deanticuerpo muyespecifico.

Todos estos metodos presentan ventajas v desventajas.El ensavo en raton policitemico detecta solo hormonabiolooicamente activa. mostrando una respuesta en un ranoode hasta 4D veces (26). Sin embargo. no es losuiicientemente sensible comopara medir la concentracionde la hormona en suero de individuos normales. Ademas. elensavo es diiicultoso, caro y sujeto a resultadosoositivos falsos orioinados en otros agentes estimulantesde la eritropovesis. como son androoenos. cobalto.prostaglandinas v agentes que causan hemolisis. einembaroo. utilizando controles apropiados. es confiable vrenrnducible. convirtiendose en el patrón de referencianara otros ensavos nuevos v para procesos industriales deorenaración de EPÜrecombinante. Los bioensavos in vitroson Generalmente mas sensibles, mas ranidos y mas facilesde realizar que el precedente. Sin embargo. detectanasialowEPÜ. que es inactiva in vivo. siendoparticularmente sensibles a efectos de matriz debido a lapresencia en las muestras a ser ensavadas de sustanciasajenas a EPÜ. comotimidina no radioactiva. endotoninas vCiertas nroteasas (31).

Los inmunoensavospresentan varias caracteristicasatractivas. Gon lo suficientemente sensibles como paramedir los niveles de EPO en sueros normales. siendorelativamente sencillos comopara realizar determinacionesen un oran número de muestras al mismo tiempo. Usando ertetipo de ensavo. varios orupos de investioadores hanencontrado nue el nivel de EPÜen el suero normal seencuentra entre JÜ v 30 mU/ml (32. 33. 34). Ademas. se hademostrado due la hormona recombinante es virtualmenteidentica a la EPÜurinaria humana cuando es usada comotrazador en el RIE (35. 36). La mayor desventaja de losinmunoensavos esta relacionada con la caoacidad dedeterminar la concentración de proteinas sin considerarsus actividades biológicas. La EFD desialidada ofraomentos de la hormona inactivos o con menor actividadin vivo pueden ser asi detectados v confundidos conhormona biolooicamente activa. Por ejemplo. en losnacientes de insuficiencia renal. los niveles séricos deEPÜ inmunolooicamente detectable (iEPÜ) son a menudomayores que los de la hormona bioactiva (32. 37). Por lotanto. la capacidad de un RIE para aportar informaciónconsistente v clínicamente relevante deberia ser evaluadacuidadosamente en cada caso. En el futuro. oodría Ferposible definir anticuerpos oue fueran relativamenteespecificos para EPÜbiolóoicamente activa (33). lo oueincrementaría el valor clinico de los resultados delensavn.

La unidad standard de medida para EPÜ se basó

orioinalmente en el efecto eritropovético del cobalto(39). La inveccion de cobalto a ratas avunadas induce unincremento dosisudependiente de la eritropovesis idénticoal producido por la EPÜcruda. Con el objeto de obtener unstandard consistente v facilmente obtenible. se definió launidad de EPÜ (Unidad Cobalto) como la que induce unaresnuesta ioual a la que se observa en la rata avunadacuando recibe 5 micromoles de cobalto. Cuando se dispusode EPÜ ovina. un lote de ella {ue considerado comoStandard A. Una unidad del mismo oroducia una respuestaeouivalente a una Unidad Cobalto. Cuandoeste material fueconsumido. {ue reemplazado por una preparación crudalinfilizada de EPÜurinaria, que poseía una actividadespecifica de 1 U/1.48 mode proteina v que fue designadacomoPrimera Preparación Internacional de Referencia (40).En 1971, una segunda preparación urinaria cruda de EPÜ{uecuidadosamente evaluada v se transformó en la SeoundaPreparacion Internacional de Referencia. La UnidadInternacional (UI) nara EFÜes actualmente 0.20 mo de estaSeounda Preparacion, que produce una resourstaGroseramente equivalente a 1 UCo o 1 U Std A (41). Como lasecuencia aminoacidica v la estructura olucidica de la EPDrecombinante es identica o casi idéntica a la de la EPUnatural v como esta esta disponible en {orma Dura encantidad considerable, el logico pensar que esta inrmarecombinante se convierta en el Standard Internacional deReferencia en el futuro inmediato. En realidad. estudiosrecientes efectuados en 26 laboratorios (incluido el luqarde realización de esta Tesis) corresoondientes a 11 oaiseshan determinado la actividad especifica de varios oosihlescandidatos. acordandose desionar como preparacióninternacional a la muestra denominada H en ese estudiocolaborativo dirigido por la ÜMSa traves del Laboratorvof Biological Standards and Control (Inglaterra). Eliniorme de tal estudio aparecera publicado en el futuroinmediato.

C) PRODUCCION DE ERITRDPÜYETINA

En 1957. se observó oue ratas con nefrectnmiabilateral eran incapaces de responder a Flehotomia o -aadministracion de cobalto con un aumento de produccion deEPÜ (42). Ratas con sus Uréteres ligados v quedesarrollaban iguales niveles de uremia que lasnefrectomizadas eran capaces de responder a esos estímulosen forma normal. Resultados similares se encontraron enratones. conejos, monosy perros, En humanos. los nivrlesséricos de EPÜse observan bajos en nacientes anemicos conuremia severa. incrementándose lueoo de un transplanteenitoso (43 . Ademas. fue posible detectar actividaderitronovetica en el líquido de perfusion de riñonesaislados de conejo (44) v en el medio de cultivo decelulas renales (45). flunoue la evidencia oue apoyaba elorioen renal de EPÜera importante. la misma no podía serextraída de riñones normales o de varias Fraccionesrenales.

Para exolicar esta dificultad. iueron propuestas doshipüiesis orincipales. La teoria "eritronénica" establecíaoue el rith. en respuesta a hipoxia‘ producía unasustancia. llamada "eritrooenina". que enzimáticamnnte

convertía a una al{a—olobulina circulante en EPÜ activa(46). mientras que la teoría "proeritronovetina" suoeríaQue los riñones producían una molécula inactiva oue eratransformada por un factor plasmático para producir EPUacti (47). '

La evidencia actual. abrumadora. indica que ninounade estas teorías es correcta y que EPÜ es sinteticndaprincioalmente en el riñon V es secretada como hormonaintacta. Primero. el analisis del qene para EPÜ muestraQue codifica sólo para una secuencia leader de 27aminoácidos que pareciera ser importante para el" proresode secreción hormonal más una estructura hormonal activade lóó aminoácidos (15). Segundo. esta estructurapredecible a oartir de la estructura del Gene de 166aminoácidos excepto para la aroinina terminal (24) serelaciona exactamente con la secuencia de aminoácidosderivada del analisis de la hormona natural. lo quesionifica que ninquna prohormonaes sintetizada. Tercero.aunque el mHNAno es facilmente detectable ni en el riñónni en ningún otro tejido en animales normales. esráoidamente inducido (dentro de 1 hora) en el riñon v enmenor medida en el higado luego de que los animales sonhechos anémicos o hipoxicos (48, 49. 50). Cuarto, aún enanimales extremadamente hipóxicos, ningún otro tejido.incluvendo pulmon, cerebro, músculo esquelético. bazo vGlandulas salivales, se ha visto contiene EPÜWmHNA(HW).Considerado en conjunto, estos resultados aportanimportantes evidencias de que en el animal adulto EPÜ essintetizada principalmente en el riñon v secretada comohormona intacta.

Aunque el riñon constituye el sitio principal deFormación de EPÜ, la producción de la hormona continúadespues de la nefrectomia bilateral en muchas especies.aunoue a un nivel considerablemente reducido. Ratones yratas anefricas retienen el 10 Z de su capacidad orioinalde incrementar la producción de EPÜ en presencia dehipoxia (51. 52). mientras que pacientes anefricos quedesarrollan intensa anemia poseen algo de EPÜ en susplasmas (53. 54). Varias lineas de estudio señalan alhinado como el sitio primario de producción de EPÜextrarenal. La hepatectomía suprime la produccion de EPÜinducida por hipoxia en ratas anefricas (55) pero no enanimales con riñones intactos; en ratas hepatectomieadasnarcialmente. la EPÜextrarenal en respuesta a hiooxia secorrelaciona directamente con la regeneración hepática.siendo mayor durante el periodo de mayor proliferación(56): v EFÜ-mRNApuede ser Hallado en el hígado, aunque enmenor cantidad que en el riñón, en ratones anemizados norflebotomia (49).

Durante la vida fetal. la fuente primaria de EPÜpodria ser también hepática, por lo menos en algunasespecies. Los fetos de oveja responden a anemia con unincremento de la EPÜ serica oue es suprimido porhepatectomia pero no por nefrectomia (57 . Además. EPÜmRNA ha sido hallado en híqado fetal humano (59) v en muvpenuefias cantidades en hioado fetal murino durante lamital del período gestante (59). Por el contrario. no seobservó mRNAen hígado fetal murino durante la gestación

:ardia cuando los fetos eran anemizados. mientras oueI ESUEPÜ. invectada en hembras gestantes. fue transferidaal feto en cantidades aoreciables durante la oorcion mediav final de la oestacion (59). Ademas. la placenta de ratasv ratones es el único tejido no-hematooovético que poseereceptores especificos nara EPÜ(60). Este último hallazgosuoiere oue en el ratón la transferencia placentaria deEPÜmaterna nodria ser una fuente de hormona fetal. Aunquenarece dificil exolicar cómola transierencia olacentarianor si misma podria oroveer cantidades crecientes de EPÜen resouesta al stress de 1a anemia tetal. es nosible dueen condiciones normales los reouerimientos fetales de EYUDuedan ser cubiertos nor la transFerencia olacentaria dehormona materna.

