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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

DANILO TANCLER STIPP

ROTAVÍRUS SUÍNO GRUPO C (PoRV-C): ANÁLISE FILOGENÉTICA DO GENE VP6 DE ESTIRPES

VIRAIS BRASILEIRAS E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE INFECÇÕES SINGULARES E MISTAS (PoRV-A e PoRV-B)

EM UM SURTO DE DIARRÉIA EM LEITÕES LACTENTES.

Londrina/PR 2011

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

ROTAVÍRUS SUÍNO GRUPO C (PoRV-C): ANÁLISE FILOGENÉTICA DO GENE VP6 DE ESTIRPES

VIRAIS BRASILEIRAS E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE INFECÇÕES SINGULARES E MISTAS (PoRV-A e PoRV-B)

EM UM SURTO DE DIARRÉIA EM LEITÕES LACTENTES.


Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal (Área de Concentração: Sanidade Animal) da Universidade Estadual de Londrina como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciência Animal.

Orientador: Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri

Londrina 2011


ROTAVÍRUS SUÍNO GRUPO C (PoRV-C): ANÁLISE FILOGENÉTICA DO GENE VP6 DE ESTIRPES VIRAIS BRASILEIRAS E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE INFECÇÕES SINGULARES E MISTAS (PoRV-A e PoRV-B) EM UM SURTO DE

DIARRÉIA EM LEITÕES LACTENTES.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal (Área de Concentração: Sanidade Animal) da Universidade Estadual de Londrina como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciência Animal.

Comissão Examinadora:

Prof. Dr. Marcos Bryan Heinemann Universidade Federal de Minas Gerais

Prof. Dr. Marco Antônio Bacellar Barreiros Universidade Federal do Paraná

Prof. Dra. Roberta Lemos Freire Universidade Estadual de Londrina

Prof. Dr. João Luis Garcia

Universidade Estadual de Londrina

Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri Universidade Estadual de Londrina

Londrina, 22 de julho de 2011.

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Virologia Animal, Departamento

de Medicina Veterinária Preventiva, Centro de Ciências Agrárias da Universidade Estadual de

Londrina, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciência Animal pelo

Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal (Área de Concentração: Sanidade Animal),

sob orientação do Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri.

Os recursos financeiros para o desenvolvimento do projeto foram obtidos junto às

agências e órgãos de fomento à pesquisa, abaixo relacionados:

1. CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / MCT

2. CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / MEC

3. FAP/PR: Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e

Tecnológico do Paraná / SETI

4. FINEP: Financiadora de Estudos e Projetos / MCT

DEDICATÓRIA

A Deus

À minha amada esposa Rejane Alves Mira

Aos meus queridos pais Paulo José Marconi Stipp e Ana Maria Tancler Stipp

À minha querida irmã Aline Tancler Stipp

À minha avó paterna Ada M. Stipp (in memorian)

Aos meus avôs maternos Geraldo Tancler (in memorian) e Nilza T. Tancler

À grande amiga e colega Dalíria do Prado (in memorian)

AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me iluminado ao longo deste trabalho, tornando possível a

concretização desse sonho. À minha amada esposa Rejane, pela compreensão e muita paciência; carinho e,

principalmente, pelo amor e companheirismo ao longo de mais esta jornada; lembranças e sentimentos que jamais se apagarão de minha memória e coração. Sempre te amarei.

Aos meus queridos pais Paulo e Ana Maria, e à minha querida irmã Aline; pelo apoio

em todos os momentos, sempre me auxiliando no que fosse necessário. Amo vocês. Aos meus tios Antônio Carlos M. Stipp e Mara Regina Stipp Balarin, pelos conselhos

e por me mostrarem o caminho a ser seguido em minha carreira acadêmica, profissão esta digna e extremamente gratificante.

A todos os meus familiares, em especial meus padrinhos Francisco e Carmem Tancler,

e Rogério Tancler; ao meu tio Sérgio Henrique Tancler; e aos meus avós Geraldo Tancler (in memorian), Nilza T. Tancler e Ada Stipp (in memorian), que sempre estarão em meu coração; agradeço a todos pelo respeito e confiança nos momentos presentes.

Ao professor e orientador Prof. Dr. Amauri A. Alfieri pela oportunidade concedida e

confiança em mim depositada. Agradeço-o por todos os conselhos que recebi, pelo excelente convívio ao longo desses dez anos desde os tempos da Graduação; e pelo exemplo de profissionalismo a ser seguido. Agradeço-o ainda pela paciência no decorrer da realização deste “parto distócico”. Meu muito obrigado!

À professora Dra. Alice Fernandes Alfieri pela orientação, atenção, confiança, e

amizade em mais esta jornada. A todos os professores do curso de graduação em Medicina Veterinária e do Programa

de Pós-graduação em Ciência Animal, em especial aos professores: Caio Abércio da Silva, Edson Luis A. Ribeiro, Ernst E. Müller, Italmar T. Navarro, Julio Augusto N. Lisboa, Julio Cesar de Freitas, Laurenil Gaste, Marcelo M. Seneda, Marilda C. Vidotto, Milton H. Yamamura, Nilva Maria F. Mascarenhas, Odilon Vidotto, Pedro Luíz de Camargo; muito obrigado pela amizade, conhecimento e formação acadêmica científica.

Aos membros da Comissão Examinadora na banca de defesa: Prof. Dr. Marcos Bryan

Heinemann, Prof. Dr. Marco Antônio Bacellar Barreiros, Prof. Dr. João Luis Garcia e Profa. Dra. Roberta L. Freire pelas valiosas contribuições ao presente trabalho.

À Elis Lorenzetti, Kerlei Cristina Médici e Thaís Neris da Silva Medeiros pela ajuda

indispensável, consideração e amizade durante todo o período de desenvolvimento deste trabalho. À grande amiga Maria Yoshie, meu muito obrigado pelos ensinamentos, puxões de orelha e momentos que jamais serão esquecidos.

À grande amiga Dalíria do Prado (in memorian) pelos ensinamentos, pelo exemplo de

integridade e profissionalismo. Que Deus a abençoe. Saudades... sempre em nossos corações.

Aos funcionários da Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-graduação (PROPPG) e Centro de Ciências Agrárias (CCA) pelo auxílio e atenção durante a realização dos trabalhos. A todos os funcionários do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva (DMVP) em especial ao José Aldivino (Microbiologia), José Roberto e Joãozinho (Patologia Clínica), por cada conversa, risadas e cumprimentos pelos corredores. Aos secretários do DMVP e Pós-Graduação, Reinaldo e Helenice, respectivamente, pela paciência e atenção.

Aos meus grandes amigos que acompanharam minha jornada ao longo deste período

de trabalho: Alexandre Redson Soares da Silva, Bruno Garcia Botaro, Danilo Laurenti Ferreira e Rafael Felipe Vieira, pelos conselhos, confiança, respeito e companheirismo, além dos momentos de descontração e muitas risadas; pessoas às quais serei eternamente grato.

Aos eternos amigos e colegas que conheci e convivi no “lab”: Alexandre Amude,

Betinha, Flora Kano, Jonas Espíndola, Juliana Dias, Marlise Claus, Michele Lunardi, Stellamaris Dezen, meu muito obrigado por toda ajuda e consideração, jamais me esquecerei de vocês. Aos demais amigos Aline Barry, Bruno Mazzer, Ceília de Souza, Claudia Tozato, Karina Flaiban, Kledir Spohr, Luciana Takemura, Patrícia Nunes da Silva, Rodrigo Otonel, Vanessa “Japa” Hashimoto, pessoas que certamente ficarão guardadas no lado esquerdo do peito, meu muito obrigado pela amizade em todos estes anos de convivência.

A todos os estagiários e bolsistas de iniciação científica do laboratório de Virologia

Animal da UEL que colaboraram com o desenvolvimento deste trabalho. À Universidade Estadual de Londrina pela estrutura e suporte fornecidos. Aos meus amigos e colegas de trabalho da Faculdade Integrado de Campo Mourão, ao

qual tenho muito orgulho e carinho por ter feito parte desta Instituição, em especial o meu agradecimento a Bruno Menarin, Claudia Gebara, Clóvis Bassani, Damaris, Franciele Baptista, Julio César Severino, Ludmila Moroz, Paulo Emílio Prohmann, Roberta R. Fernandes, Roberta Toledo, Rodrigo Yanaka, Sabrina Rodigheri, Vitor S. Sartori e a todos os meus orientados e demais alunos.

À Universidade Federal da Paraíba (UFPB / CCA), minha nova casa, à qual tenho me

dedicado neste último ano e, se Deus quiser, permitirá que eu continue meu trabalho até o fim de minha vida. Meu muito obrigado aos meus novos amigos e colegas de trabalho e profissão da UFPB, pessoal “arretado demais”: Abraão R. Barbosa, Alexandre José Alves, Daniela Lafetá, Fabiana Satake, o flamenguista doente George D. Santos, Katerin B. Grondona, o “pó de arroz” carioca Luis Felipe Souza da Silva, o “coxa branca” fanático e enciclopédia do futebol brasileiro Luiz Eduardo Buquera, o vascaíno Michel Alves da Silva, o pernambucano “Susie” da Ilha do Retiro Rafael Lima, o amigo e sofredor “gambá” Ricardo R. Guerra, o grande amigo e tricolor “bambi” paulista Rodrigo N. Pereira, o amigo e “cabra” bom Suedney de Lima Silva, a chefia do Departamento de Ciências Veterinárias, Suzana A. Costa de Araújo e Valeska P. de Melo (obrigado pela liberação das atividades – e paciência – para o desenvolvimento do presente trabalho).

Por fim, agradeço a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização

deste trabalho; meu muito obrigado.

RESUMO

STIPP, D.T. Rotavírus suíno grupo C (PoRV-C): Análise filogenética do gene VP6 de estirpes virais brasileiras e diagnóstico molecular de infecções singulares e mistas (PoRV-A e PoRV-B) em um surto de diarréia em leitões lactentes. 2011. 110f. Tese (Doutorado em Ciência Animal, Área de Concentração: Sanidade Animal) - Universidade Estadual de Londrina, Londrina. 2011. A diarreia neonatal é o principal problema sanitário que acomete leitões lactentes em todo o mundo. A diarréia é um problema multifatorial, determinada pela imunidade do hospedeiro, manejo zootécnico e agentes infecciosos como bactérias (Escherichia coli enterotoxigênica, Clostridium perfringens tipo C), protozoários (Cryptosporidium spp e Isospora suis) e vírus (rotavírus, coronavírus e calicivírus). O rotavírus suíno (PoRV) é descrito como a principal etiologia viral de enterite em leitões lactentes e recém desmamados em todo o mundo. O PoRV do sorogrupo C (PoRV-C) se distingue dos outros sorogrupos de PoRV pelas características antigênicas da proteína estrutural VP6 que é o principal alvo em técnicas de diagnóstico e análises moleculares. Este estudo teve por objetivo analisar a heterogeneidade genética de 15 estirpes de PoRV-C obtidas de episódios de diarreia em leitões provenientes de cinco estados brasileiros e descrever a participação de diferentes sorogrupos de rotavírus em um surto de diarreia em leitões em um rebanho vacinado contra a rotavirose. A diversidade genética das estirpes de PoRV-C foi analisada pela amplificação, sequenciamento e análise molecular de um produto com 1353 pb do gene da VP6. Filogeneticamente, as estirpes de PoRV-C avaliadas foram agrupadas em três clusters formados exclusivamente por estirpes de PoRV-C de origem suína, distintas das estirpes virais de origem bovina e humana. Em um surto de diarreia neonatal foram colhidas 15 amostras de fezes diarreicas de leitões lactentes com 1 a 4 semanas de idade. A presença de PoRV-A, PoRV-B e PoRV-C foi avaliada por técnicas moleculares (RT-PCR e SN-PCR). PoRV foi identificado em 14 (87,5%) amostras fecais sendo 81,2%, 56,2% e 18,7% das amostras positivas para o PoRV-C, PoRV-A e PoRV-B, respectivamente. Infecções mistas, ocasionadas por mais de um sorogrupo de PoRV, foram predominantes ocorrendo em 9 (64,3%) amostras fecais avaliadas. A associação mais frequente envolveu a presença de PoRV-A e PoRV-C. A caracterização molecular das estirpes de PoRV-A identificadas no surto demonstrou a presença do genotipo G4P[6]. Os resultados permitiram identificar, pela primeira vez, grande variabilidade genética no gene 5 (VP6) de estirpes virais brasileiras de PoRV-C indicando que, a exemplo de PoRV-A, existe diversidade molecular nas estirpes virais circulantes. O estudo de avaliação da infecção pelo rotavírus em rebanhos suínos regularmente vacinados contra a rotavirose demonstrou a importância do constante monitoramento da etiologia das diarreias neonatais em rebanhos vacinados, particularmente com relação à etiologia múltipla envolvendo diferentes grupos antigênicos de PoRV. Destaca-se ainda a importância da genotipagem das estirpes de PoRV-A identificadas nas amostras de fezes diarreicas de leitões de rebanhos vacinados com o objetivo de esclarecer as possíveis causas de falhas vacinais. Palavras-chave: suínos, diarréia, rotavírus grupo C, diagnóstico, filogenia.

ABSTRACT STIPP, D.T. Porcine rotavirus group C (PoRV-C): Phylogenetic analyses of VP6 gene of wild-type Brazilian strains and molecular diagnosis of single and mixed (PoRV-A and PoRV-B) infections in a diarrhea outbreak in suckling piglets. 2011. 110p. Thesis (Doctor’s Degree in Animal Science) – Londrina State University, Londrina. 2011. Neonatal diarrhea is the major piglet health problem in pig productions worldwide. Diarrhea is the result of the association of several factors that include host immunity, management procedures and infectious agents as bacteria (enterotoxigenic Escherichia coli, Clostridium perfringens type C), protozoa (Cryptosporidium spp and Isospora suis) and virus (rotavirus, coronavirus and calicivirus). Porcine rotavirus (PoRV) is the main cause of viral enteritis in suckling and weaned piglets. Porcine rotavirus group C (PoRV-C) is distinguished from other rotavirus groups by antigenic features of the structural protein VP6 that constitutes a frequent target of diagnostic assays and molecular analysis. The aim of the present study was to analyze the genetic heterogeneity of 15 PoRV-C strains from five Brazilian states and to describe the involvement of different rotavirus serogroups in an outbreak of diarrhea in piglets from a herd vaccinated against rotavirosis. The genetic diversity of the PoRV-C strains was investigated by amplification, sequencing and molecular analysis of a 1,353 bp VP6 gene product. Phylogenetically, the PoRV-C strains analyzed were ranged in three clusters exclusively formed by PoRV-C of porcine lineages, different from bovine and human virus strains. In a neonatal diarrhea outbreak episode, 15 diarrheic fecal samples were collected from piglets from 1 to 4-weeks-old. The presence of PoRV-A, PoRV-B and PoRV-C was analyzed by molecular techniques (RT-PCR and SN-PCR assays). PoRV was detected in 14 (87.5%) samples, where 81.2%, 56.2%, and 18.7% were positive to PoRV-C, A, and B, respectively. Mixed infections, caused by more than one PoRV serogroups, were predominant in 9 (64.3%) fecal, samples. The most frequent association involved the presence of PoRV-A and PoRV-C. The molecular characterization of wild-type PoRV-A strains detected in the diarrhea outbreak identified the presence of G4P[6] genotype. The results showed for the first time, a great genetic variability of gene 5 (VP6) of Brazilian PoRV-C strains, indicating that, like PoRV-A, the existence of molecular diversity among circulating PoRV-C strains. The study of rotavirus infection in a pig herd regularly vaccinated against rotavirosis demonstrates the importance of a constantly neonatal diarrhea etiology screening in vaccinated herds, particularly regarding to mixed etiology involving multiple antigenic PoRV groups. Note also the importance of genotyping of the PoRV-A strains identified in diarrheic fecal samples from piglets of vaccinated herds in order to clarify the possible causes of vaccine failure. Keywords: Swine, diarrhea, rotavirus, rotavirus group C, diagnosis, phylogeny.

