qui346 cromatografia (2ª parte) cromatografia a...

19/07/2016

Prof. Mauricio X. Coutrim –

DEQUI - UFOP

CROMATOGRAFIA

(2ª Parte)

Cromatografia a

Líquido

QUI346

01

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

19/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI -

UFOP 2

MECANISMOS

CROMATOGRÁFICOS

19/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP 3

• Classificação dos tipos de cromatografia conforme os

mecanismos de separação.

• Cromatografia de:

Adsorção

Partição

Troca-iônica

Exclusão molecular

Bio-afinidade


UFOP 4

É o mais antigo tipo de

cromatografia.

Utiliza uma FM líquida ou

gasosa. Essa adsorvida na

superfície da FE sólida.

O equilíbrio entre as FM e FE

proporciona a separação dos

solutos eluidos.

CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO


UFOP 5

A FE líquida forma

um filme fino sobre

um sólido (suporte)

Os diferentes

equilíbrios

alcançados pelos

solutos entre a FM e

FE são os

responsáveis pela

separação destes.

CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO


UFOP 6

CROMATOGRAFIA IÔNICA

Cromatografia

por Par Iônico

Utiliza FE reversa.

Um reagente par

iônico (um tensoativo

com grupo alifático e

com carga oposta à

dos solutos) é

adicionado antes da

amostra. Na FM é

adicionado um

tampão (solvente

orgânico + água +

ácido ou base) que

deixará os solutos

ionizados.



UFOP 7

Cromatografia de Troca

Iônica

Cátions e ânions orgânicos

são ligados covalentemente a

diversos tipos de resinas (FE).

Solutos iônicos de cargas

opostas presentes na FM são

atraídos para a resina através

de forças eletrostáticas.



UFOP 8

AS PRINCIPAIS RESINAS

UTILIZADAS COMO

SUPORTE EM

CROMATOGRAFIA DE

TROCA-IÔNICA SÃO

AQUELAS BASEADAS NO

POLÍMERO ESTIRENO -

DIVINILBENZENO


UFOP 9

Ou Cromatografia por Permeação em Gel (GPC).

A FM passa através dos poros de um gel (FE) e os solutos presentes são separados por diferença de tamanho.

Os poros são geralmente pequenos e excluem os solutos de maior tamanho.

Moléculas maiores atravessam a coluna em menos tempo do que as menores.

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR


UFOP 10

Aplicações de GPC

a) Separação preliminar de uma amostra complexa (p. ex.

proteínas a serem analisadas por HPLC);

b) Análises de amostras de proteínas purificadas para

verificação da presença de dímeros, trímeros e outras

espécies agregadas;

c) Estimação da massa molar a partir da curva de

calibração;

d) Análise e controle de qualidade de polímeros orgânicos.


UFOP 11

Altamente seletiva! Baseia-se nas interações específicas entre

um tipo de molécula de soluto da FM e uma determinada

molécula imobilizada na FE.

CROMATOGRAFIA DE BIO-AFINIDADE

Exemplo: Um anticorpo

imobilizado na FE reage

com uma proteína

específica dentre os

diversos tipos de proteínas

presentes na FM. A

proteína é extraída da FE

alterando-se o pH ou a

força iônica da FM.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA EM COLUNA


SEM PRESSÃO (Clássica)

Características: tubo de vidro com extremidade superior aberta e

inferior com torneira; de 10 cm a alguns metros;

diâmetro variando de alguns centímetros a um metro;

FE geralmente é um sólido; FM flui pela gravidade

COM PRESSÃO (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - HPLC)

Características: tubo de aço de 5 a 50 cm, com pequeno diâmetro

(mm); FE geralmente é um líquido; FM flui pela

pressão de uma bomba peristáltica

A fase estacionária (sólido ou líquido) fica dentro de um cilindro (coluna)

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CLÁSSICA


A COLUNA CROMATOGRÁFICA

Características: tubo de vidro cilíndrico + torneira

Posição: vertical (gravidade)

Enchimento: lã de vidro na saída da tubo + fase estacionária

(adsorvente) misturada com o solvente

Eluição: amostra na parte superior + suporte + solvente (FM)

Coleta: frasco(s) coletor(es)

CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO


INTERAÇÕES ↔ POLARIDADE

Ordem decrescente de retenção por FE sólida (polar)

de substâncias por função química:

-COOH > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > -C=O >

-CO2R > -OCH3 > -CH=CH-

Algumas fases estacionárias para CL:

-Óxido de alumínio básico, neutro e ácido (63mm < dp < 200mm)

-Celulose microcristalina (63mm < dp < 200mm)

-Silicato de magnésio (75mm < dp < 150mm)

-Sílica gel (63mm < dp < 200mm)

CARACTERÍSTICAS DAS FE e FM EM CL CLÁSSICA


•O adsorvente deve ser ativado (D (200 oC a 200 oC / ± 4 horas)