Hasta enocas muv recientes. las celulas renalesresnonsables de la producción de EPÜ no habian sidoidentificadas. aunque estudios indirectos señalaban altubo oroximal comonarticinando en el nroceso (61. 62).Varios exoerimentos que incluían ensavo de EP“ en variasFracciones tisulares. nroducción de EPÜ por lineascelulares derivadas de tejidos renales esoecificos ometodos de inmunofluorescencia dieron resultadosinconsistentes (63. 64). El desarrollo de sondasesnecificas marcadas de RNAv DNApara EPÜmmRNñbrindo unametodolooia noderosa para 1a localización in situ de lanroduccinn de EPÜ. A1 contrario de la hormona. que essecretada v nor lo tanto oodria estar en aoromimacionestrecha a muchosv diferentes timos celulares. el EPU"mHNAdeberia estar solo localieado en aouellas celulasoroductoras de EFG. Mediante esta metodolooia. se encontróEPüamRNAen Fracciones tisulares no olomerulares (50). Hastarde. dos orunos indenendientes ( 5. óó). mediante el usode radioautnorafias. encontraron que una célulaintersticial nerituhular era 1a única celula renal ouecontenía cantidades siqniiicativas de EPUmmRNA.tanto nncondiciones hasales comoluego de la estimulacion de lasintesis de EPÜ nor anemia o hipoxia. Ademas. lainiciacion del mecanismo oara la produccion de EPÜ cncondiciones de stress involucraba nrincioalmente elreclutamiento de celulas adicionales que transcribían EPHWmRNAen vex de estar restringido a1 incremento de laDroducción do EPÜmmRNHnor las celulas identificadasinicialmente (67). El orioen preciso de esta celulaintersticial no ha sido fijado, aunqueoodria reoresentara una celula endotelial capilar (es). Se estimó que el 20m30 Z de 1a nohlacion total de células intersticiales de lacorteza renal interna v menos del 10 Z de célulasintersticiales de la cortes; subcaosular eran caoaces desintetizar EP“. Por lo tanto. la celula productora de EPÜnodria representar un tivo esnecializado de celula dentrodel intersticio cortical más oue un tipo celularoeneralizado. como es la celula endotelial de loscanilares oeritubulares. Ademas, el estimulo hiPÓHiCDuareciera no ser uniforme. alcanzandose el umbral narainiciar la síntesis de EPOen areas focales (óü. 69).

Mientras que la identidad precisa de ‘las celulasnroductoras de EPÜes desconocida. ellas se aorunan enfocos intersticiales advacentes a los tubos nroximales(70). lo que es'a de acuerdo con trabajos de Giulio y col

(61) v de Eckardt y col (71). Trabajos previos nue-señalana los macrofaoos como productores de EPÜ (72) no pudieronser coniirmados (73). mientras que un trabajo recientesobre produccion de EPÜpor células tubulares renalesrealizado con sonda marcada con P32 dió rnsolurinn ombreen los autoradiooramas (74).

El sitio de producción de EPÜen el higado es todaviadesconocido. aunque existen evidencias para las celulas deHunFer y los hepatocitos (75).

Virtualmente. cualquier alteración oue resulte en unadisminución del aporte de HÏQEDDa los tejidos actúa comoestimulo para 1a produccion de EPÜ por el riñón: sinembaroo. la señal precisa y la secuencia de eventosresnonsables de la iniciación v modulación de estanroducción son desconocidos. Los nivel es séricos de EFE}oarecieran no estar involucrados debido a que elnrntratamiento de ratones con altas dosis de EPÜ nobloquea ' la nroduccion renal de mRNñ inducido norF]ebot omía. La ausenci a de un depdisi to anrec i.abl e de [áïF'Ü(75). e] hecho oue EPÜ no sea sintetizada como unnrerursor activahle (23) v la relación proporcionalobservada entre los niveles séricos de EPÜ v ¡aconcentración de EPÜ-mRNAluego del stress hipóxico (77)indican que la secreción renal de EPOes reoulada por elnivel de su sintesis.

El mecanismoexacto nara la translación de 1a hiponiaen el reclutamiento de celulas sintetizadores de EPÜ nstodavia desconocido. La administración de ñMPca 'atonesincrementa la producción de EPÜ v la HRC í78): P051incrementa AMPC v 1a concentracion de EPÜ en riñonesaislados de perro y perfundidos (79). mientras que PGE2incrementa los niveles de EPÜ y la eritronoyesis enratones: la constriccion de la arteria renal incrementaPGE v los niveles de EPÜen perros. mientras que laindometacina. que inhibe la formación de PGE. previene elincremento de EPÜen respuesta a hipoxia (80).

Sobre la base de estos experimentos. muchos de loscuales fueron efectuados in vivo con múltiples variables.se ha propuesto que la hinoHia renal podria resultar nnliberación de PGE. que a su vez podria incrementar el AHPCrenal y. a su vez. la sintesis de EPÜ. AMP:podria actuarcomo reductor de la concentración intracelular de Car+dehidn a que el cobalto, oue estimula la Droducción deFPÜ. es un inhibidor general de los canales de Ca++= lar‘lismim.lr:ión del ("Ja-+4-del medio aumenta la oroducción deEPÜen celulas de carcinoma renal in vitro: y el verapamilv el diltiazen. que bloquean la entrada de Ca++, tambienaumentan la nroduccion de EFG (81). Este mecanismo podriaanlicarse a la misma célula que produce EPÜo a celulasadvacentes que oatillan a la célula productora. Enhumanos,‘ sin embargo, agentes que bloouean la sintesis dePGE v los canales de Ca++ no producen secreción aumentadade [Ef-"U.

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D) SITIO Y MECANISMO DE ACCION DE ERITRÜPDYETINA

EPÜ actúa a nivel de los órganos eritropoyeticospara incrementar selectivamente a la eritropovesis sinalterar en forma significativa la producción de leucocitosv plaquetas. Este efecto involucra la iniciación de ladiferenciación de la progenie eritrocitica a partir de unacelula primitiva, morfológicamente indefinida.Específicamente, la inyección de una dosis única de EPUaratones hipertransfundidos cuvos órganos eritropoyeticosno contienen celulas de la progenie citada resulta en laaparición de proeritroblastos dentro de las 24 horas.mientras que a las 72 horas el oroceso de maduración haalcanzado la etapa de reticulocito (82). Cuando laestimulaciuón con EPÜ es terminada mediante laadministración de anticueroos antiñEPO ó horas despues dela invección hormonal. la onda de maduracióneritropovetica continúa, lo que indica que EFU no esnecesaria para la maduraciónde los eritroblastos.

En 1961 fue desarrollada una tecnica nara ensavo deCFuws (celula formadora de colonia esolenica)(83) la queoodria ser considerada comola celula basal hematopovetica(stem cell). EPÜno actúa directamente sobre CFUWC. sinosobre descendientes de la misma. denominados ERC (PPD‘reshonsive cells)(84).

La caracterización inicial de ERCfue dificultosa porla raeón de ser este compartimiento no identiiicablemoriolóoicamente. Estudios oosteriores fueron favorecidosnor el desarrollo de metodos de cultivo en coagulo deolasma (SS) o metilcelulosa (86). caoaces de Permitir elcrecimiento de colonias eritropoyeticas discretas. Conesta metodolooia, fue posible describir dos principalessubdivisiones de ERCen ratones v humanos: CFU-E (unidadformadnra de colonia eritroide) v HFUmE(unidad formadorade burst eritroide). Pareciera amistir una continuidad decelulas entre la BFU-E (celula cercana al stem rellmultipntencia] = CFUUS)v la CFU-E (celula cercana alnroeritroblasto). Esta estructura en edades.característica de las poblaciones celulares en maduración.se caracteriza por un aumento nrogresivo de celulas enciclo v de un incremento de la sensibilidad a EPÜ. demanera tal nue la CFU"Edepende de EPDpara su crecimientov diferenciación en proeritroblasto.

Esta visión de la ERC. si bien atractiva, es unasimplificación. Existe evidencia de que el efecto comoletode FPÜ involucra interacción de la hormona con oirosfactores de crecimiento asi comocon celulas de rtrolinaje (insulina v somatomedinaC)(87).

Gran cantidad de trabajos exnerimentales (88)suqieren que la estimulación de la sintesis de RNAconstituve el evento clave de 1a acción molecular de EPÜ.la que es seguida por síntesis de DNA. mitosir vmaduración (producción de hemoglobina) en la célulasensible. Todos estos estudios fueron. sin embargo.realizados utilizando hormona y poblaciones celularesimnuras. 10 que abre un interrooante sobre si los camhioscul-ictervaclos fueron inducidos por EF'Ü. Los eventos

.

descriotos deoenden de la interacción de EPÜ conreceptores presentes en las células sensibles. habiéndosedescrioto dos ooblaciones de los mismos. en dependenciacon su afinidad por la hormona.