SUMÁRIO

1 - REVISÃO DE LITERATURA

Rotavirose suína ........................................................................................................ 15 Rotavírus ................................................................................................................... 18 História e taxonomia ................................................................................................. 18 RV-A ......................................................................................................................... 18 RV-B ......................................................................................................................... 20 RV-C ......................................................................................................................... 21 Caracterização eletroforética e características das proteínas constituintes das camadas interna, intermediária e externa do capsídeo do RV-C. .............................

23

Perfil eletroforético do RV-C e diversidade genômica ............................................. 23 Proteína VP6 ............................................................................................................. 24 Proteína VP4 ............................................................................................................. 24 Proteína VP7 ............................................................................................................. 25 Epidemiologia da rotavirose suína ............................................................................ 26 Diagnóstico do rotavírus grupo C ............................................................................. 30 Profilaxia e controle .................................................................................................. 34 Referências ................................................................................................................ 35

2. OBJETIVOS

2.1. Geral ................................................................................................................. 49 2.2. Específicos ...................................................................................................... 49

3. ARTIGOS PARA PUBLICAÇÃO

3.1 VP6 gene heterogeneity of group C porcine rotavirus strains.

Abstract .................................................................................................................... 52 Introduction .............................................................................................................. 53 Materials and Methods ............................................................................................. 55 Results ...................................................................................................................... 59 Discussion ................................................................................................................ 69 References ................................................................................................................ 72

3.2 Porcine rotavirus group C (PoRV-C) single and mixed infections (PoRV-A, PoRV-B) as cause of a piglet diarrhea outbreak in vaccinated pig herd.

Abstract .................................................................................................................... 78 References ................................................................................................................ 86

4. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 93

5. ANEXOS

A. Lista de reagentes ............................................................................................ 95 B. Soluções e tampões ......................................................................................... 97 C. Protocolo de técnicas ....................................................................................... 101

LISTA DE FIGURAS

VP6 gene heterogeneity of group C porcine rotavirus strains. Fig.1. Neighbor-Joining (Tamura-Nei model) tree based on complete sequences of VP6

gene of 15 Brazilian PoRV-C wild-type strains (●) described in this study and eight reference strains acquired from GenBank with complete RV-C VP6 sequences. The names of RV-C strains and GenBank accession numbers are listed in Table 2. The scale bar is proportional with the phylogenetic distance. ......................................... 61

Fig.2. Phylogenetic tree of the VP6 gene of the Brazilian PoRV-C strains showing its genetic relationship with other RV-C strains. RV-A srains CMP12/03 (Porcine), KJ9-1 (Bovine) and PA169 (Human); and RV-B strains RUBV282 (Bovine) and WH-1 (Human), were used as out-groups. The shape markers of Brazilian PoRV-C are according to the pig herds State location (Mato Grosso do Sul [▼], Minas Gerais [■], Paraná [▲], Rio Grande do Sul [●] and Santa Catarina [♦]).The names, original hosts and GenBank accession numbers of RV-A, B and C strains are listed in Table 2. The number adjacent to the node represents the bootstrap value. Scale bar shows genetic distance expressed as nucleotide substitutions per site. ............................... 62

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LISTA DE TABELAS

VP6 gene heterogeneity of group C porcine rotavirus strains. Table 1. Brazilian PoRV-C wild-type strains with VP6 gene sequences performed in the

study, their origin and year collected. ................................................................. 56 Table 2. GenBank accession numbers of the VP6 genes of the Brazilian PoRV-C

strains, reference RV-C strains and out group strains used in phylogenetic and sequence analyses. ....................................................................................... 59

Table 3. Estimates of evolutionary divergence between the Brazilian PoRV-C and out-

group RV-A reference strains. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown ........................................................ 64

Table 4. Estimates of evolutionary divergence between Porcine I clustered strains. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown. …………………………………........................................................ 65

Table 5. Estimates of evolutionary divergence between Porcine II clustered strains. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown. ……..………………………………………………………….... 66

Table 6. Estimates of evolutionary divergence between Porcine III clustered strains. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown. .….…………………………………………………………….... 67

Table 7. Estimates of evolutionary divergence between Porcine I, Porcine II, Porcine III, Bovine and Human clusters. The numbers of base differences per site from between PoRV-C sequences are shown. ………………….………..…….... 68

Table 8. Nucleotide and deduced amino acid sequence comparison of the VP6 of the Brazilian PoRV-C strains with that of the other strains. …………………... 68

Porcine rotavirus group C (PoRV-C) single and mixed infections (PoRV-A, PoRV-B) as cause of a piglet diarrhea outbreak in vaccinated pig herd. Table 1. Groups of porcine rotavirus (PoRV) identified by RT-PCR assay in a diarrhea

outbreak in weaning piglets. .......................................................................... 83

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LISTA DE QUADROS

Revisão de Literatura Quadro 1. Frequência de detecção do rotavírus suíno grupo A em fezes de leitões ..... 28

Quadro 2. Frequência de detecção do rotavírus suíno grupo B em fezes de leitões ..... 29

Quadro 3. Frequência de detecção do rotavírus suíno grupo C em fezes de leitões ..... 30

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1. REVISÃO DE LITERATURA

15

Rotavirose suína

As diarreias neonatais constituem importante problema sanitário que afeta a produção

de rebanhos suinícolas, independentemente do nível de tecnificação da criação, sendo

observadas tanto em países desenvolvidos quanto em desenvolvimento. Os prejuízos

econômicos determinados pelas diarreias podem comprometer a longevidade da exploração

econômica de suínos devido aos aumentos nas taxas de morbidade e mortalidade; bem como,

pelas despesas adicionais de mão de obra e medicação com o tratamento dos animais

enfermos. Os episódios de diarreia em animais jovens determinam ainda alterações

consideráveis nas taxas de conversão alimentar e de ganho de peso, ocasionando problemas

de manejo em consequência da desuniformidade dos lotes. A desidratação, o desequilíbrio

eletrolítico e a acidose são os sinais clínicos mais frequentes. Os animais doentes se

apresentam imunossuprimidos, predispondo-os a outras infecções, principalmente as

respiratórias (PAUL; LYOO, 1993; WIELLER et al., 2001; CALDERATO et al., 2001;

ALFIERI et al., 2007).

Em leitões, as diarreias ocorrem tanto em animais lactentes quanto recém-

desmamados. As fases de maternidade e creche representam o período de maior desafio à

sanidade entérica dos leitões (KATOULI et al., 1995). A imaturidade imunológica e falha na

proteção passiva são as principais causas da maior susceptibilidade dos animais na

maternidade (SPENCER et al., 1989). No período pós-desmame, a primeira e a segunda

semanas constituem-se em fatores de risco para diarreias, principalmente devido às alterações

de ordem social e alimentar a que os animais são expostos em decorrência do manejo

(MELIN et al., 2000; ALFIERI et al., 2007).

A etiologia das diarreias é complexa e fatores ambientais, nutricionais e vários agentes

infecciosos como vírus, bactérias, parasitas e toxinas bacterianas podem estar envolvidos

nesta síndrome. A importância relativa dos agentes etiológicos é variável e o predomínio de

16

um determinado agente em rebanhos, regiões ou mesmo a sua distribuição sazonal, está

relacionada com a intensidade e a regularidade com que medidas de caráter higiênico-

sanitário são adotadas (JANKE, 1989; JOHNSON et al., 1992; CICIRELLO; GLASS, 1994;

ALFIERI et al., 2007).

As causas infecciosas mais comuns das diarreias em suínos nos períodos do pré e do

pós-desmame no Brasil são representadas pelos enteropatógenos Escherichia coli, rotavírus,

Isospora suis, Cryptosporidium spp e Clostridium perfringens. Estes agentes causam diarreia

cuja intensidade pode variar desde branda a grave, podendo culminar com a morte dos

animais comprometidos (MELIN et al., 2004). As variações nos sinais clínicos e nas taxas de

morbidade e de mortalidade são devidas às diferenças na virulência e/ou na dose infecciosa do

patógeno; da associação entre microrganismos; de aspectos relacionados ao hospedeiro como

o estatus imunológico e a idade; e de fatores relacionados ao meio ambiente e ao manejo

como limpeza, desinfecção, umidade e ventilação, entre outros (ALFIERI et al., 2007). A

semelhança dos sinais clínicos, independentemente do agente etiológico, impossibilita a

determinação da etiologia com base apenas nos parâmetros clínicos (DRIESEN et al., 1993).

Com relação à etiologia viral das diarreias, os rotavírus (RV) são considerados a

principal causa de infecções entéricas em mamíferos e em aves jovens em todo o mundo. A

gama de hospedeiros é extensa e, além de seres humanos, inclui várias espécies de animais de

produção destacando-se, principalmente pelo impacto econômico que representa ao setor

produtivo, as infecções em leitões, bezerros e em aves jovens como frangos de corte e perus

(McNULTY, 1978; ESTES et al., 1981; HO et al., 1988; ESTES; COHEN, 1989; ALFIERI et

al., 2007).

A rotavirose suína caracteriza-se por comprometer animais jovens, entre a segunda e a

quarta semanas de vida (BOHL, 1978; UTRERA et al., 1984; WIELER et al., 2001; ALFIERI

et al., 2007). A morbidade da rotavirose suína é alta, principalmente nas primoinfecções,

17

porém a mortalidade é variável e oscila entre 7-20% (BOHL, 1978). As matrizes prenhes,

quando portadoras, eliminam o RV por meio das fezes para o ambiente, principalmente nos

dias que antecedem ao parto, sendo fonte de infecção para os leitões (RUBIO et al., 1988).

Em infecções naturais os animais eliminam o RV tanto nas fezes normais quanto diarréicas

(DEWEY et al., 2003).

A transmissão dos RV ocorre por via fecal-oral, com a ingestão de água e/ou

alimentos contaminados com fezes. Há relatos da possibilidade da transmissão por aerosóis,

principalmente quando as condições de umidade e ventilação do ambiente são favoráveis

(COOK et al., 1996; KAPIKIAN et al., 2001). Os RV são, geralmente, espécie-específicos,

porém a ocorrência de infecções entre diferentes espécies animais, denominadas infecções

heterólogas, tem sido demonstrada (COOK et al., 2004).

O RV se replica, principalmente, em ambientes com grande concentração de animais e

com condições de higiene desfavoráveis, infectando as células epiteliais das vilosidades

intestinais (KAPIKIAN et al., 2001). Somente partículas com tripla camada protéica

conseguem aderir-se aos enterócitos. O RV apresenta tropismo por enterócitos maduros das

porções média e alta das vilosidades do intestino delgado, principalmente terço final de jejuno

e inicial de íleo, de animais e de seres humanos jovens (LUNDGREN; SVENSSON, 2001).

No processo de replicação viral ocorre a lise das células infectadas. A redução da capacidade

de absorção dos enterócitos e a descamação do epitélio intestinal, com atrofia das vilosidades,

causam o quadro diarréico (KAPIKIAN et al., 2001).

Os sinais clínicos iniciam por volta do terceiro dia pós-infecção e os animais podem

excretar o vírus por até oito dias após o início dos sinais clínicos (DEWEY et al., 2003). Os

animais apresentam, principalmente, diarreia de consistência pastosa à líquida e de curta

duração, em média por três dias. A desidratação é frequente em leitões muito jovens, onde a

infecção é mais grave (THEIL et al., 1985a).

18

Rotavírus

Histórico e taxonomia

Os RV são membros da família Reoviridae e pertencem ao gênero Rotavirus. A

partícula viral é de simetria icosaédrica, com aproximadamente 70 a 90 nm de diâmetro, não

apresenta envelope lipoprotéico e o capsídeo é constituído por três camadas concêntricas de

proteínas. O genoma viral é formado por 11 segmentos de RNA fita dupla (dsRNA) que

codificam seis proteínas estruturais (VP – viral protein) e seis proteínas não-estruturais (NSP

– non-structural protein). A nomenclatura das VPs (VP1; VP2; VP3; VP4; VP6 e VP7) e das

NSPs (NSP1; NSP2; NSP3; NSP4; NSP5; NSP6), presentes em partículas virais maduras, são

seguidas por números em ordem decrescente da massa molecular. As proteínas VP1, VP2 e

VP3 formam a camada interna, ou core, do capsídeo viral; a proteína VP6 constitui a camada

intermediária, e as proteínas VP4 e VP7 formam a camada externa do capsídeo (ESTES;

COHEN, 1989; MIDTHUN; KAPIKIAN, 1996). A proteína VP4 tem função essencial no

ciclo de replicação do vírus, incluindo a ligação ao receptor celular e a penetração em células

hospedeiras. A função da VP7, durante a interação inicial, ainda não está bem estabelecida

(ZARATE et al., 2004).

Com base na especificidade antigênica da VP6 os RV são classificados em sete grupos

sorológicos (sorogrupos) denominados de A a G. Todos os membros de cada sorogrupo,

independentemente da espécie animal de origem, apresentam seu próprio antígeno comum

que é antigenicamente distinto entre os sorogrupos (ESTES; COHEN, 1989).

Rotavírus grupo A (RV-A)

A proteína VP4 exerce influência direta na patogenicidade e na atenuação das estirpes

de RV-A e apresenta epítopos neutralizantes que, juntamente com a VP7, estão associados à

19

neutralização sorotipo-específica e à proteção contra a infecção. Com isso, à semelhança do

vírus influenza, os RV apresentam classificação sorológica binária onde devem ser

consideradas, simultaneamente, as especificidades antigênicas das proteínas VP4 e VP7,

formadoras da camada externa do capsídeo viral (HOSHINO et al., 1985; OFFIT et al., 1986).

Para a padronização da nomenclatura, os sorotipos de RV-A relacionados à VP4, são

denominados sorotipos “P” devido a sua susceptibilidade à clivagem proteolítica. Os

sorotipos relacionados ao polipeptídeo VP7, por ser de constituição glicoproteica, são

denominados sorotipos “G” (ESTES; COHEN, 1989).

A identificação por métodos sorológicos dos sorotipos G e P de RV-A apresenta uma

série de limitações como: i) alta taxa de amostras não sorotipadas nos levantamentos

epidemiológicos; ii) grande número de infecções mistas ou variantes antigênicas; iii) não

caracterização de sorotipos P por meio de ensaios imunoenzimáticos comerciais (ALFIERI,

1999). Com isso, a genotipagem passou a ser utilizada como uma técnica alternativa à

sorotipagem dos RV-A. Atualmente são reconhecidos 24 genotipos G (G1 a G24) e 33

genotipos P (P[1] a P[33]) demonstrando a ampla diversidade antigênica desse grupo de RV

(KAPIKIAN et al., 2001; MARTELLA et al., 2006; KHAMRIN et al., 2007; URSU et al.,

2009; COLLINS et al., 2010).

Os genotipos de RV-A mais frequentemente encontrados em suínos são G3, G4, G5 e

G11 que estão associados com P[6] ou P[7] (WINIARCZYK et al., 2002; BARREIROS et al.,

2003). Outros P tipos têm sido descritos em RV isolados ou presentes em amostras fecais

como P7[5]; P1A[8]; P[13]; P12[19]; P14[23] (LIPRANDI et al., 2003; MARTELLA et al.,

2005). As principais combinações entre os genotipos G e P de RV-A suíno são G5P[7]

(OSU), G4P[6] (Gottfried), G11P[7] (YM), e G3P[7] (CRW8) (BARREIROS et al., 2003;

PARRA et al., 2008).

20

Apesar da caracterização dos RV, particularidades sobre a replicação do genoma viral

e as diversas fases que envolvem a morfogênese ainda não foram esclarecidas (ARNOLDI et

al., 2007). A proteína NSP2, assim como a proteína NSP5 participam nos processos de

formação do viroplasma e de replicação viral durante infecções naturais (CAMPAGNA et al.,

2005; SILVESTRI et al., 2004). A NSP5 apresenta massa relativamente pequena (21,7 kDa)

quando comparada com outras proteínas, assumindo a forma de um octâmero quando em

solução. Análises moleculares utilizando a proteína NSP2 como sequência alvo têm

demonstrado resultados satisfatórios na detecção do RV-B de origem humano e animal

(GOUVEIA et al, 1991).