•A atividade varia de lote para lote (não é reprodutível)

•Os adsorventes provocam alguns tipos de reações indesejáveis

(alumina condensa aldeídos e cetonas, carvão ativo provoca algumas

decomposições químicas e sílica isomeriza terpenos)

O eluente deve:

- Ser um bom solvente para a amostra e fracamente adsorvido pela FE

- Não interagir quimicamente com a FE nem com a amostra

- Ter baixo ponto de ebulição (35 – 85 oC)

- Ter polaridade adequada para o desenvolvimento cromatográfico

Eluentes em ordem crescente de polaridade:

Hexano, éter de petróleo, ciclohexano, tetracloreto de carbono,

benzeno, tolueno, diclorometano, clorofórmio, éter etílico, acetato

de etila, piridina, acetona, etanol, metanol e ácido acético

O ENCHIMENTO DA COLUNA E A ELUIÇÃO


- A eficiência da coluna será melhor quanto mais uniforme

for o enchimento

- Deve-se fazer uma pasta com o adsorvente e a FM

- A adição dessa pasta na coluna deve ser feita com essa já

contendo 1/3 de FM

- As bolhas de ar devem ser eliminadas com a vibração da

coluna (essa ação também homogeneíza o enchimento)

- A FM deve sempre estar cerca de 2 cm acima da FE

(sólido)

- A adição da FM não deve perturbar a FE

- A vazão da FM deve ser constante e adequada

UTILIZAÇÃO DE CL CLÁSSICA


- Separação e purificação de intermediários

de síntese orgânica

- Purificação de solventes (escala

preparativa)

- Separação de esteróides da urina e do

sangue

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICÊNCIA (HPLC)


Diferentemente da CLC utiliza pressão na eluição da FM

Início nos anos 70 com a disponibilidade de colunas recheadas com partículas de pequenos diâmetros (3 a 10 mm).

Nos anos 70 e 80 vários detectores foram desenvolvidos (>10) A partir dos anos 80 já é comumente utilizada

Dimensões típicas de colunas:

1. Comprimento: de alguns mm a vários cm (m)

2. Diâmetro: 2 a 5 mm e 3 a 200 mm (micro coluna)

3. Fast HPLC (comp ~ 3mm e dp menores)

Utilização: 50% (biotecnologia, biomedicina, bioquímica e farmácia) Analytical Chem. vol 62, no. 19, oct 1 1990

TEORIA BÁSICA A Banda Cromatográfica


UFOP 19

Após a injeção, as moléculas do analito começam a ser arrastadas, mas elas se dispersam, distribuindo-se pela coluna segundo o perfil de uma distribuição gaussiana:

A largura da banda (pico cromatográfico) é função do parâmetro s da distribuição

gaussiana associada à eluição (wb » 4 s).

O tempo médio que as moléculas de um analito demoram para atravessar a coluna é o tempo de retenção tR.

TEORIA BÁSICA O Tempo de Retenção


UFOP 20

tR

tM

tR’ = tR - tM

TEMPO

SIN

AL

tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico

cromatográfico)

tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um

composto que não interaja com a FE atravessar a coluna)

tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito

passam sorvidas na FE)

CROMATOGRAMA

EFICIÊNCIA CROMATOGRÁFICA


UFOP 21

A migração de um analito pela

coluna provoca inevitavelmente

o alargamento da sua banda:

Efeitos do

alargamento

excessivo de picos:

Picos mais largos e menos intensos =

menor detectabilidade.

Separação deficiente de analitos com

retenções próximas.

EFICIÊNCIA: Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.

EFICIÊNCIA CROMATOGRÁFICA

19/07/2016 Prof. Mauricio X. Coutrim – DEQUI - UFOP

22

Supondo a coluna cromatográfica

como uma série de estágios

hipotéticos e separados onde

ocorre o equilíbrio entre o analito,

a FE e a FM:

O número de pratos teóricos (N) de

uma coluna pode ser calculado por:

ASSIMETRIA


UFOP 23

O fator de assimetria (As),

medido a 10% da altura,

também fornece

informações sobre a

eficiência cromatográfica.

Picos cromatográficos de

Compostos eluídos

eficientemente apresentam:

0,8 < A10 < 1,2 As = B / A

RESOLUÇÃO


UFOP 24

RESOLUÇÃO (Rs) expressa

a separação efetiva entre

dois picos adjacentes

FATORES QUE AFETAM A RESOLUÇÃO


UFOP 25

EFEITO DA EFICIÊNCIA, DA RETENÇÃO E DA SELETIVIDADE NA

RESOLUÇÃO CROMATOGRÁFICA

Resolução = x x

N e k se referem ao composto

mais retido

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Critérios de Escolha


UFOP 26

Seleção da Modalidade e

Mecanismo de

Separação

ESQUEMA DO APARELHO DE HPLC


Reservatório FM

/ Degaseificador Recuperação

/ Descarte

HPLC - INSTRUMENTAÇÃO


UFOP 28

Cromatógrafo Líquido de Alta

Eficiência (HPLC) com Detetores

UV-Vis, Indíce de Refração e

Espectrofluorimétrico.

