rafael ciro marques cavalcante - teses.usp.br · dissertação apresentada ao programa de...

1

Rafael Ciro Marques Cavalcante

Desenvolvimento de estratégias vacinais contra tumores induzidos pelo

Vírus do Papiloma Humano tipo 16 (HPV-16) baseadas em linhagens

geneticamente modificadas de Bacillus subtilis

SÃO PAULO 2008

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas.

2

Rafael Ciro Marques Cavalcante

Desenvolvimento de estratégias vacinais contra tumores induzidos pelo

Vírus do Papiloma Humano tipo 16 (HPV-16) baseadas em linhagens

geneticamente modificadas de Bacillus subtilis

SÃO PAULO

2008

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas. Área de concentração: Microbiologia Orientador: Prof. Dr. Luís Carlos de Souza Ferreira

3

Este trabalho foi realizado sob a orientação da Prof. Dr. Luís Carlos de Souza

Ferreira, no Centro de Vacinas e Terapia Gênica (CEVAT-GENE 3), no

Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade de São Paulo, com o apoio financeiro da CAPES.

4

Dedico aos meus Pais, por todo

apoio e pela incessante torcida.

5

AGRADECIMENTOS

Quero, nesse espaço que me é reservado, demonstrar minha

gratidão a todos que de maneira solíscita ajudaram-me na execução e

confecção do presente trabalho. Tenho a alegria de ter contado com a

colaboração e com o entusiasmo de muitas pessoas, sem as quais a

conclusão do presente trabalho não seria possível.

Inicialmente, quero agradecer ao meu orientador Prof. Luís Carlos

de Souza Ferreira. Professor, melhor seria definí-lo como educador, que

com maestria e notável dedicação, propocionou-me dois anos de

aprendizado científico, bem como, de marcante amadurecimento pessoal.

Agradeço pela oportunidade inicial concedida, pela paciência com os erros,

pela confiança depositada e pelas, não raras, oportunidades de

aprendizado. Espero que o professor Luís continue trabalhando dessa

forma, no intuito de termos um país produtor de tecnologia e conhecimento,

menos dependente e, sobretudo, sem desigualdades sociais tão

expressivas.

Agradeço à Profa. Rita de Cássia Café Ferreira, pela oportunidade

de estágio em seu laborátório, pelos conhecimentos científicos

compartilhados, pelo apoio nos momentos difíceis e pela preocupação

constante com o bem-estar de todos no laboratório. Agradeço-a ainda,

pelas várias oportunidades de aprendizado e enriquecimeto profissional e

pessoal.

Agradeço à Dra Maria Elizabete Sbrogio de Almeida pela ajuda nos

experimentos envolvendo animais e, sobretudo, pela sua paciência de

transmitir parte de seus conhecimentos com tanta calma e compreensão.

Agradecimento especial à minha mãe, Maria Amélia Marques

Cavalcante, um exemplo de ser humano puro, sensível e amável.

Agradeço-a por apoiar-me, incondicionalmente, nessa empreitada com

alegria e fortaleza, mesmo nos momentos em que esteve triste ou

6

desmotivada. Sou-lhe grato também por dividir comigo esse sonho

conquistado hoje.

Agradeço ao meu pai, Francisco de Assis Barroso Cavalcante, que

transmitiu-me segurança e fortaleza para olhar sempre em frente e encarar

dificuldades como etapas necessárias ao triunfo final. Agradeço-o também

pelos ensinamentos e experiências de vida transmitidos, sem os quais

seria, pelo menos, árduo viver.

Agradeço aos meus írmãos Diego e Raissa pelas palalavras de

apoio e afeto, principalmente, nos momentos mais difíceis.

Agradeço aos meu tios João Marques Pereira e José Marques

Pereira, pelo entusiasmo e pela dedicação com a qual encaram o trabalho,

fatos que me fizeram optar pela carreira acadêmica.

Agradeço à minha avó materna, Maria do Socorro Pereira, por todo

seu apoio e por ser um verdadeiro exemplo de vida.

Agradeço aos meus Amigos de infância Lairton Pereira Marinho e

Alexandra Marinho por todo seu entusiasmo e apoio.

Agradeço à minha namorada Martha Priscilla pela paciência e

comprrensão durante a execução desse trabalho, bem como, pelo

incessante apoio e carinho.

Agradeço aos meus amigos da época do colegial: Rodrigo Moreira,

Raimundo Paulino, Kildery Maciel, Carliandro Cavalcante, Rafaela Araújo e

Aretah Araújo pelo estímulo inicial e por torcer por mim.

Agradeço aos amigos da faculdade: Bruno Cavalcante, Gisele

Bastos, Gleylton Weyne, James Almada e Igor Simões que tanto me

encentivaram e torceram.

Agradeço ao Roberto Nepomuceno, por inicialmente, de bom

grado, oferecer-me sua casa, sem ao menos, conhecer-me e por ajudar-me

a dar os primeiros passos no laboratório com paciência e dedicação.

Agradeço a todo pessoal do grupo Bacillus Milene Batista, Priscila

Gomes, Renata Damásio, Juliano Paccez e Wilson Luiz pelas interessntes

discussões de artigos e aprendizado em conjunto. Agradecimento especial

7

ao Juliano e Wilson por fornecerem apoio incondicional profissional e

pessoal nos momentos mais difíceis.

Agradeço aos amigos Otto, Marcelo, Aline, Cristiane, Sabrina,

Natália, Alexandre, Mariana, Catarina, Camila Calderon, Loren, Juliana,

Liliana, Camila Santos pelas conversas científicas, pela ajuda esclarecendo

muitas dúvidas, pelas interessantes sugestões e também pelas

descontraídas conversas.

Agradeço ao meu companheiro de república Robert pela amizade,

ajuda, pelos momentos de descontração e também pelo apoio e incentivo

nos momentos desanimadores.

E Agadeço, sobretudo, a Deus, por estar sempre me protegendo e

guiando.

8

RESUMO

CAVALCANTE, R. C. M. Desenvolvimento de estratégias vacinais contra tumores induzidos pelo Vírus do Papiloma Humano tipo 16 (HPV-16) baseadas em linhagens geneticamente modificadas de Bacillus subtilis. 2008. 86 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.

Bacillus subtilis é uma bactéria gram-positiva, não patogênica, formadora

de esporos e com um grande conhecimento disponível a cerca de sua genética e

fisiologia, comparável apenas à Escherichia coli K12. Recentemente, linhagens

geneticamente modificadas de B.subtilis foram utilizadas como veículos vacinais

mas, até o momento, não se havia avaliado a indução de respostas

imunológicas citotóxicas (linfócitos T CD8+) específicas em camundongos

imunizados com esporos ou células vegetativas. No presente trabalho, avaliou-

se a indução de linfócitos T CD8+ em animais imunizados com linhagens

vacinais de B. subtilis. Inicialmente empregou-se como alvo a proteína E7 de

vírus papiloma humano tipo 16 (HPV-16) fusionada ou não à proteína gD do

vírus herpes simples tipo 1 (HSV-1). Em uma segunda estratégia, empregou-se

como alvo a subunidade B da toxina termolábil (LTB) de E. coli

enterotoxicogênica (ETEC) co-expressa ou fusionada à proteína GroEL2 de

Mycobacterium bovis. As quantidades de E7 e gDE7 expressas pelas linhagens

recombinantes de B.subtilis ficaram abaixo do limite de detecção e não foram

suficientes para ativação de células T CD8+ específicas. Por outro lado,

linhagens de B. subtilis capazes de expressar LTB e GroEL2 promoveram a

ativação de linfócitos T CD8+ específicos. De um modo geral, o presente

trabalho representa uma contribuição inédita sobre a ativação de respostas

imunológicas de base celular em camundongos imunizados com linhagens

recombinantes de B.subtilis e os resultados obtidos certamente contribuirão para

a geração de veículos vacinais mais efetivos na profilaxia e tratamento de

diferentes doenças infecciosas, como infecções virais, ou degenerativas, como o

câncer.

Palavras-chave: Bacillus subtilis; Vacinas; HPV; ETEC; Mycobacterium b

9

ABSTRACT

CAVALCANTE, R. C. M. Development of vaccine stratagies against tumors induced by human papilloma virus type 16 (HPV-16) based on genetically modified Bacillus subtilis strains. 86 p. 2008. Master thesis (Microbiology) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.

Bacillus subtilis is a sporulated, non pathogenic, gram-positive bacterial

species with a large amount of information concering its genetics and physiology,

comparable only to Escherichia coli K12. Recently, genetically modified B.subtilis

strains were successfully employed as vaccine vehicles but there is no

information concerning the activation of antigen specific cytotoxic immune

responses (T CD8+ lymphocytes) in mice vaccinated with either vegetative cells

or spores. In the present report, we evaluated the activation of CD8+ T cell

responses in mice immunized with B. subtilis vaccine strains genetically modified

in order to express the human papillomavirus type 16 (HPV-16) E7 protein as a

target antigen, isolated or genetically fused to the type I herpes simplex virus

(HSV-1) gD protein. In a second approach, we have also tested the B subunit

heat labile toxin, produced by enterotoxigenic E. coli (ETEC) strains, co-

expressed or genetically fused to the Mycobacterium bovis GroEL2 protein. E7

and gDE7 expression by B.subtilis vaccine strains were bellow the detection

limits and did not allow the activation of antigen-specific CD8+ T cell responses in

vaccinated mice. On the other hand, LTB-specific CD8+ T cell responses were

detected in mice immunized with B. subtilis expressing both LTB and GroEL2.

Collectively, the present study respresents an important contribution on the

activation of cellular immune responses in mice immunized with genetically

modified B.subtilis and should direct further analyses aiming the development of

more effective vaccine vehicles employed both for preventive and therapeutic

treatment of infectious and degenerative diseases, such as virus infections and

cancer.

Key words: Bacillus subtilis; Vaccines, HPV, ETEC, Mycobacterium bovis.

10

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS °C – graus Celsius µg – microgramas µL - microlitros AMPc – adenosina monofosfato cíclico APC – células apresentadoras de antígenos profissionais B. subtilis – Bacillus subtilis BSA – soroalbumina bovina C – base nitrogenada citosina CD – Cluster Differentiation CFA/I – fator de colonização I de ETEC CR-2 – domínio conservado II da proteína E7 CR-I – domínio conservado I da proteína E7 CT – toxina colérica C-terminal – carboxi terminal DC – célula dendrítica DNAc – fita de DNA complementar DO – densidade óptica DSM – difco sporulation media E. coli – Escherichia coli EDTA – ácido etilenodiamino tetracético EGTA – ácido etilenoglicol tetracético ELISA – enzime-linked immunosorbent assay ETEC - Escherichia coli enterotoxigênica G – base nitrogenada guanina g – gramas gA – glicoproteína A do HSV gB – glicoproteína B do HSV gC – glicoproteína C do HSV gD – glicoproteína D do HSV GM1– monossialogangliosídeo GRAS – generally recognized as safe h – horas H2SO4 – ácido sulfúrico HCl – ácido clorídrico HEPES – (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid ) HPV – vírus do papiloma humano HSP – proteína de choque térmico HSP60 – HSP de 60 kDa HSP65 – HSP de 65 kDa HSP70 – HSP de 70 kDa HSV – vírus do herpes simples

11

HSV1 – HSV tipo 1 HSV2 – HSV tipo 2 IgG – imunoglobulina de classe G IL-12 – interleucina 12 INF-γ – interferom gama IPTG – isopropil-tio-b-galactosídeo KCl – cloreto de potássio kDa - kilodáltons KH2PO4 – fosfato de potássio KOAc – acetato de potássio L – litro L.casei – Lactobacillus casei L.lactis – Lactococcus lactis L.monocytogenes – Listeria monocytogenes LB – Luria Bertani LLO – listeriolisina O LPS – lipopolissacarídeo LT – toxina termolábil de ETEC LTB – subunidade B da LT LT-I – LT tipo I LT-II – LT tipo II M – molar M.bovis – Mycobacterium bovis m/v – relação massa por volume MgCl2 – cloreto de magnésio MHC – complexo de histocompatibilidade principal MHC-I – MHC classe I MHC-II – MHC classe II min – minutos mL – mililitros (10-3L) mM – milimolar (10-3M) Na2HPO4 – fosfato ácido de sódio NaCl – cloreto de sódio NaOH – hidróxido de sódio ng - nanograma nM – nanomolar (10-9M) N-terminal – amino terminal OPD – ortho-phenylenediamine pb – pares de bases PBS – tampão salina e fosfato PBST - tampão salina fosfato acrescido de 0,5 % de tween 20 PCR – reação em cadeia da polimerase PE7 – peptideo correspondente ao epítopo CD8 da proteína E7 de HPV-16 PgsiB – promotor do gene gsiB pH – potencial hidrogeniônico PlepA – promotor do gene lepA

12

PspaC – promotor do gene spaC RBS – região de ligação ao ribossomo RNA – ácido ribonucléico RNAm – RNA mensageiro RNAt – RNA transportador rpm – rotações por minuto RT-PCR – transcriptase inversa PCR SDS – dodecil sulfato de sódio SFB – soro fetal bovino ST– toxina termoestável TC-1 – linhagem de células transformadas com E6 e E7 de HPV-16 Th1 – T helper 1 Th2 – T helper 2 TLR – tool like receptors TNF-α – fator de necrose tumoral alfa TRIS.HCl – tris(hydroxymethyl)aminomethane.HCl TTFC – fragmento C da toxina tetânica U – base nitrogenada uracila UFC – unidades formadoras de colônia V – volume V. cholerae – Vibrio cholerae VLP – virus like particles σB – fator sigma B

13

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Modelos de expressão heteróloga em linhagens recombinantes de B.subtilis.............................................................................................................23 Figura 2. Amplificação dos genes E7 e gDE7 a partir do vetor pGDE7........... 45 Figura 3. Clonagens dos genes E7 e gDE7 no vetor pHCMC03 e análise de restrição.............................................................................................................45 Figura 4. Representação esquemática dos vetores construídos para expressão dos genes E7 ou gDE7 em B.subtilis.................................................................46 Figura 5. Detecção in vitro da expressão das proteínas E7 e gDE7 produzidas pelas cepas de B.subtilis construídas................................................................ 47 Figura 6. Detecção de RNAm correspondentes às seqüências clonadas E7 e gDE7 por RT-PCR.............................................................................................48 Figura 7. Detecção de anticorpos IgG específicos anti-gD em camundongos C57BL/6, após três ou quatro doses da linhagem vacinal de B.subtilis LDVR2...............................................................................................................49 Figura 8. Análise de linfócitos T CD8+ específicos para o peptídeo PE7, em camundongos C57BL/6 imunizados por via subcutânea com as linhagens vacinais de B.subtilis LDV1, LDVR1 ou LDVR2................................................50 Figura 9. Análise de linfócitos T CD8+ / INF-γ+ específicos para o peptídeo PE7, em camundongos C57BL/6 após três doses de células ou esporos das linhagens LDV1, LDVR1 e LDVR2 pelas vias nasal (IN) ou subcutânea (SC)....................................................................................................................52 Figura 10. Representação esquemática dos vetores construídos para expressão de GroEL2 e / ou LTB em B.subtilis.................................................55 Figura 11. Detecção da expressão in vitro das proteínas GroEL2 e LTB pelas cepas de B.subtilis recombinantes construídas.................................................56

14

Figura 12. Avaliação dos títulos de anticorpos anti-LTB séricos obtidos após o protocolo de imunização envolvendo células vegetativas e esporos das linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2 administrados pela via subcutânea.57 Figura 13. Avaliação dos títulos de anticorpos anti-LTB séricos obtidos após o protocolo de imunização envolvendo células vegetativas e esporos das linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2 administrados pela via intra-nasal..................................................................................................................58 Figura 14. Análise de linfócitos T CD8+ / INF-γ+ específicos para a proteína LTB, realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via subcutânea.60 Figura 15. Análise de linfócitos T CD8+ / INF-γ+ específicos para a proteína LTB, realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via intra-nasal..................................................................................................................61

15

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Lista dos iniciadores utilizados com suas sequências alvo...............36 Tabela 2. Vetores de expressão e linhagens de B. subtilis utilizados durante o estudo................................................................................................................36 Tabela 3. Análise de proteção contra modelo desafio com células tumorais (TC-1)................................................................................................................53

16

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 19

2 OBJETIVOS ................................................................................................... 33

3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 34

3.1 Construção de vetores ............................................................................. 34

3.1.1 Construção de vetores epissomais capazes de expressar as proteínas

E7, gDE7 ou GroEL2 ....................................................................................... 34

3.1.2 Construção de vetores epissomais capazes de expressar

simultaneamente GroEL2 e LTB .................................................................... 35

3.2 Preparação e transformação de bactérias competentes ....................... 37

3.3 Análise da expressão in vitro ................................................................... 38

3.4 Detecção de RNAm .................................................................................. 39

3.5 Preparação e purificação de esporos de linhagens recombinantes de

B.subtilis ........................................................................................................... 39

3.6 Protocolos de imunização ........................................................................ 40

3.7 Detecção de respostas de anticorpos séricos específicos .................. 40

3.8 Ensaio de marcação intracelular de IFN-g expresso por células CD8+ . 41

3.9 Cultivo de células TC-1, desafio e acompanhamento da evolução

tumoral ............................................................................................................. 42

3.10 Análises estatísticas................................................................................43

4 RESULTADOS................................................................................................44

4.1 Respostas imunológicas geradas após a administração de cepas de

B.subtilis recombinantes capazes de expressar as proteínas E7 e gDE7.44

4.2 Análise de respostas imunológicas induzidas após a administração de

linhagens de B.subtilis recombinantes capazes de expressar GroEL2 e/ou

LTB............................................................................................................... ..... 54

5 DISCUSSÃO................................................................................................... 62

6 CONCLUSÕES .............................................................................................. 75

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 76

ANEXO I............................................................................................................84

17

ANEXO II...........................................................................................................85

ANEXO III..........................................................................................................86

18

1 INTRODUÇÃO

B.subtilis é uma bactéria gram-positiva, ubiquitária, não patogênica,

freqüentemente encontrada em solos. Possui a capacidade de formar

endosporos, estrutura de resistência capaz de permanecer viável por

milhares de anos, além de resistir a condições adversas como escassez de

nutrientes, extremos de pH, temperatura e salinidade e à exposição a

alguns agentes químicos e físicos utilizados no controle microbiano

(NICHOLSON et al., 2000). Apresenta baixo tempo de geração, multiplica-

se em meios simples e relativamente baratos e atinge altas densidades

celulares in vitro. B.subtilis é a bactéria gram-positiva mais estudada com

genética, bioquímica e fisiologia bem conhecidas, legado somente

comparado à Escherichia coli (HARWOOD, 1992; FERREIRA e

SCHUMANN, 2005).