Uma proteína não-estrutural de grande relevância é a NSP4, devido ao seu

envolvimento com a morfogênese viral e sua atividade enterotóxica (MARTELLA et al.,

2003). Estudos com a proteína NSP4 do RV-A, sugerem a sua classificação em cinco

genogrupos: i) genogrupos A, B e C isolados de leporinos, equinos, bovinos, suínos, símios,

caninos e felinos e seres humanos nos quais análises filogenéticas mostram o agrupamento

das estirpes sempre em um mesmo ramo, sugerindo evolução constante entre estas estirpes

virais; ii) genogrupos D e E, encontrados somente em camundongos e aves, respectivamente

(CIARLET et al., 2000).

Rotavírus grupo B (RV-B)

Tanto a caracterização antigênica e molecular quanto a prevalência dos RV-B ainda

não estão bem esclarecidas (TSUNEMITSU et al., 1999), principalmente devido à dificuldade

de adaptação desse grupo de RV em culturas celulares (THEIL; SAIF, 1985). Estudos

moleculares, direcionados aos genes que codificam as proteínas do capsídeo interno, indicam

particularidades nos RV-B quando comparados aos RV-A e RV-C (CHEN et al., 1991).

21

A variação genética existente entre as estirpes de RV-B ainda é pouco caracterizada,

porém análises de nucleotídeos e de aminoácidos têm demonstrado grande diversidade em

estirpes de RV-B em relação aos RV-A (45,2% de identidade) e RV-C (26,4% de identidade)

(CHANG et al., 1997; CHEN et al., 2002). Análises moleculares demonstraram também

grande variabilidade na proteína VP7 de estirpes do RV-B provenientes de diferentes

hospedeiros e de diversas regiões do mundo (CHEN et al., 1991; PEDRIC et al., 1991;

EIDEN; ALLEN, 1992; CHANG et al., 1997; KANG et al., 2005; ALFIERI et al., 2007).

Técnicas de hibridização molecular têm sido utilizadas para avaliar a diversidade

genética em estirpes de RV-B. O sequenciamento dos genes 4 (VP4), 6 (NSP1), 8 (NSP2), 9

(VP7) e 11 (NSP5) dos protótipos indianos CAL (Calcutá) e ADRV (adult diarrhea

rotavirus), e de algumas estirpes virais provenientes de surtos de diarreias em seres humanos,

revelaram grande diversidade antigênica nas estirpes de RV-B (SEN et al., 2001; KELDAR;

ZADE, 2004; JIANG et al., 2005; ALAM et al., 2006).

A identificação de segmentos genômicos homólogos, utilizando a técnica de

hibridização com probes, indicou que as estirpes de RV-B IDIR (infant diarrhea rats) e

ADRV estão intimamente associadas quando comparadas com o gene correspondente da

estirpe padrão Nemuro GBR (group B rotavirus) (TSUNEMITSU et al., 2005). Estes dados

são importantes para o estabelecimento das relações antigênicas entre as diferentes estirpes de

RV-B existentes e sua relação com os outros grupos de RV (EIDEN et al., 1992).

Rotavírus grupo C (RV-C)

Os RV-C foram, primeiramente, descritos na década de 80 (SAIF et al., 1980; BOHL

et al., 1982), onde algumas estirpes de RV detectadas em episódios diarreicos em suínos e em

outras espécies, como aves, apresentavam em comum um grupo de antígenos, detectado por

métodos sorológicos como imunofluorescência e técnicas de ELISA (Enzyme-linked

22

immunossorbent assay). Estes agentes, por apresentarem morfologia semelhante aos RV,

porém sem grupo antigênico comum às estirpes caracterizadas anteriormente, eram

denominados “pararotavírus”, rotavírus “não-grupo A” ou “rotavírus atípicos” (WOODE et

al., 1976; THOULESS et al., 1977).

Desde então, os RV-C têm sido identificados em humanos, bovinos, caninos e animais

silvestres, como furões (RODGER et al., 1982; TORRES-MEDIAN, 1987; TSUNEMITSU et

al., 1991; OTTO et al., 1999). Em humanos, infecções por RV-C têm sido associadas com

episódios esporádicos e também em surtos de gastroenterites em todo o mundo, determinando

sua importância como patógeno entérico (BRIDGER et al., 1986; SZUCS et al., 1987;

ARISTA et al., 1990; CAUL et al., 1990; SAIF; JIANG, 1994; JIANG et al., 1995; KUZUYA

et al., 1998; SCHNAGL et al., 2004; KUZUYA et al., 2005; RAHMAN et al., 2005;

BANYAI et al., 2006).

Assim como nos RV-A, a diversidade genômica dos RV-C também é decorrente de

mutação pontual, ressortimento e rearranjo. A mutação pontual consiste em alterações na

sequência de nucleotídeos que ocorrem durante a replicação do genoma. A acumulação de

mutações pontuais tem sido observada em isolados obtidos durante uma única epidemia de

RV-A (PALOMBO et al., 1993). Estas alterações levam à substituições nos aminoácidos da

proteína codificada, podendo alterar o sítio antigênico, resultando em estirpes resistentes aos

anticorpos neutralizantes produzidos contra as estirpes parentais. Ressortimento consiste em

mudanças no genoma que ocorrem devido a trocas de segmentos de dsRNA entre diferentes

estirpes virais (ESTES; COHEN, 1989). Este fenômeno pode ocorrer quando uma célula é

coinfectada por duas estirpes virais distintas, de forma que a progênie viral será constituída

por uma população contendo diferentes combinações dos genes parentais (TANIGUCHI;

URASAWA, 1995). Alterações em porções significativas da sequência em um mesmo

segmento genômico, muitas vezes na forma de deleções ou duplicações, são denominadas de

23

rearranjo. Estas alterações levam a modificações na massa molecular dos segmentos de

dsRNA, resultando em perfil eletroforético distinto daquele original (GONZÁLES et al.,

1989). Portanto, estes três mecanismos parecem ser responsáveis pela grande variabilidade e

complexidade dos RV.

Caracterização eletroforética e características das proteínas constituintes das camadas

interna, intermediária e externa do capsídeo do RV-C.

Perfil eletroforético do RV-C e diversidade genômica

O perfil de migração do dsRNA na técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida

(silver stained-polyacrylamide gel electrophoresis, ss-PAGE) permite a diferenciação dos RV

em sete eletroferogrupos distintos (A-G), correspondentes aos sorogrupos (RODGER et al.,

1981; ESTES et al., 1984). O padrão genômico básico do RV-C consiste de classes ou regiões

de diferentes massas moleculares contendo os segmentos de dsRNA de 1 a 4 (Classe I); 5, 6 e

7 (Classe II); 8 e 9 (Classe III) e segmentos 10 e 11 (Classe IV). Esta disposição é

frequentemente representada como 4-3-2-2, indicando o número de segmentos genômicos

encontrados em cada classe do dsRNA do RV-C.

Uma importante característica dos RV-C, que os diferencia do padrão genômico dos

RV-A é a migração dos segmentos 5 (58,6 kDa, NSP1), 6 (48,1 kDa, VP6) e 7 (34,7 kDa,

NSP3) em forma de triplet ou trinca, devido às suas respectivas massas moleculares serem

próximas. Por outro lado, o RV-A apresentam um triplet composto pelos segmentos 7, 8 e 9,

ausente no perfil eletroforético do RV-C. Contudo, o perfil genômico por ss-PAGE, não deve

ser utilizado como único método de classificação dos RV, pois alterações no genoma viral,

como rearranjo, podem levar a alterações no padrão de migração dos segmentos (SAIF;

JIANG, 1994).

24

Proteína VP6

A proteína estrutural VP6, considerada a principal estrutura protéica localizada na

superfície da partícula viral, representando 50% a 60% da massa total dos virions, é

codificada pelo segmento genômico 6. A proteína VP6 apresenta arranjo em 260 unidades

morfológicas, T=13, e estas apresentam estrutura trimérica e tubular. Evidências desta

estrutura já haviam sido descritas por Gorziglia et al. (1985), sendo encontradas 780

moléculas de VP6 por virion. Jiang et al. (1990) propuseram que a VP6 no RV-C não

apresenta estrutura trimérica, mas sim tetramérica. Em estudo desenvolvido por Tosser et al.

(1992) foi demonstrada a possível existência de pontes de ligação de dissulfeto na forma

monomérica da VP6 em RV-C.

A atividade biológica da proteína VP6 também vem sendo alvo de estudos

bioquímicos e moleculares. Estudos demonstraram que a VP6 está implicada na forma de

ação da transcriptase celular, uma vez que a remoção do capsídeo interno, do qual a VP6 faz

parte, resulta na perda da atividade enzimática (BICAN et al., 1982; SANDINO et al., 1986;

SANDINO et al.; 1988). Reciprocamente, a VP6 não está presente em partículas subvirais que

expressam a atividade de replicação do vírus (MANSELL; PATTON, 1990). A VP6 é

considerada uma das proteínas mais imunogênicas e antigênicas, sendo a mais frequentemente

detectada em métodos diagnósticos e ensaios imunológicos. A proteína ainda está envolvida

na classificação do RV em grupos e subgrupos, com base em seus epítopos (THOULESS et

al.,1982; GREENBERG et al., 1983).

Proteína VP4

O sucesso da propagação viral de estirpes virais de origem suína (Cowden) e bovina

(Shintoku) de RV-C determinou avanço considerável nos estudos moleculares deste grupo de

rotavírus. No entanto, devido à natureza biológica dos RV-C em cultura celular, apenas uma

25

quantidade limitada de dsRNA é disponível para a caracterização molecular. Poucos estudos

puderam determinar a atividade biológica da VP4 do RV-C de maneira específica. Em um

estudo realizado por Fielding et al. (1994), foi demonstrado que o gene da VP4 está

relacionado com a capacidade de replicação do RV-C em cultura celular, ainda mais que a

clivagem da proteína aumenta sua habilidade de penetração celular, sendo uma das

características determinantes de suscetibilidade tecidual.

Alta taxa de conservação tem sido observada nas sequências do gene da VP4 em

estirpes de RV-C identificados em humanos provenientes de diferentes partes do mundo. A

maior diferença foi observada comparando-se as estirpes humanas de RV-C com as estirpes

virais identificadas em bovinos e suínos (FIELDING et al., 1994; ADAH et al., 2002;

SCHNAGL et al., 2004).

Proteína VP7

De forma semelhante ao capsídeo intermediário (VP6) são encontradas 780 moléculas

da proteína VP7, por partícula viral, arranjadas de forma trimérica (T=13). Esta proteína é

glicosilada e constitui a base da camada protéica externa do capsídeo viral. A partir da VP7

são projetadas as espículas de VP4 (PRASAD; CHIU, 1994). A proteína VP7 é um dos

principais antígenos presentes na partícula viral, capaz de induzir a formação de anticorpos

neutralizantes, considerados de importância na proteção da diarreia causada pelo RV

(HOSHINO et al., 1985).

A proteína VP7 é a principal glicoproteína externa e apresenta alto grau de

variabilidade (sorotipo / genotipo G) entre as diferentes estirpes de RV humano e animal.

Ainda assim, há variação significativa entre as sequências do gene que codifica a VP7 de

estirpes de RV isoladas de humanos e animais (JIANG et al., 1991). Por outro lado, a análise

26

de sequências do gene da VP7 do RV-C demonstraram alta taxa de conservação entre as

estirpes isoladas em diferentes partes do mundo (GRICE et al., 1994).

Epidemiologia da rotavirose suína

Em todo o mundo, independentemente do grau de tecnificação do manejo

implementado, as diarreias em leitões alojados na maternidade e na creche ocasionadas pelos

RV são constantes. Considerando a frequência das diarréias, os RV-A assumem grande

importância na epidemiologia das diarreias neonatais em suínos (SAIF; JIANG, 1994).

Porém, nessas etapas da criação dos leitões as diarreias ocasionadas por RV-B e RV-C

destacam-se como as de maior ocorrência em comparação com outras espécies animais

(ALFIERI et al., 1996; CHANG et al., 1997).

Os suínos compreendem a espécie de mamíferos onde, além da soroprevalência, as

taxas de ocorrência de diarreia determinada por RV-C são as mais altas. Em algumas

situações a infecção pode apresentar caráter enzoótico, sugerindo ainda que a maioria das

infecções são sub-clínicas ou, simplesmente, não são detectadas pelos métodos de

diagnósticos rotineiramente utilizados (CHASEY; DAVIS, 1984; DEBOUCK et al., 1984;

SIGOLO DE SAN JUAN et al., 1986; SAIF, 1990; SAIF; JIANG, 1994, MÉDICI et al.,

2010).

Estudos epidemiológicos descrevendo a distribuição mundial do RV-C, especialmente

em humanos, revelam a característica emergente deste patógeno (CAUL et al., 1990;

KUZUYA et al., 2005; BÁNYAI et al., 2006; IIZUKA et al., 2006; ; STEYER et al., 2006;

KUZUYA et al., 2007; ESONA et al., 2008; MÉDICI et al., 2010). As infecções singulares ou

em associação com outros enteropatógenos, têm sido relatadas em leitões lactentes e recém-

desmamados (SAIF et al., 1980; SIGOLO DE SAN JUAN et al., 1986; MORIN et al., 1990;

SAIF; JIANG, 1994; KIM et al., 1999; MARTELLA et al., 2007, MÉDICI et al., 2011).

27

Apesar do número limitado de estudos que envolvem a prevalência do PoRV-C, estudos

mostram que a prevalência de anticorpos anti-PoRV-C é alta nos rebanhos, com taxas

variando de 28 a 70% em leitões com até oito semanas de idade, podendo alcançar taxas de 79

a 100% em animais adultos (TERRETT et al., 1987; TSUNEMITSU et al., 1992; SAIF;

JIANG, 1994). No entanto, o significado epidemiológico destes estudos é limitado com

relação à distribuição geográfica (SAIF et al., 1980; SIGOLO DE SAN JUAN et al., 1986;

MORIN et al., 1990; SAIF; JIANG, 1994; WILL et al., 1994; KIM et al., 1999; MARTELLA

et al., 2007; COLLINS et al., 2008). Os quadros 1, 2 e 3 apresentam dados relativos à

frequência de diagnóstico de RV-A, B e C, respectivamente, em leitões.

28

Quadro 1: Frequência mundial de detecção do rotavírus suíno grupo A em fezes de leitões.

Local

Técnica Rebanhos Amostras

Referência Total Positivos (%) Total Positivas (%)

Japão PAGE 10 - 845 142 (16,8) Sanekata et al. (1996)

Tailândia PAGE 3 - 557 23 (4,1) Pongsuwanna et al. (1996)

Alemanha EM 24 5 (20,8) 149 6 (4,0) Wieller et al. (2001)

Brasil PAGE - - 99 53 (55,5) Barreiros et al. (2003)

Espanha IPX - - 98 32 (32,6) Martella et al. (2005)

Coréia do Sul RT-PCR 38 5 (13,2) 157 57 (36,3) Song et al. (2006)

Irlanda RT-PCR 4 3 (75,0) 292 19 (6,5) Collins et al. (2010) EM (Microscopia eletrônica); IPX (imunoperoxidase indireta); RT-PCR (Reação em cadeia da polimerase, precedida de transcrição reversa); PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida).

29

Quadro 2: Frequência mundial de detecção do rotavírus suíno grupo B em fezes de leitões.

