QUANTIFICAÇÃO AUTOMÁTICA DA RIGIDEZ DA BORDA DAGOTA DE SANGUE PERIFÉRICO EM IMAGENS DE

MICROSCOPIA ÓTICA♦♦

C. F. F. Costa Filho, M. G. F. Costa, F. Pinagé, J. M. Aguiar.

Universidade do Amazonas – Laboratório de Processamento Digital de Imagens Av. Gal. Rodrigo Otávio Jordão Ramos, 3000 Aleixo, CEP 69077-000, Manaus-AM-Brasil

cicero.costa@internext.com.br

♦ Este trabalho contou com o apoio financeiro do CNPq e da Fundação de Apoio Institucional Rio Solimões – UNISOL.

RESUMONeste trabalho são apresentados os resultados preliminaresde um método desenvolvido para quantificação automáticado percentual de área ocupado por hemácias, em umaregião próxima a borda de uma imagem de gota de sangueperiférico, analisada através de microscopia ótica. Amotivação para o trabalho parte de uma constataçãoexperimental da Teoria Ortomolecular em MedicinaClínica, que associa a densidade da concentração dehemácias com a deficiência de vitamina C no organismo. Ométodo desenvolvido utiliza processamento de cor nosespaços RGB e HSV para identificação das hemácias e dosespaços vazios na gota de sangue; utiliza o processo derotulação para filtragem de ruídos e utiliza processamentomorfológico para determinação de áreas de interesse. Ainexistência de medidas anteriores para a determinaçãodessa densidade impossibilita uma análise quantitativa dométodo proposto. No entanto, na análise de quatro lâminas,obteve-se uma boa concordância entre os resultados obtidoscom o método e a classificação qualitativa do especialista.

Palavras-chave: processamento digital de imagens,microscopia ótica.

1. INTRODUÇÃOResultados preliminares na Teoria Ortomolecular

apontam para uma correlação positiva entre o percentual daárea ocupada por hemácias em uma região próxima a bordade uma gota de sangue periférico analisada através demicroscopia ótica, e a concentração de vitamina C noorganismo [1]. Essa associação deve-se ao fato da vitaminaC exercer um papel fundamental no processo antioxidantedos radicais livres presentes nas células. Quanto maisoxidados estiverem os radicais livres nas hemácias, maisagrupadas as mesmas se encontrarão no sangue. O processode oxidação dos radicais livres no organismo pode gerarproblemas circulatórios, sendo responsável, por exemplo,pelo acúmulo de placas gordurosas nas artérias. Amotivação desse trabalho é fornecer uma ferramentaautomática para que o nutrologista possa melhor quantificara concentração de hemácias na análise microscópica dagota de sangue periférico e com isso realizar umdiagnóstico de deficiência vitamínica do organismo. Após odesenvolvimento dessa ferramenta automática, pretende-se,em conjunto com o especialista participante desse trabalho,proceder a um trabalho prospectivo em larga escala, a fimde estabelecer dados experimentais confiáveis sobre acorrelação acima mencionada entre a concentração de

hemácias em uma região próxima a borda de uma gota desangue periférico e a deficiência de vitamina C noorganismo. Nesse trabalho não será feita essa correlação. Ointeresse maior é apenas na determinação de um métodoautomático para quantificar a concentração de hemácias emuma região próxima a borda da gota de sangue periférico.

Doravante, uma borda de gota de sangue com altaconcentração de hemácias será denominada de borda rígida,enquanto que uma borda de gota de sangue com baixaconcentração de hemácias será denominada de bordamaleável. Na figura 1(a) mostramos um exemplo de bordarígida, enquanto que na figura 1(b) mostramos um exemplode borda maleável.

(a) (b)

Fig. 1. (a) borda rígida e (b) borda maleável.

