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ENCICLOPÉDIA BIOSFERA , Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.13 n.24; p. 2016

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ASPECTOS MOLECULARES DA ESPERMATOGÊNESE

Raísa Brito Santos1, Luciana Batalha de Miranda Araújo2, Eugênio Gonçalves de Araújo2, Denise Russi Rodrigues3

1. Aluna de mestrado do programa de pós graduação em ciência animal- UFG. E-

mail: [email protected] 2. Professor(a) doutor(a) do programa de pós graduação em ciência animal- UFG 3. Aluna de doutorado do programa de pós graduação em ciência animal- UFG

Recebido em: 03/10/2016 – Aprovado em: 21/11/2016 – Publicado em: 05/12/2016

DOI: 10.18677/EnciBio_2016B_008

RESUMO A espermatogênese é o processo de transformação da espermatogônia em espermatozoide. Este processo é iniciado na vida fetal, que é quando as células germinativas passam por meiose e mitose. O hormônio folículo estimulante (FSH) e os andrógenos influenciam completamente na formação do espermatozoide, estes andrógenos por sua vez são produzidos em resposta ao hormônio luteinizante (LH) nas células de Leydig. A ausência de FSH causa alterações no desenvolvimento e funcionamento das células de Sertoli e células de Leydig na fase fetal de camundongos, e estas alterações são diferentes quando se observa a ausência do FSH no período pré-púbere. Outro hormônio essencial na espermatogênese é o estrógeno, seu papel envolve a regulação da proliferação, apoptose, a sobrevivência e a maturação das células germinativas. A aromatase P450 está envolvida na formação do estrógeno e representa um bom marcador e pode ser utilizado como ferramenta para diagnóstico de fertilidade, devido a isso esta aromatase tem uma função primordial na morfologia testicular, espermatogênese, fertilidade e comportamento sexual dos mamíferos. PALAVRAS-CHAVE : aromatase P450, estrógeno, testosterona

MOLECULAR ASPECTS OF SPERMATOGENESIS

ABSTRACT The spermatogenesis is the process of transformation of spermatogonia in sperm. This process starts in fetal life, when the germ cells undergo meiosis and mitosis. The follicle stimulating hormone (FSH) and androgens completely influence the formation of sperm, these androgens in turn are produced in response to luteinizing hormone (LH) in the Leydig cells. The absence of FSH causes changes in the development and functioning of Sertoli cells and Leydig cells in the fetal stage of mice, and these changes are different when observed in the absence of FSH prepubertal period. Another essential hormone in spermatogenesis is estrogen, its role involves the regulation of proliferation, apoptosis, survival and maturation of germ cells. P450 aromatase are involved in estrogen formation and is a good marker and can be used as a diagnostic tool for fertility due to this it aromatase plays a key

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role in testicular morphology, spermatogenesis, fertility and sexual behavior of mammals. KEYWORDS: aromatase P 450, estrogen, testosterone

INTRODUÇÃO A espermatogênese é o processo de transformação da espermatogônia em

espermatozoide (RUSSEL et al., 1990). Este processo é iniciado na vida fetal, quando as células germinativas passam por meiose e mitose (WESTERN et al., 2008). Após o completo desenvolvimento embrionário do animal, a espermatogênese é dividida em fases proliferativa, meiótica e espermiogênica. Na primeira fase as espermatogônias do tipo A, espermatogônias intermediárias e espermatogônias do tipo B sofrem sucessivas divisões mitóticas originando o espermatócito em pré-leptóteno. Na fase meiótica esta célula será multiplicada por meio de divisões meióticas e o resultado será uma célula haploide, o espermatócito. Na fase espermiogênica o espermatócito passará por várias transformações morfológicas, como desenvolvimento do flagelo e do acrossomo, e dará origem ao espermatozóide (RUSSEL et al., 1990).

Falhas na espermatogênese podem ocorrer em cada fase de desenvolvimento, e estas podem ser provocadas por fatores internos ou externos que afetam diretamente as células germinativas ou seu mecanismo de regulação. Inúmeros genes e proteínas estão envolvidos no controle da espermatogênese, a alteração destes pode resultar em azoospermia, oligozoospermia, teratospermia. (JAN et al., 2012).

O processo de formação do espermatozoide depende completamente do hormônio folículo estimulante (FSH) e dos andrógenos que são produzidos em resposta ao hormônio luteinizante (LH). Estes hormônios agem por meio de diversos receptores nas células alvo (espermatogônias, espermatócitos, espermátides e células de Sertoli) (O'SHAUGHNESSY, 2014). Cada receptor tem uma base molecular distinta e mecanismo de ativação específico. Os receptores de andrógenos ao serem ativados passam por uma translocação nuclear, aumento de fosforilação, formação de homodímeros e interação com o DNA. (LI & AL-AZZAWI, 2009).

