quantificação dos compostos bioactivos em infusões de chá ... · bebidas comerciais com chá...
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Quantificação dos Compostos Bioactivos em Infusões de Chá
Verde dos Açores: Comparação com os Teores Presentes em
Bebidas Comerciais com Chá Verde
“Quantification of Bioactive Compounds in Azorean Green Tea
Infusions: Comparison with Levels of Canned Green Tea Drinks”
Catarina Isabel Bento Petisca
Orientado por: Professora Doutora Olívia Pinho
Trabalho de Investigação
Porto, 2008
Alguns dos resultados apresentados neste trabalho deram origem às
seguintes Comunicações:
Petisca, C, Melo, A, Pinho, O, Ferreira, IMPLVO. HPLC separation and
quantification of catechins in green tea home prepared: comparison with
commercial soft drinks. Comunicação apresentada no First Meeting of Young
Researchers of U. Porto; 2008 Fev 20-22; Faculdade de Arquitectura da
Universidade do Porto. (Anexo 1)
Petisca, C, Melo, A, Ferreira, IMPLVO, Pinho, O. Effect of brewing temperature
and duration on green tea catechins and caffeine solubilization [poster]. Poster
apresentado no II Encontro Nacional de Bromatologia, Hidrologia e Toxicologia,
AOAC Europe Section International Workshop; 2008 Abr 17-18; Lisboa. (Anexo 2)
i
Dedicatória
Aos meus pais e avós.
ii
Agradecimentos
Chegando ao fim de mais uma etapa na minha ainda curta vida, quero
agradecer a todos os que me apoiaram nestes últimos meses para que este
trabalho pudesse ser realizado: à Professora Olívia, Professora Isabel e
Engenheira Elisa; ao Hugo; à Olga, Armindo e Mariana.
A todos o meu MUITO OBRIGADA!!!
iii
Índice
Dedicatória .......................................................................................................... i
Agradecimentos .................................................................................................. ii
Lista de Abreviaturas .......................................................................................... iv
Resumo .............................................................................................................. v
Abstract .............................................................................................................. vi
Palavras-Chave ................................................................................................. vii
Keywords........................................................................................................... vii
Motivação ........................................................................................................... 1
Introdução .......................................................................................................... 2
Objectivos......................................................................................................... 13
Material e Métodos ........................................................................................... 14
Resultados e Discussão ................................................................................... 18
Conclusões....................................................................................................... 35
Referências Bibliográficas ................................................................................ 36
Índice de Anexos .............................................................................................. 42
iv
Lista de Abreviaturas
ADN – Ácido Desoxirribonucleico
ACP – Análise de Componentes Principais
C – Catequina
CAF – Cafeína
CG – Galato de Catequina
CL – Cromatografia Líquida
CZE – Electroforese capilar por zonas
DAD – Detecção por díodos
EC – Epicatequina
ECG – Galato de Epicatequina
EGC – Epigalocatequina
EGCG – Galato de Epigalocatequina
EM – Espectrometria de massa
GA – Ácido Gálico
GC – Galocatequina
GCG – Galato de Galocatequina
HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Resolução
MEKC – Cromatografia capilar electrocinética micelar
ROS – Espécies Reactivas de Oxigénio
TP – Teofilina
UV – Ultravioleta
v
Resumo
Neste estudo pretendeu-se avaliar a influência do tempo de infusão, da
temperatura e das características da água no teor de catequinas, ácido gálico,
teofilina e cafeína presentes em infusões de chá verde dos Açores.
Adicionalmente, estes compostos foram quantificados em bebidas engarrafadas
que mencionam chá verde na sua composição e comparados com os teores
encontrados nas infusões de chá verde preparadas em casa.
Nas amostras de chá verde dos Açores, foram encontradas diferenças
significativas para os teores de catequinas, ácido gálico, teofilina e cafeína, como
resultado de oscilações sazonais da composição das folhas de chá, do tempo e
temperatura de infusão. Aumentar o tempo de infusão, resulta num aumento da
concentração dos compostos em estudo. Outro factor que se revelou de extrema
importância, foi o tipo de água usado para preparar as infusões de chá verde. Os
teores de catequinas com maior poder antioxidante, EGCG, EGC e ECG,
sofreram um aumento com a diminuição do valor do pH da água e aumento do
tempo de infusão. Relativamente aos teores de ácido gálico, teofilina e cafeína,
não foram encontradas correlações entre os níveis presentes nas infusões e o pH
da água.
A indústria de bebidas engarrafada produz bebidas com uma composição,
em catequinas, semelhante às infusões que são preparadas em casa com água
mineral acidificada (10 minutos de infusão). Assim, a quantificação de catequinas,
ácido gálico, teofilina e cafeína nas bebidas engarrafadas, que indicam chá verde
na sua composição, pode ser usada como um parâmetro de autenticidade, de
forma a garantir a conformidade com o rótulo.
vi
Abstract
The influence of infusion time, temperature and water characteristics on
catechins, gallic acid, theophylline and caffeine levels of Azorean green tea
infusions was evaluated. Additionally, these compounds were quantified in
commercial canned green tea drinks and levels compared with composition of
homemade green tea infusions.
Significant differences were observed for levels of catechins, gallic acid,
theophylline and caffeine in Azorean green tea infusions as result of seasonal
oscillations of tea leafs composition, infusion time and temperature. Increasing
infusion time results in an increase of concentration of the compounds under
study. The type of water used to prepare green tea infusion is of critical
importance. An enhancement of EGCG, EGC and ECG levels, the catechins with
higher antioxidant activity, is observed as water pH decreases and infusion time
increases. No correlations were found between the levels of gallic acid,
theophylline and caffeine of tea infusions and water pH.
The industry of canned green tea drinks produces beverages with
composition of catechins and other bioactive compounds similar to that of
homemade acidified green tea, 10 minutes infusion. Quantification of catechins,
gallic acid, theophylline and caffeine in canned drinks labeled as green tea was
also useful as an authenticity parameter to guaranty the conformity or non-
conformity with labeling.
vii
Palavras-Chave
Chá verde, Catequinas, Teofilina, Cafeína, Ácido Gálico, HPLC, Bebidas
Comerciais.
Keywords
Green Tea, Catechins, Theophylline, Caffeine, Gallic Acid, HPLC, Canned Drinks
1
Motivação
Os estudos epidemiológicos até hoje realizados demonstram o papel
determinante da alimentação no desenvolvimento de doenças crónicas
silenciosas. Estas são responsáveis pelas causas mais comuns de incapacidade
e morte prematura nos países desenvolvidos e incluem a obesidade, a doença
coronária, a doença cerebrovascular, diversos tipos de cancro e a Diabetes
Mellitus (1).
Em Portugal, a mudança da predominância das doenças respiratórias e
infecciosas para doenças crónicas e degenerativas, começou a dar-se em
meados do século XX. Em 2001, as duas maiores causas de morte no nosso país
correspondiam às doenças cardiovasculares e ao cancro, estando este último a
aumentar consideravelmente (1).
Segundo os vários estudos publicados, uma alimentação equilibrada deve
conter quantidades significativas de compostos polifenólicos, que ajudem a
eliminar o excesso de radicais livres, responsáveis por danos celulares.
Recentemente, também se verificou que os compostos polifenólicos parecem
exercer efeito antioxidante indirecto, através da indução de enzimas endógenas
com função protectora (2).
Os flavonóides constituem a família mais abundante do grupo dos
polifenóis e que se encontram presentes nos frutos, vegetais e folhas que
compõem a alimentação humana (3). Uma das seis subclasses de flavonóides é
denominada por flavanóis, e encontra-se presente em diversas fontes
alimentares, incluindo o cacau, o vinho tinto, as uvas vermelhas, as bagas e as
maçãs e o chá verde (4, 5).
2
Em Portugal, o consumo de chá verde é relativamente recente, mas tem
vindo a aumentar (6), o que pode ser constatado pela disponibilidade existente no
mercado de diversas variedades de chá verde e de bebidas que referem possuir
chá verde na sua constituição. Assim, foi um desafio quantificar os componentes
bioactivos no chá verde dos Açores e nas bebidas que referem a sua presença no
rótulo.