2. METODOLOGIAInicialmente, para cada gota de sangue periférico, o

especialista obtém um conjunto de quatro imagens, atravésde microscopia ótica, conforme mostrado na figura 3. Paraesse trabalho foram utilizados quatro desses conjuntos.Todas as imagens foram capturadas por um scanner a partirde fotografias fornecidas pelo especialista. Na figura 3, aimagem da borda da gota de sangue é a que está situada noquadrante inferior direito. Apenas essa imagem é utilizadapara a determinação da concentração de hemácias. Nãonecessariamente a imagem contendo a borda estará naposição referida acima. Sendo assim, o aplicativodesenvolvido permite ao especialista que selecione, dentreas quatro imagens, aquela que contém a borda da gota desangue.

O processamento computacional é efetuado em ummicrocomputador Pentium II 266 MHz, 64MB RAM emonitor de 17’’. Para o desenvolvimento do aplicativo dedetecção da incisura utilizou-se o Toolbox deprocessamento digital de imagens do Matlab.

O método computacional implementado nessetrabalho pode ser classificado, em última instância, comoum método de visão computacional, pois parte de umaimagem e obtém uma informação numérica, a concentraçãode hemácias. No entanto, o processamento digital deimagens, processamento que tem como entrada umaimagem e como saída outra imagem, é extensivamenteutilizado nas etapas intermediárias. As etapas do métododesenvolvido podem ser agrupadas em três categorias:• Detecção da borda da gota de sangue.• Delimitação de uma área próxima à borda da gota desangue.• Determinação da concentração das hemácias.

Fig. 3. Conjunto de quatro imagens da gota de sangue.

Detecção da borda da gota de sangue

Após o usuário selecionar a imagem contendo a bordada gota de sangue a ser detectada, inicia-se oprocessamento automático para detecção da mesma. Ospassos seguidos nessa etapa são os seguintes: binarizaçãoda imagem, remoção de ruídos, suavização da borda edetecção da borda.

A binarização divide a imagem em duas regiões, umacorrespondendo, aproximadamente, à região da gota desangue e a outra correspondendo, aproximadamente, àregião da lâmina sem sangue. Na figura 4(a) mostramosuma imagem antes de ser binarizada, enquanto na figura4(b) mostramos a mesma imagem após a binarização. A fimde se estabelecer o critério para a binarização observou-sepreliminarmente que a região da lâmina que não contémsangue é predominantemente de tonalidade azul, enquanto aregião da gota de sangue contendo as hemácias caracteriza-se por uma forte presença da cor vermelha. Dessa forma,considerando que a imagem está armazenada no formatoRGB, aplicou-se o seguinte critério para a binarização:

Se a componente R de um pixel for maior do que acomponente B, o mesmo assume o valor lógico 1 (um);

Se a componente R de um pixel for menor do que acomponente B, o mesmo assume o valor lógico 0 (zero).

Conforme se pode observar na figura 4(b) a imagemresultante da binarização não contém exatamente duasregiões homogêneas, aparecendo muitos ruídos em ambas.

A remoção desses ruídos foi efetuada através de doisprocessos de rotulação. O primeiro deles correspondeu àrotulação das regiões brancas e objetivou remover os ruídosbrancos na grande região preta. Após as regiões brancasterem sido rotuladas, à exceção da maior delas, as outrasassumiram o valor lógico zero. O resultado desse processoé mostrado na figura 5(a). O segundo deles correspondeu àrotulação das regiões pretas e objetivou remover os ruídospretos da grande região branca. Após as regiões pretasterem sido rotuladas, à exceção da maior delas, as outrasassumiram o valor lógico um. O resultado desse processo émostrado na figura 5(b). A interface entre as duas regiõesmostradas na figura 5(b) é muito irregular. Antes de seextrair a linha que define essa interface, a qual denominou-se de borda da gota de sangue, realizou-se uma suavizaçãoda mesma, através da aplicação de uma operação deabertura morfológica: uma erosão morfológica seguida deuma dilatação morfológica [2]. Nesse processo foi utilizadoum elemento estruturante de 2x2. O resultado da operaçãode suavização da imagem da figura 5(b) é mostrada naimagem da figura 6(a). Finalmente, a extração da borda foiefetuada realizando-se uma varredura vertical em todas ascolunas da imagem da figura 6(a), no sentido de cima parabaixo. Um ponto de borda é detectado nessa varredura nomomento em que se verifica uma transição do valor lógicoum para o valor lógico zero. As coordenadas de todos ospixels onde ocorreu uma transição desse tipo foramarmazenadas em um vetor de pixels de borda. Na figura6(b) mostra-se a borda detectada de acordo com esseprocedimento. Em algumas imagens, como a bordaresultante desse processo mostrou-se descontínua, foinecessário, além da varredura vertical, realizar-se tambémuma varredura horizontal. Na figura 7 mostra-se a bordadetectada superposta a imagem original, onde se percebeuma coincidência entre a borda real e a borda detectadaautomaticamente.