Local

Técnica Amostras

Referência Total Positivas (%)

África do Sul PAGE 65 3 (4,6) Geyer et al. (1996)

Canadá PAGE 120 56 (46,7) Magar et al. (1991)

EUA ELISA 4 2 (50,0) Vonderfecht et al. (1994)

EUA PAGE 96 6 (6,2) Will et al. (1994)

EUA PAGE 90 9 (10,0) Janke et al. (1990)

EUA IF 44 10 (23,0) Theil et al. (1985)

México PAGE 256 41 (4,8) Morilla et al. (1991)

Japão SN-PCR 845 41 (4,8) Sanekata et al. (1996)

China RT-PCR 20 4 (20,0) Gouveia et al. (1991)

Tailândia PAGE 557 1 (0,2) Pongsuwanna et al. (1996)

Austrália PAGE 16 3 (18,7) Nagesha et al. (1981) ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay); IF (Imunofluorescência indireta); PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida); RT-PCR (Reação em cadeia da polimerase, precedida de transcrição reversa); SN-PCR (Semi-nested PCR).

30

Quadro 3: Frequência de detecção do rotavírus suíno grupo C em fezes de leitões.

Local

Técnica Amostras

Referência Total Positivas (%)

África do Sul PAGE 65 7 (10,8) Geyer et al. (1996)

Canadá PAGE 120 6 (5,0) Magar et al. (1991)

EUA ELISA 4 1 (25,0) Vonderfecht et al. (1994)

EUA PAGE 96 5 (5,2) Will et al. (1994)

EUA RT-PCR 11 11 (100,0) Kim et al. (1999)

Brasil RT-PCR 34 17 (50,0) Alfieri et al. (1999)

Itália RT-PCR 188 54 (28,7) Martella et al. (2007)

Japão RT-PCR 845 29 (3,4) Sanekata et al. (1996)

Tailândia PAGE 557 2 (0,3) Pongsuwanna et al. (1996)

China RT-PCR 7 3 (42,8) Gouveia et al. (1991)

Austrália PAGE 16 7 (43,7) Nagesha et al. (1981) ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay); RT-PCR (Reação em cadeia da polimerase, precedida de transcrição reversa); PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida).

Diagnóstico do rotavírus sorogrupo C

Vários métodos de diagnóstico laboratorial para o RV-C foram desenvolvidos,

tanto para a detecção da partícula viral quanto de proteínas e do ácido nucléico. Assim

como para o RV-A, os métodos variam quanto à especificidade, sensibilidade,

facilidade de execução e custo final do diagnóstico (ALFIERI et al., 1999).

O isolamento do RV em cultivo celular somente foi difundido e utilizado como

técnica de diagnóstico, após a utilização do tratamento do inóculo viral com enzimas

proteolíticas, como a tripsina, que aumentam a probabilidade da propagação in vitro do

31

RV (SATO et al., 1981). O cultivo celular é uma técnica ainda bastante utilizada para o

isolamento do RV-A.

As estirpes de RV-C, assim como as de RV-B, são de difícil adaptação em

cultivo celular e a tentativa de isolamento viral é uma técnica laboriosa, demorada e que

requer a presença de partículas virais infectantes. Apesar desses inconvenientes, o

isolamento do RV-C em cultivo celular é uma técnica de fundamental importância para

a disponibilização de estirpes virais selvagens para estudos complementares de caráter

antigênico e molecular (TERRET et al., 1987; SAIF et al., 1988; TSUNEMITSU et al.,

1991).

A microscopia eletrônica (ME) é um importante método de diagnóstico para a

identificação de estirpes virais não-cultiváveis em amostras clínicas (NAKATA et al.,

1987). Como a quantidade de partículas víricas eliminadas por um animal na fase aguda

da doença é muito grande, principalmente nas infecções pelo RV-A, é possível a

visualização direta do RV pela microscopia eletrônica. A integridade da partícula viral

depende dos procedimentos utilizados no preparo da amostra sendo que o RV-B é o

menos estável. A ME é uma técnica altamente específica e permite a visualização da

morfologia característica dos RV, porém o emprego deste método na detecção do RV-C

ainda não foi descrita.

O ensaio imunoenzimático (ELISA), devido à sua alta sensibilidade, facilidade

de execução e ao grande número de amostras que podem ser analisadas

simultaneamente, assim como pela rapidez na obtenção dos resultados, é uma técnica

amplamente difundida para o diagnóstico do RV-A. No entanto, a utilização para a

detecção do RV-C determina resultados pouco confiáveis. Isto se deve ao fato de que

não há o reconhecimento adequado do antígeno específico VP6 do RV-C, determinando

resultados falso-negativos, caracterizando-a como metodologia de baixa sensibilidade.

32

Outro aspecto é a possibilidade de reações inespecíficas ou a presença de inibidores no

material fecal que podem diminuir a sensibilidade do teste (JURE et al., 1988). Devido

à grande antigenicidade, a proteína VP6 tem sido utilizada como base para elaboração

de “kits” comerciais de ELISA para o diagnóstico etiológico do RV-A. Por outro lado,

devido à grande heterogeneidade e baixa similaridade do gene da VP6 entre as estirpes

circulantes de RV-C de origem humana e animal, o uso de testes imunoenzimáticos

comerciais determinam resultados inconclusivos, já que não detectam o antígeno VP6

específico dos RV-C (XU et al., 1990; KUZUYA et al., 1996).

A técnica de ss-PAGE é uma das técnicas mais utilizadas para a detecção dos

segmentos do ácido nucléico (dsRNA) do RV. Por meio da análise do perfil de

migração dos 11 segmentos genômicos do RV, a técnica de PAGE apresenta a

vantagem adicional de possibilitar a determinação do eletroferotipo da estirpe viral e,

consequentemente, a identificação dos grupos A, B e C (KALICA et al., 1976;

HERRING et al., 1982). Contudo, a eletroferotipagem, apesar de ser extremamente

importante na definição de grupo ou eletroferogrupo, não possibilita a definição do

sorotipo viral. Estirpes virais de um mesmo sorotipo podem apresentar perfis

eletroforéticos diferentes, enquanto que estirpes com perfis semelhantes podem

pertencer a diferentes sorotipos (BEARDS, 1982; MARKOWSKA-DANIEL et al.,

1996). Contudo, o perfil de migração do dsRNA define o eletroferotipo, sendo

denominado de padrão genômico (RODGER et al., 1981; ESTES et al., 1984; ESTES;

COHEN, 1989). Esta característica de migração determina a classificação dos RV-C,

como também dos RV-B (4-2-2-3), como sendo rotavírus atípicos. Isto se deve por não

apresentarem o triplet característico dos RV-A (CHASEY et al., 1984; MCNULTY et

al., 1984; PEDLEY et al., 1986; KAPIKIAN et al., 2001; HOSHINO; KAPIKIAN,

1994).

33

A limitação pela baixa sensibilidade, assim como na técnica de ELISA, também

é observada na técnica de PAGE. Estudos demonstraram que para o sucesso da detecção

do dsRNA viral são necessários no mínimo 108 a 1010 partículas virais por mililitro de

fezes. A baixa quantidade de partículas virais de RV-B e RV-C, associadas ainda à

presença de inibidores nas fezes, pode determinar resultados falso-negativos (KUZUYA

et al., 1996; XU et al., 1990).

A RT-PCR é uma técnica altamente sensível para a detecção de genes do RV-C.

A RT-PCR não exige a viabilidade da partícula viral, pois a análise é feita pela

amplificação de partes do genoma, minimizando os problemas ocasionados por falhas

na conservação das amostras fecais que diminuem a infectividade ou promovem a

degradação das proteínas virais. Adicionalmente, resultados conclusivos podem ser

obtidos em poucas horas. Por outro lado, substâncias inibidoras encontradas nas fezes

podem alterar a eficiência da RT-PCR. Porém, métodos eficazes de extração do RNA e

o uso de controles internos na reação da PCR podem contornar esse inconveniente. A

RT-PCR tem demonstrado ser um método altamente sensível e específico na detecção

do RV-C de diferentes origens, utilizando para isso oligonucleotídeos iniciadores

específicos do grupo C, principalmente com base no gene que codifica a proteína VP6.

Mesmo apresentando alta sensibilidade e especificidade, o método tem sido utilizado

apenas em alguns estudos (CAUL et al., 1990; QIAN et al., 1991; GOUVEA et al.,

1991; JIANG et al., 1995; KUZUYA et al., 2005; BÁNYAI et al., 2006; IIZUKA et al.,

2006; STEYER et al., 2006; KUZUYA et al., 2007; ESONA et al., 2008; MEDICI et

al., 2010).

A RT-PCR tem contribuído ainda para otimizar o diagnóstico das rotaviroses,

possibilitando estimar a prevalência das infecções, bem como a definição dos

34

sorotipos/genotipos de RV circulantes em uma população ou rebanho, além de sua

distribuição geográfica e sazonal (DESSELBERGER et al., 2001).

Paralelamente, a RT-PCR tem demonstrado ser uma técnica eficiente na

identificação de estirpes virais com genotipos incomuns e também de infecções mistas,

com estirpes de RV pertencentes a diferentes genotipos (HEIDE et al., 2005).

Profilaxia e controle

Algumas características do RV como a resistência da partícula viral às condições

ambientais e aos produtos químicos como os desinfetantes; a possibilidade de infecções

subclínicas; assim como da transmissão interespécie, fazem com que os episódios de

diarreia causados pelo RV-C apresentem particularidades não encontradas em outras

infecções entéricas ocasionadas por bactérias ou protozoários, ou mesmo por RV de

outros grupos. Consequentemente, a profilaxia das rotaviroses não se restringe apenas

na adoção de medidas higiênico-sanitárias, pois o RV-C pode ser responsável por surtos

de diarreia com impacto em saúde pública e em sanidade animal mesmo em países

desenvolvidos e/ou em criações com manejo zootécnico e sanitário adequados

(MARTELLA et al., 2007; COLLINS et al., 2008; JEONG et al., 2009).

De modo geral, assim como outras medidas profiláticas, a vacinação de fêmeas

no terço final da gestação é uma das principais condutas a serem implantadas no

desenvolvimento de um programa sanitário que inclui o controle e profilaxia da diarreia

de leitões lactentes. Devido a prevalência estatisticamente superior das diarreias pelo

RV-A, em relação às ocasionadas por RV-B e/ou RV-C, somente são disponíveis no

mercado vacinas contra o RV-A. Resultados satisfatórios, com redução tanto na

frequência quanto na intensidade de diarreia, têm sido observados quando programas

imunoprofiláticos utilizando vacinas polivalentes são incluídos no manejo sanitário de

35

fêmeas bovinas gestantes. O sucesso do emprego da vacinação é amplamente observado

e estabelecido na saúde pública, visto que estas vacinas apresentam 74% de eficácia,

sendo responsáveis por redução nas taxas de morbidade e mortalidade de crianças em

países em desenvolvimento (MUNOS et al., 2010).

Considerando que: i) além do grupo A, os grupos B e C de RV também

contribuem com episódios de diarreias em leitões lactentes e recém-desmamados; ii) as

infecções pelos grupos B e C de RV podem ocorrer tanto de forma singular quanto,

principalmente, de forma mista; iii) a não disponibilidade de imunógenos para o

controle e profilaxia das rotaviroses ocasionadas pelos RV-B e RV-C; iv) a não

disponibilidade de técnicas de diagnóstico com sensibilidade e especificidade adequadas

para o uso na rotina laboratorial para RV-B e RV-C; v) o desconhecimento da

epidemiologia da rotavirose suína ocasionadas por RV-B e RV-C; vi) a alta frequência

de ocorrência de diarreias em leitões lactentes em todo o Brasil, e vii) o impacto

sanitário das diarreias neonatais na suinocultura brasileira; a avaliação da frequência de

diagnóstico do RV-A, B e C, tanto em infecções singulares quanto mistas, em episódios

de diarreias em leitões lactantes é de fundamental importância para a definição tanto do

impacto da infecção na produção de leitões quanto para a definição dos principais

aspectos epidemiológicos da infecção.

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48

2. OBJETIVOS

49

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Realizar análises filogenéticas no gene VP6 de estirpes de PoRV-C

identificadas em rebanhos suinícolas de cinco estados brasileiros e

caracterizar os tipos de rotavírus envolvidos em um surto de diarreia

neonatal em leitões lactentes de um rebanho vacinado.

2.2. Objetivos específicos

Realizar análises filogenéticas do gene VP6 para a determinação da

epidemiologia molecular da rotavirose ocasionada pelo PoRV-C;

Identificar o PoRV-A (genes VP7 e VP4), PoRV-B (gene NSP2) e PoRV-C

(gene VP6) a partir de amostras de fezes diarreicas de leitões lactentes

obtidas em um surto de diarreia neonatal identificado em um rebanho

regularmente vacinado contra o PoRV-A;

Realizar análises filogenéticas para a caracterização dos genotipos G (VP7) e

P (VP4) de PoRV-A identificados no surto de diarreia em leitões lactentes.

50

3. ARTIGOS PARA PUBLICAÇÃO

51

3.1. VP6 GENE HETEROGENEITY OF GROUP C PORCINE

ROTAVIRUS TRAINS.

52

VP6 gene heterogeneity of group C porcine rotavirus strains.

Abstract

Porcine rotaviruses (PoRV) are reported as the main etiological agents in piglet

diarrhea throughout the world. Rotavirus group C (RV-C) is distinguished from other

rotavirus groups essentially by the features of VP6 protein, constituting a frequent target

of diagnostic assays and molecular heterogeneity analysis of RV-C. Overall, due to the

low number of investigation of PoRV-C, several questions remained unanswered with

regard to their epidemiological features and their genetic heterogeneity. The aim of this

study was to carry out the phylogenetic analysis of VP6 gene of Brazilian PoRV-C field

strains. Fifteen (15) wild-type PoRV-C strains identified in diarrheic fecal samples of

piglets ranging from 1 to 4 weeks old, collected between 2004 and 2010 from 12

different pig farms located in five Brazilian states were included in this study. The

genetic diversity of PoRV-C strains was investigated by sequencing of VP6 gene

amplicons with 1.353-bp length amplified by RT-PCR assay. The VP6 gene nucleotide

sequences shares 82.5% to 100% identity among Brazilian PoRV-C strains. Comparing

with other PoRV-C strains described, the Brazilian strains revealed nucleotide identity

rates of 80.4% to 93.0%, characterizing a high heterogeneity rate. The Brazilian wild-

type PoRV-C strains were classified in three distinct and well definide Porcine lineage

clusters and were detected in different pig herds at different time periods. These results

suggest that the variability of wild-type strains occur frequently and that divergent

strains are widely spread, circulating at the same time in Brazilian pig herds. The

present study describes a genetic variability in Brazilian PoRV-C strains, increasing the

possibility that there is a considerable variation in gene 5, a supposedly more conserved

gene. These find contrasts with the hypothesis that only RV strains from group A have

high genetic variability. Therefore, more in-depth epidemiological and molecular

analysis of PoRV-C throughout the country and the world will be needed to understand

their diversity as well as to develop classification schemes and specific control

measures.

Key-words: Swine, rotaviruses, VP6 protein, phylogeny.

53

INTRODUCTION

Rotaviruses are the major etiologic agents of severe, acute dehydrating diarrhea

in young animals and children (ALFIERI et al., 1999a; TAMEHIRO et al., 2003;

ALFIERI et al., 2004; ELSCHNER et al., 2005; BARMAN et al., 2006). The viruses

belong to the family Reoviridae, are triple-layered concentric capsid proteins and

contain a genome consisting of 11 segments of double-stranded RNA (dsRNA). The

middle layer capsid protein VP6 exposes group specific antigens whose characteristics

classifies rotaviruses into seven serogroups (A to G) on the basis of distinct antigenicity.

Groups A, B, and C rotaviruses are associated with acute gastroenteritis in humans and

animals while groups D, E, F, and G have been detected only in animals (SNODGRASS

et al., 1984; ESTES; KAPIKIAN, 2007).

Group C rotaviruses (RV-C) were first described in a diarrheic stool sample

from a piglet in 1980 (SAIF et al., 1980). Fecal shedding of porcine group C rotavirus

(PoRV-C) has been reported in weaning and post-weaning pigs with diarrhea either

alone or in mixed infection with other enteric pathogens (SAIF et al., 1980; MORIN et

al., 1990; SAIF and JIANG, 1994; KIM et al., 1999; MARTELLA et al., 2007).

