Aula 5 – Cromatografia líquida

Julio C. J. Silva

Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) Instituto de Ciências Exatas

Depto. de Química

Juiz de Fora, 2016

QUI 154 – Química Analítica V Análise Instrumental

Introdução • Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é o tipo mais versátil e

mais amplamente empregado de cromatografia por eluição.

• Na cromatografia líquida, a fase móvel é um solvente líquido, o qual contém a amostra na forma de uma mistura de solutos.

• O tipo de cromatografia líquida de alta eficiência é geralmente definido pelo mecanismo de separação ou pelo tipo de fase estacionária:

• (1) partição ou cromatografia líquido-líquido;

• (2) adsorção ou cromatografia líquido-sólido;

• (3) troca iônica ou cromatografia de íons;

• (4) cromatografia por exclusão;

• (5) cromatografia por afinidade;

• (6) cromatografia quiral.

• A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tornou-se uma ferramenta analítica indispensável.

• Os laboratórios criminais e os programas de televisão policiais e forenses, como CSI, CSI Miami, Crossing Jordan e Law and Order, freqüentemente empregam a CLAE no processo de obtenção de evidências criminais.

Introdução • No início:

– Diâmetro interno = 10 – 50 mm

– Recheios: 150 – 200 m (para acelerar a separação): porém... !!!!

– Efeito do tamanho de partícula do recheio e vazão sobre H

Introdução

• Nos anos de 1960 que se desenvolveu a tecnologia para produzir e utilizar recheios com diâmetros de partículas tão pequenos como 3 a 10 µm;

• Necessidade de instrumentos capazes de fornecer pressões de bombeamento muito altas;

• Necessidade de detectores para o monitoramento contínuo do analitos;

• O termo cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é sempre empregado para distinguir essa tecnologia dos procedimentos cromatográficos realizados em colunas simples que os precederam;

• A cromatografia de coluna simples, contudo, ainda encontra considerável uso para propósitos preparativos.

Instrumentação

• Cromatografia líquida moderna:

– Altas pressões de bombeamento velocidades

razoáveis por recheios de partículas muito pequenas (3 – 10 µm)

– Equipamentos mais complexos

– Equipamentos mais caros

Soluto

Instrumentação • Reservatório de fase móvel/Sistemas de tratamento de

solventes

– Gases dissolvidos e material particulado devem ser retirados

– Desgaseificadores vácuo, sistemas de destilação, aquecimento e agitação e sistema de “sparging”

– Sparging sistema pelo qual os gases dissolvidos são arrastados para fora de um solvente por pequenas bolhas de um gás inerte e solúvel

• Sistema de Eluição:

– Isocrático constituição do solvente permanece constante

– Gradiente composição do solvente é alterada

Instrumentação Sistema de Bombeamento

• Requisitos: – Habilidade de gerar pressões altas (até 6.000 psi [1 atm = 14,7 psi])

– Saída livre de pulsação

– Vazões na faixa 0,1 – 10 mL/min

– Reprodutibilidade relativa da vazão de 0,5% ou melhor

– Resistência a corrosão por diferentes solventes

– Baixo risco de , porém, há risco de vazamento (incêndio !)

• Tipos de bomba: – De seringa

– Bomba recíproca

– Bomba pneumática de pressão

Sistema de Bombeamento

• Bomba de seringa (rosca): – Saída livre de pulsação

– Pequena capacidade de volume ( ± 250 mL)

– Troca de solventes difícil

• Bomba recíproca (mais usada): – Fluxo pulsado que deve ser atenuado

– Pequeno volume interno ( !)

– Alta pressão de saída (10.000 spi) ( !)

– Eluição por gradiente ( !)

– Vazões constantes ( !) queda de pressão da coluna e viscosidade da Fm

• Bomba pneumática de pressão – Barata

– Simples

– Livres de pulsação

– Baixa pressão de saída ( !)

– Vazão depende da viscosidade do solvente ( !)

– Eluição por gradiente não permite ( !)

Instrumentação

http://www.analiticaweb.com.br/images/produtos/p52b318f8ccdb0/bomba_infusao_phd_ultra_harvard.jpg

Instrumentação

Instrumentação Sistema de Injeção da Amostra

• Alça de amostragem – Permite a escolha do volume (5 a 500 µL)

– Boa precisão

– Auto-amostradores

http://s3.amazonaws.com/magoo/ABAAABarwAJ-16.jpg

Instrumentação Colunas para cromatografia

• Aço inoxidável suportam maiores pressões

• Comprimento 10 a 30 cm

• Diâmetro 2 a 5 mm

• Recheio partículas de 3 – 10 µm

• Microcolunas d.i = 1-5 mm, l = 3 – 8 mm, recheio = 3 – 5 µm

• Vantagens:

– Maior “N” ( 100.000)

– Menor consumo de solventes

– Maior velocidade de eluição

Instrumentação

Instrumentação Colunas para cromatografia

• Microcolunas exemplo:

Colunas para cromatografia

• Recheio

– Sílica (suporte) partículas com diâmetros altamente uniformes

– Fase estacionário composto orgânico química ou fisicamente ligados a superfície do suporte.

• Colunas de proteção (guarda)

– Posicionada a frente da coluna analítica

– Função aumentar a vida útil da coluna analítica (material particulado e contaminantes dos solventes)

– Satura a FM com FE aumenta vida útil da coluna analítica

– Composição semelhante a composição da coluna analítica tamanho de partícula perda de pressão.