A aromatase P450 está envolvida na formação de estrógenos e representa um bom marcador a ser utilizado como ferramenta para diagnóstico de fertilidade e, além disso, ajuda a compreender o papel fisiológico de estrogênios na capacitação e/ou a sobrevivência de espermatozoides. São expressas não só em células de Leydig ou células de Sertoli, mas também em células germinativas em roedores e humanos, qualquer que seja a fase de desenvolvimento; consequentemente, a caracterização dos promotores e a regulação dos genes da aromatase são de grande importância (LAMBARD et al., 2005). Algumas patologias reprodutivas ainda não são bem descritas, um exemplo são as diversas causas de criptorquidismo, uma delas é provavelmente relacionada com a falha na expressão de receptores de estrógeno testicular que ainda não está completamente esclarecida. Fato que evidencia a importância de mais estudos no assunto (HERMANOWICZ et al., 2005). A reprodução assistida é uma potente ferramenta na conservação de espécies ameaçadas, porém os protocolos para criopreservação de sêmen são altamente espécie-específicos, e para a grande maioria das espécies tais protocolos ainda não existem. São descritas técnicas de fertilização em elefantes africanos e em diversos felinos selvagens, porém a carência de informações para o grande

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número de animais ameaçados é enorme; o morcego banana (Neoromicia nanus) é um exemplo, em que já se conhece a morfologia espermática, mas ainda não se sabe como fatores externos, como a latitude, podem influenciar em sua reprodução. (MERWE & STIRNEMANN, 2007; COMIZZOLI & WILDT, 2012; HERMES et al., 2013).

A espermatogênese é fundamental para a manutenção da diversidade genética e perpetuação da vida, e sua regulação molecular é complexa. Assim, para o profundo entendimento de todos os eventos é necessária elucidação dos elementos e mecanismos envolvidos. Neste trabalho objetiva-se descrever os eventos moleculares acerca da espermatogênese.

DESENVOLVIMENTO

Hormônios gonadotróficos

Hormônio folículo estimulante (FSH)

O FSH é uma gonadotrofina produzida e secretada pelas células gonadotrópicas da parte anterior da glândula pituitária e é composto por subunidade α e β. Sua liberação ou inibição é modulada pelo GnRH, que é produzido no hipotálamo e chega à pituitária através da circulação sanguínea (Figura 1) (BERNARD et al., 2010).

FIGURA 1- Esquema de liberação e inibição de FSH.

Adaptado de ALVES et al., (2012) Além dos pulsos de GnRH existem proteínas estimuladoras (Ativinas) e

inibidoras (Inibinas e Folistatinas) que regulam o FSH. Porém observa-se que a frequência destes pulsos de GnRH também determina a quantidade destas

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proteínas, principalmente a folistatina, na pituitária. O aumento da produção do FSH não é acompanhado pelo aumento das proteínas estimuladoras ou pela diminuição das proteínas inibitórias. A circulação de ativina (A e B) sofre inibição hipotalâmica, mas os mecanismos desta inibição ainda não são conhecidos. Uma das sugestões refere-se à regulação dos pulsos de GnRH pela presença de proteínas inibitórias e regulatórias. (SHARMA et al., 2012).

A folistatina é a proteína responsável pela inibição de FSH por promover a adesão de moléculas de ativina, tornando-as inativas. Em fetos de ratos não se observa a presença de folistatina, e duas hipóteses foram propostas para esta ausência: a primeira pressupõe a necessidade de ativina para a correta formação do tecido testicular, e a segunda, de forma antagônica, pressupõe que a forma bioativa da ativina não é produzida no período fetal, não havendo, portanto, necessidade de folistatina. No período pós-natal a expressão de folistatina é detectável nas células de Leydig, apesar de serem estas ainda pouco desenvolvidas e não necessitarem, teoricamente, deste tipo de regulação (MAJDIC et al., 1997).

É observada, ainda, imunoexpressão de subunidades α e β de inibina/ativina nas células de Leydig de testículos em fase fetal de ratos, sugerindo que estas proteínas possam desempenhar um importante papel autócrino ou parácrino nesta fase de desenvolvimento. Já em humanos as subunidades de inibina e ativina no testículo de fetos são detectadas tanto em células de Sertoli quanto nas células de Leydig, que pode ser explicado pelas diferenças na duração do desenvolvimento gonadal em roedores e primatas (Figura 2) (MAJDIC et al., 1997).