(a) (b)

Fig. 4. (a) imagem original com a borda e (b) imagem após a binarização.

(a) (b)

Fig. 5. (a) remoção dos ruídos na região preta através da rotulação dasáreas brancas e (b) remoção dos ruídos da região branca através da

rotulação das áreas pretas.

Delimitação de uma área próxima à borda

Após a determinação da borda da gota de sangue,através da utilização dos procedimentos descritos na seção

(a) (b)Fig. 6. (a) resultado da suavização da borda mostrada na figura 5(b) e (b)

borda detectada.

Fig. 7. Borda detectada superposta a imagem original.

anterior, realizou-se a delimitação de uma região vizinha àmesma através de duas operações de processamento digitalde imagens: uma dilatação morfológica da imagemcontendo a borda mostrada na figura 6(b), seguida de umaoperação lógica AND entre a imagem resultante dessadilatação e a imagem suavizada mostrada na figura 6(a). Nadilatação da imagem mostrada na figura 6(b) utilizou-se umelemento estruturante de 24x24. A imagem resultante desseprocesso é mostrada na figura 8(a). Em seguida efetuou-sea operação lógica AND entre a imagem mostrada na figura8(a) e a imagem suavizada mostrada na figura 6(a). Aimagem resultante dessa operação lógica é mostrada nafigura 8(b). A região branca presente nessa imagemcorresponde à região onde será realizada a quantificaçãodas hemácias. A superposição dessa região na imagemoriginal é mostrada na figura 9.

(a) (b)Fig. 8. (a) imagem resultante da dilatação da imagem 6(b) por umelemento estruturante de 24x24 e (b) imagem resultante da operação lógicaAND entre a imagem da figura 6(a) e a imagem da figura 8(a).

Fig. 9. Superposição da área delimitada na figura 8(b) à imagem original.

Determinação da concentração das hemácias

A concentração das hemácias foi obtida determinando-se o percentual da área delimitada na figura 9 ocupada pelasmesmas. Com esse objetivo, verificou-se, nas imagensoriginais mostradas na figura 1, que as regiões onde não setem a presença de sangue a tonalidade épredominantemente azul. Com essa constatação, procurou-se, dentro da gota de sangue, separar regiões com atonalidade azul e sem a tonalidade azul. As primeirascorrespondem a regiões sem hemácias e as segundas aregiões com hemácias. O procedimento estabelecido paraquantificar os pixels com tonalidade predominantementeazul e os pixels sem essa característica foi converter aimagem de RGB para HSV e, no espaço de cores HSV,determinar todos os pixels cujo ângulo de cor estiver dentroda faixa correspondente ao ângulo da cor azul ± 30°. Aesses pixels damos o nome de pixels de fundo. Os pixelscorrespondentes a hemácias foram determinadossubtraindo-se o total de pixels de fundo da contagem detodos os pixels da região delimitada na figura 9. Aconcentração de hemácias foi então determinada dividindo-se o número de pixels correspondentes a hemácias pelonúmero total de pixels da região delimitada na figura 9.Quanto maior a concentração de hemácias assim definidamaior será a rigidez da borda da gota de sangue. Na figura10 é mostrada a mesma imagem da figura 9 vista de outroângulo, ressaltando os pixels de fundo e os pixelscorrespondentes a hemácias e o percentual da concentraçãode hemácias obtido pelo aplicativo.