E) LA RELACION OFERTA/DEMANDA DE ÜXIGENÜ COMO BASE DECONTROL DE LA SECRECIÜN DE ERITROPÜYETINA

E1 modelo descrioto anteriormente sobre laimoortancia de la relación existente entre el aoorte deoxioeno a los tejidos v sus necesidades del nas prediceciertas respuestas que han sido confirmadas 'porinvestigadores y clinicos:

1) Una oxiuenación de los tejidos disminuida. con demandade oxigeno normal. induce aumento de la secreción de EPUvmavor eritrooovesis. Esto se observa en condiciones dehionxia: a) hioóxica (disminución de la DUEde la sanorearterial) oor descenso de la DUE del aire inspirado(altura. hiponresión. mezclas gaseosas con poco oxioeno).nor hipoventilación pulmonar (obstrucción de las viasaereas. alteraciones nulmonares. insuficiente emoansiónnulmonar). nor difusión lenta de oxineno (alteración delendotelio caoilar o alveolar) o nor desajuste entreventilación alveolar v flujo sanguíneo nulmonar): b)anómica (disminución de la capacidad de transoorte deoxïoeno de la sangre arterial) nor hemoqlobina ocupada{intoxicación con CU). hemnolobina ' alteradaimetahemoolobina) o hemoolobina disminuida (anemia): v c)histoióxica (incaoacidad de utilización de oxígeno por lascelulas) nor intoxicación con acido cianhidrico v sussa] es) .

fi) Una oxioenación aumentada con demanda normal de oxioenodetermina disminución de la secreción de EPÜv descenso dela eritropovesis. Esto hecho se comnrueba en laoolicitemia por hipertransfusión (Dor administración deeritrocitos) o postwhioóxica (nor exposición a 002disminuida durante un tiempo y reoreso a 002 normal) o encondiciones de hiperoxia (aumento de oresión atmoslóricaen cámaras hioerbaricas. que determina aumento de -lacantidad de oxigeno transportado mediante disolución ennlasma).

o) Una oxioenación normal con disminución de la demandatisular de ouioeno determinara menor secreción de EPÜ vdescenso de la eritrooovesis. Situaciones de este tino seobservan despues de la hioofisectomia v tiroidectomia vdurante el avuno v la privación de aoua (89, 90. 91).

4) Una omioenación normal con demanda tisular de oxíoenoaumentada inducirá mayor secreción de EPDv aumento de laeritrooovesis. Esto se observa durante la administraciónde hormonas calorioénicas (92) v de anabólicos (93).

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CAPITULO II : OBJETIVOS DE LA PRESENTE INVESTIGACION

El efecto de la policitemia exnerimental sobre elnivel de EPÜcirculante v la eritropoyesis es conocidodesde los trabajos del grupo de Jacobson en Chicago (4).

Como consecuencia de los mismos, el ratón conpolicitemia inducida por hipertransfusión de eritrocitoshomólogos o por exposición crónica continua o discontinnaa hinobaria (en camaras de altura simulada) se convirtioen el animal más aconsejable para ser utilizado en losensavns de la actividad eritropovetica oresentn en plasmade humanos o de animales de experimentación. primero. y dela actividad biológica de EPÜ recombinante humana. masreci entement e (ZZ-Él) .

Desde el momento en que ambos modelos de policitemiaanarerieron en el escenario de la Hematología Eunerimentnlse munusn. sin la evidencia er-zner'imerrtalque lo avalar'a.quu los mismos eran absolutamente similares v que losresultados experimentales obtenidos en uno eranperfectamente comparables ' aplicables al otro"

la existencia de innumerables resultadoscontradictorios entre diferentes laboratorios oneestudiaron los efectos de hormonas en ratonesDolicitemicos en dependencia con el tipo de modeloutilizado, por un lado, y el hallazgo en nuestrolaboratorio (94) de diferencias entre ellos en lorelacionado con la produccion de EPÜ en resnuesta alestímulo hiooxico. nos llevo a emprender este nroyecto deinvestigacion. con el objeto de determinar las similitudesv probables diferencias que existen entre ratones conmolicitemia post-transfusional o post-hipómica en. cuantoal mecanismode regulacion de la eritronovesis se refiere.El hallazgo de diFerencias entre ambos tipos de animalnspoliritemicos obligaría a un renlanteo de lainternretacion de gran cantidad de datos exnerimentalnsobtenidos durante los últimos 30 a nrecisar lautiliración de los mismos como animaleuÉPÜ.

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I REGULACION HUMORAL DE LA ERITROPOYESISA]

entro sisI HASA ROJA CIRCULANTE!

CAPITULO III : MATERIALES Y METODOS

1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÜN

Todos los experimentos fueron realizados en ratonesde 1a cepa CFnl, adultos, de ambos sanos. con la excepciondel realizado nara determinar el efecto de la nefrectomiabilateral, oue se efectuó en ratas hembrasde la cepaNistar. adultas. Los primeros fueron obtenidos de lacolonia mantenida en nuestro laboratorio desde hace 17años. mientras que las ratas fueron adouiridas en elBioterio Central de la Facultad de Ciencias Exacta: vNat ur a1 es UBA.

Los animales ¡ueron alimentados con dieta especialpara roedores (Purina. dieta no. 1) y aoua. AmbosFueronofrecidos ad lihitum. Fueron mantenidos en un hioterio coniluminarión natural v temperatura controlada.

2. CUANTIFICACIÜN DE LA ERITRDPDYESIS

La cuantificación de 1a eritronnyesie {ue realizadamediante la determinacion del porcentaje df una deniatraradora _- (0.2w0.5 uCi) incorporada al eritron endesarrollo (eritroblastos. dondeel metal ee utilizado enla sintesis de hemoglobina) y medida en el eri+rúncirculante (eritrocitos) 48-72 horae despues de e:invecciün endovenosa (95). El metodo se baea en lasaiouientes consideraciones: e] Fefi? invertado en elcompartimiento plasmático sale del mismo paraincorporarse. en parte, a la hemoglobina que esta siendosintetizada en ese momento. la que sera asi “marcada”.Cuandoel rcceso de la eritropovesie termina. al alcaizarla; celulas eritroooyeticas la madurez suficiente naracumplir con sus Funciones en 1a sangre, la hemoglobinamarcada aparece en la circulacion. pudiendo suradicactividad ser fácilmente detectada en una alícuota desanure. La cantidad de hemoglobina marcada curaproporcional al número de celulas sintetizadorea dehemnolohina presentes en el eritrón {iio en el momento dela inveccion del Fe59. cantidad queE a su vez. seraproporcional a 1a dosis de EPÜeuogena inyectada o de EPÜnndónena sintetizada por e] animal.

Para la determinación del porcentaje de incorporacionde Fe59 a1 eritron (ïFeSQ), un ratón recibe 0.2 uCi y unarata 0.5 uCi de Fesqncitrato (CNEA)en ROOul de solucioniaofonica por via endovenosa (venas de la cola).obteniéndose una muestra de sanqre por punción cardiaca,con jeringa heparinizada y bajo anestesia eterna profunda.48m72 horas despues de 1a administracion del isótopo.Übtenida 1a muestra de sangre. se prepara unmicrohematocrito v se determina 1a radioactividad presenteen 0.5 m1 de la misma en un contador de pozo.

El ZFeS? es calculado mediante la aplicación de lasiouiente ecuación:

volemia (ml) x ccm/ml sanore H 1002F959 = ' _—«_

ccm invectadas

Donde:volemia = 5 ml/lüüq de peso corporal en animalesnormocitemicos v 8 ml/IDO g de peso corporal enDelicitemicos (valor determinado mediante dilución deeritrocitos homólogos marcados in vivo con FeS? (96))

3. INDUCCION DE HIPÜXIA HIPÜBARICA

La inducción de hipoxia hipobarica +ue realizada deacuerdo con los lineamientos generales expuestos porHrinht y col (97) mediante mantenimiento de los animalesen camaras de altura simulada (hipobáricas) en las que lapresión interior es mantenida en 456 mb (0,5 atmosfera =380 mmHq), con flujo constante de aire.

Una camara tipo es metalica. posee una capacidad de240 dmï y es mantenida en una habitacion a 22 C. Estaequipada con una bombapara vacío rotativa. que desplazaSÚÜl/min de aire. con un manómetro aneroide o de Hp quereoistra la presion en su interior y con una valvula aresorte que ahre. dejando ingresar aire al interior de lacamara. cuando en el mismo se alcanza la presion deseada.La cámara aloja en su interior 3 jaulas de alambre conbandejas de acero inoxidable con capacidad nara 70 ratonescada una. La capacidad para ratas depende del tamano delas mismas.

4. INDUCCIDN DE POLICITEMIA POR EXPOSICION CRONICA AHIPÜBARIA Ü POR HIPERTRANSFUSIDN

La inducción de policitemia fue realizada mediante laexposicion de ratones o ratas a condiciones de hipobariaen forma cronica y discontinua (animales PH = post"hinoxicos) o mediante transfusión doble de eritrocitoshomólooos (animales HT= hinertransfundidos).

En el primer modelo (PH). la inducción del estadopolicitemico fue realizada mediante estimulacion de lasecreción de EPÜ v de la eritropoyesis. siendo losanimales expuestos a 456 mb durante 18 h/dia. 5 veces porsemana (de lunes a viernes) por 3 semanhs. Este regimenaseoura una exposicion total de 270 horas. iniciándose alas .5 horas del lunes de la semana 1 v finalizando a las9 horas del sabado de la semana 3.

Los ratones ingresan a la camara hipobarica a las15.00 horas de cada dia (con excepcion de sabados vdominoos), siendo retirados de la mismaa las 9.00 horasdel dia siouiente. Este tipo de exposicion recibe elnombre de "discontinua", para oponerse a la "continua". enla que los animales son mantenidos en hipobaria continua.La exposicion discontinua es mas aconsejable due lacnn+ínua. ya que durante esta los animales reducen lainoesta de alimentos y de agua (98), con la censiouiente

pérdida de peso corporal, que no se observa en la primera.