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FIGURA 2- Produção cíclica de ativina e inibina comparada ao ciclo do epitélio

seminífero do rato. O ciclo consiste em 14 estádios de aproximadamente 12 dias. A espermiação acontece no estádio VIII. A sombra verde indica a forte expressão dos antagonistas de ativina, folistatina e bambi no epitélio seminífero. Fonte: Adaptado HEDGER & WINNALL (2012)

A proteína SMAD (Figura 3) e o fator de transcrição FOXL2 trabalham

regulando a subunidade β do FSH (FSH β) via ativina em murinos. O FOXL2 estimula a ativina por meio da SMAD2, SMAD3 e SMAD4. A ligação destas ao FOXL2 é necessária para a transcrição do FSH β, e a ativina A é indispensável para a

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indução deste processo. Dada a estabilidade deste promotor, supõe-se que ele funcione como mediador `a estimulação da transcrição do FSH β na maioria das espécies de mamífero. Mais trabalhos são necessários para definir como a ligação FOXL2 / SMAD modifica a estrutura da cromatina e promove a iniciação da transcrição (TRAN et al., 2011).

Cada célula de Sertoli suporta um número fixo de células germinativas e consequentemente estas mensuram a capacidade de produção espermática, por isso é necessária a elucidação dos mecanismos de regulação destas e o FSH está diretamente relacionado a estes mecanismos (RIERA et al., 2012). Em ratos o FSH tem algumas funções nas células de Sertoli que incluem: indução da rápida proliferação em fetos, inibição da apoptose e formação de esteroides em neonatos e diferenciação em animais com 21 dias de nascidos. Sugere-se que essa diferença de atuação do FSH nas diferentes fases da vida do animal esteja relacionada ao fato de haver diferença na quantidade de receptores (muito maior em ratos imaturos), regulação e sinalização de genes. O FSH inicia suas ações fisiológicas pela estimulação intracelular do segundo mensageiro cAMP, este por sua vez é dependente da PKA, uma proteína fosforiladora que implica na proliferação das células de Sertoli, e que apresenta como modulador a proteína PKI. A IL-6 também está envolvida, por mecanismos autócrinos, na regulação do crescimento das células de Sertoli. Portanto, o FSH regula a formação de PKI e IL-6 e estes alterando a mobilização de cálcio controlando, assim a proliferação das células de Sertoli. (DAHIA & RAO, 2006).

Há uma tendência ao aumento de inibina B em homens com a espermatogênese alterada. Este fato torna-se evidente ao se observar mais homens com oligozoospermia e altos níveis de inibina B do que homens com oligozoospermia e aumento do FSH. Há evidências de que os altos níveis de inibina B afetam não somente as células de Sertoli, mas também as células germinativas. (MEDRAS et al., 2010).

A ausência de FSH causa alterações no desenvolvimento e funcionamento das células de Sertoli e células de Leydig na fase fetal de camundongos, e estas alterações são diferentes quando se observa a ausência do FSH no período pré-púbere. Em camundongos knock-out para genes reguladores de receptores de FSH (subunidades α e β), o número células de Sertoli e seu índice proliferativo são muito diminuídos em animais recém-nascidos, sugerindo que este hormônio induza, na fase fetal, a atividade proliferativa das células de Sertoli. A claudina 11 é uma proteína de membrana expressa em células de Sertoli e pode ser utilizada como marcador do desenvolvimento das junções GAP. Esta proteína encontra-se reduzida em células de animais recém-nascidos que não possuem receptores de FSH, indicando o efeito fisiológico deste hormônio nas células de Sertoli. As altas concentrações de testosterona e a expressão de P450c17 sugerem que o FSH sinalize o controle das células de Leydig durante a vida fetal no rato através da secreção de fatores parácrinos, modulando a função destas células. Ao contrário do que se pensava o FSH não controla o desenvolvimento do testículo no feto de camundongos (MIGRENNE et al., 2012).

Camundongos com anticorpos anti-FSH mostram uma exagerada apoptose nas células espermatogênicas associada à ocorrência de células anormais. Células de Sertoli em apoptose ou células de Leydig não são observadas. Os mecanismos que fazem com que o anticorpo anti-FSH promova apoptose das espermatogônias são detectados através da expressão do Bax e Bcl-2, dois reguladores mitocondriais críticos no mecanismo de apoptose (YAO et al., 2012).

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Em peixes jovens os níveis de FSH do plasma sanguíneo são baixos, mas aumentam significativamente no começo da espermatogênese em machos adultos, com uma alta ocorrência de espermatogônias e espermatócitos no testículo. Quando o número de espermatócitos diminui, o nível plasmático cai significativamente, diminuindo ainda mais no período de máxima espermiação. A localização do receptor FSH nos testículos dos animais jovens é expressa nos prolongamentos de células intersticiais e não é expressa nas células de Sertoli primordiais. (CHAUVIGNÉ et al., 2014).