Marca/Modelo: Shimadzu

HPLC-IT-TOF Shimadzu

HPLC - INSTRUMENTAÇÃO


UFOP 29

Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (HPLC) da Agilent (HP)

HPLC vs UHPLC (UPLC)


1. DIÂMETRO DE PARTÍCULA DA FE

i. Clássica (63mm < dp < 200mm)

ii. HPLC (2mm < dp < 10mm)

iii. UHPLC (2mm < dp < ? (1,2)mm)

2. PRESSÃO MÁXIMA

i. Clássica (atmosférica)

ii. HPLC (100 a 300 atm; 500 a 4000 psi)

iii. UHPLC (UPLC) (acima de 1000 atm; 15000 psi)

Menor diâmetro de partícula (FE) maior área

superficial maior EFICIÊNCIA maior pressão (FM)

Artigo referência para uma abordagem atual sobre UHPLC:

L Maldaner e ICSF Jardim. Scientia Chromatographica v4, n3, p197-207, 2012.

Disponível em http://www.scientiachromatographica.com/files/v4n3/v4n3a14.pdf

PRINCIPAIS PARTES DO SISTEMA HPLC


1. SISTEMA DE INJEÇÃO DA AMOSTRA

2. FASE MÓVEL (FM)

3. FASE ESTACIONÁRIA (FE) = COLUNA

4. SISTEMA DE DETEÇÃO

INJEÇÃO DA AMOSTRA NO HPLC


UFOP 32

Injeção Manual

Injeção automática

• Injetor com pistão automático

• Injetor pneumático por sucção

INJETOR PARA HPLC


UFOP 33

Esquema de Injetor de seis vias para HPLC

INJETOR PARA HPLC


UFOP 34

Esquema de Injetor tipo Rheodyne de seis vias

INJETOR PARA HPLC


Tipo mais comum

é um com uma

válvula de 6 vias (3

entradas e 3

saídas) (Rodyne®)

FASE MÓVEL: ISOCRÁTICA x GRADIENTE


A separação de um soluto em uma coluna se dá devido às diferenças nas

afinidades entre esse e a FM e a FE: maior afinidade pela FM mais rápida a

eluição (menor tR) e maior afinidade pela FE maior o tR.

Tipos de FM: Isocrática e Gradiente

(com força linear de solvente-LSS)




2. FASE MÓVEL (FM)



FASE MÓVEL: ISOCRÁTICA x GRADIENTE


A eluição por gradiente melhora a resolução e a separação dos picos, além

da largura na base ficar mais fina e mais semelhantes ( ↑ N)

Em LSS (força linear

de solvente), K’ (fator

de retenção ou

capacidade) médio é

praticamente o

mesmo para todos os

solutos que eluem

em diferentes

tempos.

CARACTERÍSITICAS DA FM


Possuir alto grau de pureza

Solubilizar a amostra

Ser inerte à FE (não decompô-la)

Ser inerte aos componentes da amostra (não reagir)

Ter baixa viscosidade

Ser compatível com o detector

Ter polaridade adequada à separação

POLARIDADE DA FM


UFOP 40

SÉRIE

ELUOTRÓPICA

(ordem dos

solventes utilizados

como FM em ordem

crescente de

polaridade).

COMPOSIÇÃO DA FM


UFOP 41

EM HPLC O

DESENVOLVIMENTO

CROMATOGRÁFICO É

MUITO DEPENDENTE

DA COMPOSIÇÃO DA

FASE MÓVEL

COLUNA DE FASE REVERSA (C18)

(DMF, acetona, benzonitrila,

benzeno, tolueno e naftaleno)


UFOP 42

The chromatograms right show the

results of separations of protein

mixtures by ion exchange

chromatography. The lettered

peaks correspond to different

proteins (A = ovalbumin, B =

conalbumin, C = cytochrome c, D

= lysozyme). The separation

corresponding to the

chromatogram on the left was

performed at pH 5.85, while the

one on the right was performed at

pH 6.5. It is evident that operation

conditions such as pH and

temperature have a significant

effect on the output.