El incremento de la masa eritrocitaria solo esposible si los depósitos de hierro son aceptables parasatisfaúer la enagerada demandadel metal por la aumentadasintesis de hemoglobina. Por lo tanto, cada raton recibeuna invpcción intraoeritoneal de FerraninmLompleH (hierroelemental polimaltosado 1 q. hidrouicobalamina 1.2 mq.acido fólico 2.4 mq/IOÚ m1, HYH Liprandi SHLI)inmediatamente antes de su ingreso al periodo de inducciónde ooliritemia. Además, algunas ootas de suliato Ferrnsoen solución son aoregadas cada dia en el agua de bebidadurante las 3 semanas de exposicion. Este tioo de accionesnormite aseourar que la proporcion de ratones nue alcanzaun valor hematocrito aceotable para los estudios (FSSZ ennl mnmnnto de 1a autopsia) supera el 95 E de] total deanimales que iniciaron la exposicion.

Los valores de hematocrito (40,7 +" 2.6 Z) v de ZFH59(41.3 4" 3.2 Z) de los animales antes de su innreso a larámara de altura aumentan durante la exoosiciún.alcanzando valores de 72,3 +" 4,2 Z v de 65.2 +- 3.1 Zrpsnectivamonte. a1 finalizar la última exnosición.

La inducción de policitemia mediante hipertransfusiúnse efectúa unr medio de dos inyecciones intraperitoneaiessucesivas (separadas por 24 horas) de 0.7 m 0.8 m1 de unasuenensión de eritrocitos homólogos con hematocrito = GOZ.

Esta suspensión es preparada mediante obtención desangre de ratones "donantes" por punción cardiaca conjerinoa heparinizada. En General. son necesarios cuairodonantes para obtener un receptor policitémico. La sannreobtenida es centrífuoada. separandose e] olasma. siendoPntnnc s los Eritrocitos lavados tres veces con soluciónfisioïnoica. fijustado el hematocrito de la suspensióndosnuo, del último lavado. la mismaesta lista nara suadministracion.

Mediante este metodo se obtienen animales con unoradn de oolicitemia similar al obtenido medianteexnnsición a hionbaria. fimbosmétodos diiieren en laausnnria de estimulación de la secreción de [FU v de laeritrnnnvesis para la obtención de la nolicitvmia en elmodulo hioertransFundido. '

5. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE ERITRÜPÜYETINA ENPLASMA MEDIANTE BIDENSAYÜ 0 RADIÜINMUNDENSAYO

la determinación de la concentracion de EVOen olasmamediante bioensavo fue realizada en el modelo del ratónpolicitémico nostwhipóxico (PH)(99).

En el modelo. 1a inducción del estado oolicitemico serealiza mediante estimulación de la eritrnnovesis enresnuesfa al incremento de la secreción de EPÜ. Losanimales son expuestos durante 3 semanas a 546 mb denresiün barnmetrica. a razón de 18 h/dia. 5 veces nor

_., .)semana. en cámaras hipobaricas (ver ¿..

19

semana. en camaras hioobaricas (ver 3.)El Deriodo de condicionamiento de los animales

finali.a a las 9 horas del tercer sabado desde lainiciación del mismo. El olasma cuva actividad deseadeterminarse o oatrones conocidos de EPÜson invectados alas JO h del oromimo miercoles (ao. dia nostmhipoxia) porvia suhcutanea. Una dosis trazadora de FUE? (0.2 uCi) o.invectada por via endovenosa o intraperitoneal a las 10mlhoras del proximo viernes (bo. dia postmhipoxia). Aüwhbhoras nost-inveccion de EPÜ. La determinacion de EF.H? nsreali ada a las ? horas (90. dia nostuhipoxia. Pln'b horasDOFl‘lHVPCCiÓHde Fe59). Üentro de los resultados. sóloson considerados los valores de animales cuvnshumatncritos euneran el 55%en el momentode la autoosia.Es conveniente ountualizar que este metodo mide lfïf_‘)l"lCÏF‘f1'lTr".3CiÓr'lde EFT) biol Cioiczamente activa prevea-into en r7nl asma .

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HL“

La determinacion de la concentración de EPÜ medianteNIE. due dotermina masa de la hormona circulanteindonendientemente de su actividad biolooica. fuerealizada mediante una modificacion del metodo de Garciav col . (¡OC!) .

Foo rocombinante humana (rHumEPÜ) altamentenurificada (}1&0.000 U/mo) Fue obtenida de celulas deriñon de hamster (HHHcells) transfectadas de acuerdo conel método de Powell v col. (101) v puriticada en elLahoratorio do Proteinas de Bio Sidus S.fi. El oroducto {uemarcado con 1125 mediante el metodo de cloraminawT. LarHquPÜ {ue tambíen utilizada como inmunóoeno.obteninndose suero antimEPÜ de conejos- El standard de EPU(Standard WHOo BS 1/90) en diterentes concentraciones olüü ul de olasma Duro o diluido fueron colocados en cadatubo. aoreoándose a los mismos el mismo volumen de sueroantquPU en diferentes diluciones de trahajo. La mezcla{un mantenida a 4 C durante 22 horas antes de la adicjnnde ll?” rHquPÜ. siendo mantenida en las mismascondiciones durante las 24 horas eiouientes. La seoaracinndel antioeno unido del libre fue realizada mediante unseoundo anticuerpo (qammaulobulina anti_conejo). Plasmado 'aton con alto contenido de EPÜ (ver ó.)(?2 U/ml) fueutilizado en ol rango 1-500 mU/mlpara la nreoaracion de'una curva standard. Los resultados Fueron analizadosmediante un oroqrama computadorizado que produce una curvanue nermite el calculo de la concentracion de EPÜ nnmU/ml. El limite minimo de detección es de 3 mU/ml.

ó. PREPARACION DE PLASMA CDN ELEVADA CONCENTRACION DEERITRÜPÜYETINA

Plasma con elevada concentracion de EPÜbioactiva fueohtenido de acuerdo con el método de Tambourin v col.(102). Ratones de ambos sexos recibieron 600 r deradiacion X: 24 h despues. recibieron óü mo/Hqde pesocorooral de fenilhidrazina (agente hemolitico. PHZ) porvia intraoeritoneal. Alrededor de 10 dias mas tarde.cuando el valor hematocrito promedio era de 5.7 +n 0,4 Z,los animales fueron sangrados mediante punción cardiaca.obteniéndose plasma mediante centrifuqacion en frio. La

cnnrentración de EPÜ. medida en el binensavn del ra Ónnestmhinúxicm. fue de 25 U/ml.

7. DETERMINACION DE LA VOLEHIA

La determinación de la volemia. v a partir de eutadel volumen total de eritrocitos circulantes (WRC). fuerhulixada de aruerdo cun nl método de dilución. nunesencialmente mide la dilución de eritrocitos hmmólüone“marcados” in vivo con FeS? (95). For 10 menos 5 diamantee del eneave. ratones "donantes" +uerun invectados cnn7 “Li de Fefi? nor via intraneriteneal. La determinación dela velemia fue efectuada en ratones oxoerimentalnemediante 1a administración de 100 ul de sannre hamúlona"marcada" con radioactivídad conmuida v nasteriordeterminación de la radioactivídad nreeente en 500 u] deeannre obtenida 10 minutos desnues de la adminietración deaquella. El valer de la vulemia en m1 se obti?nedividiendo 1a 'adioactividad invenTada ner Jarndinactjvidad nresente en 1 m1 de sangre. Lamultinlíuación de mete valor ner el hematncritü nermite “lCálrulü :ndirectm de la WRC.

8. DROGAS UTILIZADAS

a. Fritrnnovetinn humana recombinantn. tritronnvetinahumana recnmhinante (rHumEPÜ) altamente nurificada(FÍhÜÚÜÜ U/mn)(HEHflX. Him SiduswElanex) fue utilizadadiluida en VHS r HSA (5 mq/ml). Fue obtenida a nartir deunn línea anular de riñón de hamster (HHH) trans+vctadadmanuerdn con el metndo de inell v col. (lül).

h. Üohalto. Se utilizó C1200.ó H20 obtenido de SIGMA.

u. Dwxametaeena. Se utilizó Decadron Shmck. EU mm/mincedido Dnr Mark. Sharm & Dohme.

d. DL Isonroterennl HCI. adquiridm en SIBHÑ.

p. Proninnatm de testosternna. cedida mer Lahmratorine(:L-¿ulnr-en scmllmídm mlensa.

9. ANALISIS ESTADISTICO

La comnaración de valnres individuales entre un:nrunne fue realizada mediante la Drueha t de Student.Unannn los nrunos fueron tres e más cnn una variableÍHdPHPHdlÉDtP. se efectuú análisis de varianza. Ruanda mehalló relatiün estadísticamente siuniiícativa‘ laGiuniíicacinn estadíetica de las diferenciae entre 1mmvaloren rue analizada mediante el test de Newmanheuls.

21

CAPITULO 4. R E S U L T A D Ü S

Experimento no. 1Efecto de 1a oolicitemia inducida oor transfusión (ratonHT) o por exposición a hioobaria (raton PH) sobre laeritrooovesis

Ratones HT v PH {ueron invectados con Fe en lostiemoos desouns de efectuada la seounda transfusión {HT}ode f 'ina) iz adn el peri odo de exposi ci on a hi pob ari a (F'll)que fiouran en la abcisa de la Fioura 4. La determinaciondel XFoS?fue calculada 48 h desoues de su administración.

la Fioura muestra la declinación secuencial de 3aeritrnnovesis Queocurre en los ratones HTa Dartir de lasenunda transfusión v en los ratones PH a oartir dnlmomento de su retorno a presion barométrica normal. Lafioura también muestra que en ambos modelos. el valor nnZFeSWes menor al 1 Z al CUthD día de la nxneriencia. loque suoiere que ambos métodos de inducción de nnlicitnmiainducen una denresión similar de 1a eritrooovesis.