Introdução
O chá (bebida) nasceu na China há cerca de 5000 anos, onde era
considerado um remédio para todas as doenças, que incluíam a indigestão e a
retenção de líquidos (7). Seguidamente, esta bebida foi levada para o Japão por
monges budistas, tornando-se um símbolo da cultura desse país, através de um
ritual único. Os holandeses trouxeram-na para a Europa, no século XVII (8) e
actualmente, é a segunda bebida mais consumida no Mundo, a seguir à água (7, 9-
14). O nome científico da planta do chá é Camelia sinensis e pertence a uma
espécie da família Theaceae (13-15). O chá é cultivado e consumido com sucesso
em diferentes países do Mundo, no entanto, há uma associação muito
significativa do chá à cultura do Oriente, onde a China e o Japão lideram o
consumo de chá verde (11). Em Portugal, as primeiras referências da existência da
planta do chá, citam-na para a povoação de Angra do Heroísmo (Ilha Terceira) e
são do princípio de século XIX (16).
Existem, essencialmente, três tipos de chá: verde, preto e Oolong. Todos
eles provêm da mesma planta, residindo a diferença no modo de preparação das
folhas. Enquanto o chá preto sofre uma fermentação (oxidação dos sucos por
contacto com o ar) após a colheita, o chá verde não é fermentado, sendo as
3
folhas secas apenas por vapor de água. O chá Oolong é considerado um chá
semi – fermentado, pois as suas folhas são fermentadas parcialmente antes da
sua secagem (11, 12).
As folhas de chá verde possuem na sua constituição três componentes
principais que actuam na saúde: xantinas (cafeína - CAF e teofilina - TP), óleos
essenciais e, especialmente, compostos polifenólicos – flavanóis.
Os flavanóis predominantes na folha de chá verde são as catequinas.
Estas, pertencem ao vasto grupo dos flavonóides, são consideradas catequinas
monoméricas, possuem uma estrutura carbonada C6 – C3 – C6 e são compostas
por dois anéis aromáticos, como se pode ver na figura 1.
A bibliografia refere, principalmente, oito catequinas divididas em duas
classes: as catequinas livres, das quais fazem parte a (+)-catequina (C), a (-)-
galocatequina (GC), a (-)-epicatequina (EC) e a (-)-epigalocatequina (EGC), e as
catequinas esterificadas, que englobam a (-)-galato de catequina (CG), a (-)-
galato de epicatequina (ECG), a (-)-galato de galocatequina (GCG) e a (-)-galato
de epigalocatequina (EGCG). A sua estrutura química pode ser observada na
figura 1.
Figura 1: Estrutura química das catequinas do chá verde (adaptado de Wang et al., 2008)(17)
(-) - Galato de epigalocatequina (-) - Galato de galocatequina (-) - Galato de epicatequina (-) - Galato de catequina
(-) - Epigalocatequina (-) - Galocatequina (-) - Epicatequina (+) - Catequina
4
As catequinas esterificadas são adstringentes, principalmente a EGCG e a
ECG originando um forte “aftertaste”, enquanto que as catequinas livres,
nomeadamente a EGC e a EC, apresentam uma menor adstringência, e por isso,
um menor sabor residual.
As catequinas estão presentes em toda a planta, sendo que, 15 a 30%
estão concentradas nas folhas principais, existindo também uma grande
concentração de catequinas nas segundas e terceiras folhas (3, 18).
As quatro catequinas mais abundantes do chá verde são a EGCG, a EGC,
a ECG e a EC que representam, aproximadamente, 59%, 19% 13,6% e 6,4% do
total das catequinas, respectivamente (3, 11, 12, 15, 19)
A quantidade relativa de catequinas presentes no chá verde depende do
modo como as folhas são processadas antes da secagem. Um certo grau de
fermentação e de aquecimento das folhas durante a manufactura pode resultar na
polimerização das catequinas, levando a modificações conformacionais e,
consequentemente, alterando as suas propriedades. Outros factores que
influenciam o conteúdo das catequinas situam-se na localização geográfica e
condições de crescimento (solo, clima, práticas de agricultura e uso de
fertilizantes), no tipo de chá verde (mistura, descafeinado ou instantâneo) e na
forma de preparação da infusão (quantidade de produto usado, tempo da infusão
e temperatura). (13, 20)
A cafeína e a teobromina pertencem ao grupo das metilxantinas, que por
sua vez, são classificadas como sendo alcalóides da purina. Estes alcalóides são
metabolitos secundários derivados dos nucleótidos da purina (21).
A cafeína é o alcalóide da purina que se encontra presente no chá em
maior quantidade. Alguns estudos indicam que, no período de Abril a Junho, em
5
plantas adultas, a biossíntese da cafeína está restringida às folhas jovens dos
novos rebentos. Esta evidência sugere que, existe uma maior concentração de
cafeína nas folhas jovens que são apanhadas neste período (21).
Os efeitos da cafeína actuam, sobretudo, no sistema nervoso central,
estimulando o estado de vigília, facilitando a associação de ideias e diminuindo a
sensação de fadiga (12). Alguns dos efeitos causados pela cafeína são
influenciados pela quantidade de teofilina presente no chá. A teofilina induz a
actividade psicoactiva, possui também um ligeiro efeito inotrópico e vasodilatador
e um efeito diurético muito maior que a cafeína. Contudo, os efeitos com maior
interesse podem ser verificados a nível respiratório e broncopulmonar. A teofilina
causa um relaxamento não específico no músculo liso brônquico e também é
observada uma estimulação respiratória (12).
Para além destes compostos, existe também o ácido gálico que, para além
de ser o composto polifenólico mais absorvido, tem a importante propriedade de
originar as catequinas esterificadas do chá verde (5, 18).
Como é possível verificar, são vários os efeitos benéficos associados aos
constituintes do chá verde, já citados em inúmeras referências bibliográficas
(cerca de 300) e que referem estudos sobre essas propriedades.
Sendo uma tarefa arrojada resumir algumas das propriedades benéficas do
chá verde, podemos referir principalmente a sua actividade antioxidante (7, 10, 12, 15,
19, 22-26), anticarcinogénica (7, 13, 15, 22, 23, 26, 27), antimutagénica (11, 15, 26, 27), acção
anti-diabética (7, 12, 28) e acção anti-bacteriana (7, 12), bem como propriedades
hipocolesterolémicas (7, 23, 25, 26, 28), propriedades anti – hipertensivas (7, 11, 23),
protecção na saúde oral (7, 11, 12) e protecção nas doenças cardiovasculares (7, 9-11,
25, 29). Apesar dos inúmeros benefícios associados ao consumo de chá verde,
6
pode dizer-se que estes estão divididos em três actividades com maior relevância:
a actividade antioxidante, a actividade antimutagénica e a actividade
anticarcinogénica.
Actividade antioxidante: Os compostos polifenólicos (flavonóis), encontram-
se apenas nas plantas e representam um dos grupos melhor distribuídos nos
alimentos, que são importantes na defesa dos radicais livres. No chá, mais de um
terço do seu peso seco é constituído pelas catequinas e outros polifenóis, que
apresentam potentes actividades antioxidantes (3).O estudo dos antioxidantes é
uma das grandes linhas de investigação actual, devido à necessidade cada vez
maior de “ajudar” o nosso organismo na luta contra os radicais livres, que são
responsáveis pelo envelhecimento.
O oxigénio é essencial para a vida, mas também pode apresentar efeitos
adversos quando o número de espécies reactivas de oxigénio (ROS) excede a
capacidade de ser adequadamente apreendido. Os radicais livres podem ser
produzidos pelas actividades metabólicas constituindo moléculas instáveis,
capazes de reagir com dadores de electrões de modo a equilibrar a sua carga.
Esta reacção é útil para a síntese de ácidos nucleicos, hormonas e proteínas. Os
radicais livres podem ser naturalmente produzidos para interceptar
microrganismos invasores como os micróbios e os vírus (7).
A captura ou eliminação das espécies reactivas de oxigénio (ROS) ocorre
através de um sistema enzimático que possui múltiplos estádios, onde as
moléculas são activadas pelas enzimas de Fase I (Citocromo P450 e NADPH) e
convertidas em compostos electrofílicos solúveis em água, que se vão conjugar a
moléculas desintoxicantes, sendo por fim inactivadas e excretadas. A glutationa, a
vitamina E, a vitamina C e a dismutase do superóxido são os principais
7
mecanismos de defesa das células (7). No entanto, apesar das células possuírem
protecção enzimática e não enzimática contra as espécies reactivas de oxigénio
(ROS), os antioxidantes provenientes dos alimentos contribuem para uma total
protecção da integridade das células e da função imune (7).
