Recombinação nos vírusProf. Dra Adriana DantasGenética de microorganismosUERGS, Bento Gonçalves. RS

Características Gerais

• Empregados como um sistema genético▫regiao rII do fago T4

• Crick et al., (1961) - elucidaram as propriedades do código genético

• Benzer (1955) – estimou dimensões dos cistron do récon e do múton▫Estrutura interna dos genes

• Vírus possuem mutantes e sistemas de recombinação ▫estudos de variabilidade genética

• Bacteriófagos – de maior importância▫Processo de transdução

T4 Phage•Conteúdo de DNA lisado por Fago T4

Características dos fagos

•Twort (1915) e D´Herelle (1917)•Descobrimento dos fagos batizados de

Bacteriófagos•Fagos pra um grande numero de

bacterias▫Escherichia, Aerobacter, Salmonella,

Shigella, Bacillus, Pseudomonas, Xanthomonas, Corynebacterium, etc...

•São constituídos por proteínas e ácidos nucléicos

Tipo de fagos

•Classificados com a presença de cabeça hexagonal▫de cauda contrátil, com ausência de cauda,

etc•Classificados quanto aos ácidos nucléicos, •DNA simples, DNA duplo, RNA simples e

RNA duplo•Reconstituição apenas de ácidos nucléicos•Ausência de genes pra tRNA ou rRNA

Composição do vírus• A) capsídio – capa que envolve o vírus• B) capsômero – unidades morfológicas do

capsídio• C) nucleocapsídio – capsídio mais ó acido

nucléico• D) core – o material no interior do capsídio• E) envelope – material celular (lipoproteico)

que envolve certos capsídios Conjunto desses elementos é o vírion que

seria, o vírus completo, sendo o termo vírus uma designação mas geral.

Acido nucléico dos virus• Vírus tem proteína e ácidos nucleicos (DNA ou

RNA)• Alguns podem conter carboidratos, lipídios e

mesmo enzimas, como transcriptase reversa, polinucleotideio, ligase e DNAse 0u endonucleases (adenovírus)

• Acido nucléico é contido dentro do capsídio, com tamanhos variados

• Proporção de1% do total fago ate 50%• Pode conter desde 3-4 genes (1.000 códons)• Conteúdo G+C são similares a célula hospedeira –

interação gênica entre o vírus oncogênicos e fagos temperados0

Tipo de ácido nucléico, peso molecular e comprimento do material genéticoVírus Tipo de ácidos

nucléicosPeso molecular (x 106 dáltons)

Comprimento de ácido nucleico (µ)

P22 DNA fita dupla 26 14

P2 DNA fita dupla 20 10

T2, T4 e T6 DNA fita dupla 110 56

DNA fita dupla 30 17

X174 DNA fita simples

1,6 1,8

Herpes DNA fita dupla 100 53

Q RNA fita simples

1,5 1,4

R17 RNA fita simples

1,1 1,1

REO RNA fita dupla 17 8,3

Multiplicação de vírus• Experimento de um só passo (one-step)• Ellis e Delbruck (1939)

▫ ocorrência da infecção de bactérias com fagos• Período de latência• Infecção 1:1 (baterias com fagos)

▫ fagos adsorvidos pelas bactérias em tempos definidos• Suspensão de baterias infectadas é semeada em placas

com culturas de bactérias sensíveis aos fagos• Onde ocorre partículas de fagos vai ocorrer ataque na

bactéria▫ Placa de lise ou plaquê▫ 104 até 108 partículas

• O rendimento ou burst size corresponde ao numero de fagos produzidos por uma bateria▫ Cerca de 100 a 200 fagos em média por bactéria infectada no

caso do fago T4.

Ciclo dos Fagos• Adsorção

▫È a colisão de fagos com bactérias através dos receptores de fagos

• São altamente específicos• Fagos como os T-pares (T2, T4, T6) se fixam

nos receptores▫ lisozimalisozima carregada nos receptores - digere a

parede mais interna da célula bacteriana• Com o rompimento da PC da bactéria ocorre

uma perda de algum material citoplasmático, mas a célula logo se refaz, tornando-se novamente impermeável

Receptores de bacteriófagos

•Fímbrias ou pêlos▫formadas por subunidades repetitivas da

proteína pilina; proteína adesina na extremidade:

•adesão a superfícies •favorece a colonização;•receptores para bacteriófagos,•capacidade de conjugação

▫Fímbrias sexuais ou pilus F

Penetração do ácido nucleico

•Feita adsorção (ligação receptor-fago) a cauda se contrai graças a interação entre proteínas nos músculos (actina e miosina)

•Deve ter ATP no fago que se torna ADP na infecção e no sistema de actonomisina

Síntese de mais vírus• Dentro da célula bacteriana DNA do vírus fornece

informações:• DNA do T-pares tem hidroximetilcitosina (HMC)

em lugar de citocina• Experimentação com 32P calculou-se que 1/3 do

DNA das novas partículas do fago formadas provem do DNA da própria bactéria e 2/3 vem de outras fontes.

• Muito pouco ou nada de proteína bacteriana é usada pelo vírus, a síntese de proteína é do fago.

• A ácido nucléico que penetra, resiste a nucleases da célula, devido a proteção do DNA e RNA duplos.

• Sistema de restrição também atuam.

Eclipse, maturação e lise•Processo de maturação

▫Ontogenia dos fagos T-pares•Nos primeiros minutos de

penetração, o DNA da célula se desintegra, no oitavo minuto já se observam fibrilas que são DNA de fagos e, no décimo, aparecem cabeças hexagonais

•Cauda e fibras vão se formando e no final se junta formando uma partícula completa

Figure 1. CryoEM view of the native bacteriophage ϕKZ (a) and the tailless mutant (b). The tailless sample contains DNA-filled (dark gray) and empty (light gray) particles. Bars represent 100 nm.

Eclipse

•Não há formação de placas de lise, pois o fago injeta seu DNA livre na célula

•Até as particulas maduras não serem formadas, o fago não é infeccioso

•Fagos “vazios” chamados de ghosts (fagos sem o acido nucléico) podem ser adsorvidos pelas células e essas podem sofrer transformações metabólicas

Repetição do ciclo dos fagos

•Ciclo lítico▫Uma vez liberadas as particulas fagicas, o

ciclo pode-se repetir quando elas vão infectar novas baterias

•Ciclo lisogênico▫Quando o DNA pode ser incorporado no

cromossomo da bacteria –

Mutantes empregados em vírus• Primeiros mutantes para estudo de recombinação fora isolados de fagos

de Staphylococcus com morfologia diferente da selvagem• Mutantes de T2 com lise rápida (r) mentem o caráter após a infecção• Mutantes minute (m) produzem placas de lise minúsculas, com baixa

capacidade de produzir partículas fágicas, de lise precoce ou de crescimento lento

• Mutantes para o hospedeiro (h) que formam placas de lise em linhagens que o fago original não pode infectar

• Mutantes para turbidez (tu) formam placas turvas quando o normal é formar placas claras

• Mutantes star (s) que dão placas de lise irregulares• Mutantes que não produzem lisozima (e), isto é, não lisam bactérias

infectadas por incapacidades de serem liberadas delas• Mutantes sensíveis a temperatura (ts), que se multiplicam a 25oC,

provavelmente porque as enzimas tem uma estrutura que não funciona em altas temperaturas

Modelos de duplicação de vírus

•Métodos clássico de recombinação direta não são aplicados em vírus

•Uma vez que muitas cópias de cromossomos de vírus estão presentes no interior da bactéria, a recombinação não ocorre de modo usual, como em células diplóides ou heterogenotas.

•Para estudar a recombinação, precisa-se saber como são formados os vírus dentro da bactéria

Duplicação dos vírus em bactérias• 1. “siga o chefe”:

▫ O DNA do fago sofre uma duplicação e da outro que novamente, se duplica dando um outro DNA.É um método conservativo e são necessárias 1.000 duplicações para dar 1.000 vírus;

• 2. “geométrico ou clonal”:▫ O vírus duplica seu DNA e da duas moléculas de DNA,

cada umas delas também se duplica e da quatro que duplicaram e dão oito – e assim sucessivamente. E um modelo semiconservativo e, com dez turnos de duplicação, mais de 1.000 vírus são formados;

• 3. “printing-press”: ▫ Um vírus infeccioso e molde para todos os outros.

Para dar 1.000 vírus, são necessários 1.000 duplicações.

Descoberta da recombinação• Com a infecção da mesma célula bacteriana com

dois ou mais tipos de fagos e analisando-se as partículas que emergem dessas células pode-se verificar a existência e tipos segregantes obtidos.