Experimento no. 2Efecto de la policitemia transfusional o hioóxica sobre laconcentracion plasmática de eritropoyetina

ton el ohieto de determinar la concentracionnlasmática de EPÜen ratones HT v PH, 10 animales de cadaoruoo Fueron sanorados mediante nunción cardiaca duranteel cuarLo dia nostmtransfusion o nostmhinoxia. Ratonnsnormocitemicos fueron considerados controles normales. Laconcentracion de 1a hormona en plasma obtenido mediantecentrifuoación {ue determinada mediante RIE.

Los valores oromedio hallados Fueron los siguientes:a) Controles e 22.5 +- 0,6 (ES) mU/ml: b) HT R 9.a +r 0.5mU/ml v c) PH = 9,3 +u 0.6 mU/ml. La diferencia entre lpsvalores corresnondientes a ambosGrupos policitémicos vlos correspondientes al gruoo normocitemico rssinnificativa no d 0.05). La mismano es sionificativa'cuando los valores correspondientes a ratones HTv PH son

vCÜITII’JI-Rl’FM'JCIS en ’ÏY'G 531 .

Estos resultados demuestran que ambos tioos deooJicitemia inducen descensos sionificativos v similaresHp la concentracion olasmatica de inmunonñpu. Merecedestacarse la observación de una cantidad dosahle de lahormona en la circulación Dese a la detención casi totalde la nritronovesis (exoerimento 1).

Experimento no. 3Respuesta eritropovetica a periodos crecientes deexposición a hipobaria en ratones PH y HT

Tres qruoos de 30 ratones cada uno recibieron dosinvenciones intraoeritoneales de Ü,b. 0.5 o 0.7 m1de unasuenension de eritrocitos homólooos al 80 Z durante dosdins consecuiivos. Dieciocho ratones HT v 18

22

Fe59

'75_

SOL T

45 _

L L30_

15 _

O Üfik-Igl [Jak-LO l 2 3 4 O 1 2 3 4

DIRS POST-TRQNSFUSION DIQS POST-HIPOBQRIQ

FIGURA 4 : Dmnresíón de la eritrnnmvwsíg. mpdida ccmn1nuornnración de F959 al mritrón circulante. En ratonesrnn nolicitemia nostntransfusimnal (HF) 0 Dust-hinóníca(PH). nn Funcion del tiemno transcurrido dpsdw la snoundahrnnnfusíon (ratones HT) o desde la finalizacíon delDEÑÍDHOde rnndicionamiento hiúuxico. Valora; nromedin vFH do ó animales/Bruno

posterior a la seounda transfusión (HT) o a lafinalización del oeriodo de condicionamiento hiooxico(PH). momentoen el cual. en un bioensavo standard. seríainyectada EPO. Los animales permanecieron en la camarahinoharica durante períodos de 4-24 h. Con excepcion de laEtstitución de la inyeccion de EPÜpor la exoosicion ahinnbaria. el ensavo de la respuesta eritropovetica siouiolos lineamientos normales. con administracion endovenosade FGSW48 h despues de la iniciacion de la exoosicion ahiooharia v determinación de la incorporación del isútonoal eritrón 48 h mas tarde. Seis ratones de cada grupo nofueron exouestos a hioobaria, siendo consideradoscontroles no expuestos. El volumen de la NRG fuedeterminado en los restantes animales de cada Grupo en elmomentode la autopsia de los animales expuestos.

La resnuesta eritropovetica a periodos crecientes deeuoosición a hiooharia. a juzqar por la incorporacion deF059 al eritrón. fue claramente dependiente del orado deonlicitemia alcanïado por los animales HTen respuesta a]volumende eritrocitos invectado (Fioura 5). Los ratonesnue recibieron 1.4 m1de eritrocitos a] 90 Z mostraron unvolumen de la HRLde 6.20 +" 0.19 ml/IÜÜ o peso Corporal vun valor hematocrito iqual a 72.1 +_ 1.1 Z. Cuando laDelicitemia fue inducida por exposicion crónica ahvnnbaria. el volumen de la NRCfue 6.47 +m0.40 ml/lüü q.nlcnnrnndo el hematocrito promedio un valor de 79.8 +“ ¡.9Z. Por lo tanto. estos dos modelos de ratones. HT v PH.con Grados similares de policitemia (o b 0,05) mostraronuna nrofunda v sionificativa diferencia (o fi 0.05) entresus resnuestas a la exposición a hioobaria. siendo elZFPSÜ “.42 +m 0.03 en el grupo HT v 15.51 +m ¿.1 en elorluio FWI.

Experimento no. 4Respuesta eritropovética a EPÜexógena en ratones conpolicitemia post-transfusional o post-hipóxica

Treinta v cinco ratones PH fueron preparados deacuerdo a lo descrinto. El mismo número de ratones HTfue obtenido mediante administracion de 2 inveccionesin de 0.6 ml de eritrocitos al 80 Z. Ambos grupos deratones policitemicos fueron dividinos en S subgruposiduales. Tres de ellos recibieron volúmenescrecientes de"plasma anémico“ con alto contenido en EPÜ (25 U/ml). comose muestra en la abcisa de la Fioura a. durante el ao. diapoetrrinr a la seounda transfusión (HT)o de finalizacióndel oeríodo de condicionamiento hinoxico. Ütro oruporecibio solución fisiológica + HSA 5 mo/ml. siendoconsiderado como control no invectado. El subqruoorestante fue utilizado oara determinacion del volumen dela HHH. Una dosis trazadora de Fe59 fue invectada oor viaiv 48 h deenues de la administración del olasma anemico.determinandose la incorporación del isótooo al eritron 48h más tarde.

La relacion dosisnresouesta para plasma anemico (EPU)en ratones PH v HT se muestran en la Fioura b. El volumende la NRGfue ó.10 +- 0.65 ml/lÚO o y 6,36 +" 1,19 en

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raton25 ' HT y PH; respectivamente (p 0.05). El

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'48hr-RBC59Feuptake(°/o)

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Time of exposure to hypoxia(hours)

FIGURA5 :Incmrooración de Fefi? al eritrón en {uncíún deltiwmpm de exnoaíción a hípobaría en ratanas PH v HT. Lma

PH Fuermn empueatus a 456 mb 4 diam ÚQEDUÉB deFinalizado al neríodo de condicionamientm hioüuicn"miüntvas que los Fatmnefi HT lo Fuermn 4 días d SUUÉSde lammoundatran AfiiÓn. Radiohierro inVü"tüd0 AHh mág tardev dmtermina mn de ZP.-? e4actuada 49 h d más. Üadanuntm Fmprm4wnta el Dromediu +MES dm fi anlmales. Losnúmwrmsentra paréntesis indican el valmr uromedio delhematmcrito. Üírculog abiartms r ratones HTtransfundídmscun 0.6 m1: cuadrados abiertos z ratones HTtransfundidoscmn ’.Ü m1; triángulms abiertos m Patones HT transfundidmscon 1.4 m1; Cuadradog negros = ratones PHTimmmi expmaurm tm hyp Mia (hours) = tiempo dm Pvasicióna hipmbaria (haraaí: üahwRBC5?Fe untake (Z) m 27.59

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Anemic plasma (ml)\

FIGURA 6 :Incormoración de P959 al mritrún (KFQSQ) enratmnws nolicitémicos en función de] volumen de Dlagmaanémjco (EPÜ = 25 U/ml) administrada 48 h antes dalradimhierro. Las símbolos rapresentan al valor promedio de7 animales por punto. mientras que las líneas verticalesdemumgtran m1 ES. Las resouestas müstrada; can rumbosfueran mbtenidas en ratones HT1 mientras que lasmmstradas con circula; 10 fueron en ratmneg PH.ñnmmic plasma (m1) n plasma anémico (m1): Drdenada = ZFGSQ

25

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valor oromedio de ZFeS? en ratones invectados con solucionfisiolodica fue 0.99 +n 0.14 y 1,04 +m0.2 Z en ratonesHT y PH. resoectivamente. El ZFe59 fue proporcional al 10odel volumen de plasma anémico invectado. mostrando unranoo entre 34.46 v 60.62 Z en ratones HTv entre 34.21 v60.E7 Z en ratones PH. Por lo tanto. curvas de relacióndosisvrespuesta casi idénticas fueron obtenidas para ambosdrunos de ratones oolicitemicos.

Experimento no. 5Determinación de la actividad eritropoyética presente enel plasma de ratones PH y HTexpuestos a hipobaria

Veinte ratones PH v 20 ratones HT (0.6 m1 x 2) fueronexnuestos a 455 mb 4 dias después de 1a finalización delnerindo de condicionamiento hipoxico o de la seoundatransFusion durante 24 h. Los animales de ambos Gruposfueron sandrados nor punción cardiaca inmediatamnntedesnues de finalizada 1a exnosicion. separandose olasmamediante centrifuuación. Los plasmas obtenidos de losratones pertenecientes a cada grupo fueron combinados naraobtener asi un volumen suiiciente nara efectuar lavaloración biolooica de los mismosmediante bioensavo enel modelo de raton exmhiponico. Los animales de bioensavoFueron invectados con 1.0 m1 de esos plasmas combinados.

