produçãobiossurfactantepseudomonas

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA

FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA

PRODUO DE BIOSSURFACTANTE POR

PSEUDOMONAS AERUGINOSA

EMPREGANDO LEO DE SOJA RESIDUAL

Autor: Cristian Jacques Bolner de Lima

Orientadoras: Dra.Vicelma Luiz Cardoso

Dra. Eliana Flvia Camporese Servulo

Uberlndia - MG

2007

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA

FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA

Autor: Cristian Jacques Bolner de Lima

Qumico Industrial

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica da Universidade Federal de Uberlndia como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Doutor em Engenharia Qumica, rea de concentrao em Pesquisa e Desenvolvimento de Processos Qumicos.

Uberlndia MG

2007

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

L732p

Lima, Cristian Jacques Bolner de, 1974- Produo de biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa empregando leo de soja residual / Cristian Jacques Bolner de Lima. - 2007. 168 f. : il. Orientadoras: Vicelma Luiz Cardoso, Eliana Flvia Camporese Servulo. Tese (doutorado) Universidade Federal de Uberlndia, Programa de

Ps-Graduao em Engenharia Qumica.

Inclui bibliografia. 1. Engenharia bioqimica - Teses. 2. Biotecnologia - Teses. 3. Biossur-factante - Teses. I. Cardoso, Vicelma Luiz. II. Servulo, Eliana Flvia Cam-porese. III. Universidade Federal de Uberlndia. Programa de Ps-Gradua-o em Engenharia Qumica. III. Ttulo. CDU: 663.1

Elaborada pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogao e Classificao

MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO DE

CRISTIAN JACQUES BOLNER DE LIMA APRESENTADA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA, EM 24/08/2007.

BANCA EXAMINADORA:

Prof. a Dra.Vicelma Luiz Cardoso

Orientadora (FEQUI/UFU)

Prof.a Dra. Eliana Flvia Camporese Servulo

Co- Orientadora (EQ/UFRJ)

Prof. a. Dra. Leila Peres

Professora (FEQUI/UNICAMP)

Prof. Dr. Eucldes Honrio de Arajo

Professor (FEQUI/UFU)

Prof. a. Dra. Miriam Maria de Resende

Professor (FEQUI/UFU)

Dedico este trabalho a minha

famlia.

AGRADECIMENTOS

Agradeo a Deus pela oportunidade de alcanar mais uma vitria em minha

vida.

A Prof. Vicelma Luiz Cardoso pela orientao, pela total dedicao e

oportunidade depositada durante esses quatro anos de trabalho.

A Prof. Eliana Flvia Camporese Srvulo pela co-orientao, colaborao e

incentivo ao longo deste projeto;

A Prof. Miriam Maria de Resende pela colaborao especial fornecida para

complementao de meus resultados.

Ao dio Alves pelo auxlio e colaborao nos assuntos relacionados

informtica.

Aos meus pais Edison e Marlei pelo amor e carinho recebidos sempre.

A minha esposa Letcia pela dedicao e pacincia nesses quatros anos e a quem

tanto amo.

As minhas colegas Patrcia e Sandra pelo companheirismo e amizade que nunca

sero esquecidos.

A Faculdade de Engenharia Qumica pelos equipamentos e a infra-estrutura

disponibilizada para execuo dos trabalhos experimentais.

A CAPES pela oportunidade a mim concedida de fazer parte do programa de

ps-graduao e pelo apoio financeiro, sem o qual este projeto pessoal no poderia ser

realizado.

Aos funcionrios dos laboratrios que sempre se dispuseram a ajudar em

necessidades.

Enfim, a todos que colaboraram para o bom desenvolvimento deste trabalho.

SUMRIO

LISTA DE FIGURAS .............................................................................................. I

LISTA DE TABELAS .......................................................................................... IV

LISTA DE SMBOLOS ........................................................................................ VI

RESUMO ............................................................................................................VIII

ABSTRACT .......................................................................................................... IX

CAPTULO 1. INTRODUO.............................................................................. 1

CAPTULO 2. REVISO BIBLIOGRFICA ....................................................... 4

2.1. LEOS E GORDURAS ............................................................................................... 4 2.2. LEO DE SOJA VEGETAL ......................................................................................... 5 2.3. INDSTRIA DE LEOS VEGETAIS.............................................................................. 6 2.4. LEVEDURA RESIDUAL DE CERVEJARIA .................................................................. 10 2.5. SURFACTANTES .................................................................................................... 11 2.6. EMULSIFICANTES.................................................................................................. 16 2.7. BIOSSURFACTANTES............................................................................................. 16 2.8. CLASSIFICAO E NATUREZA QUMICA DOS BIOSSURFACTANTES......................... 18

2.8.1. Glicolipdeos................................................................................................. 19 2.8.2. Lipopeptdeos e lipoprotenas ...................................................................... 25 2.8.3. cidos graxos, lipdeos neutros e fosfolipdeos............................................ 27 2.8.4. Biossurfactantes polimricos........................................................................ 28 2.8.5. Outros tipos de biossurfactantes .................................................................. 30

2.9. FUNO FISIOLGICA DOS BIOSSURFACTANTES ................................................... 30 2.10. PROPRIEDADES DOS BIOSSURFACTANTES............................................................ 31 2.11. PRODUO DE BIOSSURFACTANTES E PARMETROS IMPORTANTES NA MESMA .. 32 2.12. RECUPERAO DE BIOTENSOATIVOS .................................................................. 48 2.13. APLICAES INDUSTRIAIS E TECNOLGICAS DOS BIOSSURFACTANTES ............... 50 2.14. PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS E OTIMIZAO DE PROCESSOS..................... 51

CAPTULO 3. MATERIAIS E MTODOS......................................................... 53

3.1. MICRORGANISMOS ............................................................................................... 53 3.2. FONTES DE CARBONO ........................................................................................... 53

3.2.1. leos vegetais residuais ............................................................................... 53 3.2.2. Levedura residual cervejeira........................................................................ 54

3.3. MEIOS DE CULTURA.............................................................................................. 54 3.3.1. Meio de cultura utilizado no isolamento dos microrganismos .................... 54 3.3.2. Meio de cultura para a manuteno das cepas............................................ 55 3.3.3. Meio de cultura para o crescimento do microrganismo .............................. 55 3.3.4. Meio de cultura utilizado no processo fermentativo .................................... 56

3.4. SELEO DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE BIOSSURFACTANTES................. 57 3.4.1. Coleta das amostras de solo contaminado................................................... 57 3.4.2. Isolamento das estirpes microbianas ........................................................... 58 3.4.3. Manuteno das linhagens de Pseudomonas aeruginosa ............................ 59 3.4.4. Avaliao da produo de biossurfactantes pelos microrganismos isolados................................................................................................................................ 59

3.4.5. Identificao da cultura microbiana ............................................................ 60 3.5. EXPERIMENTOS..................................................................................................... 60

3.5.1. Preparao do inculo e fermentao em incubadora rotativa................... 60 3.5.2. Planejamentos experimentais fatoriais 24 .................................................... 60 3.5.3. Planejamento experimental composto central ............................................. 63 3.5.4. Produo de biossurfactante em biorreator................................................. 67 3.5.5. Regulao e processo fermentativo dos raminolipdeos .............................. 69 3.5.6. Estudo comparativo da produo de biossurfactante a partir de leos diferentemente processados.................................................................................... 69

3.6. RECUPERAO DE BIOTENSOATIVOS .................................................................... 69 3.7. CINTICA.............................................................................................................. 70

3.7.1. Modelagem da produo fermentativa de raminose .................................... 70 3.7.2. Construo do modelo cintico .................................................................... 71 3.7.3. Modelagem do crescimento celular.............................................................. 72 3.7.4. Modelagem das outras funes .................................................................... 72

3.8. ANLISES QUANTITATIVAS................................................................................... 72 3.8.1. Morfologia.................................................................................................... 72 3.8.2. Concentrao de fsforo total ...................................................................... 73 3.8.3. Concentrao de nitrognio Kjeldahl total (NKT)....................................... 73 3.8.4. Concentrao de nitrato............................................................................... 73 3.8.5. Tenso superficial ........................................................................................ 73 3.8.6. Concentrao de raminose........................................................................... 73 3.8.7. ndice de emulsificao ................................................................................ 74 3.8.8. Biomassa....................................................................................................... 74 3.8.9. Concentrao de oxignio dissolvido........................................................... 75 3.8.10. Procedimento de calibrao do eletrodo ................................................... 75 3.8.11. Determinao do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (KLa) em biorreator contendo o meio MPB. .......................................................... 75 CAPTULO 4. RESULTADOS E DISCUSSO.................................................. 77

4.1. AVALIAO DA PRODUO DE BIOSSURFACTANTE PELOS MICRORGANISMOS ISOLADOS .................................................................................................................... 77 4.2. PLANEJAMENTO FATORIAL A DOIS NVEIS PARA PSEUDOMONAS AERUGINOSA ATCC 9027 E P. AERUGINOSA PALR...................................................................................... 78 4.3. SEGUNDO PLANEJAMENTO FATORIAL A DOIS NVEIS UTILIZANDO OS MICRORGANISMOS PSEUDOMONAS AERUGINOSA ATCC 9027 E PSEUDOMONAS AERUGINOSA ISOLADA PALC ....................................................................................... 85 4.4. RESULTADOS DO PLANEJAMENTO COMPOSTO CENTRAL (PCC) ............................ 92

4.4.1. Anlise de regresso dos resultados obtidos na produo de raminose a partir das variveis estudadas................................................................................ 94 4.4.2. Anlise de regresso dos resultados obtidos da tenso superficial a partir das variveis estudadas........................................................................................ 101 4.4.3. Anlise de regresso dos resultados obtidos para o ndice de emulso a partir das variveis estudadas.............................................................................. 106 4.4.4. Anlise de regresso dos resultados obtidos para o crescimento celular a partir das variveis estudadas.............................................................................. 113