Todo esse conhecimento acumulado, bem como, algumas

características intrínsecas à B.subtilis contribuíram para o largo uso desse

microrganismo no setor industrial. A capacidade de produzir e secretar

grandes quantidades de enzimas, notadamente proteases e alfa-amilases,

fez com que esse microorganismo fosse bastante empregado na indústria

de detergentes (HARWOOD, 1992). Além disso, B.subtilis possui marcante

atividade probiótica quando administrado por via oral (GÜNTHER e

JIMÉNEZ-MONTEALEGRE et al., 2005; BALCÁZAR e ROJAS-LUNA,

2007; HONG et al., 2005). Característica que explica seu uso em

alimentos, como o Natto da culinária oriental e a sua utilização em

formulações probióticas, principalmente para peixes crustáceos, aves e

humanos (HONG et al., 2005)

B. subtilis é um modelo interessante do ponto de vista de produção

de proteínas heterólogas. Como já mencionado, há grande conhecimento a

cerca das características genéticas, fisiológicas, bioquímicas e de cultivo.

Além disso, B.subtilis não possui membrana externa (LPS) e detém alta

capacidade intrínseca de secreção protéica, características que dispensam

19

etapas adicionais de lise celular e de remoção de LPS (LI et al., 2004;

TERPE, 2006; YIN et al., 2007). Outro fator relevante é a disponibilidade de

vetores epissomais capazes de promover a produção de proteínas

heterólogas sob controle de diversos promotores gênicos fortes. De fato,

algumas proteínas heterólogas como a insulina, o fator de crescimento

epidermal humano e a interleucina 3 humana foram expressas e

purificadas com sucesso a partir de cepas geneticamente modificadas de

B.subtilis (WESTERS et al., 2004).

Recentemente, linhagens geneticamente modificadas de B.subtilis

capazes de expressar antígenos heterólogos foram empregadas como

veículos vacinais vivos (FERREIRA e SCHUMANN, 2005). De fato, o uso

de veículos vacinais vivos apresenta algumas vantagens em detrimento a

outras estratégias vacinais, dentre elas: a) mimetizam patógenos e

estimulam respostas imunológicas de mucosa; b) podem ser administradas

por via nasal ou oral, evitando riscos inerentes à via parenteral e reduzem a

necessidade de pessoal e infra-estrutura especializados para a

administração; e c) possuem baixo custo relativo de produção (DETMER e

GLENTING, 2006).

Os veículos vacinais vivos podem ser reunidos em dois grandes

grupos: os patogênicos atenuados e os não patogênicos. Veículos vacinais

não patogênicos são mais seguros que os atenuados, uma vez que, esses

últimos apresentam risco de reversão de patogenicidade, podem

desencadear doenças em hospedeiros imunologicamente comprometidos e

potencialmente produzem maiores reações adversas (MERCENIER et al.,

2000). Além das vantagens apresentadas por veículos vacinais vivos não

patogênicos, B.subtilis possui outras características particulares que

permitem alocá-lo como um dos veículos vacinais mais promissores no

desenvolvimento de estratégias vacinais baseadas em veículos vivos.

Detém o status GRAS (generally recognized as safe), propriedade que

confere segurança em seu uso inclusive em crianças, idosos e

imunocomprometidos. Muitas vantagens são conferidas pela formação de

20

esporos, entre elas, (i) estrutura termo-resistente que dispensa gastos com

manutenção da cadeia de frio durante transporte e estocagem, (ii) possuem

marcante atividade probiótica quando administrados por via oral,

propriedade que auxilia na prevenção e no combate a doenças entéricas e

(iii) são capazes de desencadear uma resposta imunológica balanceada

entre Th1 e Th2 ativando dessa forma tanto respostas celulares quanto

humorais (BARNES et al., 2007).

Encontram-se descritos na literatura dois modelos de utilização de

B.subtilis como veículo vacinal, são eles o modelo “out” e o modelo “in”

(ISTICATO et al., 2001; PACCEZ et al., 2006). O modelo “out” foi

inicialmente descrito por Isticato e colaboradores (2001) e está baseado na

expressão do antígeno alvo ancorado à superfície do esporo (Figura 1A). O

direcionamento para superfície do esporo é mediado pela fusão do gene

alvo a seqüências adicionais que codificam para proteínas da capa do

esporo denominadas de Cot. A expressão desse gene híbrido é codificada

por cópia única inserida no cromossomo bacteriano por recombinação

homóloga em sítio de gene não essencial para B.subtilis (DUC et al., 2003;

MAURIELLO et al., 2004). Nas formulações vacinais envolvendo esse

modelo, toda a carga antigênica apresentada ao sistema imune é oriunda

da administração de esporos das linhagens recombinantes com o antígeno

pré-formado ancorado em sua superfície. De fato, trabalhos empregando

esse modelo demonstraram que camundongos imunizados com esporos de

linhagens recombinantes de B.subtilis expressando o fragmento C da

toxina tetânica (TTFC), administrados tanto por via oral como parenteral,

desencadearam respostas humorais específicas e, sobretudo, foram

protegidos contra desafios com a toxina tetânica nativa (DUC et al., 2003;

MAURIELLO et al., 2004).

Em nosso laboratório foi desenvolvido um modelo alternativo,

denominado modelo “in”. Nesse modelo, o antígeno é acumulado no

interior da célula bacteriana e não há antígeno pré-formado em esporos de

linhagens recombinantes de B.subtilis (Figura 1B). Nesse caso, o sistema

21

de expressão está baseado em uma série de vetores epissomais derivados

do plasmídeo pMTLBS72 que, em oposição a maioria dos vetores

epissomais de bactérias gram-positivas (BRON et al., 1991; JANNIÈRE et

al., 1990), é capaz de replicação bidirecional (tipo teta), demonstrando,

dessa forma, alta estabilidade estrutural e segregacional (TITOK et al.,

2003). Além disso, essa série de vetores apresenta número intermediário

de cópias por célula (6 a 10), o que permite mais cópias do gene de

interesse. A partir desses plasmídeos, nosso grupo desenvolveu vetores

epissomais capazes de produzir proteínas heterólogas sob o controle de

diferentes promotores, dentre eles PspaC, ativado por IPTG, PlepA, promotor

constitutivo e o promotor PgsiB, ativado em condições de estresse ambiental

(NGUYEN et al., 2005).

O promotor derivado do gene gsiB (glucose starvation inducible) é

reconhecido pelo fator sigma alternativo B (σB), expresso em baixos níveis

em condições fisiológicas e transcrito em situações de estresse ambiental

como, escassez de glicose, altas temperaturas, pHs baixos, além de adição

de sais e etanol (MAUL et al., 1995). Além disso, trabalhos anteriores do

nosso grupo demonstraram que esse promotor é também induzido in vivo,

uma vez que, animais imunizados com esporos de linhagens

recombinantes de B.subtilis, onde não há expressão do antígeno

heterólogo, desencadearam respostas imunológicas específicas contra o

antígeno alvo (PACCEZ et al., 2006, 2007; LUIZ et al., 2008).

Utilizando esse sistema, nosso grupo construiu linhagens de

B.subtilis capazes de expressar proteínas como a subunidade B da toxina

termolábil (LTB) e a subunidade estrutural (CfaB) do fator de colonização

CFA/I, ambas oriundas de linhagens de E.coli enterotoxigênica (ETEC).

Essas linhagens foram administradas na forma de células vegetativas ou

esporos a camundongos pelas vias oral e parenteral. Camundongos

imunizados apresentaram respostas humorais secretadas e sistêmicas

especificas para os antígenos expressos (PACCEZ et al., 2006, 2007; LUIZ

et al., 2008). Dessa forma, observa-se que ambos os modelos de

expressão heteróloga em

desencadear respostas humorais locais e sistêmicas especificas, após

administração a camundongos por vias de mucosa ou parenteral.

Figura 1 - Modelos de expressão heteróloga em linhagens recombinantes de B.subtilis. (A) representação esquemática do modelo “representação esquemática do modelo “estudo.

Vacinas tradicionalmente foram desenvolvidas com o objetivo de

induzir respostas séricas de anticorpos específicos capazes de reconhecer

antígenos expressos por diferentes patógenos. No entanto, com o aumento

do conhecimento da relação patógeno

ativação do braço celular da resposta imunológica é crucial para uma maior

eficácia de vacinas contra patógenos de ciclos complexos e para

potencializar a resposta humoral desencadeadas por muitas vacinas

convencionais (MOORE e HUTCHIN

imuno-terapêuticas contra o câncer, assim como contra muitas doenças

infecciosas crônicas, a ativação de linfócitos citotóxicos (T

específicos é a principal resposta imunológica capaz de levar à proteção

e/ou cura da doença. Uma vez que, quando ativadas adequadamente, tais

linfócitos destroem células transformadas e/ou infectadas a partir do

reconhecimento de antígenos alvos expressos.

O câncer cervical é o segundo mais comum entre as mulheres,

acometendo cerca de 493.000 mulheres/ano e ocasionando 274.000

mortes anuais (FERLAY et al., 2004). O vírus do Papiloma humano (HPV)

expressão heteróloga em B.subtilis (modelos “in” e “out”) são capazes de


administração a camundongos por vias de mucosa ou parenteral.

Modelos de expressão heteróloga em linhagens recombinantes de (A) representação esquemática do modelo “

representação esquemática do modelo “in”, utilizado no presente




do conhecimento da relação patógeno-hospedeiro ficou evidente que a




convencionais (MOORE e HUTCHINGS, 2007). Além disso, em estratégias

terapêuticas contra o câncer, assim como contra muitas doenças

infecciosas crônicas, a ativação de linfócitos citotóxicos (T


a da doença. Uma vez que, quando ativadas adequadamente, tais


reconhecimento de antígenos alvos expressos.


de 493.000 mulheres/ano e ocasionando 274.000


A

22

”) são capazes de


Modelos de expressão heteróloga em linhagens recombinantes de

(A) representação esquemática do modelo “out” e (B) , utilizado no presente




ficou evidente que a




GS, 2007). Além disso, em estratégias

terapêuticas contra o câncer, assim como contra muitas doenças

infecciosas crônicas, a ativação de linfócitos citotóxicos (T CD8+)


a da doença. Uma vez que, quando ativadas adequadamente, tais



de 493.000 mulheres/ano e ocasionando 274.000


B

23

é o principal agente etiológico do câncer de colo de útero, respondendo por

mais de 99% dos casos de câncer cervical diagnosticados (BOSCH et al.,

1995; WALBOOMERS et al., 1999). Mais de 120 tipos de HPV capazes de

infectar humanos já foram descritos e mais 40 tipos são capazes de

infectar células epiteliais do trato anogenital e de outras áreas de mucosa

do corpo. (VILLIERS et al., 2004). Além do tropismo tecidual, os HPVs

podem ser divididos em HPVs de baixo e alto risco, no tocante a

capacidade de desencadear câncer. Classificam-se como HPVs de baixo

risco, principalmente, os tipos 6 e 11 os quais estão comumente

associados a lesões anogenitais benignas denominadas verrugas genitais

(condylomata acuminata); (KOUTSKY et al., 1988; JABLONSKA e

MAJEWSKI, 1997). Os HPVs 16,18,31,33,35,45 e 51 são os principais

tipos considerados de alto risco, entre eles, destacam-se os HPVs 16 e 18

que respondem juntos por cerca de 70% dos casos de câncer cervicais

diagnosticados (WALBOOMERS et al., 1999; SMITH et al., 2007). O vírus

HPV também está envolvido, com menor prevalência, em outros tipos de

câncer, tais como, o de ânus, o de vulva o de pênis e o de boca (PARKIN e

BRAY, 2006).

O vírus do papiloma humano (HPV) é um vírus não envelopado

com DNA dupla fita circular, formato icosaédrico e capacidade de infectar o

epitélio estratificado (MC MURRAY et al., 2001; MCCANCE et al., 1998). O

vírus HPV possui dois genes de expressão tardia que codificam para as

proteínas do capsídeo L1 e L2 (L, do inglês late) e seis de expressão

precoce (E, do inglês early) que codificam para seis proteínas com variadas

funções regulatórias: E1, E2, E4-E7. Em particular, as proteínas E6 e E7

atuam na malignização celular, principalmente, por ligação ou inativação

dos produtos de genes supressores de tumor p53 e pRb, respectivamente

(WERNESS et al., 1990).

A E7 é uma fosfoproteína de 98 aminoácidos que apresenta dois

domínios Cys-X-X-Cys responsáveis pela formação de dedos de zinco (zur

HAUSEN, 1996). Na extremidade N-terminal existem dois domínios, um

24

parcialmente conservado denominado de CR-1 e outro completamente

conservado denominado de CR-2 (PHELPS et al., 1988). A proteína E7

juntamente com a proteína E6 são proteínas virais necessárias para a

manutenção das células no estado transformado (RODEN et al., 2004). A

E7 é a mais expressa em tumores induzidos por HPV, além de ser a

melhor caracterizada imunologicamente (RODEN et al., 2004). Assim,

grande parte das estratégias vacinais testadas contra tumores induzidos

por esse vírus é baseada nesse antígeno.

Vale destacar que há duas vertentes no desenvolvimento de

vacinas contra o câncer causado pelo HPV, as vacinas profiláticas e as

vacinas terapêuticas. As vacinas profiláticas almejam montar uma resposta

imune prioritariamente humoral contra as proteínas do capsídeo viral e,

dessa forma, impedir a entrada do vírus nas células. Em 2007, foi lançada

uma vacina profilática contra o HPV denomida de Gardasil (Merck). Sua

formulação inclui VLPs (virus like particles) de quatro tipos de HPV, sendo

dois de alto risco (16 e 18) e dois de baixo risco (6 e 11) e mais sulfato de

hidroxifosfato de alumínio como adjuvante. Dessa forma, essa vacina é

capaz de evitar a infecção pelos vírus HPV tipos 16, 18, 6 e 11. No entanto,

ela não é capaz de proteger pacientes que já estejam infectados pelo vírus

contra o câncer cervical, uma vez que, essa formulação não desencadeia

respostas celulares contra proteínas virais normalmente expressas na

superfície das células infectadas pelo HPV, como por exemplo, as

proteínas E6 e E7. De fato, as vacinas terapêuticas procuram preencher

essa lacuna, pois empregam estratégias que promovem a apresentação

dessas oncoproteínas ao sistema imunológico, de modo que respostas

citotóxicas antígeno específicas sejam geradas. Além disso, é fundamental

que células apresentadoras de antígeno profissionais (APCs),

particularmente as células dendríticas, sejam estimuladas, pois tais células

são capazes de ativar células T antígeno-específicas, possuindo dessa

forma importante papel na geração de resposta imune contra o câncer.

25

Uma formulação vacinal inclui além do antígeno alvo, substâncias

capazes de potencializar o efeito da vacina, tais compostos são

genericamente denominados de adjuvantes (do latim adjuvare, ajudar).

Eles foram originalmente descritos como: “substâncias usadas em conjunto

com um antígeno específico com o intuito de produzir maior imunidade que

o antígeno sozinho” (RAMON et al., 1952). Os mecanismos de ação dos

adjuvantes ainda não são totalmente conhecidos, mas, em geral, eles

melhoram a resposta imune a antígenos vacinais de muitas maneiras: eles

podem potencializar a imunogenicidade de “antígenos fracos”; aumentar a

velocidade/duração da resposta imune; modular a avidez, especificidade,

isotipo ou distribuição de anticorpos, estimular linfócitos T; promover a

indução de imunidade de mucosas; amplificar a resposta em indivíduos

imunonologicamente imaturos ou senescentes e também podem diminuir a

dose de antígeno necessária, reduzindo o preço das vacinas (LIMA et al.,

2004).

Entretanto, os adjuvantes tradicionais (sais de cálcio, compostos de

alumínio e emulsões oleosas) direcionam a resposta imune para Th2,

caracterizada pela produção de anticorpos específicos para determinadas

composições antigênicas, como por exemplo, o sulfato de hidroxifosfato de

alumínio usado na vacina Gardasil (Merck). A nova geração de adjuvantes,

que incluem motivos ricos em CpG, mofosforil lipídeo A e saponina (QS21),

promovem a polarização Th1. Esses efeitos são obtidos por meio da

ativação de células apresentadoras de antígenos (APCs), em particular

células dendriticas. Recentemente chaperonas moleculares, as proteínas

de choque térmico (HSPs), tem demonstrado interagir com APCs, com

considerável capacidade de ativar linfócitos T citotóxicos específicos.

Dessa forma, essa nova geração de adjuvantes possui importante papel no

desenvolvimento de vacinas contra patógenos de ciclos complexos, bem

como, na imunoterapia contra o câncer.

Como já foi citado, veículos vacinais baseados em linhagens

geneticamente modificadas de B.subtilis apresentam marcante atividade

26

adjuvante, no entanto tal potencial fora explorado somente na indução de

respostas humorais, por meio da utilização dos modelos “in” e “out”. Já foi

mencionado também que esporos de linhagens geneticamente modificadas

de B.subtilis são capazes de desencadear padrão de resposta mista, isto é,

um balanço entre resposta Th2 (prioritariamente humoral), bem explorada

nos trabalhos utilizando os modelos “in” e “out”, e Th1 (predominantemente

celular). Além disso, é sabido que veículos vacinais vivos geneticamente

modificados baseados em outras bactérias gram-positivas não patogênicas

como Lactococcus lactis, Lactobacillus casei e Streptococcus gordonii são

capazes de desencadear marcante resposta citotóxica específica contra

antígenos heterólogos expressos quando administrados em animais por

diferentes vias de inoculação (BERMÚDEZ-HUMARÁN et al., 2003;

CORTES-PEREZ et al., 2003; POOL et al., 2006; DI FABIO et al., 1997).

O presente trabalho explorou de forma pioneira, emprego de

veículos vacinais baseados em linhagens geneticamente modificadas de

B.subtilis com o objetivo de ativar respostas de células T CD8+ por meio da

utilização do modelo “in”. Para tal feito, construímos linhagens

recombinantes de B.subtilis capazes de expressar a proteína E7. Como já

foi visto, essa proteína é a mais estudada e a mais empregada no

desenvolvimento de estratégias vacinais terapêuticas contra o HPV. Além

disso, a proteína E7 apresenta epítopo único para células T CD8+,

compreendendo os aminoácidos xxRAHYNIVTFxx (49-57), doravante

denominado de PE7, (FELTKAMP, 1993) que permite a avaliação da

resposta celular T CD8+ específica. Há ainda um modelo desafio em

camundongos C57BL/6 que permite a avaliação da funcionalidade da

resposta imunológica montada após o protocolo vacinal. O modelo desafio

baseia-se na inoculação, por via subcutânea, de células de epitélio

pulmonar murino transformadas com os genes E6 e E7 de HPV-16 e v-

Has-ras, denominadas de TC-1 (LIN et al., 1996). Essas células proliferam-

se no local de inoculação e dão origem a tumores locais que expressam os

27

antígenos E6 e E7 de HPV-16, mimetizando, dessa forma, tumores

gerados pelo vírus HPV-16 no câncer cervical.