INFLUÊNCIA DO pH CROMATOGRAFIA DE ÍONS

COMPOSIÇÃO DA FM


UFOP 43

INFLUÊNCIA DO pH CROMATOGRAFIA DE ÍONS

INFORMAÇÕES

DA COLUNA

COMPOSIÇÃO DA FM




2. FASE MÓVEL (FM)



FASE ESTACIONÁRIA IDEAL


Consiga executar a análise no menor tempo possível

Com máxima capacidade de amostra

Com a melhor resolução na separação

Com fácil introdução da amostra

Produzindo menor queda de pressão possível

Com o custo mais baixo possível

FASE ESTACIONÁRIA PARA HPLC


5 TIPOS DIFERENTES:

1. CLS (adsorção) p.ex. sílica e alumina (FN)

2. CLL (partição) suporte sólido recoberto por líquido (FR)

3. CLFL (partição) p.ex.HC ligado a um suporte sólido (FR)

ou –NH2 ligado ao suporte (FN)

4. CET (exclusão de tamanho) p. ex. sílica ou resina cruzada

5. CTI (interação iônica) p.ex. Est-DVB + –SO3¯ ou –NR3+

TIPOS DE FE QUANTO AO

MECANISMO DE SEPARAÇÃO

SÍLICA PARA FE EM HPLC


UFOP 47

A SÍLICA É O PRINCIPAL COMPOSTO

UTILIZADO COMO PARTÍCULA EM FASE

ESTACIONÁRIA PARA HPLC

FE QUIMICAMENTE LIGADA


1. Si-OH (silanol) + ROH Si-O-R (éster silicato) + H2O

2. Si-OH + R3SiCl (organoclorosilano) Si-O-SiR3 (siloxano) + HCl

3. Si-OH — Si-Cl + RLi Si-R (silício-carbono) + LiCl

SOCl

OBS: O método 1 produz fase menos estável enquanto os métodos 2

e 3 produzem fases estáveis a pH <8

FE QUIMICAMENTE LIGADA


CLASSIFICAÇÃO DA FE (TIPO DE PARTÍCULA)


Sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos

Partículas porosas ou peliculares

Partículas esféricas ou irregulares

Partículas com diferentes diâmetros

PARTÍCULAS PARA FE EM HPLC


UFOP 51

AS PARTÍCULAS QUE

COMPÕEM A FASE

ESTACIONÁRIA EM HPLC

TÊM IMPORTÂNCIA

FUNDAMENTAL, POIS

DELAS DEPENDEM A

EFICÊNCIA DA SEPARAÇÃO.

O LIMITE DE PRESSÃO A

SER UTILIZADO TAMBÉM

DEPENDE DELAS!



UFOP 52

QUANTO MENOR O

TAMANHO DA PARTICULA

MAIOR A ÁREA

SUPERFICIAL E MAIOR A

RESISTÊNCIA PARA A

PASSAGEM DA FM

Fonte:

http://www.phenomenex.com/Kinetex/Selectivities/Biphenyl?returnURL=/Produc

ts/Search/HPLC (consultado em 13/nov/14)

HPLC

UHPLC

ou

UHPLC

http://www.phenomenex.com/Kinetex/Selectivities/Biphenyl?returnURL=/Products/Search/HPLC






UFOP 53

EFEITO NA SEPARAÇÃO PELO TAMANHO DA PARTÍCULA

Fonte: http://www.allcrom.com.br/kinetex.html (consultado em 13/nov/14)

1 2

3

1 – coluna comum (dp = 5 mm)

2 – coluna (dp = 2,6 mm) com pressão

comum

1 – coluna (dp = 2,6 mm) com alta

pressão (UPLC)

ENCONTRE AS FÓRMULAS DE PELO MENOS SETE DESSES FÁRMACOS E

COLOQUE-OS NUMA ORDEM CRESCENTE DE POLARIDADE.

http://www.allcrom.com.br/kinetex.html

http://www.allcrom.com.br/kinetex.html



UFOP

ESTRUTURAS MOLECULARES DOS FÁRMACOS

OBS: Estruturas retiradas de páginas da wikipédia

1) procainamida

2) Acetaminofen / Paracetamol

3) Ácido fólico

4) sulfatiazol

5) acetobutol

6) dextrometorfano

7) difenidramina

8) Propafenona

9) Amitriptilina

10) Fluoxetina (R,S)

11) naproxeno

12) Difunisal

13) Indometacina

3) Ácido fólico

H2N

1) p

H3C

6) d

11)

H3C



UFOP 55

CADA FAIXA DE

TAMANHO DE

PARTÍCULA

APLICA-SE A

UM TIPO DE

SEPARAÇÃO.



UFOP 56

EXEMPLO DE PARTÍCULAS PELICULARES (NÚCLEO

SÓLIDO COM CAMADA POROSA).



É o nome que se dá

ao processo de se

ligar grupos

trimetilsilil aos

grupos silanóis

resultantes em fase

estacionária

quimicamente ligada

para evitar que

grupos mais polares

apresentem picos

com caldas.

Esse processo dá

mais durabilidade à

fase estacionária.

