Profa Gabriela MacedoTA 514

Velocidade = produto formadotempo de reação

P

Tempo (t)

vo

reação inicial(mais elevada)

reação mais lenta

A velocidade de uma reação química, quer seja catalisada ou não, é uma medida da conversão de reagente(s) em produto(s) por unidade de tempo, em condições controladas. Em cinética enzimática os reagentes designam-se substratos. A conversão de um substrato S num produto P, catalisada por um enzima E

Se [S] é muito grande, Km torna-se insignificante e v=Vmax

Se [S] = Km V = ½ Vmax

V = K[S] ou cinética de primeira ordem quando[S]0,01Km

Na prática: tenta-se cinética ordem zero: atividade enzimática diretamente proporcional a concentração da enzima e independe da concentração de substrato.

Km depende do pH, temperatura e força iônica do meio Km = mol ou mol de substrato/L Vmax = mol de produto formado/minuto/mg proteína

É a parte da enzimologia que estuda a velocidade das reações enzimáticas, e os atores que influenciam nesta velocidade.A cinética de uma enzima é estudada avaliando-se a quantidade de produto formado ou a quantidade de substrato consumido por unidade de tempo de reação

S1: maior afinidade

S2: menor afinidade

KM1KM2

E + S <==> [ES] ==> E + P

A partir deste modelo, estes pesquisadores criaram uma equação, que nos permite demonstrar como a velocidade de uma reação varia com a variação da concentração do substrato

1/Vo = Km Vmax

. 1[S]

+ 1Vmax

Esta equação pode ser expressa graficamente, e representa o efeito da concentração de substrato sobre a velocidade de reação enzimática. O Km de um substrato para uma enzima específica é característico, e nos fornece um parâmetro de especificidade deste substrato em relação à enzima. Quanto menor o Km, maior a especificidade, e vice-versa.

Se os valores experimentais se ajustarem na curva teórica, o valor de Km pode ser determinado pela fórmula:

V = Vmax . [S]

Contudo, as reações geralmente são complicadas: Inibição ou ativação pelo substrato em alta concentração ou pela insolubilidade do substrato

Km + [S]

Utilização de métodos gráficos: dados transformados em forma linear

Valores experimentais de Km e Vmax: obtidos dentro da região do Km teórico

Velocidades iniciais: devem ser obtidas em 6 a 10 concentrações do substrato na faixa de 0,1Km a 10Km

Bons resultados: 0,3Km a 3Km Tratamento estatístico dos dados (desvio padrão)

Lineweaver-BurkV = Vmax . [S] Inverso 1 = Km + 1

Gráfico

A equação é uma reta onde: Y = 1/V, X = 1/[S], b = 1/Vmax, = Km/Vmax

Km + [S] V Vmax[S] Vmax

O valor de Km indica a afinidade da enzima pelo substrato: quanto menor Km, maior a afinidade.

Vmax indica a velocidade máxima de formação de produto em condições de saturação de substrato

V é igual a velocidade máxima quando [S]100Km ( cinética de ordem zero)

Com concentração fixa de enzima, de início temos um rápido aumento na velocidade de reação.

A medida que a concentração do substrato continua a crescer, o aumento na velocidade da reação começa a diminuir até que, com grande concentração de substrato, não se observa aumento da velocidade de reação.

vo3

vo2

vo1

4

A velocidade de uma reação enzimática depende diretamente da concentração da enzima, na presença de excesso de substrato.

Gráficos

Mostrar software bioquímica

Tempo

[P]

1. Enzimas Monoméricas: Possuem apenas uma cadeia polipeptídica, no qual se situa o sítio Ativo.

Enzima PM Resíduos de a a

Lizosima (clara de ovo)

14600 129

Papaína (protease de

mamão)

13700 124

Tripsina (protease

pancreática

23800 203

2. Enzimas Oligoméricas: Contém no mínimo 2 ou até 60 subunidades firmemente associadas para formar a enzima ativa

Enzima SubunidadesNúmero

SubunidadesPM

PM da Enzima

Fosforilase 4 92500 370000

Hexoquinase 4 27500 102000

Fosfofrutoquinase

2 78000 190000

Enzimas que estão fortemente associadas e estão envolvidas em uma série sequencial de reações. Qualquer tentativa de dissociar as enzimas resulta em inativação.