4.5. REPRODUTIBILIDADE DO PROCESSO FERMENTATIVO REALIZADO COM AS MELHORES CONDIES EXPERIMENTAIS DEFINIDAS NO PCC....................................................... 119 4.6. DETERMINAO DO COEFICIENTE VOLUMTRICO DE TRANSFERNCIA DE OXIGNIO (KLA)......................................................................................................................... 120

4.7. OTIMIZAO DA RELAO AERAO/AGITAO................................................ 122 4.8. RESULTADOS DO PLANEJAMENTO FATORIAL COMPLETO REALIZADO EM BIORREATOR.............................................................................................................. 124

4.8.1. Anlise de regresso dos resultados obtidos na produo de raminose a partir das variveis estudadas.............................................................................. 124 4.8.2. Anlise de regresso dos resultados obtidos na tenso superficial a partir das variveis estudadas........................................................................................ 127 4.8.3. Anlise de regresso dos resultados obtidos para o ndice de emulsificao a partir das variveis estudadas........................................................................... 130 4.8.4. Anlise de regresso dos resultados obtidos para o crescimento celular a partir das variveis estudadas.............................................................................. 132

4.9. ESTUDO DA TAXA DE AERAO PARA VALORES MENORES DO QUE O MNIMO UTILIZADO NO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL FATORIAL COMPLETO....................... 134 4.10. REPRODUTIBILIDADE DA FERMENTAO NAS MELHORES CONDIES EXPERIMENTAIS DEFINIDAS NO PCC E NO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL FATORIAL COMPLETO ................................................................................................................. 135 4.11. REGULAO E PROCESSO FERMENTATIVO DOS RAMINOLIPDEOS ..................... 136 4.12. ENSAIOS REALIZADOS PARA A PRODUO DE RAMINOSE UTILIZANDO COMO FONTE DE CARBONO LEO DE SOJA IN NATURA (OSN), LEO DE SOJA RESIDUAL PROVENIENTE DA FRITURA DE DIVERSOS ALIMENTOS (OSR) E LEO DE SOJA DE FRITURAS EM SEPARADO DE CARNES (OSRC), SALGADOS (OSRS) E BATATINHA (OSRB) ..................................................................................................................... 139 4.13. EXTRAO E PURIFICAO DE RAMINOLIPDEOS .............................................. 140 4.14. CINTICA E MODELAGEM DA PRODUO DE RAMINOSE, CRESCIMENTO CELULAR E CONSUMO DE NUTRIENTES ......................................................................................... 142 4.15. VALIDAO DO MODELO CINTICO REALIZADO EM REATOR DE 3 LITROS......... 145

CAPTULO 5. CONCLUSES .......................................................................... 147

CAPTULO 6. SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS...................... 149

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................ 150

i

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1. Estrutura geral de um triacilglicerol - R1, R2, R3 = grupo alquil saturado ou insaturado, podendo ser igual ou diferente (MORETTO & FETT, 1998). ................... 4 Figura 2.2. Oleaginosas predominantes para cada regio do pas (http://www.biodieselbrasil.com.br)................................................................................. 6 Figura 2.3. Complexo soja no Brasil em 2007 (http://www.abiove.com.br). .................. 6 Figura 2.4. Fluxograma da obteno do leo refinado (BATISTA et al., 1999). ............ 8 Figura 2.5. Ilustrao das foras atrativas intermoleculares de molculas na superfcie e no seio do lquido (BRADY & HUMISTON, 1981). .................................................... 13 Figura 2.6. Representao do efeito da concentrao de um surfactante na adsoro em superfcies (PORTER, 1994).......................................................................................... 14 Figura 2.7. Biossntese de raminolipdeos por Pseudomonas aeruginosa (OSHNER et al., 1996)......................................................................................................................... 21 Figura 2.8. Estrutura qumica da molcula de raminolipdeos (ABALOS et al, 2001). 21 Figura 2.9. Estrutura de trealoselipdeo produzido por Rhodococcus erythropolis (DESAI & BANAT, 1997)............................................................................................. 24 Figura 2.10. Estrutura do soforoselipdeo produzido por Torulopsis bombicola (DESAI & BANAT, 1997). .......................................................................................................... 24 Figura 2.11. Estrutura da surfactina produzida por Bacillus subtilis (DESAI & BANAT, 1997)............................................................................................................................... 26 Figura 2.12. Estrutura genrica de um fosfolipdeo (COOPER & ZAJIC, 1980).......... 27 Figura 2.13. Estrutura do Emulsan produzido por Acinetobacter calcoaceticus RAG1 (DESAI & BANAT, 1997)............................................................................................. 29 Figura 3.1. Foto das duas lagoas localizadas na Fazenda Rio das Pedras, mostrando a divisa do terminal de combustvel com a propriedade. .................................................. 57 Figura 3.2. Foto da lagoa mostrando a caneleta e o bocal de descarga do efluente na mesma............................................................................................................................. 58 Figura 4.1. Diagrama de Pareto, mostrando a contribuio das variveis estudadas para a produo de raminose. ................................................................................................. 80 Figura 4.2. Diagrama de Pareto mostrando a contribuio das variveis estudadas na reduo da tenso superficial.......................................................................................... 81 Figura 4.3. Diagrama de Pareto mostrando a contribuio das variveis estudadas para o ndice de emulsificao. ................................................................................................. 82 Figura 4.4. Diagrama de Pareto mostrando a contribuio das variveis estudadas para o crescimento celular. ........................................................................................................ 83 Figura 4.5. Diagrama de Pareto mostrando a contribuio das variveis estudadas para a produo de raminose..................................................................................................... 86 Figura 4.6. Diagrama de Pareto mostrando a contribuio das variveis estudadas na reduo da tenso superficial.......................................................................................... 87 Figura 4.7. Diagrama de Pareto mostrando a contribuio das variveis estudadas para o ndice de emulsificao. ................................................................................................. 88 Figura 4.8. Diagrama de Pareto mostrando a contribuio das variveis estudadas para o crescimento celular. ........................................................................................................ 89

ii

Figura 4.9. Distribuio dos resduos relativos sntese de raminose. .......................... 96 Figura 4.10. Valores preditos em funo dos observados relativos sntese de raminose......................................................................................................................................... 97 Figura 4.11. Superfcie de resposta para a sntese de raminose em funo da concentrao de leo de soja residual e nitrato de amnio............................................. 98 Figura 4.12. Curvas de contorno para a resposta raminose em funo da concentrao de leo de soja residual e nitrato de amnio. ...................................................................... 98 Figura 4.13. Superfcie de resposta para a sntese de raminose em funo da concentrao de leo de soja residual e levedura cervejeira residual............................. 99 Figura 4.14. Curva de contorno para a reposta raminose em funo da concentrao de leo de soja residual e resduo de cerveja....................................................................... 99 Figura 4.15. Superfcie de resposta para a sntese de raminose em funo da concentrao de nitrato de amnio e levedura cervejeira residual. .............................. 100 Figura 4.16. Curva de contorno para a resposta raminose em funo da concentrao de nitrato de amnio e levedura cervejeira residual. ......................................................... 100 Figura 4.17. Distribuio dos resduos relativos tenso superficial. ......................... 102 Figura 4.18. Valores preditos em funo dos observados relativos tenso superficial....................................................................................................................................... 102 Figura 4.19. Superfcie de resposta para a tenso superficial em funo da concentrao de leo de soja residual e nitrato de amnio................................................................. 103 Figura 4.20. Curva de contorno para a resposta tenso superficial em funo da concentrao de leo de soja residual e nitrato de amnio........................................... 104 Figura 4.21. Superfcie de resposta para a tenso superficial em funo da concentrao de leo de soja residual e resduo de levedura cervejeira............................................. 104 Figura 4.22. Curva de contorno para a resposta tenso superficial em funo da concentrao de leo de soja residual e resduo de cerveja.......................................... 105 Figura 4.23. Superfcie de resposta para a tenso superficial em funo da concentrao de nitrato de amnio e resduo de levedura cervejeira. ................................................ 105 Figura 4.24. Curva de contorno para a resposta tenso superficial em funo da concentrao de nitrato de amnio e resduo de cerveja. ............................................. 106 Figura 4.25. Distribuio dos resduos relativos ao ndice de emulso........................ 108 Figura 4.26. Valores preditos em funo dos observados relativos ao ndice de emulso....................................................................................................................................... 108 Figura 4.27. Superfcie de resposta para o ndice de emulso em funo da concentrao de leo de soja residual e nitrato de amnio................................................................. 109 Figura 4.28. Curva de contorno para a resposta ndice de emulso em funo da concentrao de leo de soja residual e nitrato de amnio........................................... 110 Figura 4.29. Superfcie de resposta para o ndice de emulso em funo da concentrao de leo de soja residual e resduo de cerveja................................................................ 110 Figura 4.31. Superfcie de resposta para o ndice de emulso em funo da concentrao de nitrato de amnio e resduo de cerveja. ................................................................... 112 Figura 4.32. Curva de contorno para a resposta ndice de emulso em funo da concentrao de nitrato de amnio e resduo de cerveja. ............................................. 112 Figura 4.33. Distribuio dos resduos relativos ao crescimento celular. .................... 114