• Hershey e Rotman (1949) usaram dois caracteres em fagos T2, 5 fagos de cada tipo por bactéria▫Lise rápida (r) e especificidade de

hospedeiro (h)▫Genótipos: h+r x hr+ = h+r+ e hr

h+r+ x hr = hr+ e h+r

Uso dos três tipos de mutantes na recombinaçãoUso dos três tipos de mutantes na recombinação (h1, h7, h13(h1, h7, h13))

Cruzamentos (50% cada pai)

Progênie (%)

h+r+ hr+ h+r hr

hr1+ x h+r1 12,0 42,0 34,0 12,0

hr1 x h+r1+ 44,0 14,0 13,0 29,0

hr7 x h+r7 5,9 56,0 32,0 6,4

hr7 x h+r7+ 42,0 7,8 7,1 43,0

hr13 x h+r13 0,7 59,0 39,0 0,9

hr13 x h+r13+ 50,0 0,8 0,8 48,0

Segregação das classes recombinantes•Para cada cruzamento ocorre freqüência

aproximadamente iguais▫Indicação de evento recíproco envolvendo

dois cromossomos•Diferentes genes r dão diferentes

freqüências de recombinantes▫Mapeamento de diversos genes r no

cromossomo de fagos T2 chamados rI, rII, etc

•Mutantes minute (m) valores de recombinação de 30 a 50%

Vários turnos de permuta•Três tipos diferentes de fagos T2

▫hm+r1 x h+mr1+ x h+m+r1•Formação de ternos (três cromossomos

juntos trocando partes)▫Mapeamento por cruzamentos envolvendo

três marcos ao mesmo tempo e em três formas

hr (turva e grande) h+r+ (límpida e pequena) h+r (límpida e grande) hr+ (turva e pequena)

Fagos heterozigotos• Aos infecção por fagos r+e r, algumas placas de

lise formadas pela progênie com aparência mesclada (mottled), eram misturas de r+e r

• Indicação de heterozigotos formados• A heterogozidade ocorre só pra um gene ou

genes muito próximos e a frequencia é sempre constante, uma vez formados eles são deixados de lados e não tomam parte de outros turnos de duplicação

• Para cada gene, há 2% de heterozigotos em fago T4

Mapa circular do bacteriófago T4localização das regiões com genes para produção dos componentes da cabeça, cauda,

etc.

Enzimas envolvidas na síntese de DNA

Lisozima

Componentes de cauda

Fibras de cauda

Funções primarias

h+ r2 r+7

h+ r2 r+7

h+ r2 r+7

r2 h+ r2

r2 r+7

Três tipos possíveis de recombinantes heterozigotos em bacteriófagos: a) segmento sobreposto; b) redundância terminal; c) heteroduplex.

Mistura fenotípica(phenotyping mixing)• A recombinação em fagos não deve ser confundida com a

mistura fenotípica.• Dois tipos de fagos são colocados numa mesma celula

bacteriana, essa mistura pode acontecer• Ex. T2 e T4 de fagos infectam E. coli• Pode ocorrer:

▫ DNA de T2 seja englobado pela capa protéica de T4 e vice-versa.▫ Essa mistura só dura uma geração, pois T2, com capa protéica de

T4 infectando outra E. coli vai produzir só partículas do tipo T2 (DNA), pois é o DNA que contem a informação para proteína da capa protéica.

▫ T4(DNA), com capa proteica de T2, vai dar descendência do tipo T4.

• A mistura fenotípica não é, portanto, uma forma de recombinação genética, pois não se perpetua nos descendentes.

Multiplicação de vírus com DNA de fio Multiplicação de vírus com DNA de fio simples e dos vírus de RNAsimples e dos vírus de RNA

• Fagos T e de E. coli, duplicação circular rolante• X174 tem DNA fita simples e S13 tem 5.500 nucleotídeos

▫ fagos pequenos• Fio simples de DNA, contido na partícula fadiga

▫ denominado + ou plus• Dentro da célula ele insere em sitio na membrana da celula

(1 a 4 sítios por células) aí se duplicam▫ tornando-se RF (forma duplicativa)

• Circular rolante, mais formas RF são produzidas, alem do mRNA que é igual ao fio +, pois é formado a partir de fio – (minus).