Estes são também fortes quelantes de iões metálicos, como por exemplo,
os iões Fe3+ livres, prevenindo a formação de ROS (22). Os polifenóis presentes no
chá verde também conseguem aprisionar as espécies reactivas, tais como, o
radical superóxido, o oxigénio livre, ROS hidroxiladas, o óxido nítrico e o
peroxinitrito (22).
Alguns estudos epidemiológicos demonstraram que o consumo moderado
de chá verde (1 – 6 chávenas/dia) origina no plasma humano sanguíneo um
aumento significativo da sua capacidade antioxidante (11, 12).
Actividade anticarcinogénica: As catequinas possuem um efeito quimiopreventivo
em vários órgãos, tais como o pulmão (7, 11, 22, 28), o estômago (11), o esófago (12) e
o intestino (cólon) (11).
Em 1987, foram publicados pela primeira vez, os efeitos inibitórios da
aplicação tópica de EGCG na prevenção do tumor da pele (22). Mais tarde, outros
estudos efectuados em diferentes modelos animais demonstraram a actividade
inibitória do chá na formação de tumores, bem como relevantes efeitos
protectores contra o cancro. Apesar disso, existem também trabalhos publicados
que não confirmam essa acção benéfica, devendo ter-se em consideração as
razões para esses resultados negativos.
Tem sido demonstrada em modelos animais a acção inibitória exercida
pelos constituintes do chá verde no cancro do pulmão (7, 11, 22). A ingestão de chá
8
verde ou da própria EGCG durante os diversos estágios de desenvolvimento do
cancro, revelou uma diminuição significativa de produtos carcinogénicos
provenientes do fumo do tabaco (7, 22).
A inibição da proliferação celular, da indução apoptótica e a redução da
angiogénese são considerados, geralmente, mecanismos de prevenção de cancro
para muitos agentes. A existência de resultados da inibição da tumorogénese do
pulmão é consistente com este conceito (30).
Para além da protecção conferida ao cancro do pulmão, o chá verde tem
também efeitos inibitórios na carcinogénese do intestino, que foram demonstrados
em diferentes modelos animais e por diversos grupos de investigação (31).
Em teoria, o intestino constitui um órgão promissor para o estudo da
prevenção do cancro, utilizando polifenóis que possuam baixa biodisponibilidade
sistémica. A EGCG tem uma biodisponibilidade sistémica limitada após a ingestão
oral. Mesmo a EGCG que é absorvida vai ser excretada maioritariamente no
intestino através da bile (31). Assim, o intestino pode estar exposto a elevados
níveis de EGCG após a ingestão (32).
A adição da EGCG em doses de 0,08% ou de 0,16% a bebidas pode
diminuir significativamente a formação de tumores no intestino grosso em cerca
de 37% e 47%, respectivamente. (22, 33).
Apesar de existirem muitos mais estudos com resultados positivos, também
existem estudos com resultados negativos, não havendo consistência dos efeitos
do chá verde (13, 22, 34). As razões para a discrepância entre os diferentes estudos
existentes são complexas e podem ser relacionadas com diversos factores: 1) a
alimentação usada; 2) o comportamento do tumor na fase de iniciação e
respectivas causas, 3) o tipo e a dose de polifenóis presentes no chá, quando
9
estes são dados sob a forma de infusão, de extractos ou através da alimentação
(22).
Outra possível razão para a divergência encontrada entre os estudos
epidemiológicos prende-se com o facto de os indivíduos em estudo não serem
geneticamente homogéneos e possuírem diferentes estilos de vida, havendo por
isso vários factores confundidores. Nos estudos em modelos animais, as
condições experimentais são controladas de modo a permitir a detecção do efeito
do tratamento. Uma outra razão tem a ver com as doses de chá ou extractos de
polifenóis pois as doses utilizadas nos estudos em animais são, normalmente
mais elevadas que as quantidades consumidas por humanos. Na maioria dos
estudos epidemiológicos, a quantificação do consumo de chá é inadequada,
sendo necessária mais investigação neste campo, que conduza a um melhor
entendimento a nível celular do complexo processo de desenvolvimento do
cancro e a sua inibição. Desse modo, no futuro poderá ser possível explicar como
é que os componentes do chá promovem a prevenção e inibição do cancro (7, 13,
22).
Alguns estudos realizados na última década em ratinhos têm mostrado que
os polifenóis presentes no chá verde possuem actividade antimutagénica.
O termo antimutagénico foi indicado para qualquer agente que possua a
capacidade de reduzir o número de mutações espontâneas ou induzidas. Os
antimutagénicos conseguem prevenir a mutação interagindo com o ADN por
inactivação química ou enzimática, ou reduzindo os efeitos adversos dos
compostos mutagénicos, modulando as modificações celulares induzidas após o
dano no ADN (15).
10
Os polifenóis presentes no chá estão extensivamente estudados
relativamente aos efeitos antioxidantes e antimutagénicos. Em estudos realizados
anteriormente (15, 27) foi demonstrado, utilizando o teste de Ames, que as
catequinas inibiam a activação mutagénica das aminas aromáticas.
Um grande número destes antioxidantes inibem a formação da actividade
mutagénica, uma vez que a formação de radicais livres de oxigénio e os
processos de peroxidação lipídica representam os factores mais importantes na
indução da mutagénese e da carcinogénese.(3, 15).
O actual interesse sobre os efeitos benéficos do chá e a pesquisa de
alimentos naturais como fonte de agentes quimioterapêuticos, tornou necessário o
desenvolvimento de novos métodos analíticos para a determinação de produtos
naturalmente protectores, tais como as catequinas presentes no chá.
Actualmente, torna-se necessário e indispensável oferecer aos
consumidores um nível consistente da qualidade dos produtos que consomem.
Para atingir este propósito, foi importante padronizar e monitorizar os
componentes presentes nas folhas de chá, nos seus extractos e nos próprios
produtos finais prontos a consumir (3).
Assim sendo, são necessárias informações correctas das quantidades de
flavonóides presentes nas folhas de chá e nos seus extractos. Para atingir estes
objectivos, começou a dar-se muita atenção ao desenvolvimento de métodos
analíticos para os flavonóides presentes no chá (3).
A técnica de HPLC combina as vantagens da separação e quantificação
simultânea dos flavonóides presentes nas amostras de chá sem, na maioria dos
casos, se proceder a uma derivatização preliminar. Existem vários estudos
11
publicados que utilizam o método de HPLC na análise e doseamento de
catequinas presentes nas folhas de chá (3).
Neste procedimento analítico, o metanol ou o acetonitrilo são usados
frequentemente como componentes de fase móvel, e a adição de pequenas
quantidades de ácido acético, solução tampão de fosfato ou de ácido fórmico,
incorporadas numa fase móvel, podem melhorar bastante as separações (3, 35, 36).
O método tradicionalmente escolhido para a análise das catequinas
presentes no chá é a cromatografia líquida (LC) de fase reversa com detecção por
Ultravioleta (UV) utilizando, normalmente como comprimentos de onda, 210, 278
ou 280 nm (3, 37-39). No entanto, podem também ser utilizadas outro tipo de
detecções na análise de catequinas(3), como por exemplo, a detecção com
espectrometria de massa (MS).
A aplicação de métodos de cromatografia líquida na quantificação das
catequinas presentes em amostras de plasma sanguíneo, urina e saliva, têm sido
utilizados como meios de melhor entendimento da biodisponibilidade e da
farmacocinética destes bioflavonóides, assim como das ligações entre o consumo
de chá e a prevenção de doenças crónicas. Os níveis de catequinas presentes
nos biofluídos requerem métodos de detecção altamente sensíveis, de modo a
determinar com exactidão a sua quantificação nessas matrizes. Um número
considerável de métodos analíticos tem sido descrito, incluindo a cromatografia
líquida com multidetecção de eléctrodos colorimétricos, detecção por
fluorescência e detecção por quimiofluorescência (40, 41).