La actividad eritroooyetica presente en el plasma deratones HT v PH expuestos a hipobaria durante 24 h senresenta en la Fioura B. El hematocrito promedio fue 65.08l- ¡.79 Z nn donantes PH y ¿“.92 +—1.54 Z en donantes HT.Mientras nue no se detectó actividad eritrooovética en elülasma de ratones HTexpuestos a hipobaria. su valorsupero las EO“ mU/ml en los ratones PH.

Experimento no. óResouesta eritropoética a hipobaria en ratones posthipóxicos, hipertransfundidos, o post-hipóxicoshipertransfundidos

Comose muestra en la Figura 9, Fueron constituidos 4orunos (81"84) de 22 ratones cada uno. G1 estaba formadonor ratones PH. 82 estaba integrado por ratones HT“aoudos”. due recibieron dos invecciones intraneritonenlesde 0.a m1 de eritrocitos a1 80 Z durante 2 diasconsecutivos. La seuunda transfusión fue realizada duranteel ultimo día de exoosicion de los ratones pertenecientesal Hi a hinoharia. 33 estaba formado nor ratones HT“crónicos”. que recibieron 1 inyeccion semanal por viaintranelitoneal de 0.8 ml de eritrocitos al BÚZ durante 3semanas. La tercera transíusion fue efectuada durant? elúltimo dia de exposicion de los ratones oertenecientes aHi a hinobaria. G4 estaba integrado nor ratones PHMHT.resultado de 1a combinacion de los tratamientos imouestosa los ratones de GI v GS. Ocho ratones de cada orunofueron expuestos a hipobaria (456 mb) 4 dias desnués de laúltima transfusidnv o de terminado el tieriodo decondicionamiento hinoxico. Es ese momento. en unhioonsavo standard. hubiera sido inyectada EPU. Los

27

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FIGURA 8 :ñctividad eritrmouyética pr&gente en el plasmade ratones HT y PH expuestas a 455 mb durante 2 h. Laactividad fue medida como ZFeS? (mrdenada) mn ratonesp05t*hipómicns. Los ratones de bioensayo racibíeron: Gruonñ = solución iiainlóqica, Grupn B m plasma de ratones HT,Grupo C m plasma de ratmnes PH, Grupn D = 200 mUda,EPO¡Los valurem son prmmedio y ES de 8‘10 animales por grupn \

animales permanecieron en la camara hioobarica durante 24horas. Con 1a excepción de la sustitución de EPO norhinoxia. el ensavo de la actividad eritropovetica siouiolos pasos del protocolo standard. con inveccion iv de Feñ?48 horas despues de la iniciación de 1a exposición ahioobaria v determinación del ZFeS? 4B horas mas tarde.Ocho ratones de cada grupo no expuestos a hipoharia Fueronconsiderados comocontroles no-expuestos para cada qrupo.El volumen de la MRCfue determinado en los restantes bratones de cada orupo en el momentode 1a autoosia de losanimales emperimentales.

La respuesta eritropoyetica a 20 horas deexnosición a 456 mb. medida como ZFeSW. en ratones PH(GI). HT "aoudos" (G2), HT "crónicos" (GE) v ratones PHnHT(U4). se muestra en la Fioura 10. El volumen de la HHCve] valor hematocrito no fueron sionificativamentediFerentes (p b 0.05) entre ratones PH v HT (Gi vs P2 vGF). H nesar de ello, e] ïFeS? fue aproximadamente 25veces mavor en los ratones PH que en ambos tioos derainnes HT. aqudos y crónicos en respuesta a hipobaria.{'1:";lt_-"mas,los ratones F'H--H1. que mostraron el mayor volumende HRC v de valor hematocrito en comparacion con losres antes oruoos (p á 0.05) mostraron una resouestaeritronoyetica no significativamente diferente (p k 0-05)de la observada en los ratones PH (GI 's G4) vaproximadamente 20 veces mayor que la corresnondientw a

-.r-¡ratones HT "aoudos" y "crónicos" (G4 vs hL v ha).

Experimento no. 7Efecto de la duración de 1a exposición previa a hipobariasobre la respuesta eritropoyética a hipobaria de ratonesHT

Para el oresente experimento. fueron constituidos Borunos (leGB) de 14 ratones cada uno. Todos los animalesrecibieron dos inyecciones intraueritoneales de 0.6 m1 deeritrocitos homolooosa1 80 Z durante 2 dias consecutivos.Ratones pertenecientes a los grupos 63 a GBhabian sidopreviamente expuestos a 45a mbdurante períodos variables.entre ó v 216 horas. El último dia de 1a exoosicion. entodos los casos. fue el dia inmediatamente anterior a lanrimera transfusión. Ratones de cada orupo fueronexpuestos a 455 mb durante 24 horas 4 dias desoues de laúltima transfusión. Los animales fueron invectados conFPS? 48 horas mas tarde. determinandose KFeH?48 horasdesuues. Los ratones pertenecientes a G1 no fueronmxnuestos a hinobaria. Los ratones pertenecientes a Ü?fueron expuestos sólo despues de haber sido transiundidos.Fl volumen de MRC {ue determinado en los ó animalesrestantes de cada grupo. en el momentode la autopsia delns animales experimentales.

La Finura il muestra e] efecto de la duracion de laexnosición orevia a hioobaria sobre la respuestaeritropovetica a 24 horas de exoosicion a 456 mb enratones HT. Los animales HTno expuestos oreviamentn ahinoharia (H2) mostraron un muv pequeno incremento. aunquesinnificativo (n i 0.05) de ZFe59en respuesta a lahipuxia. Un proqresivo incremento de ZFeS? en respuesta a

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hipabaría se mbservó en rafanes HTcuando habían aida

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RCV(ml/100bwt)5.32:O.2 55610.4 5.61:O.2 8.71:O.3

Hemotocrir(°/.)64811.8 69,3:26 66.3:1A 78.7:2.4

FIGURA10 :Hmfimuwgtaeritrmpovética a hipmharia en ratmnesmostwhinóxicms (PH. 81). winfirtransíundidoa “agudos” EHT.GE). hipwrtransfundidos “crúnicms” (HTn GE) y pmgtwhiDÓHicmswhipartranfiiundídmm (PHMHT, Gü). Loa ratünem PHfueron muuuestms a 456 mb 4 dias ¿“.JÉS de laFinalización del período de unndicimnamiantm hípúmicn.mipntrag que los ratmneg HT 10 Fueron 4 días desoués derecibir la ESQUHÜRtrangfusión. El PGE? fue inyectado 48 hdngpué; de iniciada la exposición a hípobaría v el KFQSQcalculado 48 h más tarde. Barras blancafi = ratmnmaexpmrimentales. barras rayadas = ratones nm emnuestmg ahimoharia. Cada barra representa m1 valmr prümedim de ¿"aanimalas: las lineag verticales reprmggntan 1 E8Ürdenada m ZFQSÑ: REV= masa roja circulante

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Durotion of previous exposure to hypoxi

exnuestos previamente a hipobaria durante ¿"30 horas. Nose observaron incrementos mavores cuando la exposiciónprevia a hinobaria fue de 46-216 horas.

Experimento no. 8 _Respuesta eritropoyética a estímulos que inducen secreciónde eritropoyetina endógena en ratones policitémicoshipertransfundidos o post-hipóxicos

Ochenta ratones HTv 80 ratones PH fueron divididosen oruoos de 10 animales cada uno. Cinco dias desouésde la última transfusión o de la finalización del oeriodode condicionamiento hiooxico. qrunos de ratones HTv PHrecibieron uno de los siguientes tratamientos: (1)exoosición a 45h mb durante 24 h; (2) inyeccion subcutaneade 0.5 mo de dexametasona: (3) inyección subcutanea de 50mn/Ho de oeso corporal de DL isoproterenol HCl: (4)invección subcutanea de 2.5 mo de propionato detestosterona. que fue repetida 24 horas desoues: v (5)invoca-ion submitanea de 700 mUde EF'D (en 1a {orma deplasma anemico). El exoerimento fue también realizadocomenzando los tratamientos descriotos 4 dias desoues dela seounda transfusión o de 1a finalización del periodo decondicionamiento hipóxico. Comolos resultados obtenidosen ambos casos no difirieron en forma significativa.solo seran considerados aquellos obtenidos en el primerode ellos. Los ratones expuestos a hinobaria o tratados condeuametasona. isoproterenol o EPUfueron inyectados porvia endovenosa con Fe59 48 horas mas tarde, determinandoseZFeS? 48 horas despues. Los ratones tratados contestosterona recibieron el Fe59 96 horas después de lasegunda inveccion del esteroide. determinandose KFeS?72horas mas tarde. Se realizo la determinación de laferremia en plasmas de ratones HT v PH tomados al azar enel momentode la inveccion del radiohierro. E1 volumen dela NRGfue determinado en el momento de 1a autopsia.

El volumen de 1a MRCen ratones PH fue 5.84 4 0.6mÏ/IÚÜ g de peso corpOral. mientras oue el valor Fue 5,72I” 0.3 ml/IOÚ o en ratones HT (p 3 0.05). lo que indicaone ambos modelos policitemicos mostraban el mismo niVelde policitemia. Los niveles de ferremia fueron 2,53 +w0.7uo/m] v 2,77 +—0,8 ug/ml en ratones PH y HT,respectivamente (p b 0.05).