A previous study reported 59 to 100% seroprevalence of RV-C infection in pigs

of all ages, with the antibody titer being higher in older pigs (TERRETT et al., 1987).

Molecular and serologic studies have indicated that the virus is circulating worldwide,

being an emerging pathogen (TSUNEMITSU et al., 1992; BÁNYAI et al., 2006;

IIZUKA et al., 2006; MÉDICI et al., 2010). To date, a high incidence of PoRV-C

infections in Brazilian pig herds has been described, however detection rates for RV-C

diverged more than 50% when compared reverse transcription-polymerase chain

reaction (RT-PCR) to silver stained-polyacrylamide gel electrophoresis (ss-PAGE); the

54

results showed that molecular methods are an essential tool to determine the

epidemiological role of these viruses in animal infections (ALFIERI et al., 1999b;

MÉDICI et al., 2011).

The major capsid protein of rotaviruses, VP6, is highly antigenic and

immunogenic. It is well documented that VP6 is the major structural component of

virions, accounting for approximately 51% by weight of the RV-A, and plays a key role

in virion structure by interacting with both the outer capsid proteins VP4 and VP7 and

the core protein VP2 (ESTES; KAPIKIAN, 2007). Group-antigen epitopes are detected

predominantly on VP6 in each rotavirus group (ESTES; KAPIKIAN, 2007). Antigenic

relationships correspond to the similarity in VP6 polypeptide sequences, with >87%

amino acid identity within mammalian RV-A (TANG et al., 1997).

Since RV-C is distinguished from other rotavirus groups essentially by the

features of VP6, this protein constitutes a frequent target of diagnostic assays and

molecular heterogeneity analysis of RV-C. Overall, due to the low number of

investigation of PoRV-C, several questions remained unanswered with regard to their

epidemiological features and their genetic heterogeneity.

In addition, a possible zoonotic role of animal RV-C has been postulated based

on increase seroprevalence rates to RV-C in human populations living in rural settings

(ITURRIZA-GÓMARRA et al., 2004). Direct evidence for the zoonotic potential of

PoRV-C has been gained by analysis of archival fecal samples of Brazilian children

(GABBAY et al., 2008). Furthermore, RV-C surveillance has detected interspecies

transmission between animal species; bovine strain WD534tc is actually considered a

porcine strain (CHANG et al., 1999). Therefore, the detection of animal-like RV-C in

humans has showed the potential zoonotic impact of animal RV-C for humans,

highlighting the need for a more in-depth study of the epidemiology of animal RV-C.

55

The complete molecular analysis of VP6 gene of the PoRV-C has only been

carried out in the United States (JIANG et al., 2000), Ireland (COLLINS et al., 2008)

and South Korea (JEONG et al., 2009); and partial molecular analysis carried out in

Italy (MARTELLA et al., 2007) and Brazil (MÉDICI et al., 2010). Therefore, it is

unclear if the PoRV-C circulating in other countries has distinct genetic characteristics.

Molecular comparison suggests that there is significant genetic diversity among the

PoRV-C circulating in Brazil and other countries. Due to the low number of

phylogenetic studies among PoRV-C strains, which may hide important features of

PoRV-C genetic characteristics; the aim of this study was to carry out the phylogenetic

analysis of VP6 gene of Brazilian PoRV-C field strains.

MATERIALS AND METHODS

Stool samples collection and inclusion criteria

The sampling was part of a stool sample collection (n = 588) consisted by

diarrheic and pasty feces of piglets ranging from 1 to 4 weeks old, collected between

2004 and 2010. The identification of potentially positive PoRV-C fecal samples, as a

screening method, was carried out by ss-PAGE technique according Herring et al

(1982) and Pereira et al (1983). Inconclusive ss-PAGE results, as low intensity or extra

bands (dsRNA segments) and samples with undefined or type C electropherotype were

included in the sampling to evaluate the presence of PoRV-C by RT-PCR assay

according to Alfieri et al. (1999). Thirty two fecal samples had showed type C or

inconclusive electropherotype, which 15 diarrheic fecal samples were positive to RV-C

detection by RT-PCR. The samples were obtained from 12 different pig herds from five

Brazilian states and three geographical regions. All pig farms, in a multi-site production

56

system, had a good nutritional and health management practices including all-in, all out

management (Table 1).

Table 1. Brazilian PoRV-C wild-type strains with VP6 gene sequences performed in the study, their

origin and year collected.

Strain Origin Year Region State County

BRA189/04-Po Central-West Mato Grosso do Sul São Gabriel do Oeste 2004

BRA258/04-Po South Rio Grande do Sul Gaurama 2004

BRA499/04-Po Rio Grande do Sul Três Passos 2004

BRA662/05-Po Rio Grande do Sul Santa Rosa 2005

BRA889/07-Po Santa Catarina Concórdia 2007



BRA634/05-Po Paraná Catanduvas 2005

BRA36/08-Po Paraná Cascavel 2008

BRA01/10-Po Paraná Itaipulândia 2010

BRA61/10-Po Paraná Itaipulândia 2010

BRA1014/10-Po South-East Minas Gerais Urucânia 2010

BRA1208/10-Po Minas Gerais Belo Horizonte 2010

BRA1033/10-Po Minas Gerais Oratórios 2010

BRA1034/10-Po Minas Gerais Oratórios 2010

RNA extraction and rotavirus detection

The dsRNA extraction was performed with a combination of the

phenol/chloroform/isoamyl alcohol (SAMBROOK; RUSSEL, 2001) silica/guanidinium

isothiocyanate (BOOM et al., 1990) methods as described by Alfieri et al. (2006). RT-

PCR and semi nested-PCR (SN-PCR) assays were performed with different

oligonucleotide primer sets for porcine rotavirus group A (GOUVEA et al., 1990;

57

GOUVEA et al., 1991; GENTSCH et al., 1992), group B (DAS et al., 1994), and group

C detection (ALFIERI et al., 1999). The amplification products were analyzed by 2%

agarose gel electrophoresis and visualized under UV light after ethidium-bromide

staining.

VP6 gene amplification, purification and sequencing.

The RT-PCR assay was performed using a modification of the BMJ41 forward

(5’ GGC TTT AAA AAT CTC ATT CAC AA 3’, [nt] 1-23) primer described by Alfieri

et al. (1999); and a reverse (5’ AGC CAC ATA GTT CAC ATT TCA 3’ [nt] 1333-

1353) primer (BÁNYAI et al., 2006). Electrophoresis analysis was carried out using an

ethidium bromide-stained 1% agarose gel that was visualized under UV light. The

samples were positive for RV-C in RT-PCR assay by amplifying a total of 1.353-bp

PCR product of gene 5 (VP6). The PCR products were purified using the GFXTM PCR

DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare UK Ltd, Little Chalfont,

Buckinghamshire, UK), quantified in a QubitTM Fluorometer (Invitrogen Life

Technologies, Carlsbad, California, USA) and sequenced in a MegaBACETM

1000/Automated 96 Capillary DNA Sequencer (GE Healthcare UK Ltd, Little Chalfont,

Buckinghamshire, UK) with Thermo Sequenase™ II DNA Polymerase and the

DYEnamic™ ET Dye Terminator Kit (GE Healthcare UK Ltd, Little Chalfont,

Buckinghamshire, UK). The amplicons were sequenced directly using forward and

reverse primers.

58

Sequence analysis

Sequence quality analysis was carried out using Phred and CAP3 softwares

(http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/). Sequence similarity searches were

performed using the BLASTn software (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), and multiple

alignment and identity matrix analysis were performed using BioEdit version 7.0.9.0

(HALL, 1999) and ClustalW softwares. Nucleotide distance and phylogenetic analysis

were performed with MEGA software version 5 (TAMURA et al., 2011). The analyses

were based on the neighbor-joining method from the model Tamura-Nei and pairwise

distance calculation (TAMURA; NEI, 1993). Bootstrapping was statistically supported

with 1,000 replicates. The referenced sequences included in the study were acquired

from the National Center for Biotechnology Information, USA (GenBank)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/) (Table 2).

59

Table 2. GenBank accession numbers of the VP6 genes of the Brazilian PoRV-C strains,

reference RV-C strains and out group strains used in phylogenetic and sequence analysis.

Strains Origin Accession

Numbers

Strains Origin Accession

numbers

BRA36/08-Po Porcine JF810441 06-146-2 Porcine FJ494692

BRA189/04-Po Porcine JF810442 06-92-1 Porcine FJ494690

BRA258/04-Po Porcine JF810443 CA-2 Porcine GQ925781

BRA499/04-Po Porcine JF810444 Cowden Porcine M94157

BRA634/05-Po Porcine JF810445 WD534tc Porcine AF162434

BRA662/05-Po Porcine JF810446 Shintoku Bovine M88768

BRA889/07-Po Porcine JF810447 Yamagata Bovine AB108680

BRA904/07-Po Porcine JF810448 Belem Human M94155

BRA905/07-Po Porcine JF810449 Bristol Human X59843

BRA1014/10-Po Porcine JF810450 Moduganari Human AF325806

BRA1208/10-Po Porcine JF810451 Preston Human M94156

BRA01/10-Po Porcine JF810452 CMP12/03 Porcine RV-A EU372798

BRA61/10-Po Porcine JF810453 KJ9-1 Bovine RV-A HM988974

BRA1033/10-Po Porcine JF810454 PA169 Human RV-A EF554130

BRA1034/10-Po Porcine JF810455 RUBV282 Bovine RV-B GQ358715

WH-1 Human RV-B AY539858

RESULTS

In previous PoRV analysis among the fecal samples, 4 (26.6%) out of 15 PoRV-

C positive fecal samples tested positive for consensual VP4 and/or VP7 PoRV-A genes.

No PoRV-B infection was found in all RT-PCR followed by SN-PCR examined fecal

samples.

An amplicon with 1,353-bp length of the PoRV-C VP6 gene was amplified by

RT-PCR assay in all the 15 fecal samples included in this study. The alignments of the

60

sequenced product indicated that the Brazilian PoRV-C wild-type strains exclusively

belonged to the porcine lineages. The BLAST search showed that all 15 sequences had

high similarity to published RV-C VP6 gene sequences.

In the phylogenetic reconstruction, five distinct clusters were formed among

RV-C strains, designated as Porcine I, Porcine II, Porcine III, Human, and Bovine

(Figure 1). The Porcine I cluster also spread into two subclusters where the

BRA1208/10-Po, BRA1014/10-Po, BRA1033/10-Po, and BRA1034/10-Po sequences

were grouped segregated from the Cowden and WD534tc subcluster, which

BRA189/04-Po, a Cowden-like strain, was included. The Porcine II cluster included

four subclusters where the BRA258/04-Po, BRA634/05-Po, and BRA01/10-Po

followed by BRA36/08-Po and BRA662/05-Po; and finally BRA499/04-Po sequences

were grouped in distinct subclusters segregated from the CA-2 strain subcluster. The

PoRV-C Brazilian strains BRA889/07-Po, BRA904/07-Po, and BRA905/07-Po formed

one subcluster of Porcine III cluster, which also was formed by a unique BRA61/10-Po

strain subcluster segregated from Korean PoRV-C 06-146-2 and 06-92-1 strains. The

Human and Bovine clusters included exclusively RV-C strains of human and bovine

origin. All Brazilian PoRV-C and references strains were clustered segregated from the

out group strains composed by human, bovine, and porcine RV-A strains (Figure 2).

61

Figure 1. Neighbor-Joining (Tamura-Nei model) tree based on complete sequences of

VP6 gene of 15 Brazilian PoRV-C wild-type strains (●) described in this study and

eight reference strains acquired from GenBank with complete RV-C VP6 sequences.

The names of RV-C strains and GenBank accession numbers are listed in Table 2. The

scale bar is proportional with the phylogenetic distance.

BR

A258

/04-

Po

BRA6

34/0

5-Po

18

BRA01/10-Po

24

BRA499/04-Po

32

CA2-Po 46

BRA36/08-Po

BRA662/05-Po

99100

06-92-1-Po

06-146-2-Po

BRA61/10-Po

BRA904/07-Po

BRA889/07-Po BRA905/07-Po

32100

100

56100

98

Cow

den-

Po

WD534tc-Bo

100

BRA189/04-Po

97

BRA1208/10-Po

BRA1014/10-Po

BRA1033/10-Po

BRA1034/10-Po

100

100

100

100

91

Shintoku-Bo

Yamagata-Bo

100

Belem-HuModuganari-H

u

87

Preston-Hu

Bristol-Hu

9910

0

0.02

Porcine II

Porcine I

Porcine III

Human

Bovine

62

Figure 2. Phylogenetic tree of the VP6 gene of the Brazilian PoRV-C strains showing

its genetic relationship with other RV-C strains. RV-A srains CMP12/03 (Porcine),

KJ9-1 (Bovine) and PA169 (Human); and RV-B strains RUBV282 (Bovine) and WH-1

BRA258/04-Po

BRA634/05-Po

BRA01/10-Po

BRA499/04-Po

CA2-Po

BRA36/08-Po

BRA662/05-Po

06-92-1-Po

06-146-2-Po

BRA61/10-Po

BRA904/07-Po

BRA889/07-Po

BRA905/07-Po

Shintoku-Bo

Yamagata-Bo

Belem-Hu

Moduganari-Hu

Preston-Hu

Bristol-Hu

Cowden-Po

WD534tc-Bo

BRA189/04-Po

BRA1208/10-Po

BRA1014/10-Po

BRA1033/10-Po

BRA1034/10-Po

CMP12/03-Po

KJ9-1-Bo

PA169-Hu

RUBV282-Bo

WH-1-Hu100

100100

100

99

78

100

100

100

100

100

99

100

94

97

62

99

7377

39

52 89

90

59

28

1914

0.1

Porcine II

Porcine I

Porcine III

Bovine

Human

RV-A

RV-B

63

(Human), were used as out-groups. The shape markers of Brazilian PoRV-C are

according to the pig herds State location (Mato Grosso do Sul [▼], Minas Gerais [■],

Paraná [▲], Rio Grande do Sul [●] and Santa Catarina [♦]).The names, original hosts

and GenBank accession numbers of RV-A, B and C strains are listed in Table 2. The

number adjacent to the node represents the bootstrap value. Scale bar shows genetic

distance expressed as nucleotide substitutions per site.

The nucleotide distances among Brazilian PoRV-C strains ranged from 0.0 to

16.83%, and between Brazilian PoRV-C and reference RV-C and RV-A strains ranged

from 6.92 to 19.24% and 45.01 to 47.83%, respectively (Table 3). Among the PoRV-C

strains grouped in Porcine I cluster, Brazilian PoRV-C strains BRA1208/10-Po and

BRA189/04-Po showed a high and low nucleotide distance rates, when compared with

the PoRV-C Cowden and WD534tc strains, respectively. Nucleotide distance rates of

Porcine I cluster strains are showed in Table 4. Brazilian PoRV-C strains grouped in

Porcine II cluster were compared to Korean PoRV-C CA-2 strain, revealing a high

nucleotide distance, showed in Table 5. Analysis of Porcine III clustered strains showed

a lower nucleotide distances, compared to other intra-clusters distances analysis (Table

6). Mean group distances of porcine clusters are showed in Table 7. Genetic distances

were variable among the Brazilian PoRV-C strains and between Brazilian and other

known PoRV strains (Table 8).