(a) (b)

Fig. 10. (a) Imagem da figura 9 vista de outro ângulo, com a região defundo e a região de hemácias ressaltadas e (b) valores de saída do

aplicativo para a concentração de hemácias.

3. RESULTADOS

Com o objetivo de testar o algoritmo desenvolvidoforam utilizadas 4 imagens com diferentes graus de rigidezda borda da gota de sangue. Essas quatro imagens sãomostradas na figura 11. A ordem de aparecimento dasmesmas (da letra “a” a letra “d”) corresponde a um grau derigidez crescente, estabelecido pelo especialista. Na tabela 1

mostra-se a concentração de hemácias determinada peloaplicativo para essas imagens, conforme procedimentoestabelecido na seção anterior. Ao comparar-se a ordemestabelecida pelo especialista do grau de rigidez da bordadas imagens mostradas na figura 11 e os dados da tabela 1,observa-se a existência de uma correlação positiva entre osmesmos.

(a) (b)

(c) (d)Fig. 11. Imagens de bordas de gotas de sangue periféricos mostradas daesquerda para direita e de cima para baixo com graus de rigidez crescentesda letra (a) para a letra (d).

Tabela 1.Concentração de hemácias calculada

pelo aplicativo para as imagens da figura 11.

Imagem Concentraçãocalculada (%)

Figura 11 (a) 67,50Figura 11 (b) 73,95Figura 11 (c) 98,44Figura 11 (d) 98,65

4. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

Embora tenha havido uma correlação entre os resultadosobtidos pelo aplicativo e a classificação qualitativa doespecialista, o número de amostras testadas foi muitopequeno, exigindo que seja feita uma avaliação maisaprofundada com um maior número de amostras e com oestabelecimento de uma escala qualitativa de classificação aser utilizada pelo especialista. Salienta-se, no entanto, aimportância dos resultados obtidos, que demonstraram apossibilidade de realizar a quantificação da concentração dehemácias na borda da gota de sangue periférico, analisadaatravés de microscopia ótica, por métodos automáticos deprocessamento digital de imagens. Para o estabelecimentode um método definitivo é necessário que se investigueainda alguns pontos do método proposto, como: ainfluência do tamanho da região onde é feita aquantificação da concentração de hemácias sobre os valoresdessa concentração; a influência do método de digitalização

das imagens (scanner) sobre as cores resultantes na imagemdigital e a influência do tamanho da região angular (30°)utilizada para determinar os pixels de fundo na regiãoestabelecida para o cálculo da concentração de hemácias.Pretende-se consolidar os pontos ora expostos, antes deutilizar o método em um trabalho prospectivo queestabeleça a correlação entre a rigidez da borda da gota desangue e a deficiência de vitamina C no organismo.

REFERÊNCIAS [1] OLIVEIRA, J. M. , "A Teoria Ortomolecular em Medicina Clínica",

Nova Letra, 1998.

[2] GONZALEZ, R. C. E WOODS, R. E., “Digital Image Processing”,Addison Wesley, 1993.

AUTOMATIC QUANTIFICATION OF THE PERCENTAGEOF AREA OCCUPIED BY RED BLOOD CELLS IN A

REGION NEAR THE BORDER OF A MICROSCOPY IMAGEOF PERIPHERAL BLOOD DROP

ABSTRACT

This work shows the preliminary results of a method meant to automatically measure the percentage of areaoccupied by red blood cells in a region near the border of a microscopy image of peripheral blood drop. Thiswork was motivated by an experimental finding of Ortomolecular Theory in Clinical Medicine, which relatesdensity of concentration of red blood cells to C vitamin deficiency. The method uses colour processing inRGB space and in HSV space for the identification of red blood cells and of blank spaces in the blood drop.For the filtering of noises and definition of areas of interest, the method uses the labeling process and themorphological process. The absence of previous measures to determine the density of red blood cellsprecludes any quantitative analysis of the proposed method. However, the analysis of four plates showed theresults of the method to be fairly consistent with the qualitative classification made by the physician.

Key-words: microscopy image, peripheral blood drop, vitamin C, ortomolecular theory