• Só uma forma de RF fica junto a membrana e as outras (progênies RF) são liberadas, não mais se duplicam e dão apenas os fios +, que são englobados pelas capas protéicas dos vírus, sendo circularizados pelas ligases.

• Também os fagos fd e M13 tem duplicação semelhante ao X174

Duplicação em vírus ssRNADuplicação em vírus ssRNA• Fagos são constituídos por RNA como MS2,

R17 e Q, que infectam E. coli, ▫possuem apenas de 3 a 5 genes (3.000

nucleotídeos) que codificam a capa protéica, RNA-sintetase necessária a síntese de RNA (uma RNA-polimerase), uma enzima lítica (lisozima) e uma enzima de maturação.

• O 174, possui DNA como material genético, ▫ tem sobreposição de genes ▫grande numero de descendentes por célula

hospedeira (2.000 a 20.000 partículas virais).• Muitos fagos de RNA tem sequencia terminal

CCA, igual a de um tRNA

Figura 2. Mapas genéticos do grupo A e B colifagos RNA. A) Repressão da tradução replicase pela capa protéica. B) Lise da capa proteica tem sobreposição com os genes da replicase.

Fagos de RNA infectando atraves do F-pili de E. coli. Fiers (1975).

Mapa genético vírus M13

Lisogenia• Bacteriófagos temperado, não lisam.• Produzem a lisogenia que vem da persistência do

DNA fago no hospedeiro por muitas gerações • Bactérias lisogênicas podem manter o fago num

processo de parasitismo• Uma cultura lisogênica só pode ser detectada se ela

puder ser induzível (voltar ao ciclo lítico) ou se houver indicadora sensível a ela (não possuidora de fago)

• Uma célula lisogênica é imune ao fago que ela contem.

• Na imunização a célula recebe o DNA viral, mas este é incapaz de se multiplicar

• Na resistência o DNA não é injetado no interior da bactéria, pois faltam receptores específicos

Bacteriófago • Constituído por cadeia dupla de DNA (46.500 nucleotídeos)• Extremidades em fita simples (12 nucleotídeos terminais nas

extremidades 5´)• As projeções dos 12 nucleotídeos são ocmplementares na bactéria

infectada, esse DNA era linear na partícula fadiga e pode circularizar-se pela formação de pontes de H e a presença de enzima DNA-ligase.

• A circularização do DNA do fago o protege contra endonucleases, alem de favorecer a duplicação

• Ocorre por dois estágios▫ Se multiplica e lisa o hospedeiro (ciclo litico)▫ Se insere no cromossomo bacteriano e esse DNA se duplica junto com o DNA do

hospedeiro (lisogenia)

• A opção depende do estado fisiológico da célula, se a célula estiver apta a ser lisogenizada, e se houver região homóloga de pareamento em e no cromossomo de E. coli, produz proteína pela integração do fago através da região de homologia (regiao att) que tem apenas 15 pares de bases homologas no fago e na bactéria.

Genoma do bacteriófago lambda

• Schematic representation of the insertion of the bacteriophage lambda. Note how sib is displaced by the recombination event from the N extended PL promoter open reading frame

Genoma estrutural do bacteriófago lambdaGenoma estrutural do bacteriófago lambda

• Visão geral da função da proteínaVisão geral da função da proteína

• cro, (Controle de Operador de Repressor)▫ inibidor de transcrição, liga-OR3, e OR2 OR1 (afinidade OR3> = OR2 OR1, ou seja, liga-se preferencialmente

OR3).

• cI; (Clear 1)▫ inibidor da transcrição, se liga OR1, OR2 e OR3 (afinidade OR1> = OR3 OR2, ou seja, liga-se preferencialmente

OR1). Em baixas concentrações de blocos o promotor PR (impede a produção de cro). Em altas concentrações regulação baixa produção própria através OR3 vinculativo. Repressor também inibe a transcrição a partir do promotor pL. Susceptível à clivagem por * RecA em células submetidos a resposta SOS.

• cII; (Clear 2)▫ Transcrição ativador. Ativa a transcrição do PAQ, promotores pré e PI. Baixa estabilidade, devido à

suscetibilidade para celulares HflB (FTSH) proteases (especialmente em células saudáveis e células submetidos a resposta SOS).