ENDCAPPING



UFOP 58

TIPOS DE FASE

ESTACIONÁRIAS

PARA HPLC

(hidrofóbicas)

Fonte: http://www.phenomenex.com/Kinetex/Selectivities/Biphenyl?returnURL=/Products/Search/HPLC (consultado em 13/nov/14)






UFOP 59

TIPOS DE FASE ESTACIONÁRIAS PARA

HPLC (hidrofílicas e aromáticas)

Fonte: http://www.phenomenex.com/Kinetex/Selectivities/Biphenyl?returnURL=/Products/Search/HPLC (consultado em 13/nov/14)






UFOP 60

FASE ESTACIONÁRIA QUIRAL (ciclodextrinas - CD)

Fonte: Shodex, colunas para HPLC. http://www.shodex.net/index.php?seitenid=19 (consultado em 15/nov/14)

Para separação de

isômeros óticos a fase

estacionária também deve

apresentar isomeria ótica



UFOP 61

APLICAÇÃO:

WARFARINA

(anticoagulante)

Fonte: Shodex, colunas para HPLC. http://www.shodex.net/index.php?seitenid=19 (consultado em 15/nov/14)

FE QUIRAL com

ciclodextrina



UFOP 62

Fonte: http://az621941.vo.msecnd.net/documents/e1e6bbfa-

9759-4293-bcea-c72db79131da.pdf (consultado em 13/nov/14)

celulose

FASE ESTACIONÁRIA QUIRAL

(celulose e amilose)

fenilcarbamato

-CH3

-CH3

3,5 dimetil

http://az621941.vo.msecnd.net/documents/e1e6bbfa-9759-4293-bcea-c72db79131da.pdf












UFOP 63

APLICAÇÃO:

DISOPIRAMIDA

(antiarrítmico p/

tratamento da

taquicardia

ventrícular) Fonte: https://phenomenex.blob.core.windows.net/documents/fac273de-826b-4502-

b5ac-eb748b3130f3.pdf (consultado em 15/nov/14)

FE QUIRAL com celulose

https://phenomenex.blob.core.windows.net/documents/fac273de-826b-4502-b5ac-eb748b3130f3.pdf













2. FASE MÓVEL (FM)



DETECTOR IDEAL PARA HPLC


Alta sensibilidade e baixo limite de detecção

Resposta rápida a todos os solutos

Insensível a mudanças de temperatura, composição e vazão da FM

Pequeno volume extra (alargamento do pico)

Resposta linear com a massa de soluto

Não destrutivo

Seguro e conveniente para a utilização

Fornecer resposta qualitativa sobre o composto detectado

DETECTORES EM HPLC


OS MAIS COMUNS:

Refractive Index (RI),

Ultra-Violet (UV) (l fixo e varável),

Fluorescent,

Radiochemical,

Electrochemical,

Near-Infra Red (Near-IR),

Mass Spectroscopy (MS),

Nuclear Magnetic Resonance (NMR),

Light Scattering (LS).

Sensibilidade (g.mL-1)

(10-8 a 10-9)

(10-9 a 10-11)

(10-9 a 10-10)

(10-12 a 10-15)

(10-8 a 10-10)

LINEARIDADE DE DETECÇÃO


Limite de detecção (LD) = 3 x ruído

Limite superior LS) = maior valor da curva

Faixa dinâmica = LS / LD

DETECTOR IR (ÍNDICE DE REFRAÇÃO)


Fonte: http://www.shodex.net/index.php?seitenid=1&applic=1485, consultado em 15/nov/14

Detector por Índice de Refração

VANTAGENS

1) Detector universal

2) Adequado para substâncias que não

absorvam energia UV-Vis

3) Útil nos casos de solventes que

absorvam fortemente na região UV

(P. ex., solventes para GPC)

4) A relação do sinal (IR) é diretamente

correlacionada com a concentração

do analito

http://www.shodex.net/index.php?seitenid=1&applic=1485



DETECTOR UV (Diode Array)


Fonte: Jones, Analytical Chemistry,1985, Vol. 57, pp. 1057-1073

Detector de UV-Vis com arranjo de diodos

DETECTOR DE FLUORESCÊNCIA


UFOP 70

EXEMPLOS DE UTILIZAÇÃO:

1. Determinação de DNA/RNA,

Enzima, funcionalidade e

bioquímica de proteína;

2. Determinação de PAH

Diagrama do detector de fluorescência em um

único comprimento de onda de excitação (Scott, Raymond P. W. Chromatographic detectors: design, function, and operation,

Series: Chromatographic Science, Marcel Dekker, Inc. v.70, p.202, 1996)

DETECÇÃO POR FLUORESCÊNCIA


UFOP 71

Naftaleno Acenafteno

Acenaftileno

Fuoreno

Fenantreno An traceno

Fluoranteno Pireno

Benzo[a]Antraceno * Criseno *

Benzo[g,h,i]Perileno Dibenzo[a,h]Antraceno * Indeno[1,2,3 - cd]Pireno *

Benzo[b]Fluoranteno * Benzo[k]Fluoranteno *

Benzo[a]Pireno *

Figura 1 - Estrutura dos 16 HPAs incluídos na lista de poluentes prioritários da

EPA. As estruturas assinaladas com (*) referem-se aos HPAs carcinogênicos.