Para além dos métodos já descritos, as catequinas presentes no chá
também podem ser determinadas através do sistema de electroforese capilar.
12
A electroforese capilar por zonas (CZE) e a cromatografia capilar
electrocinética micelar (MEKC) com detecção UV, são os métodos de
electroforese escolhidos para a determinação de catequinas. Nestes métodos
foram utilizados capilares de sílica fundida não-ligada para efectuar as
separações. Em geral, os métodos de MEKC fornecem uma melhor separação,
resolução e quantificação de um maior número de catequinas, relativamente aos
métodos rudimentares de CZE (41, 42).
Muitas outras técnicas físicas e químicas mais recentes têm sido aplicadas
na separação e/ou quantificação das catequinas presentes no chá verde. As
técnicas mais eficientes incluem a cromatografia gasosa, a cromatografia em
camada fina, a cromatografia em papel, a espectrofotometria vísivel, os
biosensores, a quimiofluorescência e a ressonância magnética nuclear. Alguns
destes métodos têm demonstrado ser, geralmente, mais úteis na medição de
catequinas individuais, enquanto outras só são usadas para a medição ou
identificação do “total” de catequinas (41).
Uma vez que ao longo dos anos se tornou necessário proceder à
quantificação dos compostos bioactivos presentes no chá verde, os industriais
têm tentado colocar os seus extractos em bebidas engarrafadas para posterior
venda. No entanto, notou-se que a produção de extracto de chá verde para
engarrafar era muito mais problemática que a produção de extractos de chá preto
e de chá Oolong.
Os produtos engarrafados são relativamente recentes e existe muito pouca
informação disponível sobre os extractos de chá verde presentes nestas bebidas
(43). A comparação entre os níveis de catequinas e dos restantes compostos
bioactivos presentes nas bebidas engarrafadas com extractos de chá verde e as
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infusões de chá verde feitas em casa, podem fornecer informação útil, quer para a
indústria do chá, quer para os consumidores.
Devido ao aumento do consumo de chá em Portugal, muitas foram as
empresas que colocaram no mercado, bebidas com extractos de chá verde na
sua constituição, sendo necessário conhecer os conteúdos de extracto de chá
verde nestas bebidas.
Objectivos
- Conhecer o comportamento dos teores em catequinas, teofilina, cafeína e ácido
gálico presentes no chá verde dos Açores, no que se refere:
- Conhecer a variabilidade dos compostos de lote para lote
- Estudar a influência da temperatura e do tempo de infusão na extracção
dos compostos em estudo.
- Compreender a influência das características dos diferentes tipos de água
na solubilização dos compostos.
- Comparar os níveis de catequinas, cafeína, ácido gálico e teofilina presentes nas
bebidas engarrafadas, que referem extracto de chá verde na sua composição,
com os teores apresentados nas infusões de chá verde dos Açores feitas com
água mineral acidificada.
14
Material e Métodos
Reagentes
Para a realização do presente trabalho, os compostos estudados foram
catequinas que incluem, a (+)-Catequina (>98%), a (-)-Epicatequina (>98%), a (-)-
Galocatequina (>98%), a (-)-Epigalocatequina, a (-)-Galato de catequina (>98%),
a (-)-Galato de galocatequina (>98%), a (-)-Galato de epicatequina (98%) e a (-)-
Galato de epigalocatequina (>98%), Ácido gálico, Teofilina (>99%) e Cafeína,
referenciados para HPLC. Estes químicos provieram da Sigma® Chemical Co (St.
Louis, MO, EUA).
Foram feitas soluções padrão, utilizando água ultrapura, contendo 2,5
�g/ml de TP e CG, 5 �g/ml de GA, EC, GCG e CAF, 10 �g/ml de C, 25 �g/ml de
ECG, 40 �g/ml de GC, 60 �g/ml de EGCG e EGC, que foram usadas para traçar
as curvas de calibração.
Os restantes reagentes utilizados e os solventes usados no gradiente do
HPLC provieram da Merck® (Darmstradt, Alemanha). Os solventes do HPLC
foram filtrados através de uma membrana de nylon com 0,2 �m de tamanho de
poro (Teknokroma, Barcelona, Espanha) e desgaseificados num aparelho de
ultrassons (modelo Ultrasonic Cleaner Economic Series da Fungilab SA). A água
ultrapura utilizada foi proveniente do Sistema de Purificação de Água Seralpur
PRO 90 CN e Seradest LFM 20.
15
Amostragem e Preparação das Amostras:
Amostras de chá verde – Neste estudo foram analisadas diferentes
amostras de chá verde, à venda no mercado, e com origem no Arquipélago dos
Açores (Gorreana). O tamanho das folhas de chá variou entre 5 e 7 mm.
Para conhecer a influência da temperatura, do tempo e do tipo de água na
extracção dos compostos em estudo, foram usados dois chás com teores muito
diferentes, denominados, respectivamente, A e B.
Preparação das infusões de chá verde – Para avaliar o teor de catequinas,
teofilina, cafeína e ácido gálico no chá verde dos Açores, e a influência da
temperatura nas infusões, estas foram preparadas usando o seguinte
procedimento: 2 g de folhas de chá verde foram colocadas em 250 ml de água
desionizada, com pH 6.90 a 100ºC.
- Para avaliar a influência da temperatura e do tempo de duração da infusão na
solubilização dos compostos, fez-se o seguinte procedimento: 2 g de folhas de
chá verde foram colocadas em 250 ml de água desionizada, com um valor de pH
6.90, a 70ºC, 80ºC, 85ºC, 90ºC, 95ºC e 100ºC. As infusões foram preparadas a
dois tempos diferentes, nomeadamente, 5 e 10 minutos.
- Para avaliar a influência das condições de tempo e do tipo de água na extracção
das catequinas, teofilina, cafeína e ácido gálico: 2 g de folhas de chá verde das
amostras A e B foram colocadas em 250 mL de água desionizada (pH 6.90), água
da torneira (pH 7,85), água mineral (pH 5.67) e água mineral acidificada (pH 4,40)
com sumo de limão. As infusões foram feitas a 100 e a 90ºC por 3, 5 e 10
minutos, respectivamente. As amostras foram codificadas da seguinte forma: 1A3,
16
1A5, 1A10, 1B3, 1B5 e 1B10, que correspondem a 3, 5 e 10 minutos de infusão
com água mineral acidificada das amostras A e B, respectivamente. 2A3, 2A5,
2A10, 2B3, 2B5 e 2B10 correspondem a 3, 5 e 10 minutos de infusão em água
desionizada das amostras A e B, respectivamente. 3A3, 3A5, 3A10, 3B3, 3B5 e
3B10 correspondem a 3, 5 e 10 minutos de infusão em água mineral das
amostras A e B, respectivamente. 4A3, 4A5, 4A10, 4B3, 4B5 e 4B10
correspondem a 3, 5 e 10 minutos de infusão em água da torneira das amostras A
e B, respectivamente.
De seguida, as amostras foram filtradas com um filtro de 0,45 �m de
poliéster e analisadas directamente pelo método de HPLC.
Refrigerantes com extractos de chá verde – Estudaram-se seis bebidas
refrigerantes à venda no mercado, provenientes de 4 marcas diferentes e que
foram codificadas de C a F. A denominação e respectivos ingredientes de cada
uma das bebidas é seguidamente descrita.
C1 – Bebida refrigerante com chá verde e citrinos (ingredientes: água,
extracto de chá verde (8,4%), sumo de limão (0,2%), aromas, frutose, cafeína,
acidificantes e edulcorantes). C2 – Bebida refrigerante com chá verde
(ingredientes: água e extracto de chá verde (5,3%), açúcar, frutose, aromas,
acidificantes e ácido ascórbico). D1 – Bebida refrigerante com chá verde e limão
(ingredientes: água, açúcar, sumo de limão (0,5%), extracto de chá verde (0,1%),
acidificantes e preservantes, edulcorantes). D2 – Néctar de laranja, kiwi e chá
verde (ingredientes: água, sumo e polpa de laranja (29%) e kiwi (11%), extracto
de chá verde (0,12%), ácido ascórbico e edulcorantes). E – Bebida refrigerante de
chá verde e pêra (ingredientes: água mineral (98,5%), fibra (1,0%), dextrina
17
(0,1%), aromas naturais, acidificantes, edulcorantes). F – Bebida refrigerante com
água mineral gasocarbónica, com limão e chá verde (ingredientes: água mineral
gasocarbónica, concentrado de sumo de maçã e limão (2,3%), acidificantes,
aroma de limão e extracto de chá verde).