iii

Figura 4.34. Valores preditos em funo dos observados relativos ao crescimento celular. .......................................................................................................................... 114 Figura 4.35. Superfcie de resposta para a biomassa em funo da concentrao de leo de soja residual e nitrato de amnio. ............................................................................ 116 Figura 4.36. Curvas de contorno para a resposta biomassa em funo da concentrao de leo de soja residual e nitrato de amnio................................................................. 116 Figura 4.37. Superfcie de resposta para a biomassa em funo da concentrao de leo de soja residual e resduo de cerveja. ........................................................................... 117 Figura 4.38. Curvas de contorno para a resposta biomassa em funo da concentrao de leo de soja residual e resduo de cereja.................................................................. 117 Figura 4.39. Superfcie de resposta para a biomassa em funo da concentrao de nitrato de amnio e resduo de cerveja. ........................................................................ 118 Figura 4.40. Curvas de contorno para a resposta biomassa em funo da concentrao de nitrato de amnio e resduo de cerveja. ................................................................... 118 Figura 4.41. Transferncia de oxignio em funo da taxa de aerao com velocidade de agitao de 550 rpm e taxas de aerao de 0,5, 1,0 e 1,5 vvm. .................................... 121 Figura 4.42. Superfcie de resposta da concentrao de raminose em funo da agitao e aerao para a produo de raminose. ....................................................................... 126 Figura 4.43. Curvas de contorno em funo da agitao e aerao para a produo de raminose. ...................................................................................................................... 126 Figura 4.44. Superfcie de resposta da tenso superficial em funo da agitao e aerao para a tenso superficial. ................................................................................. 129 Figura 4.45. Curvas de contorno em funo da agitao e aerao para tenso superficial. .................................................................................................................... 129 Figura 4.46. Superfcie de resposta do ndice de emulsificao em funo da agitao e aerao para o ndice de emulso. ................................................................................ 131 Figura 4.47. Curvas de contorno em funo da agitao e aerao para o ndice de emulso......................................................................................................................... 131 Figura 4.48. Superfcie de resposta da concentrao de biomassa em funo da agitao e aerao para a biomassa............................................................................................. 133 Figura 4.49. Curvas de contorno em funo da agitao e aerao para a biomassa. .. 134 Figura 4.50. Evoluo ao longo do tempo das concentraes de biomassa (), nitrato (), Fsforo total (S), Nitrognio Kjeldahl total (), e Raminose () durante o cultivo da Pseudomonas aeruginosa PALC em biorreator usando uma taxa de aerao 0,5 vvm e velocidade de agitao de 555 rpm. Os smbolos representam os resultados experimentais e as linhas, os dados resultantes do modelo cintico descrito pelas equaes de (3.11) a (3.15)........................................................................................... 143 Figura 4.51 - Evoluo ao longo do tempo das concentraes de biomassa (), nitrato (), Fsforo total (S), Nitrognio Kjeldahl total (), e Raminose () durante o cultivo da Pseudomonas aeruginosa PALC em biorreator (3 litros) usando um a taxa de aerao 0,5 vvm e velocidade de agitao de 555 rpm. Os smbolos representam os resultados experimentais e as linhas, os dados resultantes do modelo cintico descrito pelas equaes de (3.11) a (3.15)........................................................................................... 145

iv

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1. Porcentagem de cidos graxos nos diferentes leos vegetais (VIEIRA et al., 2005)................................................................................................................................. 5 Tabela 2.2. Principais grupos de surfactantes de origem natural e sinttica (NITSCHKE & PASTORE, 2002). ...................................................................................................... 19 Tabela 3.1. Composio bsica do resduo seco (100% Saccharomyces cerevisiae) .... 54 Tabela 3.2. Composio dos meios de cultura utilizados para o isolamento de microrganismos .............................................................................................................. 55 Tabela 3.3. Composio do meio de cultura utilizado para o crescimento dos microrganismos produtores de biossurfactantes............................................................. 56 Tabela 3.4. Composio do meio de cultura utilizado para a produo de biossurfactantes .............................................................................................................. 56 Tabela 3.5. Matriz do planejamento experimental a dois nveis .................................... 63 Tabela 3.6. Matriz de planejamento experimental (PCC) com trs variveis ................ 64 Tabela 3.7. Concentraes empregadas para cada varivel nos 16 experimentos do PCC........................................................................................................................................ 65 Tabela 3.8. Matriz do planejamento fatorial completo a trs nveis............................... 68 Tabela 4.1. Valores da tenso superficial aps cultivo dos microrganismos isolados em meio mineral (M1) acrescido de 1% de leo de soja residual, e respectivas percentagens de reduo da tenso superficial do meio....................................................................... 77 Tabela 4.2. Resultados mdios de produo de raminose, ndice de emulsificao, tenso superficial e crescimento celular obtidos durante a realizao dos Experimentos com Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 e P. aeruginosa PALR............................. 79 Tabela 4.3. Resultados mdios de produo de raminose, ndice de emulsificao, tenso superficial e crescimento celular obtidos durante a realizao dos Experimentos........................................................................................................................................ 85 Tabela 4.4. Resultados mdios de produo de raminose, ndice de emulsificao, tenso superficial e crescimento celular obtidos durante a realizao dos experimentos empregando a cultura isolada PALC.............................................................................. 93 Tabela 4.5. Resultados da regresso para a produo de raminose................................ 95 Tabela 4.6. Resultados da regresso para a tenso superficial ..................................... 101 Tabela 4.7. Resultados da regresso para o ndice de emulso .................................... 107 Tabela 4.8. Resultados da regresso para o crescimento celular.................................. 113 Tabela 4.9. Comparativo dos resultados obtidos no ponto central do planejamento (PCC) com os valores reais resultantes das concentraes das variveis independentes OSR, NA e LCR ........................................................................................................... 119 Tabela 4.10. Comparativo dos resultados de produo de raminose, tenso superficial, ndice de emulsificao e crescimento celular obtidos no PCC (ensaios 15 (C) e 16 (C)), com a sua respectiva reprodutibilidade (repetio) ...................................................... 120 Tabela 4.11. Variao dos valores de KLa em funo da taxa de aerao e velocidade de agitao em meio MPB ................................................................................................ 121

v

Tabela 4.12. Resultados mdios da sntese raminose, ndice de emulsificao, tenso superficial e crescimento celular a partir da variao do KLa aps 48 horas de fermentao .................................................................................................................. 122 Tabela 4.13. Resultados da regresso para a produo de raminose............................ 125 Tabela 4.14. Resultados da regresso para a tenso superficial ................................... 127 Tabela 4.15. Resultados da regresso para o ndice de emulsificao ......................... 130 Tabela 4.16. Resultados da regresso para o crescimento celular................................ 132 Tabela 4.17. Variao da sntese de raminose, tenso superficial, ndice de emulsificao e biomassa em funo da aerao.......................................................... 135 Tabela 4.18. Resultados mdios de produo de raminose, ndice de emulsificao, tenso superficial e crescimento celular obtidos durante a realizao do experimento utilizando as melhores condies obtidas nos dois ltimos planejamentos experimentais...................................................................................................................................... 136 Tabela 4.19. Resultados mdios de produo de raminose, ndice de emulsificao, tenso superficial e biomassa obtida durante a realizao do experimento utilizando as melhores condies obtidas nos dois ltimos planejamentos experimentais, sem a presena do leo de soja residual ................................................................................. 137 Tabela 4.20. Resultados mdios de produo de raminose, ndice de emulsificao, tenso superficial e biomassa obtida durante a realizao do experimento utilizando as melhores condies obtidas nos dois ltimos planejamentos experimentais, sem a presena dos sais inorgnicos ....................................................................................... 138 Tabela 4.21. Resultados obtidos para a sntese de raminose, tenso superficial e ndice de emulso utilizando como fonte de carbono OSN, OSR, e oriundos de frituras em separado OSRC, OSRS e OSRB. ................................................................................. 139 Tabela 4.22. Resultados de produo de raminolipdeos, ndice de emulsificao e tenso superficial obtidos a partir da extrao orgnica e coluna de adsoro do meio fermentado aps 48 horas de processo ......................................................................... 141 Tabela 4.23. Valores dos parmetros obtidos pelo ajuste paramtrico ........................ 144 Tabela 4.24. Comparao dos rendimentos experimental (Yexp), e rendimento dado pelo Modelo (Ymod) para a converso de nitrognio Kjeldahl total, fsforo total, e nitrato em biomassa (X) ............................................................................................... 144

vi

LISTA DE SMBOLOS

0 valor mdio da resposta;

a,b, c,....p constantes ou parmetro da equao;

C concentrao de oxignio dissolvido no instante t (mmol/L)

C* concentrao de oxignio dissolvido na saturao (mmol/L).

CC crescimento celular

IE ndice de emulsificao, %

KLa coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio

LCR levedura cervejeira residual

MPB meio de produo de biossurfactante

NA concentrao de nitrato de amnio, g/L

OSN leo de soja in natura

OSR leo de soja residual

OSRB leo de soja residual usado somente na fritura batatas

OSRC leo de soja residual usado somente na fritura de carnes

OSRS leo de soja residual usado somente na fritura de salgados

PALC Pseudomonas aeruginosa isolada de lagoa contaminada)

PARL Pseudomonas aeruginosa isolada de Landfarming Reduc

PCC planejamento composto central

resduo de estimao

RM produo de raminose, g/L

RPM rotao por minuto

TS tenso superficial, dina/cm

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velocidade especfica de crescimento, 1/h