Estudos indicam que a proteína E7 é dotada de baixa estabilidade

em células eucarióticas e que fusões em sua porção N-terminal são

capazes aumentar sua meia vida (REINSTEIN et al., 2000). Bermúdez-

Humaran e colaboradores (2001) demonstraram também que a expressão

da proteína E7 na forma de proteína de fusão em L.lactis possuía maior

estabilidade quando comparada a proteína expressa em sua forma nativa.

Em trabalhos anteriores do grupo, a utilização da glicoproteína D

(gD) do Vírus do Herpes Simples Humano tipo 1 (HSV-1) como parceira de

fusão para antígenos alvo demonstrou marcante potencial adjuvante

quando administrada camundongos em estratégia vacinal baseada em

vacina de DNA. Alves e colaboradores (1998) empregaram uma vacina de

DNA capaz de expressar a proteína gD de HSV-1 fusionada ao fator de

colonização I de ETEC CFA/I. Nesse último trabalho constatou-se que a

fusão do antígeno à proteína gD foi capaz de potencializar a resposta

humoral anti-CFA/I em modelo murino. Em trabalho recente do grupo,

demonstrou-se que camundongos imunizados com vacinas de DNA

capazes de expressar a proteína E7 de HPV-16 geneticamente fusionada à

porção C-terminal da gD foram capazes de desencadear respostas

citotóxicas específicas para proteína E7 e, sobretudo, permaneceram

livres de tumor após desafio com células TC-1 (LÁSARO et al., 2005). Além

disso, Lásaro e colaboradores (2008), utilizado vacinas de DNA e

adenovírus recombinantes, demonstraram que a fusão de antígenos virais

à proteína gD demonstram maior imunogenicidade no tocante à resposta

celular, quando comparado à imunização com vacinas de DNA capazes de

expressar apenas os antígenos virais.

As glicoproteínas gA, gB, gC, gD e gE são as principais

constituintes do envelope viras dos HSVs (NORRILD, 1980). Há dois tipos

de vírus do herpes simples, o tipo 1 (HSV-1) e o tipo 2 (HSV-2). Em geral, o

HSV-1 está relacionado a lesões orolabiais, enquanto que o HSV-2 está

28

implicado em lesões genitais (NAHMIAS et al., 1990). Estima-se que de 40-

50% dos adolescentes e de 60 a 90% dos adultos estejam infectados com

o HSV-1 (RODU et al., 1992; SIEGEL et al., 1992), no entanto, apenas de

20-30% dos infectados apresentam lesões recorrentes (SPRUANCE et al.,

1988). A prevalência do HSV-2 é bastante variável nos Estados Unidos, por

exemplo, detecta-se a presença do vírus em aproximadamente 21% da

população enquanto que na África Sub-Saariana a prevalência pode ser tão

alta quanto 80% (PAZ-BAILEI et al., 2006).

As glicoproteínas do HSV são expressas na membrana plasmática

de células infectadas, agindo, dessa forma, como principal estímulo

antigênico para a resposta imune celular e humoral (NORRILD, 1980;

AURELIAN, 2004). A gD é o principal alvo de ativação de linfócitos T CD4+

em estratégias vacinais contra o HSV-1. Além disso, as gD do HSV-1 e

HSV-2 têm alto nível de similaridade e podem gerar proteção contra ambos

tipos virais (MIKLOSKA e CUNNINGHAM, 1998). Dessa forma, estratégias

vacinais que empregam a proteína gD como parceira de fusão têm caráter

bifuncional, uma vez que, desencadeiam respostas imunológicas tanto

contra o antígeno alvo à ela fusionado como podem também conferir

proteção contra os HSVs (1 e 2).

Diante dos motivos acima expostos, construiu-se uma linhagem

recombinante adicional de B.subtilis capaz de expressar uma proteína

híbrida constituída pela fusão da proteína E7, próxima à extremidade C-

terminal da proteína gD de HSV-1. Teoricamente, essa linhagem possui

maior potencial imunogênico no que concerne à geração de respostas

imunológicas específicas contra a proteína E7, pois a fusão com a proteína

gD promoveria maior estabilidade à proteína, o que aumentaria o tempo de

exposição ao sistema imune do hospedeiro. Além disso, como foi visto, a

proteína gD possui adjuvanticidade intrínseca, apresentando a propriedade

de potencializar respostas humorais e celulares contra antígenos-alvo.

Como foi citado no início do texto, trabalhos anteriores do grupo

demonstraram que linhagens geneticamente modificadas de B.subitilis

29

capazes de expressar a proteína LTB eram capazes de desencadear

respostas humorais locais e sistêmicas, quando administradas a

camundongos por diferentes vias (PACCEZ et al., 2006, 2007). No intuito

de fornecer mais uma evidência da funcionalidade do modelo “in” de

expressão heteróloga em B.subtilis na ativação de linfócitos citotócicos (T

CD8+) específicos, decidiu-se avaliar a ativação de linfócitos T CD8+

específicos para a proteína LTB após a administração de linhagens

vacinais em camundongos. No presente trabalho, utilizou-se a linhagem

denominada LDV2, a qual é capaz de acumular a subunidade B da toxina

termolábil (LTB) de E.coli enterotoxigênica (ETEC) no citoplasma sob o

controle do promotor PgsiB.

No entanto, a principal resposta imunológica desencadeada pelo

antígeno LTB em animais imunizados com linhagens vacinais de B. subtilis

é humoral (PACCEZ et al., 2006, 2007). Dessa forma, a ativação de

respostas imunológicas de caráter celular requer a utilização de adjuvantes

específicos. Com isso em mente, o presente trabalho também empregou

linhagens geneticamente modificadas de B.subtilis capazes de expressar

além da proteína LTB, a proteína GroEL2 de Mycobacterium bovis.

As proteínas GroEL são proteínas pertencentes ao grupo das

proteínas de choque térmico que possuem atividade de chaperonina. As

HSPs estão entre as moléculas mais conservadas da biosfera e são

vastamente distribuídas em todos os reinos (ZUGEL e KAUFMANN, 1999;

SILVA, 1999). As chaperoninas são proteínas capazes de exercer diversas

funções celulares dependendo do organismo em questão. Em resumo, tais

proteínas possuem papel fundamental no metabolismo das proteínas

celulares, exercendo atividades como síntese, dobramento e montagem de

complexos protéicos, transporte e degradação de proteínas, tráfego de

peptídeos, processamento antigênico e ação tampão contra mutações

(MANJILI et al., 2002; KIANG e TSOKOS 1998; NETZER e HARTL, 1998).

Além disso, elas mantêm as funções cruciais das vias celulares durante o

estresse, atenuando o dano causado nessas condições. Durante períodos

30

de estresse, as chaperoninas realizam suas funções ligando-se a sítios

hidrofóbicos nos polipeptídios e, dessa forma, impedem mudanças

conformacionais não viáveis. Elas previnem ainda a formação de

agregados protéicos, a montagem errônea de proteínas e facilitam o

transporte através das membranas celulares.

As micobactérias produzem duas GroEL distintas, denominadas

GroEL1 e GroEL2 (KONG et al., 1993). Ambas apresentam 60 kDa e

demonstram mais de 60% de homologia entre si (YOUNG et al., 1988).

GroEL1 é uma proteína não essencial para M.bovis que está envolvida

principalmente na formação de ácido micólico e na produção de biofilmes

bacterianos. A GroEL2 é uma proteína essencial que possui funções gerais

na manutenção da homeostase celular (housekeeping protein); (OJHA et

al., 2005). As GroEL de M.bovis são freqüentemente referidas como HSP-

60, uma vez que as mesmas são proteínas de choque térmico e possuem

60 kDa.

Acumulam-se as evidências que as HSPs são os principais

antígenos de muitos patógenos (KAUFMANN, 1990). A infecção é um

processo multifatorial onde estão envolvidos os fatores de virulência dos

patógenos e a resposta imune do hospedeiro. Durante a infecção, tanto o

patógeno como o hospedeiro aumentam a produção de HSPs. Devido a sua

abundancia, as HSPs tornaram-se antígenos proeminentes que disparam a

principal porção do sistema imune. Membros da família da HSP60 e HSP70

representam o principal alvo para anticorpos em muitas infecções com

helmintos nematóides protozoários e bactérias (YOUNG et al., 1989).

Atualmente, as HSPs são consideradas potentes indutoras do sistema

imune inato e especifico. Seu papel é atuar como “sinal de perigo” para

primar múltiplas vias de defesa do hospeiro. De fato, essas proteínas estão

sendo utilizadas no desenvolvimento vacinas contra infecções crônicas e

contra o câncer (TODRYK et al., 2000). Desse modo, essas proteínas, além

de funcionar como chaperonas em suas células de origem, possuem

marcante atividade imunoadjuvante.

31

O mecanismo de adjuvanticidade das HSPs não é bem conhecido.

Acredita-se que moléculas de HSPs se complexem com antígenos alvo e

potencializem a indução de respostas adaptativas. De fato, peptídios

complexados às HSPs entram em células apresentadoras de antígenos

profissionais através de receptores específicos como TLRs, LOX-1 e CD91

e primam células T por meio do aumento da apresentação via MHC classes

I e II (CALDERWOOD et al., 2007). Além disso, algumas HSPs são capazes

de induzir a secreção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α e IL-12 e a

maturação de células dendriticas (DC); (MANJILI et al., 2004; GALLUCCI e

MATZINGER, 2001). Diante do exposto, observa-se que o mecanismo de

adjuvanticidade das HSPs permeia todos os ramos da resposta imunológica,

características que fazem dessas moléculas importantes ferramentas para o

desenvolvimento de vacinas eficazes.

Em resumo, o presente trabalho avaliou a imunogenicidade de

linhagens geneticamente modificadas de B.subtilis no tocante a ativação de

linfócitos citotóxicos (T CD8+) em modelo murino. Para tal feito, foram

utilizados dois antígenos modelo, a proteína E7 de HPV-16 e a subunidade

B da toxina LT-I. Empregamos também duas proteínas adjuvantes, a

proteína gD de HSV em conjunto com a proteína E7 e a proteína GroEL2

de M.bovis com a proteína LTB. Ao todo, foram utilizadas cinco linhagens

vacinais de B.subtilis recombinantes, duas expressando o antígeno E7 e

três linhagens expressando LTB. Para o antígeno E7, foram empregadas

linhagens capazes de expressar o antígeno isolado e a proteína de fusão

gDE7. Para o antígeno LTB, foram aplicadas linhagens capazes de

expressar a proteína LTB isolada, de co-expressar a proteína LTB e a

proteína GroEL2 e de expressar uma proteína de fusão composta pelas

proteínas GroEL2 e LTB.

32

2 OBJETIVOS

O objetivo geral do presente trabalho foi avaliar as respostas

imunológicas celulares T CD8+ induzidas em camundongos após a

administração de veículos vacinais baseados em linhagens geneticamente

modificadas de B.subtilis. Em uma primeira estratégia, foram estudadas

linhagens de B. subtilis capazes de expressar o antígeno alvo E7 de HPV-

16 em sua forma nativa ou geneticamente fusionado à proteína gD do HSV-

1. Em uma segunda abordagem experimental, estudamos linhagens de B.

subtilis que expressam o antígeno LTB de ETEC, que co-expressam LTB e

GroEL2 de M.bovis ou que expressam a proteína híbrida GroEL2-LTB.

33

3 MATERIAIS E MÉTODOS

O trabalho envolveu etapas de clonagem, análise de transcritos,

avaliação da expressão de proteínas in vitro, imunização de animais,

análise da resposta imunológica e ensaios de desafio e testes estatísticos.

Inicialmente serão descritas as etapas de construção dos diferentes

vetores. Os iniciadores utilizados durante as amplificações e os vetores

construídos serão descritos no decorrer do texto e maiores detalhes

encontram-se apresentados, respectivamente, nas Tabelas 1 e 2. Em

seguida, serão descritas as demais metodologias empregadas com os

respectivos materiais utilizados em cada etapa.

3.1 Construção de vetores

3.1.1 Construção de vetores epissomais capazes de expressar as

proteínas E7, gDE7 ou GroEL2

Os fragmentos gênicos correspondentes aos genes E7 e gDE7

foram amplificados pela técnica da PCR, utilizando o vetor pGDE7

(LÁSARO et al., 2005) e os pares de iniciadores específicos Fw3E7BglII,

Rv3E7XbaI e F1gDE7BglII, R2gDE7XbaI, respectivamente. Os fragmentos

gerados de aproximadamente 300 pb e 1.500 pb, respectivamente, foram

clivados com as enzimas de restrição BglII e XbaI e inseridos no vetor

pHCMC03, previamente digerido com as enzimas BamHI e XbaI (NGUYEN

et al., 2005). Dessa forma, foram gerados dois novos vetores pLDVR1 e

pLDVR2, respectivamente.

O fragmento gênico correspondente ao gene groEL2 foi amplificado

pela técnica da PCR, a partir de DNA genômico de M.bovis cepa

AF2122/97 (GARNIER et al., 2003) e dos iniciadores específicos

GroEL2FBglII e GroEL2RBglII. O fragmento gerado, de aproximadamente

34

1.600 pb, foi clivado com a enzima de restrição BglII e inserido no vetor

pHCMC03 (NGUYEN et al., 2005), previamente digerido com a enzima

BamHI, gerando um novo vetor, denominado pLDV72.

3.1.2 Construção de vetores epissomais capazes de expressar

simultaneamente GroEL2 e LTB

Para verificar a influência da expressão de GroEL2 de M.bovis na

imunogenicidade de linhagens de B. subtilis capazes de expressar LTB,

foram construídas duas linhagens, uma capaz de expressar uma proteína

híbrida composta pela fusão das proteínas GroEL2 e LTB e outra capaz

expressar as duas proteínas na forma não fusionada sob o controle do

mesmo promotor. Para primeira construção, amplificou-se pela reação da

PCR o gene eltB, a partir de DNA cromossômico de ETEC H10407 e dos

iniciadores específicos LTBF3BcuI e LTBR3BcuI. O fragmento gênico

obtido de aproximadamente 300 pb foi tratado com a enzima BcuI e

inserido no vetor pLDV72, gerando um novo vetor, denominado pLDV73.

Para segunda construção, amplificou-se o gene eltB acrescido de uma

região gênica responsável pela ligação ao ribossomo (RBS) derivada do

gene gsiB de B.subtilis (TAAAAGGAGGAAG), a partir do plasmídeo

pLDV73 e dos iniciadores específicos LTBRBSF6AatII e LTBR6. O

fragmento gerado, de aproximadamente 300pb, foi clivado com a

endonuclease AatII e inserido no vetor pLDV72, previamente preparado

com a enzima EcoRV, gerando um novo vetor denominado, pLDV74.

35

Tabela 1 - Lista dos iniciadores utilizados com suas seqüências e gene alvo

Tabela 2 - Vetores de expressão e linhagens de B. subtilis utilizados Vetores Epissomais

Linhagem de B. subtilis

Proteína (s) Expressa(s)

Referência

pLDV1 LDV1 ----- PACCEZ et al., 2006

pLDVR1 LDVR1 E7 Presente estudo pLDVR2 LDVR2 gDE7 Presente estudo pLDV2 LDV2 LTB PACCEZ et al.,

2006 pLDV72 LDV72 GroEL2 Presente estudo pLDV73 LDV73 GroEL2-LTB (fusão) Presente estudo pLDV74 LDV74 GroEL2 e LTB Presente estudo

Iniciadores Sequência 5´- 3´ Gene alvo Fw3E7BglII GGGTGGCACAGATCTATGCATGGAG Gene E7 Rv3E7XbaI GGCGCCTTTCTAGATTATGGTTTCTG Gene E7 F1gDE7BglII CGTTATAGATCTATGGGGGGGGCGC Gene gDE7

R2gDE7XbaI ATTAAGGGGGGGTCTAGAGTAAAACAAGGGC

Gene gDE7

GroEL2FBglII

GGCCATAGATCTATGGCCAAGACAATTGCGTACGA

Gene groEL2

GroEL2RBglII

GGCCATAGATCTGATATCGAAATCCATGCCACCCATGTCG Gene groEL2

LTBF3BcuI GGCCACTAGTGCTCCTCAGTCTATTACAGAACTATG

Gene eltB

LTBR3BcuI

GGCCTCTAGACTAGTTTTCCATACTGATTGCCG

Gene eltB

LTBRBSF6AatII GGCCATGACGTCTAAAAGGAGGAAGAATTCATGGCTCCTCAGTCTATTACAGAACTATG

Gene eltB

LTBR6AatII

GGCCATGACGTCATGGCTCCTCAGTCTATTACAGAACTATG Gene eltB

36

3.2 Preparação e transformação de bactérias competentes

Os plasmídeos construídos foram inicialmente propagados E. coli

DH5-α. A indução da competência foi realizada segundo protocolo

estabelecido por Sambrook e colaboradores (2001). Bactérias crescidas

até a metade da fase exponencial (D.O.600nm 0,6) foram incubadas em

solução de 0,1 M de CaCl2 por 1h a 0º C. Em seguida, a solução foi

centrifugada (10 min 5000 g) e as bactérias ressuspendidas em uma

solução 0,1 M de CaCl2 acrescida de 10% de glicerol (m/v). Alíquotas de

200 µL foram congeladas a - 80 ºC até a utilização. A transformação foi

realizada ao se adicionar a mistura de ligação ou o plasmídeo purificado

(20 - 100 ng) às alíquotas de células, incubando em gelo por 30 min,

seguindo-se de um choque térmico (42 ºC) por 2 min, nova incubação em

gelo por 2 min e adição de 900 µL de LB e incubação a 37 ºC por 1h,

seguida por plaqueamento em meio seletivo.

Os plasmídeos recombinantes foram isolados através de extração

por lise alcalina e transformados na linhagem de B. subtilis WW02 (WEHRL

et al., 2000) ou na linhagem WB800 (MURASHIMA et al., 2002) segundo

protocolo descrito anteriormente por Anagnostopoulos e Spizizen (1961),

no qual a linhagem de B.subtilis torna-se naturalmente competente em

meio HS (20% de glicose, 0,1% de L-triptofano, 2% de casaminoácidos,

10% de extrato de levedura, 8% de arginina e 0,4% de histidina), passando

a uma etapa seguinte de transformação com os plasmídeos em meio LS

(20% de glicose, 0,1% de L-triptofano, 2% de casaminoácidos, 2% extrato

de levedura, 1 M de MgCl2 e 1 M de CaCl2) após adição de 0,1 M de

EGTA.