Determinação de Hidrocarbonetos

Policíclicos Aromáticos (HPA´s)

A

P

L

I

C

A

Ç

Ã

O

DETERMINAÇÃO DE HPA´s


UFOP 72



UFOP 73

M

E

T

O

D

O

L

O

G

I

A



UFOP 74

C

R

O

M

A

T

O

G

R

A

M

A



UFOP 75

C

O

N

C

E

N

T

R

A

Ç

Õ

E

S

L

I

M

I

T

E

S

DETECTOR DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS


UFOP 76

EXEMPLOS DE UTILIZAÇÃO:

Determinação de substâncias

presentes nas folhas de chá verde

por UPLC/LCMS-IT-TOF

Fonte: http://www.shimadzu.com/an/lcms/lcmsittof/ittof.html, consultado em 16/nov/14

Fonte: http://www.shimadzu.com/an/lcms/lcmsittof/metabo-

example.html, consultado em 16/nov/14

http://www.shimadzu.com/an/lcms/lcmsittof/ittof.html

http://www.shimadzu.com/an/lcms/lcmsittof/ittof.html

http://www.shimadzu.com/an/lcms/lcmsittof/metabo-example.html




PRINCÍPIO A amostra é fragmentada e ionizada em um padrão

característico da espécie química (analito).

1 Moléculas da amostra são bombardeadas por elétrons (electron impact =

EI) ou íons (chemical ionization = CI):

ABCDE + e- ABCDE.+ + 2 e-

2 O íon formado se fragmenta: ABCDE.+ AB

. + CDE+

ABCDE.+ AB+ + CDE

.

ABCDE.+ A+ + BCDE

.

3 Os íons formados são separados de acordo com suas massas e cargas

Ab

un

dân

cia

Massa / Carga

O gráfico do número de íons

formados em função da razão

Massa / Carga dos íons é o

ESPECTRO DE MASSAS do analito

DETECTOR DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS

MONITORAMENTO DO ÍON SELECIONADO (SIM = Single Ion Monitoring)

Seleciona-se um fragmento resultante da fragmentação da espécie de interesse.

Gera-se o cromatograma plotando-se o número de íons detectados com a massa

desse fragmento em função do tempo.

Espectros de massas completos coletados e arquivados em

intervalos regulares de tempo

Geração do cromatograma a partir dos espectros:

CROMATOGRAMA DE ÍONS TOTAIS (TIC = Total Ion Chromatogram)

Para cada espectro o número total de íons detectados na faixa de massas

varrida é somado e plotado em função do tempo, gerando o cromatograma.

TIC

Universal

Similar a DIC

SIM

Seletivo

Maior Sensibilidade

DETECTOR DE EM: GERAÇÃO DO CROMATOGRAMA

TIC = Total Ion

Chromatogram Aparecem os picos

correspondentes a todas

substâncias eluídas

SIM = Single Ion

Monitoring (m/z = 149) Cromatograma construído a

partir dos mesmos dados

acima, mas apenas usando

fragmentos com massa = 149

(ftalatos: plastificante)

DETECTOR DE EM: (LC-MS/MS): TIC x SIM X SRM


Idealmente os analitos devem estar presente na amostra em

condições de análise (injeção direta da amostra no sistema

cromatográfico)

Na realidade, as amostras precisam ser preparadas para o

sistema cromatográfico

Extração:

Limpeza da amostra (clean up)

Concentração dos analitos da amostra

Derivatização:

Muitos analitos não são adequados para a separação e/ou

detecção

PREPARAÇÃO DA AMOSTRA (analitos)

DIVERSAS TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO


1) Extração líquido-líquido (LLE),

2) Extração por Soxhlet (p.ex., p/ extração de lipídeos),

3) Extração por arraste de vapor (p.ex., p/ óleos essenciais),

4) Extração líquido-líquido a baixa temperatura (LLE-PLT,

liquid-liquid extraction with partition at low temperature),

5) Extração sólido-líquido a baixa temperatura (SLE-LTP,

solid-liquid extraction with low temperature partitioning),



6) Extração em fase sólida (solid phase extraction, SPE),

7) Extração por headspace (HS),

8) Microextração em fase sólida (SPME),

9) Microextração em gota única ( SDME, single drop micro

extraction).