VVM volume de ar por volume de mosto

X0 concentrao inicial de clulas, g/L

Xf concentrao final de clulas, g/L

expY resultado experimental

tY resultado terico

consumo de nitrognio, g Nt/g biomassa/h consumo de nitrato, g NO3-/g biomassa/h

consumo de fsforo, g Pt/g biomassa/h

rendimento de raminolipdeos, g Ram/g biomassa/h

viii

RESUMO

Este trabalho tem como objetivo investigar a produo de biossurfactante empregando culturas de Pseudomonas aeruginosa utilizando como fonte de carbono leos de soja residual proveniente da fritura de diversos alimentos. Nos primeiros ensaios foram empregados a Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Pseudomonas aeruginosa isolada do Landfarming REDUC (PALR) e a Pseudomonas aeruginosa PALC, isolada de solo de uma lagoa contaminada com hidrocarbonetos. Para selecionar a Pseudomonas e avaliar os resultados dos ensaios foi utilizado um planejamento fatorial a dois nveis, estudando como variveis a linhagem de microrganismo, as concentraes de leo de soja residual (OSR), de nitrato de amnio (NA) e de levedura cervejeira residual (LCR). Os experimentos foram realizados em Erlenmeyers de 500 mL de capacidade contendo 50 mL do meio de produo, a 170 rpm e temperatura de 30 1C durante 48 h de fermentao. A produo de biossurfactante foi monitorada pelas determinaes da tenso superficial (TS), da concentrao de raminose (RM) produzida e da atividade emulsificante (IE). As P. aeruginosa PALR, ATCC 9027 e a PALC foram capazes de reduzir a tenso superficial do meio de 62 dina/cm 1 para 33,9; 28 e 26 dina/cm, produzir em g/L 0,25; 0,77 e 1,39 de raminose, com ndice de emulso de 60, 100 e 100%, respectivamente. Os resultados obtidos nestes planejamentos experimentais demonstraram que a Pseudomonas aeruginosa isolada PALC apresentou maior potencial para produzir biossurfactante, sendo, portanto, selecionada para os demais experimentos realizados neste estudo. A otimizao das concentraes do OSR, NA e da LCR foram obtidas a partir de um planejamento de experimento composto central (PCC) e seus resultados analisados pelas superfcies de resposta. Os melhores resultados do planejamento foram encontrados no ponto central, correspondendo a 22 g/L de OSR, 5,625 g/L de NA e 11,5 g/L de LCR. A maior concentrao obtida de raminose aps 48 horas de fermentao, foi 2,3 g/L com ndice de emulso de 100%. A partir do melhor resultado obtido no PCC, determinou-se, utilizando um bioreator, as melhores condies de taxa de aerao (vvm) e velocidade de agitao (rpm) empregando um planejamento fatorial completo. Nas condies otimizadas, de 0,5 vvm (KLa de 10,2 h-1) e velocidade de agitao de 550 rpm, foram obtidos a tenso superficial de 26,0 dina/cm e sntese de raminose de 3,26 g/L. A partir das condies otimizadas, a produo de biossurfactante proveniente da mistura de leo de soja residual foi comparada com leo de soja in natura (OSN) e leo de soja residual usado na fritura em separado de carnes (OSRC), salgados (OSRS) e batatas (OSRB). Finalmente foi feito um estudo cintico, visando determinar um modelo que representasse os dados experimentais de produo de raminose e de consumo de nutrientes. Aps recuperao e purificao do biossurfactante a concentrao de raminose aumentou em 80% no produto final, ou seja, 6,8 g/L. PALAVRAS-CHAVE: biossurfactantes, glicolipdeos, Pseudomonas aeruginosa, raminolipdeos.

ix

ABSTRACT

This work has as objective to investigate the production of biosurfactant employing strain of Pseudomonas aeruginosa using as source of carbon residual soybean oil from several foods frying. In the first assay the Pseudomonas aeruginosa were used ATCC 9027, isolated Pseudomonas aeruginosa from Landfarming REDUC (PALR) and a Pseudomonas aeruginosa PACL strain, isolated from a lagoon hydrocarbon-contaminated soil. To evaluate the results of the assay a two levels complete factorial experimental design was used, studying as variables the microorganism strain, the concentrations of residual soybean oil (OSR), the concentrations of nitrate of ammonium (AN) and brewery residual yeast (YRB). The experiments were performed in 500-mL Erlenmeyer flasks containing 50 mL of production medium, at 170 rpm and 301C, for a 48-hour fermentation period. Biosurfactant production has been monitored by measurements of rhamnose concentration (RM), surface tension (TS) and emulsifying activity (IE). The P. aeruginosa PALR, ATCC 9027 and the PALC were capable to reduce the superficial tension of the initial medium of 61 1dynes/cm for 33,9; 28 e 26 dynes/cm, to produce g/L 0,25; 0,77 e 1,39 of rhamnose, with emulsification index of 60, 100 and 100%, respectively. The results obtained by experimental design proved that isolated Pseudomonas aeruginosa PALC presented potential greater to produce biossurfactante, being, therefore, selected for the other experiments carried out in at study. The optimization of OSR, AN, and RBY was accomplished by a central composite design (CCD) and their results analyzed by surface response analysis. The best planned results, was located on the central point, have corresponded to 22 g/L of RSO, 5.625 g/L of AN, and 11.5 g/L of RBY. The greater obtained concentration of rhamnose after 48 hours of fermentation, was 2,3 g/L with emulsifying activity of 100%. Employed the best result obtained in PCC, was determined, using a bioreactor, the best conditions of aeration rate (vvm) and agitation speed (rpm) using a complete factorial experimental design. In the optimized conditions, of 0,5 vvm (KLa of 10,2 h-1) and speed of agitation of 550 rpm, were obtained the superficial tension of 26,0 dyne/cm and synthesis of rhamnose of 3,26 g/L. Under the optimized conditions, the biosurfactant production from a mixture of waste frying soybean oil was compared with non used soybean oil (NUSO) and waste soybean oils used to fry in separate meats (MFSO), salty (SAFSO), and potatoes (POFSO). Finally was made a kinetic study, seeking to determine a model to represent the experimental data of rhamnose production and the nutrients consumption. After recovery and purification of the biosurfactant the rhamnose concentration increased in 80% in the final product, that is, 6,8 g/L. KEYWORDS: biosurfactants, glycolipids, Pseudomonas aeruginosa, rhamnolipids.

CAPTULO 1. INTRODUO

Os surfactantes so molculas que apresentam grupos hidroflicos e hidrofbicos

e agem em interfaces entre fases fluidas com diferentes graus de polaridade (leo/gua).

A formao de um filme molecular, ordenado nas interfaces, reduz as tenses interfacial

e superficial. Estas propriedades tornam os surfactantes adequados para uma ampla

gama de aplicaes industriais envolvendo: detergncia, emulsificao, lubrificao,

capacidade espumante, molhabilidade, solubilizao e disperso de fases (URUM &

PEKDEMIR, 2004).

Os biossurfactantes so substncias de origem microbiana que apresentam alta

atividade superficial e interfacial. So produzidos por biotransformao de matrias-

primas renovveis, apresentando baixos impactos ambientais e vantagem seria melhor

em relao aos detergentes qumicos convencionais (BANAT et al., 2002; KIM et al.,

2000). Entre as vantagens e caractersticas, os biossurfactantes apresentam

termoestabilidade, tolerncia fora inica, biodegradabilidade e baixa toxicidade

(MULLIGAN et al, 1989).

Nos pases industrializados h uma tendncia para a substituio dos

surfactantes sintticos pelos naturais. Esta tendncia movida pela necessidade de

aplicao de bioprodutos, substituindo compostos no biodegradveis (alquil benzenos

ramificados) (NITSCHKE & PASTORE, 2002).

Os biossurfactantes podem ser aplicados em reas como agricultura, para a

formulao de pesticidas e herbicidas; na indstria alimentcia, bem como aditivos em

condimentos; nas indstrias farmacuticas, txtil, cosmtica; e petrolfera, onde so

amplamente utilizados para a recuperao secundria do petrleo, como na remoo de

resduos de leo e biorremediao (RON & ROSENBERG, 2002).

Alguns biossurfactantes tm propriedades antimicrobianas, resultando na

destruio de microrganismos pela lise de suas membranas celulares. No microambiente

esta propriedade importante para evitar competio com outros microrganismos pelo

alimento (SANDRIN et al., 1990; THIMON et al., 1991).

Ao considerar as potencialidades de aplicao dos biossurfactantes, deve-se

lembrar que estas macromolculas so produzidas por uma grande variedade de

microrganismos e que possuem diferentes estruturas qumicas e propriedades de

superfcie. O tipo e a quantidade de biossurfactante produzido dependem primeiramente

do tipo de microrganismo produtor e de fatores como fontes de carbono e nitrognio

1

Captulo 1. Introduo

concentrao de nutrientes, elementos traos, agitao, aerao e outros fatores que

podem influenciar na produo destes compostos por microrganismos (FRANCY et al.,

1991).

Os glicolipdeos so os surfactantes microbianos mais conhecidos e, dentre

estes, os raminolipdeos esto entre os mais bem estudados. Biossurfactantes

raminolipdicos produzidos por Pseudomonas aeruginosa so formados por uma ou

duas raminoses ligadas a uma ou duas molculas de cido graxo, com a cadeia alquila,

saturada ou insaturada, entre C8 e C12 (RENDELL et al.1980). Dependendo da

combinao entre as molculas de raminose e o tipo de cadeia hidrocarbonada,

possvel a obteno de diferentes homlogos (LANG & WAGNER, 1998).

A dificuldade em encontrar o balano correto dos componentes empregados no

processo fermentativo, a otimizao das condies operacionais desse processo, assim

como os aditivos necessrios otimizao, quer do crescimento microbiano, quer da

produo de tensoativos, tem estimulado a pesquisa da produo de biossurfactante.

A economia outro grande desafio nos processos biotecnolgicos,

especialmente para a produo de biossurfactantes. O sucesso para a produo de

biossurfactante depende do desenvolvimento de processos mais baratos e a utilizao de

matria prima de baixo custo, as quais, no devem ultrapassar 10 a 30% os custos do

produto final (CAMEOTRA & MAKKAR, 1998).

A maior parte dos relatos encontrados na literatura sobre a utilizao de

produtos ou subprodutos agroindustriais, est relacionada a produtos puros como

carboidratos e leos vegetais. No entanto, pouco tem sido publicado sobre a utilizao

dos resduos hidrofbicos como substratos gerados de frituras de alimentos provenientes

de leos vegetais (BENICASA, 2002).

A soja atualmente a mais importante oleaginosa produzida no Brasil cuja

produo em 2006/07 foi estimada em 55 milhes de toneladas

(http://www.abiove.com.br).

No comrcio exterior o complexo soja: produo de gros, de farelo e refino de

leo vegetal movimenta mais de 5 bilhes de dlares

(www.eq.ufrj.br/posgraduacao/aulas/suely/2006/aula2_oleaginosas.ppt).

Um levantamento primrio da oferta de leos residuais de frituras, suscetveis de

serem coletados (produo > 100 kg ao ms), revela um valor da oferta brasileira

superior a 30.000 toneladas anuais (PARENTE, 2003).

2

Captulo 1. Introduo

Assim, a proposta desse trabalho foi estudar a produo por fermentao de

biossurfactante empregando como substrato leo de soja utilizado na fritura de diversos

alimentos, em meio com a mnima quantidade de sais minerais e como fator de

crescimento levedura cervejeira industrial autolizada. Neste estudo foram utilizadas

duas culturas isoladas e identificadas como Pseudomonas aeruginosa e uma de

linhagem conhecida (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027).