37

3.3 Análise da expressão in vitro

As linhagens pLDV1, pLDV2, pLDVR1, pLDVR2, pLDV72, pLDV73

e pLDV74 foram crescidas por uma noite em meio LB. Inóculos com

diluição inicial de 1 : 100, feitos em meio LB, foram mantidos a 37 ºC sob

agitação (200 rpm) até início do crescimento exponencial (DO600nm 0,6). As

culturas foram submetidas, em seguida, a um choque térmico a 45 ºC por

2h. As linhagens pLDVR1 e pLDVR2 foram expostas a outros estímulos

capazes de ativar o promotor derivado do gene gsiB (PgsiB). Após atingir o

inicio da fase exponencial, essas últimas foram submetidas a

concentrações crescentes de etanol, que variaram de 1 a 8%, a

concentrações de NaCl, que variaram de 2 a 10%, a pHs ácidos, variando

de 6 até 4 e ao crescimento por 48h, simulando a exaustão de nutrientes.

Em todos os casos, foram retiradas amostras antes da indução e

após a indução de 2h. Extratos totais de células foram obtidos por

tratamento em tampão específico (sacarose 15%, Tris-HCl 250 mM,

lisozima 800 µg/mL), incubados a 37 ºC por 15 minutos, posteriormente

foram acrescidos 10 µL de SDS a 10% e feita uma nova incubação a 37 ºC

por 15 minutos. Todo material utilizado para análise foi dissolvido em

tampão de amostra para eletroforese em gel de poliacrilamida e

quantidades equivalentes a aproximadamente 108 UFC células vegetativas

foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 15%. Em

seguida, transferidas para filtro de nitrocelulose e posteriormente reveladas

com anticorpos policlonais e/ou monoclonais específicos para cada

antígeno utilizado.

38

3.4 Detecção de RNAm

Ensaios de RT-PCR foram realizados a partir de RNA total extraído

das linhagens LDVR1 e LDVR2 após protocolos de indução (descritos no

item anterior). O RNA total foi extraído utilizando o tampão de lise

(sacarose 15%, Tris-HCl 250 mM, lisozima 800 µg/mL), incubados a 37 ºC

por 15 min, posteriormente foram acrescidos 10 µL de SDS a 10% e feita

uma nova incubação a 37 ºC por 15 minutos. O produto da lise foi

centrifugado e o sobrenadante utilizado para purificação de RNA total. Para

purificação de RNA total utilizou-se o SV Total RNA Isolation System

(Promega) de acordo com as especificações estabelecidas pelo fabricante.

As reações de transcriptase reversa foram realizadas com OneStep RT-

PCR Kit (QIAGEN) com os iniciadores reversos específicos utilizados nas

amplificações dos genes E7 e gDE7, Rv3E7XbaI e R2gDE7XbaI,

respectivamente. À exceção dessa alteração, todas as recomendações

fornecidas pelo fabricante foram seguidas. Em seqüência, foram realizadas

amplificações, a partir dos pares de iniciadores específicos para E7 e gDE7

e das fitas de DNA complementar geradas.

3.5 Preparação e purificação de esporos de linhagens recombinantes

de B. subtilis

A esporulação das linhagens recombinantes de B. subtilis foi

induzida em DSM (difco-sporulation media) usando o método de exaustão

descrito por Nicholson e Setlow (1990). Resumidamente, a linhagem a ser

esporulada é crescida por uma noite em meio LB, a cultura é inoculada em

meio DSM e o crescimento é feito por 48 horas (37 ºC, 200 rpm). A cultura

crescida é centrifugada para remoção do meio (10000 g, 10 min a 4 ºC) e

com ¼ de uma solução 1 M KCl e 0,5 M NaCl, após nova etapa de

centrifugação, o preciptado foi ressuspendido em ¼ do volume inicial de

um tampão de Tris.HCl (50 mM, pH 7,2) contendo lisozima a 50 µg/mL e

39

incubado por 1h a 37 ºC. Os esporos foram limpos por lavagens

consecutivas em soluções de NaCl 1 M, água deionizada, SDS a 0,05%,

tampão TEP (50 mM de Tris.HCl, pH 7,2; 10 mM de EDTA) e finalizadas

com três lavagens consecutivas com água deionizada. Depois de limpos os

esporos foram estocados a - 20 ºC.

3.6 Protocolos de imunização

Os protocolos de imunização empregados foram baseados em

trabalhos previamente publicados que descrevem a utilização de esporos

de B. subtilis geneticamente modificados para expressar antígenos

heterólogos (LTB e fragmento C da toxina tetânica, TTFC) ancorados à

parede externa (DUC et al., 2003) e em trabalhos que empregaram

linhagens geneticamente modificadas L.lactis como vetor vacinal

expressando a proteína E7 de HPV-16 (BERMÚDEZ-HUMARÁN et al.,

2003). Camundongos C57BL/6 foram imunizados pelas vias nasal ou

subcutânea com uma dose de 5 x 1010 UFC de células vegetativas vivas

induzidas, como descrito no item anterior, ou esporos (1010 UFC) nos dias

0, 14 e 28. As amostras de soro foram colhidas um dia antes de cada dose

e sete dias após a última dose.

3.7 Detecção de respostas de anticorpos específicos séricos

Análises das respostas de anticorpos anti-LTB específicos foram

realizadas em placas de ELISA de 96 poços sensibilizadas com

gangliosídeo GM1 na concentração de 2 mg/mL em PBS, deixadas a 37 ºC

por 4 horas. Foi realizada uma etapa de bloqueio incubando as placas a

37ºC por 30 minutos com uma solução 1% de BSA dissolvida em tampão

PBS. Posteriormente a toxina LT purificada foi adicionada (0,5 µg por poço)

e incubada por 2h a 25 ºC. Foram realizadas diluições seriadas com soros

40

diluídos em tampão PBS contendo 0,1% de BSA e 0,05% de Tween-20.

Após uma etapa de lavagem com tampão PBS contendo 0,05% de Tween-

20, as placas foram incubadas com anticorpos anti-IgG de camundongo

conjugados à peroxidase por 1,5h à temperatura ambiente. As placas

foram reveladas com solução reveladora (tampão citrato-fosfato 0,2 M pH 5

acrescido de OPD (0,4 mg/mL) e H2O2 0,04% v/v) e as reações foram

interrompidas com 50 µL de solução de H2SO4 a 1 M. A absorbância foi

medida no comprimento de onda de 492 nm. Os resultados apresentados

são baseados em analise individual a partir de experimentos de imunização

realizados em duplicata com cinco animais por grupo. Os valores obtidos

com animais imunizados com a linhagem LDV72 (não expressa LTB) e não

imunizados foram subtraídos dos valores encontrados com as demais

linhagens capazes de expressar LTB. Os gráficos representam os títulos de

anticorpos atingidos representados pelas médias + desvio padrão.

A análise de anticorpos séricos específicos para proteína gD foram

realizados seguindo o mesmo protocolo descrito a cima, diferindo apenas

na etapa de sensibilização das placas de ELISA. Essas últimas, nesse

caso, foram sensibilizadas por uma noite com a proteína gD purificada (200

ng/poço) a 4 °C. Os ensaios foram realizados em triplicata e os valores

obtidos com camundongos não imunizados foram subtraídos dos valores

obtidos com a linhagem LDVR2 e LDV1. Os gráficos representam os títulos

de anticorpos atingidos representados pelas médias + desvio padrão.

3.8 Ensaio de marcação intracelular de IFN-g expresso por células T

CD8+

A marcação de IFN-g foi realizada com células mononucleares do

sangue periférico (PBMC) ou a partir de esplenócitos obtidos de baços

após sete dias do fim do protocolo vacinal. As células foram tratadas por 5

minutos no gelo com Ack Lising Buffer (BioSource International) até ruptura

das hemácias e então centrifugadas a 1500 rpm por 5 min. As células

foram incubadas a uma concentração de 106 células por 5 horas a 37 °C /

41

5% CO2 na presença de Brefeldin A (GolgiPlug; BD PharMingen) e

peptídeo específico E7 (aminoácidos 49-57) xxRAHYNIVTFxx (CHEN,

2003; PENG, 2004; FELTKAMP, 1993) para os grupos de animais

imunizados com as linhagens LDV1, LDVR1 ou LDVR2 ou proteína LTB

purificada para grupos de animais imunizados com as linhagens LDV72,

LDV73 LDV74 e LDV2. Após este período, as células foram incubadas por

30 min a 4 ºC com o anticorpo anti-CD8 conjugado com fluoresceína FITC

(BD PharMingen). Após a permeabilização com Cytofix/Cytoperm (BD

PharMingen) por 20 minutos a 4 ºC, as células foram tratadas com

anticorpo anti-IFN-g conjugado a ficoeritrina PE (BD PharMingen) por 30

min a 4 ºC. As células foram ressuspendidas em PBS e examinadas por

citometria de fluxo de duas cores utilizando o aparelho EPICS Elite XL

(Beckman Coulter). Os dados foram analisados pelo programa WinMDi

para a determinação das porcentagens de células INF-g+ / CD8+ sobre o

total de células T CD8+. Os experimentos envolvendo as linhagens LDV1,

LDVR1 e LDVR2 foram realizados em triplicata com análise individual de

camundongos de ativação de linfócitos T CD8+. Os resultados expressos

nos gráficos representam a média dos valores obtidos ± o desvio padrão.

Enquanto que nos ensaios envolvendo as linhagens LDV2, LDV72, LDV73

e LDV74, os soros dos animais imunizados foram submetidos à análise

individual. Os dados apresentados nos gráficos representam as médias dos

valores obtidos ± desvio padrão, já subtraídos dos valores encontrados em

animais imunizados com a linhagem LDV72 (não expressa LTB).

3.9 Cultivo de células TC-1, desafio e acompanhamento da evolução

tumoral

A linhagem celular tumoral TC-1 (LIN et al., 1996) é derivada de

células primárias do epitélio pulmonar de C57BL/6 transformadas com v-

Has-ras e os genes de E6 e E7 do HPV-16 (gentilmente cedida pelo

Dr.T.C. Wu, Universidade Johns Hopkins, EUA). As células TC-1 foram

cultivadas em meio DMEM suplementado com 2 mM L-glutamina, 1 mM

42

piruvato de sódio, 2 mM aminoácidos não essenciais, 10 mM tampão

HEPES, 50 U/mL penicilina/streptomicina, 10% de soro fetal bovino (SFB)

e mantidas a 37 °C e 5% de CO2. No dia do desafio tumoral, as células

foram tratadas com tripsina, lavadas duas vezes, e ressuspendidas em

meio sem soro em concentrações apropriadas para inoculação. Os animais

foram desafiados sete dias após a última imunização com número de

células que variou entre 104 e 5 x 105 células por animal por via

subcutânea. Os tumores foram acompanhados e medidos diariamente

durante 30 dias e animais que apresentassem tumores maiores que 1,5 cm

de diâmetro eram sacrificados antes do final do período de observação.

3.10 Análises estatísticas

Os resultados obtidos nos ensaios de ELISA e de marcação

intracelular foram analizados no programa Microcal Origin Professional

versão 8.0. Para a análise de siguinificância dos dados obtidos entre os

grupos experimentais, utilizou-se o teste T de Student após a verificação da

variância entre os grupos. O intervalo de confiança utilizado foi de 95%, de

forma que, diferenças entre os grupos com valores de “p” menores ou

iguais a 0,05 foram consideradas siguinificativas.

43

4 RESULTADOS

4.1 Respostas imunológicas geradas após a administração de cepas

de B.subtilis recombinantes capazes de expressar as proteínas E7 e

gDE7

Os genes correspondentes às proteínas E7 e gDE7 foram

amplificados e bandas únicas, correspondentes a 300 pb e 1.500 pb,

respectivamente, tamanhos esperados para os dois genes em estudo,

foram isoladas (Figura 2). Os fragmentos gênicos obtidos foram tratados

com enzimas de restrição apropriadas e inseridos no vetor de expressão

pHCMC03 (descritos em materiais e métodos). A clonagem do gene E7 no

vetor pHCMC03 foi confirmada por análise de restrição, utilizando a enzima

AvaIII. Como esperado, obteve-se uma banda única de 6.955 pb

(linearização do vetor) após a digestão do pHCMC03 (vetor vazio) e duas

bandas, uma de 5.571 pb e outra de 1.671 pb, após a digestão do vetor

construído (Figura 3A), denominado de pLDVR1 (Figura 4). A clonagem do

gene gDE7 também foi confirmada por análise de restrição com a mesma

enzima. Após as digestões, obteve-se novamente uma banda de 6.955 pb

correspondente ao vetor vazio, enquanto que, como esperado, uma banda

de 6.388 pb e outra de 1.671 pb foram observadas com vetor construído

(Figura 3B), denominado pLDVR2 (Figura 4). Ambas as construções foram

confirmadas também por análise de seqüenciamento (dados não

mostrados). Os vetores construídos, pLDVR1 e pLDVR2, foram inseridos

na cepa de B.subtilis WW02 gerando, respectivamente, as linhagens

recombinantes LDVR1 e LDVR2, enquanto que linhagens de B.subtilis

transformadas com o vetor vazio (pHCMC03) já haviam sido denominadas

de LDV1 (PACCEZ et al., 2006).

44

Figura 2 - Amplificação dos genes E7 e gDE7, a partir do vetor pGDE7. (A)

Amplificação do gene E7. Amostras: 1- Marcador de massa molecular GeneRuler™ 1 kb (Fermentas) e 2- PCR E7 e 3- Marcador de massa molecular (O’GeneRuler ™) 100 pb (Fermentas). (B) Amplificação do gene gDE7. Amostras: 1- GeneRuler™ 1kb (Fermentas) e 2- PCR gDE7.

Figura 3 - Clonagens dos genes E7 e gDE7 no vetor pHCMC03 e análise de restricão. (A) Análise de restrição após clonagem do gene E7 no vetor pHCMC03. Amostras: 1- Marcador de massa molecular (GeneRuler™) 1 kb (Fermentas), 2- vetor pHCMC03 (vetor vazio) após a digestão com a enzima AvaIII, 3- poço sem DNA e 4- vetor pLDVR1 construído, após a digestão com AvaIII. (B) Análise de restrição da clonagem do gene gDE7 no vetor pHCMC03. Amostras: 1- Marcador de massa molecular (GeneRuler™) 1 kb (fermentas), 2- vetor pHCMC03 (controle negativo), após a digestão com a enzima AvaIII e 3- vetor pLDVR2 construído, após a digestão com AvaIII.

6.000 pb

2 1 3

1.500 pb 1.671 pb

10.000 pb

A1 2 3 4

1.671 pb

8.000 pb

1.500 pb

2 1

1.500 pb 500 pb

250 pb

1 2 3

300 pb

A

5.581 pb

gDE7

6.388 pb

B

B

45

Figura 4 - Representação esquemática dos vetores construídos para expressão

dos genes E7 ou gDE7 em B.subtilis. (A) representação do vetor pLDVR1, construído a partir da clonagem do gene E7 no cerne do vetor pHCMC03. (B) representação esquemática do vetor pLDVR2, construído a partir da clonagem do gene gDE7 no cerne do vetor pHCMC03. Destaques para: o promotor PgsiB, em verde, os sítios da enzima Ava III, em vermelho e para os genes clonados E7 e gDE7, realçados com uma elipse.

As linhagens LDV1, LDVR1 e LDVR2 após indução in vitro

(descrito no item material e métodos) foram submetidas a ensaios de

western-blot. Ensaios utilizando o anticorpo monoclonal anti-E7 não foram

capazes de detectar a proteína E7, nem a quimera gDE7 produzidas pelas

cepas LDVR1 e LDVR2, respectivamente, reconhecendo apenas a proteína

E7 purificada (Figura 5A). Ensaios realizados com anticorpo monoclonal

anti-gD, que deveriam reconhecer a proteína gDE7 produzida pela cepa

LDVR2, reconheceram apenas a proteína gDE7 purificada (Figura 5B).

A fim de esclarecer a deficiência na detecção das proteínas

heterólogas produzidas pelas cepas de B.subtilis recombinantes

construídas, realizou-se ensaios de western-blot com anticorpos policlonais

anti-E7 e anti-gDE7 os quais eram capazes de detectar quantidades

mínimas de 50 ng e 100 ng de proteína purificada, respectivamente.

Ensaios de western-blot com esses anticorpos também não foram capazes

de detectar as proteínas recombinantes E7 e gDE7, respectivamente,

produzidas em amostras correspondentes a 108 unidades formadoras de

colônia (UFC) das linhagens LDVR1 e LDVR2.

A B

pLDVR1 pLDVR2

46

As linhagens recombinantes foram submetidas a incubações a

45°C durante 2h como forma de ativar o promotor derivado do gene gsiB,

condição que poderia acelerar a degradação de proteínas. No intuito de

reduzir esse risco, realizou-se também induções em outras situações de

estresse capazes de induzir o promotor PgsiB, tais como adição de NaCl e

etanol e exposição a extremos de pH e à escassez de nutrientes. Realizou-

se também a inserção dos plasmídeos construídos em cepas de B.subtilis

WB800 (MURASHIMA et al., 2002), linhagem deficiente nas oito principais

proteases naturalmente produzidas pelas cepas selvagens utilizadas no

estudo. Em nenhuma das condições citadas a cima, conseguiu-se detectar,

por ensaios de western-blot, a expressão das proteínas E7 e gDE7,

respectivamente pelas linhagens LDVR1 e LDVR2 (dados não mostrados).

Figura 5 - Detecção in vitro da expressão das proteínas E7 e gDE7 produzidas

pelas cepas de B.subtilis construídas. (A) Detecção utilizando anticorpo monoclonal anti-E7. Amostras: 1- LDV1, 2- LDVR1, 3- LDVR2 e 4- Proteína E7 purificada (18 kDa). (B) Detecção utilizando anticorpo monoclonal anti-gD. Amostras: 1- LDV1, 2- LDVR1, 3- LDVR2 e 4- Proteína gDE7 purificada (55 kDa).

Como os ensaios de western-blot realizados não foram capazes de

detectar a expressão das proteínas heterólogas produzidas, realizou-se

ensaios de RT-PCR a fim de inferir indiretamente a cerca da expressão das

proteínas heterológas pelas linhagens de B.subtilis LDVR1 e LDVR2.