El efecto de la exposición a hipobaria o de laadministracion de dexametasona. isoproterenol.testosterona o EPÜ sobre ZFeS? (expresado en formarelativa en relacion con el control esnecifico no tratado)se muestra en la Figura 12. Se observaron diferenciassionificativas (p ñ 0,05) entre los valorescorrespondientes a ratones PHy HTexpuestos a hipobaria oinvectados con dexametasona, isoproterenol o testosterona.siendo los valores siempre superiores en los primeros queen los seonndos. Por el contrario, la respuesta a EPÜfuesimilar en ambos qrupos.

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\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\“o-42221 x__.=.=.E2: fiHYPOXIA ISOPROÏERENOL ERYTHROPOIETIN

DEXAMETHASONE TESTOSTERONE

FIGURA 12 : anctm dm diferentem tratamimnfmï HOhFHEFQS?' valmw CÜHÏFÜI) en vatmnwü Dustwhimüxícmg íbarramblancam) e hipertrangfundidma (barrag ravadafi)dennada m ZFQEQ

Experimento no. 9:

Producción de eritropoyetina renal y extra-renal enrespuesta a hipoxia hipobarica en ratas post-hipóxicas ohipertransfundidas

a. Respuesta eritropovetica a la exposicion a hioobaria enratas oostwhioóxicas o hipertransfundidas

Siete ratas HT v 7 ratas PH fueron expuestas a 456 mbfl días desnues de la seounda transfusión o de laterminacion del oeríodo de condicionamiento hipoxico.respectivamente. Un número igual de ratas normales fuerontambién Houestas. La euoosicion a hioobaria duro 24horas: dosis trazadoras de FeS? fueron invectadas a losanimales por via endovenosa 4B horas despues de lainiciacion de la exposicion. determinandose ïFeEQ 48 horasmás tarde. Siete ratas de rada orupo no fueron expuestas ahinoharia. siendo consideradas como controles no“expuestos. El volumen de la NRCfue determinado en 5 raiasde cada oruno en el momentode la autopsia de los animalesempurimentales.

lo: resultados obtenidos se muestran en la Fiouralï.Las ratas nue recibieron 5.0 ml/IÚÚ o de oeso cornoral deunn eusnensiün de eritrocitos homolooos con hematocrito eRU K (ratas HT) mostraron un volumen de HRC = 4.68 +—0.omlflÜÜ o y un valor hematocrito = 67.2 +w 2.0 ï. Cuando lanolicitemia Fue inducida mediante exposición cronica 5hirvoharia (ratas PH) . la MFICfue 4.322. -+'--0.15 ml-J’lüü Cl Vel valor hematocrito = 64.3 +" 2,1 Z. Estos dos tipos deanimales con Grados similares de policitemia mostraron unadiferencia sionificativa (p i 0.05) entre sus respuestas ala exposicion a hipoxia hipobarica. siendo nl valor deZFPFW = 11.24 +m 3.6 Z en las ratas HT e = 6?.6 +" 3.9en las ratas PH. Por lo tanto. los cambios inducidos enEFGS? nor el estímulo hipoxico en ratas HT v PH fueron2.h3 v 13.5? veces el valor de su oropio control.resnectivamente. Ratas normocitemicas tratadas en formasimilar y expuestas a hinobaria mostraron un ïFeSQ 1.34vetns suoerior al de su resnectivo control no expuesto.

A

h- Concentracion de eritroooyetina en extractos renalesde ratas postwhipoxicas o hipertransfundidas exouestas mhiooharia

Cinco ratas PH y 5 HT fueron expuestas a 455 mbdurante ó horas. 4 dias despues de la seounda transiusión(H1) o de la Finalización del periodo de condicionamientohIDÓHiCÜ (PH) Cinco ratas normales fueron tambiénennuestas y consideradas comocontroles. El oeriodo deennosicion de ó horas fue elegido teniendo en cuenta eloatron temporal de EPO renal en ratas exouestas ahiooharia. ñl Final del periodo hipoxico. los animales(uernn anestesiados con éter. obteniéndose la mavorcantidad posihle de sangre por punción de la aortaabdominal. n traves de la mismaaguja insertada en laarteria. v orevia seccion de la vena vuoular, losanimales fueron perfundidos con solucion fisiolóoica hasta

k).

nue se produjo el cese de la actividad cardiaca. Laeficacia de la transfusión fue determinada en un gruposeparado de ratas que Fueron inyectadas con eritrocitosmarcados con F6359por via endovenosa. Todo el radiohierroinvectado fue recuperado en el liouido de perfusión. Losrifiones de cada animal fueron extraídos v cortados encuartos. los oue fueron colocados en solución de bufferFnsFatn, pH 7.3. a razón de 12 riñones/ml de liquida. Elconiuntn fue colocado sobre hielo y homooeinizado duranteTH een. La mezcla fue entonces centrituqada a 2.30Ú odurante 3Ü min, recogiendose el sobrenadante. que fuecongelado hasta su ensavo en el raton enwhinóxico.

La concentración de EPÜen homogenatos de riñonesnrovenientee de ratas normales, PH y HT expuestas a 455 mbdurante ó horas se muestra en la Fío. 14. La concentraciónde EPÜrenal en los tres grupos de animales no expuestos ahiuobaria fue inferior al limite detectable nor elbíoensavo (50 mU/ml). La misma aumentó en formasignificativa en los animales normocitemicos v en lospolicitemices durante la exposición a hioobaria. Sinemheroo. el valor hallado en los animales PH Eueeinnificativamente (p fi 0.05) mayor al correspondiente alos HTv aún a los normocitemicos. Por el contrario. laconcentracion de EPÜen los homogenatos renales obtenidosde ratas HTfue.inferior (p < 0,05) que el observado enlos corresoondientes a ratas normocitémicas.

c. Concentración de eritropoyetina en plasma de ratasnefrectomizadae. post"hioÓHicas o hipertransfundidas.anuestas e hionharia

Cinco ratas PH v 5 HT fueron sometidas a nefrectomiaunilateral un dia despues de la finalización del periodode condicionamiento hinoxico (PH) o de la segundatransfusión (HT). El riñon restante fue extirpado 3 díasmás tarde. inmediatamente antes de one las ratas +unranexnuestas a hipnharia. Un orupo de S ratas normales v otrode ratas nefrectomizadas no oolicitemicas {ueron tambiénemnuestos v considerados comocontroles. Se obtuvo sangremediante nunción cardiaca de los animales desnues de Bhoras de exnosición. seoarandose el plasma mediantecentrifuqacion. que fue conservado a n 20 C hasta sueneavn en el ratón exnhínóxico.

La concentración de EPÜ en ratas normales vneírectnmizadas normc«o oolicitemicas expuestas ahinubaria se muestra en 1a Figura 15. La concentraciónde EPUen plasma de ambas tinos de ratas nolicitemicas (HTv PH) Fue significativamente menor (P í 0.05) que el valorrnrrespondiente a ratas nefrectomizadas normocitemicas. Noen encontraron diferencias significativas entre ratas PHvH! en lo referente a la concentracion de EPÜen olasma.

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100 F“RCV:Á.3230.15 ml/100gHct:643:2.1°/o

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1.8hRBC-ngeuptake(°/o)

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PH rot‘s HT rats

FIGURA 13 : ïFmHW mn "atas mmlicitémicam DÜEÏMÜÁÚDHiCHH 0himnrürangfundidas HHDUQrv a hipmxia himühárica durante

Las barras blancam remresentan el vaimr pvumwdioWXDUH%ÍH%, mimntrag que namwas

z"an el valor corresmmndiente a ratas nm expuestas.a ratag pmfitwhipóxicas. HT rata = rataa

hinwrtransfundida%. Promedim v ESÜrdmnada m ÏFmfiq: REV m mama raja circulante

Lam jarra;

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48h-RBC59Feuptoke¡nassaymice(°/o)

o- (:1 [j .4C N1 N2 PH HT

FIGURA 14 : Concentración de arítrmmmvmtina mn hmmmqwnatmsrmnalmg dm ratas nmrmomy policitémícas mxnuegtag ahimmxia hinubárica durantm 24 haraa. La cmncwntracíün dela hmrmmna se amarmsa cmmmZFEE? en ratmneg mogtmhínóxicmsinvwctadus con Las homuganatns. Ü w control inesmecíficown el animal de bimensavo, N1 = hGMÜQEHatD de

normociiémicm nm muuuamta a hipobaria. BM idem HP'ja :xpup a hímrnaría. PH m idem de

ica. HT m ídam de r . hipmrtrans%undida.standard da cada qrumo.

¿uá yrata1""r" (:1m (a d i, C.) y

Ürrhflwada ==

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48h-RBC59Feuptakeinossaymice(°/o)

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C N Nx-PH Nx-HT

FIGURA 15 :Cmncentración de mritromoyütina plasmática onratas nnrmalms (H) y mairectümizadas policitémicam, poet—hinóxícas (HHWPH) D hipertransfundidaz (MNWHT) enrespuwsta a exposicion a hipouia hipobárica. Lacmncentracíon de la hormona se expresa camu ZFQS? enratones de bioensayu. C z central inesoecí+icm delbiomnsavm. Las barras representan valmres promedio y laslínmag smbra 1 mismas el error standardDrdanada fi ÏFEÏ'

Experimento no. 10:Eritropoyesis y secreción de eritropoyetina en respuesta ala inyección de cloruro de cobalto en ratones conpolicitemia hipóxica (PH) o transfusional (HT)

Con el objeto de determinar la respuesta a cobalto deratones PH v HT. 56 ratones de cada modelo {Heronoreparados seoún lo exouesto. Ambosorupos de ratonespolicitemicos fueron divididos en 7 subgrupos iguales.Cuatro de ellos recibieron diferentes dosis de rHquPO(entre 50 v 400 mU); otros 2 subqrupos {ueron inyectadoscon 61200 (4 v 8 umoles): el subqrupo restante recibiosolucion fisiológica, siendo considerado comocontrol -noinvectado. Todas las invecciones fueron realizadas 4 diasdespues de la seounda transfusión en los ratones HTw dela terminación del periodo de condicionamiento hinóxicn enlos animales .PH. La determinacion de la iasaeritrnpovetica Fue efectuada mediante cálculo del ZFeÜÜenla forma descrinta.