Como objetivos especficos para o desenvolvimento do trabalho pode-se citar:

Isolar e selecionar, linhagens de Pseudomonas aeruginosa para a produo de biossurfactante;

Otimizar as condies operacionais do processo fermentativo empregando como variveis independentes a concentrao de leo de soja residual, de nitrato de

amnio e de levedura cervejeira residual, em frascos agitados;

Otimizar as melhores condies operacionais em relao ao nvel de agitao e aerao em biorreator;

Comparar a produo de raminolipdeos utilizando como fonte de carbono leos de soja residuais, provenientes da fritura de distintos alimentos, e in natura;

Realizar a extrao e a purificao dos raminolipdeos obtidos; Construir um modelo para descrever o comportamento cintico da produo de

raminose, os consumos de fsforo, nitrato e nitrognio totais, em funo do

crescimento celular.

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CAPTULO 2. REVISO BIBLIOGRFICA

2.1. leos e gorduras

Os leos e gorduras so substncias insolveis em gua (hidrofbicas), de

origem animal ou vegetal, formado predominantemente por steres de triacilgliceris,

produtos resultantes da esterificao entre o glicerol e cidos graxos. Os triacilgliceris

(Figura 2.1) so compostos insolveis em gua e a temperatura ambiente, possuem uma

consistncia de lquido para slido (MORETTO & FETT, 1998).

Segundo a resoluo n 20/77 do CNNPA (Conselho Nacional de Normas e

Padres para Alimentos) a diferena entre leos e gorduras, o estado fsico em que se

encontram abaixo da temperatura de 20C (http://e-legis.anvisa.gov.br/leisref/public).

Quando o estado slido em uma temperatura de at 20C classificado como

gordura. As gorduras encontram-se no estado slido pela constituio qumica dos

cidos graxos formadores dos triglicerdeos que so saturados, isto , no apresentam

duplas ligaes, resultando em estruturas lineares aumentando a superfcie de contato

entre as molculas favorecendo uma maior interao intermolecular, denominada fora

de Van der Waals, aumentando o ponto de fuso que a temperatura da passagem do

estado slido para o lquido (MITTELBACH, 1992)

Alm de triacilgliceris, os leos contm vrios componentes em menor

proporo, como mono e diglicerdeos (importantes como emulsionantes); cidos

graxos livres; tocoferol (importante antioxidante); protenas, esteris e vitaminas

(FARIA et al., 2002; HIDALGO et al., 2001).

Figura 2.1. Estrutura geral de um triacilglicerol - R1, R2, R3 = grupo alquil saturado ou

insaturado, podendo ser igual ou diferente (MORETTO & FETT, 1998).

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Captulo 2. Reviso Bibliogrfica

2.2. leo de soja vegetal

A maior parte do leo de soja composto por gordura insaturada. cidos graxos

poliinsaturados (cido linolnico e linolico), monoinsaturados (cido olico) e

saturados (cido palmtico e esterico) correspondem, em mdia, a 61%, 25% e 15%,

respectivamente. O cido linolnico (componente da frao poliinsaturada do leo), que

corresponde, em mdia, a 7% da composio do leo, um cido graxo mega-3. A

soja uma das poucas fontes vegetais de cidos graxos mega-3. cidos graxos mega-

3 so nutrientes essenciais para crianas e podem ajudar a reduzir os riscos tanto de

doenas do corao quanto de cncer (GREAVES et al., 2000).

cidos graxos so cidos carboxlicos alifticos de cadeias longas, encontrados

em gorduras e leos naturais. Estes cidos podem ou no apresentar ligaes duplas

entre as molculas de carbono, sendo classificados como saturados (sem ligao dupla)

com 4 a 24 unidades de carbono na cadeia ou insaturados (ligaes duplas) com 10 a 30

carbonos e com 1 a 6 ligaes duplas na cadeia. Por sua vez, os cidos graxos saturados

podem ser monoinsaturados (apenas uma ligao dupla) ou poliinsaturados (mais de

uma ligao dupla). Tambm existem cidos com cadeias ramificadas, cclicas,

cetnicas, hidroxiladas e epoxiladas. (MOTH & CORREIA, 2005).

A Tabela 2.1 apresenta a diferena nas propriedades dos diversos leos vegetais

referentes composio em cidos graxos.

Tabela 2.1. Porcentagem de cidos graxos nos diferentes leos vegetais (VIEIRA et al.,

2005).

cido Graxo Soja Algodo Milho Oliva Mirstico 0,1 1,0 0 0,1 Palmtico 10,5 25,0 11,5 16,9 Esterico 3,2 2,8 2,2 3,9 Olico 22,3 17,1 26,6 63 Linolico 54,5 52,7 58,7 14,8 Linolnico 8,3 0 0,8 0,9 Eicosanico 0,2 0 0,2 0 Eicosenico 0,9 0 0 0,4

A grande dimenso territorial brasileira possibilita o cultivo de uma enorme

variedade de oleaginosas (soja, algodo, mamona, girassol e outras). Cada variedade

adapta-se em diferentes regies do pas, conforme mostra a Figura 2.2.

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Figura 2.2. Oleaginosas predominantes para cada regio do pas

(http://www.biodieselbrasil.com.br).

2.3. Indstria de leos vegetais

A soja atualmente a mais importante oleaginosa produzida no Brasil cuja

produo para a safra 2006/07 (fevereiro a janeiro) estima-se entorno de 55,2 milhes

de toneladas de gros. A Figura 2.3 apresenta a distribuio do complexo soja no Brasil

(http://www.abiove.com.br).

Figura 2.3. Complexo soja no Brasil em 2007 (http://www.abiove.com.br).

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A obteno do leo vegetal bruto feita por meio de mtodos fsicos e qumicos

a partir das sementes de oleaginosas usando-se um solvente como extrator e prensagem

(GONALVES et al., 2002; MORETTO & FETT, 1998; MORETTO et al., 2002).

Nesta fase, o leo vegetal contm impurezas como cidos graxos livres,

pigmentos, tocoferis, fosfatdeos, graxas, protenas, acares, gomas, pesticidas,

micotoxinas, metais e outros, e necessitam de processos de refino para remover essas

impurezas, prejudiciais qualidade e estabilidade do produto, pelos processos de refino

que envolve a remoo do solvente, a degomagem, o branqueamento, a desacidificao

e a desodorizao (BATISTA et al., 1999).

Porm, a retirada total dessas impurezas crtica e causa efeitos indesejveis,

como menor ponto de fumaa do leo pela presena de cidos graxos livres, efeito pro-

oxidante do metal e precipitao e escurecimento do leo pelos fosfatdeos. Alm dos

problemas relacionados com os processos de refino do leo, dietas ricas em gorduras

com altos nveis de cidos graxos saturados, contribuem para o aumento de doenas

cardiovasculares devido elevao dos nveis de colesterol no sangue (HARTMAN et

al, 1996).

Dos resduos da extrao, torta, no caso da prensagem, farelo, no caso de

extrao por solvente, menos de 20 % so usados para alimentao humana. Geralmente

so usados para a preparao de raes para animais.

A Figura 2.4 representa o fluxograma do processo de refinao de leos

vegetais

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Figura 2.4. Fluxograma da obteno do leo refinado (BATISTA et al., 1999).

A maior parte dos leos e gorduras produzidos no mundo so usados na indstria

de alimentos, gerando grandes quantidades de resduos. Os chamados leos vegetais so

geralmente leos de soja, sendo o de cozinha mais conhecido (LANG &

WULLBRANDT, 1999).

Hoje no Brasil, parte do leo vegetal residual do consumo humano destinada

fabricao de sabes ou de raes para animais, entretanto, a maior parte descartado

na rede de esgotos, um crime ambiental inadmissvel. A pequena solubilidade dos leos

vegetais na gua constitui um fator negativo no que se refere sua degradao em

unidades de tratamento de despejos por processos biolgicos e, quando presentes em

mananciais utilizados para abastecimento pblico, causam problemas no tratamento da

gua (MITTELBACH & TRITTHART, 1988).

A presena deste material, alm de acarretar problemas de origem esttica,

diminui a rea de contato entre a superfcie da gua e o ar atmosfrico impedindo a

transferncia do oxignio da atmosfera para a gua, e tambm os leos e graxas em seu

processo de decomposio, reduzem o oxignio dissolvido elevando a DBO (Demanda

8


Bioqumica de Oxignio), causando alterao no ecossistema aqutico

(www.biodieselbrasil.com.br).

Segundo Mittelbach (1992), as possveis fontes dos leos e gorduras residuais

podem ser encontrados em diferentes locais como:

1. As lanchonetes e nas cozinhas industriais, comerciais e domsticas, onde so

praticadas as frituras de alimentos;

2. Nas indstrias as quais processam frituras de produtos alimentcios, como

amndoas, tubrculos, salgadinhos, e vrias outras modalidades de petiscos;

3. Nos esgotos municipais onde a nata sobrenadante rica em matria graxa,

possvel de se extrarem leos e gorduras;

4. Em guas residuais de processos de certas indstrias alimentcias, como as

indstrias de pescados, de couro, etc.

Na Alemanha, por exemplo, eram coletados em torno de 3,8 a 5,0 x 105

toneladas de leos e gorduras por ano (ANGGRAINI, 1999). Na ustria, consumia-se

anualmente uma mdia de 120.000 toneladas de leos e gorduras, sendo cerca de 50%

utilizados na fritura de alimentos. Estima-se que um total de 3,7 x 104 toneladas foram

coletadas (MITTELBACH, 1992; MITTELBACH, 2000).

A reutilizao de leos vegetais residuais de processos de frituras de alimentos

tem se mostrado atraente para a produo de biossurfactante, pois, o reaproveitamento

do leo vegetal como fonte de carbono para as transformaes microbianas aps a sua

utilizao na cadeia alimentar resulta numa destinao alternativa a um resduo da

produo de alimentos (MIELKE, 1992).