As amostras foram filtradas com um filtro de 0,45 �m de poliéster e
analisadas directamente pelo método de HPLC.
Foi necessário proceder a uma diluição da bebida E, para poder avaliar os
compostos existentes na mesma.
Análise pelo método de HPLC
A análise cromatográfica foi realizada numa unidade de HPLC (Jasco),
equipada com duas bombas Jasco para HPLC, PU-2080, um forno – modelo 7981
– Jones Chromatography, um detector multicomprimento de onda MD-2010 e um
injector automático da Jasco, modelo As-950.
A coluna utilizada foi uma C18 Waters Spherisorb® de fase reversa, 5 �m
ODS2. Foi usado, também, o software Borwin PDA (JMBS Developments, Le
Fontanil, França). A eluição por gradiente foi feita de acordo com Liang et al.
(2001, 2007), onde se utilizou uma mistura de dois solventes: Eluente A –
acetonitrilo, ácido acético e água (6, 1, 193) e Eluente B – acetonitrilo, ácido
acético e água (60, 1, 139), e um fluxo de 1ml/min. A corrida decorreu do seguinte
modo: 100% de A a 100% de B durante os primeiros 40 minutos, 100% de B dos
40 aos 45 minutos e 100% de B a 100% de A dos 45 aos 60 minutos. A detecção
foi efectuada a 280 nm.
18
Análise de dados
A análise foi realizada em duplicado para cada amostra, sendo
apresentados os seus valores médios. O programa de análise estatística usado
no tratamento dos resultados foi o SPSS para Windows, v. 16 (SPSS, Chicago IL,
EUA). Os dados quantitativos obtidos na análise do HPLC foram comparados,
usando para tal, a análise da variância (ANOVA). O teste de Tukey foi utilizado na
comparação das médias das variáveis em que se verificaram valores
estatisticamente significativos (� <0,05). Usou-se também a correlação de
Pearson para calcular os níveis de catequinas, ácido gálico, teofilina e cafeína
presentes nas diferentes amostras de chá e nos diferentes tempos de infusão. A
análise de componentes principais, foi realizada de modo a reduzir a
dimensionalidade dos dados e focar os efeitos mais importantes da influência do
tipo de água na composição das infusões de chá verde.
Resultados e Discussão
3.1 Estudo da linearidade, repetibilidade e reprodutibilidade do método
Os compostos em estudo (catequinas, ácido gálico, cafeína e teofilina)
foram extraídos, separados e quantificados de acordo com o método validado por
Liang et al.(44)
Na Figura 2, encontra-se um cromatograma tipo da separação de padrões
dos compostos em estudo presentes no chá verde. As concentrações de cada um
dos padrões foram 2,5�g/ml para a GC e a TP, 5 �g/ml para a GCG, GA e EC, 10
�g/ml para a C, 25 �g/ml para a ECG, 40 �g/ml para a GC e 60 �g/ml para a EGC
19
e para a EGCG. Não se avaliou o padrão da cafeína na mesma injecção
cromatográfica dos restantes padrões, uma vez que, o pico correspondente a uma
concentração ideal para a cafeína interferia com os padrões dos outros
compostos, sendo por isso necessário fazer outra injecção cromatográfica apenas
com este padrão, usando uma concentração de 40 �g/ml (Figura 3).
A linearidade para cada composto, usando um comprimento de onda (�) de
280 nm e um detector de UV/DAD, foi avaliada nos intervalos de concentração
indicados na Tabela 1. As curvas de calibração foram calculadas a partir da área
do pico em relação à concentração de cada composto. As curvas foram ajustadas
para uma função linear, obtendo-se coeficientes de regressão (r) superiores a
0,9741.
Figura 2: Separação cromatográfica dos padrões de compostos bioactivos presentes no chá verde. 1 – GA; 2 – GC; 3 – TP; 4 – EGC; 5 – C; 6 – EC; 7 – EGCG; 8 – GCG; 9 – ECG; 10 – CG.
Figura 3: Separação cromatográfica do padrão da cafeína.
20
Intervalo de
concentração (μg/ml)
Declive (unidades de
área/μg) r
C 5 – 20 1,16 x 104 0,9989
EC 10 – 40 2,23 x 104 1
GC 5 – 40 2,14 x 103 0,9741
EGC 40 – 120 2,78x 103 0,9992
GCG 10 – 40 1,42 x 104 0,9999
EGCG 60 – 100 1,84 x 104 0,9825
CG 5 – 30 7,09 x 103 0,9999
ECG 20 – 80 2,29x 104 0,9998
GA 2 – 10 7,02x 104 0,9998
TP 1 – 6 6,81 x 104 0,9995
CAF 40 – 120 6,88 x 104 0,9999
Tabela 1: Parâmetros das curvas de calibração e limites de detecção determinados, avaliados pelo método do padrão externo, para um λ de 280 nm.
Efectuou-se o estudo da repetibilidade (precisão obtida no mesmo dia) e da
reprodutibilidade (precisão encontrada ao longo de vários dias) do método de
HPLC com detector de UV/DAD. Para calcular a repetitibilidade foram efectuadas,
no mesmo dia, cinco injecções consecutivas de uma mistura de padrões,
contendo as catequinas, ácido gálico e metilxantinas. Para a avaliação da
reprodutibilidade foi utilizada a mesma mistura padrão, sendo injectada três vezes
em dias diferentes.
O desvio padrão relativo (RSD) do tempo de retenção variou entre 0,03 e
0,25% para a repetibilidade, e 0,10 e 0,63% para a reprodutibilidade. No que
respeita à concentração, a repetibilidade, expressa em RSD, variou entre 0,19 e
3,27%, e a reprodutibilidade variou entre 0,56 e 10,30%.
21
3.2 Quantificar o teor em catequinas, teofilina, cafeína e ácido gálico em
amostras de chá verde proveniente dos Açores
Os primeiros estudos foram realizados usando infusões de chá preparadas
com 2 g de folhas de chá verde, colocadas em 250 mL de água desionizada, e
aquecidas a 100ºC durante 3, 5 e 10 minutos. A Tabela 2 apresenta os intervalos
de concentração mínimos e máximos encontrados para cada composto. O teor de
catequinas, teofilina, cafeína e ácido gálico variou significativamente (� <0,05) em
todas as amostras analisadas. Esta variabilidade pode dever-se ao facto de o chá
açoreano ser produzido entre os meses de Abril e Setembro, e o teor de
catequinas presentes no chá ser maior no Verão do que na Primavera,
provavelmente devido à maior taxa de crescimento e actividades metabólicas das
folhas jovens durante essa estação (43, 45). Alguns trabalhos publicados referem
efeitos sazonais no chá australiano (46) e no chá do nordeste indiano (47, 48), cujos
níveis de EGCG, EGC e ECG foram maiores nos chás produzidos na estação
mais quente e menores nos chás produzidos na estação mais fria. É frequente
encontrar, também, variações no teor de cafeína de acordo com a origem da
folha, tipo de solo e as condições de manufactura do chá (45).
Os níveis de catequinas, teofilina, cafeína e ácido gálico das diferentes
amostras de chá foram correlacionados positivamente com o tempo de infusão
(correlação de Pearson) e esta correlação é significativa para � <0,05, com um
valor de � de 0,695; 0,641; 0,636; 0,528; 0,539; 0.529; 0,578; 0,573; 0,38; 0,584;
para C, EC, EGC, GCG, EGCG, CG, ECG, GA, TP e CAF, respectivamente.