64

Table 3. Estimates of evolutionary divergence between the Brazilian PoRV-C and out-group RV-A reference strains. The numbers of base

differences per site between sequences are shown. Strain

BRA36 /08-Po

BRA189 /04-Po

BRA258 /04-Po

BRA499 /04-Po

BRA634 /05-Po

BRA662 /05-Po

BRA889 /07-Po

BRA904 /07-Po

BRA905 /07-Po

BRA1014 /10-Po

BRA1208 /10-Po

BRA01 /10-Po

BRA61 /10-Po

BRA1033 /10-Po

BRA1034 /10-Po

CMP12/03 KJ9-1 PA169

BRA36/08-Po - - - - - - - - - - - - - - - - - -

BRA189/04-Po 0,1590 - - - - - - - - - - - - - - - - -

BRA258/04-Po 0,1004 0,1558 - - - - - - - - - - - - - - - -

BRA499/04-Po 0,0988 0,1598 0,0876 - - - - - - - - - - - - - - -

BRA634/05-Po 0,0940 0,1526 0,0819 0,0948 - - - - - - - - - - - - - -

BRA662/05-Po 0,0755 0,1647 0,0980 0,1020 0,0948 - - - - - - - - - - - - -

BRA889/07-Po 0,1365 0,1430 0,1430 0,1510 0,1470 0,1470 - - - - - - - - - - - -

BRA904/07-Po 0,1365 0,1430 0,1430 0,1510 0,1470 0,1470 0,0000 - - - - - - - - - - -

BRA905/07-Po 0,1365 0,1430 0,1430 0,1510 0,1470 0,1470 0,0000 0,0000 - - - - - - - - - -

BRA1014/10-Po 0,1590 0,0948 0,1518 0,1614 0,1478 0,1582 0,1631 0,1631 0,1631 - - - - - - - - -

BRA1208/10-Po 0,1663 0,1044 0,1558 0,1687 0,1550 0,1687 0,1526 0,1526 0,1526 0,0691 - - - - - - - -

BRA01/10-Po 0,1084 0,1679 0,0859 0,0964 0,0940 0,1076 0,1494 0,1494 0,1494 0,1639 0,1590 - - - - - - -

BRA61/10-Po 0,1309 0,1510 0,1438 0,1478 0,1454 0,1454 0,0442 0,0442 0,0442 0,1606 0,1542 0,1462 - - - - - -

BRA1033/10-Po 0,1631 0,0956 0,1566 0,1663 0,1526 0,1655 0,1622 0,1622 0,1622 0,0361 0,0691 0,1687 0,1558 - - - - -

BRA1034/10-Po 0,1622 0,0948 0,1558 0,1655 0,1518 0,1647 0,1614 0,1614 0,1614 0,0353 0,0683 0,1679 0,1550 0,0008 - - - -

CMP12/03 0,4627 0,4578 0,4659 0,4715 0,4618 0,4707 0,4659 0,4659 0,4659 0,4627 0,4659 0,4691 0,4667 0,4546 0,4538 - - -

KJ9-1 0,4643 0,4594 0,4715 0,4675 0,4683 0,4771 0,4514 0,4514 0,4514 0,4618 0,4691 0,4747 0,4498 0,4635 0,4627 0,2080 - - PA169

0,4643 0,4578 0,4707 0,4699 0,4651 0,4763 0,4506 0,4506 0,4506 0,4554 0,4627 0,4755 0,4490 0,4554 0,4546 0,2112 0,0209 -

65

Table 4. Estimates of evolutionary divergence between Porcine I clustered strains. The numbers of base differences per site between PoRV-C

sequences are shown.

Strain BRA189/04-Po BRA1014/10-Po BRA1208/10-Po BRA1033/10-Po BRA1034/10-Po Cowden-Po WD534tc-Bo

BRA189/04-Po - - - - - - -

BRA1014/10-Po 0.1051 - - - - - -

BRA1208/10-Po 0.1145 0.0733 - - - - -

BRA1033/10-Po 0.1062 0.0380 0.0735 - - - -

BRA1034/10-Po 0.1052 0.0371 0.0725 0.0008 - - -

Cowden-Po 0.0744 0.0987 0.1041 0.0986 0.0977 - -

WD534tc-Bo 0.0879 0.1127 0.1150 0.1095 0.1085 0.0146 -

66

Table 5. Estimates of evolutionary divergence between Porcine II clustered strains. The numbers of base differences per site between PoRV-C

sequences are shown.

Strain BRA36/08-Po BRA258/04-Po BRA499/04-Po BRA634/05-Po BRA662/05-Po BRA01/10-Po CA2-Po

BRA36/08-Po - - - - - - -

BRA258/04-Po 0.1112 - - - - - -

BRA499/04-Po 0.1088 0.0954 - - - - -

BRA634/05-Po 0.1031 0.0887 0.1036 - - - -

BRA662/05-Po 0.0822 0.1082 0.1127 0.1040 - - -

BRA01/10-Po 0.1207 0.0934 0.1055 0.1025 0.1197 - -

CA2-Po 0.1167 0.0952 0.1052 0.1104 0.1140 0.1136 -

67

Table 6. Estimates of evolutionary divergence between Porcine III clustered strains. The numbers of base differences per

site between PoRV-C sequences are shown.

Strain BRA889/07-Po BRA904/07-Po BRA905/07-Po BRA61/10-Po 06-146-2-Po 06-92-1-Po

BRA889/07-Po - - - - - -

BRA904/07-Po 0,0000 - - - - -

BRA905/07-Po 0,0000 0,0000 - - - -

BRA61/10-Po 0,0466 0,0466 0,0466 - - -

06-146-2-Po 0,0845 0,0845 0,0845 0,0857 - -

06-92-1-Po 0,0955 0,0955 0,0955 0,0974 0,0777 -

68

Table 7. Estimates of evolutionary divergence between Porcine I, Porcine II,

Porcine III, Bovine and Human clusters. The numbers of base differences per

site between PoRV-C sequences are shown.

Strain Porcine I Porcine II Porcine III Bovine Human

Porcine I - - - - -

Porcine II 0.0883 - - - -

Porcine III 0.1033 0.0781 - - -

Bovine 0.1651 0.1517 0.1692 - -

Human 0.1498 0.1489 0.1645 0.1967 -

Table 8. Nucleotide (nt) and deduced amino acid (aa) sequence comparison of the

VP6 of the Brazilian PoRV-C strains with that of the other strains.

Strain Origin % similarity with 15 Brazilian strainsa

Nt aa

06-146-2 Porcine 83.5 - 92.2 83.5 - 97.3

06-92-1 Porcine 83.5 - 91.2 83.0 - 97.3

CA-2 Porcine 83.0 - 91.0 86.7 - 96.6

Cowden Porcine 84.2 - 93.0 83.0 - 98.6

WD534tc Bovine 82.9 - 91.6 79.4 - 94.0

Shintoku Bovine 80.4 - 82.4 80.9 - 90.6

Yamagata Bovine 80.4 - 82.2 80.9 - 91.1

Belem Human 80.6 - 82.3 80.9 - 91.1

Bristol Human 81.0 - 82.9 80.9 - 91.1

Moduganari Human 80.6 - 82.2 80.4 - 90.6

Preston Human 81.0 - 83.0 80.9 - 91.1 a The classification of Brazilian RV-C strains into 15 and 1 is based on the phylogenetic data in which

they clustered on the separate branches (Fig. 1). The nucleotide and deduced amino acid sequence

identities of VP6 among the Brazilian 15 strains were 82.5–100 and 80.4–100%, respectively.

69

DISCUSSION

RV-C has already been described as a cause of outbreaks either in weaning, post-

weaning and older pigs, in some cases leading to substantial mortality rates (TERRETT et al.,

1987; SAIF; JIANG, 1994; MARTELLA et al., 2007). In spite of these data, epidemiologic

characterization of RV-C infection is very limited. The molecular characterization of RV-C

strains is still not extensively performed, which restricts the study of these circulating strains

and may interfere on success of specific control measures implementation to RV-C in the

future.

The analysis performed in the present study was based on the complete sequence of

gene 5. In contrast to previous descriptions from Italy (MARTELLA et al., 2007) and Brazil

(MÉDICI et al., 2010), this study included the complete sequence of the gene which allows us

to compare the Brazilian with other RV-C available sequences. The molecular analyses of 15

complete VP6 gene sequences from PoRV-C wild-type strains revealed that Brazilian strains

were ranged in three clusters, revealing different characteristics regarding low or high PoRV-

C Cowden strain identity. The Brazilian strains BRA189/04-Po, BRA1014/10-Po,

BRA1208/10-Po, BRA1014/10-Po, BRA1033/10 and BRA1034/10-Po that were grouped

with the Cowden strain in the dendrogram, did not display such high variability; identity with

the prototype ranged from 89.1 to 93.0%. Recently, a comparison including Cowden and

Italian PoRV-C strains reveals a genetic heterogeneity, with nucleotide identity diverging in

almost 12% (MARTELLA et al., 2007). Some Brazilian PoRV-C strains analyzed in the

present study, considering the low PoRV-C Cowden strain identity with differences rates of

14.0 to 15.8%, the PoRV-C strains were grouped with Korean PoRV-C strains.

In this study, genetically variable PoRV-C strains were related with bovine and human

RV-C, which determines a lower identity with a variable similarity rates (80.4 to 83.0%).

70

Analysis of the complete VP6 gene of the 15 PoRV-C strains showed that they share low

nucleotide and deduced amino acid sequence identities with human RV-C, consistent with a

previous report (MARTELLA et al., 2007). This result indicates that the Brazilian PoRV-C

belong to others different genetic RV-C clusters. According to the phylogenetic analysis of

RV-C VP6 gene between Brazilian and other known PoRV-C strains, the analysis also

revealed two clusters consisting one with the Korean CA-2 PoRV-C strain, and other with

Korean 06-146-2 and 06-92-1 PoRV-C strains. However, genetic distances were variable

among the Brazilian PoRV-C strains (82.5 to 100% nucleotide and 80.4 to 100% deduced

amino acid identities) and between Brazilian and other known PoRV strains (80.4 to 93.0%

nucleotide and 79.4 to 98.6% deduced amino acid sequence identities) (Table 8). From these

results, it is unclear whether there are different sublineages within the PoRV-C lineage.

Therefore, more in-depth epidemiological analysis of PoRV-C throughout the world will be

needed to understand their diversity and evolution as well as to develop classification

schemes.

Among the Brazilian sequences, the nucleotide identity showed a wide range of values

with a surprising minimum similarity of 82.5% between two sequences. The geographical

genetic divergence of PoRV-C VP6 gene is unclear because the available GenBank sequence

data involve only a few countries. In this study, genetically variable PoRV-C was detected in

specific regions of Brazil and common features that correlated with the geographic origin of

the pig herds (Table 1).

The Brazilian strains BRA258/04-Po, BRA499/04-Po, and BRA662/05-Po were

ranged in Porcine II cluster. The analysis revealed that even from the same State origin, Rio

Grande do Sul, however, from different pig herds; the PoRV-C strains had a variable

similarity rate of 89.2–91.5%. This relationship between the Brazilian PoRV-C heterogeneity

and pig farm State location is dubious when comparing the sequenced strains obtained from

71

diarrheic fecal samples from Parana State. The sequences were analyzed and disposed in

different clusters, as observed in BRA61/10-Po (Porcine III cluster), and BRA36/08-Po,

BRA634/05-Po, and BRA01/10-Po strains (Porcine II cluster). Comparing the nucleotide

similarity rate of 85.1% between the BRA61/10-Po and BRA01/10-Po strains, it showed that

even samples belonging to different pig farms, in the same county (Itaipulândia); carried

heterologous PoRV-C strains. Nevertheless, in comparison between Brazilian PoRV-C

BRA1033/10-Po and BRA1034/10-Po, grouped in Porcine I cluster, this relationship could

not be showed even the strains belonged to the same pig farm.

A 100% nucleotide similarity rate was observed in a subcluster of Porcine III cluster

composed by Brazilian strains BRA889/07-Po, BRA904/07-Po, and BRA905/07-Po. The

strains were obtained from a single outbreak in the city of Concórdia, Santa Catarina State.

Even a period of 45 days between the diarrheic fecal samples, in which BRA889/07-Po and

BRA904/07-Po or BRA905/07-Po strains were analyzed, no nucleotide distances were

showed. In comparison with other Brazilian PoRV-C strains, the nucleotide sequences

similarity ranged from 83.5 to 95.5%, reaffirming that how near the PoRV-C strain origin,

closer and stronger are the genetic relations (MARTELLA et al., 2007). The same relation

could be determined in Porcine I cluster, which all Brazilian PoRV-C strains detected in fecal

samples from herds of Minas Gerais State, showed a variable similarity rate through

themselves (83.2–99.8%), with low rates corresponding to strains obtained from different pig

herds. The cluster also contains a Brazilian PoRV-C strain obtained from a pig herd of Mato

Grosso do Sul State, with a high similarity rate in comparison with porcine Cowden (93.0%)

and bovine WD534tc (91.6%) strains.

The genetic variation presented here, in a gene that is supposedly conserved, opens up

the possibility that RV-C is more variable than previously thought and that there is more than

one porcine genogroup based on VP6 gene classification. These strains were more similar to

72

the porcine strains already described, although their classification in the same lineage is

unanswered. These results may suggest that are new lineages and also new sublineages of

PoRV-C strains.

In the present study, it was shown that the heterogeneity in the VP6 gene from PoRV-

C was higher than expected. Previous studies have indicated that genetic similarity might

occur between strains from different host species, where porcine/bovine and porcine/human

strains demonstrated a high nucleotide similarity (CHANG et al., 1999; GABBAY et al.,

2008). With the description of more RV-C sequences from different host species, the

molecular features of VP6 will be more clearly defined. This description of the genetic

variability in porcine strains increases the possibility that there is considerable variation in

gene 5 of RV-C, supposedly a more conserved gene, which contrasts with the hypothesis that

only RV-A strains have high variability (RAHMAN et al., 2005). Furthermore, divergent

Brazilian PoRV-C strains classified in all Porcine clusters were detected in different pig herds

at different time periods (2004 to 2010), which suggest that the variability of wild-type strains

occurred frequently and that divergent strains, grouped in distinct porcine clusters lineage, are

widely spread, proving the strains are circulating at the same time in Brazilian pig herds.

From these results, it is unclear whether there are different sublineages within the

PoRV-C lineage. Therefore, more in-depth epidemiological and molecular analysis of PoRV-

C throughout the country and world will be needed to understand their diversity and evolution

as well as to develop classification schemes and specific control measures.

REFERENCES

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77

3.2. PORCINE ROTAVIRUS GROUP C (PoRV-C) SINGLE AND MIXED INFECTIONS (PoRV-A, PoRV-B) AS CAUSE OF A PIGLET DIARRHEA

OUTBREAK IN VACCINATED PIG HERD.

78

Porcine rotavirus groups C (PoRV-C) single and mixed infections (PoRV-A, PoRV-B)

as cause of a piglet diarrhea outbreak in vaccinated pig herd.

Abstract

The porcine rotavirus group A (PoRV-A) is the most frequent cause of diarrhea in

suckling and weaned pigs worldwide. However, PoRV groups B and C can also infect pigs

and to cause diarrhea. The aim of this report is to describe a PoRV neonatal diarrhea outbreak

in piglets. A diarrhea outbreak with high morbidity (80%) and mortality (20%) rates occurred

in suckling (21-day-old) piglets of a Brazilian pig herd with good nutritional and health

management. The herd was regularly vaccinated for neonatal diarrhea with commercial

vaccine containing enterotoxigenic Escherichia coli fimbrial antigens (K88, K99, 987P, and

F41) and Clostridium perfringes type C toxoids besides attenuated PoRV-A G5P[7] and

G4P[6] strains. Were collected 16 diarrheic fecal samples for parasitological, bacteriological,

and virological exams. Cryptosporidum spp and Isospora suis oocysts and hemolytic E. coli

were not characterized as the major cause of the diarrhea outbreak. By RT-PCR assays 14

(87.5%) fecal samples were PoRV positives. In 5 (37.5%) fecal samples was identified only a

single PoRV genogroup and in the others 9 (64.3%) samples mixed infections, characterized

by more than one PoRV group, were revealed by RT-PCR assays. The PoRV-C was the RV

group more frequent in single as in mixed infections being identified in 13 (81.2%) fecal

samples. PoRV-A and PoRV-B were identified in 9 (56.2%) and 3 (18.7%) fecal samples,

respectively. The amplicon sequencing analyses confirmed the identity of the amplified

products by RT-PCR assays for the PoRV-A (VP7 and VP4 genes), PoRV-B (NSP2 gene),

and PoRV-C (VP6 gene). The four wild-type PoRV-A strains sequenced in this study were

classified as G4P[6] genotype and presented nucleotide identity of 88.7 to 89.3% with G4P[6]

strain of human origin (P2A serotype) and 79.7 to 80.1% with the Gottfried strain of porcine

origin (P2B serotype). This is the first report of a diarrhea outbreak in suckling piglets in a

regularly vaccinated Brazilian pig herd caused by mixed infections of PoRV-C and PoRV-B

strains of swine origin and a PoRV-A strain with antigenic characteristics (P2A-like) of

human origin.