Em camundongos adultos com deficiência na produção desta gonadotrofina observa-se um volume testicular diminuído, uma severa interrupção na progressão do desenvolvimento dos espermatócitos na fase de paquíteno, ausência de espermátides, e poucas células de Leydig com um espaço intersticial aparente. Quando tratados com FSH por sete dias há um significante aumento do volume testicular juntamente com o peso da vesícula seminal. Os animais apresentam aumento do diâmetro dos túbulos seminíferos, com o lúmen do túbulo estabilizado e aumento do número de células germinativas. Os níveis de testosterona também se elevam em animais submetidos ao tratamento por oito dias. Não há interação no fenótipo do animal em relação aos efeitos do FSH, porém o número de espermatogônias e espermatócitos aumenta após o tratamento, e há indução do desenvolvimento de espermátides redondas. (O’SHAUGHNESSY et al. 2010)

Hormônio Luteinizante (LH)

O Hormônio luteinizante (LH) é um homodímero composto por subunidade α e

β produzido pela glândula pituitária e sua principal função é regular as células de Leydig (LEI et al., 2004). O aumento exagerado de LH juntamente com baixos níveis de Inibina B estão relacionados com uma baixa na concentração de espermatozoides e anormalidade morfológica destes (MEEKER et al., 2007).

A sinalização de LH é necessária para a formação de células de Leydig adultas, e também para a migração de monócitos e a sua diferenciação em macrófagos nos testículos. Animais knockout para o receptor de LH mostram nível de testosterona testicular drasticamente diminuído, devido a alteração causada nas células de Leydig. Assim, pode se observar testículos abdominais, micropênis perineal, testículos pequenos e espermatogênese retardada. Ao exame histológico e quantificação é revelado tamanho e área de túbulos seminíferos diminuídos e lúmen tubular obstruído. No entanto, observa-se o mesmo número de células de Sertoli e espermatogônias. O número de espermatócitos e espermátides arredondadas passa por diminuição e as espermátides alongadas são totalmente ausentes (LEI et al., 2004).

A ausência dos receptores de LH altera também a proliferação de células, tornando-as defeituosas e com diminuição da expressão de alguns, mas não todos os genes associados a descida testicular, resultando em camundongos criptorquidas. A falha no desenvolvimento é devido a uma diminuição na proliferação de células mesenquimatosas, causando um defeito na diferenciação das células musculares e de maturação tardia. Os animais tratados com testosterona por 21 dias apresentam um aumento nesta proliferação celular, diferenciação das células musculares e maturação do músculo cremáster. Isso reafirma a função do LH na produção de testosterona e que esse é um fator determinante para a descida testicular (YUAN et al., 2006).

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Embora a estimulação de LH seja necessária para o desenvolvimento normal dos testículos e para o estabelecimento do número normal de células de Leydig, não é absoluta sua primordialidade. A secreção de andrógenos pelas células de Leydig fetais não depende do LH completamente, pode-se dizer que é controlada também por outros fatores. Assim, mesmo que a produção de testosterona seja afetada nos animais knockout para receptores de LH, pode ser que não afete totalmente a morfofunção do testículo. Existe uma resposta bifásica à sensibilidade do LH, a primeira pouco conhecida e a segunda com dados bem consolidados. A primeira fase se caracteriza por uma resposta independente a andrógenos e a segunda fase é dependente a resposta da testosterona. Verifica-se que na ausência de LH as células de Leydig são reguladas pelo gene Thbs2 (GRIFFIN et al., 2010).

O hCG pode induzir a espermatogênese qualitativamente completa em ratos deficientes dos hormônios gonadotrópidos, mimetizando a função do LH. Além disso, pode também estimular o desenvolvimento das células de Leydig. Com a exceção de espermatogônias, os efeitos testiculares das doses máximas de hCG são idênticos aos os efeitos do tratamento com testosterona. O hCG sozinho também estimula a maturação das células de Leydig e mantém o conteúdo intratesticular normalizado (SPALIVIERO et al., 2004).

Estrógeno

O papel do estrógeno na espermatogênese envolve proliferação, apoptose, a sobrevivência e a maturação das células germinativas, e estas funções têm descrição recente e são muito mais complexas do que se imaginava. A regulação destes mecanismos abrangem receptores de membrana, genes, ERα, β, γ e várias isoformas de ERs. Além disso, deve-se ter em mente que ao contrário dos espermatozoides dos roedores, os espermatozoides dos humanos expressam uma aromatase funcional e ativa após a ejaculação, e em conjunto com a presença de ERs e especialmente na mitocôndria dos espermatozoides (CARREAU et al., 2011).