22
Tempo de inf. (min)
Compostos(mg/g) 3 5 10
C 0,48 - 0,88 0,72 – 2,15 1,07 – 2,96
EC 1,57 - 2,55 1,93 -3,42 2,35 – 4,31
GC 0,22- 0,58 0,27 - 0,69 0,49 - 0,71
EGC 8,78 - 11,34 10,32 – 19,50 13,66 – 27,31
GCG 0,49 - 1,15 0,72 – 2,68 1,09 – 3,78
EGCG 5,64 - 13,23 7,07 – 24,88 9,90 – 31,35
CG 0,74 - 1,51 0,89 - 2,03 1,15 - 2,10
ECG 2,44 - 5,72 2,93 - 7,86 4,01 - 9,64
GA 0,36 - 0,73 0,41 – 1,08 0,52 – 1,25
TP 0,12 - 0,27 0,14 - 0,40 0,20 - 0,50
CAF 4,40 - 11,76 4,68 - 13,52 4,81 - 14,37
Tabela 2: Variabilidade de compostos bioactivos extraídos em chá verde, com diferentes tempos de infusão e diferentes chás. Estes compostos foram extraídos com água desionizada, a 100ºC. Os resultados apresentam-se sob a forma de média ± desvio-padrão, sendo expressos em mg/g de folha de chá.
Apenas as correlações para a GC foram significativas para p <0,01
(p=0,290). Assim, pode dizer-se que aumentar o tempo da infusão resulta num
aumento da concentração dos compostos em estudo.
3.3 Efeitos da temperatura e do tempo da duração da infusão na
solubilização dos compostos bioactivos em estudo no chá verde dos
Açores
Após a análise dos resultados apresentados seleccionou-se uma amostra
para estudar o efeito da temperatura na extracção dos compostos em estudo. Os
resultados da Figura 4 mostram o comportamento das catequinas mais
abundantes, metilxantinas e ácido gálico, a diferentes tempos e temperaturas de
23
infusão. Assim, podemos observar que para o mesmo tempo de infusão, a
concentração pode duplicar quando a temperatura de infusão aumenta dos 90ºC
para os 100ºC, mas as diferenças obtidas são menores quando a temperatura é
inferior a 90ºC.
Para a análise destas amostras foi utilizado o teste Two – Way – ANOVA,
de modo a verificar para os compostos em estudo se os valores médios obtidos,
durante 5 e 10 minutos de infusão e a seis temperaturas diferentes (catequinas,
ácido gálico, teofilina e cafeína) apresentam diferenças estatísticas. Verificou-se,
com 95% de confiança, que o tempo e temperatura de infusão apresentam
diferenças significativas para as variáveis em estudo (� <0,01).
Assim, podemos concluir que ocorreu um aumento significativo dos teores
de catequinas, ácido gálico, teofilina e cafeína com o aumento da temperatura.
Estes resultados estão de acordo com os obtidos por outros autores (49, 50).
24
Tempo Média Estimada para a EGCG
Méd
ias
Temp. ºC
Média Estimada para a EGC
Méd
ias
Tempo
Temp. ºC
Tempo
Média Estimada para a ECG
Méd
ias
Temp. ºC
Média Estimada para o GA Tempo
Temp. ºC
Méd
ias
Tempo Média Estimada para a CAF
Méd
ias
Tempo Média Estimada para a TP
Méd
ias
Tempo
Temp. ºC Temp. ºC
Figura 4: Médias estimadas para as catequinas predominantes nas folhas de chá (EGCG, EGC e ECG), para o GA e para as metilxantinas (TP e CAF), a diferentes tempos e temperaturas de infusão. Os resultados encontram-se expressos em mg/g de folha de chá.
25
3.4 Influência das condições de infusão na extracção das catequinas,
teofilina, cafeína e ácido gálico
Depois de apresentados os resultados do estudo da variabilidade entre os
vários lotes de chá e a influência da temperatura na concentração das catequinas,
das xantinas e do ácido gálico, referem-se neste ponto os resultados do estudo da
influência do tipo de água na extracção dos compostos em análise. Nesta fase do
trabalho, com base nos valores apresentados no ponto 3.2, foram escolhidas as
duas amostras de chá que indicavam uma maior variabilidade entre si, ou seja, as
que continham os valores máximos e mínimos da concentração dos compostos,
sendo denominados por “chá A” e “chá B”, respectivamente. Sendo assim, a
amostra do chá A, quando comparada com a amostra do chá B, apresentou níveis
significativamente mais elevados de todos os compostos em estudo. A catequina
mais abundante é a EGCG, seguida pela EGC, na amostra do chá A, enquanto
que na amostra do chá B, a catequina mais abundante é a EGC, seguida pela
EGCG. A terceira catequina mais abundante em ambas as amostras foi a ECG
(Figura 5).
GC
EG
C C
EC
EG
CG
GC
G
EC
G
CG
CA
F
GA
TP
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Sample B
Sample A
Figura 5: Teores de catequinas, teofilina, cafeína e ácido gálico (mg/g) de duas amostras (A e B) de chá verde dos Açores, feito em água desionizada a 100ºC durante 5 minutos.
Amostra A
Amostra B
Co
nce
ntr
ação
(m
g/g
)
26
Foram testados diferentes tipos de água, que incluíram água desionizada,
água mineral, água mineral acidificada com sumo de limão e água fornecida pela
rede pública. As temperaturas de infusão seleccionadas foram 100ºC e 90ºC, com
base nos resultados apresentados no ponto 3.3.
Os valores obtidos para as infusões preparadas, utilizando os dois lotes de
folhas de chá (amostras A e B) com os quatro tipos de água seleccionadas e a
respectiva temperatura de infusão, apresentam-se nas Tabelas 3 e 4.
Podemos verificar na Tabela 3 que, a infusão a 100ºC com água mineral e
acidificada com sumo de limão possui um maior teor total de catequinas (65,05
mg/g) do que a infusão a 90ºC com água da rede pública (27,52 mg/g). Também
podemos verificar, que o GA, a TP e a CAF possuem concentrações maiores na
infusão feita com água da rede pública a 100ºC.
Fazendo uma breve análise dos resultados apresentados na Tabela 4,
podemos verificar que, a infusão a 100ºC com água mineral acidificada com sumo
de limão possui a maior quantidade total de catequinas (40,60 mg/g), e que a
infusão que possui menor teor total de catequinas é a infusão feita a 100ºC com
água desionizada (26,32 mg/g).
Verificamos ainda, que o GA e a CAF continuam a indicar uma maior
concentração na infusão feita com água fornecida pela rede pública a 100ºC, mas
a TP passa a ter um teor mais elevado quando a infusão é feita com água da rede
pública a 90ºC.
27
Ág
ua
TºC
C
E
C
GC
E
GC
G
CG
E
GC
G
CG
E
CG
T
ota
l de
cate
qu
inas
G
A
TP
C
AF
Des
i. 10
0 1,
37±0
,49
3,10
±0,5
7 0,
66±0
,07
16,0
3±4,
42
1,66
±0,4
6 18
,54±
5,39
1,
88±0
,32
7,74
±1,9
7 50
,99
0,80
±0,0
8 0,
33±0
,06
13,2
2±1,
33
90
1,53
±1,8
4 2,
45±1
,43
0,48
±0,8
3 16
,32±
16,0
3 1,
34±1
,64
18,3
0±21
,64
1,33
±1,1
8 7,
67±8
,63
49,4
1 0,
66±0
,55
0,26
±0,2
2 11
,78±
8,95
Min
eral
10
0 1,
68±0
,74
4,41
±1,3
1 4,
95±1
,71
19,8
0±6,
02
1,65
±0,8
0 20
,71±
10,1
3 1,
43±0
,58
7,80
±3,5
8 62
,43
0,73
±0,1
7 0,
31±0
,10
12,1
5±2,
22
90
1,25
±0,4
8 2,
80±0
,63
0,34
±0,2
9 14
,67±
4,01
1,
17±0
,54
14,7
6±4,
97
1,35
±0,4
2 5,
92±1
,87
42,2
6 0,
60±0
,09
0,21
±0,0
5 10
,51±
1,40
Red
e.