Key-words: Pig, rotaviruses, diarrhea, diagnosis, RT-PCR, mixed infection.

79

The neonatal diarrhea is the major health problem in suckling piglets wordwide. The

diarrhea is the result of the association of several factors that include infectious agents, the

host immunity, and management procedures (MOXLEY; DUHAMEL, 1999; SAIF, 1999).

The newborn piglets are susceptible to the infection for several classes of microorganisms

such as bacteria (enterotoxigenic Escherichia coli, Clostridium perfringens type C), protozoan

(Cryptosporidium spp and Isospora suis), and virus (rotavirus, coronavirus, calicivirus)

(MORIN et al., 1983; HOLLAND, 1990; JOHNSON et al., 1992; JEONG et al., 2009).

The rotaviruses are considered the main infectious agents involved in diarrhea

outbreaks in suckling and weaned pigs throughout the world (CHANG et al., 1999). The

rotaviruses belongs to the Reoviridae family and is characterized by double-stranded RNA

(dsRNA) with 11 genomic segments and capsid composed by three concentric protein layers.

Based on the main protein (VP6) of the intermediary capsid layer, rotaviruses are classified

into seven (A to G) distinct serologic groups (ESTES; KAPIKIAN, 2007).

The porcine rotavirus group A (PoRV-A) is the more frequent virus involved in

diarrhea outbreak in piglet production units (ALFIERI et al., 2006; PARRA et al., 2008;

LINARES et al., 2009; HALAIHEL et al., 2010). The involvement of porcine rotavirus

groups B and C (PoRV-B and PoRV-C) in weaning and post-weaning diarrhea are

occasionally described (BROWN et al, 1987; TERRETT et al., 1987; SAIF; JIANG, 1994).

The lower frequency of piglet diarrhea reports caused by PoRV-B and PoRV-C could

not be consequence of the low infection rate but of the use of less sensitive diagnosis

techniques. The silver stained-polyacrylamide gel electrophoresis (ss-PAGE) is the most

practical and low cost method used for the rotavirus diagnosis in animal production

wordwide. However, this diagnosis method presents low sensitivity and, frequently, the

PoRV-B and PoRV-C infections are not identified (XU et al., 1990; MÉDICI et al., 2011).

80

The majority of the survey involving the etiological diagnostic of the suckling piglets

diarrhea involves the identification of a single microorganism. Few studies analyze multiple

microorganisms simultaneously in cases of diarrhea in weaning piglets. When these studies

are carried, most of them are cross sectional study and not drive on the objective of the

elucidation of an outbreak (ALFIERI et al., 2006; KATSUDA et al., 2006).

The aim of this report was to describe a diarrhea outbreak in nursing piglets caused by

simultaneous infections involving PoRV-A, B, and C.

The outbreak occurred in a pig farm located in the state of Santa Catarina, Brazilian

South region. The pig farm with 500 sows had a complete cycle, with confinement system

(all-in / all-out) good nutritional and health management practices. The biosafety rules were

strictly applied and evaluated. All of the sows were routinely vaccinated with a triple

commercial vaccine for neonatal diarrhea control that included enterotoxigenic Escherichia

coli fimbrial antigens (K88, K99, 987P, and F41); Clostridium perfringens type C toxoid; and

attenuated PoRV-A genotypes G5P[7] (OSU strain) and G4P[6] (Gottfried strain), according

to manufacturer recommendations. Until then, the occurrence of neonatal diarrhea in this pig

farm was with low frequency and intensity, not constituting a health problem in the herd.

Suddenly, episodes of severe and watery diarrhea increased in number and intensity.

In two weeks the morbidity and mortality rates in suckling piglets reached 80% and 20%,

respectively. The ss-PAGE technique, carried out according to Herring et al. (1982) and

Pereira (1983), in a fecal sampling (n=60) showed positive results with similar

electropherotypes of PoRV-A, B, and C. Many fecal samples present inconclusive results by

ss-PAGE such as extra bands, bands of low intensity and/or in anomalous positions. The

sampling consisted of pooled fecal samples representing one litter in the farrowing unit and

more than 50% were fecal samples with normal consistency. As the sent sampling was not

appropriate and the ss-PAGE technique results were not conclusive and a new fecal sampling

81

was collected 15 days after. The new sampling consisted of 16 diarrheic fecal samples with

watery consistency obtained of just one piglet (21-day-old) per litter. The samples were

collected separately for bacteriological, parasitological, and virological exam and immediately

transported under refrigeration condition.

For the Escherichia coli detection the samples were sown onto sheep red blood and

MacConkey agar, incubated at 37°C overnight. The identification of Cryptosporidium spp

was carried out by Ziehl Neelsen stain (HENRIKSEN; POHLENZ, 1981) and flotation

(SHEATHER, 1923) methods; and concentration of Isospora suis oocysts was determined by

method described by Henriksen and Christensen (1992), modified by Meyer et al. (1999).

The PoRV-A dsRNA detection in 10-20% (w/v) fecal samples suspensions in

Tris/Ca2+ buffer (50 mM Tris-HCl; 10 mM NaCl; 3 mM CaCl2; pH 7.2), was evaluated by

reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. For the RNA extraction was

used a combination of phenol/chloroform/isoamyl alcohol (SAMBROOK; RUSSEL, 2001)

and silica/guanidinium isothiocyanate (BOOM et al., 1990), described by Alfieri et al. (2006).

The identification of PoRV-A VP4 (P) and VP7 (G) genes was carried out by RT-PCR assay

according to Gouvea et al. (1990, 1991) and Gentsch et al. (1992), respectively. The presence

of PoRV-B and PoRV-C in fecal samples was investigated by methods described by Das et al.

(1994) for the NSP2 gene of PoRV-B and Alfieri et al. (1999) for the VP6 gene of PoRV-C.

For the evaluation of amplicons identity, the RT-PCR amplified products were

purified, quantified and sequenced. Phylogenetic and molecular evolutionary analyses were

conducted based on a neighbor-joining method from the model Kimura two-parameter and

pairwise distance calculation.

Escherichia coli strains were isolated from MacConkey and sheep blood agar medium.

However, in all diarrheic fecal samples evaluated, no hemolysis was visualized in the blood

agar. For E. coli strains isolated of diarrheic porcine fecal samples the hemolysin production

82

is an important biological indicator and, as well, serves for diagnosis improvement in spite of

colonies detection and biochemical analysis (MARTINS et al., 2000; VU-KHAC et al., 2004).

Among all 16 diarrheic fecal samples no oocysts of Isospora suis were found, been

considered negative. The results may be explained by the occurring of age resistance to

infection (WORLICZEK et al., 2009). Even with these results, I. suis cannot be neglected as a

main pathogen; however the difficulties of oocysts detection often determine in rarely

attempted investigations (MARTINEAU; DEL CASTILLO, 2000).

A low number of Cryptosporidium spp oocysts were observed in four diarrheic fecal

samples examined and, this low rate of Cryptosporidium infection was not considered the

cause of diarrhea episodes. These results can be explained by the opportunistic infection

behavior of this enteric pathogen among immunodepressive piglets, considered as an agent

determinant of secondary infections (SNODGRASS et al., 1986, GARCIA; LIMA, 1994).

The table 1 shows the distribution of PoRV RNA detection by RT-PCR assay in

porcine diarrheic fecal samples according the infection type (single or mixed). By RT-PCR

and SN-PCR, 14 (87.5%) out of 16 diarrheic fecal samples evaluated were PoRV positives. In

5 (37.5%) fecal samples was identified only a single PoRV antigenic group and in the others 9

(64.3%) samples mixed infections, characterized by more than one PoRV group. The PoRV-C

was de PoRV group more frequent in single as in mixed infections being identified in 13

(81.2%) fecal samples. PoRV-A and PoRV-B were identified in 9 (56.2%) and 3 (18.7%)

fecal samples, respectively.

83

Table 1. Groups of porcine rotavirus (PoRV) identified by RT-PCR assay in a diarrhea outbreak in weaning piglets from Santa Catarina State, 2006.

Infection PoRV group detected Nº of samples (%)

Single A 1 (6.2)

B

C 4 (25.0)

Mixed A + B

A + C 6 (37.5)

B + C 1 (6.2)

A + B + C 2 (12.5)

Negative NA 2 (12.5)

Total 16 NA – not applicable

All the sows of the herd were regularly vaccinated against neonatal diarrhea with

commercial vaccine according manufacter’s instructions. The four wild-type PoRV-A isolated

in the porcine diarrhea outbreak sequenced in this study were classified as G4P[6] genotype.

This initial results indicated vaccinal fails once the vaccine used in the herd contemplates this

genotype of PoRV-A in your composition. However, the phylogenetic analysis revealed that

the G4P[6] genotype identified in the outbreak presented nucleotide identity of 88.7 to 89.3%

with G4P[6] strain of human origin (serotype P2A) and 79.7 to 80.1% with the Gottfried

strain of porcine origin (serotype P2B).

The emergence of a different PoRV-A genotype or new genetic variants of a specific

genotype or still the re-emergence of some genotypes that were previously controlled by

vaccine can occur or spread in the population in appropriate conditions (MATTHIJNSSENS

et al., 2009). The PoRV-A diarrhea outbreak in an regularly vaccinated pig herd, described in

84

this study, provides evidence of the appearance of the P[6] genotype with characteristics of

human strains (serotype P2A-like) in suckling piglets. This find suggests that the PoRV-A

vaccine strain (genotype G4P[6], serotype P2B, Gottfried strain) did not induce heterologous

immunity for the PoRV-A genotype G4P[6], serotype P2A-like, identified in this diarrhea

outbreak.

There are many studies that related the interspecies transmission and genetic

reassortment of RV-A P[6] genotype involving human and pigs, where strains detected in

human host can have porcine origin (MASCARENHAS et al., 2006; MASCARENHAS et al.,

2007ab; MARTELLA et al., 2008; BÁNYAI et al., 2009b; STUPKA et al., 2009) or where

porcine strains can have human origin (TEODOROFF et al., 2005; MARTELLA et al.,

2006). However, in the best knowledge of the authors, this is the first report of the diarrhea

outbreak in piglets caused by PoRV-A G4P[6] (serotype P2A-like) in a vaccinated pig herd.

The identification of enteric pathogens in the neonatal diarrhea in pig farms have been

conducted worldwide. However, the majority of the surveys evaluate only one pathogen

resulting in insufficient information about the frequency and severity of the diarrhea outbreak

caused by the concomitant infections with multiple enteropathogens (ALFIERI et al., 2006;

KATSUDA et al., 2006; JEONG et al., 2009). In addition, investigations concerning on

multiple infections in porcine enteritis were reported more than 10 years ago, describing the

diarrhea occurrence in animals from different pig farms, and are doubtful to reflect the current

epidemiologic situation (MORIN et al., 1983; HOEFLING, 1989; JOHNSON et al., 1992;

DRIESEN et al., 1993). In Brazil, the involvement of different RV groups in piglet enteritis

had been described in isolate diarrhea episodes among different pig farms, but not involved in

an outbreak in a vaccinated pig herd (MÉDICI et al., 2011). Considering the variety of enteric

pathogens that can be isolated in suckling piglets, the lack of recent multiple etiological

studies compromise the successful of preventive measures.

85

In spite of, previously major reports of diarrhea outbreaks had only described the

involvement of a single rotavirus group (MORIN et al., 1990; WIELER et al., 2001; PARRA

et al., 2008; JEONG et al., 2009), the present study describes the frequency detection of single

and mixed PoRV groups A, B, and C infections in a diarrhea outbreak in suckling piglets. The

high rates of morbidity and mortality observed in this outbreak can be, partly, justified for the

simultaneous occurrence of infections with three different antigenic groups of PoRV. Chang

et al. (1999) had describe the influence of bovine RV-A and RV-C dual infections involved in

neonatal diarrhea episodes in gnotobiotic calves, where intestinal lesions, as villous atrophy

lymphoid hyperplasia were generally more severe compared with single infection lesions.

The immunity given by rotaviruses, through natural infection or antigens present in

commercial vaccines, is predominantly homotypic, acting against homologous serotypes of

rotavirus infections which the animals were exposed previously (OLIVEIRA et al., 1994).

Therefore, rotavirus human and animal (porcine and bovine) vaccines are composed of

multiple genotypes. The immune pressure induced by mass vaccination could promote

reassortment, rearrangement, and zoonotic transmission between animal and human rotavirus

strains (MATTHIJNSSENS et al., 2009). Although the virus identified in this outbreak is a

G4P[6] genotype, it belongs to another serotype. Therefore, the vaccine did not provide cross

immunity and PoRV-A also had involved in the outbreak.

The present study allows concluding that the PoRV is an important etiological agent of

diarrhea outbreak in suckling piglets even in regularly vaccinated pig herds. In these

situations, for the elucidation of the etiology and also of the vaccine failures is decisive the

use of more sensitive diagnosis techniques; to include diagnosis systems for the PoRV-B and

PoRV-C; and also to provide the genotyping of the PoRV-A strains identified in the diarrhea

outbreak.

86

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91

4. CONCLUSÕES

92

4. CONCLUSÕES

Com base na análise do gene VP6, as estirpes de PoRV-C identificadas em rebanhos

suinícolas de cinco estados brasileiros apresentaram extensa variabilidade genética

sendo as linhagens de origem suína agrupadas em três distintos clusters;

Em surtos de diarreia neonatal em rebanhos regularmente vacinados contra o PoRV-A,

para a identificação da causa da falha vacinal, é importante caracterizar os genotipos G

(VP7) e P (VP4) das estirpes de PoRV-A identificadas;

Para o diagnóstico da etiologia viral de surtos de diarreia neonatal em rebanhos suínos

regularmente vacinados contra o PoRV-A é importante incluir técnicas de diagnóstico

que, além da identificação do PoRV-A, identifiquem também infecções ocasionadas

pelo PoRV-B e PoRV-C;

Em algumas situações específicas, como aquelas representadas por diarreia neonatal

em rebanhos suinícolas regularmente vacinados contra o PoRV-A, o PoRV-C é um

importante agente etiológico, atuando tanto em infecções singulares quanto,

principalmente, mistas incluindo o PoRV-A e o PoRV-B.

93

ANEXOS

94

ANEXO A: Lista de Reagentes

1. 100 mM dNTP Set, 4 x 250 sL; 25 smol cada (100 mM dATP Solution, 100 mM dCTP

Solution, 100 mM dGTP Solution, 100 mM dTTP Solution) (InvitrogenTM Life

Technologies, EUA)

2. 10 x PCR-Buffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KCl) (InvitrogenTM Life

Technologies, EUA)

3. 123 bp DNA Ladder (InvitrogenTM Life Technologies, EUA)

4. 2-Mercaptoetanol (C2H6O5) P.M. 78,13 (Fluka®)

5. Acetona, P.A. (CH3COCH3) P.M. 58,08 (Dinâmica®)

6. Ácido acético glacial, P.A. (CH3COOH) P.M. 60,05 (Nuclear®)

7. Ácido bórico (H3BO3) P.M. 61,83 (Reagen®)

8. Ácido clorídrico (HCl) P.M. 36,46 (Reagen®)

9. Ácido etilenodiaminotetraácido Sal di-sódico – EDTA, P.A. (C10H14N2O8Na22H2O) P.M.