De acordo com Kosaric et al (1984), muitos substratos alternativos tm sido

sugeridos para a produo de biossurfactantes, especialmente resduos de guas

miscveis: melados, soro de leite ou resduos destilados.

A maior parte dos relatos encontrados na literatura sobre a utilizao de produtos

ou subprodutos agroindustriais, est relacionada a produtos puros como carboidratos e

leos vegetais. No entanto, pouco tem sido publicado sobre a utilizao dos resduos

hidrofbicos como substratos gerados de frituras de alimentos provenientes de leos

vegetais (BENICASA, 2002).

A economia freqentemente o grande desafio nos processos biotecnolgicos,

especialmente para a produo de biossurfactantes. O sucesso para a produo de

biossurfactante depende do desenvolvimento de processos mais baratos e a utilizao de

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matria prima de baixo custo, as quais, no devem ultrapassar 10 a 30% os custos do

produto final (CAMEOTRA & MAKKAR, 1998).

2.4. Levedura residual de cervejaria

A biomassa de levedura (Saccharomyces sp.) tem sido produzida no Brasil no

setor sucro-alcooleiro, com uma produo anual de cerca de 240 mil ton/ano, como

subproduto da produo de etanol (FURCO, 1996); no setor de panificao, com uma

produo brasileira de cerca de 120 mil ton/ano e no setor cervejeiro, contribuindo com

cerca de 3500 ton/ano (PEIXOTO, 1996).

Nas cervejarias, ao final do processo de fermentao, remove-se a levedura do

mosto fermentado e prepara-se com estas uma nova inoculao, para a prxima

batelada. No entanto, como durante o processo de fermentao ocorre a multiplicao

do levedo, gera-se um excedente deste material a cada batelada, que necessita de um

destino adequado. Adicionalmente, a reutilizao das clulas ocorre no mximo por

cinco ciclos, isto , enquanto no houver reduo da viabilidade celular em nveis que

levem baixa rentabilidade do processo fermentativo. Nesta fase, todas as clulas

presentes no reator so descartadas (PINHEIRO-ROBERG, 2000).

Em geral, dado o valor nutricional da biomassa, as cervejarias vendem-na para as

indstrias de raes e alimentos. As clulas de levedura, inativadas termicamente ou no,

podem ser usadas diretamente como clulas ntegras de levedura ou ser processadas

para obteno de vrios derivados. As clulas ntegras so usadas principalmente na

alimentao animal, enquanto certos derivados, como o autolisado e o extrato de

levedura, vm sendo utilizados na formulao de produtos para consumo humano, ou

como complemento nutritivo e aromatizante e potencializador de sabor (CABRAL

FILHO, 1999).

As clulas de levedura apresentam alto teor protico, entre 30 a 70%, e so ricas

em vitaminas, particularmente do complexo B (B1, B2, B6, cido pantotnico, niacina,

cido flico e biotina), e em minerais essenciais, macro e microelementos,

particularmente selnio e fibra diettica, representados por carboidratos da parede

celular, principalmente mananas e glicanas (HALSZ & LSZTITY, 1991). O valor

nutritivo das protenas considerado bom, correspondendo a 70 - 85% do valor da

casena (CABALLERO-CRDOBA et al., 1997). No entanto, apresenta baixos nveis

de aminocidos sulfurados, metionina e cisteina (KINSELLA & SHETTY, 1978,

10


VANANUVAT, 1977, WALSIEN, 1975). Outros problemas restritivos ao uso de

leveduras na alimentao humana e de animais monogstricos em geral est relacionado

com a rigidez da sua parede celular e ao elevado teor de cidos nuclicos,

particularmente RNA, (WALSIEN et al., 1970, SHETTY & KINSELLA, 1982). Tem-

se que a ingesto de clulas de leveduras secas, acima de 30 g, ou cidos nuclicos

acima de 2 g por dia, pode elevar a concentrao de cido rico no sangue, resultando

em clculos renais e/ou gota, em humanos (WALSIEN et al., 1970).

Ademais, nem sempre a procura atende a quantidade de rejeito gerado, o que

acarreta em grande acmulo.

Por outro lado, considerando o volume gerado e o alto teor orgnico da levedura

(120.000 a 140.000 mg DBO/L), o descarte da biomassa cervejeira s pode ser efetuado

aps um adequado tratamento, o que representa um nus considervel para a cervejaria.

Por isso, de interesse desenvolver tecnologias que permitam obter produtos de alto

valor agregado a partir deste rejeito cervejeiro (FURCO, 1996).

No Brasil, o resduo cervejeiro comercializado na forma mida e, que

normalmente estocado por perodos de 20 a 30 dias. A elevada quantidade de gua no

resduo mido pode resultar em outros fatores limitantes como a dificuldade no

transporte a longas distncias, dificuldades no armazenamento, ataque de

microrganismos, principalmente fungos. Uma das prticas adotadas, na maioria das

vezes, a adio de sal comum (NaCl) na tentativa de minimizar o ataque de

microrganismos. Outra possibilidade praticada em muitos pases a desidratao parcial

do resduo que minimiza os problemas de contaminao. Entretanto, o processo para

secagem representa um custo adicional (SGARBIERI et al, 1999).

2.5. Surfactantes

Os surfactantes constituem uma classe importante de compostos qumicos

amplamente utilizados em diversos setores industriais (NISTCHKE & PASTORE,

2002). De fato, o mercado mundial de surfactantes movimenta, anualmente, cerca de 9,4

bilhes de dlares, com estimativa de crescimento de 35% ao ano (KIM et al., 2000).

Os surfactantes so molculas anfipticas, constitudas de uma frao polar ou

hidroflica e uma frao apolar ou hidrofbica (TADROS, 1987; GEORGIOU et al.,

1992). A poro apolar freqentemente formada por hidrocarbonetos de cadeias

alifticas, grupos aromticos ou policclicos. Esta parte da molcula tem uma baixa

11


solubilidade em gua devido ao efeito hidrofbico, provocado no tanto pela atrao

entre grupos apolares, mas principalmente pela dificuldade em romper as fortes

interaes entre as molculas de gua (HELENIUS & SIMONS, 1975;

LICHTENBERG et al., 1983).

A poro polar pode ser inica (aninica ou catinica), no-inica ou

anfotrica. Alguns exemplos de surfactantes inicos utilizados comercialmente incluem

steres sulfatados ou sulfatos de cidos graxos (aninicos) e sais de amnio quaternrio

(catinicos) (DESAI & BANAT, 1997; NISTCHKE & PASTORE, 2002).

Em funo da presena de grupos hidroflicos e hidrofbicos na mesma

molcula, os surfactantes tendem a se distribuir nas interfaces entre fases fluidas com

diferentes graus de polaridade (leo/gua e gua/leo). Essas propriedades conferem aos

surfactantes a capacidade de reduzir a tenso interfacial e a tenso superficial atravs da

formao de um filme molecular entre duas fases no miscveis. Esses compostos

podem ainda formar emulses estveis de hidrocarbonetos em gua ou de gua em

hidrocarbonetos. Alm da atividade emulsificante, o uso dos surfactantes garantido

por outras propriedades, tais como: formao de micelas, formao de macro e

microemulses, adsoro, disperso ou agregao de slidos, ao espumante ou anti-

espumante, solubilidade, solubilizao, molhabilidade ou detergncia (PORTER, 1994;

DESAI & BANAT, 1997; NISTCHKE & PASTORE, 2002).

A solubilidade dos surfactantes responsvel por sua adsoro superfcie de

lquidos e a formao de micelas, que por sua vez propicia a reduo da viscosidade e

solubilizao de compostos no meio. Por outro lado, a adsoro dos surfactantes resulta

em molhabilidade, emulsificao, formao de espumas, disperso de partculas e

detergncia. Estas propriedades permitem que os surfactantes possam ter uma ampla

aplicao nos mais diferentes setores industriais (DESAI & BANAT, 1997; NISTCHKE

& PASTORE, 2002).

A principal caracterstica de um agente tensoativo a de formar concentraes

diferenciadas quando em soluo, sendo a concentrao do surfactante na superfcie

muito maior do que no seio do lquido (PORTER, 1994). No interior do lquido as

molculas so atradas igualmente em todas as direes, sendo a distncia mdia entre

elas resultante do balano entre foras atrativas, que possibilitam a aproximao das

molculas, e foras repulsivas, que impedem que duas molculas ocupem o mesmo

espao, conforme observado na Figura 2.5. Por outro lado, as molculas na superfcie

livre do lquido apresentam foras diferenciadas resultando em um comportamento

12


distinto. Neste caso, as molculas praticamente no apresentam foras atrativas dirigidas

para fora do lquido, conseqentemente sendo atradas em direo ao seio do lquido.

Do mesmo modo, num sistema constitudo por dois lquidos imiscveis, tem-se que as

molculas presentes na interface sofrem foras de atrao para o lquido de maior

densidade (BRADY & HUMISTON, 1981).

Figura 2.5. Ilustrao das foras atrativas intermoleculares de molculas na superfcie e

no seio do lquido (BRADY & HUMISTON, 1981).

A intensidade de adsoro de um surfactante a uma superfcie depende da sua

concentrao. Conforme ilustrado na Figura 2.6, concentraes crescentes do

surfactante ocasionam variao na ordenao das molculas deste composto sobre

superfcies. Em concentraes muito baixas de surfactante, as molculas se distribuem

na superfcie e tendem a se orientar paralelamente a esta. Com o aumento da

concentrao do surfactante, diminui a rea disponvel para as molculas e, por

conseguinte, tem incio uma ligeira ordenao das mesmas em relao superfcie. A

orientao das molculas depende, sobretudo, da natureza hidroflica/hidrofbica da

superfcie. Numa determinada concentrao, denominada concentrao micelar crtica

(CMC), a quantidade disponvel de molculas do surfactante propicia a formao de

uma nica camada unidirecional (LUCAS, 1988).