10)Headspace e microextração em fase sólida (HS-SPME),



11) Extração assistida por micro-ondas (microwave-assisted

extraction, MAE),

12) Extração assistida por ultrassom (ultrassonic-assisted

extraction, UAE),

13) Extração em fluído supercrítico (supercritical fluid

extraction, SFE),

14) Extração subcrítica com água (líquida a altas temperaturas

e pressão) (Subcritical water extraction, SWE), etc.

EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS)


Etapas do processo de EFS:

1) condicionamento do cartucho (uso de solvente adequado

para disponibilizar os sítios ativos e para ajustar as forças

dos solventes de eluição com o solvente da amostra);

2) extração dos analitos da amostra pela passagem desta no

cartucho;

3) lavagem do cartucho para eliminar possíveis interferentes;

4) eluição dos analitos de interesse para posterior análise.

EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA


Sistema de vácuo Manifold para a

extração das amostras

Cartuchos com fase sólida (FS) C18

para extração de compostos

orgânicos de amostras complexas

EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA


Vantagens da EFS:

1) diminuição do tempo de extração das amostras,

2) automação do sistema de extração permitindo que várias

amostras sejam extraídas simultaneamente,

3) utilização de pequenos volumes de solvente para eluição

e condicionamento,

4) eliminação de outras etapa de clean-up das amostras (a

fase estacionária retem apenas os analitos de interesse).

7/19/2016 QUI 149 / Mauricio - DEQUI - UFOP 87

DERIVATIZAÇÃO

Tipos: 1) pré-coluna 2) pós-coluna

Técnica utilizada com diversas finalidades em cromatografia. Nela o analito é reagido, antes ou depois da separação, com a finalidade de melhorar a análise, qualitativa ou quantitativamente. Essa reação deve ser rápida, quantitativa e com poucos subprodutos. Em CG, muitas vezes, a polaridade do analito é diminuída.

Aspectos: Qualitativo: o derivado apresenta sinal numa região específica

de detecção (eliminação de interferentes). Quantitativo: o sinal do derivado é muito maior do que o

respectivo analito (aumento do limite de detecção).


DETERMINAÇÃO DE ALDEÍDOS E CETONAS

Reagente derivatizante:

a) dimedona (5,5-dimetil-1,3-ciclohexanodiona (dimedona)

b) 1,3-ciclohexanodiona

c) acetilacetona

d) 3-aminofluoranteno

e) cloridrato de o-benzilhidroxilamina

f) cloridrato de metoxilamina

g) 2,4 dinitrofenilhidrazina (2,4-DNFHi)

h) bissulfito de sódio (NaHSO3)


DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS POR CG

a) Esterificação

a1) metanol / BF3 : R-COOH + H3COH R-COOCH3 + H2O

a2) diazometano : R-COOH + H2C R-COOCH3 + N2

a3) metanol / ácido: R-COOH + H3COH R-COOCH3 + H2O

b) Sililação (-COOH + -OH; -SH; -NH2; =NH)

b1) hexametildisilazano (HMDS) / trimetilclorosilano (TMCS)

R-OH + (CH3)3-Si-NH-Si-(CH3)3 (HMDS) + (CH3)3-Si-Cl (TMCS) R-O-Si-(CH3)3 (éter silílico) + NH4Cl

b2) bis-trimetilsililacetamida (CH3)3-Si-O-C(CH3)=N-Si-(CH3)3

R-OH + BSA R-O-Si(CH3)3 + H3C-C(=O)-NH-Si-(CH3)3

b3) bis-trimetilsililtrifluoracetamida (BSTFA)

(CH3)3-Si-O-C(CF3)=N-Si-(CH3)3

N

N

90

DETERMINAÇÃO DE AMINOÁCIDOS (I)

M.Y. Khuhawar , A.D. Rajper. Journal of Chromatography B, 788 (2003) 413–418

Agente derivatizante: 2-hidroxi-naftaldeído (HN) Analitos: Ácido g-aminobutírico (GABA) e outros aminoácidos Característica: separação por HPLC e detecção espectrofluorescente

To the solution (1 ml) containing GABA (5.6–140mg) separately or GABA (5.6–140 mg),

glycine (30–750mg), tyramine (39–975 mg), lysine (58–1460mg) in a mixture was added

0.6 ml borax buffer pH 8 and 1 ml of derivatizing reagent HN (0.3% w/v in methanol).

The solution was heated on a water bath at 80oC for 10 min and was allowed to cool.

The final volume was adjusted to 5 ml with methanol. The solution (5 ml) was injected

on Phenomenex C18, 5mm (150x4.6 mm I.D.) and eluted with methanol: water (62:38

v/v) with a flow-rate 1 ml/min. The detection UV was at 330nm.