Esses ensaios apesar de não detectarem a proteína, detectam o RNAm

correspondente e por estarem baseados em reações de PCR possuem

sensibilidade superior aos ensaios de western-blot. Após as amplificações,

B

A

E7

1 2 3 4

gDE7

1 2 3 4

47

obteve-se uma banda correspondente a 300 pb a partir do RNA extraído da

cepa LDVR1 mas não foi possível amplificar o gene gDE7 a partir do RNA

extraído da cepa LDVR2 (Figura 6). Não se detectou também amplificação

quando se utilizou iniciadores para amplificação do gene E7 (contido no

gene híbrido gDE7), a partir RNA extraído da cepa LDVR2 (dado não

mostrado). Ensaios de RT-PCR também foram realizados com RNAs

extraídos das cepas recombinantes submetidas aos diferentes estímulos

capazes de induzir o promotor PgsiB (citados anteriormente), novamente,

observou-se a presença do transcrito correspondente à proteína E7 a partir

da cepa LDVR1 e não se detectou RNAm correspondente ao gene gDE7 a

partir da cepa LDVR2 (dados não mostrados).

Figura 6 - Detecção de RNAm correspondentes às seqüências clonadas E7 e

gDE7 por RT-PCR. Amostras: 1- GeneRuler™ 1 kb (fermentas), 2- RT-PCR de LDV1, 3- RT-PCR de LDVR1 e 4- RT-PCR de LDVR2.

Os ensaios de imunização foram iniciados mesmo sem a detecção

da expressão in vitro, uma vez que, como já visto, todas as construções

foram confirmadas por análises de restrição e seqüenciamento e o

transcrito correspondente à proteína E7 foi detectado na cepa LDVR1 por

RT-PCR. Inicialmente, realizou-se um ensaio piloto utilizando apenas

células vegetativas das linhagens construídas, administradas por via

subcutânea a camundongos C57BL/6. Foram pesquisados anticorpos IgG

séricos específicos contra gD em soros de camundongos imunizados com

três ou quatro doses da linhagem LDVR2, com o intuito de avaliar a

expressão in vivo da proteína gDE7 por essa cepa vacinal. Anticorpos

321 41 2 3 4

300 pb 500 pb 250 pb

48

específicos contra gD foram detectados por ensaios de ELISA, a partir de

soros de animais imunizados com a linhagem vacinal LDVR2.

Camundongos que receberam três doses da linhagem LDVR2 (expressa a

proteína gDE7), apresentaram um título médio de 277,24, camundongos

imunizados com quatro doses apresentaram um título médio de 319,40 e o

grupo controle, que recebeu a linhagem vazia (LDV1), apresentou um título

médio inespecífico de 91,7 (Figura 7).

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 1 2 3

Figura 7 - Detecção de anticorpos IgG específicos anti-gD em camundongos C57BL/6 após três ou quatro doses da linhagem vacinal de B.subtilis LDVR2. No eixo das ordenadas estão expressos os títulos de IgG sérico anti-gD e no eixo das abscissas, os grupos de imunização correspondentes aos títulos obtidos: 1- grupo que recebeu três doses da linhagem controle LDV1, 2- grupo que recebeu três doses da linhagem LDVR2 e 3- grupo que recebeu quatro doses da linhagem LDVR2. As barras horizontais representam os títulos médios encontrados em cada grupo.

No mesmo ensaio piloto descrito acima, avaliou-se a presença de

linfócitos TCD8+/INF-γ+ específicos para o PE7 por citometria de fluxo, a

partir de sangue periférico colhido de camundongos imunizados com as

linhagens de B.subtilis LDVR1, LDVR2 e LDV1. Os camundongos

imunizados com a linhagem vazia (LDV1) apresentaram 0,11% de ativação

Grupos de imunização

Tít

ulo

s d

e Ig

G a

nti

-gD

49

de linfócitos TCD8+ / INF-γ+ sem o estímulo e 0,20% com o estímulo do PE7.

Os animais receberam a linhagem LDVR1 apresentaram valores de 0,09%

sem estímulo e 0,21% com estímulo, enquanto que o grupo que recebeu a

linhagem LDVR2 foi capaz de ativar a maior resposta obtida, 0,12% sem

estímulo e 0,65% com estímulo. Nesse primeiro ensaio não foi possível

fazer análise estatística dos dados obtidos, uma vez que, o ensaio fora

realizado uma só vez a partir de pools de linfócitos extraídos de sangue

periférico. Nesse experimento, demonstrou-se que a administração da

cepa vacinal LDVR2 foi capaz de induzir a produção de linfócitos T CD8+

específicos para o PE7, embora os valores encontrados sejam baixos

quando comparados àqueles encontrados em animais imunizados com

vacina de DNA (LÁSARO et al., 2005).

Figura 8 - Análise de linfócitos T CD8+ específicos para o peptídeo PE7, em

camundongos C57BL/6 imunizados por via subcutânea com as linhagens vacinais de B.subtilis LDV1, LDVR1 ou LDVR2. A população de linfócitos positiva para CD8 e INF-γ encontra-se destacada em um círculo, com a respectiva percentagem em relação ao numero de linfócitos T CD8+ totais, enquanto que as populações positivas apenas para CD8 apresentam-se realçadas por um retângulo. Linha superior ensaio sem estímulo e linha inferior estímulo com o PE7. As colunas representam a análise de linfócitos TCD8+ específicos para as diferentes construções testadas.

LDV1 LDVR1 LDVR2

Sem estímulo

Peptídeo E7

50

A fim de confirmar dados acima descritos e de testar a

imunogenicidade de esporos das linhagens recombinantes construídas,

além de explorar uma via de mucosa, repetiu-se o experimento descrito

acima incluindo, imunizações com esporos das linhagens recombinantes e

a utilização da via nasal tanto com células vegetativas como esporos das

linhagens vacinais de B.subtilis construídas. Após a detecção individual de

ativação de linfócitos TCD8+ específicos, em grupos com cinco animais

imunizados com células ou esporos das linhagens construídas, não se

conseguiu confirmar os dados obtidos para camundongos imunizados com

a linhagem LDVR2 (Figura 9). Em camundongos imunizados com esporos

da linhagem LDVR1 por via subcutânea, detectou-se um valor médio de

0,38% de ativação de linfócitos T CD8+ específicos. No entanto, observa-se

que nem todos os camundongos desse grupo responderam da mesma

forma. Esses dados não suportaram os resultados obtidos no primeiro

experimento e demonstram que as linhagens vacinal LDVR1 e LDVR2 não

foram capazes de ativar de modo significato a produção de linfócitos

TCD8+ específicos para o PE7 (Figura 9).Tal fato, pode ser atribuído à baixa

expressão dos antígenos alvo pelas linhagens vacinais de B. subtilis

desenvolvidas.

Figura 9 - Análise de linfócitos T CD8

camundongos C57BL/6 após três doses de células ou esporos das linhagens LDV1, LDVR1 e LDVR2 pelas vias nasal (IN) ou subcutânea (SC). No eixo das ordenadas, têmCD8+/INF-γ+ ativados valores obtidos do ensaio sem o peptídio E7. No eixo das abscissas, encontram-se representados os grupos de imunização: 1LDVR1, 3- LDVR2, 4imunizados com esporos assinalados com um asterisco (*).

Uma confirmação dos resultados obtidos após a medição de

linfócitos T CD8+ E7-específicos foi feita por meio da inoculação de animais

imunizados com células tumorais TC

vacinais. Inicialmente, desafiou

105 células TC-1. Observou

imunizados com as duas formulações vacinais (LDVR1 e LDVR2), bem

como no grupo controle (

das células tumorais (

significativas na velocidade do desenvolvimento de tumores entre os

grupos que receberam as diferentes formulações vacinais (

Devido a variações encontradas na literatura nos protocolos

vacinais e número de células TC

foram realizados, a fim de se averiguar a influência dessas variáveis na

Lin

fóci

tos

TC

D8

esp

ecíf

ico

s (%

)

Análise de linfócitos T CD8+/INF-γ+ específicos para o peptídeo Pcamundongos C57BL/6 após três doses de células ou esporos das linhagens LDV1, LDVR1 e LDVR2 pelas vias nasal (IN) ou subcutânea (SC). No eixo das ordenadas, têm-se os valores médios de linfócitos T

ativados expressos em percentagem, já subtraídos dos valores obtidos do ensaio sem o peptídio E7. No eixo das abscissas,

se representados os grupos de imunização: 1-LDVR2, 4- LDV1*, 5- LDVR1* e LDVR2*. Os grupos

imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontramassinalados com um asterisco (*).


específicos foi feita por meio da inoculação de animais

imunizados com células tumorais TC-1 sete dias após a fim dos protocolos

vacinais. Inicialmente, desafiou-se os camundongos imunizados com 5 x

1. Observou-se o aparecimento de tumores nos animais


como no grupo controle (LDV1), dentro de uma semana após a inoculação

das células tumorais (Tabela 3). Não houve também diferenças


grupos que receberam as diferentes formulações vacinais (Tabela


vacinais e número de células TC-1 inoculadas, experimentos adicionais



51

específicos para o peptídeo PE7, em camundongos C57BL/6 após três doses de células ou esporos das linhagens LDV1, LDVR1 e LDVR2 pelas vias nasal (IN) ou subcutânea

se os valores médios de linfócitos T expressos em percentagem, já subtraídos dos

valores obtidos do ensaio sem o peptídio E7. No eixo das abscissas, - LDV1, 2-

. Os grupos das linhagens recombinantes encontram-se


específicos foi feita por meio da inoculação de animais

as após a fim dos protocolos

se os camundongos imunizados com 5 x

se o aparecimento de tumores nos animais


LDV1), dentro de uma semana após a inoculação

3). Não houve também diferenças


Tabela 3).


1 inoculadas, experimentos adicionais


52

proteção induzida pelas cepas de B.subtilis recombinantes construídas.

Foram realizados desafios com número intermediário de células tumorais

variando de 5 x 104 à 5 x 105 e empregou-se um regime vacinal com

quatro doses com intervalos de 14 dias no intuito de melhorar a resposta

celular específica induzida. De forma, semelhante ao ensaio anterior, não

observamos proteção significativa conferida pelas vacinas aos animais

imunizados (dados não mostrados).

Tabela 3 - Análise de proteção contra modelo desafio com células tumorais (TC-1).

Grupos de imunizaçãoa Animais com tumor /Animais inoculadosb

Tempo médio (dias)c

Via subcutânead

LDV1 5/5 5,8 ± 1,14

LDVR1 5/5 5,8 ± 0,83

LDVR2 5/5 6,6 ± 1,14

LDV1* 5/5 6,4 ± 0,89

LDVR1* 5/5 5,6 ± 1,10

LDVR2* 5/5 6,6 ± 0,55

Via nasale

LDV1 5/5 5,8 ± 1,10 LDVR1 5/5 6,4 ± 0,55

LDVR2 5/5 6,2 ± 0,84

LDV1* 5/5 6,0 ± 0,71

LDVR1* 5/5 5,8 ± 0,84

LDVR2* 5/5 5,4 ± 0,89

a Grupos de 5 camundongos C57BL/6 foram imunizados com células ou esporos das linhagens vacinais LDV1, LDVR1 e LDVR2 pelas vias nasal e subcutânea em um regime vacinal constituído por três doses com intervalos de 14 dias. Sete dias após a última dose, os camundongos foram desafiados com 5 x 105 células da linhagem TC-1. b Relação entre o número de camundongos desafiados e os que desenvolveram tumores após um período de observação de 20 dias. c Tempo médio de desenvolvimento de tumores palpáveis nos grupos de imunização. d Camundongos imunizados por via subcutânea. e Camundongos imunizados por via nasal.

53

4.2 Análise de respostas imunológicas induzidas após a

administração de linhagens de B.subtilis recombinantes capazes de

expressar GroEL2 e/ou LTB

Ao todo, foram construídos três vetores capazes de expressar

GroEL2 e/ou LTB. O vetor denominado pLDV72 possui a seqüência gênica

da proteína GroEL2 de M.bovis sob o controle do promotor PgsiB (Figura

10A). Os vetores pLDV73 e pLDV74 possuem os genes GroEL2 e eltB, de

modo que o vetor pLDV73 detém um gene híbrido constituído pela fusão do

gene eltB à jusante do gene GroEL2 (Figura 10B), enquanto que, o vetor

pLDV74 possui as duas seqüências separadas por uma região gênica

correspondente a um sítio de ligação ao ribossomo (RBS) de B.subtilis

(Figura 10C). Em ambos os vetores, os genes clonados encontram-se sob

o controle do mesmo promotor (PgsiB). As construções foram confirmadas

por análises de restrição e de seqüenciamento (dados não mostrados). Os

vetores construídos: pLDV72, pLDV73 e pLDV74 foram inseridos em

B.subtilis WW02 gerando, respectivamente, as linhagens recombinantes

LDV72, LDV73 e LDV74. Utilizou-se, como controle positivo, a linhagem de

B.subtilis LDV2 que alberga o plasmídeo pLDV2 capaz de expressar

somente a LTB sob o controle do mesmo promotor utilizado nas

construções a cima descritas (PACCEZ et al., 2006).

Figura 10 - Representação esquemática dos vetores construídos para expressão

de GroEL2 e/ou LTB em expressar a proteína GroEL2. (B) pLDV73 vetor capaz de expressar a proteína GroEL2 fusionada à LTB. (C) pLDV74 vetor capaz de coexpressar GroEL2 e LTB. Em azul, o promotor Pum círculo os genes clonados.

As linhagens LDV72, LDV73, LD

expressão das proteínas heterólogas

de western blot utilizando anticorpos policlonais anti

Ensaios utilizando o anticorpo policlonal anti

detectar proteínas com massas correspondentes a 60 kDa nas linhagens

LDV72, LDV74 e LDV2. Fato que era esperado, uma vez que, as linhagens

LDV72 e LDV74 expressam GroEL2 e cepas de

expressam uma HSP de 60 kDa com mais de 60% de homologia com a

GroEL2 de M. bovis. A cepa LDV73 apresentou um sinal mais forte no

ensaio e um pouco acima dos 60 kDa, resultado que era esperado, uma

vez que, essa cepa produz tanto a HSP60 de

pLDV72

epresentação esquemática dos vetores construídos para expressão de GroEL2 e/ou LTB em B.subtilis. (A) pLDV72 vetor capaz de expressar a proteína GroEL2. (B) pLDV73 vetor capaz de expressar a proteína GroEL2 fusionada à LTB. (C) pLDV74 vetor capaz de coexpressar GroEL2 e LTB. Em azul, o promotor PgsiB e destacados em um círculo os genes clonados.

As linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2, após indução da

expressão das proteínas heterólogas in vitro, foram submetidas a ensaios

utilizando anticorpos policlonais anti-GroEL2 e anti

Ensaios utilizando o anticorpo policlonal anti-GroEL2 foram capazes de

roteínas com massas correspondentes a 60 kDa nas linhagens


LDV72 e LDV74 expressam GroEL2 e cepas de B.subtilis


. A cepa LDV73 apresentou um sinal mais forte no


vez que, essa cepa produz tanto a HSP60 de B.subtilis (60 kDa) como a

A

B

pLDV73

pLDV74

54

epresentação esquemática dos vetores construídos para expressão (A) pLDV72 vetor capaz de

expressar a proteína GroEL2. (B) pLDV73 vetor capaz de expressar a proteína GroEL2 fusionada à LTB. (C) pLDV74 vetor capaz de co-

e destacados em

V74 e LDV2, após indução da

, foram submetidas a ensaios

GroEL2 e anti-LTB.

GroEL2 foram capazes de

roteínas com massas correspondentes a 60 kDa nas linhagens


selvagens


. A cepa LDV73 apresentou um sinal mais forte no


(60 kDa) como a

C

55

proteína de fusão GroEL2-LTB (Figura 11A). Ensaios utilizando o anticorpo

anti-LTB, como esperado, revelaram a expressão da proteína LTB (11,5

kDa) pelas linhagens LDV2 e LDV74, enquanto que uma banda de

aproximadamente 71 kDa foi detectada na linhagem LDV73, massa

correspondente a proteína de fusão gerada (GroEL2-LTB); (Figura 11B).

Assim, demonstra-se que as cepas LDV72, LDV73 e LDV74 são capazes

de expressar, respectivamente, as proteínas heterólogas GroEL2,

GroeEL2-LTB e GroeEL2 e LTB.

Figura 11 - Detecção da expressão in vitro das proteínas GroEL2 e/ou LTB pelas cepas

de B.subtilis recombinantes construídas. (A) Detecção utilizando anticorpos anti-GroEL2. Amostras: 1- LDV2, 2- LDV72, 3- LDV73, 4- LDV74 e 5- GroEL2 purificada. (B) Detecção utilizando anticorpo anti-LTB. Amostras: 1- LDV2, 2- LDV72, 3- LDV74, 4- LDV73 e 5- LTB purificada.

A análise de resposta humoral anti-LTB foi feita a partir dos títulos

IgG séricos obtidos em animais imunizados com células vegetativas ou

esporos das linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2 pelas vias nasal ou

subcutânea. Os valores obtidos com a linhagem LDV72, cepa que não

expressa LTB, foram subtraídos dos resultados aqui expressos. Em

animais imunizados pela via subcutânea, observou-se que, à exceção de

grupos imunizados com a linhagem LDV73, a administração das cepas

vacinais na forma de células vegetativas desencadeou maiores títulos de

anticorpos anti-LTB séricos, quando comparados a títulos obtidos em

animais que receberam esporos das linhagens recombinantes

correspondentes (Figura 12). Comparando os títulos obtidos a partir da

administração de células vegetativas pela mesma via, constatou-se que

camundongos que receberam a linhagem LDV74 e LDV2 apresentaram

1 3 4 1 2 3 4 5

LTB

GroEL2

5 2

A B

56

títulos mais elevados, respectivamente, 120,4 e 74,3 do que camundongos

imunizados com a linhagem LDV73, 17,2 (Figura12). Não se observou

diferenças significativas nos títulos obtidos entre os grupos que receberam

esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2. Diante do exposto a cima,

pode-se propor que a fusão da proteína LTB à GroEL2, expressa pela

linhagem de B.subtilis LDV73, é capaz de inibir a produção de anticorpos

anti-LTB quando essa cepa é administrada a camundongos por via

subcutânea na forma de células vegetativas.

Figura 12 - Avaliação dos títulos de anticorpos anti-LTB séricos obtidos após o

protocolo de imunização envolvendo células vegetativas e esporos das linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2 administrados pela via subcutânea. No eixo das ordenadas encontram-se representados os títulos de anticorpos anti-LTB obtidos e no eixo das abscissas os grupos de imunização correspondentes. Os valores obtidos com a linhagem LDV72 foram subtraídos dos demais grupos e grupos imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontram-se indicados por um asterisco (*).