As micelas so definidas como agregados moleculares, com regies estruturais

hidroflicas e hidrofbicas, que dinmica e espontaneamente se associam em meio

aquoso, a partir de uma determinada concentrao crtica (CMC - concentrao micelar

crtica), formando grandes agregados moleculares de dimenses coloidais. Abaixo da

CMC, o tensoativo est predominantemente na forma monomrica (HINZEL, 1979). As

13


micelas so termodinamicamente estveis, mas so destrudas pela diluio com gua,

quando a concentrao do tensoativo fica abaixo da CMC (PELIZZETI, 1987).

Figura 2.6. Representao do efeito da concentrao de um surfactante na adsoro em

superfcies (PORTER, 1994).

Segundo Rosen (1989), pequenas quantidades de material orgnico podem

produzir mudanas significativas na CMC, em meio aquoso. Estas impurezas, que

podem estar presentes na forma de subprodutos da manufatura de surfactantes, podem

causar diferenas expressivas entre compostos comerciais supostamente similares.

Desta forma, estudar os efeitos produzidos por estes materiais na CMC de grande

importncia. Segundo o autor, h duas classes de materiais que afetam as concentraes

micelares crticas: classe 1, por incorporao na micela; classe 2, pela modificao das

interaes solvente-micela ou solvente-surfactante.

A tenso superficial de um lquido pode ser definida como a quantidade de

trabalho (fora por unidade de comprimento) necessria para expandir o filme na

superfcie lquido-gs. Esta quantidade de trabalho dependente da intensidade das

foras das molculas dirigidas para o interior do lquido. A tenso superficial tambm

depende da temperatura do lquido, j que um aumento da temperatura, que propicia um

aumento da energia cintica das molculas individualmente, reduz as foras atrativas

intermoleculares. Como conseqncia, tem-se um decrscimo da tenso superficial com

Concentrao H2O/Superfcie

Hidrofbica

H2O/Superfcie

Hidroflica

Muito Baixa

Baixa

CMC

Acima da CMC

14


o aumento da temperatura (BRADY & HUMISTON, 1981). A mesma explanao

atribuda para tenso interfacial que, no entanto, representa interao entre lquidos.

Estudos realizados por Parra et al. (1989) demonstraram a dependncia dos

valores de atividade superficial de biossurfactante com relao ao pH do meio aquoso.

Os experimentos demonstraram que em pH 3,0, a CMC diminuiu para 5,5 ppm,

enquanto que no pH 7,0, o valor foi de 11 ppm.

As medidas de tenso superficial e interfacial de lquidos e de solues aquosas

e orgnicas contendo tensoativos podem facilmente serem feitas utilizando um

tensimetro Du Nouy. A adio de um bom surfactante na gua pode diminuir as

tenses superficial e interfacial a 20C de 72,8 para 30 mN/m e de 50,1 para 1,0 mN/m, em sistema n-octano/gua, respectivamente (KOSARIC et al., 1983; DESAI &

BANAT, 1997).

Os surfactantes quimicamente sintetizados tm sido usados na indstria do leo

cru, como auxiliares no tratamento despoluente de ambientes acometidos por derrames

de petrleo, bem como na recuperao terciria de leo de reservatrios. Porm, estes

compostos no so biodegradveis e podem ser txicos para o ecossistema (SERKER et

al., 1989 apud BANAT, 1995). Adicionalmente, os surfactantes apresentam aplicao

industrial, em grande escala, em produtos de uso pessoal, regularmente utilizado por

bilhes de pessoas em todo o mundo. A ingesto acidental, nem que seja de pequenas

quantidades destes surfactantes, impossvel evitar, uma vez que estes so constituintes

de produtos como cremes dentais e cosmticos, cuja utilizao freqente pode acarretar

na sua absoro. Por isso, muitos dos surfactantes usados comercialmente tm sido

estudados com rigor quanto ao possvel efeito txico a seres humanos (PORTER, 1994).

Os surfactantes apresentam diferentes graus de toxicidade, destacando-se os

compostos catinicos como os mais nocivos. Normalmente, tambm apresentam

acentuada atividade bactericida. Em menor grau, encontram-se os compostos aninicos

seguidos dos no-inicos, os quais apresentam variao de toxicidade em funo de sua

estrutura qumica (KANTIN, 1980). Os compostos tensoativos agem sobre a membrana

citoplasmtica desnaturando as protenas celulares e, conseqentemente, alterando o

equilbrio osmtico. A toxicidade est provavelmente relacionada estrutura molecular,

pois molculas contendo cadeias ramificadas, com nmero de tomos de carbono maior

que 16, ou anis aromticos, so as mais txicas (KANTIN, 1980).

A grande maioria dos surfactantes comercialmente disponveis sintetizada a

partir de derivados de petrleo (DESAI & BANAT, 1997; NISTCHKE & PASTORE,

15


2002). Contudo, o custo varivel do petrleo e a possibilidade do seu esgotamento vem

estimulando a busca por tecnologias alternativas que possibilitem a produo comercial

de agentes tensoativos biodegradveis a custo competitivo. Uma possibilidade seria a

obteno por via microbiana, uma vez que algumas espcies so capazes de acumular

grande quantidade de compostos com propriedades tensoativas (KOSARIC et al.,

1983).

2.6. Emulsificantes

A emulsificao, formao de emulses entre duas fases lquidas imiscveis, ,

provavelmente, a propriedade mais verstil dos agentes tensoativos para aplicaes

prticas e, por isso, tem sido extensivamente estudada (ROSEN, 1989). Emulsificao

a disperso de um lquido em outro, consistindo em gotas microscpicas que variam de

tamanho entre 0,1 e 100 nm de dimetro. Geralmente, quanto menor o dimetro das

gotculas, mais estvel ser a emulso formada (ZAJIC & SEFFENS, 1984)

Dois lquidos imiscveis no podem formar emulses. Neste caso, para promover

a disperso de um lquido em outro, deve ser adicionado um terceiro componente capaz

de estabilizar o sistema. Este componente chamado de agente emulsificante e,

usualmente, um agente tensoativo. Este agente no precisa ser constitudo por uma

nica substncia e, de fato, os emulsificantes mais eficientes so normalmente misturas

de uma ou duas substncias (ROSEN, 1989).

Shepherd et al. (1995) estudaram a produo de agentes emulsificantes por

microrganismos para serem utilizados no processamento de alimentos. Para tanto, um

experimento padro de emulsificao, desenvolvido especificamente para avaliar

emulsificantes de alimentos, foi utilizado para examinar 24 produtos microbianos

extracelulares de bactrias, levedura e algas. Dos 24 produtos testados, cerca de 71%

apresentaram capacidade emulsificante, dos quais 9 com atividade semelhante aos

emulsificantes normalmente utilizados em alimentos, como goma arbica e

carboximetilcelulose; sendo que os outros 8 apresentaram um efeito ainda melhor.

2.7. Biossurfactantes

Os compostos de origem microbiana com propriedades surfactantes, isto , com

capacidade de diminuir a tenso superficial e promover a emulsificao de lquidos

16


imiscveis, so denominados biossurfactantes. Em geral, esses compostos so

subprodutos do metabolismo de bactrias, fungos filamentosos e leveduras. Esses

microrganismos produzem as molculas de biossurfactantes utilizando vrios substratos

incluindo acares, hidrocarbonetos, e resduos agroindustriais (NITSCHKE &

PASTORE, 2002; MESQUITA, 2004).

Os biossurfactantes podem ser intra, extracelulares ou constituintes da parede

celular (BERTRAND et al., 1994). A maioria destes compostos apresenta natureza

lipdica. Ademais, os biossurfactantes apresentam propriedades semelhantes aos

surfactantes sintticos, por apresentarem tambm, na mesma molcula, grupos polares e

apolares (COOPER & ZAJIC, 1980). Em geral, o grupo hidrofbico constitudo por

longas cadeias de cidos graxos, hidroxilados ou no, e seus derivados como cidos -alquil--hidroxi-graxos. A frao hidrofilica na molcula pode ser devido presena de carboidratos, aminocidos, peptdeos cclicos, fosfato, cidos carboxlicos, lcoois,

steres, entre outros (PARRA et al., 1989).

Muitas vezes, a clula microbiana, por si s, pode demonstrar significante

capacidade emulsificante e se comportar como um biossurfactante. Em adio, a ao

solvente do hidrocarboneto na superfcie lipofilica da clula pode causar uma perda de

sua integridade estrutural, liberando componentes tensoativos no meio. Muitos autores

consideram que a clula intacta possuidora de capacidade emulsificante por si s um

biossurfactante, porm, apenas os biossurfactantes extracelulares tm o poder de reduzir

a tenso superficial de uma fase aquosa (FRANCY et al., 1991).

Os biossurfactantes podem apresentar baixo ou alto peso molecular. Os

biossurfactantes de baixo peso molecular apresentam uma maior eficincia em reduzir a

tenso superficial e interfacial de meios lquidos, enquanto os surfactantes de alto peso

molecular demonstram uma maior eficincia em estabilizar emulses leo/gua

(ROSENBERG & RON, 1999). Pode-se, portanto, definir os biossurfactantes como

compostos biodegradveis que, em muitos casos, possui propriedade emulsificante

equivalente aos compostos qumicos (SARKER et al., 1989 apud BANAT, 1995).

Assim, os biossurfactantes emulsificam hidrocarbonetos, aumentando sua solubilidade

em gua, diminuindo a tenso interfacial e aumentando o deslocamento das substncias

oleosas agregadas s partculas do solo (BANAT, 1995; BANAT, 2000).

Os surfactantes produzidos microbiologicamente oferecem vrias vantagens

sobre seus equivalentes qumicos, gerando novas possibilidades para aplicao

industrial (PARRA et al., 1989). Entretanto, a vantagem mais importante dos

17


biossurfactantes a de serem produtos ecologicamente corretos, o que est diretamente

relacionada com a sua aceitao pelos consumidores. Alm da biodegradabilidade, tem-

se a possibilidade de produzi-los a partir de substratos renovveis, ou at mesmo, de

rejeitos agroindustriais (FIECHTER, 1992; ROSENBERG et al., 1999; BANAT et al.,

2002; REIS et al., 2004).