A isoforma ESR1 é expressa no núcleo de células de Sertoli de ratos imaturos e adultos, células de Leydig, células mióides e algumas espermátides, enquanto a isoforma ESR2 é detectada em células de Sertoli e células de Leydig, não estando presentes nas células germinativas. O E2 induz a translocação de ESR1 e ESR2 dos núcleos para a membrana plasmática das células de Sertoli, além das modificações pós-traducionais de ESR1 pela palmitoilação. É muito provável que o estrogênio não apenas influencie a diferenciação de células de Sertoli, como também atuam sendo um agente indutor de mitose nesta proliferação celular durante o período neonatal. A ação do E2 em efetuar a translocação de ESR1 e ESR2 para a membrana plasmática é mediada pela SRC tirosina-quinase receptora e ativação de EGFR e via de sinalização MAPl (LUCAS et al., 2008). A proteína GPR30 e os receptores ER α/β também estão envolvidos na proliferação das células de Leydig e agem via transdução de sinal, sendo ativados pela ERK via EGFR (Figura 4) (GE et al., 2014).

Na gametogênese fetal / neonatal do homem o estrógeno exerce seus efeitos via ERβ, enquanto o ERα não parece estar envolvido, pois a sua inativação não demonstra nenhum efeito sobre o desenvolvimento de células germinativas. Animais neonatos knockout para ERβ apresentam muito mais gonócitos do que neonatos normais, pois os estrógenos endógenos inibem fisiologicamente o crescimento de células germinativas durante o desenvolvimento fetal / neonatal em ratos. Eles não têm efeitos sobre as células de Sertoli e atuam diretamente sobre as células

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germinativas. Já o número e atividade das células de Leydig é afetado pela inativação do ERβ (DELBÈS et al., 2003).

A aromatase é uma enzima conversora de andrógenos em estrógenos. Em pacientes com tumor de células de Leydig a aromatase é localizada no citoplasma das células de Leydig e a marcação é mais forte em casos avançados da neoplasia. Estes pacientes apresentam um aumento dos níveis de estrógeno circulante, resultando também em baixos níveis de testosterona. Apresentam também um aumento moderado de contagem de espermatozoides e um aumento da motilidade do sêmen (CARPINO et al., 2012). Além disso, estes elevados níveis de estrógenos podem provocar a feminização do indivíduo. Esta desregulação na síntese de estrogênio pode ser causada pelo aumento dos níveis do promotor de transcrição da aromatase (gene CYP19 II) e pelo o aumento do fator esteroidogênico 1 (STRAUME et al., 2012).

FIGURA 4- Mecanismo de ação do estrógeno nas células de Sertoli.

Interação do estrógeno com indução nuclear e translocação do ESRs, ativação do SRC, com fosforilação e ativação do EGFR, ativação do MAPK3/1 e os genes de transcrição envolvidos (Setas pretas). (LUCAS et al., 2011).

Pacientes com uma mutação no gene CYP19 tratados por três meses com

estradiol revelaram um aumento da contagem de espermatozoides, mas uma diminuição da motilidade espermática, sendo que antes apresentavam a ausência de aromatase com oligozoospermia, vitalidade normal, motilidade espermática reduzida, e morfologia espermática normal. Após seis meses de tratamento com estradiol a contagem espermática, bem como o número de espermatozoides e

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morfologia, apresentou-se normal, porém a motilidade diminuiu, o que pode estar relacionado aos baixos níveis de testosterona induzidos pelo excesso de estradiol (HERRMANN et al., 2002).

As células germinativas representam uma fonte adicional de estrógenos no rato macho adulto, porém o excesso destes estrógenos regula negativamente a expressão das aromatases em espermatócitos em paquíteno e espermátides arredondadas. Além disso, a testosterona e o estradiol também regulam esta expressão. A primeira controla positivamente através da indução do aumento da quantidade de RNAm da aromatase P450. Já o estradiol provoca um efeito oposto. Este efeito inibitório do estradiol na expressão do gene da aromatase é anulado na presença do antagonista de ER, ERICI 182.780. Este antagonista de ER não afeta a indução da testosterona na expressão do gene aromatase, o que sugere que a testosterona e o estradiol usam vias de sinalização distintas para direcionar estes mecanismos de expressão (BOURGUIBA et al., 2003).

Andrógenos

Os mecanismos pelos quais andrógenos regulam a espermatogênese em mamíferos não estão completamente elucidados, uma vez que os locais de ação dos andrógenos ainda não são totalmente esclarecidos, e além destes, os mecanismos moleculares e intracelulares de controle, da barreira hematotesticular por exemplo, também necessitam de mais estudos. Algumas de suas ações estão demonstradas na figura 5 (BOURGUIBA et al., 2003; SU et al., 2010).