Em camundongos imunizados pela via nasal, também se observou

que a administração de células vegetativas das linhagens recombinantes

de B.subtilis LDV73, LDV74 e LDV2 desencadearam maiores títulos

quando comparados aos obtidos com camundongos imunizados pela

mesma via com esporos das linhagens correspondentes (Figura 13). Além

0

20

40

60

80

100

120

140

160

LDV73 LDV74 LDV5 LDV73* LDV74* LDV5*Grupos de Imunização

Tít

ulo

s d

e Ig

G a

nti

-LT

B

LDV 73 LDV74 LDV2 LDV73* LDV74* LDV2*

57

disso, por essa mesma via de imunização, foi possível observar que os

títulos atingidos em camundongos que receberam a linhagem LDV73 foram

inferiores aos obtidos com as linhagens LDV74 e LDV2, fato semelhante ao

que ocorreu nas imunizações por via subcutânea.

Ao se comparar as duas vias, pôde-se perceber que, de modo

geral, as imunizações por via nasal resultaram em menores títulos de

anticorpos quando comparados aos grupos que receberam as linhagens

recombinantes por via subcutânea (Figuras 12 e 13). Assim, constata-se

que há a inibição da resposta humoral sérica anti-LTB em camundongos

que receberam a linhagem LDV73, tanto pela via parenteral utilizada como,

pela via de mucosa e as respostas de anticorpos anti-LTB geradas pela

administração das cepas vacinais pela via subcutânea são superiores às

geradas em camundongos imunizados pela via nasal.

Figura 13 - Avaliação dos títulos de anticorpos anti-LTB séricos obtidos após o protocolo de imunização envolvendo células vegetativas e esporos das linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2 administrados pela via intra-nasal. No eixo das ordenadas, encontram-se representados os títulos de anticorpos anti-LTB obtidos e no das abscissas, os grupos de imunização correspondentes. Os valores obtidos com a linhagem LDV72 foram subtraídos dos demais grupos e grupos imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontram-se indicados por um asterisco (*).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

LDV73 LDV74 LDV5 LDV73* LDV74* LDV5*

Tít

ulo

s d

e Ig

G a

nti

-LT

B

Grupos de imunização LDV 73 LDV74 LDV2 LDV73* LDV74* LDV2*

58

A fim de se avaliar a ativação de resposta celular tipo T CD8+

específica para proteína LTB em animais que receberam células ou

esporos das linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2 pelas vias nasal e

subcutânea, realizou-se ensaios de citometria de fluxo em triplicata a partir

de pools de baços de cinco animais por grupo. Os valores obtidos nos

ensaios sem estímulo com a proteína LTB, bem como, os obtidos com a

linhagem LDV72 (expressa somente GroEL2) foram subtraídos dos valores

aqui representados. Em camundongos imunizados pela via subcutânea,

observou-se que aqueles que receberam as linhagens LDV2 e LDV73,

administradas na forma de células vegetativas, apresentaram maior

número de linfócitos T CD8+ específicos ativados, quando comparados a

animais que receberam esporos das linhagens correspondentes (Figura

14). Em contra partida, animais imunizados com esporos da linhagem

LDV74 pela mesma via, alcançaram valores superiores de linfócitos T CD8+

específicos ativados quando comparados aos valores obtidos em animais

que receberam células vegetativas da mesma linhagem (Figura 14). Em

animais imunizados com células vegetativas das linhagens LDV73 e LDV2,

por via subcutânea, observou-se a ativação 2,99% ±0,8 e 4,37% ±0,7,

respectivamente, de linfócitos T CD8+ específicos para LTB, valores

superiores aos obtidos com a linhagem LDV74, que ativou apenas 1,89% ±

0,1 (Figura 14). Constatou-se, com esses experimentos, que veículos

vacinais baseados em B.subtilis são capazes de desencadear respostas T

CD8+ específicas contra o antígeno modelo LTB expresso pelas cepas

vacinais. Além disso, as linhagens vacinais LDV73 e LDV2 administradas

na forma de células vegetativas e a linhagem LDV74 administrada na forma

de esporos pela via subcutânea revelaram-se mais promissoras na

ativação de respostas T CD8+ específicas contra o antígeno modelo LTB.


realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via subcutânea. No eixo das ordenadas, temT CD8+/INF-γsem a proteína LTB e no eixo das abscissasimunização correspondentes. Os grupos imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontram(*). Os valores obtidos com a linhagem LDV72 foram subtraídos dos demais valores apresentados.

Em camundongos imunizados pela via nasal, observou

novamente que, à exceção de animais imunizados com linhagem LDV74, a

administração de células vegetativas

desencadeou maior número de linfócitos T CD8

LTB quando comparada à administração de esporos das linhagens

correspondentes. Nos camundongos imunizados com células vegetativas

pela mesma via, observou

cepa LDV73 alcançou

experimento, alcançando

já em camundongos imunizados com células vegetativas das linhagens

LDV74 e LDV5 desencadearam valores médios respectivamente de 1,5%

±0,1 e 1,5 ±0,4 de ativação (

Lin

fóci

tos

TC

D8+

esp

ecíf

ico

s


linfócitos T CD8+/INF-γ+ específicos para a proteína LTB, realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via subcutânea. No eixo das ordenadas, tem-se porcentagem de linfócitos

γ+ ativados, já subtraídos dos valores obtidos do ensaio sem a proteína LTB e no eixo das abscissas, os grupos de imunização correspondentes. Os grupos imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontram-se assinalados com um asterisco (*). Os valores obtidos com a linhagem LDV72 foram subtraídos dos demais valores apresentados.

Em camundongos imunizados pela via nasal, observou


administração de células vegetativas das linhagens recombinantes

desencadeou maior número de linfócitos T CD8+ ativados específicos para


correspondentes. Nos camundongos imunizados com células vegetativas

pela mesma via, observou-se que, em camundongos vacinados com a

cepa LDV73 alcançou-se a maior ativação de linfócitos T CD8

alcançando um valor médio 5,5% ±0,9 de ativação específica,


desencadearam valores médios respectivamente de 1,5%

±0,1 e 1,5 ±0,4 de ativação (Figura 15). Entre os camundongos imunizados



59

específicos para a proteína LTB, realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via

se porcentagem de linfócitos ativados, já subtraídos dos valores obtidos do ensaio

os grupos de imunização correspondentes. Os grupos imunizados com esporos das

se assinalados com um asterisco (*). Os valores obtidos com a linhagem LDV72 foram subtraídos dos

Em camundongos imunizados pela via nasal, observou-se


das linhagens recombinantes

ativados específicos para


correspondentes. Nos camundongos imunizados com células vegetativas,

em camundongos vacinados com a

se a maior ativação de linfócitos T CD8+ do

um valor médio 5,5% ±0,9 de ativação específica,


desencadearam valores médios respectivamente de 1,5%

15). Entre os camundongos imunizados

com esporos das linhagens recombinantes, ainda pela via nasal, detectou

se que os animais que receberam a linhagem LDV74 (3,0

desencadearam maior ativação de linfócitos T CD8

comparados a animais que receberam esporos das linhagens LDV73 (1,1%

±0,9) e LDV2 (1,1% ±0,8); (


a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via nasal. No eixo das ordenadas, tem-se porcentagem de linfócitos T CD8valores obtidos do ensaio sem a proteína LTB e no eixo das abscissasgrupos de imunização correspondentes. Os grupos imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontramOs valores obtidos com a valores apresentados.

Lin

fóci

tos

TC

D8s

pec

ífic

os

(%)


com esporos das linhagens recombinantes, ainda pela via nasal, detectou

se que os animais que receberam a linhagem LDV74 (3,0

desencadearam maior ativação de linfócitos T CD8+ específicos quando


±0,9) e LDV2 (1,1% ±0,8); (Figura 15).

de linfócitos T CD8+/INF-γ+ específicos para a proteína LTB, realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via nasal. No eixo das ordenadas,

se porcentagem de linfócitos T CD8+/INF-γ+ ativados, já subvalores obtidos do ensaio sem a proteína LTB e no eixo das abscissasgrupos de imunização correspondentes. Os grupos imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontram-se assinalados com um asterisco (*). Os valores obtidos com a linhagem LDV72 foram subtraídos dos demais valores apresentados.



60

com esporos das linhagens recombinantes, ainda pela via nasal, detectou-

se que os animais que receberam a linhagem LDV74 (3,0% ±0,7)

específicos quando


específicos para a proteína LTB, realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via nasal. No eixo das ordenadas,

ativados, já subtraídos dos valores obtidos do ensaio sem a proteína LTB e no eixo das abscissas, os grupos de imunização correspondentes. Os grupos imunizados com esporos

se assinalados com um asterisco (*). linhagem LDV72 foram subtraídos dos demais

61

5 DISCUSSÃO

No presente trabalho, mostrou-se, pela primeira vez, a expressão

das proteínas E7 de HPV-16 e GroEL2 de M.bovis em cepas

geneticamente modificadas de B.subtilis. Além disso, realizou-se também a

construção inédita de linhagens B.subtilis capazes de expressar as

proteínas híbridas gDE7 (proteína E7 fusionada à região próxima à

extremidade C-terminal da gD de HSV-1) e GroEL-LTB (sub-unidade B da

toxina LT de EHEC fusionada à extremidade C-terminal da proteína

GroEL2). Destaca-se ainda o pioneirismo na avaliação de respostas

celulares induzidas contra antígenos expressos por cepas geneticamente

modificadas de B.subtilis após administração por via parenteral e de

mucosa. Tais resultados representam uma importante contribuição aos

estudos voltados para utilização de linhagens geneticamente modificadas

de B.subtilis como veículo vacinal.

No presente trabalho, empregou-se o modelo de expressão em que

o antígeno alvo acumula-se no interior de células vegetativas de B.subtilis

(modelo “in”, ver introdução) utilizadas como veículo vacinal para a

expressão das proteínas E7 e gDE7. Como já exposto, esse modelo

permite um maior número de cópias do gene alvo o que,

conseqüentemente, leva à maior produção do produto gênico gerado,

quando comparado ao sistema que integra o gene alvo em cópia única ao

cromossomo da bactéria (“modelo out”). Apesar disto, não foi possível

detectar a expressão in vitro das proteínas E7 e gDE7 pelas cepas

recombinantes de B.subtilis LDVR1 e LDVR2, respectivamente, por

ensaios de western blot. Constatou-se que a falha na detecção das

proteínas recombinantes expressas pode ser atribuída a vários fatores,

entre eles, (i) a sensibilidade do ensaio de detecção das proteínas

expressas por western blot, (ii) a degradação das proteínas

recombinantes por proteases produzidas pela linhagem de B. subtilis

62

empregada e (iii) a baixa expressão das proteínas recombinantes pelas

cepas de B.subtilis construídas.

A proteína E7 foi expressa em diferentes hospedeiros procarióticos,

dentre eles: E.coli (KASHER et al., 1993; MIRECKA et al., 2006),

Salmonella Typhymurium (LONDOÑO et al., 1996), Listeria monocytogenes

(GUNN et al., 2000; LIN et al., 2002), Streptococcus gordonii (DI FABIO et

al., 1997) Lactobacillus casei (POOL et al., 2006). Lactococcus lactis

(BERMÚDEZ-HUMARÁN et al., 2003; CORTES-PEREZ et al., 2003). Vale

destacar que, à exceção dos trabalhos envolvendo E.coli, a expressão da

proteína E7 foi avaliada apenas por ensaios qualitativos como imuno blots.

Na expressão dessa proteína por linhagens recombinantes de B.subtilis,

observou-se que a quantidade de proteína E7 produzida por 108 unidades

formadoras de colônia (UFC) da linhagem LDVR1 foi inferior a 50 ng, uma

vez que esse último valor corresponde ao limiar de detecção dos

anticorpos anti-E7 utilizados. Dessa forma, a baixa sensibilidade dos

anticorpos empregados poderia ser uma possível explicação para a não

detecção da proteína E7 nos ensaios de western blot realizados. A

obtenção de anticorpos específicos com maiores títulos e afinidade à

proteína seria uma alternativa para demonstrar-se a expressão nas

linhagens de B. subtilis construídas.

A proteína gD foi expressa em E.coli (MOSKO et al., 2004) em

Pichia pastoris (van KOOIJ et al., 2002) e em sistema Baculovírus – células

de inseto (SISK et al., 1994). No caso de B.subtilis, expressou-se a

proteína gD na forma de proteína de fusão com a proteína E7 (linhagem

LDVR2). É válido ressaltar que essa fusão gênica havia sido relatada

somente em trabalho anterior do grupo cuja expressão foi observada em

células eucarióticas (LÁSARO et al., 2005). No entanto, semelhante ao

que ocorreu com a expressão da proteína E7, ensaios de western blot

demonstraram que a quantidade da proteína gDE7 produzida por 108 UFC

da linhagem LDVR2 foi inferior a 100 ng de proteína purificada (limite de

detecção dos anticorpos anti-gD utilizados). Como já explicitado, no

63

parágrafo anterior, acredita-se que a utilização de anticorpos com títulos

mais elevados e mais específicos detectariam a produção das proteínas

heterólogas em B.subtilis.

A linhagem de B.subtilis utilizada no trabalho (B.subtilis WW02)

possui grande capacidade intrínseca de secretar proteínas, sobretudo,

proteases as quais, potencialmente, podem degradar o produto de genes

heterólogos quando se utiliza essa bactéria como modelo de expressão

heteróloga (BOLHUIS et al., 1999; LI et al., 2004; WESTERS et al., 2004;

FERREIRA e SCHUMAN, 2005). De fato, alguns trabalhos demonstram

que cepas de B.subtilis deficientes em proteases são capazes de produzir

grandes quantidades de proteínas heterólogas. (FAHNESTOCK e FISHER,

1987; MURASHIMA, 2002; WESTERS et al., 2005). Dessa forma, a fim de

reduzir a interferência de proteases na detecção dos produtos gênicos

expressos, inseriu-se também os vetores gerados durante o trabalho

(pLDVR1 e pLDVR2) na linhagem B.subtilis WB800, linhagem deficiente

em oito proteases, possuindo uma atividade residual inferior a 0,20%

quanto comparada à cepa de B.subtilis selvagem (MURASHIMA et al.,

2002). Novamente, não foi possível detectar a expressão dos genes E7 e

gDE7 nas cepas de B.subtilis construídas. Na realidade, não se esperava

que as proteínas heterólogas E7 e gDE7 expressas pelas cepas de

B.subtilis construídas fossem degradadas pelas proteases produzidas, uma

vez que, os antígenos em questão foram acumulados intracelularmente,

enquanto que as principais proteases de B.subtilis são secretadas para o

meio externo ou ficam ancoradas à parede celular.

O sistema de expressão de proteínas heterólogas utilizadas no

presente estudo envolveu o promotor induzido por estresse, derivado do

gene gsiB, presente em vetor epissomal derivado do plasmídeo pMTLB72

(TITOK et al., 2003). Em trabalho anterior foi possível demonstrar que

linhagens de B. subtilis transformadas com tais vetores expressando a sub-

unidade B da toxina termolábil de E.coli podem acumular proteínas

heterólogas em concentrações 50 ng/108 UFC (PACCEZ et al., 2006). Uma

64

possibilidade para explicar variações na expressão de diferentes proteínas

heterólogos em sistemas de expressão procarióticos passa pela

adequação dos códons encontrados no gene que se deseja expressar. A

proteína gDE7 possui 25 resíduos de prolina codificados pelo códon CCC o

que corresponde a cerca de cinco por cento (5%) da proteína total,

enquanto que, B.subtilis utiliza preferencialmente os códons CCG e CCU

para codificar o aminoácido prolina. Quando se analisou apenas a proteína

E7, observou-se que tal códon raro para B.subtilis aparece apenas uma

vez, representando apenas cerca de um por cento da proteína total.

A utilização de códons varia entre as espécies de seres vivos e, até

mesmo, entre genes de um mesmo organismo (SHARP et al., 1995). Os

códons de um gene são fatores limitantes para expressão, sobretudo, se o

produto a ser expresso for oriundo de um gene heterólogo que apresente

códons incompatíveis com o hospedeiro utilizado para expressão

(FUGLSANG, 2003 e CHECHETKIN, 2006). Dessa forma, observa-se que

códons raros para B.subtilis são utilizados em grande parte da proteína

gDE7, fato esse que pode ter contribuído para baixa expressão e,

conseqüentemente, para falha da detecção in vitro por ensaios de western

blot da referida proteína. Já a proteína E7 apresenta apenas uma prolina

codificada por CCC, sendo, do ponto de vista de utilização de códom, mais

promissora para expressão heteróloga em B.subtilis. A substituição dos

códons CCC por CCG ou CCU pode aumentar a expressão da proteína

gDE7 em B.subtilis, uma vez que, como já fora mencionado, a referida

bactéria utiliza preferencialmente esses códons para codificar o aminoácido

prolina. Outra forma da aumentar expressão desse gene seria a introdução

da seqüência gênica responsável pela síntese do RNAt em questão no

genoma ou em vetor epissomal de B.subtilis, permitindo, dessa forma, a

complementação do códon raro.

Os experimentos de imunização foram realizados, mesmo sem a

detecção das proteínas recombinantes in vitro, uma vez que, todas as

construções realizadas foram confirmadas por análise de restrição e

65

seqüenciamento e observou-se a presença do transcrito na linhagem

LDVR1. As vias de imunização escolhidas foram baseadas em estudos

anteriores do grupo e em estudos empregando L.lactis, outra bactéria

gram-positiva não patogênica (CORTES-PEREZ et al., 2003). A via

parenteral já havia sido empregada com sucesso em trabalho anterior do

grupo que observou a geração de respostas imunológicas a partir da

administração de linhagens recombinantes de B.subtilis capazes de

expressar a proteína LTB em diferentes compartimentos celulares

(PACCEZ, 2006, 2007). Por outro lado, a via nasal foi empregada com

base em estudos que administraram linhagens geneticamente modificadas

de L.lactis capazes de expressar a proteína E7 a camundongos e

observaram respostas citotóxicas específicas contra o PE7 (CORTES-

PEREZ et al., 2003).

Ensaios de ELISA confirmaram a expressão da proteína gDE7 in

vivo pela cepa LDVR1. O título médio atingido (300), embora significativo, é

baixo quando comparado a títulos atingidos após a imunização com quatro

doses da vacina de DNA pGDE7 descrita por Lásaro e colaboradores

(2005). Durmanová e colaboradores em 2006, utilizando vacinas de DNA,

também encontram títulos elevados contra a proteína gD com valores de

títulos de aproximadamente 8.000. No entanto, vale destacar, que veículos

procarióticos podem não realizar modificações pós-traducionais presentes

em proteínas expressas por eucariotos, o que compromete a apresentação

de epítopos conformacionais e, conseqüentemente, diminui a

imunogenicidade da proteína heteróloga produzida. Entretanto, nossos

resultados demonstram que veículos vacinais baseados em linhagens

geneticamente modificadas de B.subtilis capazes de expressar a proteína

gDE7 são capazes de desencadear respostas de anticorpos séricos contra

a proteína gD quando administrados por via parenteral a camundongos

C57BL/6.