Esses compostos podem possuir diferentes estruturas qumicas e propriedades de

superfcie uma vez que podem ser produzidos por uma grande variedade de

microrganismos em diferentes condies nutricionais e ambientais. Com base na

diversidade dos biossurfactantes razovel que apresentem diferentes aplicaes

especificas permitindo seu uso potencial nos mais variados setores da indstria, como j

mencionado (ROSENBERG & RON, 1999).

A produo destes tensoativos ainda no economicamente vantajosa, quando

comparada com os equivalentes sintticos. Por isso, o interesse no emprego de matrias-

primas mais baratas, como os resduos agroindustriais ou fontes renovveis contendo

hidratos de carbono e/ou lipdeos (MERCADE et al, 1994). Porm, h que se definir o

balano correto dos componentes do meio a fim de propiciar a obteno de altos

rendimentos e produtividades do processo a partir de matrias-primas de baixo valor

econmico.

2.8. Classificao e natureza qumica dos biossurfactantes

Os biossurfactantes constituem uma das mais importantes classes de surfactantes

naturais, sendo classificados de acordo com sua natureza bioqumica e pela sua origem

microbiana, ao contrrio dos surfactantes sintticos, os quais so geralmente

classificados de acordo com a natureza do seu grupo polar. Na Tabela 2.2 esto

descritos os principais surfactantes de origem natural e sinttica.

De acordo com seus constituintes os biossurfactantes podem ser agrupados nas

seguintes classes: glicolipdeos, lipopeptdeos, cidos graxos, lipdeos neutros,

fosfolipdeos e biossurfactantes polimricos (ZAJIC & STEFFENS, 1984; HOMMEL,

1990; GEORGIOU et al., 1992; DESAI & BANAT, 1997).

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Tabela 2.2. Principais grupos de surfactantes de origem natural e sinttica (NITSCHKE

& PASTORE, 2002).

NATURAIS SINTTICOS

Alquil poliglicosdeos Alcanolaminas Biossurfactantes Alquil e aril ter carboxilados Amidas de cidos graxos Alquil aril sulfatos Aminas de cidos graxos Alquil aril ter sulfatos Glucamidas Alquil etoxilados Lecitinas Alquil sulfonados Derivados de protenas Alquil fenol etoxilados Saponinas Aminoxidos Sorbitol e steres de sorbitan Batanas steres de sacarose Co-polimeros de xido de etil/propileno Sulfatos de lcoois graxos naturais cidos graxos etoxilados

A seguir uma breve descrio dos biossurfactantes mais investigados, dando

maior nfase ao biossurfactante alvo deste estudo:

2.8.1. Glicolipdeos

Os glicolipdeos so os surfactantes microbianos mais conhecidos. Estes

compostos so constitudos por carboidratos associados a uma longa cadeia de cidos

alifticos ou hidroxi-alifticos (DESAI & BANAT, 1997). Uma determinada espcie

microbiana capaz de produzir diferentes tipos de glicolipdeos, dependendo da fonte

de carbono disponvel para seu crescimento (ZAJIC & STEFFANS, 1984). Dentre os

glicolipdeos mais conhecidos, podem ser citados os raminolipdeos, trealoselipdeos e

soforoselipdeos (DESAI & BANAT, 1997).

Considerando a sntese de glicolipdeos, que constituem o maior grupo entre os

biotensoativos, quatro caminhos biossintticos so possveis, segundo SYLDATK &

WAGNER (1987): (1) sntese das metades hidroflica e hidrofbica; (2) a metade

hidroflica sintetizada enquanto a sntese da metade hidrofbica induzida pelo

substrato; (3) a metade hidrofbica sintetizada enquanto a sntese da metade

hidroflica induzida pelo substrato e (4) a sntese de ambas as metades depende do

substrato. Os raminolipdeos esto entre os glicolipdeos mais estudados.

Os dois principais raminolipdeos produzidos por Pseudomonas aeruginosa em

culturas lquidas so ramnosil-b-hidroxidecanoil-b-hidroxidecanoato (Rha-C10-C10) e

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ramnosil--ramnosil--b-hidroxidecanoil-b-hidroxidecanoato (Rha-Rha-C10-C10)

(DZIEL et al, 1999; MAIER & SOBERN-CHVEZ, 2000).

A sntese de raminolipdeos resulta de uma srie de reaes de transferncia do

grupo glicosil, cada uma catalisada por uma raminosil transferase especfica, com a

tidiminadifosfato-L-raminose (TDP-raminose) agindo como um doador de raminose e

os monoraminolipdeos agindo como os respectivos receptores (MAIER & SOBERN-

CHVEZ, 2000). Na Figura 2.7 est representada a seqncia de reaes que resultam

na sntese de raminolipdeos, de acordo com OCHSNER et al., (1995).

Nos ltimos anos, algumas publicaes tm indicado que os raminolipdeos

designados por 1(R1) e 2(R2) so, na realidade, produzidos como parte de uma mistura

complexa de raminolipdeos. Estes compostos contm uma ou duas molculas de

raminose ligadas a uma ou duas molculas de hidroxi cidos graxos com diferentes

comprimentos de cadeia, que podem conter uma dupla ligao. As diversas

combinaes destes grupos geram um grande nmero de possveis homlogos (DZIEL

et al., 1999). Novas tcnicas analticas tm sido aplicadas no estudo de raminolipdeos

microbianos, e mais de 28 homlogos j foram detectados (ABALOS et al., 2001). A

Figura 2.8 representa a estrutura geral de raminolipdeos produzidos pelo gnero

Pseudomonas.

Enquanto os raminolipdeos 1 e 2 so principalmente produzidos em culturas

lquidas, o raminolipdeo 3, contendo duas molculas de raminose e um cido graxo, e o

raminolipdeo 4, constitudo por uma molcula de raminose e um cido graxo, parecem

ser produzidos por clulas em condies no proliferantes (KOCH et al., 1991).

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Figura 2.7. Biossntese de raminolipdeos por Pseudomonas aeruginosa (OSHNER et

al., 1996).

Figura 2.8. Estrutura qumica da molcula de raminolipdeos (ABALOS et al, 2001). R1 = H2 (monoraminolipdeos) ou a-L- ramnopiranosil (diraminolipdeos).

R2 = cadeia hidrocarbonada saturada ou insaturada com C8 C12.

Estruturas diferenciadas de raminolipdeos, contendo cidos hidroxigraxos com

variados tamanhos de cadeias (C8, C12), tm sido descritos como produtos obtidos pelo

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crescimento de linhagens de Pseudomonas aeruginosa da rea clnica (RENDELL et

al., 1990). A grande variedade estrutural dos raminolipdeos est relacionada

variabilidade das cepas bem como s condies de cultivo como, por exemplo, o

crescimento em aerobiose ou anaerobiose, imobilizao bacteriana, uso de resting cells,

idade da cultura e variao de substratos (MATA-SANDOVAL et al., 1999; LANG &

WULLBRANDT, 1999).

Santos et al. (2002) estudaram a influncia de diferentes fontes de carbono e

nitrognio, em distintos valores de pH na estrutura molecular dos raminolipdeos, a

partir de fermentaes empregando a linhagem Pseudomonas aeruginosa PA1. Os

autores observaram que o emprego de glicerol, como nica fonte de carbono,

proporcionou maior quantidade de raminolipdeos do tipo R2 (cerca de 80%) e do tipo

R1 (17%) em relao s demais fontes de carbono estudadas (etanol, e leos de soja e

de oliva). Por outro lado, as fontes de nitrognio testadas (extratos de levedo, sulfato de

amnio e nitrato de sdio), no tiveram influncia nas propores dos raminolipdeos

sintetizados. Ainda segundo os autores, a quantidade de R1 produzido foi menor do que

a quantidade de R2 em valores de pH menores que 7,0. Em valores de pH superiores a

7,0, as quantidades de R1 e R2 foram equivalentes. As diferenas nas propores entre

os tipos de raminolipdeos sintetizados podem afetar as caractersticas do produto final,

como a concentrao micelar crtica (CMC) e suas propriedades surfactantes (atividade

emulsificante e tenso superficial), o que ir definir sua posterior aplicao (MATA-

SANDOVAL et al., 1999; CHRISTOFI & IVSHINA, 2002). Desta forma, dependendo

da aplicao que se queira dar ao produto, as concentraes relativas dos raminolipdeos

nele presentes podero ser modificadas com a escolha apropriada da fonte de carbono e

do pH do meio de cultivo.

Os raminolipdeos, assim como outros biossurfactantes, favorecem o

crescimento de microrganismos a partir de fontes de carbono hidrofbicas como os

hidrocarbonetos (COOPER & ZAJIC, 1980). ITOH & SUZUKI (1971) apud DESAI &

BANAT (1997) realizaram o cultivo de duas linhagens mutantes de Pseudomonas

aeruginosa, deficientes em enzimas responsveis pela sntese de raminolipdeos, em

meio de cultura contendo alcanos como nica fonte de carbono. Nas condies

ensaiadas, o crescimento destas culturas bacterianas s foi possvel quando os cultivos

foram suplementados com raminolipdeos. Posteriormente, outros autores, estudando a

degradao de hidrocarbonetos do solo, determinaram ser este surfactante essencial para

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mineralizao de hidrocarbonetos alifticos (OBERBREMER et al., 1990; ZANG &

MILLER, 1992; JAIN et al., 1992; VAN DYKE et al., 1993).

Mercade et al. (1993) estudaram a produo de biossurfactante a partir de

efluente gerado nos moinhos da extrao do leo de oliva. Nas condies ensaiadas,

observaram que diferentes espcies de Pseudomonas foram capazes de crescer a partir

desta matria-prima, ocorrendo tambm produo de raminolipdeos. Estes foram

capazes de reduzir a tenso superficial e a tenso interfacial de 42,0 e 30,0 para 1,0

mN/m respectivamente, indicativo da presena de alta concentrao de raminolipdeos.

Fernandes et al. (2005) estudaram a possibilidade de se utilizar resduos

provenientes do processamento de

produçãobiossurfactantepseudomonas

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