372,24 (Reagen®)

10. Acrilamida P.M. 71,08 (Gibco BRL®)

11. Agar Noble (Difco®)

12. Agarose (Gibco® BRL)

13. Álcool etílico absoluto (C2H2OH) P.M. 46,07 (Nuclear®)

14. Álcool isoamílico (CH3)2CHCH2CH2OH) P.M. 88,15 (Synth®)

15. Azul de bromofenol (Sigma®, EUA)

16. Bicarbonato de sódio P.A.(NaHCO3) P.M. 84,01 (Biotec®)

17. Bis-acrilamida P.M. 154,2 (Sigma®, EUA)

18. Borohidreto de sodio P.M. 37,83 (Sigma®, EUA)

19. Brometo de etídeo (C21H20N3Br) P.M. 394,3 (Sigma®, EUA)

20. Cloreto de Calcio Puro (CaCl2) P.M. 110,94 (InvitrogenTM Life Technologies, EUA)

21. Cloreto de potássio, P.A. (KCl) P.M. 74,56 (Reagen®)

22. Cloreto de sódio, P.A. (NaCl) P.M. 58,45 (Reagen®)

23. Clorofórmio, P.A. (CHCl3) P.M. 119,38 (Dinâmica®)

24. Dióxido de silica (SiO2) P.M. 60,08 (SigmaR, EUA)

25. Dodecil Sulfato de Sódio - Lauril Sulfato de Sodio - SDS (C12H25NaO4S) P.M. 288,38

(BHD)

26. Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4) P.M. 141,96 (Synth®)

95

27. Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4 H2O) P.M. 137,99 (Reagen®)

28. Glicina, P.A. (Nuclear®)

29. Glicose (Reagen®)

30. Hidróxido de sodio P.A. (NaOH) P.M. 40,00 (Mallinckrodt Chemicals®)

31. Hidroximetil amino metano - TRIS 99% P.M. 121,14 (Merck)

32. Isotiocianato de guanidina P.M. 118,16 (InvitrogenTM Life Technologies, EUA)

33. Metanol, P.A. (CH3OH) P.M. 32,04 (Allkimia®)

34. Platinum Taq DNA Polymerase recombinant 500 unidades (InvitrogenTM Life

Technologies, BRA)

35. REACT® 2 (500 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 500 mM NaCl) (Invitrogen Life

TechnologiesTM)

36. Sacarose, P.A. – sucrose (C12H22O11) P.M. 342,3 (Reagen®)

37. Superscript TM II RNase H - Reverse Transcriptase – 200 unidades/L (InvitrogenTM Life

Technologies, EUA)

38. Triton 100 (J.T.Baker®)

96

ANEXO B: Soluções e Tampões

Hidratação da sílica

- 60 g de sílica

- Adicionar 500 mL de água MilliQ autoclavada

- Agitar lentamente e manter em repouso durante 24 h

- Por sucção, desprezar 430 mL do sobrenadante

- Ressuspender a sílica em 500 mL de água bidestilada

- Manter em repouso durante 5 h para sedimentar

- Desprezar 440 mL do sobrenadante

- Adicionar 600 L de HCl (32% w/v) para ajustar o pH (pH=2,0)

- Aliquotar e autoclavar

Solução L6

- 120 g de tiocianato de guanidina (GUSCN)

- 100 mL de TRIS-HCl 0,1 M pH 6,4

- 22 mL de EDTA 0,2 M pH 8,0

- 2,6 g de Triton x 100

Solução L2

- 120 g de tiocianato de guanidina (GUSCN)

- 100 mL de TRIS-HCl 0,1 M pH 6,4

Tampão de amostra para eletroforese em gel de agarose

- Azul de bromofenol 0,25%

- Sacarose – sucrose (C12H22O11) 45%

- Água MilliQ q.s.p. 100 mL

Tampão de amostra para eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)

- 0,2 mL azul de bromofenol 1%

- 6,0 mL SDS 10%

- 1 mL 2-mercaptoetanol

- 2,5 mL de TRIS-HCL 0,5M

97

- 6 g uréia


Tampão de corrida para gel de agarose TBE (TRIS – Ácido bórico – EDTA) 10 x [ ]

- 107,78 g TRIS (0,89 M)

- 55,03 g de acido borico (0,89 M)

- 7,45 g de EDTA (0,02 M)

- Água bidestilada q.s.p. 1 L

Tampão de corrida para PAGE

- 30 g TRIS (0,24 M)

- 14,4 g de acido aminoacético (glicina) (NH2CH2COOH) (0,19M)

- Água MilliQ q.s.p. 1L

Tampão de estabilização para o rotavírus (TRIS/Ca++ 10 x) – pH 7,2

- 12,12 g TRIS (0,89mM)

- 2,2 g cloreto de calcio (1,5mM)

- Água MilliQ autoclavada q.s.p. 1L

Fenol / clorofórmio – álcool isoamílico

- 25 mL fenol saturado

- 24 mL clorofórmio

- 1 mL álcool isoamílico

SDS 10%

- 5 g dodecilsulfato de sódio – Lauril sulfato de sódio – SDS (C12H25NaO4S)

- Água MilliQ autoclavada q.s.p. 50 mL

Lower TRIS pH 8,8 para PAGE

- 36,34 g TRIS (1,5M)


98

Upper TRIS pH 6,8 para PAGE

- 12,12 g TRIS (0,5M)

- Água MilliQ q.s.p 200 mL

Solução Acrilamida / Bisacrilamida

- 1,3 g bisacrilamida

- 50 g acrilamida

- Água MilliQ q.s.p 100 mL

Solução fixadora para PAGE

- 30 mL álcool etílico absoluto

- 1,5 mL acido acético


Solução de prata para PAGE

- 0,55 g de nitrato de prata


Solução reveladora para PAGE

- 9 g hidróxido de sodio

- 2,5 mL formaldeido

- 0,06 g borohidreto de sódio


Solução stop da coloração para PAGE

- 15 mL ácido acético P.A.


Solução conservadora para PAGE

- 15 mL álcool etílico P.A.


99

Gel inferior (7,5%) da PAGE

- 5 mL Lower TRIS

- 3 mL acrilamida/Bisacrilamida

- 50 µL TEMED

- 0,56 mL persulfato de amônio 2%

- 11,44 mL água bidestilada

Gel superior (3,5%) da PAGE

- 2,5 mL Upper TRIS

- 0,7 mL acrilamida/bisacrilamida

- 50 µL TEMED

- 0,60 mL persulfato de amônio 2%

- 6,20 mL água bidestilada

Gel de agarose 2%

- 1 g agarose

- 50 mL de tampao TEB 1x

- 30 µL de brometo de etídio

Diluição de dNTP

- solução estoque - concentração 100 mM - 100 µL de cada dNTP

- solução uso - concentração 10 mM - 10 µL da solução estoque + 90 µL de água MilliQ autoclavada

100

ANEXO C: Protocolo de Técnicas

Suspensão fecal – Extração bruta

- Pesar 1g do material fecal em balança de precisão

- Adicionar 9 mL de tampão TRIS/Ca++ 1x (para amostra liquidas estabelecer a

proporção 1:2)

- Homogeneizar

- Calibrar os tubos

- Centrifugar 2.000 x g / 5 min.

- Recolher sobrenadante

- Identificar e estocar em frascos a 4º C

Extração do RNA: Associação das técnicas fenol/clorofórmio – álcool isoamílico e

sílica / isotiocianato de guanidina

- Aliquotar 500 L da suspensão fecal

- Adicionar 50 µL de SDS 10%

- Homogeneizar em vórtex

- Banho-maria a 56o C durante 20 min.

- Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s.

- Adicionar 500 L de fenol / clorofórmio – álcool isoamílico (25:24:1)


- Banho-maria a 56o C durante 15 min.

- Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min.

- Recolher sobrenadante em outro tubo

- Adicionar 900 L de solução L6

- Adicionar 25 L de sílica hidratada


- Agitar durante 30 min. à temperatura ambiente


- Desprezar sobrenadante em solução contendo NaOH 10M




101






- Adicionar 1 mL de etanol a 70%



- Desprezar sobrenadante

- Adicionar 1 mL de etanol a 70%




- Adicionar 1 mL de acetona PA


- Centrifugar a 10.000 g durante 1 min.


- Secar o pellet em termo-bloco à 60oC (aproximadamente 2 min.) ou banho-maria à 56 oC

(15 min.)

- Adicionar 50 L de água DEPEC


- Banho-maria à 56o C durante 15 min.


- Centrifugar a 10.000 x g durante 2 min.

- Recolher sobrenadante em eppendorfs de 500 µL

- Estocar a -20ºC

102

Quadro 1. Primers – amplificação dos genes VP4 e VP7 (PoRV-A), NSP2 (PoRV-B) e VP6 (PoRV-C).

RV

Group

(gene)

Primer Sequence Position/Polar Product Referenc

e

A (VP7) Beg9 5´ggc ttt aaa aga gag aat ttc cgt ctg g 3´ 1-28 (+) 1062 bp (1)

End9 5´ggt cac atc ata caa ttc taa tct aag 3´ 1062-1036 (-) (1)

End9 (UK) 5´ggt cac atc atc aaa ctc taa tct 3´ 1059-1036 (-) (2)

End9 (CRW8) 5´ggt cac atc tta cag ctt taa cct 3´ 1059-1036 (-) (2)

A (VP4)

B (NSP2)

C (VP6)

Con3 5´tgg ctt cgc tca ttt ata gac a 3´ 11-32 (+) 877 bp

434 bp

270 bp

(3)

Con2 5átt tcg gac cat tta taa cc 3´ 868-887 (-)

B1

B3

B4

5ćta ttc agt gtg tcg tga gag g 3´

5ćga agc ggg cta gct tgt ctg c 3´

5ćgt ggc ttt gga aaa ttc ttg 3´

18-42 (+)

451-473 (-)

506-527 (-)

(4)

BMJ41

BMJ42

5´ggc ttt aaa aat ctc att ca 3´

5ćct cta gtt gat tga aça ta 3´

1-20 (+)

251-270 (-)

(5)

C (VP6) modBMJ41

BJB

5´ggc ttt aaa aat ctc att cac aa 3´

5ágc cac ata gtt cac att tca 3´

1-23 (+)

1333 – 1353 (-)

1353 bp

(1) GOUVEA et al., 1990; (2) GOUVEA et al., 1993; (3) GENTSCH et al, 1992; (4) DAS et al., 1994; (5) ALFIERI et al., 1999.

RT-PCR P consensual para o rotavírus grupo A

- Mix Desnaturação P tipo

con 2 (20 pmol) - 1 µL

con 3 (20 pmol) - 1 µL

Água - 3 µL

Volume final - 5 µL

- Mix Desnaturação G tipo

Beg9 (20 pmol) - 1 µL

End9 (20 pmol) - 1 µL

End9 (UK) (20 pmol) - 1 µL

End9 (CRW8) (20 pmol) - 1 µL

Água - 1 µL

103


- Mix Transcrição Reversa (RT-MIX)

Tampão 10 x pH 8,4 - 2,5 µL

MgCl2 50 mM - 2,5 µL

dNTP 2,5 mM - 4,0µL

SuperScript HII® 200U/µL – 0,15µL Água - 5,85 µL


- Mix Reação da Polimerase em Cadeia para P e G tipo (PCR-MIX)



Platinun®Taq DNA Polymerase 5U/µL – 0,25 µL

Primer con 2 (20 pmol) – 1 µL

Primer con 3 (20 pmol) – 1 µL

Água - 16,25 µL


Mix Reação da Polimerase em Cadeia para G tipo (PCR-MIX)




Água - 18,25 µL


104

Esquema da RT-PCR para genotipo P

5l Mix desnaturação G 5l Mix desnaturação P

5 l do RNA extraido 5 l do RNA extraido

97°C / 5 min 97°C / 5 min

5 min banho gelo 5 min banho gelo

adicionar 15 L de RT-MIX adicionar 15 L de RT-MIX

42ºC / 30 min 42ºC / 30 min

adicionar 25 L de PCR MIX para G adicionar 25 L de PCR MIX para P

Ciclos:

1 ciclo (94ºC / 3 min)

40 ciclos (94ºC /45 s; 45ºC / 45 s e 72ºC / 1 min).

Extensão final 72ºC / 10 min.

50 L de amplicon G 50 L de amplicon P

RT-PCR e SN-PCR para o rotavírus grupo B

a) RT-PCR

- Mix Desnaturação

B1 (20 pmol) - 1 µL

B4 (20 pmol) - 1 µL

Água - 3 µL


105


Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L

MgCl2 50 mM– 2,5 L

dNTP 2,5mM– 4µL

SuperScript HII RT 200U/L – 0,15 L

Água – 5,85 L


- Mix Reação da Polimerase em Cadeia (PCR-MIX)

Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L

dNTP 2,5mM– 4µL


Água – 18,25 L


b) SN-PCR


B1 (20 pmol) - 1 µL

B3 (20 pmol) - 1 µL

Água - 3 µL


- Mix Semi Nested-PCR

Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L

MgCl2 50 mM– 2 L

dNTP 2,5mM– 4 µL


Água – 11,25 L


106

Esquema da Semi nested-PCR para o rotavírus grupo B

5L RNA extraido 5L Mix desnaturação 97ºC / 5 min banho de gelo / 5 min adicionar 15 L do RT mix

42ºC / 30 min

adicionar 25 L do PCR Mix

Ciclos: 94ºC / 3 min.

40 ciclos (94ºC / 45 s, 45ºC / 45 s, 72ºC / 1 min)

extensão final a 72ºC /10 min

Volume final 50 L de amplicon PCR Semi nested-PCR

5 L amplicon PCR 5 L Mix desnaturação Semi nested-PCR

97ºC/5 min

20 L Mix seminested PCR

Ciclos:

94ºC / 3 min

30 ciclos (94ºC/45 s; 45ºC /45 s; 72 ºC/1 min

extensão final 72ºC/10 min

Volume final 30 L de amplicon seminested PCR

107

RT-PCR para o rotavírus grupo C (270 pb)


BMJ41 (20 pmol) - 1 µL

BMJ42 (20 pmol) - 1 µL

Água - 3 µL



Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L

MgCl2 50 mM– 2,5 L

dNTP 2,5mM– 4µL


Água – 5,85 L



Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L

dNTP 2,5mM– 4µL


Água – 18,25 L


108

Esquema para a RT-PCR do rotavírus grupo C (270 pb)

5 L RNA extraido

5 L Desnaturação Mix

97ºC / 5 min

adicionar 15 L do Mix RTPCR

42ºC / 30 min

adicionar 25 L do Mix PCR

Ciclos:

3 ciclos ( 94ºC / 1 min; 40ºC / 2 min; 69ºC / 8 min)

30 ciclos (94ºC / 1 min; 40 ºC / 2 min; 72ºC / 3 min)

extensão final 72ºC / 7 min.

Volume final 50 L de amplicon

RT-PCR para o rotavírus grupo C (1353 pb)


modBMJ41 (20 pmol) - 1 µL

BJB (20 pmol) - 1 µL

Água - 3 µL



Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L

MgCl2 50 mM– 2,5 L

dNTP 2,5mM– 4µL


Água – 5,85 L


109


Tampão 10 x pH 8,4 – 2,5 L

dNTP 2,5mM– 4µL


Água – 18,25 L


Esquema para a RT-PCR do rotavírus grupo C (1353 pb)

5 L RNA extraído

5 L Desnaturação Mix

97ºC / 4 min

adicionar 15 L do Mix RTPCR

42ºC / 30 min

adicionar 25 L do Mix PCR

Ciclos:

94ºC / 2 min

35 ciclos (94ºC / 1 min; 55 ºC / 1 min; 72ºC / 1 min)

extensão final 72ºC / 7 min.

Volume final 50 L de amplicon

programa de pÓs-graduaÇÃo em ciÊncia animal · londrina, como requisito parcial para a...

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