Exemplos: Complexo piruvato desidrogenase (metabolismo de

carboidratos) Complexo -cetoglutarato desidrogenase (Ciclo de Krebs) Complexo ácido graxo sintetase (biossíntese de ácido

graxos)

3. Isoenzimas: Têm múltiplas formas moleculares no mesmo organismo e catalisam a mesma reação.

Ác. Pirúvico Ác. LácticoLactato desidrogenase

Zimogênio Agente ativador

Enzima

Pepsinogênio H+ ou pepsina pepsina

Tripsinogênio Enteroquinase ou tripsina

tripsina

Quimotripsinogenio A

tripsina Alfa quimotripsina

Proelastase tripsina elastase

Moléculas ou íons que se associam a algumas enzimas para promover atividade catalítica:

Coenzimas: cofator orgânico Enzima + cofator = Grupo prostético Enzima + grupo prostético = Holoenzima

São compostos que são necessários para a enzima catalisar a reação

Podem ser classificados em:1. Íons metálicos2. Coenzimas3. Grupos protéticos

Grande número de enzimas exigem cátions mono ou divalentes (K+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, Zn2+) como ativadores metálicos.

Esses íons podem estar presos à porção protéica forte ou fracamente, através da formação de quelatos com grupos fenólicos, amino, fosfato ou carbonilo

Enzimas que contém íons metálicos, presentes em frutas e vegetais, que causam deteriorações oxidativas

Enzima Íon Ação da Enzima

Peroxidase Fe3+ Ação deteriorativa em frutas e vegetais, formação de sabor e aromas estranhos

Polifenoloxidase Cu2+ Escurecimento enzimático em frutas e vegetais

Ácido ascórbico Oxidase

Cu2+ Oxidação da Vit. C

Catalase Fe3+ Decomposição de peróxido de hidrogênio

Coenzima: Molécula orgânica pequena, termoestável que se dissocia facilmente da proteína enzimática

Pode ser separada por diálise Ex. CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO+NADH+H+

Cofator firmemente ligado à proteína enzimática e não pode ser separado sem destruir a enzima

Exemplo: FAD+ (Flavina adenina dinucleotídeo)

A especificidade permite modificar seletivamente compostos individuais dos alimentos sem afetar

outros.

Amido Amido liquefeito (glicose,maltose, maltotriose,-limite

dextrina)

Proteína Peptídeos, aminoácidos

Triglicerídeos Diglicerídeos+monoglicerídeos+ácidos graxos

-amilase

Protease

Lipase pancreática

1,3 específica

A especificidade torna as enzimas importantes como um instrumento analítico.

Determinação Enzimática de Glicose

Glicose Ácido glucônico + H2O2

2H2O2 + o-dianizidina+peroxidase Complexo colorido

(Vermelho-Marrom)(450nm)

Glicose Oxidase

A especificidade das enzimas distingue-as dos catalisadores não biológicos

Mistura de

500g de glicose

500g de frutose

500g de galactose pormL de amostra

Arseniato de sódio+Molibdato de amônio+H2SO4( SN II)

CuSO4 em meio alcalino

(SN I)

1500g açúcares redutores/mL amostra

Mistura de

500g de glicose

500g de frutose

500g de galactose pormL de amostra

Determinação Enzimática de Glicose 500g de glicose/mL

de amostra

(Kit glicose oxidase)

Glicose oxidase reage especificamente com glicose

Especificidade de Grupo: Uma enzima pode apresentar especificidade de grupo, ou seja, um grupo de compostos pode servir como substrato

Ex: Glicose + ATP Glicose-6P Frutose + ATP Frutose-6P Manose + ATP Manose-6P

Hexoquinase

Hexoquinase

Hexoquinase

A enzima atua sobre um único substrato e catalisa uma única

reaçãoEx: R-arginina-glicina-R R-arginina +

glicina-R (fibrina+2 peptídeos)

Trombina

Fibrinogênio

A enzima não discrimina o substrato e exibe somente especificidade em relação a ligação a ser rompida

Caseína Peptídeos+Aminoácidos

Miosina e Actina Peptídeos+Aminoácidos

(Proteína do Leite)

Pepsina(protease do estômago)

Pepsina(protease do estômago)

(Proteínas da Carne)

Muitas enzimas apresentam esteroespecificidade por um isômero óptico ou geométrico em particular

L-aminoácidos -cetoácidos+NH3+H2O2

D-aminoácidos -cetoácidos+NH3+H2O2

L-aminoácido oxidase

D-aminoácido oxidase

De acordo com a regra internacional, uma unidade de atividade é definida como a quantidade de enzima que causa a transformação de 1,0 mol de substrato por minuto a 25ºC sob condições ótimas de ensaio.

Atividade: Refere-se ao total de unidades de enzimas em uma solução

Atividade específica: É o número de unidades de enzima por miligrama de proteína

A atividade específica é uma medida da pureza da enzima: aumenta durante as etapas de purificação de uma enzima e se torna máxima ou constante quando a

enzima está pura.