100
2,24
±0,7
0 3,
05±0
,52
0,81
±0,1
1 12
,93±
2,17
3,
54±1
,36
12,3
3±2,
27
3,09
±0,8
8 6,
80±1
,69
44,8
0 0,
89±0
,11
0,36
±0,0
6 13
,55±
0,78
90
1,42
±0,5
9 2,
58±1
,08
0,64
±0,3
0 7,
69±4
,29
2,16
±0,8
1 6,
48±3
,77
2,07
±0,7
5 4,
48±1
,52
27,5
2 0,
73±0
,12
0,29
±0,0
6 10
,30±
1,42
Min
. aci
d
100
1,96
±1,3
3 4,
74±1
,99
4,96
±2,5
6 20
,77±
9,60
1,
39±0
,96
20,8
4±12
,91
1,46
±0,7
4 8,
93±5
,15
65,0
5 0,
75±0
,23
0,34
±0,1
8 12
,91±
2,32
90
1,65
±0,6
4 4,
01±1
,24
4,14
±1,3
7 18
,05±
5,43
1,
05±0
,60
19,2
2±8,
25
1,15
±0,3
1 7,
76±3
,02
57,0
3 0,
73±0
,15
0,31
±0,1
0 12
,12±
1,55
Tab
ela
3: C
ompa
raçã
o en
tre
a co
mpo
siçã
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chá
ver
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água
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(Chá
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ua
TºC
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E
C
GC
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GC
G
CG
E
GC
G
CG
E
CG
T
ota
l de
cate
qu
inas
G
A
TP
C
AF
Des
i. 10
0 0,
76±0
,29
1,95
±0,3
9 0,
33±0
,14
10,9
2±2,
50
0,77
±0,3
0 7,
54±2
,17
0,93
±0,2
1 3,
13±0
,80
26,3
2 0,
43±0
,08
0,15
±0,0
4 10
,21±
0,98
90
0,96
±0,3
7 2,
27±0
,63
0,31
±0,1
7 12
,91±
3,22
0,
77±0
,25
9,20
±2,3
7 0,
94±0
,22
3,86
±1,0
0 31
,21
0,54
±0,0
6 0,
18±0
,05
11,6
3±0,
93
Min
eral
10
0 0,
84±0
,14
2,48
±0,1
6 0,
21±0
,35
11,8
7±1,
03
0,69
±0,2
5 7,
65±0
,26
0,80
±0,2
8 2,
93±0
,30
27,4
6 0,
43±0
,02
0,17
±0,0
3 10
,62±
0,35
90
0,88
±0,3
8 2,
37±0
,55
0,32
±0,1
1 11
,68±
2,57
0,
73±0
,28
7,03
±1,8
7 0,
99±0
,21
3,20
±0,8
1 27
,19
0,48
±0,1
0 0,
17±0
,05
10,3
6±0,
97
Red
e.
100
1,71
±0,6
1 3,
27±0
,74
5,90
±1,8
9 10
,67±
2,94
2,
13±0
,85
6,24
±2,3
0 2,
14±0
,95
3,85
±1,2
3 35
,91
0,67
±0,1
4 0,
21±0
,07
11,9
1±1,
48
90
1,66
±0,6
5 3,
33±0
,77
0,80
±0,1
9 8,
19±4
,05
2,05
±0,7
5 5,
28±3
,23
1,96
±0,7
4 4,
44±1
,85
27,7
2 0,
64±0
,12
0,29
±0,0
7 11
,33±
1,57
Min
. aci
d
100
1,23
±0,9
8 3,
57±1
,79
3,97
±2,3
6 15
,43±
8,07
0,
70±0
,53
10,1
9±7,
20
1,06
±0,6
0 4,
44±2
,70
40,6
0 0,
52±0
,23
0,26
±0,1
4 10
,56±
2,63
90
0,79
±0,3
8 2,
91±0
,85
3,02
±1,0
6 13
,07±
3,93
0,
53±0
,29
8,17
±3,5
1 0,
80±0
,27
3,50
±1,4
0 32
,80
0,50
±0,1
0 0,
20±0
,07
10,4
5±1,
31
Tab
ela
4: C
ompa
raçã
o en
tre
a co
mpo
siçã
o do
chá
ver
de d
e di
fere
ntes
lote
s e
dife
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guas
e te
mpo
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(Chá
B).
Os
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édia
± d
esvi
o-pa
drão
e e
xpre
ssos
em
mg/
g de
folh
a de
chá
.
28
A estes resultados foi aplicada a análise de componentes principais (ACP),
usando os valores das catequinas a 100ºC como variáveis, de modo a reduzir a
dimensão dos dados, destacando os efeitos mais importantes do tipo de água e
do tempo de infusão na extracção das catequinas e evidenciando as alterações
devidas à epimerização e oxidação. Outra ACP foi aplicada aos valores das
catequinas extraídas a 90ºC.
As semelhanças entre as variáveis foram elevadas, oscilando entre 0,528 e
0,983 para as amostras ensaiadas a 100ºC e entre 0,773 a 0,987 para as
amostras ensaiadas a 90ºC. Como podemos observar na Tabela 5 foram
encontrados comportamentos semelhantes das catequinas, tanto a 100ºC como a
90ºC. Assim, estão descritos num gráfico bidimensional apenas os resultados a
100ºC (Figura 6), tornando possível explicar 87,9% da variância total.
Catequinas
Testes a 100ºC
Testes a 90ºC
PC1
PC2
Communalities
PC1
PC2
Communalities
C 0,650 0,738 0,968 0,521 0,842 0,987 EC 0,949 0,259 0,969 0,790 0,544 0,773 GC 0,721 0,090 0,528 0,816 - 0,065 0,695 EGC 0,961 0,166 0,952 0,938 0,032 0,860 GCG 0,173 0,979 0,989 0,021 0,994 0,969 EGCG 0,897 0,246 0,866 0,939 0,135 0,864 CG 0,174 0,976 0,983 0,005 0,992 0,957 ECG 0,840 0,447 0,904 0,843 0,482 0,924 Tabela 5: ACP para os teores de catequinas determinados a dois níveis de experimentação: um a 100ºC e outro a 90ºC.
29
GC
, EG
C, E
C, E
GC
G, E
CG
C, GCG, CG
Component 1 (45.6%)
Com
pone
nt2
(42.
2%)
GC
, EG
C, E
C, E
GC
G, E
CG
C, GCG, CG
Component 1 (45.6%)
Com
pone
nt2
(42.
2%)
Figura 6: Gráfico bidimensional representando a ACP das catequinas em infusões de 100ºC. 1A3, 1A5, 1A10, 1B3, 1B5 e 1B10 correspondem a infusões de 3, 5 e 10 minutos de infusão, em água mineral acidificada das amostras A e B, respectivamente. 2A3, 2A5, 2A10, 2B3, 2B5 e 2B10, correspondem a infusões de 3, 5 e 10 minutos de infusão, em água desionizada das amostras A e B, respectivamente. 3A3, 3A5, 3A10, 3B3, 3B5 e 3B10, correspondem a infusões de 3, 5 e 10 minutos de infusão em água mineral das amostras A e B, respectivamente. 4A3, 4A5, 4A10, 4B3, 4B5 e 4B10, correspondem a infusões de 3, 5 e 10 minutos de infusão em água da rede pública das amostras A e B, respectivamente.
A Componente 1 explica 45,6% da variância presente nos dados. O
segmento positivo do gráfico para esta componente, está intimamente relacionado
com os níveis de GC, EGC, EC, EGCG e ECG, como se pode ver na Figura 6. A
Componente 2 explica 42,2% da variância dos dados, estando esta dimensão
positivamente relacionada com os níveis de C, GCG e CG. Nesta figura, as
catequinas necessárias para a definição destas componentes são mostradas nos
extremos dos eixos, indicando a direcção para a qual os seus níveis aumentam.
Foram agrupados os valores encontrados para as infusões feitas com o
mesmo tipo de água. Os dados obtidos permitiram observar três “clusters”: um
para as infusões feitas com água da rede pública, outro para as infusões feitas
Componente 1
Co
mp
on
ente
2
30
com água mineral e água desionizada e um terceiro “cluster” para as infusões
feitas com água mineral acidificada. Todas estas infusões foram realizadas a 3, 5
e 10 minutos para as amostras A e B.
Com estes resultados, podemos concluir que os iões presentes na água,
assim como a variação do valor de pH, influenciaram a extracção e a composição
das catequinas presentes.