Los resultados obtenidos se muestran en la Fioura ló.Fn la parte izquierda de la mismapueden observarse lasrespuestas de ambos modelos experimentales a dosiscrecientes de rHu_EPO. La reoresion de las relacionesdosismrespuesta fue naralela . confirmando una ve: másnue 1a resouesta a EPÜexooena es semejante en ambos tiposde ratones policitemicos. La parte derecha de la fiuuramuestra las respuestas a 4 y 8 umoles de cobalto. Mediantecomparación con la curva dosis-resnuesta para rHumEPÜcorrespondiente a cada modelo, se determinó que lasresnuestas de los ratones PH fueron equivalente a 5 v 145mUrHquPÜ. respectivamente. La respuesta de los ratnnesHTa 4 umoles de cobalto no fue detectable; la respuesta a8 umoles fue equivalente a 52 mUrHunEPÜ. Por lo tantou laresnuesta eritropoyetica a 8 umoles de cobalto fuesionificativamente mavor (p 4 0.05) en los ratones PH uueen los HT.

Experimento no. 11:Concentración plaSmatica de eritropoyetina endógena y tasaeritropoyética en respuesta a 1a inyección de cobalto enratones normo- y policitémicos

Tres oruoos de 40 ratones cada uno {uernnestablecidos con animales normocitemicos v pnlicitémicosPH 0 HT. Cada gruoo fue subdividido en 4 suborunosiouales. 2 para la determinación de la tasa eritropovútíca(control + experimental) y 2 para la estimación de laconcentración plasmática de EPD(control + exnerimental).Los suborunos experimentales recibieron una invección de Bumolws de CIECo mientras oue los controles Fueroninvectados con solución {isiolooica. Un suborupoexperimental v otro control fueron sangrados mediantenunrión cardiaca 2 h despues de la inyección de cobalto.F1 plasma de cada animal fue separado medianternntrifuoarinn y conservado a w HO C hasta la

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determinacion de la concentración de EPÜ inmuno—reactivamediante RIE. Los restantes subqrupos xperimental vcontrol recibieron una dosis trazadora de Fefi? 49 hdesnues de las invecciones de cobato o de solutionfisiológica. La determinacion del ZFeS? fue realizada 49 hmas tarde.

La Figura 17 muestra las respuestas eritropoyeticascorresoondientes a ratones normocitemicos v policitemicosen su parte izquierda v las concentraciones de iEPÜ enplasma en su parte derecha. El análisis de 1a misma indicanue la respuesta eritronovética a cobalto en los ratonesHT¡ue extremadamente baja v significativamente diferentede la observada en ratones PH. La comparación entre lasrennuestas a cobalto de ratones normo- v oolicitémicos fuediFicultada por el elevado valor basal de ZFeS? presenteen los animales normocitemicos controles. La fiouratambien muestra que los niveles en plasma de iEPÜ 1k hdesoues de la inyección de cobalto no {Heronsionificativamnnte diferentes (p F 0.05 entre ratonesnormncitemicos y PH, sugiriendo que la producción de lahormona fue similar en ambos grupos. Por el contrario. laresouesta a cobalto de los ratones HT fuesioniiicatívamente inferior (o í Ü.ÜS) nue lacorresnondiente a ratones normocitemicos y PH.

Experimento no. 12:Efecto de un estado hemolítico compensado sobre larespuesta eritropoyéticn a hipobaria dl ratones conpolicitemia post-transfusional

El ennerimento fue realizado con el objeto dedeterminar si un estado hemolitico comoensado.caracterizado por una producción de eritrocitos aumentadaa nesar de una concentración casi normal de hemoglobina.es capaz de modificar la respuesta eritropoyetica ahipoharia de ratones hechos policitemicos mediantehipertranstusión al termino del período hemolitico.Cuarenta ratones fueron divididos en 4 gruoos de 10animales cada uno. Dos de ellos recibieron una dosisinicial de 4.0 mq/IOOq peso corporal de Fenilhidrazinatamente hemoliticn, PHZ) durante el día 1 de la nrimorasemana. la que {ue seguida por dosis de 2,0 mo/IÚÚg cada7 dias durante un total de seis semanas. Los animalesinvectados con la droda más los inteorantes de los dosnrnnos restantes, que no la recibieron. Fuerontransfundidns de acuerdo con lo explicado al termino delas seis semanas. Un grupo de ratones no invectados másotro de ratones invectados con PHZfueron eanuestos a !Bómh durante 24 h en la camara hipobarica. Los dos gruuosrestantes no fueron expuestos. La emnosicion {ue iniciada4 dias desoues de la segunda transfusión. Los animalesrecibieron una dosis trazadora de Fe59 2 dias despues deiniciada la exposición a hinobaria, determinandose ZFe 2dias mas tarde.

La evidencia para el establecimiento del estadohemnliiico comoensado en los animales invectados con PHZse obtuvo a partir del valor hematocrito v del recuento de

\ . reticulmcitus en sangre; El primera maatró au menor 'alor

/

a:

4G

PH3-5 HT

30“

.,‘í.1‘zl, l,

yCOBALT;

25

20

15l

RBC-59FeUptake(%)

¡1:\\\\o

O 100 mU 200 4 umol 8

FIGURA 16 :Relación dosismrasuumsta para rHquPÜ enstones malicitémicmg postwhipóxicom (PH) u

hipertransfundidms (HT) medida como ZFÉEW. Efecto de laadministrauión de 61280 sabre a] migmmmarámetrm y mn losmismas modelos experimentales. Valores nromedio y ES de 7animales/grupoOrdenada = ïFeSg

41

IIIIIIIIIl...'I"II..I".Il=IIIII.II.'II'.I"II.II.II.III'.I'CI.

RBC-59FeUptake(%)

' 350

"300

*250

” —2oo

r -150

Respuasta ea la inyección de B mmm]

ratoneg nürmocitémicms (N) y policitémicms

FIGURA 17 :Parte 'zmuimrda mmedida coma ZFQSQ,

(PH) e hipertransfundidos (HT). ParteCmnmentración plasmática de eritrmpoymtína(iEPÜ) en qrupms de animales similares 12 hadministración de la droga. C m ratmnes ismlución fiaiulúgica, Cm= ratones inyectadUalüres prmmedio y ES de 10 animalea/grupoÜrdmnada izquierda = ïFeS9; nrdenadaconcentración plaamática de EPÜ (mU/ml)

'1x;

x xz z zx \1 z rx xz r z\ \ —z / z\ xz z rs x/\/\4z z z\ \z , ,x xr z z\ \z z r .x \z z rx s/\/ N;1 r zx \z z ;x x4 z zx \z z z

Vitropayética.es de CIECQ enpust-hipóxicus

derecha =inmunoreactivadespués de lanvmctados canDE can (31HCD.

derecha =

¡EPO(mU/ml)

dos dias después de e!nctuada la nrimera inyección dePHZ.E1 hematocrito alcanzó su valor prentrataminntn alfinalizar la tercera Spmanadel mismo. E] rmcunntu .9rpticulocítns en los animales tratados con PHZ mnstróvalmre; elevados durante tado el período de tratamiento.

La Figura 18 muestra que los ratones nolicitémícnasnmmtidoa previamente a un estado hemnlíticn dnranfp ósumanms FFGDDHÜÍPFOHa] Putímulo hinüxicu incrpmentando nlZFDHQen forma significativamente mavar que rahnnesnnllcitémicos sin estado hmmolítíco previa.

25

—*7

20 _

15 _

10 _

ZFESS

C H C 4H

PHZ PHZ

FIGURA18:ngmue5ta eritropmvética mn términüg de ïFcra+0nms pmlh“itémicos hinewtrangfundidmm nxnumgtwn ahinmxia himabárica durante 2m h. C H cmntrmlcaenp' "ms, H m expuestos. PHZ x animal ; que Fueroninvmctadus semanalmentm con {anilhidrazina duranta óSemanag cun el ijütm de inducir un e.tado hemoliticmcmmnensadu ureviamente a la hímertranaFusiÓn. Laexmmgición dm tmdmg los qrupms a hipühmria {UH realizada 4diafi dmfipuú da efüctmada la segunda tran%+umiün. ’almrwüprnmpdim v h de 10 anímaleg por qrupm

z}.¡1

DISCUSION

La hiooxia tisular constituye el sis alrededor delcua] se ubica el mecanismode retroalimentación que operacnntrolando la producción de eritrocitos v adaptando elvolumnnde la masa roja circulante a la necesidad tisularde oxígeno (Figura 3). La importancia homeostatica da putomefanismo en la corrección de 1a hipoxia anemica esevidente. Sin embargo, esa importancia ha sido cuestionadapa‘a la corrección de la hipoxia hipÓHica. lo nur hallevado a considerar comoinadecuada a esa respuesta (lflï.1Ü4). Eaton. en un interesante articulo titulado "Lowaliitude hominids at high altitudes" (105). ha sugeridodue la Naturalosa ha disefiado este mecanismo do controlpara cmntrihuir a 1a supervivencia de los hominidoshabitantes de las sabanas africanas, contribuvondo a lar.-