Derivado de glicina-HN Derivado de GABA-HN

derivatização/det ac aminobutirico por derivatização j chromat B 2003.pdf







91

DETERMINAÇÃO DE AMINOÁCIDOS (II)

Q. Weng, W. Jin Analytica Chimica Acta 478 (2003) 199–207

Agente derivatizante: naftaleno-2,3-

dicarboxaldeído (NDA) / CN-

Analitos: serina (Ser), alanina (Ala), taurina (Tau) e

glicina (Gly)

Característica: separação por CE e detecção

eletroquímica

Limite de detecção: 3,0.10-7 mol.L-1 (serina)

derivatização/det aminoacido por derivat anal chim acta 2003.pdf






92

DETERMINAÇÃO DE AMINAS ALIFÁTICAS

Li-Wei Cao, Hong Wang, Xin Liu, Hua-Shan Zhang. Talanta 59 (2003) 973-979

Agente derivatizante: 2,6-dimetilquinoline-4-(N-succinimidil)-formiato

Analitos: aminas alifáticas primárias e secundárias

Característica: derivados fortemente fluorescentes

Limite de detecção: 1,94.10-10 mol.L-1 (detecção espectrofluorescente)

p-toluidina

acetaldeído

Ácido pirúvico

2,6-dimetilquinolina-4-

formiato

N-hidroxi

succinimida N,N´ diciclo hexil

carbodiimida

derivatização/det aminas alifáticas por derivatização talanta 2003.pdf

DETERMINAÇÃO DE ISOCIANATOS

Agente derivatizante: 4-Nitro-7-piperazino-2,1,3-benzoxadiazol(NBDPZ) Analitos: mono e di isocianatos no ar

Característica: separação por CE e detecção eletroquímica

Limite de detecção: 11-35 (UV-vis) e 5-9 (fluorescência) nmol.L-1

M. Vogel, U. Karst Anal. Chem. 2002, 74, 6418-6426

HPLC - Coluna: Discovery RP 18 (Supelco, Deisenhofen,

Germany); particle size 5mm; pore size 200 Å; 150 mm x 3 mm.

4-chloro-7-

nitro-2,1,3-

benzoxadiazol

piperazina

isocianatos

NBDPZ-uréia

derivatização/det isocianato por derivat anal chem 2002.pdf



7/19/2016 94

REVISÃO DE MÉTODOS DE DERIVATIZAÇÃO

T. Fukushima, N. Usui, T. Santa, K. Imai.

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30 (2003) 1655

Técnicas: HPLC e CE Detecção: fluorescência e quimioluminescência Aplicação: bioamostras Abrangência: 180 artigos (1982-2002) Destaque: CE com fluorescência induzida a laser ld = atto

(10-18) a yocto (10-21) mol e tempo de análise ~ min.

derivatização/met derivatização CL e EC review 2003.pdf












VANTAGENS E DESVANTAGENS DA HPLC


Vantagens:

1. Menor tempo de análise (min a hs)

2. Alta resolução

3. Resultados quantitativos (erros < 0,5%)

4. Boa sensibilidade (deteção ~10-12g)

5. Versatilidade (só limitada para gases)

6. Automatização Desvantagens:

1. Alto custo instrumentação ($ 30 a 60 mil)

2. Operação cara (reagentes de alta pureza)

3. Requer acessórios para análise qualitativa

4. Não há um detector universal e sensível

5. Requer muita experiência para utilização

HPLC x HRGC


Principal vantagem da HRGC (Cromatografia Gasosa Alta

Resolução / coluna capilar):

Serve para amostras gasosas

Análises com muitos analitos mais rápidas

Vantagens da HPLC:

Possui duas fases interagindo com a amostra

Possui uma variedade maior de mecanismos de separação

Separa compostos termicamente instáveis

A injeção da amostra é facilmente reproduzida

HPLC e HGGC são técnica complementares

FUTURO PARA HPLC


O Mapemeamento do genoma humano requer colunas menores

Indústria farmacêutica necessita de colunas quirais com mais eficientes e de alta capacidade na produção de enantiômeros ativos

O monitoramento ambiental requer colunas específicas (p.ex. quelatos para separação de metais em água)

Colunas rápidas para monitorar fermentação e outras reações

HPLC-MS será cada vez mais importante em medicina forense (determinação de doping em atletas)

Resinas orgânicas podem substituir a sílica com sucesso

Aumentos das técnicas hifenizadas

Utilização de robôs para análise de substâncias perigosas

Brown, P.R. Analytical Chemistry, 1990, Vol. 62, pp. 995-1008

APLICAÇÃO DE HPLC


TODAS AS APRESENTAÇÕES DE SEMINÁRIOS DA

DISCIPLINA SERVEM COMO EXEMPLO DE APLICAÇÃO DA

TÉCNICA DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA

EFICIÊNCIA (HPLC) EM DIVERSAS ÁREAS DO

CONHECIMENTO (p.ex., FARMÁCIA)

qui346 cromatografia (2ª parte) cromatografia a...

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