Na detecção de linfócitos TCD8+ específicos para o PE7 em animais

imunizados com as cepas recombinantes de B.subtilis LDV1 (controle

66

negativo), LDVR1 (expressa somente a proteína E7) e LDVR2 (expressa a

proteína gDE7), observou-se que no primeiro experimento realizado houve

a ativação significativa de linfócitos T CD8+ (0,65%) em camundongos que

receberam a linhagem LDVR2 por via subcutânea. No entanto, tal ativação

não foi confirmada após dois ensaios de imunização subseqüentes. De

fato, esperava-se que camundongos imunizados com a linhagem LDVR2

fossem capazes de apresentar maior ativação de linfócitos T específicos

para o PE7 quando comparados a animais que receberam a linhagem

LDVR1 que expressa apenas a proteína E7. Uma vez que, a linhagem

LDVR2 expressa a proteína E7 na forma de proteína de fusão, construção

que permite maior estabilidade a proteína E7 quando expressa em

hospedeiros bacterianos (CORTES-PEREZ et al., 2003; BERMÚDEZ-

HUMARÁN et al., 2003). Além disso, em trabalhos anteriores observou-se

que a fusão de antígenos à proteína gD na forma de vacinas de DNA foi

capaz de potencializar as resposta imunológicas contra os antígenos

modelo utilizados (ALVES et al., 1998; LÁSARO et al., 2005, 2008). Dessa

forma, no caso específico de B.subtilis, acredita-se que a baixa expressão

da proteína gDE7 tenha sido responsável pela não ativação de resposta

celular detectável. Acredita-se que uma melhor expressão do antígeno alvo

pelas linhagens recombinantes de B. subtilis, seja pela adequação de

códon ou pela utilização de outros promotores, possam gerar veículos

promissores para geração de respostas imunes celulares.

Outros pesquisadores já haviam observado respostas celulares

especificas para proteína E7 a partir da administração de veículos vacinais

capazes de expressar esse antígeno. Poo e colaboradores (2006),

utilizando L.casei expressando a proteína E7 fusionada geneticamente à

primeira porção da poli-γ-glutamato sintetase de B.subtilis, demonstraram

a ativação de 12% de linfócitos T totais ( T CD4+ e T CD8+) específicos

para a proteína E7 após um protocolo de imunização envolvendo três

séries de cinco doses por via oral. Vale ressaltar, que o veículo utilizado é

capaz de colonizar e se propagar por várias gerações após cada dose e

67

que o número de doses utilizado é bem superior ao utilizado no presente

estudo (ver materiais e métodos), fatores esses que implicam maiores

quantidades de antígenos apresentados ao sistema imune e a conseqüente

geração de uma maior ativação da resposta imune. No entanto, veículos

capazes de colonizar o hospedeiro apresentam risco potencial no que

concerne ao desenvolvimento de tolerância imunológica ao antígeno e / ou

ao veículo utilizado (DI FABIO et al., 1997).

Lin e colaboradores (2002) utilizaram linhagens geneticamente

modificadas de L.monocytogenes capazes de expressar a proteína E7

fusionada à listeriolisina O (LLO), produzida pela mesma bactéria. Nesse

último trabalho, detectou-se a presença de 6,5% de linfócitos T específicos

para o epítopo T CD8+ da proteína E7 em animais imunizados com duas

doses da formulação por via oral. Sewell e colaboradores (2004), utilizando

sistema semelhante, observaram a presença de 2,8% de linfócitos T CD8+

específicos para o pE7 após duas doses de L.monocytogens recombinante

por via intraperitoneal. É fundamental destacar que os modelos utilizados

nos dois últimos estudos empregam bactérias patogênicas atenuadas,

estratégia que, apesar de bastante promissora, possui risco potencial de

reversão de patogenicidade. As linhagens de B.subtilis utilizadas durante o

presente estudo são derivadas da cepa WW02 que é reconhecida como

segura para o uso em humanos e animais e ainda apresenta atividade

probiótica quando administrada por via oral.

Os ensaios de dupla marcação em citometria de fluxo detectam

apenas células T CD8+ ativadas pelo peptídeo apresentado, mas não

demonstram a atividade citotóxica propriamente dita. Trata-se de um

correlato importante para possíveis respostas citotóxicas. Alguns trabalhos

avaliaram a atividade citotóxica específica para E7 em ensaios de

citotoxidade in vitro. Lin e colaboradores (2002), utilizando abordagem

vacinal descrita a cima, detectaram e média 30 e 40% de lise específica

mediada por linfócitos extraídos de baços de camundongos imunizados,

respectivamente, pelas vias oral e subcutânea com as cepas

68

geneticamente modificadas de L.monocytogens. Bermúdez-Humarán e

colaboradores (2005) a partir da co-administração de duas cepas de

L.lactis, uma capaz de expressar a proteína E7 fusionada à LLO e outra

expressando interleucina -12 (IL-12) observaram 16% de lise específica

desencadeada por linfócitos extraídos de baços de camundongos

imunizados pela via nasal. No presente trabalho, não se avaliou a

citotoxicidade in vitro, após as imunizações com as linhagens

recombinantes de B.subtilis. No entanto, tão logo se construa cepas de

B.subtilis capazes de expressar maiores quantidades de E7 ou gDE7,

pretende-se realizar tais ensaios.

O desafio com células tumorais TC-1 é o melhor parâmetro para se

avaliar a funcionalidade das respostas imunológicas geradas por

formulações vacinais, uma vez que, verifica a atividade não só dos

linfócitos T CD8+ específicos, mas sim, de toda a resposta imune montada

in vivo em decorrência da administração de formulações vacinais. Em

desafio profilático com células TC-1, não se observou proteção contra o

aparecimento de tumores em animais imunizados pelas vias nasal ou

subcutânea com células vegetativas ou esporos das linhagens de B.subtilis

LDVR1 e LDVR2. Nos ensaios de desafio, foram utilizadas inicialmente 5 x

105 células TC-1, de acordo com trabalho anterior realizado no laboratório

(LÁSARO et al., 2005). Esses dados indicam que a baixa expressão dos

antígenos alvo não permitiu que as linhagens vacinais de B. subtilis

desencadeassem respostas imunológicas com atividade citotóxica

específica nos animais imunizados.

Pesquisadores que avaliaram a capacidade terapêutica de modelos

vacinais baseadas em vetores bacterianos em modelo desafio utilizaram

um número de células TC-1 variando entre 5 x 104 e 2 x 105 (BERMÚDEZ-

HUMARÁN et al., 2005; SEWELL et al., 2004; POO et al., 2006). A fim de

testar a influência do número de células tumorais na proteção

desencadeada pelas cepas de B.subtilis vacinais, ensaios de desafio foram

realizados com um número intermediário de células (105 células), no

69

entanto, nenhuma proteção foi observada após a administração das cepas

LDVR1 e LDVR2 de B.subtilis. Bermúdez-Humarán e colaboradores (2003,

2005) conseguiram 35% de proteção para o desenvolvimento de tumores

em camundongos imunizados por via intranasal com L.lactis capazes de

expressar a proteína E7 e secretar IL-12. Poo e colaboradores (2006)

conseguiram atingir 40% de proteção para o desenvolvimento de tumores

em camundongos imunizados com L. casei por via oral. A ausência de

efeito antitumoral em animais imunizados com as linhagens vacinas de B.

subtilis reflete, provavelmente, a baixa ativação de respostas celulares (T

CD8+) específicas para o peptídeo E7. Esse fato pode estar relacionado à

baixa produção dessas proteínas e a baixa estabilidade da proteína E7

gerada pela cepa LDVR1. Como dito antes, a adequação de códons

presentes na proteína gDE7, bem como a utilização de sistemas de

expressão mais eficientes para B.subtilis poderão permitir o aumento da

expressão da proteína em B.subtilis e, conseqüentemente, estimular o

sistema imune, de forma que o mesmo seja capaz de prevenir e erradicar

tumores induzidos pelo vírus HPV-16.

Recentemente, nosso grupo empregou um sistema vacinal de

sensibilização e reforço (Prime-Boost) baseado na administração de vacina

de DNA como sensibilização e B.subtilis recombinante como reforço

administrado por via oral (Anexo I). Nesse trabalho, foram utilizados células

e esporos de linhagens geneticamente de modificadas de B.subtilis

capazes de expressar a porção estrutural da fímbria CFA/I (CfaB) de ETEC

e a vacina de DNA pRECFA que codifica para o mesmo antígeno alvo

fusionado à gD do HSV-1 (LUIZ et al., 2008). Os resultados mostraram que

animais que receberam o regime vacinal de sensibilização-reforço

apresentaram respostas sinérgicas para os níveis séricos de anticorpos

anti-CfaB quando comparados a animais que receberam apenas uma das

formulações. Além disso, fêmeas de animais imunizados com as duas

formulações foram capazes de fornecer maiores níveis de proteção passiva

a neonatos após uma dose letal de ETEC, quando comparadas a fêmeas

70

que receberam apenas uma das formulações (LUIZ et al., 2008). Como

continuação dos estudos voltados para a avaliação do potencial vacinal das

linhagens recombinantes de B. subtilis, esperamos realizar imunizações do

tipo prime-boost que empregue uma vacina de DNA que expresse o

mesmo antígeno alvo (LÁSARO et al., 2005), em animais que

posteriormente imunizados com a linhagem de B.subtilis LDVR2 (capaz de

expressar gDE7) como reforço. Espera-se, dessa forma, amplificar os

efeitos imuno estimuladores frente a linfócitos T CD8+ específicos para PE7

ativados por linhagens vacinais de B. subtilis.

Como já fora mencionado, em trabalho anterior do grupo, mostrou-

se que cepas geneticamente modificadas de B.subtilis expressando a

proteína LTB são capazes de desencadear a produção de anticorpos

séricos e secretados, quando administradas a camundongos pela vias oral

ou parenteral (PACCEZ et al., 2006, 2007). No presente trabalho, a partir

do mesmo sistema de expressão, construiu-se cepas de B.subtilis capazes

expressar GroEL2 e/ou LTB, com o objetivo de avaliar o potencial desse

veículo vacinal em ativar respostas celulares (linfócitos T CD8+) contra o

antígeno modelo apresentado. Além disso, avaliou-se a influência da

expressão de GroEL2, tanto na forma fusionada como co-expressa com a

proteína LTB, na indução de respostas imunológicas celulares contra LTB.

Observou-se que, em geral, animais que receberam esporos, tanto

por via nasal como por subcutânea, apresentam menores títulos quando

comparados a grupos de camundongos que receberam células vegetativas

das linhagens correspondentes. Esse resultado era esperado, uma vez

que, quando esporos das linhagens recombinantes são administrados, o

antígeno alvo é formado apenas in vivo, enquanto que células vegetativas

são administradas com os antígenos pré-formados em seu interior. Tal

resultado já havia sido observado em trabalhos anteriores do grupo

envolvendo B.subtilis (PACCEZ et al., 2006, 2007; LUIZ et al., 2008).

Notou-se também que a administração das cepas recombinantes por via

nasal desencadeou menores títulos quando comparada à administração

71

por via subcutânea. Fato que pode ser atribuído a fatores intrínsecos a vias

de mucosa, tais como, produção de muco e enzimas hidrolíticas, presença

de microbiota residente e descamação celular, fatores que, sabidamente,

podem afetar a apresentação do antígeno ao sistema imune, sobretudo,

quando o antígeno alvo é expresso por um veículo vacinal vivo

(MERCENIER et al., 2000).

Entre os grupos de imunização, observou-se que a cepa LDV73

desencadeou títulos de anticorpos bem inferiores aos títulos obtidos com

as linhagens LDV74 e LDV2 tanto por via subcutanea como por via nasal.

Assim, observa-se que a fusão da LTB com a GroEL2 foi capaz de inibir a

resposta de anticorpos séricos contra LTB. De fato, as proteínas de choque

térmico possuem ligantes para receptores presentes em células

apresentadoras de antígenos (CD40 e CD91) os quais medeiam a

internalização e o direcionamento para a apresentação via MHC-I

(OSTERLOH e BRELOER, 2008). Desse modo, acredita-se que grande

parte da proteína híbrida (GroEL2-LTB) gerada esteja sendo apresentada

por via de MHC-I, gerando desse modo uma resposta prioritariamente

celular (Th1) em detrimento à resposta humoral.

No que concerne à resposta de células T CD8+ específicas para

LTB, observou-se que a cepa LDV73 foi capaz de desencadear respostas

celulares elevadas, sobretudo quando administrada por via nasal na forma

de células vegetativas. Observação que corrobora a hipótese descrita no

parágrafo anterior, uma vez que epítopos apresentados por via de MHC-I

geram respostas prioritariamente celulares. De fato, alguns pesquisadores

fusionaram proteínas de choque térmico a antígenos modelo e observaram

potente ativação de respostas celulares específicas. Liu e colaboradores

(2007) utilizando HSP65 de M.bovis fusionada à proteína E7 de HPV-16,

na forma de vacina de sub-unidade, observaram ativação específica, tanto

de linfócitos T CD4+ como de linfócitos T CD8+ específicos para PE7. e

proteção frente ao desafio com células TC-1. Huang e colaboradores

(2007) também observaram ativação de linfócitos T CD8+ específicos, bem

72

como, proteção a células TC-1 em camundongos que receberam HSP60

humana fusionada às proteínas E6 e E7 de HPV-16 na forma de vacina de

DNA. Outros trabalhos também enfocam a utilização de antígenos

complexados às HSPs em imunoterapias contra o câncer, uma vez que a

resposta celular é a principal envolvida na erradicação de tumores

(revisado por WANG et al., 2006). Assim, constata-se que os dados obtidos

com a administração de cepas de B.subtilis capazes de expressar a fusão

GroEL2-LTB (LDV73) estão em consonância com a literatura

especializada.

Em nossos ensaios, a maior ativação de respostas T CD8+

específica foi observada em camundongos imunizados com a a cepa

LDV73 por via nasal. De fato, outros pesquisadores já observaram a

ativação de respostas citotóxicas específicas, a partir da administração de

veículos vacinais vivos pela via nasal. Bermúdez-Humarán e colaboradores

(2005) desencadearam respostas citotóxicas específicas ao administrarem

L.lactis expressando a proteína E7 de HPV-16 por via nasal. Publicouver e

colaboradores (2004) utilizaram vírus recombinantes não patogênicos da

estomatitite vesicular capazes de expressar as proteínas do envelope do

vírus HIV, administrados pela via nasal a camundongos e observaram

ativação de respostas celulares específicas potentes contra esses

antígenos. De forma semelhantes, He e colaboradores (2007) registraram

respostas celulares específicasa partir da administração por via nasal de

vírus da influenza (H1N1) recombinantes atenuados capazes de expressar

os principais epítopos da maior proteína da membrana externa do

patógeno intracelular Chlamydia trachomatis. Nossos dados revelam,

portanto, que cepas geneticamente modificadas de B.subtilis representam

veículos vacinais alternativos para ativação de respostas imunológicas

celulares após administração por via de mucosal em modelo murino.

No presente trabalho, mostrou-se que cepas de B.subtilis, quando

utilizadas como veículos vacinais, são capazes de desencadear respostas

celulares específicas a antígenos heterólogos expressos. Além disso,

73

observou-se que a proteína GroEL2 de M. bovis quando expressa na forma

de proteína de fusão com o antígeno LTB por cepas recombinantes de

B.subtilis levam a uma modulação da resposta imune contra LTB no

sentido do aumento da ativação de linfócitos T CD8+ específicos. Desse

modo, acredita-se que a geração de cepas vacinais de B.subtilis capazes

de expressar a proteína GroEL2 fusionada à proteína E7 represente uma

estratégia promissora para a geração de vacinas terapêuticas para tumores

induzidos pelo HPV.

74

6 CONCLUSÕES

Constatou-se que é possível expressar as proteína GroEL2 de M.bovis,

LTB de ETEC, e as fusões quiméricas gDE7 e GroEL2-LTB em cepas

geneticamente modificadas de B.subtilis. Concluiu-se também que as linhagens

de B.subtilis que expressam as proteínas GroEL2 e LTB e gDE7 são capazes de

induzir respostas humorais específicas para os antígenos alvo quando

administradas a camundongos.

No que concerne à ativação de linfócitos T CD8+ , observou-se que entre

as linhagens que expressam GroEL2 e LTB, a linhagem LDV73 (expressa

GroEl2 fusionada à LTB) foi capaz de ativar a maior percentagem de linfócitos T

CD8+ específicos. Dessa forma, pode-se concluir que a proteína GroEL2 quando

fusionada ao antígeno alvo representa uma estratégia promissora para

potencializar a ativação de linfócitos T CD8+ .

A conclusão geral do trabalho foi que o modelo “in” de expressão de

antígenos heterólogos em B.subtilis, seja na forma de esporos, mas, sobretudo,

como células vegetativas, desenvolvido em nosso laboratório, pode ser adaptado

de forma a aumentar a ativação de linfócitos T citotóxicos para antígenos

específicos quando administrados em camundongos tanto pelas vias de mucosa

ou parenteral. Estudos posteriores deverão detalhar os resultados encontrados e

lançar as bases para o uso desse novo sistema vacinal voltado para a ativação

específica de células T.