• cIII; (3 aberto) HflB (FTSH) proteína de ligação, ▫ protege cII da degradação por proteases.

• N; (aNtiterminator) ▫ proteína RNA ligação e RNA polimerase cofator, liga RNA (em locais Nut) e as transferências para o RNApol

nascente que apenas transcreveu o site porca.

• Q; ▫ DNA-proteína de ligação e cofator RNApol, liga-se DNA (em sites da própria universidade) e transferências

para a RNApol inicial. • xis;

▫ (excisão) excisionase e regulador proteína Int, administra excisão e inserção do genoma do fago no genoma do hospedeiro.

• int; ▫ Integração. proteína Int, consegue inserção do genoma do fago no genoma do hospedeiro.

• A, B, C, D, E, F, Z, U, V, G, T, H, M, L, K, I, J;▫ Mostrado em diagrama como a cabeça e a cauda, o código para os genes AF cabeça do fago, ZJ código para

os genes da cauda de fagos. Leitura no sentido horário; proteínas estruturais, a auto-montagem com o genoma do fago em partículas de fago-filhas.

• S, R;▫ Mostrado no diagrama como lise. A ordem mostrada aqui é como encontrado no genoma, a leitura no sentido

horário]; causar a célula hospedeira sofrer lise em concentrações suficientemente elevadas.• OP;

▫ Mostrado no diagrama como O P replicação; funções de replicação de DNA, promove a replicação específica de apenas o fago genoma.

• sib ;▫ não uma proteína, mas uma sequência de DNA vital conservada; forma uma estrutura de loop estável hairpin

no mRNA transcrito além int. Atrai degradação de mRNA por RNAaseIII.• attP;

▫ não uma proteína, mas uma sequência de ADN conservada; ponto de acção da Int. Xis e na integração e excisão do genoma do fago no genoma do hospedeiro. AttB correspondente encontrada no genoma do hospedeiro, no ponto de inserção.

Genoma estrutural do bacteriófago lambdaGenoma estrutural do bacteriófago lambda

Repressor• O repressor encontrado no fago lambda é um exemplo notável do nível de

controlo possível sobre a expressão do gene por um sistema muito simples. • Forma um 'switch binário' com dois genes sob expressão mutuamente exclusivos,

como descoberto por Barbara J. Meyer. ▫ O lambda sistema gene repressor consiste de (da esquerda para a direita no cromossomo):

    cI gene     OR3    OR2    OR1    cro gene

O repressor lambda é um dímero de auto montagem também conhecida como a proteína cI .

• Liga-se o DNA no motivo de hélice-vice-versa-hélice de ligação. • Regula a transcrição da proteína cl ea proteína Cro.• O ciclo de vida de fagos lambda é controlado pela cI e proteínas Cro.• O fago lambda permanecerá no estado lisogénico se proteínas cI predominar, mas vai

ser transformado no ciclo lítico se cro proteínas predominantes.

• Na ausência de proteínas cI, o gene pode ser transcrito cro• Na presença de proteínas de CI, apenas o gene cl pode ser transcrito.• Em alta concentração de CI, transcrições de ambos os genes estão reprimidos.

Inserção do fago • A inserção depende do gene int e do gene xis e o fago

integrado (prófago) volta ao estado autônomo e inicia o ciclo lítico

• A integração ao cromossomo bacteriano pode ser detectada no mapa genético da bactéria

• No cromossomo bacteriano, os genes gal e bio tornam-se mais distantes (o que é evidenciado por menor frequencia de transdução conjunta pelo fago P1), indicando que se insere entre os genes gal e bio.

• A integração de ocorre sempre no mesmo local do cromossomo de E. Coli;

• Por isso produz transdução especifica ou restrita, ao contrario de outros fagos temperado, como pro exemplo , o P1 que inclusive, pode lisogenar sem integração ou se integra a vários pontos do cromossomo, dando transdução generalizada

• A excisão pode ser normal (o DNA de destaca-se do cromossomo de E. Coli sem levar material genético dele) ou anormal, em que o DNA do fago pode levar parte do cromossomo bacteriano, deixando parte do DNA da bactéria.

• Assim pode ocorrer os dg ( defectivo que levam o gene gal) ou db ( defectivo que levam o gene bio).

• Esses defectivos são incapazes de lisogenar, ou infectar novas células, eles necessitam um fago auxiliar (helper)

Excisão do fago