A Figura 6 mostra que usando água da rede pública à temperatura de
ebulição, o conteúdo das estruturas não – epi das catequinas (C, GCG e CG),
com excepção da GC, aumentou. Por outro lado, quando comparado com outros
tipos de água também à mesma temperatura, o conteúdo das estruturas epi das
catequinas, nomeadamente a EGC, a EC, a EGCG e a ECG diminuiu, sendo este
efeito mais notório na infusão feita com água mineral acidificada. Isto indica que
durante a infusão do chá, a epimerização das catequinas ocorre mais facilmente
quando se utiliza água da rede pública.
As amostras A e B indicaram diferentes conteúdos de catequinas, contudo,
elas mostraram um comportamento semelhante para os quatro tipos de água,
quando sujeitos a diferentes tempos de infusão. A epimerização das catequinas
ocorre mais facilmente em água da rede pública do que em água pura, tal como o
verificado por outros autores (51). As principais razões para as diferentes taxas de
conversão das catequinas, parecem ser a complexidade dos iões presentes na
água da rede pública e as diferenças do valor de pH das águas utilizadas.
Chen, 1998 (23), descreveu que para uma variação do pH entre 4 e 7, a
estabilidade das catequinas do chá verde está inversamente relacionada com o
valor de pH das infusões.
31
Toshi et al. (52) observou que o chá verde possui maior poder antioxidante
quando contém níveis mais elevados de EGCG, EGC e ECG. No nosso estudo,
as infusões de chá 1A10 e 1B10, preparadas com água mineral acidificada, foram
as que apresentaram níveis mais elevados destes compostos, indicando por isso,
uma elevada capacidade antioxidante.
Os níveis de ácido gálico, teofilina e cafeína obtidos a partir dos diferentes
tipos de água estão correlacionados positivamente com o tempo de infusão. As
correlações de Pearson, a um nível de significância de 0,05, indicam valores de p
de 0,659, 0,690 e 0,759, respectivamente. Não foram encontradas correlações
entre os níveis destes compostos e o pH da água.
32
3.5 Análise de bebidas comerciais que contêm chá verde
Foram analisadas 6 bebidas referentes a 4 marcas comerciais diferentes e
que contêm chá verde na sua constituição. As Figuras 7 e 8, apresentam os dois
perfis cromatográficos referentes às bebidas designadas por C1 e F.
Nessas amostras analisadas foram quantificadas oito catequinas, ácido
gálico, teofilina e cafeína, como mostra a Tabela 6.
Todas as catequinas em estudo, ácido gálico, teofilina e cafeína foram
quantificadas em todas as amostras, excepto para as amostras E e F, como se
pode verificar na Tabela 6. As concentrações de EGC e de EGCG foram as que
apresentaram teores mais elevados nestas amostras.
Figura 8: Perfil cromatográfico da bebida comercial F: 1 – GC; 2 – EGC; 3 – EGCG.
Figura 7: Perfil cromatográfico da bebida comercial C1: 1 – GA, 2 – GC; 3 – TP, .4 - EGC, 5 – C, 6 – CAF, 7 – EC, 8 – EGCG, 9 – GCG, 10 – ECG, 11 – CG.
33
C
E
C
GC
E
GC
G
CG
E
GC
G
CG
E
CG
G
A
TP
C
AF
C
1 31
,045
±0,1
48
52,5
15±0
,092
14
,55±
0,11
3 44
7,07
±14,
863
13,3
9±0,
240
387,
555±
10,1
75
17,1
5±0,
127
85,1
75±0
,233
3,
61±0
4,
96±0
19
2,56
±1,4
849
C2
9,23
5±0,
177
17,8
1±0,
325
16,4
85±0
,346
16
4,18
5±2,
284
5,48
5±0,
0495
16
1,17
5±4,
080
7,75
5±0,
0778
33
±0,4
667
4,34
5±0,
120
1,3±
0 81
,49±
3,50
7
D1
3,32
±0,0
14
8,88
±0,0
85
18,9
7±0,
664
122,
6±3,
0123
6,
745±
0,21
9 61
,575
±1,9
16
2,86
±0,0
42
8,57
±0,1
13
3,67
5±0,
148
1,05
5±0,
021
43,8
8±2,
192
D2
3,94
5±0,
021
13,3
±0,3
68
15,1
4±0,
170
126,
415±
0,20
5 4,
98±0
,127
59
,045
±0,1
20
5,34
±0,0
566
7,83
±0
4,31
5±0,
021
2,78
±0
43,2
95±0
,289
9
E
n.d.
n.
d.
n.d.
n.
d.
0,07
±0,0
57
5,29
±0,1
70
n.d.
0,
175±
0,00
7 n.
d.
n.d.
n.
d.
F
n.d.
n.
d.
6,06
5±0,
615
5,71
±0,0
99
n.d.
4,
875±
0,04
95
n.d.
n.
d.
n.d.
n.
d.
n.d.
Tab
ela
6: Q
uant
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com
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34
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
1A10 1B10 C1 C2 D1 D2 E F
C EC GC EGC GCG EGCG CG ECG GA TP CAF
Comparando os teores dos compostos presentes nas bebidas que contêm
chá verde com os valores contidos nas amostras de chá A e B preparados com
água mineral acidificada, verifica-se que a amostra C1 foi a mais enriquecida em
EGC, EGCG, ECG e CAF, quando comparada com as amostras 1A10 e 1B10,
como se pode verificar no gráfico da Figura 9.
A amostra C2 apresentou valores semelhantes à amostra 1A10 e as
amostras D1 e D2 foram semelhantes à amostra 1B10. Constatou-se que a
quantidade de catequinas presente em algumas bebidas engarrafadas é
semelhante ao teor contido no chá preparado de forma tradicional, com água
mineral acidificada.
Relativamente às amostras E, água mineral, e F, água mineral
gasocarbónica, que mencionam a adição de extractos de chá verde, apenas
foram detectadas três catequinas. A amostra E continha EGCG e vestígios de
GCG e de ECG. A amostra F continha GC, EGC e EGCG. O ácido gálico, a
teofilina e a cafeína não foram detectados nestas amostras.
Figura 9: Teores de catequinas, ácido gálico, teofilina e cafeína presentes nas infusões de chá (1A10 e 1B10) e nas bebidas engarrafadas com chá verde na sua constituição (amostras C1, C2, D1, D2 e F). Os resultados encontram-se expressos em �g/ml.
35
Conclusões
A realização deste trabalho de investigação permitiu retirar várias
conclusões, que seguidamente se encontram descritas.
As catequinas, a teofilina, a cafeína e o ácido gálico não são constantes
nas amostras de chá verde dos Açores, contudo, podemos concluir que a EGCG,
a EGC e a ECG são as catequinas mais abundantes. Pode-se concluir, também,
que o chá verde açoriano, tal como o verificado por outros autores em estudos
efectuados sobre amostras de chá provenientes de outras origens, é influenciado
pela temperatura e pelo tempo de infusão. O aumento destes dois parâmetros
traduz-se num aumento significativo da concentração de catequinas, ácido gálico,
teofilina e cafeína. Relativamente ao tipo de água usada para preparar as
infusões de chá verde, podemos concluir que, tal como a temperatura e o tempo
de infusão, também o diferente tipo de água influencia os teores dos compostos
em estudo. Verificou-se que há um aumento dos níveis de EGCG, EGC e ECG,
quando o valor de pH da água decresce e o tempo da duração da infusão
aumenta, sendo estas catequinas as que apresentam maior actividade
antioxidante. Pode-se então concluir que esta prática leva a uma melhoria do
perfil de catequinas. Relativamente ao efeito deste parâmetro na determinação
dos níveis de ácido gálico, teofilina e cafeína, não foram encontradas quaisquer
correlações. As indústrias de bebidas engarrafadas que referem chá verde na sua
composição, produzem bebidas contendo uma composição semelhante às
catequinas, recorrendo ao efeito estabilizante do ácido ascórbico e de outros
agentes acidificantes. O resultado obtido é comparável à infusão caseira
preparada com água mineral e acidificada com sumo de limão.
36
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42
Anexos
Índice de Anexos
Anexo 1 ............................................................................................................ a1
Anexo 2 ............................................................................................................ a3
a1
Anexo 1
Resumo “HPLC separation and quantification of Catechins in Green Tea home
prepared: comparison with commercial soft drinks”
a2
a3
Anexo 2
Resumo “Effect of brewing temperature and duration on green tea catechins and
caffeine solubilization”