• Termostato para coluna manter a temperatura sob controle.

Instrumentação Detectores

• Pequeno volume morto

• Pequeno e compatível com a vazão de líquido

• Não existe detector universal

• Tipos de detectores:

Instrumentação

Detectores

Instrumentação

Tipos de CLAE (partição) • Cromatografia por partição a fase estacionária

é um líquido imiscível com a fase móvel

• Cromatografia por partição líquido-líquido FE é um solvente que é imobilizado por adsorção

• Cromatografia por partição com fase ligada FE é um composto orgânico imobilizado por ligações químicas

• Amplamente empregada

Tipos de CLAE (Partição) Recheios com fase ligada

• FE diferentes polaridades

• Características:

– Maior estabilidade

– Compatível com CLAE por gradiente

– Pequena capacidade de amostra (!)

• Recheios de Fase Normal e Reversa

– Fase normal A FE é polar e a fase móvel é apolar

– Fase reversa A FE é apolar e a fase móvel é polar

- Octil

- Octadecil

- Éteres

- Nitrilas

- Hidrocarbonetos

- Etc.

Tipos de CLAE (Partição)

Escolha das Fases Móvel e Estacionária

• Regra geral:

iguala-se a polaridade do analito com a da FE

Usas-se uma FM com polaridade diferente da FE

Analito e FM com polaridades semelhantes não é vantajoso...

Analito e FE com polaridades muito parecidas também não é vantajoso...

Tipos de CLAE (Partição)

• Aplicações:

Tipos de CLAE (Partição)

• Aplicações:

Tipos de CLAE (Adsorção)

• CLAE por adsorção Os analitos são adsorvidos sobre uma superfície de um sólido polar finamente dividido (recheio)

• A FM é constituída por um solvente orgânico ou por uma mistura de solventes orgânicos

• A FE é composta por partículas de sílica ou alumina (polar)

• Coeficiente de distribuição (K) FM !

Cromatografia de troca Íonica

• Separação de íons por troca iônica processo no qual íons presos num sólido poroso são trocados por íons presentes em uma solução levada ao contato com o sólido

• Resinas trocadoras de Íons • Resinas trocadoras de cátions contém grupos ácidos (-SO3

-H+)

xR-SO3

-H+ (sólido) + Mx+ (solução) (-SO3-H+)xMx+ (sólido) + xH+ (solução)

• Resinas trocadoras de ânionscontém grupos básicos (-N(CH3)3

+OH-)

xR-N(CH3)3

+OH- + Ax- [R-N(CH3)3+]xAx- + xOH-

• Funcionamento:

Separação em Fase Sólida

• Equilíbrio de troca iônica lei da ação das massas

Ca2+

(solução) + 2H+(resina) Ca2+

(resina) + 2H+(solução)

K´= ([H+]2aq . [Ca2+]res)/([H+]2

res . [Ca2+]aq) • Separação de troca iônica um dos íons deve prevalecer em ambas as

fases. Por exemplo H+

[Ca2+]aq << [H+]aq

[Ca2+]res << [H+]res

• Assim:

(K´. [H+]2res)/[H+]2

aq= [Ca2+]res/[Ca2+]aq K = [Ca2+]res/[Ca2+]aq

Métodos de Separação

Tipos de CLAE (Troca Iônica)

• Existem dois tipos Baseadas em supressores e coluna única

• Cromatografia de íons baseadas no uso de supressores:

• Detector de condutividade sensíveis, universais para espécies carregadas, simples, baixo custo e fáceis de serem miniaturizados

• Limitação alta concentração de eletrólito para eluição da maioria dos íons dos analitos

• Conseqüentemente alta condutividade e baixa sensibilidade

• Porém, em 1975...

Tipos de CLAE (Troca Iônica)

• Porém, em 1975...

• Coluna supressora de eluente coluna recheada com uma resina trocadora de íons que converte os íons do solvente de eluição para espécies moleculares de ionização limitada

• Na determinação de cátions:

• Na determinação de anions:

Tipos de CLAE (Troca Iônica)

Supressora Coluna

Tipos de CLAE (Troca Iônica)

Coluna de guarda

Tipos de CLAE (Exclusão)

• O fracionamento é baseado nos tamanhos das moléculas

• Filtração em gel recheio hidrofílico (espécies polares)

• Permeação em gel recheio hidrofóbico (espécies apolares)

Tipos de CLAE (Exclusão)

CLAE versus CG

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- Silva, L.L.R. Notas de Aula. FACET, UFVJM, 2008.

- Juliano, V. F. Notas de Aula. Depto de Química. UFMG. 2010

- Faria, L.C. Notas de Aula. Instituto de Química. UFG. 1995

- D. A. SKOOG, F. J. HOLLER e T. A. NIEMAN – Princípios de Análise

Instrumental, 5a ed., Saunders, 2002.

- A. I. VOGEL - Análise Analítica Quantitativa, LTC, 6ª ed., Rio de Janeiro. - Galen W. Ewing. Métodos Instrumentais de Análise Química (Volume 1). Editora Edgard Blücher/Ed. da Universida

- Cadore, S. Notas de Aula. IQ, UNICAMP, 2004.

- SKOOG, D. A; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A., Princípios de Análise Instrumental, 5ª edição, Editora Bookman, 2006.

- COLLINS, H. C.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S., Fundamentos de Cromatografia, Editora Unicamp, 2006.