FIGURA 5- Ação molecular dos andrógenos na espermatogênese. O

desenvolvimento das células germinativas estão indicados nas estruturas azuis. O microtúbulos e filamentos intermediários em verde e azul escuro, respectivamente. Junções intercelulares em roxo e por fim em vermelho especializações ectoplásmicas. Fonte: Adaptado de VERHOEVEN et al.,( 2010)

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A testosterona, que é um dos andrógenos, e algumas citocinas regulam a

integridade da barreira hematotesticular. Esta regulação ocorre pelo equilíbrio entre a cinética de endocitose de proteínas e pela reciclagem e destinação das mesmas. Os andrógenos são produzidos pelas células de Leydig, que estão no interstício testicular, e exercem os seus efeitos através de ARs específicos que se encontram nas células de Sertoli. A célula de Sertoli é um dos principais alvos da ação dos andrógenos, em particular na fase VIII do ciclo do epitélio seminífero de ratos, quando ocorre a espermiação. Os andrógenos facilitam o transporte de proteínas da superfície da membrana celular para o citosol, bem como sua reciclagem a partir do citosol de volta para a superfície da célula. Esta contínua síntese de novas proteínas da barreira hematotesticular ocorre para facilitar a acomodação do movimento celular durante a espermatogênese (YAN et al., 2008).

A ação dos andrógenos sobre AR de células de Sertoli tem efeitos significativos sobre a estrutura destas células, porém não atuam na ação da testosterona no bloqueio da diferenciação de espermatogônias em camundongos jovens com depleção das mesmas (WANG et al., 2009). Já a ablação seletiva do AR em células de Sertoli afeta a sua maturação, resultando em atraso e formação incompleta da barreira hematotesticular. O padrão de expressão de vários genes relacionados com a adesão celular e o desenvolvimento do citoesqueleto em células de Sertoli é modificado. Mostra diferenças nos níveis de transcrição de elementos de junção como a claudina 11, que é conhecida por ser essencial para a formação da barreira hematotesticular (WILLEMS et al., 2010).

Os andrógenos não só afetam o nível de expressão de moléculas de junção, mas também a sua distribuição e localização. Há um paralelismo entre a formação da barreira hematotesticular e o inicio da meiose, logo os andrógenos podem afetar o desenvolvimento da espermatogênese por afetar a barreira. Um dos defeitos observados em células de Sertoli com ausência de AR é a incapacidade do núcleo em assumir sua posição normal perto da lâmina basal. Além disso, esta célula não suporta a formação completa da barreira hematotesticular e a progressão das células germinativas através da meiose (WILLEMS et al., 2010).

Os andrógenos estimulam a produção de aromatase em espermatócitos em paquíteno e espermátides arredondadas, e esta é conhecida por catalisar a formação de estrógenos e andrógenos. Verifica-se a presença do mRNA dos receptores de andrógenos em células germinativas, sugerindo a transcrição deste receptor nestas células. Além disso, observa-se também estes receptores interagindo com uma proteína específica do testículo (ARIP3) localizada no núcleo de células de Sertoli, espermatogônias e espermatócitos (BOURGUIBA et al., 2003). São observados os receptores também nas zonas nucleares das células de Sertoli, células mióides peritubulares e células de Leydig em testículo, e em ambas as células epiteliais e intersticiais de epidídimo (ZHU et al., 2000).

O LH estimula a produção de testosterona nas células de Leydig, animais suprimidos para a produção deste apresentam encolhimento dos testículos e epidídimo, espermatogênese paralisada, e morte de células germinativas. Já com a reposição androgênica com 7α-methyl-19-nortestosterona (MENT) há aumento do peso dos testículos e recuperação da espermatogênese. O FSH também é um importante regulador da expressão de receptores de andrógenos em células de Sertoli. A regulação hormonal da expressão dos receptores de andrógenos nucleares é específica para cada tipo de célula. O FSH, por exemplo, permite que as

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células de Sertoli responda a estimulação pelos andrógenos, porém este fato não se aplica ás células de Leydig e células mióides (ZHU et al., 2000).

A DAX-1 é um gene que representa uma fase do mecanismo regulatório da estereoidogênese nas células de Leydig, e é regulado pela insulina. Animais tratados com insulina por 10 dias tem os receptores cAMP das células de Leydig ativados pela indução da DAX-1, que são mediados pelo receptor nuclear LRH-1, ativando, assim, os receptores ligados a redução dos níveis de esteroides nos testículos. Esta redução não é acompanhada da diminuição dos níveis de LH ou FSH, pois estes receptores são sinalizados de diferentes formas (AHN et al., 2013).