75

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALVES, A.M.; LÁSARO, M.O.; ALMEIDA, D.F.; FERREIRA, L.C. Epitope specificity of antibodies raised against enterotoxigenic Escherichia coli CFA/I fimbriae in mice immunized with naked DNA. Vaccine, v.16, n.1, p. 9-15, 1998. ANAGNOSTOPOULOS, C.; SPIZIZEN, J. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol., v. 81, p. 741-46, 1961. AURELIAN, L. Herpes simplex virus type 2 vaccines: new ground for optimism? Clin Diagn. Lab. Immunol., v. 11, n. 3, p. 437-45, 2004. BALCÁZAR, J.L.; ROJAS-LUNA T. Inhibitory activity of probiotic Bacillus subtilis UTM 126 against vibrio species confers protection against vibriosis in juvenile shrimp (Litopenaeus vannamei). Curr. Microbiol., v. 55, p. 409-412, 2007. BARNES, A.G.; CEROVIC, V.; HOBSON, P.S.; KLAVINSKIS, L.S. Bacillus subtilis spores: a novel microparticle adjuvant which can instruct a balanced Th1 and Th2 immune response to specific antigen. Eur. J. Immunol., v. 37, n. 6, p.1538-47, 2007. BERMÚDEZ-HUMARÁN, L.G. et al. A novel mucosal vaccine based on live Lactococci expressing E7 antigen and IL-12 induces systemic and mucosal immune responses and protects mice against human papillomavirus type 16-induced tumors. J. Immunol., v.175, n. 11, p.7297-302, 2005. BERMÚDEZ-HUMARÁN, L.G. et al. Fusion to a carrier protein and a synthetic propeptide enhances E7 HPV-16 production and secretion in Lactococcus lactis. Biotechnol. Prog., v.19, n.3, p.1101-4, 2003. BOLHUIS, A. et al. Evaluation of bottlenecks in the late stages of protein secretion in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol., v. 65, n. 7, p. 2934-41, 1999. BOSCH, F.X. et al. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. International biological study on cervical cancer (IBSCC) Study Group. J. Natl. Cancer Inst., v. 87, p. 796–802, 1995. BRON, S.; LUXEN, E.; SWART, P. Instability of recombinant pUB110 plasmids in Bacillus subtilis: plasmid-encoded stability function and effects of DNA inserts. Plasmid, v. 19, p. 231-41, 1988. CALDERWOOD, S.K.; MAMBULA, S.S.; GRAY, P.J. Jr. Extracellular heat shock proteins in cell signaling and immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci., v.1113, p. 28-39, 2007. CHECHETKIN, V.R. Genetic code from tRNA point of view. J .Theor. Biol., v. 242, n. 4, p. 922-34, 2006. Review. CORTES-PEREZ, N.G. et al. Mice immunization with live lactococci displaying a surface anchored HPV-16 E7 oncoprotein. F.E.M.S. Microbiol. Lett., v. 229, n. 1, p. 37-42, 2003.

76

de VILLIERS, E.M. et al. Classification of Papilomaviruses. Virology, v. 324, n. 1, p. 17-27, 2004. Review. DETMER, A.; GLENTING, J. Live bacterial vaccines -a review and identification of potential hazards. Microb. Cell. Fact., v. 5, p. 23, 2006. Di Fabio, S., et al. Vaginal immunization of Cynomolgus monkeys with Streptococcus gordonii expressing HIV-1 and HPV 16 antigens. Vaccine, v.16, n. 5, p. 485-92,1998. DUC, L.H. et al. Bacterial spores as vaccine vehicles. Infect. Immun., v.71, p. 2810-18, 2003. FAHNESTOCK, S.R.; FISHER, K.E. Protease-deficient Bacillus subtilis host strains for production of Staphylococcal protein A. Appl. Environ. Microbiol., v. 53, n. 2, p. 379-84, 1987. FELTKAMP, M.C. et al. Vaccination with cytotoxic T lymphocyte epitope-containing peptide protects against a tumor induced by human papillomavirus type 16-transformed cells, Eur. J. Immunol., v. 23, p. 2242–2249, 1993. FERLAY, J.; BRAY, F.; PISANINI, P.; PARKIN, D.M. Globocan 2002: incidence, mortality and prevalence worldwide [CD-ROM]. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 2004. FERREIRA, L. C. S.; R. C.; FERREIRA.; SCHUMANN, W. Bacillus subtilis as a tool for vaccine development: from antigen factories to delivery vectors. An. Acad. Bras. Cienc., v. 77, p. 113-124, 2005. FUGLSANG, A. The effective number of codons for individual amino acids: some codons are more optimal than others. Gene, v. 320, p. 185-90, 2003. GALLUCCI, S.; MATZINGER, P. Danger signals: SOS to the immune system. Curr. Opin. Immunol., v. 13, n. 1, p. 114-9, 2001. GARNIER, T. et al. The complete genome sequence of Mycobacterium bovis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., v. 100, n. 13, p. 7877-82, 2003. GUNN, G.R. et al. Two Listeria monocytogenes vaccine vectors that express different molecular forms of human papilloma virus-16 (HPV-16) E7 induce qualitatively different T cell immunity that correlates with their ability to induce regression of established tumors immortalized by HPV-16. J. Immunol., v. 167, n. 11, p. 6471-9, 2001. GÜNTHER, J.; JIMÉNEZ-MONTEALEGRE, R. Effect of the probiotic Bacillus subtilis on the growth and food utilization of tilapia (Oreochromis niloticus) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) under laboratory conditions. Rev. Biol. Trop., v. 52, p. 937-943, 2004. HARWOOD, C.R. Bacillus subtilis and its relatives: molecular biological and industrial workhorses. Trends Biotech., v. 10, p. 247-256, 1992. Review.

77

HE, Q. et al. Live-attenuated influenza viruses as delivery vectors for Chlamydia vaccines. Immunology, v.122, n. 1, p. 28-37, 2007. HONG, H.A.; DUC, LE H; CUTTING, SM. The use of bacterial spore formers as probiotics. FEMS Microbial Rev., v. 29, p. 813-835, 2005. Review. HUANG, C.Y. et al. DNA vaccine encoding heat shock protein 60 co-linked to HPV16 E6 and E7 tumor antigens generates more potent immunotherapeutic effects than respective E6 or E7 tumor antigens. Gynecol. Oncol., v.107, n. 3, p. 404-12, 2007. ISTICATO, R. et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. J. Bacteriol., v. 183, p. 6294-6301, 2001. JABLONSKA, S.; MAJEWSKI, S. Human papillomavirus infection in women. Special aspects of infectious diseases in women. Clin. Dermatol., v.15, n. 1, p. 67-79, 1997. JANNIÈRE, L.; BRUAND, C.; ERLICH, S.D. Structurally stable Bacillus subtilis cloning vectors. Gene, v. 87, p. 53-61, 1990. KASHER, M.S.; WAKULCHIK, M.; COOK, J.A.; SMITH, M.C. One-step purification of recombinant human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein and its binding to the retinoblastoma gene product. Biotechniques, v. 14, n. 4, p. 630-41, 1993. KAUFMANN, S.H. et al. T-cells, stress proteins, and pathogenesis of mycobacterial infections. Curr. Top. Microbiol. Immunol., v.155, p. 125-41,1990. KIANG, J.G.; TSOKOS, G.C. Heat shock protein 70 kDa: molecular biology, biochemistry, and physiology. Pharmacol. Ther., v.80, n. 2, p.183-201, 1998. KONG, T.H. et al. Mycobacterium tuberculosis expresses two chaperonin-60 homologs. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v. 90, n.7, p. 2608-12, 1993. KOUTSKY, L.A.; GALLOWAY, D.A.; HOLMES, K.K. Epidemiology of genital human papillomavirus infection. Epidemiol. Rev., v.10, p. 122-63, 1988. LÁSARO, M.O. et al. Anti-tumor DNA vaccines based on the expression of human papillomavirus-16 E6/E7 oncoproteins genetically fused with the glycoprotein D from herpes simplex virus-1. Microbes Infect., v. 7, n.15, p. 1541-50, 2005. LÁSARO, M.O. et al. Targeting of antigen to the herpesvirus entry mediator augments primary adaptive immune responses. Nat. Med., v. 14, n. 2, p. 205-12, 2008. LI, W.; ZHOU, X.; LU, P. Bottlenecks in the expression and secretion of heterologous proteins in Bacillus subtilis. Res. Microbiol., v.155, p. 605-10, 2004. Review. LIMA, K.M.; dos SANTOS, S.A.; RODRIGUES, JM Jr.; SILVA, C.L. Vaccine adjuvant: it makes the difference. Vaccine, v.22, n.19, p. 2374-9, 2004. Review. LIN, C.W. et al. Oral vaccination with recombinant Listeria monocytogenes expressing human papillomavirus type 16 E7 can cause tumor growth in mice to regress. Int. J. Cancer., v. 102, n.6, p. 629-37, 2002.

78

LIN, K.Y. et al. Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class II presentation of tumor antigen. Cancer Res., v. 56, p. 21-26, 1996. LIU, H.; WU, B.H.; ROWSE, G.J.; EMTAGE, P.C. Induction of CD4-independent E7-specific CD8+ memory response by heat shock fusion protein. Clin. Vaccine Immunol., v. 14, n. 8, p. 1013-23, 2007. LONDOÑO, L.P. et al. Immunisation of mice using Salmonella typhimurium expressing human papillomavirus type 16 E7 epitopes inserted into hepatitis B virus core antigen. Vaccine, v. 14, n. 6, p. 545-52, 1996. LUIZ, W.B. et al. Boosting systemic and secreted antibody responses in mice orally immunized with recombinant Bacillus subtilis strains following parenteral priming with a DNA vaccine encoding the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) CFA/I fimbriae B subunit. Vaccine, v.26, n. 32, p. 3998-4005, 2008. MANJILI, M.H. et al. Cancer immunotherapy and heat-shock proteins: promises and challenges. Expert. Opin. Biol. Ther., v. 4, n. 3, p. 363-73, 2004. MANJILI, M.H. et al. Immunotherapy of cancer using heat shock proteins. Front. Biosci., v. 7, p. 43-52, 2002. Review. MAUL, B. et al. σB dependent regulation of gsiB in response to multiple stimuli in in Bacillus subtilis. Mol Gen Genet., v. 248, n.1, p. 114-20, 1995 MAURIELLO, E.M.F. et al. Display of heterologous antigens on the Bacillus subtilis spore coat using CotC as a fusion partner. Vaccine, v. 22, p. 1177-187, 2004. MC MURRAY, H.R.; NGUYEN, D.; WESTBROOK, T.F.; MCANCE, D.J. Biology of human papillomaviruses. Int. J. Exp. Pathol., v. 82, p. 15-33, 2001. MCCANCE, D.J. Human papillomaviruses and cervical cancer. J. Med. Microbiol., v. 47, p. 371-73, 1998. Review. MERCENIER, A.; MÜLLER-ALOUF, H.; GRANGETTE, C. Lactic acid bacteria as live vaccines. Curr. Issues Mol. Biol. v.2, n. 1, p.17-25, 2000. Review. MIKLOSKA, Z.; CUNNINGHAM, A.L. Herpes simplex virus type 1 glycoproteins gB, gC and gD are major targets for CD4 T-lymphocyte cytotoxicity in HLA-DR expressing human epidermal keratinocytes. J. Gen. Virol., v.79, p. 353-61, 1998. MIRECKA, E.A.; RUDOLPH, R.; HEY, T. Expression and purification of His-tagged HPV16 E7 protein active in pRb binding. Protein Expr. Purif., v. 48, n. 2, p. 281-91, 2006. MOORE, A.C.; HUTCHINGS, C.L.Combination vaccines: synergistic simultaneous induction of antibody and T-cell immunity. Expert Rev. Vaccines, v. 6, n.1, p. 111-21, 2007.

79

MOSKO, T. et al. Expression of herpes simplex virus 1 glycoprotein D in prokaryotic and eukaryotic cells. Acta. Virol., v. 48, n. 2, p. 97-107, 2004. Erratum in: Acta Virol., v. 48, n. 3, p. 188, 2004. MURASHIMA, K. et al. Heterologous production of Clostridium cellulovorans engB, using protease-deficient Bacillus subtilis, and preparation of active recombinant cellulosomes. J. Bacteriol., v.184, n. 1, p. 76-81, 2002. NAHMIAS, A.J.; LEE, F.K.; BECKMAN-NAHMIAS, S. Sero-epidemiological and -sociological patterns of herpes simplex virus infection in the world. Scand. J. Infect. Dis., v. 69, p. 19-36, 1990. NETZER, W.J.; HARTL, F.U. Protein folding in the cytosol: chaperonin-dependent and -independent mechanisms. Trends Biochem. Sci., v. 23, n. 2, p. 68-73, 1998. NGUYEN, H.D. et al. Construction of plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis exhibiting full structural stability. Plasmid, v.54, p. 241-8, 2005. NICHOLSON, W. L. et al. Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments. Microbiol. Mol. Biol. Rev., v. 64, p. 548-572, 2000. Review. NICHOLSON, W.L.; SETLOW, P. Dramatic increase in negative superhelicity of plasmid DNA in the forespore compartment of sporulating cells of Bacillus subtilis. J. Bacteriol., v. 172, n.1, p. 7-14, 1990. NORRILD, B. Immunochemistry of herpes simplex virus glycoproteins. Curr. Top. Microbiol. Immunol., v. 90, p. 67-106, 1980. Review. OJHA, A. et al. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell, v.123, n. 5, p. 861-73, 2005. OSTERLOH, A.; BRELOER, M. Heat shock proteins: linking danger and pathogen recognition. Med. Microbiol. Immunol., v.197, n. 1, p.1-8, 2008. PACCEZ, J.D. et al. Evaluation of different promoter sequences and antigen sorting signals on the immunogenicity of Bacillus subtilis vaccine vehicles. Vaccine, v. 25, n. 24, p. 4671-80, 2007. PACCEZ, J.D. et al. Stable episomal expression system under control of a stress inducible promoter enhances the immunogenicity of Bacillus subtilis as a vector for antigen delivery. Vaccine, v. 24, n. 15, p. 2935-43, 2006. PARKIN, D.M.; BRAY, F. Chapter 2: The burden of HPV-related cancers. Vaccine, v.24, S11-25, 2006. Suppl. 3. Review. PAZ-BAILEY, G.; RAMASWAMY, M.; HAWKES, S.J.; GERETTI, A.M. Herpes simplex virus type 2: epidemiology and management options in developing countries. Sex. Transm. Infect., v. 83, n. 1, p. 16-22, 2007.

80

PHELPS, W.C.; YEE, C.L.; MÜNGER, K.; HOWLEY, P.M. The human papillomavirus type 16 E7 gene encodes transactivation and transformation functions similar to those of adenovirus E1A. Cell, v. 53, n. 4, p. 539-47, 1988. POO, H. et al. Oral administration of human papillomavirus type 16 E7 displayed on Lactobacillus casei induces E7-specific antitumor effects in C57/BL6 mice. Int. J. Cancer, v. 119, n. 7, p. 1702-9, 2006. PUBLICOVER. J.; RAMSBURG, E.; ROSE J.K. Characterization of nonpathogenic, live, viral vaccine vectors inducing potent cellular immune responses. J. Virol., v. 78, n. 17, p. 9317-24, 2004. RAMON, G.; RICHOU, R.; DELAUNEY, G.; GERBEAUX, C. Production in bovines of staphylococcic anatoxin by means of a specific anatoxin alone or with the addition of aluminum hydroxide. C. R. Hebd. Seances Acad. Sci., v. 234, n. 17, p.1657-9, 1952. REINSTEIN, E. et al. Degradation of the E7 human papillomavirus oncoprotein by the ubiquitin-proteasome system: targeting via ubiquitination of the N-terminal residue. Degradation of the E7 human papillomavirus oncoprotein by the ubiquitin-proteasome system: targeting via ubiquitination of the N-terminal residue. Oncogene, v.19, n. 51, p.5944-50, 2000. RODEN, R.B.; LING, M.; WU, T.C. Vaccination to prevent and treat cervical cancer. Hum. Pathol., v. 35, n. 8, p. 971-82, 2004. RODU, B., et al. Prevalence of herpes simplex virus antibodies in dental students. J. Dent. Educ., v.56, n. 3, p. 206-8, 1992. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. SEWELL, D.A. et al. Recombinant Listeria vaccines containing PEST sequences are potent immune adjuvants for the tumor-associated antigen human papillomavirus-16 E7. Cancer Res., v.64, n. 24, p. 8821-5, 2004. SHARP, P.M. et al. DNA sequence evolution: the sounds of silence. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., v. 349, n.1329, p. 241-7, 1995. SIEGEL, D. et al. Prevalence and correlates of herpes simplex infections. The population-based AIDS in Multiethnic Neighborhoods Study. JAMA, v. 268, n. 13, p. 1702-8, 1992. SILVA, C.L. The potential use of heat-shock proteins to vaccinate against mycobacterial infections. Microbes Infect., v. 1, n. 6, p. 429-35, 1999. Review. SISK, W.P. et al. High-level expression and purification of secreted forms of herpes simplex virus type 1 glycoprotein gD synthesized by baculovirus-infected insect cells. J. Virol., v.68, n. 2, p. 766-75, 1994.

81

SMITH, J.S. et al. Human papillomavirus type distribution in invasive cervical cancer and high-grade cervical lesions: a meta-analysis update. Int. J. Cancer, v.121, n.3, p. 621-32, 2007. SPRUANCE, S.L. et al. A large-scale, placebo-controlled, dose-ranging trial of peroral valaciclovir for episodic treatment of recurrent herpes genitalis. Valaciclovir HSV Study Arch. Intern. Med., v.156, n. 15, p. 1729-35, 1996. TERPE, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 72, p. 211-22, 2006. Review. TITOK, M.A. et al. Bacillus subtilis soil isolates: plasmid replicon analysis and construction of a new theta-replicating vector. Plasmid, v. 49, p. 53-62, 2003. TODRYK, S.M.; MELCHER, A.A.; DALGLEISH, A.G.; VILE, R.G. Heat shock proteins refine the danger theory. Immunology, v. 99, n. 3, p.334-7, 2000. van KOOIJ, A. et al. High level expression and secretion of truncated forms of herpes simplex virus type 1 and type 2 glycoprotein D by the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Protein Expr. Purif., v. 25, n. 3, p. 400-8, 2002. WALBOOMERS, J.M. et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide, J. Pathol., v. 189, p. 12–19, 1999. WANG, H.H.; MAO, C.Y.; TENG, L.S.; CAO, J. Recent advances in heat shock protein-based cancer vaccines. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., v. 5, n. 1, p. 22-7, 2006. WEHRL, W.; NIEDERWEIS, M.; SCHUMANN, W. The FtsH protein accumulates at the septum of Bacillus subtilis during cell division and sporulation. J. Bacteriol., v. 182, n. 13, p. 3870-3, 2000. WERNESS, B,A.; LEVINE, A.J.; HOWLEY, P.M. Association of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53. Science, v.248, n. 4951, p. 76-9, 1990. WESTERS, L.; WESTERS, H.; QUAX, W.J. Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceutical proteins: a biotechnological approach to optimize the host organism. Biochim. Biophys. Acta, v.11, p. 299-310, 2004. YIN, J.; LI, G.; REN, X.; HERRLER, G. Select what you need: A comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes. J. Biotechnol., v. 127, p. 335-47, 2007. YOUNG, D.B. Structure of mycobacterial antigens. Br. Med. Bull, v. 44, n. 3, p. 562-83, 1988. ZÜGEL, U.; KAUFMANN, S.H. Immune response against heat shock proteins in infectious diseases. Immunobiology, v. 201, n. 1, p. 22-35, 1999. zur HAUSEN, H. Papillomavirus infections - a major cause of human cancers. Biochim. Biophys. Acta, v. 1288, n. 2, p. 55-78, 1996.

83

ANEXO I

Artigo publicado em periódico

84

ANEXO II

Resumos envidos a congressos

85

ANEXO III

Premiação

rafael ciro marques cavalcante - teses.usp.br · dissertação apresentada ao programa de...

Documents