As células de Leydig, principais produtoras de andrógenos, tem capacidade de regeneração, uma vez que quando destruídas novas células se diferenciam com características parecidas às células de origem fetal. Nestas situações as concentrações de testosterona aumentam, o que pode estar relacionado à sensibilidade das células novas ao LH. As células germinativas são resistentes às mudanças abruptas nas concentrações de testosterona, uma vez que nos primeiros dias de queda do número das células de Leydig não se observam alterações na morfologia geral das mesmas, exceto nos espermatócitos em paquíteno do estádio VII e VIII. Em ratos, observa-se que os níveis séricos de FSH e LH aumentam significativamente três dias após a remoção das células de Leydig, e o FSH permanece elevado até seis semanas seguintes (BARTLETT et al., 1986).

Existem duas fases de sensibilização de receptores de andrógenos durante a espermatogênese. A primeira ocorre nos estádios finais de diferenciação das espermátides e a segunda, que caracteriza-se pela ausência de sensibilização nas células de Sertoli, ocorre durante a transição das células arredondadas para alongadas na espermatogênese. O papel primordial da função dos andrógenos é regular a adesão das espermátides em células de Sertoli. Por outro lado, os andrógenos são necessários para a espermiação e liberação dos espermatozoides para o lúmen do túbulo, sendo importantes para a progressão normal da meiose. Há a hipótese dos andrógenos regularem a orientação dos espermatozoides para fora dos túbulos seminíferos através de células mióides peritubulares, já que estas expressam receptores para estes hormônios em todos os estádios da espermatogênese (HOLDCRAFT & BRAUN, 2004).

As especializações ectoplásmicas (ES) são estruturas de adesão das células de Sertoli relacionadas à espermátides em fase VIII. Quando o nível de testosterona testicular é reduzido, o número de ES permanece normal, indicando que estas estruturas são independentes deste hormônio. Outras moléculas de adesão são reguladas pela testosterona na barreira hematotesticular, como a ocludina e a claudina, porém outros estudos são necessários para saber exatamente como ocorre esta interação (O'DONNELL et al., 2000; SU et al., 2010).

A ligação ao AR pode ativar uma reação de transcrição de andrógenos em células de Sertoli levando a mudanças na expressão do gene e na transdução de sinal. No entanto, a forma pela qual os andrógenos / AR atuam nas células de Sertoli e, consequentemente, afetam a diferenciação de células germinativas, é em grande parte desconhecida. Os andrógenos podem regular o microambiente do epitélio seminífero, influenciando um amplo espectro de alterações genéticas nas células de Sertoli. As perdas de AR especificamente nestas células podem afetar: � a função de suporte para a movimentação e desenvolvimento de células germinativas; � junções intercelulares, prejudicando a integridade funcional da barreira hematotesticular; � proteases específicas de células de Sertoli, proteínas de transporte e produção e/ou secreção de fatores parácrinos, levando a deficiência

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nas funções das células de Sertoli no desenvolvimento células germinativas (WANG et al., 2006).

Os andrógenos, assim como o estrogênio, são formados a partir do colesterol, na mitocôndria. São sintetizados a partir da remoção da uma cadeia lateral de carbonos e introdução de átomos de oxigênio, sendo o processo catalisado por oxidases de reação mista que empregam o NADPH, O2, e o citocromo mitocondrial P450.

(NELSON & COX, 2014).

Aromatase P450

O citocromo P450 que pertence ao grupo das aromatases tem uma função primordial na morfologia testicular, espermatogênese, fertilidade e comportamento sexual dos mamíferos. Este é traduzido em uma proteína biologicamente ativa capaz de transformar andrógenos em estrógenos em várias espécies de mamíferos. A expressão da aromatase é regulada pelo promotor II nas células de Sertoli, Leydig e do epitélio seminífero de rato (BOURGUIBA et al., 2003).

A expressão da aromatase em sêmen é um marcador para a sua qualidade. Nos búfalos (Bubalus bubalis) há maior expressão do citocromo P450 aromatase em espermatozoides obtidos a partir de boas amostras (alta motilidade), em comparação com espermatozoides obtidos de amostras de má qualidade (baixa motilidade). Do mesmo modo, a expressão do citocromo P450 é significativamente mais elevada em espermatozoides móveis, em comparação com os espermatozoides não móveis. Assim sugere-se que a expressão mais elevada do RNAm da aromatase em espermatozoides móveis, podem ter papel importante na função do espermatozoide, particularmente para o aquisição de motilidade (TIWARI et al., 2008).

Os perfis de aromatase em testículos acompanham os aumentos de E2 (estrógeno) durante o desenvolvimento testicular. A aromatase P450 e o E2 são observados nas células ao longo dos túbulos seminíferos. (OSADAA et al., 2004). Em ratazanas observa-se marcação para aromatase na cabeça do espermatozoide e, com menor frequência, na região proximal da cauda. A presença de receptores para estrógeno é observada na extremidade da cabeça. A análise quantitativa da área total ocupada pela aromatase é de 11,3% da região proximal da cabeça, ao passo que AR, ER α e β ocupam 7,2%, 5,9%, e 4,7% da área, respectivamente. Adicionalmente, a aromatase ocupa cerca de 41 % da região de cauda dos espermatozoides (BALAK et al., 2012).

A enzima 3βHSD, que assim como a P450 também é uma enzima esteroidogênica, é observada em pequenos grupos de células de Leydig imaturas de equinos pré-púberes, e sua intensidade aumenta de acordo com a idade do animal. Além disso, esta enzima pode ser observada em células de Sertoli de animais pré-púberes, mas não em células de Sertoli de animais pós-púberes ou adultos, sugerindo que as células de Leydig são a principal fonte da síntese de novos de esteroides nos testículos. Contudo, a 3βHSD também é localizada no interior do túbulo seminífero de testículos pré-púberes, indicando que o túbulo seminífero também pode estar envolvido na biossíntese de andrógenos (ALMEIDA et al., 2011).

Animais que apresentam mudanças sazonais na espermatogênese mostram também a expressão da P450 alteradas, assim como o tamanho e peso dos testículos. Os esquilos selvagens do campo (Citellus dauricus Brandt), por exemplo, no período de abril a maio, apresentam células do ciclo do epitélio seminífero completo, desde as espermatogônias até os espermatozoides, enquanto nos meses de agosto e setembro observa-se somente espermatócitos primários e

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espermatogônias. Nos meses de abril e maio a enzima P450 c-17 é expressada em espermátides e células de Leydig, e a aromatase P450 em células de Leydig, células de Sertoli, espermatogônias, espermatócitos primários e secundários e espermátides. Nos meses de agosto e setembro a primeira só é expressa em células de Leydig e a segunda não é detectada. Finalmente, nos meses de abril e maio o tamanho e o peso dos testículos encontra-se aumentado, e reduzido em agosto e setembro (ZHANG et al., 2010).

O guaxinim (Procyon lotor) também é um animal de reprodução sazonal e se reproduz no período de frio intenso no Japão (janeiro a março). No verão é observada inatividade da espermatogênese nestes animais, com ausência de espermatozoides nos túbulos seminíferos ou na cauda do epidídimo. Neste período também não se observa a presença da aromatase P450, mostrando o importante papel na manutenção deste processo (OKUYAMA et al., 2014).

Homens com altos níveis de FSH e LH, baixos níveis de inibina B, falha nas células de Leydig e na espermatogênese apresentam um aumento na relação estrógeno / testosterona aliado a um aumento da aromatase P450. Sabendo-se que a aromatase contribui nas alterações desta relação entre estrógeno e testosterona, sugere-se que o aumento da aromatase contribua para o aumento de estrógeno e consequente falha na função esteroidogênica das células de Leydig (LARDONE et al., 2010).

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os hormônios regulam direta ou indiretamente o desenvolvimento da

espermatogênese. Seu mecanismo é iniciado desde o hipotálamo que regula a secreção dos hormônios hipofisários (LH e FSH) pela modulação dos pulsos de secreção do GnRH, e estes atuando nas gônadas.

Estes hormônios sinalizam para a produção de testosterona pelas células de Leydig, regulam funções das células de Sertoli, entre elas a sustentação das espermatogônias, composição da barreira hematotesticular, influenciando até mesmo na meiose das células germinativas. Todas essas reações envolvem diversos genes, proteínas e enzimas, localizadas em diferentes células do tecido gonadal. Sofrem interferência de fatores relacionados ao próprio animal, como diferenças em vias de produção de certos hormônios e também de fatores externos como o bisfenol A que altera diversos mecanismos moleculares da espermatogênese.

O conhecimento desta cascata de regulação é imprescindível para a perpetuação das espécies, visto que fatores diversos podem alterar tais mecanismos inviabilizando a reprodução animal e humana. Algumas enzimas funcionam como indicadores de fertilidade do sêmen, como a enzima P450, podendo futuramente funcionar como um marcador molecular, preciso e eficaz na detecção de animais excelentes para reprodução.

Visto isso, mais estudos são necessários acerca de cada passo desta regulação, a fim de que futuramente o processo reprodutivo seja otimizado e menos oneroso tanto em termos econômicos quanto energéticos, visto que os animais silvestres passam diversos obstáculos, naturais ou antropomórficos, para efetivar o processo reprodutivo.

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recebido em: 03/10/2016 – aprovado em: 21/11/2016 ... moleculares.pdf · outro hormônio...

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